Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2002, Приложение № 4 86 ÏÎÒÅÍÖÈÐÎÂÀÍÍÛÅ ÀÍÒÈÒÅËÀ Ê ÝÐÈÒÐÎÏÎÝÒÈÍÓ: ÈÑÑËÅÄÎÂÀÍÈÅ ÌÓÒÀÃÅÍÍÛÕ ÑÂÎÉÑÒ Î.Ë.Âîðîíîâà, Î.Ï.Ðîãîçèíà, Þ.Ì.Äóãèíà*, À.Â.Ìàðòþøåâ*, Î.È.Ýïøòåéí* ÍÈÈ ôàðìàêîëîãèè ÒÍÖ ÑÎ ÐÀÌÍ; *ÍÏÔ “Ìàòåðèà Ìåäèêà Õîëäèíã”, Ìîñêâà  ýêñïåðèìåíòàõ íà ìûøàõ ëèíèè ÂÀLÂ/ñ ïîêàçàíî, ÷òî ñâåðõìàëûå äîçû àíòèòåë ê ýðèòðîïîýòèíó ïðè îäíîêðàòíîì è êóðñîâîì ââåäåíèè íå âûçûâàþò óâåëè÷åíèÿ äîëè ïîâðåæäåííûõ ìåòàôàç â êëåòêàõ êîñòíîãî ìîçãà è íå ÿâëÿþòñÿ ãåíîòîêñè÷íûìè â òåñòå ñîìàòè÷åñêîãî ìîçàèöèçìà íà êëåòêàõ êðûëà Drosophila melanogaster. Êëþ÷åâûå ñëîâà: àíòèòåëà ê ýðèòðîïîýòèíó, ìóòàãåííîñòü  êëèíè÷åñêîé ïðàêòèêå äëÿ êîððåêöèè àíåìè÷åñêîãî ñèíäðîìà ïðèìåíÿþòñÿ ðàçëè÷íûå ïðåïàðàòû ýðèòðîïîýòèíà [5,7]. Îêàçûâàÿ âûðàæåííîå ñòèìóëèðóþùåå äåéñòâèå íà ýðèòðîèäíûé ðîñòîê êðîâåòâîðåíèÿ, îíè âûçûâàþò ðÿä ïîáî÷íûõ ýôôåêòîâ [6], ïîýòîìó àêòóàëüíûì ñòàíîâèòñÿ ïðèìåíåíèå ïðåïàðàòîâ, ñîäåðæàùèõ ñâåðõìàëûå äîçû äåéñòâóþùèõ âåùåñòâ, íå âûçûâàþùèõ ïîáî÷íûõ ýôôåêòîâ ïðè äëèòåëüíîì ïðèåìå [8,9]. Öåëüþ íàñòîÿùåãî èññëåäîâàíèÿ ÿâèëîñü èçó÷åíèå öèòîãåíåòè÷åñêèõ ýôôåêòîâ íîâîãî ïðåïàðàòà íà îñíîâå àíòèòåë ê ýðèòðîïîýòèíó (ÀÒÝ), ñîçäàííîãî ÍÏÔ “Ìàòåðèà Ìåäèêà Õîëäèíã” (Ìîñêâà) è èçó÷åííîãî â êà÷åñòâå ãåìîñòèìóëÿòîðà â ÍÈÈ ôàðìàêîëîãèè ÒÍÖ ÑÎ ÐÀÌÍ. ÌÅÒÎÄÈÊÀ ÈÑÑËÅÄÎÂÀÍÈß Âîçäåéñòâèå îäíîêðàòíîãî è êóðñîâîãî ââåäåíèÿ ïðåïàðàòà ÀÒÝ [1] èçó÷àëè ìåòîäîì ó÷åòà õðîìîñîìíûõ àáåððàöèé â êëåòêàõ êîñòíîãî ìîçãà 47 ìûøåé ëèíèè ÂALB/c ìàññîé 18-22 ã. Æèâîòíûõ, ïîëó÷åííûõ èç Íàó÷íî-èññëåäîâàòåëüñêîé ëàáîðàòîðèè ýêñïåðèìåíòàëüíî-áèîìåäèöèíñêîãî ìîäåëèðîâàíèÿ ÍÈÈ ôàðìàêîëîãèè ÒÍÖ ÑÎ ÐÀÌÍ (ñåðòèôèêàò èìååòñÿ), ñîäåðæàëè â ñîîòâåòñòâèè ñ ïðàâèëàìè, ïðèíÿòûìè Åâðîïåéñêîé êîíâåíöèåé ïî çàùèòå ïîçâîíî÷íûõ æèâîòíûõ, èñïîëüçóåìûõ äëÿ ýêñïåðèìåíòàëüíûõ è èíûõ íàó÷íûõ öåëåé (Ñòðàñáóðã, 1986) è ñîãëàñíî ïðèêàçó ¹ 1179 ÌÇ ÑÑÑÐ îò 10.10.83 ã.  I ñåðèè ýêñïåðèìåíòîâ ÀÒÝ (ñìåñü ãîìåîïàòè÷åñêèõ ðàçâåäåíèé Ñ12+Ñ30+Ñ200) ââîäèëè îäíîêðàòíî âíóòðèæåëóäî÷íî â äîçå 0.5 ìë/20 ã òîëüêî ñàìöàì. Âî II ñåðèè ýêñïåðèìåíòîâ èñïûòóåìûé ïðåïàðàò ââîäèëè òàêèì æå ñïîñîáîì â äîçå 0.2 ìë/20 ã ñàìöàì è ñàìêàì åæåäíåâíî íà ïðîòÿæåíèè 5 ñóò. Êëåòêè êîñòíîãî ìîçãà ôèêñèðîâàëè ÷åðåç 24 ÷ ïîñëå ïîñëåäíåãî ââåäåíèÿ. Ìûøè ãðóïïû ñðàâíåíèÿ ïîëó÷àëè ïîòåíöèðîâàííóþ âîäó (Ñ12+Ñ30+Ñ200, íåãàòèâíûé êîíòðîëü) èç ðàñ÷åòà 0.25 ìë íà 10 ã.  êà÷åñòâå ïîçèòèâíîãî êîíòðîëÿ èñïîëüçîâàëè ââåäåíèå ïëàòèíà (öèñ-äèõëîðäèãèäðîêñèëàìèíïëàòèí, çàâåäîìî îáëàäàþùèé öèòîãåíåòè÷åñêîé àêòèâíîñòüþ) â äîçå 17 ìã/êã (ËÄ50) îäíîêðàòíî âíóòðèáðþøèííî. Äàííóþ ãðóïïó æèâîòíûõ ñðàâíèâàëè ñ ìûøàìè, êîòîðûì ââîäèëè òàêèì æå ñïîñîáîì ðàñòâîðèòåëü — 0.9% NaCl. Çà 1.5 ÷ äî îêîí÷àíèÿ ýêñïîçèöèè (24 ÷) äëÿ íàêîïëåíèÿ ìåòàôàç ìûøàì âíóòðèáðþøèííî ââîäèëè 0.025% êîëõèöèí ïî 0.01 ìë/ã ìàññû æèâîòíîãî. Ïðåïàðàòû êëåòîê êîñòíîãî ìîçãà ãîòîâèëè ìîäèôèöèðîâàííûì ìåòîäîì Ôîðäà [3] è îêðàøèâàëè àçóðîì II è ýîçèíîì â òå÷åíèå 30 ìèí. Âî âñåõ ãðóïïàõ îò êàæäîãî æèâîòíîãî àíàëèçèðîâàëè 50-100 ìåòàôàç. Äëÿ àíàëèçà îòáèðàëè íåðàçðóøåííûå êëåòêè îêðóãëîé ôîðìû ñ õîðîøèì ðàçáðîñîì õðîìîñîì, áåç íàëîæåíèé, ñ ìîäóëüíûì ÷èñëîì (40).  êëåòêàõ êîñòíîãî ìîçãà ó÷èòûâàëè äîëþ ïîâðåæäåííûõ ìåòàôàç è àáåððàíòíûõ õðîìîñîì. Ñðåäè ñòðóêòóðíûõ íàðóøåíèé õðîìîñîì îòìå÷àëè îäèíî÷íûå, ïàðíûå ôðàãìåíòû è îáìåíû. Çíà÷èìîñòü ðàçëè÷èé ïðè ñòàòèñòè÷åñêîé îáðàáîòêå äàííûõ îöåíèâàëè ïî t êðèòåðèþ Ñòüþäåíòà.  îñíîâå ìåòîäà ñîìàòè÷åñêèõ ìîçàèê ëåæèò ó÷åò ìîçàè÷íûõ ïÿòåí íà êðûëå, âîçíèêàþùèõ ó ФАРМАКОЛОГИЯ СВЕРХМАЛЫХ ДОЗ 87 Òàáëèöà 1. Îöåíêà öèòîãåíåòè÷åñêîé àêòèâíîñòè ÀÒÝ â îòíîøåíèè ÷àñòîòû õðîìîñîìíûõ àáåððàöèé â êëåòêàõ êîñòíîãî ìîçãà ìûøåé ëèíèè BALB/ñ (M±m) Ïîêàçàòåëü Èíòàêòíûå (n=5) Êîíòðîëü H 2O (n=6) 0.9% NaCl Ïëàòèí (n=7) ÀÒÝ (n=5) Количество исследованных клеток 500 600 500 700 500 Количество аберраций, % 2.40±1.53 1.17±0.60 2.40±1.47 27.00±2.13* 0.6±0.4+ 2.40±1.53 1.17±0.60 2.40±1.47 23.00±2.08* 0.6±0.4 + 0±0 0±0 0±0 0.14±0.14 0±0 обменов 0±0 0±0 0±0 3.86±0.83* 0±0+ Доля поврежденных метафаз, % 1.20±0.38 1.17±0.60 2.40±1.47 19.00±1.43 0.6±0.4+ в том числе: фрагментов одиночных парных Примечание. Различия достоверны: *с соответствующим контролем (0.9 % NaCl), +с группой платина. Drosophila melanogaster òåñòåðíûõ ëèíèé â ðåçóëüòàòå êîìïëåêñíîãî íàðóøåíèÿ ãåíîòèïà. Äåâcòâåííûõ ñàìîê ëèíèè mwh/mwh â êîëè÷åñòâå 10 îñîáåé ïîìåùàëè âìåñòå ñ 5 ñàìöàìè ëèíèè flr3/ TM3 â ïðîáèðêè, ñîäåðæàùèå ñòàíäàðòíóþ ïèòàòåëüíóþ ñðåäó. ×åðåç 60-62 ÷ ðîäèòåëåé ïåðåñàæèâàëè â ïðîáèðêè ñî ñâåæåé ïèòàòåëüíîé ñðåäîé, à â ïðåæíèå ïðîáèðêè äîáàâëÿëè ÀÒÝ (500 ìêë/2 ìë ñðåäû). Ïðîñìîòð âûëåòåâøèõ îñîáåé íà÷èíàëè ñ 9-10 äíÿ ïîñëå íà÷àëà ýêñïåðèìåíòà, îòáèðàëè ìóõ ñ ãåíîòèïîì mwh+/+flr3, êîòîðûõ ôèêñèðîâàëè â 70% ýòèëîâîì ñïèðòå. Èç êðûëüåâ ýòèõ ìóõ äåëàëè ìèêðîñêîïè÷åñêèå ïðåïàðàòû â æèäêîñòè Ôîðà. Îáå ïîâåðõíîñòè êðûëà, ñîñòîÿùèå èç ìîíîñëîÿ êëåòîê, ïðîñìàòðèâàëè ïîä ìèêðîñêîïîì (½400). Ìóòàíòíûå ïÿòíà ïîäðàçäåëÿëè íà êëàññû, âûäåëÿÿ åäèíè÷íûå ïÿòíà èç 1-2 êëåòîê (mwh èëè flr), áîëüøèå åäèíè÷íûå ïÿòíà — 3 è áîëåå êëåòîê (mwh èëè flr) è äâîéíûå ïÿòíà, ñîñòîÿùèå èç ðÿäîì ðàñïîëîæåííûõ êëîíîâ êëåòîê mwh è flr. Ýòè 3 êëàññà ìóòàíòíûõ ïÿòåí îöåíèâàëè îòäåëüíî ïî ÷àñòîòå èõ ïîÿâëåíèÿ íà êðûëå [2]. Çíà÷èìîñòü ðàçëè÷èé ïðè ñòàòèñòè÷åñêîé îáðàáîòêå äàííûõ îöåíèâàëè ïî êðèòåðèþ χ2 [4]. ÐÅÇÓËÜÒÀÒÛ ÈÑÑËÅÄÎÂÀÍÈß Äîëÿ ïîâðåæäåííûõ êëåòîê â ãðóïïå ìûøåé, ïîëó÷àâøèõ ÀÒÝ â äîçå 0.5 ìë/20 ã ïðè ýêñïîçèöèè 24 ÷ îñòàâàëàñü íà óðîâíå ñòðóêòóðíûõ íàðóøåíèé â ôîíå è íåãàòèâíîì êîíòðîëå è äîñòîâåðíî ñíèæàëàñü ïî ñàìûì âàæíûì ïîêàçàòåëÿì öèòîãåíåòè÷åñêîé àêòèâíîñòè ïî ñðàâíåíèþ ñ òàêîâûìè ïðè ââåäåíèè öèòîñòàòèêà (òàáë. 1). Âî II ñåðèè ýêñïåðèìåíòîâ ó ñàìöîâ ÷åðåç 24 ÷ â 500 ìåòàôàçàõ îòìå÷åíî 1.40±0.75% êëå- òîê ñ àáåððàöèÿìè õðîìîñîì, ñðåäè êîòîðûõ îòìå÷àëèñü òîëüêî îäèíî÷íûå ôðàãìåíòû, ÷òî ñîîòâåòñòâîâàëî êîíòðîëüíîìó óðîâíþ çíà÷åíèé. Ó 5 ñàìîê, ïîëó÷àâøèõ ÀÒÝ, ÷åðåç 24 ÷ â 500 ìåòàôàçàõ äîëÿ ïîâðåæäåííûõ êëåòîê ñîñòàâëÿëà 1.00±0.45%. Àáåððàöèè õðîìîñîì áûëè ïðåäñòàâëåíû òîëüêî îäèíî÷íûìè ôðàãìåíòàìè. Òàêèì îáðàçîì, îäíîêðàòíîå è êóðñîâîå âíóòðèæåëóäî÷íîå ââåäåíèå ÀÒÝ íå âûçûâàåò óâåëè÷åíèÿ äîëè ïîâðåæäåííûõ ìåòàôàç â êëåòêàõ êîñòíîãî ìîçãà ìûøåé. Ïîä âëèÿíèåì ÀÒÝ îòìå÷åíî äîñòîâåðíîå ñíèæåíèå ÷àñòîòû ìóòàíòíûõ ïÿòåí (òàáë. 2). Ïðè âîçäåéñòâèè ïðåïàðàòà âñòðå÷àþòñÿ òîëüêî åäèíè÷íûå ìóòàíòíûå êëåòêè ñ äâóìÿ èëè òðåìÿ âîðñèíêàìè, ëîêàëèçîâàííûå â ðàçíûõ ÿ÷åéêàõ íà ïëîñêîñòè êðûëà. Ðàçëè÷èÿ ìåæäó îïûòíîé è êîíòðîëüíîé ãðóïïàìè, à òàêæå ñ èíòàêòíûìè ìóõàìè áûëè ñòàòèñòè÷åñêè äîñòîâåðíû (òàáë. 2). Òàêèì îáðàçîì, ïðåïàðàò ÀÒÝ íå ãåíîòîêñè÷åí äëÿ äðîçîôèëû. Èòàê, îäíîêðàòíîå è êóðñîâîå âíóòðèæåëóäî÷íîå ââåäåíèå ÀÒÝ íå âûçûâàåò óâåëè÷åíèÿ Òàáëèöà 2. Ó÷åò ñîìàòè÷åñêîãî ìîçàèöèçìà íà êðûëå D. melanogaster (íà 100 êðûëüåâ) ïðè èñïîëüçîâàíèè ìàðêåðîâ mwh è flr Ïîêàçàòåëü Пятна Èíòàêòíûå Êîíòðîëü ÀÒÝ 48 43 19 единичные (mwh/flr) 48/0 41/0 19/0 большие (mwh/flr) 0/0 1/0 0/0 0 1 0 Частота индукции, ½10—5 1.58 1.42 0.63 χ2 9.29 12.56 — двойные (mwh и flr) 88 Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2002, Приложение № 4 ÷àñòîòû öèòîãåíåòè÷åñêèõ íàðóøåíèé â êëåòêàõ êîñòíîãî ìîçãà ìûøåé ëèíèè ÂÀLÂ/ñ. Êðîìå òîãî, ïðåïàðàò íå îáëàäàåò ãåíåòè÷åñêîé òîêñè÷íîñòüþ è äàæå ñíèæàåò ñïîíòàííûé óðîâåíü ìóòàöèé è ðåêîìáèíàöèé íà êðûëå D. melanogaster. ËÈÒÅÐÀÒÓÐÀ 1. Äóðíåâ À.Ä., Ðåâàçîâà Þ.À., Âåðñòàêîâà Î.Ë. è äð. Ðóêîâîäñòâî ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èçó÷åíèþ íîâûõ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ âåùåñòâ. Ì., 2000. Ñ. 47-60. 2. Çàõàðåíêî Ë.Ï., Çàõàðîâ È.Ê. // Ãåíåòèêà. 1996. Ò. 32, ¹ 6. Ñ. 755-758. 3. Îðëîâ Â.Í., ×óäèíîâñêàÿ Ã.À., Êðþêîâà Å.Ï. Èññëåäîâàíèå õðîìîñîìíûõ íàáîðîâ ìëåêîïèòàþùèõ. Ì., 1976. 4. Frei H., Wurgler F.E. // Mutat. Res. 1988. Vol. 203. P. 297-308. 5. Geissler R.G., Schulte, Ganser A. // Int. J. Hematol. 1997. Vol. 65, N 4. P. 339-354. 6. Jabs K., Harmon W.E. // Adv. Ren. Replace Ther. 1996. Vol. 3, N 1. P. 24-36. 7. Jelkmann W., Metzen E. // Anat. Anz. 1996. Vol. 178, N 5. P. 391-403. 8. Kaplan B. // Prof. Care Mother Child. 1994. Vol. 4, N 5. P. 151-152. 9. Poitevin B. // Bull. WHO. 1999. Vol. 77, N 2. P. 160-166.