Хроматография — метод разделения и анализа смесей газов, паров, жидкостей или растворенных веществ сорбционными методами в динамических условиях. Вследствие различной сорбируемости компонентов смеси (подвижная фаза) происходит их зональное распределение по слою сорбента (неподвижная фаза) — возникает хроматограмма, позволяющая выделить и проанализировать отдельные вещества. Впервые X. предложена в 1903 г. русским ученым М. Цветом. Хроматографические методы различаются по следующим признакам по средам, в которых производится разделение - газовая, газожидкостная, жидкостная хроматография по механизмам разделения - молекулярная, ионообменная, осадочная и распределительная хроматография по технике проведения разделения – колоночная (колонки сорбентов), капиллярная (используют узкие капилляры), бумажная (специальная фильтровальная бумага) и тонкослойная (применяют тонкие слои сорбентов) хроматография Для разделения смеси аминокислот чаще всего применяют метод распределительной хроматографии на бумаге. Он основан на различной степени распределения компонентов смеси между двумя несмешивающимися жидкими фазами (неподвижной водной фазой и подвижной фазой органического растворителя - элюента). Твердая фаза, в данном случае специальная бумага, служит только опорой, а распределение веществ происходит между жидкими фазами. Вода удерживается порами бумаги и фиксируется, а подвижная фаза – органический растворитель – продолжает двигаться, увлекая за собой растворенный в ней компонент смеси. Органический растворитель (элюент), например, фенол, насыщенный водой, или смесь н-бутилового спирта, ледяной уксусной кислоты и воды, проходя через полоску фильтровальной бумаги, увлекает за собой аминокислоты, раствор которых был нанесен на бумагу. Различные аминокислоты передвигаются по бумаге с неодинаковой скоростью. Скорость перемещения аминокислот зависит от многих факторов: строения молекулы аминокислот, их способности легче растворяться в органическом растворителе или воде, избирательной адсорбции на бумаге, типа бумаги, условий проведения анализа и т. д. Чем лучше растворяется аминокислота в органическом растворителе, тем больший путь она пройдет с ним по бумаге. Распределительная хроматография может быть классифицирована по способу проведения: радиальная – движение растворителя и веществ смеси происходит из центра носителя по радиусу к периферии восходящая – движение растворителя и веществ смеси происходит снизу вверх по носителю нисходящая - движение растворителя и веществ смеси происходит сверху вниз по носителю Положение отдельных аминокислот обнаруживают путем проявления — обработки высушенной бумаги раствором нингидрина и последующего нагревания ее при 100° С. На полоске бумаги (хроматограмме) отчетливо видны пятна фиолетового, синего, голубого, желтого, оранжевого, коричневого цвета. Положение аминокислот на бумаге можно установить и без проявления, рассматривая хроматограмму в ультрафиолетовых лучах. Пятна отчетливо флуоресцируют в ультрафиолете. Для каждой аминокислоты характерна скорость перемещения, которую выражают с помощью коэффициента подвижности (распределения). Коэффициентом подвижности называют отношение пути, пройденного аминокислотой (от места ее нанесения на бумагу до середины пятна на хроматограмме), к расстоянию от места нанесения смеси аминокислот до фронта растворителя: где а — расстояние от места нанесения раствора смеси аминокислот до середины пятна данной аминокислоты, мм; b — путь, пройденный растворителем, мм.
