На правах рукописи ГОЛОВИНСКАЯ Ольга Вячеславовна

На правах рукописи
ГОЛОВИНСКАЯ
Ольга Вячеславовна
ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА РАЗЛИЧНЫХ
УГЛЕВОДСОДЕРЖАЩИХ ПРЕПАРАТОВ
HAEMOPHILUS INFLUENZAE
14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва – 2011
Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук
Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток
им. И.И. Мечникова РАМН
Научный руководитель:
доктор медицинских наук
Ястребова Наталия Евгеньевна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор
Киселевский Михаил Валентинович
доктор биологических наук
Мирошниченко Ирина Вадимовна
Ведущая организация:
Российский
государственный
медицинский
университет им. Н.И. Пирогова
Защита диссертации состоится «24» марта 2011 г. в 12 часов на заседании
диссертационного совета Д 001.035.01 при НИИВС им. И.И. Мечникова
РАМН по адресу: 105064, Москва, Малый Казённый пер., д.5а.
С
диссертацией
можно
ознакомиться
в
библиотеке
им. И.И. Мечникова РАМН
Автореферат разослан «___» февраля 2011г.
Учёный секретарь диссертационного совета
кандидат биологических наук
И.В. Яковлева
НИИВС
Актуальность темы. Инфекции, вызываемые Haemophilus influenzae,
являются причиной заболеваемости и смертности в экономически развитых и
развивающихся странах, прежде всего, среди детей раннего возраста
[Л.М.Куртасова с соавт., 2010]. Установлена роль H.influenzae в этиологии
гнойного менингита, гнойного эпиглоттита, сепсиса, хронического бронхита,
пневмонии, среднего отита, синусита, конъюнктивита и др. Фактические
данные, накопленные в последние годы, свидетельствуют о том, что эти
заболевания имеют широкое распространение на территории России и
являются актуальной проблемой здравоохранения [В.К.Таточенко, 2010].
Заболевания, вызываемые наиболее вирулентным капсульным штаммом
H.influenzae типа b (Hib), имеют тяжелое течение с нередким развитием
осложнений и высокую летальность. Вместе с тем, нельзя недооценивать
медико-социальную значимость инфекций, вызываемых бескапсульными или
нетипируемыми (NTHi) штаммами гемофильной палочки.
Если вопрос защиты от инфекций, вызванных капсульными штаммами
H.influenzae, в настоящее время решается применением конъюгированных
вакцин на основе капсульного полисахарида H.influenzae типа b (КПС Hib) и
белков-носителей, то вакцины против инфекций, вызванных бескапсульными
штаммами, до сих пор нет. В качестве основы для вакцинных препаратов,
направленных на профилактику заболеваний, вызванных бескапсульными
штаммами H.influenzae, за рубежом изучается роль белков наружной мембраны
и липоолигосахаридов (ЛОС) [A.R.Foxwell, M.K. Jennelle et al, 1998;
W.E.Adhami, et al 1999]. Следует отметить, что ЛОС бескапсульных штаммов
H.influenzae имеют уникальную структуру. Обнаружено более 10-ти субтипов
NTHi,
различающихся
по
электрофоретической
[О.Е.Орлова, 2006; X.X. Gu et al., 1995].
_________________________
Список сокращений – с.24
3
подвижности
ЛОС
В
нашей
стране
субтипирование
циркулирующих
бескапсульных
штаммов не проводилось. Вместе с тем, решение этого вопроса может
способствовать
определению
наиболее
распространенных
в
популяции
субтипов возбудителей с дальнейшим получением из них детоксицированных
ЛОС, обеспечивающих перекрестную защиту от NTHi. Не изучена также
возможность создания вакцинного препарата на основе двух Т-независимых
антигенов (КПС и ЛОС) H.influenzae для одновременной защиты от капсульных
и бескапсульных штаммов.
Цель.
Получение
углеводсодержащих
антигенов
H.influenzae
и
характеристика их иммунобиологических свойств.
Задачи исследования:
1. Провести выбор бескапсульных штаммов H.influenzae, наиболее
распространенных в популяции больных бронхолегочными заболеваниями
(БЛЗ).
2. Получить препараты капсульного полисахарида Hib, гидроксиламиновые препараты капсульного и бескапсульного штаммов H.influenzae, ЛОС
NTHi
и
охарактеризовать
их
по
химическим,
физико-химическим
и
иммунохимическим свойствам.
3. Изучить влияние гидроксиламингидрохлорида, безводного гидразина,
гидроксида натрия на жирнокислотный состав липида А липоолигосахарида
бескапсульного штамма и его токсичность.
4. На основании результатов изучения иммунобиологических свойств
антигенных препаратов H.influenzae определить наиболее перспективный
препарат для разработки вакцины, направленной на профилактику заболеваний,
вызываемых капсульными и бескапсульными штаммами H.influenzae.
Научная новизна. Впервые при использовании SDS-электрофореза в
полиакриламидном геле (ПААГ) проведен скрининг ЛОС, выделенных из 62
бескапсульных штаммов H.influenzae, циркулирующих на территории России
(Москва)
среди
больных
с
бронхолегочными
заболеваниями.
По
электрофоретической подвижности ЛОС выявлено 10 основных субтипов,
4
имеющих один электрофоретический компонент, и 13 дополнительных,
включающих 2-3 основных компонента в различных сочетаниях. Наиболее
распространены среди больных – VI (17,7±4,8%), VIII (12,9±4,3) и X (12,9±4,3)
субтипы.
Впервые при использовании твердофазного ИФА на основе ЛОС 67
штаммов NTHi определена частота повышенного уровня ЛОС-специфических
IgG-антител к H.influenzae
у больных бронхолегочными заболеваниями и
здоровых доноров. Наиболее часто повышенный уровень антител наблюдали к
11 штаммам (16,7-54,8%), которые также имели признаки или принадлежали к
трем основным субтипам (VI, VIII, X).
Выделены и охарактеризованы по химическим, физико-химическим и
иммунохимическим свойствам три группы бактериальных антигенов: КПС
1095 Hib; ГАП 1095 Hib и 58 NTHi; ЛОС штаммов 45, 54, 58, 65 NTHi и 1095
Hib. По результатам иммунохимических исследований наиболее выраженной
перекрестной активностью обладал ЛОС штамма 45 NTHi (X субтип).
Впервые проведено сравнительное изучение детоксицирующих свойств
безводного гидразина (БГ), солянокислого гидроксиламина (ГА) и гидроксида
натрия. На примере ЛОС 45 NTHi показано, что при использованных
концентрациях БГ и ГА приводят к удалению основной массы жирных кислот
из липида А, что, в свою очередь, ведет к уменьшению токсичности препарата в
опытах на животных в 31,5-25 раз (LD50ЛОСИСХ=0,063 мкг; LD50 дЛОСБГ=1,99
мкг; LD50 дЛОСГА=1,58 мкг).
Изучение иммунобиологических свойств КПС, ГАП, ЛОС, дЛОС и
смесей КПС с ЛОС 45 NTHi и КПС с дЛОСГА показало, что смесь КПС Hib (10
мкг) и дЛОСГА 45 NTHi (0,1-10мкг) является наиболее перспективным
углеводсодержащим препаратом в качестве основы для разработки новой
вакцины против гемофильной инфекции, обусловленной как капсульными, так
и бескапсульными штаммами. При испытанных дозах и схемах введения смесь
указанных препаратов обладает низкой токсичностью, высокой перекрестной
протективной
активностью
при
заражении
5
иммунизированных
мышей
капсульным и бескапсульными штаммами H.influenzae и вызывает активацию
эффекторов системы врожденного и адаптивного иммунитета, приводя к
повышению фагоцитарной способности лейкоцитов мышей, продукции
провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, увеличению числа Тклеток, экспрессирующих молекулы CD4, активационные молекулы CD25 и
MHCII, повышению продукции специфических IgG-антител к ЛОС.
Практическая значимость. Установлено, что циркулирующие на
территории России (Москва) NTHi штаммы по структуре ЛОС относятся к
десяти основным субтипам, среди которых VI, VIII и X субтипы наиболее
распространены у больных бронхолегочными заболеваниями. Предложенный
способ
субтипирования
эпидемиологического
может
мониторинга
быть
использован
штаммов
в
разных
для
проведения
географических
регионах России.
Высокая степень очистки и специфическая активность КПС 1095 Hib
позволяет рекомендовать его использование в качестве референс-препарата, а
также для создания современных диагностических и профилактических
препаратов.
В
рамках
выполнения
федеральной
целевой
программы
«Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научнотехнического комплекса России на 2007-2012 гг.» КПС 1095 Hib использовали
для создания количественной иммуноферментной тест-системы для оценки
поствакцинального иммунитета.
Солянокислый гидроксиламин может быть использован в качестве
детоксицирующего агента для ЛОС NTHi штаммов.
Смесь капсульного полисахарида Hib и детоксицированного ЛОС NTHi
может быть использована в качестве основы для разработки вакцины с
серотиповой (Hib) и видовой (NTHi) перекрестной протективной активностью.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Бескапсульные штаммы H.influenzae, циркулирующие в популяции
больных бронхолегочными заболеваниями людей, по электрофоретической
6
подвижности
ЛОС
относятся
к
10
основным
субтипам,
наиболее
распространенными из которых являются VI, VIII и X.
2. Среди выделенных углеводсодержащих препаратов – КПС 1095 Hib,
ГАП 1095 Hib и 58NTHi, ЛОС 45, 54, 58, 65 NTHi и 1095 Hib – высокой
перекрестной серологической активностью обладают ГАП и ЛОС 45 NTHi.
3. Действие 1% водного раствора гидроксиламингидрохлорида приводит
к удалению из липида А ЛОС NTHi 3-гидроксикаприновой, миристиновой,
олеиновой и стеариновой кислот и снижению токсичности полученного дЛОС в
25 раз.
4. Низкая токсичность, высокая степень внутривидовой перекрестной
защиты смеси КПС Hib и дЛОС NTHi, способность этой смеси активировать
эффекторы
врожденного
иммунитета,
а
также
инициировать
процесс
формирования адаптивного иммунитета является основанием для разработки
новой вакцины, направленной на профилактику заболеваний, вызванных
капсульными и бескапсульными штаммами H.influenzae.
Апробация работы. Основные материалы диссертации представлены и
обсуждены:
на
Всероссийской
научной
конференции
"Объединенный
Иммунологический Форум", Санкт-Петербург, 2008; на конференции молодых
ученых НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН, Москва, 2009. Апробация работы
состоялась на конференции отдела иммунологии НИИ вакцин и сывороток им.
И.И. Мечникова РАМН 18 ноября 2010 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных
работ в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на
149 страницах компьютерного текста, иллюстрированы 18 рисунками и 20
таблицами, состоят из введения, четырех глав обзора литературы, пяти глав
собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка
литературы, включающего 109 источников, в том числе, 41 на русском языке.
7
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Штаммы микроорганизмов: Hib 1095 выделен в 2001 году от ребенка
больного менингитом; 67 бескапсульных штаммов выделены в течение 2006
года от пациентов НЦЗД РАМН, страдающих различными бронхолегочными
заболеваниями, и любезно предоставлены нам д.м.н., проф. Л.К.Катосовой.
Культивирование бактерий каждого штамма NTHi проводили на
плотной сердечно-мозговой среде («Дифко», США) с добавлением в нее
факторов роста – НАД (4 мл/л) и гемина (60 мл/л), и полусинтетической
жидкой
питательной
среде,
содержащей
аминопептид.
Длительность
культивирования составляла 10-14 час при 37°С.
Сыворотки клинически здоровых доноров (n=40) получены со станции
переливания крови г. Москвы в 2006 г. Средний возраст лиц, допущенных к
донорству
крови
–
30,6
лет.
Сыворотки
крови
больных
(n=56)
бронхолегочными заболеваниями детей (бронхиальная астма, хроническая
пневмония, острый рецидивирующий обструктивный бронхит, синдром
Картагенера, врожденный порок развития легких) получены из НЦЗД РАМН в
2006 г. Средний возраст обследуемых пациентов – 10,1 г. У 25 детей имелось
бактериологическое подтверждение инфекции, вызванной NTHi штаммами.
При этом от 14 детей имелись одновременно и штаммы и сыворотки. У 31
ребенка данные бактериологических исследований отсутствовали или были
отрицательными.
Гипериммунные сыворотки кроликов получали после многократной
иммунизации животных суспензией гретых бактерий различных штаммов
H.influenzae. Титр сывороток в реакции агглютинации составлял 1:800-1:1600.
Лабораторные животные. Для исследований использовали мышей
белых беспородных (n=1386), линейных С57Вl/6 (n=80) и Balb/c (n=350) массой
16-18 г и 18-20 г, самцы; кроликов породы «шиншилла» (n=18) массой 2-2,5 кг.
Животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом в соответствии с
8
«Правилами
проведения
работ
с
использованием
экспериментальных
животных».
Получение антигенных препаратов. Препараты ЛОС получали с
помощью фенольной экстракции из водной и фенольной фаз [O. Westphal et al,
1965];
лизиса
бактерий
с
последующей
обработкой
протеиназой
К
[P.J.Hitchcock et al., 1983]; лизиса бактерий, депротеинизации ферментами и
осаждения этанолом [P.A. Jones et al, 2002]; экстракции 0,1М раствором NaCl с
последующей
очисткой
ДНК-азой,
РНК-азой,
протеиназой
К
и
ультрацентрифугированием [Л.Д. Варбанец, 2006]. КПС Hib выделен с
помощью цетавлона [E.C. Gotschlich et al, 1969]. ГАП получали из бактерий
капсульного
и
бескапсульного
штаммов
с
помощью
солянокислого
гидроксиламина [Н.И. Синяшин с соавт., 1964].
Детоксикацию липоолигосахаридов проводили с помощью безводного
гидразина (БГ), 1% солянокислого гидроксиламина (ГА) и
0,1М щелочи в
условиях, описанных X.X. Gu [1997, 2001] для БГ.
Химический состав полученных препаратов изучали, определяя
содержание в них белка [О.H. Lowry et al., 1951]; углеводов [M. Dubois et al.,
1959]; рибозы [В.В. Мейбаум, 1945]; нуклеиновых кислот по величине
оптической плотности при 260 нм [Л.Р. Остерман, 1981].
Электрофорез в 10% и 15% полиакриламидном геле проводили по
методу Laemmli [1970] с окраской Coumassi Brilliant Blue R-250 или
азотнокислым серебром.
Газожидкостная хроматография высших жирных кислот (ВЖК) была
выполнена на хроматографе Hewlett-Packard 5890A (США), снабженном
капиллярной колонкой НР-1MS и пламенно-ионизационным детектором (газноситель – азот). Содержание высших жирных кислот оценивали по площадям
пиков соответствующих метиловых эфиров на хроматограммах и выражали в
виде отношения к площади пика метилового эфира пальмитиновой кислоты
(С16:0), который имелся на хроматограммах всех образцов и площадь которого
9
принимали за единицу. Исследование выполнено совместно с сотрудниками
НИИ Органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН.
ЯМР-спектроскопия КПС Hib выполнена на спектрометре DRX-500
(«Bruker», Германия). Исследование выполнено совместно с сотрудниками
ГНЦ Института Иммунологии ФМБА.
Определение
молекулярно-весовой
гетерогенности
препаратов
осуществляли с помощью гель-фильтрации на колонке («LKB-Pharmacia»)
размером 70х1,5 см, заполненной сефарозой CL6B. Оптическую плотность
каждой фракции определяли при длине волны 280 нм. Рассчитывали
коэффициенты объемного распределения (Каv) фракций.
Определение серологической специфичности выделенных препаратов
осуществляли в реакции преципитации в геле [O. Ouchterlony, 1953]; линейном
иммуноэлектрофорезе
[П.Грабар,
1961],
ракетном
иммуноэлектрофорезе
(РИЭФ) [B.Weeke, 1973].
Для определения уровня IgG антител в сыворотках людей и
экспериментальных
животных
использовали
метод
непрямого
иммуноферментного анализа (ИФА) с адсорбцией на носителе антигена. Для
получения иммуносорбентов со штаммовой (по ЛОС) и типовой (по КПС)
специфичностью
полистироловые
пластины
(производство
ВНИИ
«Медполимер», Россия) сорбировали каждым из антигенов в дозах 2,5-5
мкг/мл.
Торможение ИФА применяли для изучения перекрестной активности
ЛОС.
Конкуренция за связывание антител происходила между антигеном,
сорбированным на твердой фазе, и антигеном, добавленным в гипериммунную
кроличью сыворотку в момент внесения ее рабочего разведения в лунку.
Определение фагоцитарной активности лейкоцитов проводили на
мышах линии С57Bl/6. Препараты вводили внутрибрюшинно в дозах 100 (ГАП)
и 10 (другие препараты) мкг/мышь. Через 24 часа мышей заражали штаммом
Wood 46 Staphylococcus aureus внутрибрюшинно в дозе 5х108 м.к./мышь в 0,4%
агаре.
Поглотительную
способность
10
фагоцитов
крови
оценивали
по
фагоцитарному индексу и фагоцитарной активности через 4, 24 и 48 часов
после заражения.
Оценку цитокинового профиля мышей проводили в сыворотках после
однократной внутрибрюшинной иммунизации исследуемыми препаратами в
дозе 1,0 мкг. Забор крови проводили через 4, 8 и 24 часа. Определение
цитокинов (GM-CSF, IFN-γ, IL-1α, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-17, TNF-α)
проводили при использовании набора «Flow Cytomix» согласно инструкции
производителя. Контролем служили показатели у интактных животных.
Результаты
учитывали
на
проточном
цитометре
FacsCalibur
(«Becton
Dickinson», США).
Исследование экспрессии поверхностных маркеров мононуклеарных
лейкоцитов
(МЛ)
селезенок
мышей
проводили
путем
иммунофенотипирования с применением моноклональных антител («Caltag
Laboratories», США) против соответствующих антигенов на проточном
цитометре FacsCalibur («Becton Dickinson», США). На МЛ исследовали уровни
экспрессии
дифференцировочных
антигенов
CD3,
CD4,
CD8,
NK;
активационных антигенов CD25, МНС II; а также маркеров В-лимфоцитов –
CD19. Контролем служили показатели у интактных животных.
Токсичность препаратов определяли на беспородных белых мышах,
которым за день до иммунизации внутрибрюшинно вводили по 0,5 мл
актиномицина Д в дозе 10 мкг/мышь с целью иммуносупрессии и увеличения
чувствительности
животных
к
препаратам.
Препараты
вводили
внутрибрюшинно в дозах: 50,0; 10,0 и 2,0 мкг (ГАП); 10,0; 1,0 и 0,1 мкг (КПС)
или 2,0; 0,2 и 0,02 мкг (ЛОС). Гибель животных учитывали на 2-5-е сутки после
иммунизации. По окончании опыта рассчитывали LD50 по формуле [Б.Л. Ван
дер Варден, 1960].
Протективную
активность
определяли
путем
предварительной
иммунизации беспородных белых мышей кратными разведениями антигенных
препаратов в различных дозах (от 50,0 до 0,1 мкг/мышь). Для изучения
перекрестной защиты мышей иммунизировали двукратно с интервалом в одну
11
неделю. Мышей заражали на 14-е сутки культурой H.influenzae типа b в дозе
1,5х109 м.к. на мышь, либо культурами штаммов 45, 58 и 65 NTHi (в опыте по
изучению перекрестной защиты) в дозах 0,3х109, 1,0х109 и 1,5х109 м.к. на
мышь, соответственно. Гибель мышей учитывали в течение 5 суток. По
окончании опыта рассчитывали среднюю иммунизирующую дозу ЕD50 по
формуле Ван дер Вардена.
Статистическую обработку проводили с помощью компьютерных
программ Microsoft Exel и Biostat и по методу Гланца [С. Гланц, 1998]. Данные
представлены как M±m. Различия рассматривались как значимые при p<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Выбор наиболее распространенных в популяции субтипов бескапсульных
штаммов Н.influenzae
Определение субтиповой принадлежности ЛОС 62 штаммов NTHi
проводили с помощью SDS-электрофореза в 15% ПААГ при окрашивании
азотнокислым серебром. Как мы и ожидали, демицеллированные молекулы
ЛОС находились в зоне низких молекулярных масс (<6,5 kDa), что совпадает с
данным литературы [X.X. Gu et al., 1995]. Оценку результатов проводили для
каждого из 62 исследованных препаратов по величине коэффициента
подвижности (Rf). Следует отметить, что в отличие от принятого расчета Rf,
мы делили расстояние до выявления пятен ЛОС на
расстояние пробега
апротинина – одного из компонентов калибровочной смеси с молекулярной
массой 6,5 kDa. Это обеспечивало хорошую воспроизводимость результатов.
По величине Rf выявлено 23 субтипа NTHi (табл. 1). Из них 10 (I-X)
были основными, их ЛОС проявлялись в виде одного электрофоретического
компонента с Rf от 1,01 до 1,11 (69,4%), остальные ЛОС (29,0%) были
гетерогенными и имели 2-3 основных компонента в различных сочетаниях.
12
Таблица 1
Субтипы ЛОС (по результатам электрофореза в ПААГ)
Rf относительно
№№ ЛОС штаммов NTHi
Всего, %±m
апротинина (6,5 kDa)
1,01
2
1,6±1,6
I
1,03
61
1,6±1,6
II
1,04
11, 84
3,2±2,2
III
1,05
10
1,6±1,6
IV
1,06
8, 36, 39, 41
6,4±3,1
V
1,07
1,
3,
7,
9,
12,
16,
17,
23,
24,
37,
47
17,7±4,8*
VI
1,08
21, 72
3,2±2,2
VII
1,09
26, 31, 34, 38, 49, 50, 51, 54
12,9±4,3*
VIII
1,10
18, 20, 35, 48, 86
8,1±3,5
IX
1,11
5, 28, 32, 33, 40, 45, 83, 87
12,9±4,3*
X
1,01; 1,07
53, 58
3,2±2,2
I-VI
1,01; 1,09
66, 67
3,2±2,2
I-VIII
1,01;
1,07;
1,09
59
1,6±1,6
I-VI-VIII
1,01; 1,08; 1,09
71
1,6±1,6
I-VII-VIII
1,03; 1,08
60
1,6±1,6
II-VII
1,03; 1,06; 1,08
55
1,6±1,6
II-V-VIII
1,04; 1,07
15
1,6±1,6
III-VI
1,04; 1,08
63, 64
3,2±2,2
III-VII
1,04; 1,11
52
1,6±1,6
III-X
1,05; 1,11
46
1,6±1,6
IV-X
1,06; 1,08
62, 69
3,2±2,2
V-VII
1,06; 1,09
65, 68
3,2±2,2
V-VIII
1,07; 1,09
70
1,6±1,6
VI-VIII
*Примечание. Различия достоверны (р<0,05) по сравнению с 3,2±2,2% и 1,6±1,6%. В
штамме № 6 NTHi низкомолекулярные компоненты не выявлены.
Субтип
Наличие
в
составе
одной
бактериальной
клетки
нескольких
отличающихся по подвижности ЛОС, вероятно, можно объяснить тем, что при
генетических изменениях, происходящих в процессе мутации штаммов, клетки
продолжают синтезировать ЛОС различной структуры.
Наиболее
распространенными
в
популяции
оказались
штаммы,
относящиеся к VI (17, 7%), VIII (12,9%) и X (12,9%) субтипам, а с учетом
наличия субтипов, включающих несколько основных, их удельный вес в
популяции составил 67,7%.
Для того чтобы установить, какие субтипы NTHi штаммов чаще всего
вызывают бронхолегочные заболевания, в ИФА анализировали уровень IgG-АТ
в сыворотках крови больных различными бронхолегочными заболеваниями и
здоровых доноров. Исследования показали, что к ЛОС 11 из 67 штаммов в
13
сыворотках больных бронхолегочными заболеваниями достоверно чаще, чем у
здоровых повышен уровень IgG-АТ (табл. 2).
Таблица 2
Частота выявления повышенного уровня IgG-антител к отдельным ЛОС NTHi у
клинически здоровых доноров и больных бронхолегочными заболеваниями
№№
п/п
Субтип
ЛОС
Частота повышенного уровня IgG-АТ (%)
штаммов
здоровые (n = 40)
больные БЛЗ (n = 42)
№№
1
X
5
2,5 ± 2,5
16,7 ± 5,7*
2
VI
23
2,5 ± 2,5
19,8 ± 6,0*
3
VIII
26
2,5 ± 2,5
16,7 ± 5,7*
4
н/о
44
2,5 ± 2,5
45,2 ± 7,7**
5
X
45
5,0 ± 3,4
35,7 ± 7,4*
6
VIII
54
2,5 ± 2,5
23,8 ± 6,6*
7
II-V-VIII
55
2,5 ± 2,5
26,2 ± 6,8*
8
I-VI
58
5,0 ± 3,4
54,8 ± 7,7**
9
V-VIII
65
2,5 ± 2,5
26,2 ± 6,8*
10
I-VIII
67
5,0 ± 3,4
19,8 ± 6,0*
11
I-VII-VIII
71
2,5 ± 2,5
21,4 ± 6,3*
Примечание. Достоверность различий по сравнению с клинически здоровыми
донорами: * р<0,05; ** р<0,01. Н/о – не определяли.
Полученные данные указывали на более выраженную иммуногенность
этих штаммов по сравнению с другими штаммами, принадлежащими к тем же
субтипам.
В ходе выполнения данного раздела исследований получены также
косвенные доказательства важной роли NTHi штаммов в возникновении ряда
бронхолегочных заболеваний, т.к. повышенные уровни IgG-АТ к ЛОС NTHi
обнаружены у 73,2% больных и только у 32,5% здоровых лиц. Свидетельством
частой смены субтипа возбудителя у больных бронхолегочными заболеваниями
служил факт определения повышенного уровня IgG-АТ (64,0% против 12,5% у
здоровых лиц) к ЛОС разных субтипов одновременно (табл. 3).
Полученные
результаты
позволили
выбрать
для
дальнейших
исследований группу из 4-х NTHi штаммов, которые относились к VI, VIII, Х
субтипам или имели признаки этих субтипов и к которым в сыворотках
больных наиболее часто определялся повышенный уровень IgG-антител
(№№45, 54, 58, 65).
14
Таблица 3
Сравнительная характеристика уровня IgG-АТ
к ЛОС NTHi у клинически здоровых доноров и больных бронхолегочными
заболеваниями
Частота выявления антител среди группы обследуемых
Число ЛОС NTHi,
к которым
больные БЛЗ (n = 56)
Здоровые
определяли IgGс высевом NTHi
без высева NTHi
(n = 40)
всего
антитела
(n = 25)
(n = 31)
0
67,5 ± 2,5
4,0 ± 3,9**
32,3 ± 8,4*
19,6 ± 5,5*
1
15,0 ± 5,6
16,0 ± 7,3
6,4 ± 4,4
10,7 ± 4,1
2–3
5,0 ± 3,4
16,0 ± 7,3
35,5 ± 8,6*
26,8 ± 5,2*
≥4
12,5 ± 5,2
64,0 ± 9,6*
25,8 ± 7,9
42,9 ± 6,6*
Примечание. Достоверность различий по сравнению с клинически здоровыми людьми
(* р < 0,05; ** р < 0,01).
Характеристика химических, физико-химических и иммунохимических
свойств углеводсодержащих препаратов Н.influenzae
В ходе подбора оптимального метода выделения и очистки ЛОС было
установлено, что наибольший выход препарата достигается экстракцией 0,1М
раствором NaCl с последующей его очисткой [Л.Д. Варбанец с соавт., 2006].
Эти препараты использовали для дальнейших исследований.
В химическом составе препаратов ЛОС преобладали углеводы (18,223,3)%. С помощью ГЖХ в них обнаружены высшие жирные кислоты (3гидроксикаприновая, миристиновая, 3-гидроксимиристиновая, пальмитиновая,
олеиновая
и
стеариновая),
что
соответствует
данным
литературы
о
жирнокислотном составе липида А [E.K.H.Schweda et al, 2003] .
КПС содержал 39,8% рибозы, незначительную примесь белка (0,9%) и
нуклеиновых кислот (1,2%) и проявлял свойства отрицательно заряженного
антигена в линейном электрофорезе и РИЭФ. В ГАП преобладали вещества
белковой природы (56,2-63,1)% (табл.4). В ГАП капсульного штамма
содержание углеводов было выше за счет присутствия в препарате КПС, что
подтверждено результатами РИЭФ, линейным электрофорезом и в реакции
преципитации в геле по Оухтерлони с гипериммунной кроличьей сывороткой к
Hib штамму.
15
КПС
Hib
в
реакции
преципитации
в
геле
по
Оухтерлони
с
гипериммунными сыворотками кроликов к гомологичному и гетерологичным
штаммам NTHi и Hib демонстрировал только серотиповую специфичность.
Наиболее выраженной специфической и перекрестной антигенной активностью
обладали ЛОС 45 NTHi (Х субтип),
ГАП1095 Hib и ГАП58 NTHi. ГАП
образовывали до 3-х дуг преципитации с гипериммунными сыворотками
кроликов.
Таблица 4
Химический состав и серологическая специфичность антигенных препаратов
Н.influenzae
Содержание, %
Название
препарата
ЛОС45NTHi1
3,2±0,3
нуклеиновые
кислоты
3,7±0,9
ЛОС54NTHi1
2,1±0,3
3,4±0,3
20,8±2,3
ЛОС58NTHi1
4,3±0,6
2,4±0,6
23,3±1,8
ЛОС65NTHi1
4,2±0,5
0,5±0,1*
18,2±1,3
КПС1095Hib
0,9±0,1*
1,2±0,3
39,8±2,3●*
ГАП1095Hib
56,2±3,3*
4,2±0,7
15,6±1,0
белок
углеводы
Серологическая специфичность
антигенов в реакции преципитации
по Оухтерлони
бескапсульные, №№
Hib1095
45
54
58
65
18,5±1,8
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
ГАП58NTHi
63,1±4,8*
3,1±0,9
6,4±0,7*
Примечание.
1
– жирнокислотный состав липида А ЛОС (3-гидроксикаприновая, миристиновая, 3гидроксимиристиновая, пальмитиновая, олеиновая и стеариновая кислоты);
● - содержание рибозы - основного компонента КПС Hib;
* - достоверность различий (р<0,05) по сравнению с ЛОС 45 NTHi.
С помощью электрофореза в 10% ПААГ (рис. 1) в составе обоих ГАП
были обнаружены электрофоретические компоненты с молекулярной массой
близкой к молекулярной массе известных белков наружной мембраны Р1, Р2 и
Р6 (М.м. 35-50; 36-42 и 16 kDa, соответственно).
16
Рис.1. Результаты SDS-электрофореза в 10% ПААГ гидроксиламиновых
препаратов H.influenzae в концентрациях 20 мг/мл.
Примечание. Окраска Coumassi Brilliant Blue R-250.
Изучение влияния различных детоксицирующих агентов на
жирнокислотный состав и токсичность липоолигосахаридов Н.influenzae
Известно, что ЛОС обладают высокой токсичностью, обусловленной
наличием высших жирных кислот в составе липида А [I.M. Helander et al.,
1988]. Учитывая данные о возможности использования солянокислого
гидроксиламина [Н.Е. Захарова, 2001] и безводного гидразина [X.X.Gu et al.,
1997, 2001] для детоксикации ЛПС, а также способность щелочных растворов
удалять ВЖК липида А, было решено сравнить эти методы и оценить
значимость гидроксиламина в детоксикации ЛОС 45 NTHi. Для этого в единых
условиях эксперимента (370С, 2 часа) на ЛОС воздействовали тремя
реагентами: БГ, ГА и NaOH. В результате были получены препараты
детоксицированного ЛОС (дЛОС). Изучение в сравнительном аспекте
жирнокислотного
состава
исходного
ЛОС
и
его
детоксицированных
производных с помощью ГЖХ показало, что полученные препараты в процессе
детоксикации утратили часть ВЖК.
17
Как видно из табл. 5, обработка исходного препарата БГ и ГА привела к
удалению 4-х из 6-ти ВЖК, за исключением 3-гидроксимиристиновой и
пальмитиновой в первом случае, и миристиновой и пальмитиновой кислот во
втором случае, что может объяснять более выраженную детоксицирующую
активность БГ и солянокислого ГА, по сравнению с раствором гидроксида
натрия, воздействие которым привело к удалению из препарата только
олеиновой и стеариновой кислот. Таким образом, было показано, что механизм
детоксикации ЛОС использованными реагентами различен.
Таблица 5
Токсичность детоксицированных производных препарата ЛОС 45 NTHi и
относительное содержание высших жирных кислот в них
Относительное содержание высших жирных кислот
Препарат
3-гидроксикаприновая
Миристиновая
3-гидроксимиристиновая
Пальмитиновая
Олеиновая
Стеариновая
ЛОС
45NTHi
0,15
0,30
0,35
1
0,23
0,18
дЛОС БГ
-
-
7,43
1
-
-
дЛОС ГА
-
0,15
-
1
-
-
дЛОС NaOH
0,59
0,38
0,86
1
-
-
н/о
н/о
н/о
н/о
Очищенный
н/о
н/о
ЛПСE.Coli055
Примечание. Н/о – не определяли.
Для изучения степени
LD50
(мкг)
0,06
(0,05÷0,08)
1,99
(1,58÷2,51)
1,58
(1,25÷1,99)
0,79
(0,59÷1,05)
0,16
(0,12÷0,21)
влияния использованных детоксицирующих
агентов на токсичность ЛОС были проведены опыты на мышах. Установлено,
что наибольшей токсичностью обладает исходный ЛОС не подвергавшийся
детоксикации (LD50=0,063мкг) (табл. 5). Его токсичность в 2,5 раза выше
токсичности препарата положительного контроля (E.coli 055). Токсичность
ЛОС, детоксицированнго с помощью щелочи была ниже (LD50=0,79мкг).
Наименее токсичными были препараты дЛОСБГ и дЛОС
ГА
(LD50=1,99мкг и
1,58мкг, соответственно). Их токсичность достоверно не отличалась. Это
позволяет
рекомендовать
более
гидроксиламина в качестве
широкое
использование
солянокислого
детоксицирующего агента. В дальнейших
18
исследованиях был использован дЛОСГА, полученный в результате воздействия
солянокислым гидроксиламином.
Таким образом, для выполнения основной задачи исследования было
получено и охарактеризовано пять препаратов: ГАП 1095 Hib, ГАП 58 NTHi,
КПС 1095 Hib, ЛОС 45 и дЛОСГА 45 NTHi, которые были дополнены двумя
препаратами, представляющими собой смеси КПС 1095 Hib с ЛОС 45 и КПС
1095 Hib с дЛОСГА 45 NTHi. В опытах на животных изучали влияние указанных
препаратов на активацию врожденного и адаптивного иммунного ответа.
Изучение иммунобиологических свойств антигенных препаратов
Н.influenzae
При
изучении
поглотительной
способности
нейтрофилов
мышей
показано, что через 4 часа все препараты стимулировали фагоцитарную
активность, однако максимальные индексы активации нейтрофилов были
получены при введении дЛОС 45, а также смесей КПС 1095 Hib с ЛОС 45 и с
дЛОС 45 (табл. 6).
Таблица 6
Влияние препаратов H.influenzae на показатели фагоцитарного индекса
№
1
2
3
4
5
6
7
8
Фагоцитарный индекс (%)
Доза мкг/
мышь
4 часа
24 часа
48 часов
КПС 1095 Hib
10
0,36 ±0,04*
0,25±0,06*
0,35±0,03
ГАП 1095 Hib
100
0,27 ±0,07*
0,72±0,14*
0,65±0,04*
ГАП 58 NTHi
100
0,3 ±0,06*
0,63±0,17*
0,57±0,07*
ЛОС 45 NTHi
10
0,34 ±0,07*
0,36±0,08*
0,55±0,13*
дЛОС 45 NTHi
10
0,47 ±0,06*
0,48±0,08*
0,46±0,14
КПС 1095 Hib +ЛОС 45
10+10
0,46 ±0,1*
0,5±0,14*
0,74±0,22*
КПС 1095 Hib +дЛОС 45
10+10
0,47 ±0,11*
0,26±0,04*
0,69±0,17*
Контроль
0,09 ±0,01
0,15±0,05
0,37±0,12
Примечание. * - указана достоверность различий (р<0,05) по сравнению с контролем.
Название препарата
Через 24 часа пика достигали фагоцитарные показатели при введении
препаратов ГАП Hib и NTHi. Через 48 часов пики поглотительной способности
были отмечены в группах, где вводили ГАП 1095 Hib, а так же смеси
препаратов КПС 1095 Hib с ЛОС 45 и КПС 1095 Hib с дЛОС 45. При этом
19
максимальные значения фагоцитарных индексов снова были у смесей
препаратов.
При изучении динамики продукции цитокинов установлено, что КПС и
смесь КПС с ЛОС и дЛОС NTHi приводили к достоверному увеличению
содержания большинства исследованных цитокинов (табл. 7).
Таблица 7
Динамика** продукции цитокинов при введении препаратов H.influenzae
Время
Кратность увеличения уровня цитокинов в сыворотке крови мышей по
после
сравнению с интактными животными
Препаиммурат
IL-4
IL-5
IL-6
GM-CSF
IL-10
IL-17
TNFα
IFNγ
низа- IL-1а IL-2
ции
4ч
7*
8
19*
6
13*
11*
0
3
19*
6
КПС
Hib
8ч
3
3
26*
7
4
8
3
8*
9
7*
1095
24ч
2
2
32*
2
0
2
4*
2
3
8*
4ч
6
2
2
4
2
2
0
0
9
5
ГАП
Hib
8ч
3
2
2
5
0
0
2
0
4
6*
1095
24ч
2
0
0
0
0
0
3
0
2
7*
4ч
5
0
3
3
4
2
2
0
4
5,6
ГАП
58
8ч
2
3
2
6
2
2
2
0
3
4
NTHi
24ч
0
3
0
2
0
0
3
0
2
5
4ч
5
0
13
6
9,7
3
2
0
4
7*
ЛОС
45
8ч
3
0
15
4
4
2
3
0
3
9*
NTHi
24ч
0
0
8
2
2
0
2
0
0
8*
4ч
5
4
25*
7
4
5
2
0
8
5
дЛОС
45
8ч
2
0
27*
5
2
2
3
0
4
6*
NTHi
24ч
2
2
20*
8
0
0
3
0
7
7*
4ч
8*
12*
14
13* 18*
12*
2
4
22*
7*
КПС
1095+
8ч
2
5
12
14*
6
7
3*
8*
11
8*
ЛОС45
24ч
2
2
14
4
2
2
3*
3
2
5
4ч
10*
15*
17*
14*
17*
12*
2
9*
20*
6*
КПС
1095+
8ч
4
4
13
13
7
6
3
5
8
8*
дЛОС45
24ч
2
2
17*
5
3
2
2
2
2
9*
Примечание.* - достоверно по сравнению с контролем; ** кратность отношения
концентрации (пг/мл) цитокинов в опыте к данным в контроле (р<0,05); 0 – достоверных
различий между опытом и контролем нет.
Смесь КПС с дЛОСГА была более мощным активатором продукции
цитокинов, чем другие препараты. Полученные данные свидетельствуют о
значительном влиянии КПС Hib в смеси на активацию врожденного
иммунитета. Препараты ГАП и ЛОС не влияли на продукцию ИЛ-17 и
оказывали слабое воздействие на синтез ИЛ-2.
20
Исследование экспрессии поверхностных маркеров МЛ селезенок
мышей (табл. 8) показало, что большинство препаратов не вызывало
существенного изменения фенотипа, активируя в основном CD25 (КПС Hib,
ГАП, ЛОС и дЛОС
ГА
NTHi), CD19 (ЛОС и дЛОСГА NTHi) и МНС II (все
препараты).
Отсутствие экспрессии поверхностных маркеров МЛ под действием
ГАП, очевидно, связано с недостаточной иммунизирующей дозой. Наиболее
заметную активацию врожденного иммунитета демонстрировали смеси КПС с
ЛОС и КПС с дЛОСГА (в большей степени), что проявлялось достоверным
увеличением значений всех исследованных показателей.
Изучение протективной активности углеводсодержащих препаратов
показало, что у животных, иммунизированных большинством указанных
препаратов, формируется специфический серотиповой (против Hib штамма) и
видовой (против NTHi штаммов) иммунный ответ (табл. 9). Так, все
препараты, содержащие КПС (КПС, ГАП Hib, смеси КПС и ЛОС), защищали
50% животных при введении небольших доз антигенов при заражении
летальной дозой капсульного штамма (ЕD50=0,32-1,26мкг).
Исключение составил ГАП NTHi (ЕD50=5,0мкг). При этом ни КПС, ни
ГАП Hib не обладали защитным эффектом в отношении NTHi штаммов.
Высокой перекрестной протективной активностью обладали препараты ЛОС
и их смесь с КПС. Исследования показали, что, дЛОС
ГА
в составе смеси
усиливает протективные свойства КПС (ЕD50=0,32мкг против 1,26мкг).
21
Таблица 8
Действие различных препаратов H.influenzae на субпопуляционную структуру МЛ селезенок мышей
Назв.
препарата
Содержание клеток, экспрессирующих поверхностные маркеры, (Мm ), %
CD 3
СD4
СD8
СD19
NK
СD3/
NK
СD25
СD4/
СD25
МНСII
КПС 1095 Hib
20,6±1,4
12,2±1,0
11,4±1,5
22,5±1,7
15,5±1,3
2,3±0,2
3,7±0,1*
1,3±0,3
31,9±3,9*
ГАП 1095 Hib
21,2±1,9
13,1±1,1
12,9±1,5
19,6±1,5
12,0±1,0
1,7±0,2
2,4±0,2
0,7±0,1
27,0±1,6*
ГАП 58 NTHi
18,9±2,5
9,9±0,8
8,7±0,7
18,9±1,7
11,1±0,7
1,4±0,1
3,5±0,2*
0,5±0,1
20,7±1,3*
ЛОС 45 NTHi
20,7±1,1
9,2±1,2
8,7±0,7
24,0±1,9*
11,7±0,7
1,6±0,1
3,0±0,2*
1,3±0,3*
21,4±1,3*
дЛОС 45 NTHi
20,3±1,0
10,5±1,6
10,9±0,9
29,2±1,1*
12,6±0,9
1,5±0,2
3,9±0,3*
1,6±0,2*
23,1±2,0*
22,6±1,2*
14,8±1,4*
13,6±1,0*
29,9±1,4*
16,8±1,4*
2,8±0,4*
4,0±0,2*
1,9±0,3*
33,4±1,9*
26,8±1,2*
17,9±2,0*
14,4±1,4*
35,3±1,5*
17,4±1,7*
3,4±0,2*
4,5±0,3*
2,8±0,3*
32,3±2,5*
18,2±1,1
9,6±0,9
9,2±0,9
16,9±1,7
11,3±1,9
1,6±0,2
2,7±0,2
0,5±0,1
14,3±0,9
КПС 1095 Hib
+ЛОС 45 NTHi
КПС 1095 Hib
+дЛОС45
NTHi
Контроль
Примечание. *Различия достоверны (р < 0,05) по сравнению с контролем.
22
Таблица 9
Протективная активность и токсичность препаратов H.influenzae
ED50 (мкг)при заражении штаммами
Название АГ
1095 Hib
1,26
(0,9÷1,8)
0,8
(0,5÷1,26)
5,0
(2,9÷8,7)
45 NTHi
58 NTHi
LD50 (мкг)
65 NTHi
1,58
(0,85÷2,95) *
100
79,4
125,9
0,46
ГАП 1095Hib
(64,6÷154,9) * (41,7÷51,3)* (83,2÷190,5) * (0,25÷0,85) *
1,0
0,63
0,63
0,40
ГАП 58NTHi
(0,5÷2,1) *
(0,33÷1,2) *
(0,33÷1,2)
(0,22÷0,72) *
0,05
0,13
0,2
0,04
ЛОС 45NTHi
н/о
(0,03÷0,076)
(0,07÷0,24)
(0,1÷0,38)
(0,023÷0,07)
0,2
0,2
0,13
1,28 *
дЛОС 45NTHi
н/о
(0,1÷0,38)
(0,09÷0,43)
(0,07÷0,24)
(0,46÷1,57)
КПС1095
1,26
0,05
0,13
0,2
0,04
+ЛОС 45
(0,8÷2,0)
(0,03÷0,076)
(0,07÷0,24)
(0,1÷0,4)
(0,023÷0,069)
КПС1095
0,32
0,13
0,2
0,08
1,26 *
+дЛОС 45
(0,2÷0,5)
(0,07÷0,2)
(0,09÷0,43)
(0,05÷0,13)
(0,68÷2,34)
Примечание. * - Различия достоверны (р < 0,05) по сравнению с ЛОС 45 NTHi.
КПС 1095 Hib
>10,0*
>10,0*
>10,0*
Помимо высокой иммуногенности, препараты очищенного КПС и его
смеси с дЛОСГА обладали низкой токсичностью (табл.9), что, учитывая
повышенную
способность
к
активации
врожденного
и
адаптивного
иммунитета, делает его перспективным для разработки вакцины, направленной
на защиту от инфекций, вызываемых наиболее распространенными в
популяции капсульными и бескапсульными штаммами H.influenzae.
ВЫВОДЫ
1. Бескапсульные штаммы H.influenzae, циркулирующие на территории
Москвы, по структуре ЛОС относятся к 10 основным субтипам, наиболее
распространенными из которых являются VI, VIII и X.
2. Сыворотки больных бронхолегочными заболеваниями достоверно
чаще, чем сыворотки клинически здоровых людей содержат повышенный
уровень
IgG-антител
к
ЛОС
NTHi
(что
доказывает
важную
роль
бескапсульных штаммов в инициации заболеваний).
3. Сыворотки больных бронхолегочными заболеваниями достоверно
чаще, чем сыворотки клинически здоровых доноров, содержат повышенный
23
уровень IgG-антител к ЛОС разных субтипов, что свидетельствует о частой
смене субтипа возбудителя.
4. В сыворотках больных бронхолегочными заболеваниями, достоверно
чаще, чем у клинически здоровых доноров определяется повышенный
уровень антител к 11 бескапсульным штаммам H.influenzae, относящимся к
VI, VIII и X субтипам.
5. Установлено, что 3 группы антигенов, полученных из капсульного
(1095) и бескапсульных (45, 54, 58 и 65) штаммов H.influenzae, различны по
химическому составу. В иммунохимических реакциях КПС Hib проявляет
серотиповую специфичность; ГАП Hib и NTHi – серотиповую и видовую
специфичность; ЛОС
NTHi - внутривидовую специфичность, причем
наибольшей перекрестной серологической активностью обладает ЛОС
штамма 45 NTHi (Х субтип).
6. Детоксикация ЛОС 1% раствором гидроксиламингидрохлорида
приводит к удалению 4-х из 6-ти ВЖК липида А и 25-кратному снижению
токсичности по сравнению с нативным препаратом ЛОС.
7. Установлено, что при испытанных дозах и схемах иммунизации КПС
Hib, ГАП капсульного и бескапсульного штаммов и ЛОС H.influenzae
вызывают активацию эффекторов системы врожденного иммунитета, что
проявляется в повышении фагоцитарной активности лейкоцитов мышей,
продукции провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, при
этом смеси КПС Hib с ЛОС и КПС Hib с дЛОС 45NTHi обладают наиболее
высокой стимулирующей активностью.
8. Смесь КПС Hib с ЛОС и дЛОС45ГА NTHi вызывает у мышей
повышение количества клеток, экспрессирующих поверхностные маркеры
(CD4, CD25, CD4/CD25, CD19, MHCII) в большей степени, чем введение
монопрепаратов.
9. Смесь КПС Hib с дЛОС45ГА NTHi обладает более высокой
протективной активностью при заражении вирулентным капсульным
штаммом H.influenzae типа b по сравнению с монопрепаратами ГАП и КПС
24
Hib. Наиболее выраженной внутривидовой перекрестной протективной
активностью обладают ГАП NTHi, ЛОС и дЛОС45ГА NTHi, а также смеси
КПС Hib с ЛОС 45 NTHi и КПС Hib с дЛОС45ГА NTHi.
10. Способность смеси КПС 1095 Hib с дЛОС45ГА NTHi к активации
систем врожденного и адаптивного иммунитета позволяет рекомендовать эту
комбинацию в качестве основы для создания вакцины для профилактики
инфекций,
вызываемых
капсульными
и
бескапсульными
штаммами
H.influenzae.
Список научных работ, опубликованных по теме диссертации
Новикова О.В. = Головинская О.В.
1. О.В. Новикова. Иммунный ответ на липоолигосахариды Haemophilus
influenzae у людей больных различными бронхолегочными заболеваниями /
О.В. Новикова, Н.Е. Ястребова, Н.П. Ванеева, О.Е. Орлова, Н.Г. Калина,
С.И.Елкина,
Л.К.
Катосова,
Н.Н.
Овечко
//
Эпидемиология
и
вакцинопрофилактика. – 2009. – №3 (46). – С.51-55;
2. О.В. Новикова. Влияние различных детоксицирующих реагентов на
свойства ЛОС Haemophilus influenzae / О.В. Новикова, Н.П. Ванеева,
С.И.Елкина, Н.Г. Калина, М.М. Токарская, Н.Е. Ястребова, О.Е. Орлова //
Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2009. - №5.
– С.43-46;
3. Ю.С. Шевчик. Действие белка теплового шока на иммуногенную
активность капсульного полисахарида Haemophilus influenzae типа b /
Ю.С.Шевчик, О.В. Новикова, Н.К. Ахматова, П.Г. Свешников, Н.Е. Ястребова,
Е.А. Курбатова // «Дни иммунологии в С.-Петербурге». Медицинская
иммунология. – 2009. – Т.11. - №4-5. – С.340-341.
4. Н.П. Ванеева. Субтипирование липоолигосахаридов бескапсульных
штаммов Haemophilus influenzae, выделенных от детей с бронхолегочными
заболеваниями / Н.П. Ванеева, О.В. Новикова , О.Е. Орлова, Н.Г. Калина, С.И.
25
Елкина, М.М. Токарская, Л.К. Катосова // Журнал микробиологии,
эпидемиологии и иммунобиологии. – 2010. -№6.-С.93-95;
5. О.В. Новикова. Иммунобиологические свойства углеводсодержащих
препаратов
Haemophilus
influenzae
/
О.В.
Новикова,
Н.Г.
Калина,
Н.П.Ванеева, С.И. Елкина, М.М. Токарская, Н.Е. Ястребова // Журнал
микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2010. - №6. – С.9598.
СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АТ
БГ
БЛЗ
ВЖК
ГА
ГАП
ГЖХ
дЛОС БГ
дЛОС ГА
дЛОС NaOH
ИФА
КПС
ЛОС
ЛПС
М.к.
М.м.
МЛ
ОП
ПААГ
РИЭФ
ХИБ (Hib)
ХОБЛ
ЯМР
CD
TNFα
IL
МНС
NTHi
антитело
безводный гидразин
бронхолегочные заболевания
высшая жирная кислота
гидроксиламин
гидроксиламиновый препарат
газожидкостная хроматография
липоолигосахарид, детокс. безводным гидразином
липоолигосахарид, детоксицированный гидроксиламином
липоолигосахарид, детоксицированный гидроксидом натрия
иммуноферментный анализ
капсульный полисахарид
липоолигосахарид
липополисахарид
микробные клетки
молекулярная масса
мононуклеарный лейкоцит
оптическая плотность
полиакриламидный гель
ракетный иммунный электрофорез
Hаemophilus influenzae тип b
хроническая обструктивная болезнь легких
ядерный магнитный резонанс
Сluster of differenciation (кластер дифференцировки)
Tumor necrosis factor α (Фактор некроза опухоли α)
Интерлейкин
Major histocompatibility complex (главный комплекс
гистисовместимости)
Nontypable
Hаemophilus
influenzae
(нетипируемый
(бескапсульный) штамм гемофильной палочки)
26