Определение минимальной концентрации коллоидного золота

УДК 577.344.3
Определение минимальной концентрации коллоидного золота,
способствующей уменьшению пороговой дозы начала
фотодинамического эффекта
Нигай Е.Р., студент
Россия, 105005, г. Москва, МГТУ им. Н.Э. Баумана,
кафедра «Медико-технические информационные технологии»
Научный руководитель: Жорина Л.В., доцент
Россия, 105005, г. Москва, МГТУ им. Н.Э. Баумана,
кафедра «Биомедицинские технические системы»
bmt-1@bmstu.ru
Введение
Фототермическая терапия – метод лечения опухолей, различных инфекционных
заболеваний с использованием золотых и серебряных наночастиц. При облучении таких
частиц светом с длиной волны, приходящейся на длину волны плазмонного резонанса,
происходит их сильный нагрев. Если эти частицы находятся внутри или вокруг клетокмишеней, то последние погибают в результате перегрева [1]. Однако термическое
воздействие
на
клетки
не
является
единственным
показателем
эффективности
фототермической терапии. Так, например, исследования показали, что при быстром
нагреве частиц происходит образование пузырьков пара, которые способны вызывать
кавитационное повреждение клеток [2].
Области применения золотых и серебряных наночастиц в медицине достаточно
многочисленны, и их число продолжает увеличиваться. В основном золотые наночастицы
используются для диагностики и визуализации опухолей, для адресной доставки
фармпрепарата, т.е. входят в состав сложных композитов, и др. Благородные металлы уже
используются в лечении ревматоидного артрита и других тяжелых аутоиммунных
заболеваний.
Согласно проведённым исследованиям [3], основным путем проникновения
золотых наночастиц в клетки является пиноцитоз и эндоцитоз в зависимости от типа
клеток. В процессе пиноцитоза на поверхности клеток формируются длинные выростыскладки, которые затем смыкаются, захватывая все, что попадает внутрь. В результате
наночастицы золота накапливаются в клетке (рис.1).
http://sntbul.bmstu.ru/doc/736178.html
Рис. 1. Поглощение наночастиц золота и накопление их в цитоплазме [3]
Такой характер поступления веществ скорее свойствен не «нормальным» клеткам,
которые
достаточно
строго
осуществляют
контроль
поступаемых
веществ,
а
патологическим, которые поглощают большие объемы жидкости, из которой они
извлекают питательные вещества.
Фотодинамический эффект – метод лечения опухолевых заболеваний, основанный
на свойстве некоторых фотосенсибилизаторов селективно накапливаться в опухолевых
клетках. При облучении таких клеток светом с длиной волны, приходящейся на максимум
поглощения фотосенсибилизатора, происходит образование атомарного (синглетного)
кислорода, который и приводит к разрушению опухолевых клеток. На сегодняшний день
имеются сведения, что сочетанное действие коллоидного золота и фотосенсибилизатора
позволяет снизить пороговую дозу начала фотодинамического эффекта [4, 5].
На
сегодняшний
фотосенсибилизаторов,
а
день
также
продолжается
новых
способов
поиск
более
уменьшения
эффективных
пороговой
дозы
фотодинамического эффекта (ФДЭ). Ведь даже используемый в фотодинамической
терапии опухолей красный и ближний инфракрасный свет, будучи не таким опасным, как
ионизирующее излучение, способен вызвать у одних людей расширение сосудов, у других
их сужение; возможны покраснения отдельных участков кожи, ожоги и другие
нежелательные реакции. Также нельзя не учесть, что воздействию излучения
подвергаются не только патологические клетки, но и нормальные. Встает вопрос о том,
насколько предсказуем
может
быть
эффект
от
такого
воздействия
с
учетом
индивидуальных особенностей отдельного человека. Мы предполагаем, что уменьшить
Молодежный научно-технический вестник ФС77-51038, ISSN 2307-0609
пороговую дозу начала ФДЭ, и тем самым повысить эффективность фотодинамической
терапии как метода уничтожения опухолевых клеток, возможно с дополнительным
использованием коллоидного золота [8]. Тогда логично предположить, что существует
некоторая минимальная концентрация золотых наночастиц, при которой еще наблюдается
снижение пороговой дозы начала ФДЭ.
Целью
данной
работы
является
определение
минимальной
концентрации
коллоидного золота, способствующей уменьшению пороговой дозы начала ФДЭ.
Материалы и методы исследования
В качестве фотосенсибилизатора использовался Радахлорин, который представляет
собой модифицированную природную смесь хлоринов из микроводоросли Spirulina, около
70-90 % которых составляет хлорин е6. Препарат (3,5 мг/мл), предоставленный компанией
ООО «Рада-Фарма» (Россия), предназначен для внутривенного введения. Первоначально
препарат был разбавлен согласно инструкции компании «Рада-Фарма» [6] в 0,9 %
растворе NaCl (физрастворе), далее полученный раствор разводился в 400 раз в смеси
крови и физраствора, коэффициент пропускания такого образца составлял около 20-25 %.
Использовался образец крови с добавлением гепарин-натрия для стабилизации свойств
взвеси эритроцитов в течение проводимой серии экспериментов (каждая серия измерений
проводилась в течение одного рабочего дня в аналогичных условиях).
Кровь можно рассматривать как суспензию (взвесь) эритроцитов в практически
прозрачной среде. Изменение формы эритроцита приводит к изменению оптических
характеристик суспензии. Суммарная экстинкция оказывается минимальной при полной
сферуляции эритроцитов. Полная же гемолизация крови приводит к резкому падению
оптической плотности. То, что в результате фотодинамического воздействия кровь из
классической мутной среды превращается в раствор, близкий к коллоидному, взято за
основу экспериментальной методики.
Экстинкция суспензии эритроцитов измерялась на фотоколориметре КФК-2.
Прибор имеет шкалу для определения пропускания Т, которое связано с экстинкцией и
оптической плотностью D по формуле:
‫ = ܦ‬− lg ܶ = ܿߝ‫ܮ‬,
где с – концентрация поглощающего вещества, ε – коэффициент молярной экстинкции,
L – толщина образца.
Согласно сказанному выше, увеличение пропускания раствора эритроцитов будет
означать увеличение количества погибших клеток.
http://sntbul.bmstu.ru/doc/736178.html
При проведении эксперимента использовалось несколько проб: контрольные
(помещенные в темноту) и облучаемые пробы фотосенсибилизатор + эритроциты и
фотосенсибилизатор + коллоидное золото + эритроциты. Облучение проб происходило в
течение некоторого отрезка времени, затем кратковременно измерялось пропускание
пробы, снова проводилось облучение этой же пробы и вновь измерялось пропускание
и т.д. В качестве источника света использовался фотоматричный облучатель сферической
формы [7] на сверхярких светодиодах BL-L513URC (AlGaAs) с плотностью мощности
излучения на поверхности образца 6,79 мВт/см2 и длиной волны максимума излучения
656 нм. Максимум спектра поглощения Радахлорина в физрастворе располагается на
642 нм, в суспензии эритроцитов – на 656 нм. При расчете дозы облучения учитывалась
мощность излучателя, время облучения, площадь засветки, потери мощности на границе
стекло-воздух кюветы около 4 %.
Согласно
данным
сканирующей
электронной
микроскопии,
размеры
использованных нами коллоидных частиц составляют порядка 15…20 нм. Поглощение
полученного коллоидного золота находится в районе 450…580 нм.
Следует также отметить, что длина волны облучения не совпадает с длиной волны
поглощения коллоидного золота и не совпадает с длиной волны плазмонного резонанса
золота.
Результаты и их обсуждение
Пропускание
образцов
крови,
содержащих
Радахлорин,
контролировалось
непосредственно после приготовления образцов и после инкубации в темноте. Для
накопления фотосенсибилизатора в клетках проводилась инкубация, т.е. помещение
образца с фотосенсибилизатором в темноту на 30 минут. Инкубация суспензии
эритроцитов вместе с коллоидным золотом составляла 10 и 30 минут одновременно с
фотосенсибилизатором.
Поскольку
в
работе [8]
количество
коллоидного
золота
составляло 1,25 %, 2,5 % и 3,7 % от объёма суспензии и авторами был сделан вывод о том,
что данные концентрации коллоидного золота не влияют на значение пороговой дозы
начала фотодинамического воздействия, было принято решение об уменьшении
концентраций коллоидного золота в суспензиях до значений 1,25 %, 0,5 % и 0,25 %. Ранее
было показано [8], что при сочетанном действии Радахлорина и коллоидного золота
происходит уменьшение пороговой дозы начала фотодинамического эффекта. Нами были
получены аналогичные результаты.
Молодежный научно-технический вестник ФС77-51038, ISSN 2307-0609
На рис. 2 видно, что при добавлении коллоидного золота (1,25 %) к образцам,
инкубированным с фотосенсибилизатором, доза начала фотодинамического эффекта
уменьшается по сравнению с контрольным образцом (только с фотосенсибилизатором) в
среднем на 0,3 Дж (30 %).
Рис. 2. Зависимость коэффициента пропускания от дозы облучения (концентрация
коллоидного золота 1,25 %).
Образец «Контроль» – образец, состоящий из суспензии эритроцитов и Радахлорина,
время инкубации которого составило 30 минут. Образец «Рх30Кз30» – образец,
состоящий из суспензии эритроцитов, Радахлорина и коллоидного золота в
концентрации 1,25 %; время инкубации образца вместе с коллоидным золотом
составило 30 минут. Образец «Рх30Кз10» – образец, состоящий из суспензии
эритроцитов, Радахлорина и коллоидного золота в концентрации 1,25 %; время
инкубации образца вместе с коллоидным золотом составило 10 минут
Дозой начала фотодинамического эффекта нами было принято считать дозу, при
которой коэффициент пропускания образца превысит значение 0,3.
В последующих экспериментах мы начали уменьшать концентрацию коллоидного
золота. В результате оказалось, что при концентрации коллоидного золота 0,25 % доза
начала фотодинамического эффекта увеличилась по сравнению с контрольным образцом
(рис. 3).
http://sntbul.bmstu.ru/doc/736178.html
Рис. 3. Зависимости коэффициентов пропускания от дозы облучения (концентрации
коллоидного золота 0,5 % и 0,25 %).
Образец «Контроль» – образец, состоящий из суспензии эритроцитов и Радахлорина,
время инкубации которого составило 30 минут. Образец «Рх30Кз10» – образец,
состоящий из суспензии эритроцитов, Радахлорина и коллоидного золота в концентрации
0,5 %; время инкубации образца вместе с коллоидным золотом составило 10 минут.
Образец «Рх30Кз30» – образец, состоящий из суспензии эритроцитов, Радахлорина и
коллоидного золота в концентрации 0,5 %; время инкубации образца вместе с
коллоидным золотом составило 30 минут. Образец «Рх30Кз10а» – образец, состоящий из
суспензии эритроцитов, Радахлорина и коллоидного золота в концентрации 0,25 %; время
инкубации образца вместе с коллоидным золотом составило 10 минут. Образец
«Рх30Кз30а» – образец, состоящий из суспензии эритроцитов, Радахлорина и коллоидного
золота в концентрации 0,25 %; время инкубации образца вместе с коллоидным золотом
составило 30 минут
На графике видно, что при концентрации коллоидного золота 0,5 % происходит
уменьшение пороговой дозы начала фотодинамического эффекта по сравнению с
контрольным образцом на 0,3 Дж (35 %). Таким образом, можно предположить, что
минимальная
концентрация
коллоидного
золота,
при
которой
уменьшение пороговой дозы, находится в пределах [0,25 %; 0,5 %].
Молодежный научно-технический вестник ФС77-51038, ISSN 2307-0609
еще
происходит
Для того чтобы исключить версию теплового действия коллоидного золота при
облучении матрицей, была проведена серия экспериментов «суспензия эритроцитов +
коллоидное золото» (рис. 4).
Рис. 4. Зависимости коэффициента пропускания от дозы для контрольных образцов.
Образец «Контроль» – образец, состоящий из суспензии эритроцитов и Радахлорина,
время инкубации которого составило 30 минут. Образец «КонтрольКолЗол» – образец,
состоящий из суспензии эритроцитов и коллоидного золота, время инкубации которого
составило 30 минут
На рис. 4 видно, что уменьшение дозы начала фотодинамического действия при
добавлении коллоидного золота к фотосенсибилизатору не связано с тепловым действием
последнего.
Полученные в ходе данной работы средние дозы начала ФДЭ представлены в
таблице. Согласно полученным данным, можно сделать вывод о том, что уменьшение
пороговой дозы было в среднем на 0,2…0,5 Дж.
http://sntbul.bmstu.ru/doc/736178.html
Значения пороговой дозы начала ФДЭ для различных образцов
Препарат
Время инкубации, мин.
Доза, Дж
Радахлорин
30
1,092±0,124
Радахлорин + коллоидное
10
1,250±0,137
золото (0,25 %)
30
1,358±0,150
Радахлорин + коллоидное
10
0,815±0,089
золото (0,5 %)
30
0,545±0,059
Радахлорин + коллоидное
10
0,541±0,060
золото (1,25 %)
30
0,820±0,092
Выводы
Сочетанное действие коллоидного золота и фотосенсибилизатора приводит к
уменьшению пороговой дозы начала фотодинамического действия.
Согласно полученным зависимостям, можно предположить, что минимальное
количество коллоидного золота, при котором еще происходит уменьшение пороговой
дозы, находится в пределах [0,25 %; 0,5 %] от облучаемого объёма суспензии
эритроцитов.
По-видимому, коллоидное золото способствует уменьшению пороговой дозы за
счет увеличения уровня накопления фотосенсибилизатора путем пиноцитоза вместе с
наночастицами.
Само
коллоидное
золото
не
является
фотосенсибилизирующим
веществом.
Список литературы
1.
Terentyuk G.S., Maslyakova G.N., Suleymanova L.V. Inducirovannaya lazerom tkanevaya
gipertermiia s ispolzovaniem zolotikh nanochastic: v napravlenii lecheniia raka [Laserinduced tissue hyperthermia mediated by gold nanoparticles: toward cancer phototherapy]
// Journal of Biomedical Optics. 2009. Vol. 14. P. 021016-1 – 021016-9.
2.
Дыкман Л.А., Хлебцов Н.Г. Золотые наночастицы в биологии и медицине:
достижения последних лет и перспективы // Acta naturae. 2011. № 2 (9). С. 36-59.
3.
Рябчикова Е.И., Пышная И.А., Спицына Ю.Е. Позолотить клетку // Наука из первых
рук. 2011. № 4 (40). С. 10-13.
4.
Kuo W.S., Chang C.N., Chang Y.T. et al. Zolotie nanosterzhni v kachsetve agentov
gipertermii i blizhnei infrakrasnoi opticheskoi vizualizacii [Gold nanorods in
Молодежный научно-технический вестник ФС77-51038, ISSN 2307-0609
photodynamic therapy, as hyperthermia agents, and in near-infrared optical imaging]
// Angew Chem Int Ed Engl. 2010. № 49 (15). P. 2711-2715.
5.
Tuchina E.S., Ratto F., Khlebtsov B. Kombinirovanniie bliznii infrakrasnii termoliz i
fotodinamicheskaia terapiia pri pomoshchi zolotikh nanochastic i organicheskikh krasitelei
[Combined near infrared photothermolysis and photodynamic therapy by association of
gold nanoparticles and an organic dye] // Plasmonics in Biology and Medicine VII (San
Francisco, California, USA, Junary 22, 2011): proceedings. San Francisco, 2011. V.
7911.79111C. DOI: 10.1117/12.875122.
6.
Сайт компании ООО «РАДА-ФАРМА®». Режим доступа: http://www.radapharma.ru
(дата обращения 15.04.2014).
7.
Жаров В.П., Змиевской Г.Н., Калинин К.И. и др. Фотоматричные аппараты для
терапии
пространственно-протяженных
патологий
//
Биомедицинская
радиоэлектроника. 1999. № 5. С. 46-48.
8.
Жорина Л.В., Змиевской Г.Н., Семчук И.П. и др. Дозиметрические аспекты
фотодинамической терапии при наличии ускоряющих и замедляющих факторов //
Мир измерений. 2013. № 7. С. 27-33.
http://sntbul.bmstu.ru/doc/736178.html