ÓÄÊ 577.352.3 ÖÈÒÎÒÎÊÑÈ×ÅÑÊÎÅ ÄÅÉÑÒÂÈÅ ÊÎÐÎÒÊÎÖÅÏÎ×Å×ÍÛÕ ÏÐÎÈÇÂÎÄÍÛÕ ÂÈÒÀÌÈÍÀ Å ÍÀ ÒÈÌÎÖÈÒÛ ÊÐÛÑÛ Ã. Â. ÏÅÒÐÎÂÀ, Ã. Â. ÄÎÍ×ÅÍÊÎ Èíñòèòóò áèîõèìèè èì. À. Â. Ïàëëàäèíà ÍÀÍ Óêðàèíû, Êèåâ; e-mail: petrova@biochem.kiev.ua Óñòàíîâëåíî, ùî α-òîêîôåðîë, α-òîêîôåðèëàöåòàò ³ òîêîôåðèëõ³íîí ç óêîðî÷åíèìè äî 6 àòîì³â âóãëåöþ á³÷íèìè ëàíöþãàìè äîçîçàëåæíî ³íã³áóþòü æèòòºçäàòí³ñòü ïåðâèííî¿ êóëüòóðè òèìîöèò³â ùóð³â. ³äñóòí³ñòü ì³æíóêëåîñîìíî¿ äåãðàäàö³¿ ÄÍÊ õðîìàòèíó ïîðÿä ç âèõîäîì ³ç êë³òèí öèòîçîëüíî¿ ëàêòàòäåã³äðîãåíàçè ñâ³ä÷èòü ïðî íåêðîòè÷íèé øëÿõ çàãèáåë³ òèìîöèò³â. Âèõ³ä ³ç êë³òèí êèñëî¿ ôîñôàòàçè – ìàðêåðíîãî ôåðìåíòó ë³çîñîì ï³äòâåðäæóº äåñòàá³ë³çàö³þ äîñë³äæóâàíèìè ðå÷îâèíàìè ë³çîñîìíî¿ ìåìáðàíè. Çàïðîïîíîâàíî ìîæëèâèé ìåõàí³çì öèòîòîêñè÷íî¿ ä³¿ êîðîòêîëàíöþãîâèõ àíàëîã³â â³òàì³íó Å â êóëüòóðàõ êë³òèí, à ñàìå: ¿õíÿ ï³äâèùåíà ïðîíèêí³ñòü ÷åðåç ïëàçìàòè÷íó ìåìáðàíó äîçâîëÿº ñòâîðèòè â ñåðåäèí³ êë³òèíè êîíöåíòðàö³þ, ÿêà äîñòàòíÿ äëÿ äåòåðãåíòïîä³áíî¿ äåñòàá³ë³çàö³¿ ìåìáðàí ë³çîñîì, ùî ïðèçâîäèòü äî âèõîäó â öèòîçîëü ë³çîñîìíèõ ôåðìåíò³â ³ çàãèáåë³ êë³òèíè øëÿõîì íåêðîçó. Ê ë þ ÷ î â ³ ñ ë î â à: êîðîòêîëàíöþãîâ³ àíàëîãè â³òàì³íó Å, àïîïòîç, íåêðîç, òèìîöèòè, ë³çîñîìè. È çâåñòíî, ÷òî ïðèðîäíûé âèòàìèí Å ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé ñìåñü ðàçëè÷íûõ ïðîèçâîäíûõ òîêîôåðîëà, ñðåäè êîòîðûõ íàèáîëüøåé áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòüþ, òðàäèöèîííî îïðåäåëÿåìîé â òåñòå íà ïðåäîòâðàùåíèå ðåçîðáöèè ïëîäà ó êðûñ [1], îáëàäàåò α-òîêîôåðîë.  ñâÿçè ñ ýòèì áèîëîãè÷åñêèå ôóíêöèè ìèíîðíûõ êîìïîíåíòîâ âèòàìèíà Å – β-, γ- è δ-òîêîôåðîëîâ, ñîîòâåòñòâóþùèõ òîêîòðèåíîëîâ, à òàêæå ïðîäóêòîâ èõ ìåòàáîëèçìà, äîëãîå âðåìÿ îñòàâàëèñü âíå ïîëÿ çðåíèÿ èññëåäîâàòåëåé. Îäíàêî äàííûå ëèòåðàòóðû ïîñëåäíèõ ëåò ñâèäåòåëüñòâóþò î òîì, ÷òî ìèíîðíûå êîìïîíåíòû âèòàìèíà Å, íå îáëàäàþùèå èëè îáëàäàþùèå ìåíüøåé ïî ñðàâíåíèþ ñ α-òîêîôåðîëîì áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòüþ, ÿâëÿþòñÿ áîëåå ýôôåêòèâíûìè â ïëàíå ïðîòèâîâîñïàëèòåëüíûõ, àíòèíåîïëàñòè÷åñêèõ è ïðîòèâîîïóõîëåâûõ ôóíêöèé [2]. Îñîáîå çíà÷åíèå äàííîå îáñòîÿòåëüñòâî ïðèîáðåëî ïîñëå îáíàðóæåíèÿ ó÷àñòèÿ âèòàìèíà Å â ðåãóëÿöèè çàïðîãðàììèðîâàííîé êëåòî÷íîé ãèáåëè – àïîïòîçå. Óñòàíîâëåíî, ÷òî α-òîêîôåðîë ñïîñîáåí èíãèáèðîâàòü ãèáåëü êëåòîê, èíäóöèðîâàííóþ ðàçëè÷íûìè ïðîàïîïòè÷åñêèìè ôàêòîðàìè, ÷òî ïîçâîëÿåò îòíåñòè åãî ê ðÿäó àíòèàïîïòè÷åñêèõ àãåíòîâ [3].  òî æå âðåìÿ ñèíòåòè÷åñêèå àíàëîãè è ïðèðîäíûå ìåòàáîëèòû âèòàìèíà Å îáëàäàþò öèòîòîêñè÷åñêèìè ñâîéñòâàìè è ñïîñîáíû âûçûâàòü êàê àïîïòè÷åñêóþ, òàê è íåêðîòè÷åñêóþ ãèáåëü êëåòîê. Òàê, ýôèðíûå ïðîèçâîäíûå α-òîêîôåðîëà (òîêîôåðèëñóêöèíàò, òîêîôåðèëîêñàëàò, íåãèäðîëèçóåìîå ïðîèçâîäíîå àöåòàòà) âûçûâà- þò àïîïòè÷åñêóþ ãèáåëü ðàçëè÷íûõ êëåòî÷íûõ êóëüòóð [4,5]. Âûðàæåííûìè öèòîòîêñè÷åñêèìè ñâîéñòâàìè îáëàäàþò β-, γ-, δ-òîêîôåðîëû è ñîîòâåòñòâóþùèå èì òîêîòðèåíîëû [6]. Èçâåñòíî, ÷òî â ïðîöåññå äåãðàäàöèè â êëåòêå áîêîâàÿ öåïü òîêîôåðîëîâ ïîäâåðãàåòñÿ ïîñëåäîâàòåëüíî ω- è β-îêèñëåíèþ [7], â ðåçóëüòàòå ÷åãî, î÷åâèäíî, â êëåòêå ïîñòîÿííî ïðèñóòñòâóþò ìåòàáîëèòû ñ ðàçëè÷íîé äëèíîé áîêîâîé öåïè. Óñòàíîâëåíî, ÷òî ñèíòåòè÷åñêèå ïðîèçâîäíûå α-òîêîôåðîëà ñ óêîðî÷åííîé äî 6 è 1 àòîìîâ óãëåðîäà áîêîâîé öåïüþ ïðàêòè÷åñêè ïîëíîñòüþ èíãèáèðóþò ðîñò êóëüòóð êëåòîê îñòðîé ëåéêåìèè ÑÅÌ-Ñ-1 è ýïèòåëèîèäíîé êàðöèíîìû HeLa – S3K [8], îäíàêî ìåõàíèçìû äàííîãî ôåíîìåíà íå èññëåäîâàíû.  ñâÿçè ñ ýòèì öåëüþ íàñòîÿùåé ðàáîòû áûëî èçó÷åíèå öèòîòîêñè÷åñêîãî äåéñòâèÿ òðåõ ïðîèçâîäíûõ α-òîêîôåðîëà ñ óêîðî÷åííîé äî 6 àòîìîâ óãëåðîäà áîêîâîé öåïüþ – α-òîêîôåðèëàöåòàòà (ÒÀö-Ñ6), α-òîêîôåðîëà (ÒÔ-Ñ6) è òîêîôåðèëõèíîíà (ÒÕ-Ñ6) íà òèìîöèòû êðûñû. Ðåàêòèâû.  ðàáîòå èñïîëüçîâàëè ÌÒÒ (3-[4,5-äèìåòèëòèàçîë-2-èë]-2,5-äèôåíèë-òåòðàçîëèé áðîìèä), 4-íèòðî-ôåíèëôîñôàò, NAD+, àãàðîçó äëÿ ýëåêòðîôîðåçà, ïðîòåèíàçó Ê («Sigma», ÑØÀ), ñðåäó RPMI-1640, HEPES («Serva», ÑØÀ). Îñòàëüíûå ðåàêòèâû áûëè îòå÷åñòâåííîãî ïðîèçâîäñòâà ñ êâàëèôèêàöèåé õ. ÷. è ÷. ä. à. α-Òîêîôåðîë, α-òîêîôåðèëàöåòàò è òîêîôåðèëõèíîí ñ óêîðî÷åííûìè äî 6 àòîìîâ óãëåðîäà ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2005, ò. 77, ¹ 4 77 Ìàòåðèàëû è ìåòîäû ÅÊÑÏÅÐÈÌÅÍÒÀËÜͲ ÐÎÁÎÒÈ áîêîâûìè öåïÿìè áûëè ñèíòåçèðîâàíû â Èíñòèòóòå îðãàíè÷åñêîé õèìèè ÍÀÍ Óêðàèíû. Ïðåïàðàòû ïðåäâàðèòåëüíî ïîäâåðãàëè î÷èñòêå ñ ïîìîùüþ òîíêîñëîéíîé õðîìàòîãðàôèè íà ñèëèêàãåëå â ñèñòåìå ãåêñàí: äèýòèëîâûé ýôèð (70 : 30). Ðàáîòà ïðîâîäèëàñü íà áåëûõ êðûñàõ-ñàìêàõ 3-ìåñÿ÷íîãî âîçðàñòà ñ ìàññîé òåëà 100–150 ã. Ïîëó÷åíèå òèìîöèòîâ è ïîäñ÷åò êîëè÷åñòâà êëåòîê ïî èñêëþ÷åíèþ òðèïàíîâîãî ñèíåãî ïðîâîäèëè êàê îïèñàíî ðàíåå [9]. Èíêóáàöèÿ êëåòîê. Îêîëî 2 ⋅ 106 êëåòîê ðåñóñïåíäèðîâàëè â 1 ìë ñðåäû RPMI-1640, ñîäåðæàùåé 10 ìÌ HEPES-NaOH áóôåð, ðÍ 7,3; 0,1% ÁÑÀ, 100 U/ìë ïåíèöèëëèíà, 100 ìêã/ìë ñòðåïòîìèöèíà è 50 ìêÌ β-ìåðêàïòîýòàíîë. Èññëåäóåìûå àíàëîãè òîêîôåðîëà äîáàâëÿëè èç ìàòî÷íûõ ñïèðòîâûõ ðàñòâîðîâ, ïðåäâàðèòåëüíî ðàçâåäåííûõ ñðåäîé èíêóáàöèè. Êîíå÷íàÿ êîíöåíòðàöèÿ ýòàíîëà â ñðåäå íå ïðåâûøàëà 0,1%. Êëåòêè èíêóáèðîâàëè ïðè 37 °Ñ 18 ÷, ïîñëå ÷åãî îñàæäàëè öåíòðèôóãèðîâàíèåì (200 g, 5 ìèí) è îòìûâàëè 1 ìë PBS (136,9 ìÌ NaCl, 2,7 ìÌ KCl, 8,1 ìÌ Na2HPO4, 1,5 ìÌ KH2PO4, ðÍ 7,2). Îöåíêó æèçíåñïîñîáíîñòè êëåòîê ïðîâîäèëè ñ èñïîëüçîâàíèåì ÌÒÒ-òåñòà. Ïðèíöèï ìåòîäà îñíîâàí íà ñïîñîáíîñòè ìåòàáîëè÷åñêè àêòèâíûõ êëåòîê ïðåâðàùàòü âîäîðàñòâîðèìûé ÌÒÒ (3-[4,5-äèìåòèëòèàçîë-2-èë]-2,5-äèôåíèë-òåòðàçîëèé áðîìèä) â îêðàøåííûé íåðàñòâîðèìûé â âîäå ôîðìàçàí. Ðåàêöèþ ïðîâîäèëè â 96-ëóíî÷íûõ ïëàíøåòàõ. Îêîëî 300 òûñ. êëåòîê èíêóáèðîâàëè 18 ÷ â 200 ìêë ñðåäû êàê îïèñàíî âûøå. Ïëàíøåòû öåíòðèôóãèðîâàëè ïðè 200 g 5 ìèí, íàäîñàäî÷íóþ æèäêîñòü óäàëÿëè. Ê îñàäêó êëåòîê äîáàâëÿëè 90 ìêë ñâåæåé ñðåäû èíêóáàöèè è 10 ìêë ðàñòâîðà ÌÒÒ (èñõîäíàÿ êîíöåíòðàöèÿ 5ìã/ìë â PBS). Ïîñëå èíêóáàöèè â òå÷åíèå 1,5 ÷ ïðè 37 °Ñ, îáðàçîâàâøèéñÿ ôîðìàçàí îñàæäàëè öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 400 g â òå÷åíèå 10 ìèí è îòìûâàëè â àíàëîãè÷íûõ óñëîâèÿõ 200 ìêë PBS. Îñàäêè ïîäñóøèâàëè â òå÷åíèå íî÷è â òåìíîòå, äîáàâëÿëè 150 ìêë äèìåòèëñóëüôîêñèäà è îïðåäåëÿëè ïîãëîùåíèå ïðè 570 íì. Çà 100% ïðèíèìàëè êîëè÷åñòâî ôîðìàçàíà, îáðàçîâàâøåãîñÿ â àëèêâîòå ñâåæåâûäåëåííûõ èíòàêòíûõ òèìîöèòîâ. Ýêñòðàêöèþ ôðàãìåíòèðîâàííîé ÄÍÊ ïðîâîäèëè ñîãëàñíî ìåòîäó, îïèñàííîìó â ðàáîòå [10], ñ ìîäèôèêàöèÿìè. Îêîëî 2 ìëí. êëåòîê èíêóáèðîâàëè â 1 ìë ñðåäû êàê îïèñàíî âûøå, êëåòêè îñàæäàëè è ïðîìûâàëè 1 ìë PBS. Ê îñàäêó êëåòîê äîáàâëÿëè 300 ìêë 20 ìÌ Tris-HCl-áóôåðà, ðÍ 8,0, ñîäåðæàùåãî 10 ìÌ ÝÄÒÀ è 0,2%-é òðèòîí Õ-100. Ïîñëå ýêñòðàêöèè â òå÷åíèå 5 ìèí ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå ïðîáû öåíòðèôóãèðîâàëè 15 ìèí ïðè 12 000 g è â íàäîñàäî÷íîé æèäêîñòè ïðîâîäèëè êà÷åñòâåííóþ èäåíòèôèêàöèþ ìåæíóêëåîñîìíûõ ôðàãìåíòîâ ÄÍÊ ñ ïîìîùüþ ýëåêòðîôîðåçà â 1%-ûõ ãåëÿõ àãàðîçû ñîãëàñíî ïðîöåäóðå, îïèñàííîé â ðàáîòå [11]. ÄÍÊ èç ýêñòðàêòà êëåòîê òðèòîíîì Õ-100 îñàæäàëè ýòàíîëîì, èíêóáèðîâàëè ïðè 37 °Ñ 2 ÷àñ ñ 0,5 ìã/ìë ÐÍÊ-àçû À, ñâîáîäíîé îò ÄÍÊ-àç, à çàòåì åùå 2 ÷àñ ñ 100 ìêã/ìë ïðîòåèíàçû Ê. Ýëåêòðîôîðåòè÷åñêîå ðàçäåëåíèå ôðàãìåíòîâ ÄÍÊ ïðîâîäèëè â 40 ìÌ áóôåðå Tris – óêñóñíàÿ êèñëîòà, ðÍ 8,0, ñîäåðæàùåì 1 ìÌ ÝÄÒÀ, ïðè íàïðÿæåíèè ýëåêòðè÷åñêîãî ïîëÿ 5 Â/ñì. Òåñò íà íåêðîòè÷åñêóþ ãèáåëü òèìîöèòîâ. Âûõîä èç êëåòîê â êóëüòóðàëüíóþ ñðåäó öèòîçîëüíîé ëàêòàòäåãèäðîãåíàçû îöåíèâàëè ñîãëàñíî ïðîöåäóðå, îïèñàííîé â ðàáîòå [12], ñ ìîäèôèêàöèÿìè. Ðåàêöèþ ïðîâîäèëè â 96-ëóíî÷íûõ ïëàíøåòàõ. Îêîëî 500 òûñ. êëåòîê èíêóáèðîâàëè 18 ÷àñ â 200 ìêë ñðåäû êàê îïèñàíî âûøå, êëåòêè îñàæäàëè öåíòðèôóãèðîâàíèåì è íàäîñàäî÷íóþ êóëüòóðàëüíóþ ñðåäó ñîáèðàëè. Ðåàêöèîííàÿ ñìåñü ñîäåðæàëà 20 ìêë íàäîñàäî÷íîé êóëüòóðàëüíîé ñðåäû è 60 ìêë 0,4 Ì ãèäðàçèí ñóëüôàò-1 Ì ãëèöèí áóôåðà, ðÍ 9,9, ñîäåðæàùåãî 100 ìÌ ëàêòàò íàòðèÿ è 10 ìÌ NAD+. Ïðîáû èíêóáèðîâàëè 10 ìèí ïðè 37 °Ñ, ïîñëå ÷åãî äîáàâëÿëè 20 ìêë 50%-ãî ÒÕÓ (âåñ/îáúåì) è 25 ìêë 0,1%-ãî ðàñòâîðà 2,4-äèíèòðîôåíèëãèäðàçèíà â 2 Ì HCl. Ïëàíøåòû âûäåðæèâàëè 1 ÷àñ ïðè 37 °Ñ äëÿ îáðàçîâàíèÿ ôåíèëãèäðàçîíà è 10 ìèí ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå, ïîñëå ÷åãî äîáàâëÿëè 120 ìêë 2 Ì NaOH. Àáñîðáöèþ îïðåäåëÿëè ïðè äëèíå âîëíû 450 íì ïðîòèâ êîíòðîëüíîé ïðîáû, ñîäåðæàùåé 20 ìêë ÷èñòîé êóëüòóðàëüíîé ñðåäû. Çà 100% ïðèíèìàëè îáùóþ ëàêòàòäåãèäðîãåíàçíóþ àêòèâíîñòü â àëèêâîòå èíòàêòíûõ òèìîöèòîâ, ñîëþáèëèçèðîâàííîé â 200 ìêë 0,2%-ãî òðèòîíà Õ-100. Àíàëèç äåñòàáèëèçàöèè ìåìáðàí ëèçîñîì. Âûõîä èç êëåòîê êèñëîé ôîñôàòàçû îïðåäåëÿëè ïî ìåòîäó, îïèñàííîìó â ðàáîòå [13], àäàïòèðîâàííîìó íàìè äëÿ ïðîâåäåíèÿ â 96-ëóíî÷íûõ ïëàíøåòàõ. Ðåàêöèîííàÿ ñìåñü ñîäåðæàëà 50 ìêë íàäîñàäî÷íîé êóëüòóðàëüíîé ñðåäû è 25 ìêë 0,1 Ì àöåòàò íàòðèÿ-óêñóñíàÿ êèñëîòà áóôåðà, ðÍ 5,0. Ïîñëå ïðåèíêóáàöèè â òå÷åíèå 10 ìèí ïðè 37 °Ñ ê ïðîáàì äîáàâëÿëè 25 ìêë 32 ìÌ ðàñòâîðà 4-íèòðîôåíèë-ôîñôàòà â ðåàêöèîííîì áóôåðå (êîíå÷íàÿ êîíöåíòðàöèÿ ñóáñòðàòà â ðåàêöèîííîé ñìåñè 8 ìÌ) è èíêóáèðîâàëè 1 ÷àñ ïðè 37 °Ñ. Îáðàçîâàâøèéñÿ ï-íèòðîôåíîë âèçóàëèçèðîâàëè äîáàâëåíèåì 100 ìêë Tris-HCl-áóôåðà (ðÍ 8,5), ñîäåðæàùåãî 0,4 Ì K2HPO4. Àáñîðáöèþ îïðåäåëÿëè ïðè äëèíå âîëíû 420 íì ïðîòèâ êîíòðîëüíîé ïðîáû, ñîäåðæàùåé 50 ìêë ÷èñòîé êóëüòóðàëüíîé ñðåäû. Çà 100% ïðèíèìàëè îáùóþ àêòèâ- 78 ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2005, ò. 77, ¹ 4 Ã. Â. ÏÅÒÐÎÂÀ, Ã. Â. ÄÎÍ×ÅÍÊÎ íîñòü êèñëîé ôîñôàòàçû â àëèêâîòå èíòàêòíûõ òèìîöèòîâ, ñîëþáèëèçèðîâàííîé â 200 ìêë 0,2% òðèòîíà Õ-100. Äëÿ îïðåäåëåíèÿ ïîëíîòû âûõîäà êèñëîé ôîñôàòàçû, ê îñàäêó êëåòîê ïîñëå óäàëåíèÿ êóëüòóðàëüíîé ñðåäû äîáàâëÿëè 100 ìêë 20 ìÌ HEPESNaOH-áóôåðà (ðÍ 7,5), ñîäåðæàùåãî 250 ìÌ ñàõàðîçó, 10 ìÌ KCl, 1,5 ìÌ MgCl2, 1 ìÌ ÝÄÒÀ è 1 ìÌ ÝÃÒÀ. Ïîñëå èíêóáàöèè 30 ìèí íà ëåäÿíîé áàíå è èíòåíñèâíîãî âñòðÿõèâàíèÿ â òå÷åíèå 15 ñ íà ïðèáîðå Vortex, ïðîáû öåíòðèôóãèðîâàëè 15 ìèí ïðè 12 000 g è â íàäîñàäî÷íîé æèäêîñòè îïðåäåëÿëè àêòèâíîñòü êèñëîé ôîñôàòàçû êàê îïèñàíî âûøå. Ðåçóëüòàòû è îáñóæäåíèå Ðàíåå íàìè áûëî ïîêàçàíî, ÷òî α-òîêîôåðîë, α-òîêîôåðèëàöåòàò è òîêîôåðèëõèíîí ñ íàòèâíîé áîêîâîé öåïüþ (Ñ16) â êîíöåíòðàöèÿõ 100 ìêÌ íå îêàçûâàþò âëèÿíèÿ íà âûæèâàåìîñòü òèìîöèòîâ êðûñû ïðè èíêóáàöèè â òå÷åíèå 18 ÷àñ [14]. Èññëåäîâàíèå âûæèâàåìîñòè òèìîöèòîâ â çàâèñèìîñòè îò êîíöåíòðàöèè êîðîòêîöåïî÷å÷íûõ àíàëîãîâ âèòàìèíà Å ïîêàçàëî, ÷òî â êîíöåíòðàöèÿõ 10 è 20 ìêÌ óêàçàííûå ñîåäèíåíèÿ íå ýôôåêòèâíû, â òî âðåìÿ êàê ïðè óâåëè÷åíèè êîíöåíòðàöèé äî 100 ìêÌ íàáëþäàåòñÿ äîçîçàâèñèìîå óâåëè÷åíèå ãèáåëè êëåòîê. Êðèâûå äåéñòâèÿ àíàëîãîâ èìåëè ñõîäíûé õàðàêòåð, îäíàêî íàèáîëåå òîêñè÷íûì îêàçàëñÿ ÒÔ-Ñ6, ýôôåêò êîòîðîãî áûë âûðàæåí ïðè êîíöåíòðàöèè 50 ìêÌ (ðèñ. 1). Îáíàðóæåííàÿ íàìè ñïîñîáíîñòü êîðîòêîöåïî÷å÷íûõ ïðîèçâîäíûõ α-òîêîôåðîëà â ýêâèìîëÿðíûõ α-òîêîôåðîëó êîíöåíòðàöèÿõ èíãèáèðîâàòü âûæèâàåìîñòü ïåðâè÷íîé êóëüòóðû òèìîöèòîâ îáóñëîâèëà íåîáõîäèìîñòü èññëåäîâàíèÿ õàðàêòåðà ãèáåëè êëåòîê. Èçâåñòíî, ÷òî ãèáåëü êëåòîê ìîæåò ïðîèñõîäèòü ïî äâóì àëüòåðíàòèâíûì ïóòÿì – àïîïòîçà èëè íåêðîçà, êîòîðûå â çíà÷èòåëüíîé ìåðå ðàçëè÷àþòñÿ ïî ìîðôîëîãè÷åñêèì è áèîõèìè÷åñêèì ïðèçíàêàì. Òàê, îäíèì èç îñíîâíûõ ïðèçíàêîâ àïîïòè÷åñêîé ãèáåëè êëåòîê ñ÷èòàåòñÿ ìåæíóêëåîñîìíàÿ ôðàãìåíòàöèÿ ÄÍÊ õðîìàòèíà, â ñëó÷àå æå ãèáåëè êëåòîê ïî ïóòè íåêðîçà ôðàãìåíòàöèÿ ÄÍÊ ëèáî íå íàáëþäàåòñÿ âîâñå, ëèáî îáðàçóþùèåñÿ ôðàãìåíòû ÄÍÊ èìåþò íåîïðåäåëåííûå ðàçìåðû, êîòîðûå ïðè ýëåêòðîôîðåòè÷åñêîì ðàçäåëåíèè äàþò ñïëîøíóþ ïîëîñó [15]. Êàê âèäíî èç ðèñ. 2, ÒÔ-Ñ6 â êîíöåíòðàöèÿõ 10 è 20 ìêÌ íå èçìåíÿåò êîíòðîëüíûé óðîâåíü (ñïîíòàííûé àïîïòîç [9]) ìåæíóêëåîñîìíûõ ôðàãìåíòîâ ÄÍÊ õðîìàòèíà, à ïðè óâåëè÷åíèè êîíöåíòðàöèè íàáëþäàåòñÿ óìåíüøåíèå ñòåïåíè ìåæíóêëåîñîìíîé äåãðàäàöèè ÄÍÊ, ÷òî, íàðÿäó ñî ñíèæåíèåì âûæèâàåìîñòè êëåòîê (ðèñ. 1), ñâèäåòåëüñòâóåò î ðàçâèòèè â áîëüøåé ìåðå íåêðîòè÷åñêèõ, ÷åì àïîïòè÷åñêèõ ïðîöåññîâ. Áîëåå òîãî, êàê ïîêàçàíî íàìè ðàíåå, èñ÷åçíîâåíèå àïîïòè÷åñêîé ëåñòíèöû ïîä äåéñòâèåì ÒÀö-Ñ6 íàáëþäàåòñÿ äàæå íà ôîíå äåéñòâèÿ äåêñàìåòàçîíà – ìîùíîãî èíäóêòîðà àïîïòè÷åñêîé ãèáåëè òèìîöèòîâ, âûçûâàþùåãî áîëåå 70% ôðàã- Выживаемость клеток, % 100 α-Токоферилацетат-С6 α-Токоферол-С6 Токоферилхинон-С6 80 60 40 20 0 0 10 20 50 100 Концентрация, мкМ Ðèñ. 1. Çàâèñèìîñòü âûæèâàåìîñòè (% îò èíòàêòíûõ êëåòîê) òèìîöèòîâ êðûñû îò êîíöåíòðàöèè êîðîòêîöåïî÷å÷íûõ ïðîèçâîäíûõ âèòàìèíà Å (ÌÒÒ-òåñò), M ± m, n = 7–8. ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2005, ò. 77, ¹ 4 79 ÅÊÑÏÅÐÈÌÅÍÒÀËÜͲ ÐÎÁÎÒÈ 1 2 3 4 5 Ðèñ. 2. Ýëåêòðîôîðåãðàììà ìåæíóêëåîñîìíûõ ôðàãìåíòîâ ÄÍÊ õðîìàòèíà òèìîöèòîâ êðûñû, îáðàçóþùèõñÿ ïðè äåéñòâèè α-òîêîôåðîëà-Ñ6 â ðàçëè÷íûõ êîíöåíòðàöèÿõ: 1 – êîíòðîëü (ñïîíòàííûé àïîïòîç), 2–5 – äîáàâëåí α-òîêîôåðîë-Ñ6 â êîíöåíòðàöèÿõ ñîîòâåòñòâåííî 10, 20, 50 è 100 ìêÌ. Ïðåäñòàâëåíà òèïè÷íàÿ êàðòèíà ðàñïðåäåëåíèÿ äëÿ òðåõ íåçàâèñèìûõ ýêñïåðèìåíòîâ. α-Токоферилацетат-С6 α-Токоферол-С6 Токоферилхинон-С6 80 Выход лактатдегидрогеназы, % ìåíòàöèè ÄÍÊ [9]. Õàðàêòåð ðàñïðåäåëåíèÿ ìåæíóêëåîñîìíûõ ôðàãìåíòîâ ÄÍÊ â ñëó÷àå èñïîëüçîâàíèÿ ÒÀö-Ñ6 è ÒÕ-Ñ6 áûë àíàëîãè÷åí (äàííûå íå ïðåäñòàâëåíû). Èçâåñòíî, ÷òî õàðàêòåðíûìè ðàçëè÷èÿìè àïîïòè÷åñêîé è íåêðîòè÷åñêîé ãèáåëè êëåòîê ÿâëÿþòñÿ òàêæå êîíå÷íûå ýòàïû äàííûõ ïðîöåññîâ.  ñëó÷àå àïîïòîçà çàâåðøàþùèì ýòàïîì ÿâëÿåòñÿ îáðàçîâàíèå òàê íàçûâàåìûõ àïîïòè÷åñêèõ òåëåö – âàêóîëåïîäîáíûõ îáðàçîâàíèé ïëàçìàòè÷åñêîé ìåìáðàíû, â êîòîðûå çàêëþ÷åíî ñîäåðæèìîå êëåòêè. Ïðè ýòîì âíóòðèêëåòî÷íîå ñîäåðæèìîå íå èçëèâàåòñÿ â ìåæêëåòî÷íîå ïðîñòðàíñòâî. Ïðè íåêðîçå íàáëþäàåòñÿ ïîâûøåíèå ïðîíèöàåìîñòè è, â êîíå÷íîì èòîãå, ðàçðûâ ïëàçìàòè÷åñêîé ìåìáðàíû, â ðåçóëüòàòå ÷åãî öèòîçîëüíûå ôåðìåíòû âûõîäÿò èç êëåòêè â îêðóæàþùóþ ñðåäó [16]. Íà ðèñ. 3 ïðåäñòàâëåí âûõîä (% îò îáùåãî ñîäåðæàíèÿ â àëèêâîòå èíòàêòíûõ êëåòîê) â êóëüòóðàëüíóþ ñðåäó öèòîçîëüíîé ëàêòàòäåãèäðîãåíàçû – ôåðìåíòà, íàèáîëåå ÷àñòî èñïîëüçóåìîãî êàê òåñò íà íåêðîòè÷åñêóþ ãèáåëü. Çàâèñèìîñòü âûõîäà èç êëåòîê ëàêòàòäåãèäðîãåíàçû ïîä äåéñòâèåì êîðîòêîöåïî÷å÷íûõ àíàëîãîâ âèòàìèíà Å îáðàòíî ïðîïîðöèîíàëüíà âûæèâàåìîñòè êëåòîê, ÷òî, íàðÿäó ñ îòñóòñòâèåì ìåæíóêëåîñîìíîé äåãðàäàöèè ÄÍÊ õðîìàòèíà (ðèñ. 2), ñâèäåòåëüñòâóåò îá èíäóêöèè èññëåäóåìûìè ñîåäèíåíèÿìè èìåííî íåêðîòè÷åñêîé ãèáåëè êëåòîê. Êàê è ïðè èññëåäîâàíèè âûæèâàåìîñòè êëåòîê, äåéñòâèå êîðîòêîöåïî÷å÷íûõ ìåòàáîëèòîâ α-òîêîôåðîëà â äàí- 70 60 50 40 30 20 0 10 20 50 100 Концентрация, мкМ Ðèñ. 3. Çàâèñèìîñòü âûõîäà èç òèìîöèòîâ êðûñû öèòîçîëüíîé ëàêòàòäåãèäðîãåíàçû (% îò îáùåãî ñîäåðæàíèÿ â àëèêâîòå èíòàêòíûõ êëåòîê) îò êîíöåíòðàöèè êîðîòêîöåïî÷å÷íûõ ïðîèçâîäíûõ âèòàìèíà Å, M ± m, n = 5–6. 80 ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2005, ò. 77, ¹ 4 Ã. Â. ÏÅÒÐÎÂÀ, Ã. Â. ÄÎÍ×ÅÍÊÎ íîì ñëó÷àå ñõîäíî, à íàèìåíüøèì ýôôåêòîì îáëàäàåò ÒÀö-Ñ6. Ñóùåñòâóþò äàííûå ëèòåðàòóðû î òîì, ÷òî â ìîäåëüíûõ ñèñòåìàõ ëèïèäíûõ ìåìáðàí àíòèîêñèäàíòíûå ñâîéñòâà íàòèâíîãî α-òîêîôåðîëà è åãî êîðîòêîöåïî÷å÷íûõ ïðîèçâîäíûõ ñõîäíû, îäíàêî èìåþòñÿ çíà÷èòåëüíûå ðàçëè÷èÿ â ñòåïåíè ïðîíèêíîâåíèÿ äàííûõ ñîåäèíåíèé âî âíóòðü ëèïèäíûõ âåçèêóë. Äëèííàÿ ãèäðîôîáíàÿ áîêîâàÿ öåïü â ìîëåêóëå íàòèâíîãî α-òîêîôåðîëà îïðåäåëÿåò åãî “çàÿêîðåâàíèå” â ìåìáðàíå, â òî âðåìÿ êàê óêîðî÷åíèå áîêîâîé öåïè îáåñïå÷èâàåò áîëåå ñâîáîäíîå ïðîíèêíîâåíèå ÷åðåç ëèïèäíûé áèñëîé [17]. Èçâåñòíî òàêæå, ÷òî áëàãîäàðÿ àìôèôèëüíîñòè ìîëåêóëû, α-òîêîôåðîë ïðè âûñîêèõ êîíöåíòðàöèÿõ ìîæåò ïðîÿâëÿòü ñâîéñòâà äåòåðãåíòà, â ðåçóëüòàòå ÷åãî ñïîñîáåí äåñòàáèëèçèðîâàòü ìåìáðàííûé áèñëîé [18].  ñâÿçè ñ ýòèì ìû ïðåäïîëîæèëè, ÷òî âûñîêàÿ ñòåïåíü ïðîíèöàåìîñòè ÷åðåç êëåòî÷íóþ ìåìáðàíó êîðîòêîöåïî÷å÷íûõ ïðîèçâîäíûõ α-òîêîôåðîëà ïîçâîëÿåò ñîçäàòü âíóòðè êëåòêè èõ êîíöåíòðàöèþ, äîñòàòî÷íóþ äëÿ äåñòàáèëèçàöèè ìåìáðàí ñóáêëåòî÷íûõ ñòðóêòóð.  ïîñëåäíèå ãîäû â ëèòåðàòóðå øèðîêî îáñóæäàþòñÿ äàííûå î òîì, ÷òî, íàðÿäó ñ ìèòîõîíäðèÿìè è ÿäðîì – ñòðóêòóðàìè, ïðèíèìàþùèìè íåïîñðåäñòâåííîå ó÷àñòèå â íåêðîòè÷åñêîé è àïîïòè÷åñêîé ãèáåëè êëåòîê, àêòèâíóþ ðîëü â äàííûõ ïðîöåññàõ èãðàþò òàêæå ëèçîñîìû. Ïîâûøåíèå ïðîíèöàåìîñòè ëèçîñîìíîé ìåìáðàíû è âûõîä â öèòîçîëü êëåòêè ëèçîñîìíûõ ãèäðîëè- α-Токоферилацетат-С6 α-Токоферол-С6 Токоферилхинон-С6 40 Выход кислой фосфатазы, % òè÷åñêèõ ôåðìåíòîâ îáóñëîâëèâàåò ãèáåëü êëåòîê, à ñòåïåíü óâåëè÷åíèÿ ïðîíèöàåìîñòè ëèçîñîìíîé ìåìáðàíû è èíòåíñèâíîñòü âûõîäà ôåðìåíòîâ ìîãóò îïðåäåëÿòü “âûáîð” ìåæäó àïîïòîçîì è íåêðîçîì [19]. Êàê ñëåäóåò èç ðèñ. 4, êîðîòêîöåïî÷å÷íûå ïðîèçâîäíûå α-òîêîôåðîëà âûçûâàþò ïîÿâëåíèå â èíêóáàöèîííîé ñðåäå êèñëîé ôîñôàòàçû – îäíîãî èç îñíîâíûõ ìàðêåðîâ ëèçîñîì. Õàðàêòåð âûõîäà èç êëåòîê ôåðìåíòà ïðÿìî ïðîïîðöèîíàëåí âûõîäó ëàêòàòäåãèäðîãåíàçû è îáðàòíî – âûæèâàåìîñòè êëåòîê. Íàèáîëüøèì ýôôåêòîì â êîíöåíòðàöèè 50 ìêÌ îáëàäàåò ÒÔ-Ñ6, íàèìåíüøèì – ÒÀö-Ñ6. Ïîñêîëüêó âûõîä êèñëîé ôîñôàòàçû èç êëåòîê ÿâëÿåòñÿ âòîðè÷íûì ïî îòíîøåíèþ ê åå âûõîäó èç ëèçîñîì â öèòîçîëü, äëÿ êîððåêòíîé îöåíêè êîëè÷åñòâà ñâîáîäíîãî ôåðìåíòà áûëî ïðîâåäåíî èññëåäîâàíèå ïîëíîòû åãî âûõîäà èç êëåòîê. Îñòàòî÷íàÿ àêòèâíîñòü ñâîáîäíîãî ôåðìåíòà â îñàäêå êëåòîê áûëà îäèíàêîâîé äëÿ êîíòðîëüíîé è îïûòíûõ ïðîá ïðè âñåõ êîíöåíòðàöèÿõ èññëåäóåìûõ ïðîèçâîäíûõ è êîëåáàëàñü â ïðåäåëàõ 8–10% îò îáùåãî ñîäåðæàíèÿ êèñëîé ôîñôàòàçû â èíòàêòíûõ êëåòêàõ. Ñóììèðîâàíèå îòíîñèòåëüíîé àêòèâíîñòè âûøåäøåãî èç êëåòîê ôåðìåíòà è åãî îñòàòî÷íîé àêòèâíîñòè â êëåòêàõ íå èçìåíÿëî õàðàêòåð êðèâûõ, ïðåäñòàâëåííûõ íà ðèñ. 4. Ïî íàøåìó ìíåíèþ, ïîÿâëåíèå â êóëüòóðàëüíîé ñðåäå êèñëîé ôîñôàòàçû ñâèäåòåëüñòâóåò î äåñòàáèëèçàöèè èññëåäóåìûìè ñîåäèíåíèÿìè ëèçîñîìíîé ìåìáðàíû, ÷òî, î÷åâèäíî, è îáóñëîâëèâàåò èõ öèòîòîêñè÷åñêèé ýôôåêò. 35 30 25 20 15 0 10 20 50 100 Концентрация, мкМ Ðèñ. 4. Çàâèñèìîñòü âûõîäà èç òèìîöèòîâ êðûñû êèñëîé ôîñôàòàçû (% îò îáùåãî ñîäåðæàíèÿ â àëèêâîòå èíòàêòíûõ êëåòîê) îò êîíöåíòðàöèè êîðîòêîöåïî÷å÷íûõ ïðîèçâîäíûõ âèòàìèíà Å, M ± m, n = 5–6. ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2005, ò. 77, ¹ 4 81 ÅÊÑÏÅÐÈÌÅÍÒÀËÜͲ ÐÎÁÎÒÈ Ñõîäñòâî õàðàêòåðà êðèâûõ âëèÿíèÿ êîðîòêîöåïî÷å÷íûõ àíàëîãîâ íà âñå èññëåäîâàííûå ïîêàçàòåëè óêàçûâàåò íà òî, ÷òî èõ öèòîòîêñè÷íîñòü îïðåäåëÿåòñÿ, ïðåæäå âñåãî, íàëè÷èåì óêîðî÷åííîé áîêîâîé ôèòèëüíîé öåïè, ïîâûøàþùåé ñòåïåíü ïðîíèöàåìîñòè ÷åðåç öèòîïëàçìàòè÷åñêóþ ìåìáðàíó, ïîñêîëüêó α-òîêîôåðîë, α-òîêîôåðèëàöåòàò è òîêîôåðèëõèíîí ñ íàòèâíîé áîêîâîé öåïüþ â êîíöåíòðàöèÿõ 100 ìêÌ íå îêàçûâàþò âëèÿíèÿ íà âûæèâàåìîñòü òèìîöèòîâ êðûñû [14]. Îäíàêî íàëè÷èå îïðåäåëåííûõ ðàçëè÷èé â ñòåïåíè ýôôåêòîâ ñâèäåòåëüñòâóåò â ïîëüçó äîïîëíèòåëüíîé ðîëè õèìè÷åñêîé ñòðóêòóðû õðîìàíîâîãî ÿäðà êîðîòêîöåïî÷å÷íûõ àíàëîãîâ. Òàê, ñïîñîáíîñòü α-òîêîôåðîëà è, âåðîÿòíî ÒÔ-Ñ6, â âûñîêèõ êîíöåíòðàöèÿõ ïðîÿâëÿòü ïðîîêñèäàíòíûå ñâîéñòâà [18], âûçûâàÿ îêñèäàòèâíûé ñòðåññ, ìîæåò âíîñèòü äîïîëíèòåëüíûé ê ëèçîñîìîäåñòàáèëèçèðóþùåìó ýôôåêòó âêëàä â öèòîòîêñè÷åñêîå äåéñòâèå ÒÔ-Ñ6. Ýêðàíèðîâàíèå ÎÍ-ãðóïïû õðîìàíîâîãî ÿäðà ýôèðíîé ñâÿçüþ â ñëó÷àå ÒÀö-Ñ6 ïðåäîòâðàùàåò ïðîòåêàíèå íåñïåöèôè÷åñêèõ îêèñëèòåëüíî-âîññòàíîâèòåëüíûõ ðåàêöèé, ÷òî ìîæåò îïðåäåëÿòü åãî íàèìåíüøóþ öèòîòîêñè÷íîñòü. Íåîáõîäèìî îòìåòèòü, ÷òî õîòÿ êîíöåíòðàöèÿ 100 ìêÌ ÿâëÿåòñÿ ôèçèîëîãè÷åñêîé äëÿ α-òîêîôåðîëà [20], îäíàêî â ñëó÷àå åãî êîðîòêîöåïî÷å÷íûõ ìåòàáîëèòîâ îíà áåçóñëîâíî äîëæíà ðàññìàòðèâàòüñÿ êàê íàãðóçî÷íàÿ.  íàñòîÿùåå âðåìÿ íå ñóùåñòâóåò äàííûõ î êîíöåíòðàöèè Ñ6-ìåòàáîëèòîâ â êëåòêå. Ýêñêðåöèÿ ñ ìî÷îé êîíå÷íîãî ïðîäóêòà ìåòàáîëèçìà α-òîêîôåðîëà (α-ÑÅÍÑ, Ñ2-ìåòàáîëèò ) ó ÷åëîâåêà ñîñòàâëÿåò îêîëî 0,3 ìã â ñóòêè [21]. Ïðè èíêóáàöèè êóëüòóðû êëåòîê HepG2 ñ 50 ìêÌ α-òîêîôåðîëà êîíöåíòðàöèÿ α-ÑÅÍÑ â êëåòêàõ íàõîäèòñÿ â ïðåäåëàõ 0,1 íìîëü/ìã áåëêà [22 ]. Îäíàêî, ïîñêîëüêó êîðîòêîöåïî÷å÷íûå àíàëîãè α-òîêîôåðîëà âûçûâàþò ãèáåëü êóëüòóð ðàêîâûõ êëåòîê [8], ýòî îáñòîÿòåëüñòâî, íà íàø âçãëÿä, íå ìåøàåò ðàññìàòðèâàòü äàííûå ñîåäèíåíèÿ êàê ïîòåíöèàëüíûå ïðîòèâîîïóõîëåâûå àãåíòû, îñîáåííî â ñëó÷àå ôåíîìåíà ëåêàðñòâåííîé ðåçèñòåíòíîñòè, êîãäà ðàêîâûå êëåòêè óñòîé÷èâû ê äåéñòâèþ àãåíòîâ, âûçûâàþùèõ àïîïòîç. Îòìåòèì òàêæå, ÷òî òîêîôåðèë-ñóêöèíàò, ïðîàïîïòè÷åñêîå è ïðîòèâîîïóõîëåâîå äåéñòâèå êîòîðîãî èíòåíñèâíî èññëåäóåòñÿ â ïîñëåäíèå ãîäû [5], âîîáùå íå ÿâëÿåòñÿ ôèçèîëîãè÷åñêèì ñîåäèíåíèåì è äîëæåí ðàññìàòðèâàòüñÿ êàê êñåíîáèîòèê. Òàêèì îáðàçîì, ïî íàøåìó ìíåíèþ, ñîâîêóïíîñòü ïðåäñòàâëåííûõ äàííûõ ñâèäåòåëüñòâóåò â ïîëüçó ïðåäëîæåííîãî íàìè âîçìîæíîãî ìåõàíèçìà öèòîòîêñè÷åñêîãî äåéñòâèÿ êîðîòêîöåïî÷å÷íûõ ïðîèçâîäíûõ α-òîêîôåðîëà â êóëüòóðå êëåòîê, à èìåííî – èõ ïîâûøåííàÿ ïðîíèöàåìîñòü ÷åðåç ïëàçìàòè÷åñêóþ ìåìáðàíó ïîçâîëÿåò ñîçäàòü âíóòðè êëåòêè êîíöåíòðàöèþ, äîñòàòî÷íóþ äëÿ äåòåðãåíòïîäîáíîé äåñòàáèëèçàöèè ìåìáðàí ëèçîñîì, ÷òî ïðèâîäèò ê âûõîäó â öèòîçîëü êëåòêè ëèçîñîìíûõ ôåðìåíòîâ è ãèáåëè êëåòêè ïî ïóòè íåêðîçà. Ïîäîáíûé ìåõàíèçì öèòîòîêñè÷åñêîãî äåéñòâèÿ ïîñòóëèðóåòñÿ è äëÿ ïðèðîäíîãî êîìïîíåíòà áèîëîãè÷åñêèõ ìåìáðàí è âòîðè÷íîãî ìåññåíäæåðà – ñôèíãîçèíà. ßâëÿÿñü â íèçêèõ êîíöåíòðàöèÿõ èíäóêòîðîì àïîïòîçà, ïðè óâåëè÷åíèè êîíöåíòðàöèé âûøå 20 ìêã/ìë ñôèíãîçèí âûçûâàåò íåêðîòè÷åñêóþ ãèáåëü êëåòîê çà ñ÷åò äåòåðãåíòïîäîáíîé ñîëþáèëèçàöèè ëèçîñîìíîé ìåìáðàíû [23]. Ïîäîáíàÿ äåñòàáèëèçàöèÿ ìåìáðàíû ëèçîñîì ïðåäïîëàãàåòñÿ è äëÿ ïðîàïîïòè÷åñêîãî äåéñòâèÿ òîêîôåðèë-ñóêöèíàòà [24]. Âïîëíå âîçìîæíî, ÷òî ìåõàíèçì ïîäîáíîãî ðîäà ÿâëÿåòñÿ óíèâåðñàëüíûì äëÿ öèòîòîêñè÷åñêîãî äåéñòâèÿ â óñëîâèÿõ êóëüòóð êëåòîê ãèäðîôîáíûõ ñîåäèíåíèé, êîòîðûå îáëàäàþò äåòåðãåíòïîäîáíûìè ñâîéñòâàìè è ñïîñîáíû äîñòàòî÷íî ëåãêî ïðîíèêàòü ÷åðåç ïëàçìàòè÷åñêóþ ìåìáðàíó êëåòêè. CYTOTOXIC EFFECT OF VITAMIN E SHORT-CHAIN DERIVATIVES ON RAT THYMOCYTES G. V. Petrova, G. V. Donchenko Palladin Institute of Biochemistry, National Añademy of Sciences of Ukraine, Kyiv; e-mail: petrova@biochem.kiev.ua Summary It is established, that α-tocopherol, α-tocopheryl acetate and tocopheryl quinone with carbon lateral chains shortened to 6 atoms inhibited the viability of primary culture rats thymocytes in a dosedependent manner. Absence of the DNA internucleosomal degradation side by side with cytosolic lactatedehydrogenase outlet from the cells testifies to the benefit of necrotic way of thymocytes destruction. The outlet from cells of acid phosphatase, lysosomal marker enzyme, testifies to destabilization of lysosomal membranes by the researched compounds. The possible mechanism of cytotoxication of vitamin E short-chain derivatives in cell cultures is offered, namely: their high permeability through a plasmatic membrane allows to create inside the cells a concentration, sufficient for detergent-like rupture of the lysosomal membranes, that results in the entering of lysosomal enzymes in cytosol and destruction of cells by necrosis. K e y w o r d s: vitamin E short-chain derivatives, apoptosis, necrosis, thymocytes, lysosomes. . 82 ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2005, ò. 77, ¹ 4 Ã. Â. ÏÅÒÐÎÂÀ, Ã. Â. ÄÎÍ×ÅÍÊÎ 1. Emerson O. H., Emerson G. A., Mohammed A. et al. // J. Biol. Chem. 1937. 122. Ð. 99–107. 2. Hensley K., Benaksas E. J., Bolli R. et al. // Free Radic. Biol. Med. 2004. 36, N 1. Ð. 1–15. 3. Ïåòðîâà Ã. Â., Êàïðàëîâ À. À., Äîí÷åíêî Ã. Â. // Óêð. áiîõiì. æóðí. 2003. 75, ¹ 6. Ñ. 25– 34. 4. Kogure K., Hama S., Kisaki M. et al. // Biochim. Biophys. Acta. 2004. 1672, N 2. P. 93–99. 5. Prasad K. N., Kumar B., Yan X. D. et al. // J. Am. Coll. Nutr. 2003. 22, N 2. P. 108–117. 6. McIntyre B. S., Briski K. P., Tirmenstein M. A. et al. // Lipids. 2000. 35, N 2. P. 171–180. 7. Birringer M., Drogan D., Brigelius-Flohe R. // Free Radical Biol.and Med. 2001. 31, N 2. P. 226–232. 8. Äîí÷åíêî Ã. Â., Õîëîäîâà Þ. Ä., Êóçüìåíêî È. Â. è äð. // Óêð. áiîõiì. æóðí. 1998. 70, ¹ 2. Ñ. 37–45. 9. Ïåòðîâà Ã. Â., Êàïðàëîâ À. À., Äîí÷åíêî Ã. Â. // Òàì ñàìî. 2003. 75, ¹ 1. Ñ. 78–84. 10. Herrmann M., Lorenz H. M., Voll R. et al. // Nucleic Acids Res. 1994. 22. P. 5506–5507. 11. McConkey D. J. // J. Biol. Chem. 1996. 271, N 37. P. 22398–22406. 12. Chen A., Jones T. W., Brown P. C. et al. // Ibid. 1990. 265, N 35. P. 21603–21611. 13. Áàððåò À. Äæ., Õèò Ì.Ô. / Ëèçîñîìû. Ìåòîäû èññëåäîâàíèÿ. Ïîä ðåä . Äæ. Äèíãëà. Ì.: Ìèð. 1980. Ñ. 25–156. 14. Ïåòðîâà Ã. Â., Äîí÷åíêî Ã. Â. // Óêð. áiîõiì. æóðí. 2005. 77, ¹ 1. Ñ. 68–73. 15. Nicotera P., Melino G. // Oncogene. 2004. 23. P. 2757–2765. 16. Fiers W., Beyaert R., Declercq W. et al. // Ibid. 1999. 18. P. 7719–7730. 17. Niki E., Kawakami A., Saito M. et al. // J. Biol.Chem. 1985. 260, N 4. P. 2191–2196. 18. Wang, X., Quinn P. J. // Prog. Lipid Res. 1999. 38, N 4. P. 309–336. 19. Guicciardi M. E., Leist M., Gores G. J. // Oncogene. 2004. 23. P. 2881–2890. 20. Ïàëüìèíà Í. Ï., Ìàëüöåâà Å. Ë., Êóðíàêîâà Í. Â. è äð. // Áèîõèìèÿ. 1994. 59, ¹ 2. Ñ. 193–200. 21. Schuelke M., Elsner A., Finckh B. et al. // J. Lipid Res. 2000. 41. P. 1543–1551. 22. Birringer M., Pfluger P., Kluth D. et al. // J. Nutr. 2002. 132. P. 3113–3118. 23. Kagedal K., Zhao M., Svensson I. et al. // Biochem. J. 2001. 359, N 2. P. 335–343. 24. Neuzil J., Zhao M., Ostermann G. et al. // Ibid. 2002. 362, N 3. P. 709–715. Ïîëó÷åíî 11.02.2005 ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2005, ò. 77, ¹ 4 83