Загрузил bigbelka007

ЗАНЯТИЕ 1 ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ И СТРОЕНИЕ ПРОСТЫХ БЕЛКОВ

реклама
ЗАНЯТИЕ 1
ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ И СТРОЕНИЕ ПРОСТЫХ БЕЛКОВ
Цель занятия. Освоить некоторые методы выделения белков из мышечной ткани.
Проанализировать аминокислотный состав выделенных из мышечной ткани белков,
используя цветные реакции на белки и аминокислоты.
ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОПОДГОТОВКИ
1. Белки: элементный и аминокислотный состав. Физиологическая роль белков.
2. Гидролиз белков (кислотный, щелочной, ферментативный, полный и частичный).
3. Качественное обнаружение белков с помощью цветных реакций (биуретовой,
нингидриновой).
4. Хроматографические методы изучения аминокислотного состава гидролизатов белков.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ЗАНЯТИЯ
Биуретовая реакция
Принцип метода: реакция основана на том, что в щелочной среде в присутствиеи
солей меди белки дают фиолетовое окрашивание, обусловленное образованием комплекса
ионов меди с пептидной группировкой. Реакция позволяет обнаружить наличие
пептидной связи в исследуемом веществе, и является универсальной реакцией для
обнаружения веществ белковой природы.
Ход работы: в пробирку наливают 1-2 мл раствора белка, добавляют 1-2 мл 10%
раствора NaОН и 1-2 капли 1% раствора CuSO4.
Результат:
Вывод:
Нингидриновая рекция
Принцип метода: основан на том, при нагревании с -аминокислотами, а также
полипептидами нингидрин образует фиолетово-розоватое окрашивание. При нагревании с
нингидрином аминокислоты подвергаются окислительному дезаминированию
идекарбоксилированию, при этом выделяется углекислый газ, аммиак, образуется
альдегид, восстановленный нингидрин конденсирует с аммиаком и окисленным
нингидрином, образуя окрашенное соединение.
Ход работы: к 0,5 мл раствора белка добавить 5 капель 0,2 % водного раствора
нингидрина и прокипятить 2-3 минуты.
Результат:
Вывод:
Хроматографическое разделение аминокислот на бумаге
Определение содержания отдельных амнокислот методом хроматографии на бумаге
важно для изучения обмена белков и аминокислот в организме. С помощью бумажной
хроматографии можно легко провести разделение аминокислот, содержащихся в
гидролизате различных белков, сыворотке крови, моче и т.д.
Принцип метода. Основан на том, что различные растворители (Н-бутанол
СН3СООН; фенол, насыщенный водой и др.), смачивая хроматографическую бумагу,
создают на ней две фазы: неподвижную водную фазу и подвижную фазу органического
растворителя. Неподвижная водная фаза образуется в силу значительной
гигроскопичности бумаги, т.е. свойства задерживать определенное количество влаги на
поверхности волокон целлюлозы. Органический растворитель, двигаясь по бумаге,
увлекает за собой аминокислоты, которые перемещаются с различной скоростью. Она
зависит от способности аминокислот растворяться в органическом растворителе (или
воде). От избирательной адсорбции, от окружающей температуры, сорта бумаги,
растворителя и ряда других факторов.
Хроматографию проводят в герметических камерах, насыщенных парами
растворителя.
Для проведения восходящей хроматографии на нижний конец хроматографической
бумаги наносят определенный объем исследуемого раствора, высушивают, нижний край
бумаги помещают в растворитель и бумагу закрепляют в этом положении. Камеру
закрывают. Растворитель поднимается по бумаге и увлекает за собой аминокислоты. При
этом происходит разделение аминокислот из смеси. После того, как фронт растворителя
по бумаге достигнет определенного уровня, бумагу вынимают из камеры, высушивают, а
аминокислоты проявляют с помощью нингидрина.
Скорость передвижения аминокислот на бумаге характеризуется коэффициентом
распределения Rf. Это отношение расстояния от места нанесения аминокислоты до
середины ее пятна (А) к расстоянию от места нанесения смеси аминокислот до фронта
растворителя (Б)
А
Rf.= ---Б
Rf. является величиной, характерной для каждой аминокислоты, и постоянен при
данных условиях опыта.
Ход работы. На конце полоски фильтровальной бумаги размером 1х15см сделать прокол
иглой, продеть нитку, завязать петлю. На противоположном конце простым карандашм,
отступив от края на 1 см, нанести кружок, в который наносят смесь аминокислот.
На дно пробирки, не задевая стенок, поместить 1,5 мл растворителя. Придерживая за
нитку, опустить бумажку до соприкосновения ее нижнего краяс ратворителем и закрыть
пробирку, чтобы бумажка висела на нитке, касаясь нижним краем растворителя. Через час
бумагу вынимают, просушивают, смачивают 0,5% раствором нингидрина в ацетоне, снова
просушивают, и помещают в термостат на 15 минут при температуре 55С в темноте.
Отмечают появление фиолетовых пятен. Проводят расчет для каждой аминокислоты.
Результат.
Вывод.
ДОМАШНЕЕ ЗАДАНИЕ:
1. Повторить классификацию и строение аминокислот (знать формулы)
2. Повторить типы связей в молекулах белка, стабилизирующих первичную, вторичную,
третичную и четвертичную структуры.
3. Знать образование ди-, три- и полипептидов и их название.
4. Повторить методы изучения аминокислотного состава белков с помощью цветных
реакций и хроматографии.
Скачать