по биохимии - Нижегородская государственная медицинская

Государственное образовательное учреждение высшего
профессионального образования
«Нижегородская государственная медицинская
академия
Федерального агентства по здравоохранению и
социальному развитию»
Кафедра биохимии им. Г.Я. Городисcкой
РУКОВОДСТВО
К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ
ПО БИОХИМИИ
НИЖНИЙ НОВГОРОД
2010
Руководство к практическим занятиям по биохимии. -Нижний Новгород: издательство Нижегородской государственной медицинской академии, 2010.
Учебное пособие составлено в соответствии с программой по биохимии для студентов всех факультетов медицинских вузов.
Оно предназначено для самостоятельной подготовки студентов и оптимизации их работы на практических занятиях.
Составители:
Зав. кафедрой, д.б.н. Е.И. Ерлыкина (общая редакция), доценты
к.м.н. С.П. Калашников, к.м.н. П.П. Загоскин, к.б.н. Е.И. Кузьмина, к.м.н.
Т.И. Шлапакова, ст. преподаватели к.б.н. Т.С. Семенова, к.м.н. Л.И. Якобсон,
ассистенты В.П. Французова, Т.Ф. Сергеева, к.б.н. О.И. Коновалова, к.б.н.
О.В. Баринова.
Печатается по решению Методической комиссии по естественнонаучным дисциплинам.
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2010
2
ПРЕДИСЛОВИЕ
Предлагаемое вашему вниманию учебное пособие составлено на основе многолетнего опыта работы преподавателей кафедры биологической химии им. Г. Я. Городисской Нижегородской государственной медицинской
академии.
Пособие построено по принципу систематизации полученных знаний
по биохимии на основе проведения лабораторной работы, обсуждения полученных результатов и закрепления теоретического материала.
Руководство составлено в соответствии с программой по курсу биохимии, рекомендованной МЗ РФ.
Учебное пособие содержит:
- введение к соответствующему разделу биохимии, биомедицинское
значение тем лабораторных занятий,
- методики выполнения практических работ,
- теоретические вопросы для подготовки студентов к аудиторным занятиям и зачетам.
Авторский коллектив заранее благодарен преподавателям и студентам
за советы и замечания по содержанию и оформлению представленного руководства.
3
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ТЕХНИКЕ БЕЗОПАСНОСТИ И ПРОИЗВОДСТВЕННОЙ
САНИТАРИИ ПРИ РАБОТЕ НА КАФЕДРЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ
ХИМИИ
МЕРЫ ПРОТИВОПОЖАРНОЙ БЕЗОПАСНОСТИ
1. Курение в лабораториях, служебных помещениях и коридорах категорически запрещается.
2. В случае воспламенения горючей жидкости необходимо:
-немедленно выключить электронагревательные приборы и вентиляцию;
-вынести из лаборатории все сосуды с огнеопасными жидкостями;
-при возникновении пожара вызвать противопожарную команду.
3. Пламя необходимо гасить следующими средствами:
-при загорании жидкостей, смешивающихся с водой, любыми огнетушителями: струей воды, песком, асбестом, кошмой, суконным одеялом;
-горящие провода и электроприборы, находящиеся под напряжением,
обесточить и тушить углекислым огнетушителем;
-горящие деревянные части – всеми огнегасящими средствами: сухой песок, кошма.
Лица, виновные в нарушении инструкции пожарной безопасности, несут
административную и материальную ответственность.
МЕРЫ БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ РАБОТЕ С АГРЕССИВНЫМИ СРЕДАМИ
1. Проводить опыты, только предусмотренные преподавателем, соблюдая
правила безопасности.
2. В химической лаборатории не ешьте, не пробуйте вещества на вкус, не
наклоняйтесь над склянкой с реактивами.
3. Определяя вещество по запаху, осторожно направляйте к себе газ или пар
и не делайте глубокого вдоха.
4. Будьте особенно осторожны в обращении с концентрированными кислотами, щелочами и ядовитыми веществами. Если на участки кожи или одежды
попал реактив, то сначала тщательно смойте водой, затем протрите нейтрализующим реактивом.
5. Для приготовления растворов серной кислоты необходимо приливать в воду тонкой струей при непрерывном помешивании. Приливать воду в серную
кислоту запрещается.
6. Жидкости, могущие причинить ожоги или отравления, запрещается брать
ртом через пипетки.
4
МЕРЫ БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ РАБОТЕ С ЭЛЕКТРООБОРУДОВАНИЕМ И
ЭЛЕКТРИЧЕСКИМИ ПРИБОРАМИ
При работе с электрооборудованием и электроприборами запрещено:
-работать с неисправным электрооборудованием;
-прикасаться руками или металлическими предметами к корпусам электроприборов и оголенным проводам;
-нарушать правила пользования электроприборами; уходя из помещения,
оставлять включенными электрические установки без надзора;
-заменять перегоревший предохранитель проволочным “жучком”.
В случае загорания электропроводов или электроприборов под током, немедленно отключить ток. Загоревшиеся провода тушить углекислым огнетушителем.
Основными поражающими факторами являются: поражение электрическим током, электрической дугой, ослепление электрической дугой.
Быстрая и правильная помощь при поражении электрическим током –
главное условие спасения пострадавшего.
Необходимо:
-как можно быстрее освободить его от действия электрического тока, перед этим выключив ток;
-если поблизости нет рубильника, силой отделить пострадавшего от проводника, не касаясь его тела, встав при этом на резиновый коврик, сухую
фанеру или брезент;
-если на пострадавшего упал оголенный проводник под напряжением, то
этот провод нужно сбросить сухой палкой или защищенной (рукавом,
шарфом) рукой;
-оказать первую помощь, обеспечить пострадавшему приток свежего воздуха, дать понюхать нашатырный спирт, согреть тело растиранием, при
отсутствии признаков жизни сделать искусственное дыхание;
-вызвать врача.
5
СЕМЕСТР 1
ЗАНЯТИЕ 1
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА В БИОХИМИИ.
ЭЛЕКТРОМЕТРИЯ.
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ:
Зависимость активности ферментативных реакций от рН среды имеет
большое значение для организма. Диапазон колебания рН в физиологических
условиях незначителен, но на ограниченном участке клетки могут быть изменения рН, которые и влияют на активность ферментов. Знание оптимумов рН для индивидуальных ферментов важно для практической медицины.
Определение рН биологических жидкостей требуется для диагностики и
коррекции некоторых патологических состояний. При положительном балансе водородных ионов происходит закисление – ацидоз. Обратный процесс
называется алкалозом. Электрометрический метод анализа позволяет с высокой точностью (до сотых) определять рН биологических жидкостей.
Работа 1. Определение pH биологических жидкостей с помощью
рН-метра (иономера).
ОБОРУДОВАНИЕ: иономер ЭВ-74 или И – 160 М.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Прибор состоит из двух электродов - стеклянного и хлорсеребряного, погруженных в исследуемый раствор, электронного милливольтметра, шкала
которого градуирована в единицах рХ и в милливольтах ЭДС электродной
пары.
Измерительным является стеклянный электрод, потенциал которого зависит от концентрации (активности) ионов водорода в исследуемом растворе.
Хлорсеребряный электрод имеет постоянный потенциал.
ХОД РАБОТЫ.
Включить прибор в сеть. Нажать тумблер "сеть", переключатель "анионы/катионы" и нажать рХ, затем выбрать кнопку диапазонов измерения "-1 +19".
Тщательно промыть электроды прибора водопроводной водой, ополоснуть
дистиллированной водой и обтереть чистой фильтровальной бумагой. В
стеклянный стаканчик налить исследуемый раствор или биологическую жидкость в таком объеме, чтобы рабочие поверхности электродов были полностью погружены в слой жидкости.
Считать результат с нижней (грубой) шкалы прибора в единицах рХ (рН).
Выбрать необходимый поддиапазон для точного (до 0,01 ед. рН) измерения рН, нажимая соответствующую кнопку на правой стороне панели прибора. Считать результат с верхней шкалы прибора.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
6
Работа 2. Определение рН биологических жидкостей с помощью
универсальной индикаторной бумаги (см. инструкцию на пенале).
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОД (Сравнить достоинства и недостатки предложенных методов):
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:
1. Электролиты в биологических системах. Вода как слабый электролит.
Ионное произведение воды.
2. Выражение концентрации водородных ионов с помощью рН. Шкала рН.
Понятие о нейтральных, кислых и щелочных средах.
3. Методы определения рН растворов:
а) колориметрический, б) электрометрический.
4. Какие вещества называют индикаторами? Что такое универсальный индикатор?
5. Потенциал электрода. Электроды сравнения: водородный, хлорсеребряный. Электрод измерения. Стеклянный электрод. Устройство и принцип работы иономера.
6. рН как параметр гомеостаза. Понятие ацидоза и алкалоза. Биологическое
значение поддержания постоянства внутренней среды организма.
ЗАНЯТИЕ 2
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В БИОХИМИИ.
ФОТОМЕТРИЯ.
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ:
Фотоэлектроколориметрический метод анализа относится к методам
определения концентрации вещества в окрашенном растворе по интенсивности окраски. Метод широко применяется в медицине для определения
концентраций окрашенных веществ в биологических жидкостях и тканях.
Он может быть использован для измерения концентраций и неокрашенных
веществ, если эти вещества могут быть переведены в окрашенное состояние с помощью подходящего реагента.
Работа 1. Количественное определение ионов железа в растворе
фотоэлектроколориметрическим методом.
ОБОРУДОВАНИЕ: фотоэлектроколориметр КФК-2МП.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Колориметрический метод основан на физическом свойстве данного вещества избирательно поглощать монохроматический поток световой энергии.
7
Степень поглощения света раствором может быть охарактеризована оптической плотностью раствора (Д), которую можно выразить как десятичный логарифм величины ослабления света (Т), т. е. Д = - LgT, где Т – это отношение
I1/I0 , где I1 - интенсивность светового потока, прошедшего через слой окрашенного вещества, I0 – интенсивность падающего светового потока.
Между концентрацией вещества в растворе и величиной оптической плотности (экстинкцией) имеется прямо пропорциональная зависимость, описываемая законом Бугера-Ламберта-Беера:
D=.l.с,
где  - молярный коэффициент светопоглощения (индивидуален для каждого
вещества),
l - толщина слоя раствора,
с- молярная концентрация.
ХОД РАБОТЫ.
Построение калибровочного графика.
В три мерные колбочки на 25 мл отмеривают по 10 мл одного из стандартных растворов с концентрацией железа: 0,1 мг/мл; 0,2 мг/мл; 0,4 мг/мл.
В каждую колбочку добавляют по 1 мл салициловой кислоты для образования окрашенного комплекса и доводят объем в колбе дистиллированной
водой до метки. После перемешивания перед каждым определением ополаскивают приготовленным раствором кювету (толщина кюветы 10 мм), затем
заполняют ее и колориметрируют против воды. По полученным данным
строят график зависимости оптической плотности от концентрации ионов
железа в растворе.
ТЕХНИКА РАБОТЫ НА ФОТОЭЛЕКТРОКОЛОРИМЕТРЕ МАРКИ
КФК-2-МП.
При открытой крышке прогреть ФЭК 15 минут. Установить светофильтр
(для данного анализа –зеленый; длина волны 540 нм). Поставить кюветы
(дальняя кювета - контроль, содержащий дистиллированную воду (растворитель), ближняя кювета - анализируемый раствор).
Установить рычаг влево. Нажать кнопку "ПУСК". Нажать кнопку "Ш0".
Закрыть крышку. Нажать кнопку "К1". Перевести рычаг в правое положение.
Нажать кнопку "D5". Считать результат со шкалы прибора. Перевести рычаг
в левое положение. Открыть крышку. Вынуть "опытную" кювету. Протереть
кюветное отделение ФЭК. Прибор готов к дальнейшим измерениям.
Определение концентрации ионов железа в исследуемом растворе (решение задачи)
В мерную колбу на 25 мл взять 10 мл исследуемого раствора, добавить 1
мл салициловой кислоты и довести объем до метки. Содержимое колбы тщательно перемешать. Измерить оптическую плотность полученного раствора
на фотоэлектроколориметре и по калибровочному графику определить концентрацию ионов железа в исследуемом растворе.
Определить концентрацию можно и более простым способом, подобрав
стандартный раствор, оптическая плотность которого наиболее близка к
8
оптической плотности анализируемого раствора, и решив пропорцию:
относительно Сх.
Dст---------Сст
Dx------------Cx
КАЛИБРОВОЧНЫЙГРАФИК
0.4
0.35
0.3
0.25
D
оптическая 0.2
плотность
0.15
0.1
0.05
0
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
Концентрацияжелезавмг/мл
С (Fe3+), D
мг/мл
0,1
0,2
0,4
РЕЗУЛЬТАТЫ (решение задачи):
Dx Cx ВЫВОДЫ:
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:
1. Сущность колориметрического метода определения концентрации вещества в растворе. Принцип метода. Закон Бугера- Ламберта -Беера.
2. Применение фотометрического (колориметрического) метода исследования в биологии и медицине.
3. Принцип работы фотоэлектроколориметра. Его устройство. Порядок работы на фотоэлектроколориметре. Калибровочный график, его построение и
использование.
9
ЗАНЯТИЕ 3
СТРУКТУРА И СВОЙСТВА БЕЛКОВ.
ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА БЕЛКОВ.
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ:
Белки - высокомолекулярные, полимерные соединения, состоящие из аминокислот. Определение свободных аминокислот имеет клиникодиагностическое значение при изучении обмена белков в организме. Изменение содержания аминокислот в сыворотке крови и моче наблюдаются при
недостаточной функции печени: усиленном распаде белков, а также при
нарушении выделительной функции почек.
Обнаружить присутствие белка и отдельных аминокислот в биологических жидкостях можно с помощью качественных реакций. Хроматографический метод исследования используется для установления аминокислотного состава гидролизатов белков, первичной структуры, а также для количественного определения свободных аминокислот в крови, моче, экссудатах и
других биологических жидкостях.
Работа 1 . Анализ хроматограмм гидролизатов различных белков.
ОБОРУДОВАНИЕ: ФЭК, хроматограммы различных белков, пробирки со
спиртовым раствором для экстракции.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Аминокислотный состав гидролизатов белков исследуется с помощью распределительной хроматографии на бумаге. Распределительная хроматография основана на способности веществ по-разному адсорбироваться на адсорбентах и по-разному растворяться в полярных и неполярных растворителях.
В качестве адсорбента в данном методе используется хроматографическая
бумага. Разделение проводится смесью растворителей (бутанол + ледяная уксусная кислота + вода в соотношении 4:1:5). При этом вода удерживается
бумагой, а органический растворитель движется по бумаге с определенной
скоростью. Вещества (в данном случае аминокислоты), растворимые в органическом растворителе, будут двигаться по бумаге вместе с растворителем.
Вещества, растворимые в воде, займут на хроматограмме промежуточное положение между линией старта и линией фронта растворителя. После окончания разделения и высушивания хроматограммы ее проявляют раствором
нингидрина и вновь высушивают. После этого пятна разделенных аминокислот становятся видимыми и доступными для качественного и количественного анализа.
ХОД РАБОТЫ.
Студенты исследуют готовые хроматограммы различных белков.
1. Качественный анализ хроматограмм (идентификация пятен аминокислот). Производится путем расчета коэффициентов Rf для каждого пятна:
10
Rf 
lв  ва
lф.р.
где
Rf- коэффициент распределения,
lв-ва- путь, пройденный веществом от линии старта,
lф.р.- путь, пройденный фронтом растворителя от линии старта.
Пользуясь табличными значениями Rf для каждой аминокислоты, идентифицируют аминокислоты исследуемой хроматограммы. Для расчета коэффициента измеряют расстояния от линии старта до центра каждого пятна и расстояние от линии старта до линии фронта растворителя.
Рассчитанные значения коэффициентов Rf сравнивают с табличными данными и идентифицируют таким образом все пятна аминокислот на хроматограмме.
Аминокислоты
Аминокислоты
Аланин
Rf
0.45
Треонин
Rf
0.35
Аргинин
0.20
Триптофан
0.55
Аспарагиновая к-та
0.24
Фенилаланин
0.68
Глицин
0.25
Метионин
0.55
Серин
0.27
Цистеин
0.07
Глутаминовая к-та
0.30
Цистин
0.08
Пролин
0.43
Лизин
0.12
Валин
0.60
Лейцин
0.73
2. Количественный анализ хроматограмм Окрашенные пятна, соответствующие определенным аминокислотам, вырезать ножницами, измельчить в виде
щеточек и поместить для экстракции окрашенного продукта в пробирки со
спиртовым раствором. Для полноты экстракции пробирки закрыть пробками
и оставить на 30 мин. в темноте, время от времени встряхивая содержимое.
Затем окрашенные растворы проколориметрировать на ФЭКе с зеленым светофильтром*( длина волны 540 нм; толщина кюветы 5 мм). По полученным
величинам оптической плотности (D) с помощью калибровочного графика
найти концентрацию каждой аминокислоты.
*
После колориметрии жидкость не выливать, а слить обратно в пробирку.
11
Калибровочныйграфикдляопределения
аминокислотвгидролизатебелка
0.4
0.3
Dоптическая
0.2
плотность
0.1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
СконцентрацияаминокислотвмкМ/мг белка
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОДЫ:
Работа 2. Определение концентрации белка в сыворотке крови
рефрактометрическим методом.
ОБОРУДОВАНИЕ: рефрактометр.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
При переходе луча света из среды оптически менее плотной в среду оптически более плотную и наоборот происходит изменение его направления, т.е.
рефракция. Величина рефракции зависит от показателя преломления исследуемого вещества:
n = c/v, где
n – абсолютный показатель преломления данной среды, который указывает, во сколько раз скорость света в вакууме (с) больше скорости света в
среде (v).
Показатель преломления является важной характеристикой исследуемого
вещества, зависящей от химической природы, структуры и характера связей
12
внутри молекулы и между молекулами, от их взаимодействия, плотности и
концентрации исследуемого вещества. В связи с этим метод рефрактометрии
используют для установления размера и формы частиц, структуры молекул,
молекулярной массы веществ, для измерения концентрации веществ в рабочих растворах, в том числе в биологических жидкостях.
Для растворов зависимость концентрации от преломления определяется
уравнением:
С = (n – n0) / K, где
n и n0 – соответственно показатели преломления раствора и растворителя,
С – процентная концентрация вещества в растворе, К – удельный инкремент
показателя преломления при увеличении концентрации раствора на 1%. Когда величина К неизвестна, концентрацию определяют методом калибровочных кривых. В обычной работе концентрацию вещества чаще устанавливают
по известным таблицам соответствия ее показателю преломления. Их составляют по результатам стандартных измерений для данного вещества.
ХОД РАБОТЫ.
Измерения начинают с проверки нулевой точки.
1. На полированную рабочую грань измерительной призмы поместить
пипеткой 2-3 капли дистиллированной воды и опустить осветительную
призму.
2. Зеркалом направить свет в осветительную призму. Вторым зеркалом
осветить шкалу рефрактометра.
3. Вращением окуляров зрительной и микроскопической труб установить
резкость изображения полей зрения. Найти в поле зрительной трубы
границу светотени.
4. Вращая ручку компенсатора дисперсии устранить ее окрашивание.
5. Совместить границу светотени с визирными линиями. Отсчитать показатель преломления с точностью до десятичных долей. (При правильной настройке прибора граница светотени должна совпадать с визирными линиями и показателем преломления 1,333.)
6. Осторожно высушить измерительную призму бумажным фильтром.
Измерение преломления исследуемого раствора.
1. Измерение проводится таким же образом, как и проверка нулевой точки, но вместо воды берется исследуемый раствор.
2. Если раствор темный или окрашен, измерения проводят в отраженном
свете, освещая снизу измерительную призму.
3. По окончании измерений рабочие поверхности призм промывают дистиллированной водой и протирают насухо.
4. По показателю преломления определяют концентрацию белка с использованием калибровочных графиков или таблиц. При рефрактометрическом определении содержания белка в сыворотке крови используют таблицу Рейса показателей преломления белковых растворов
разной концентрации.
Норма содержания белка в сыворотке крови составляет 6,5 – 8,5 %, у детей до 3-х лет – 5,7 – 7 %.
13
Показатели преломления белковых растворов по Рейсу.
Показатель преломления
1,3412
1,3413
1,3414
1,3421
1,3422
1,3423
1,3424
1,3425
1,3426
1,3427
1,3428
1,3429
1,3430
1,3431
1,3432
1,3433
1,3434
1,3435
1,3436
1,3437
1,3438
1,3439
1,3440
1,3441
1,3442
1,3443
1,3444
1,3445
1,3446
1,3447
1,3448
1,3505
1,3506
1,3507
1,3508
1,3509
1,3510
1,3511
1,3512
1,3513
Белок, %
Показатель
преломления
Белок, %
Показатель
преломления
Белок, %
3,06
3,1
3,16
3,56
3,62
3,68
3,74
3,79
3,85
3,92
3,97
4,03
4,09
4,14
4,2
4,26
4,32
4,36
4,43
4,48
4,54
4,61
4,68
4,73
4,78
4,83
4,9
4,95
5,0
5,07
5,14
8,45
8,5
8,56
8,62
8,68
8,74
8,8
8,86
8,91
1,3415
1,3416
1,3417
1,3449
1,3450
1,3451
1,3452
1,3453
1,3454
1,3455
1,3456
1,3457
1,3458
1,3459
1,3460
1,3461
1,3462
1,3463
1,3464
1,3465
1,3466
1,3467
1,3468
1,3469
1,3470
1,3471
1,3472
1,3473
1,3474
1,3475
1,3476
1,3514
1,3515
1,3516
1,3517
1,3518
1,3519
1,3520
1,3521
1,3522
3,21
3,27
3,32
5,21
5,25
5,31
5,37
5,42
5,49
5,54
5,59
5,66
5,71
5,76
5,83
5,89
5,94
6,01
6,06
6,12
6,18
6,23
6,29
6,36
6,42
6,48
6,52
6,58
6,64
6,7
6,77
8,96
9,03
9,08
9,14
9,2
9,27
9,32
9,38
9,43
1,3418
1,3419
1,3420
1,3477
1,3478
1,3479
1,3480
1,3481
1,3482
1,3483
1,3484
1,3485
1,3486
1,3487
1,3488
1,3489
1,3490
1,3491
1,3492
1,3493
1,3494
1,3495
1,3496
1,3497
1,3498
1,3499
1,3500
1,3501
1,3502
1,3503
1,3504
1,3523
1,3524
1,3525
1,3526
1,3527
1,3528
1,3529
1,3530
1,3531
3,39
3,44
3,5
6,82
6,88
6,94
7,0
7,05
7,11
7,16
7,22
7,28
7,33
7,4
7,46
7,51
7,58
7,63
7,69
7,74
7,79
7,86
7,92
7,98
8,04
8,09
8,15
8,21
8,28
8,33
8,39
9,51
9,55
9,62
9,67
9,73
9,79
9,84
9,9
9,95
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОД:
14
Работа 3. Биуретовая реакция на пептидную связь (реакция Пиотровского).
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Реакция обусловлена присутствием в белке пептидных связей, образующих с ионами меди в щелочной среде солеобразные комплексы. В зависимости от длины полипептидной цепи раствор окрашивается в сине-фиолетовый
или розовый цвет.
ХОД РАБОТЫ.
К 10 каплям раствора белка прибавить 5 капель 10% едкого натра и 1 каплю 1% сернокислой меди и перемешать. Содержимое пробирки приобретает
сине-фиолетовый цвет. То же самое проделать с растворами полипептидов и
аминокислот. Затем решить задачу, определив содержимое раствора (белок,
полипептид, смесь аминокислот), проделав биуретовую реакцию.
РЕЗУЛЬТАТЫ.
ВЫВОД:
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:
1. Белки - важнейшие макромолекулы организма. Разнообразие белков и
их функций. Понятие о протеомике.
2. Аминокислоты – структурные мономерные молекулы белка, их строение, свойства, классификация, номенклатура. Заменимые и незаменимые аминокислоты.
3. Первичная структура, строение полипептидной цепи, пептидная связь,
наименование пептидов.
4. Наследственные изменения первичной структуры. Примеры изменения
свойств белка при изменении первичной структуры.
Для фарм. факультета:
1. Методы определения молекулярной массы и структуры белка.
2. Аминокислоты, пептиды и белки как лекарственные препараты.
15
ЗАНЯТИЕ 4
ПРОСТРАНСТВЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БЕЛКОВОЙ МОЛЕКУЛЫ.
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.
При воздействии различных физических и химических факторов может
происходить денатурация белка. Снижается ферментативная активность
биологических катализаторов, а субстраты белковой природы легче подвергаются гидролизу. Способность белка прочно связывать ионы тяжелого
металла в виде нерастворимых осадков в воде используется как противоядие при отравлении солями ртути, меди, свинца и др.
Метод диализа широко применяют для очистки коллоидных растворов и
растворов высокомолекулярных соединений от низкомолекулярных примесей. На принципе компенсационной диффузии основан аппарат «искусственная почка», при помощи которого можно освобождать кровь от продуктов
обмена веществ и, следовательно, временно замещать функцию больной
почки.
Работа 1. Высаливание.
ОБОРУДОВАНИЕ: воронки с фильтрами.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Высаливание – процесс осаждения белков солями щелочных и щелочноземельных металлов (NaCl, KCl, MgSO4, Na2SO4), и солями аммония
(NH4)2SO4. Реакция высаливания обусловлена дегидратацией макромолекул
белка с одновременной нейтрализацией электрического заряда.
Глобулины, имеющие больший молекулярный вес, легче высаливаются,
чем альбумины. Глобулины осаждаются в полунасыщенном, а альбумины – в
насыщенном растворе сернокислого аммония.
При высаливании белок почти не теряет своих естественных свойств; он
может, например, вновь проявлять свою ферментативную активность. При
растворении осажденного белка в воде происходит восстановление его исходных физико-химических и биологических свойств. Метод высаливания
позволяет получить белки в кристаллическом виде и разделить белковые
фракции.
ХОД РАБОТЫ.
В пробирку наливают 2 мл сыворотки крови, прибавляют равный объем
насыщенного раствора сернокислого аммония и перемешивают. Получается
полунасыщенный раствор сернокислого аммония. Выпадает осадок белка
(глобулина).
Через 30 минут отфильтровывают содержимое пробирки. В фильтрате
остается другой белок – альбумин.
Для высаливания альбумина в фильтрат добавляют тонко измельченный
порошок сернокислого аммония до полного насыщения, т.е. до тех пор, пока
новая порция порошка останется не растворенной. В осадок выпадает альбумин. Альбумин отфильтровывают. Проверяют фильтрат на отсутствие белка
с помощью биуретовой реакции.
16
РЕЗУЛЬТАТЫ:
Отметить положительный результат осаждения белков плюсом, а отрицательный – минусом, и результаты занести в таблицу.
Название
Осаждение в полуна- Осаждение в насыщенбелковых фракций
сыщенном
растворе ном растворе (NH4)2SO4
(NH4)2SO4
ВЫВОД:
Работа 2. Определение изоэлектрической точки казеина.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
В изоэлектрической точке белки обладают наименьшей устойчивостью
из-за потери заряда. Молекулы белка при этом агрегируют, образуя более
крупные частицы, что приводит к увеличению светорассеяния (мутности)
раствора.
ХОД РАБОТЫ.
В пять пробирок отмерить по 9 мл буферных растворов с определенным
значением рН. Добавить по 1 мл раствора казеина. Перемешать содержимое
пробирок. Через 10-15 минут оценить степень мутности во всех пробирках.
Отметить пробирку с наибольшей степенью помутнения (коагуляции).
РЕЗУЛЬТАТЫ записать в таблицу:
№№
РН буферной Объем буферной Раствор казеи- Степень
пробирок смеси
смеси (мл)
на (мл)
мутности*
1
3.8
9
1
2
4.4
9
1
3
4.7
9
1
4
5.1
9
1
5
5.7
9
1
ВЫВОД:
*
Степень мутности :" +++" - значительная, "++" -менее значительная," +" -слабая, "-" -отсутствие мутности.
17
Работа 3. Необратимые способы осаждения белка из раствора.
ОБОРУДОВАНИЕ: водяная баня ( 100С).
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Осаждение белков из растворов и биологических жидкостей может быть достигнуто с помощью физических и химических агентов, вызывающих необратимую денатурацию белка с нарушением обоих факторов устойчивости
молекул белка (гидратной оболочки и заряда) и выпадением белка в осадок.
ХОД РАБОТЫ.
Работа выполняется в соответствии с условиями, указанными в таблице:
№№
Денатурирующие
Порядок работы
Резульпроби- агенты
таты
рок
1
Температура
(кипяче- 1 мл белка + нагревание при
ние)
100оС 5-10 мин.
2
Ионы Pb (раствор ацета- 1 мл белка + 2-3 капли раста свинца)
твора ацетата свинца*
3
Концентрированные
1 мл конц. HNO3 + 1 мл белка
минеральные кислоты
(осторожно наслоить!)*
(качественная реакция
на белок в моче)
4
Концентрированные ор- 1 мл белка + 1 мл 50% триганические кислоты
хлоруксусной кислоты (ТХУ)
ВЫВОД:
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:
1. Вторичная структура белка, связи ее стабилизирующие. Характеристика спирали и -складчатой структуры.
2. Третичная структура, связи ее стабилизирующие. Понятие о доменах и
кластерах. Мономерные белки.
3. Четвертичная структура, связи ее стабилизирующие. Олигомерные белки.
4. Фолдинг белков. Понятие о шаперонах.
5. Белок-лигандные и белок-белковые взаимодействия. Избирательность взаимодействия. Типы природных лигандов и особенности их взаимодействия с
белками. Привести примеры. Роль в образовании межмолекулярных комплексов.
6. Физико–химические свойства белков. Молекулярная масса. Изоэлектрическая точка белков. Влияние рН на заряд белков.
*
Соблюдай технику безопасности при работе с сильно действующими и ядовитыми веществами.
18
7. Факторы устойчивости белка в растворе. Денатурация белков. Использование денатурации в лабораторных биохимических исследованиях и медицине.
Для фарм. факультета:
1. Методы выделения и очистки индивидуальных белков.
ЗАНЯТИЕ 5
ФЕРМЕНТЫ. СПЕЦИФИЧНОСТЬ ДЕЙСТВИЯ.
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ:
Диагностическая энзимология является областью медицины, использующей ферменты для диагностики и контроля за результатами лечения.
Многие болезни (врожденные нарушения метаболизма) определяются генетически обусловленными нарушениями в синтезе ферментов. При повреждении клеток (вызванном, например, недостатком кровоснабжения или
воспалением) некоторые ферменты попадают в плазму крови. Измерение
активности таких ферментов обычно используется для диагностики многих
распространенных заболеваний (например, инфаркта миокарда).
Многие методы биохимических исследований основаны на абсолютной
специфичности действия ряда ферментов. Например, специфичность глюкозооксидазы позволяет с высокой точностью определять концентрацию
глюкозы в крови.
Работа 1. Специфичность действия амилазы и сахаразы.
ОБОРУДОВАНИЕ: термостат на 38оС, водяная баня на 100оС.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Каждый фермент может катализировать только одну реакцию, действуя на
одно вещество или ряд веществ, сходных по строению. Высокая специфичность - одно из наиболее характерных свойств ферментов. В данной работе
специфичность изучается на примере двух ферментов класса гидролаз (подкласса гликозидаз) - амилазы и сахаразы. Для выявления продуктов реакций,
имеющих свободную альдегидную или кетонную группировку, применяют
реакцию Троммера.
ХОД РАБОТЫ.
Готовится инкубационная смесь в 4-х пробирках по следующей схеме:
№№
Амилаза
проби- (слюна 1:10,
рок
тщательно
перемешать)
1
5 кап.
2
3
5 кап.
4
-
Сахараза
Крахмал
0,5 %
5 кап.
5 кап.
10 кап.
10 кап.
19
Сахароза
Результат про(тростнико- бы Троммера
вый
сахар,
1%)
10 кап.
10 кап.
Готовые пробирки поместить в термостат на 10 минут при температуре
38оС. После термостатирования с содержимым каждой пробирки провести
реакцию Троммера. Результаты занести в таблицу.
Реакция Троммера основана на способности глюкозы, окисляясь, восстанавливать металлы, в данном случае двухвалентную медь. При нагревании в
кипящей водяной бане Cu(OH)2 (осадок голубого цвета) восстанавливается в
CuOH (осадок желтого цвета), а затем в Cu2O (осадок красного цвета). Для
проведения реакции Троммера к исследуемому раствору прибавить 5 капель
10% раствора NaOH и 2 капли 1% раствора CuSO4. пробирки поместить в
водяную баню на 1-2 минуты. Нельзя добавлять избыток CuSO4 и передерживать пробирки в водяной бане, т.к. в этом случае может образоваться оксид меди CuO (черный осадок), маскирующий положительную реакцию.
ВЫВОДЫ:
Работа 2. Количественное определение глюкозы в крови глюкозооксидазным методом.
ОБОРУДОВАНИЕ: ФЭК, центрифуга.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Метод основан на специфичности действия фермента глюкозооксидазы.
Этот фермент окисляет глюкозу в присутствии молекулярного кислорода с
образованием глюконолактона, спонтанно гидролизующегося до глюконовой
кислоты. При этом образуется эквимолярное количество пероксида водорода
(Н2О2), который разлагается ферментом пероксидазой. Выделяющийся в результате пероксидазной реакции атомарный кислород окисляет ортотолидин. Последний из бесцветного соединения переходит в голубое или синее состояние в зависимости от количества выделившегося атомарного кислорода, а, следовательно, от количества глюкозы в исследуемой пробе. Количественное определение глюкозы завершается измерением оптической плотности пробы и сравнением с оптической плотностью пробы, содержащей
стандартный раствор глюкозы.
ХОД РАБОТЫ.
Опытная проба.
1. В центрифужную пробирку, содержащую 0,1мл крови и 1,0 мл физиологического раствора, добавить 0.4 мл 5% раствора ZnSO4 и 0.4 мл 0.3 н.
NaOH. Смесь тщательно перемешать.
2. Через 10 мин. центрифугировать при 1500 об/мин в течение 10 минут
для осаждения белков (правила центрифугирования см. дальше).
3. После центрифугирования надосадочную жидкость ОСТОРОЖНО!
слить в чистую пробирку.
20
4. В другую чистую сухую пробирку отмерить 1 мл надосадочной жидкости и добавить 3 мл рабочего реактива для определения глюкозы (реактив
содержит глюкозооксидазу, пероксидазу и орто-толидин).
5. Через 15 минут раствор колориметрировать на ФЭКе с красным светофильтром против воды (670 нм; толщина кюветы 5 мм).
Стандартная проба.
Готовится точно так же, как и опытная проба, но вместо крови необходимо
взять 0.1 мл стандартного раствора глюкозы с концентрацией 5,5 мМ/л.
Расчет провести по методике, описанной в протоколе к занятию 2:
Dcт--------------5,5 мМ/л
Dx------------ Х мМ/л
Решая пропорцию относительно "Х", найти концентрацию глюкозы в крови и сравнить с нормой. Концентрация глюкозы в крови взрослого здорового
человека колеблется в пределах 3,3 – 5,5 мМ/л.
Правила работы на центрифуге:
1. Открыть крышку центрифуги.
2. Проверить, нет ли воды или других посторонних предметов в гильзах
пробиркодержателя.
3. Используя центрифужные весы, уравновесить каждую пару центрифужных пробирок. Для этого поместите пробирки вместе с гильзами на весы. Добавляя воду в гильзы, добейтесь равновесия пробирок.
4. Поместить пробирки с гильзами в пробиркодержатель.
5. Закрыть крышку.
6. Установить необходимое число оборотов.
7. Включить центрифугу в сеть.
8. По истечении требуемого времени центрифугирования выключить центрифугу.
9. После полной остановки пробиркодержателя снять крышку и вынуть
пробирки.
10. Вылить из гильз воду и закрыть крышку.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОД:
21
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:
1. Понятие о ферментах. Основные отличия ферментов от неорганических
катализаторов.
2. Структура ферментов. Апофермент, кофермент и простетическая группа.
Витамины и ионы металлов как кофакторы ферментов.
3. Наследственные (первичные) энзимопатии, причины их возникновения.
4. Активный центр фермента, его строение, участки активного центра.
5. Теории взаимодействия активного центра ферментов с субстратом (теории
Фишера и Кошланда).
6. Номенклатура и классификация ферментов. Характеристика отдельных
классов ферментов. Привести примеры.
7. Единицы измерения ферментативной активности. Принципы количественного определения активности ферментов.
8. Специфичность действия ферментов, виды специфичности, ее значение
для организма.
9. Применение ферментов в медицине.
Для фармфакультета:
1. Применение ферментов в фармацевтическом анализе.
ЗАНЯТИЕ 6
СТРОЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ. ВИТАМИНЫ КАК УЧАСТНИКИ
ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ.
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.
Витамины являются необходимым компонентом питания для каждого
человека. Витамины являются кофакторами целого ряда сложных ферментов, кроме того, некоторые витамины непосредственно участвуют в химических реакциях. В организме человека большинство витаминов синтезироваться не может. Поэтому витамины должны поступать в необходимом
количестве с пищей. Доза витаминов, потребляемая с пищей, должна соответствовать суточной потребности в данном витамине. Как недостаток,
так и избыток того или иного витамина приводит к нарушению обмена веществ (гипо-, гипер- или авитаминозу).
Работа 1. Открытие апофермента и кофермента в аспартатаминотрансферазе.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
В сложных белках-ферментах белковый компонент (апофермент) может
быть обнаружен с помощью биуретовой реакции. Небелковый компонент,
содержащий производное какого-либо витамина, может быть открыт с помощью качественных реакций на соответствующий витамин. В состав аспартатаминотрансферазы входит в качестве кофермента пиридоксальфосфат производное витамина В6. Витамин В6 (пиридоксол) и его производные бес22
цветны, но приобретают красную окраску в присутствии хлорного железа.
Реакция обусловлена образованием комплексной соли типа фенолята железа.
ХОД РАБОТЫ.
1. Открыть белковую часть фермента с помощью биуретовой реакции. (См.
протокол занятия №3).
2. Открыть кофермент с помощью качественной реакции на витамин В6. В
пробирке смешать 5 капель раствора аспартатаминотрансферазы и 1 каплю
5% раствора хлорного железа. Встряхнуть. Появляется вишневое окрашивание.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОД:
Работа 2. Количественное определение аскорбиновой кислоты в
различных пищевых продуктах.
ОБОРУДОВАНИЕ: весы с разновесами, бюретки для титрования.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Метод основан на окислении аскорбиновой кислоты в дигидроаскорбиновую кислоту 2,6-дихлорфенолиндофенолом, который в кислой среде восстанавливается в бесцветное лейкосоединение.
ХОД РАБОТЫ.
Исследуемый продукт взвесить на весах (см. таблицу). Навеску измельчить
вначале в сухой ступке, а затем с добавлением воды (см. таблицу). Образуется экстракт, в котором содержание витамина С соответствует его содержанию в навеске продукта. Полученный экстракт отфильтровать через ватный
фильтр и набрать необходимое количество фильтрата в колбу для анализа
(см. таблицу).
Исследуемый продукт
Навеска
Кол-во
Кол-во экс- Содержаили объем воды для
тракта для
ние
продукта экстрактитрования
вит. С
для анации
(Б)
(мг%)
лиза (В)
(Г)
Лук
5г
20 мл
1 мл экстракрепчатый
та + 5 мл воды
Настой ши1 мл настоя +
повника
10 мл воды
23
Кол-во
продукта
(г, мл)
Капуста
свежая
Капуста
квашеная
Сок квашеной капусты
Лимонная
мякоть
Лимонная
корка
Яблоко
печеное
5г
20 мл
10 мл
10 г
20 мл
10 мл
Яблоко
Яблочный
сок
Картофель
вареный
Картофель
сырой
Кабачок
1 мл сока + 5
мл воды
1г
10 мл
5 мл
1г
10 мл
5 мл
5г
10 мл
5г
10 мл
5г
10 мл
1г
10 мл
1г
10 мл
1 мл экстракта+ 10 мл воды
5 мл экстракта+ 5 мл воды
5 мл сока +5
мл воды
1 мл экстракта+ 10 мл воды
5 мл экстракта+ 5 мл воды
5 мл экстракта+ 5 мл воды
5 мл экстракта+ 5 мл воды
5 мл экстракта+ 5 мл воды
1 мл экстракта +5 мл воды
Сок
ананасовый
Сок персика
Драже по- 1 драже
ливит.1
50 мл
К заданному количеству фильтрата при необходимости добавить дистиллированную воду (см. таблицу и добавить 1мл 2% раствора НСL , после чего
титровать 2,6 дихлорфенолиндофенолом (2,6-ДХФИФ) до появления слаборозового окрашивания. Необходимо отметить, сколько мл раствора 2,6ДХФИФ пошло на титрование.
Расчет содержания аскорбиновой кислоты необходимо провести на 100 г
плотного продукта, либо на 100 мл жидкого продукта (в мг %). Для расчета
используют формулу:
1
Рассчитать содержание аскорбиновой кислоты в одном драже.
24
X 
0,088  А  Г  100
,
БВ
где: Х - содержание аскорбиновой кислоты в продукте (в мг%),
0,088 - титр аскорбиновой кислоты для 2,6-дихлорфенолиндофенола,
А - результат титрования (кол-во мл 2,6-дихлорфенолиндофенола),
Б - объем экстракта для титрования (мл) без учета воды,
В - навеска (г) или объем (мл) продукта для анализа,
Г - общее количество экстракта (мл),
100 - цифра, необходимая для пересчета содержания аскорбиновой кислоты на 100 г (мл) продукта.
Вычислив содержание аскорбиновой кислоты, необходимо рассчитать количество данного продукта (в г или мл), необходимое для покрытия суточной
потребности в витамине С (50-100 мг).
РЕЗУЛЬТАТЫ заносят в правые столбцы таблицы.
ВЫВОД:
Работа 3 Количественное определение витамина Р в разных сортах
чая.
ОБОРУДОВАНИЕ: бюретки для титрования.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Основан на способности витамина Р окисляться перманганатом калия. В
качестве индикатора применяется индигокармин, который вступает в реакцию с перманганатом калия после того, как окислится весь витамин.
ХОД РАБОТЫ.
В стеклянном стаканчике к 100 мг сухого чая прилить 50 мл кипящей дистиллированной воды. Экстрагировать в течение 5 минут. В другой чистый и
сухой стаканчик отмерить 10 мл экстракта чая, прилить 5 мл дистиллированной воды комнатной температуры и 5 капель индигокармина. Титровать с
перманганатом калия в колбочках до появления желтой окраски, не исчезающей в течение 30 сек. Расчет полученных данных произвести по формуле:
Х=0,0032 . А . 100 . 50/ 10 . 0,1;
где:
Х - содержание витамина Р в мг, содержащееся в 100 г сухого чая,
0.0032 - титр витамина Р для перманганата,
А - результат титрования (кол-во мл перманганата калия),
100 - коэффициент для перевода в мг /100 г.,
50 - общее кол-во экстракта,
10 - кол-во экстракта, взятое для титрования,
25
0.1 - навеска чая в г,
После соответствующих упрощений формула приобретает вид:
Х= 16 . А (мг /100 г).
РЕЗУЛЬТАТЫ:
№№ Сорт чая
п/п
1
2
3
Содержание вит. Р (мг /100 г)
ВЫВОД:
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:
1. Классификация и номенклатура витаминов. Функции витаминов. Алиментарные и вторичные авитаминозы и гиповитаминозы. Гипервитаминозы.
2. Водорастворимые витамины В1, В2, В3, В5, В6, В12, Вс, С, Р, Н, фолиевая
кислота, пангамовая кислота. Структура, участие в обмене веществ.
3. Жирорастворимые витамины А, Д, К, Е, Q, F. Структура, участие в обмене
веществ.
4. Кофакторная функция витаминов:
- витамины кофакторы оксидоредуктаз: В2, В3
- витамины кофакторы трансфераз: В5, В6, Вс, В12
- витамины кофакторы изомераз: В12
- витамины кофакторы лиаз: В1, В6
- витамины кофакторы лигаз: Н, К.
5, Роль аскорбиновой кислоты в гидроксилировании пролина и лизина. Проявление недостаточности витамина С.
6. Витаминоподобные вещества - холин, инозин, S-метилметионин, липоевая
кислота.
7. Понятие об антивитаминах, их роль в обменных процессах в организме.
Для фармацевтического факультета:
1. Витамины как лекарственные препараты.
ЗАНЯТИЕ 7
НЕСПЕЦИФИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.
Зависимость активности ферментативных реакций от рН среды имеет
большое значение для организма как один из факторов неспецифической регуляции активности ферментов и метаболизма в целом. Отклонение рН
26
биологической жидкости или клеточного компартмента от оптимума в
кислую или щелочную сторону влечет за собой снижение активности ферментов, а, следовательно, изменение метаболизма. Знание оптимумов рН
индивидуальных ферментов важно для определения активности ферментов
in vitro, а также для коррекции их активности при нарушении кислотноосновного состояния организма.
Термозависимость ферментативных реакций также используется в практической деятельности врача. Так, искусственное охлаждение организма
(гипотермия) или отдельных его органов используется в клинике для проведения кардиохирургических операций и операций по пересадке органов. Снижение температуры тела замедляет скорость ферментативных реакций,
это позволяет снизить расход энергетических веществ и более длительно
сохранить жизнеспособность организма или трансплантируемого органа.
Повышение температуры тела (лихорадочное состояние), например, при
инфекциях, ускоряет биохимические реакции, катализируемые ферментами.
Искусственная гипертермия является составным компонентом терапии ряда хронических инфекционных и онкологических заболеваний.
Работа 1. Влияние реакции среды на активность ферментов (определение оптимума рН амилазы слюны).
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Оптимум рН амилазы слюны человека определяется в условиях взаимодействия фермента с крахмалом при различных значениях рН среды. О степени расщепления крахмала судят по образующимся продуктам реакции
(амило-, эритро- и мальтодекстрины), обнаруживаемых с помощью раствора
Люголя.
ХОД РАБОТЫ.
Готовится 5 пробирок с инкубационной смесью с разными значениями рН по
схеме, указанной в таблице:
№
пробирки
1
2
3
4
5
рН
буферного
р-ра
5.0
6,2
6.8
7.2
8.0
к-во буф. 0,5%
слюна
(разведение результаты
р-ра,
крахмал 1:30, тщательно пере- реакции
с
мл
мл
мешать) мл
р-ом Люголя
1.0
2.0
1.0
1.0
2.0
1.0
1.0
2.0
1.0
1.0
2.0
1.0
1.0
2.0
1.0
Содержимое каждой пробирки после прибавления слюны тщательно перемешать и оставить при комнатной температуре. Через 5 минут делают капельные пробы на стекле (чашка Петри) с раствором Люголя из 3-й пробирки
до появления желтой окраски. Для этого 2 капли содержимого 3-й пробирки
(комнатная температура) нанести на стекло, к ним добавить 1 каплю раствора
Люголя.
27
При появлении желтого окрашивания в капельной пробе во все пробирки
приливают по 1 капле раствора Люголя и тщательно перемешивают. На основании полученной окраски судят о степени расщепления крахмала в зависимости от рН среды.
ВЫВОД:
Работа 2. Термолабильность ферментов.
ОБОРУДОВАНИЕ: термостат на 38оС, водяная баня на 100оС.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Влияние температурных условий на активность ферментов выявляется на
примере изучения активности амилазы слюны при разных температурах. Об
активности амилазы судят по степени расщепления крахмала (реакция с раствором Люголя).
ХОД РАБОТЫ.
1. В четыре пробирки отмерить по 2 мл крахмала.
2. В другие четыре пробирки отмерить по 1 мл раствора слюны, разведенной 1:10 дистиллированной водой.
3. Пробирки по паре: одна с субстратом (крахмалом), другая с ферментом
(слюной) - разместить в разные температурные условия. 1-ю пару поставить
в снег (0 градусов), 2-ю оставить в штативе (комнатная температура), 3-ю пару в термостат на 40 градусов. 4-ю пару - в кипящую водяную баню (100 градусов).
4. Через 10 минут соединить субстрат с ферментом, быстро перемешать и
оставить 4 пробирки при тех же температурных условиях.
5. Через 5 минут начать делать капельные пробы на стекле, чтобы добиться
расщепления крахмала до эритродекстринов (красно-бурая окраска). Для этого 2 капли содержимого 2-й пробирки (комнатная температура) нанести на
стекло, к ним добавить 1 каплю раствора Люголя. Пробу проводить на стекле
до появления красно-бурой окраски.
6. При появлении красно-бурой окраски во 2-ю пробирку добавить 1 каплю
раствора Люголя и тщательно перемешать. Затем добавить 1 каплю раствора
Люголя в 3-ю пробирку (40 градусов), не вынимая из термостата. Затем содержимое 3-й пробирки тщательно перемешать и перенести в штатив.
7. Содержимое 1-й и 4-й пробирок разлить пополам. В одну половину этих
пробирок добавить по 1 капле раствора Люголя и тщательно перемешать.
28
Другую половину пробирок 1а и 4а поставить на 10 минут в термостат на 40
градусов, затем в них добавить по 1 капле раствора Люголя и тщательно перемешать.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
Заполните правый столбец таблицы
№ к-во 0,5% слюна (разведение 1:10,
про крахмала тщательно перемешать)
бы
в мл
мл
1
2.0
1.0
1а
2.0
1.0
2
2.0
1.0
3
2.0
1.0
4
2.0
1.0
4а
2.0
1.0
ВЫВОДЫ:
Температура в
°С
рез-ты пробы с
раствором Люголя
0
0+40
Комнатная
40
100
100+40
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:
1. Биологический катализ. Термодинамические аспекты действия ферментов
(энергетический барьер, энергия активации).
2. Температура и рН как неспецифические факторы регуляции активности
ферментов.
3. Пути регуляции активности ферментов.
4. Виды торможения активности ферментов: обратимое, необратимое, специфическое, неспецифическое.
5. Действие химических компонентов табачного дыма на активность ферментов полости рта (амилаза, лактатдегидрогеназа, аспартатаминотрансфераза).
6. Основы ферментативной кинетики.Зависимость скорости ферментативной
реакции от концентрации субстрата и фермента. Уравнение МихаелисаМентен. Константа Михаелиса, ее физический смысл. Субстратное ингибирование.
ЗАНЯТИЕ 8
СПЕЦИФИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ.
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.
Действие многих фармакологических препаратов основано на принципе
конкурентного ингибирования ферментов. Например, группа антихолинэстеразных препаратов является конкурентным ингибитором фермента
29
ацетилхолинэстеразы по отношению к ацетилхолину. Антихолинэстеразные
вещества (прозерин и др.) конкурируют с ацетилхолином за активный центр
фермента, связываются с ним и выключают каталитическую активность
фермента.
Как фармакологические средства в медицине применяются и неконкурентные ингибиторы. Например, препараты, содержащие ртуть, свинец,
серебро, неконкурентно ингибируют ферменты в клетках болезнетворных
бактерий. Этим определяется их антисептический эффект. Токсическое
действие тяжелых металлов на организм человека обусловлено их способностью ковалентно связываться с белками и ферментами. Последние образуют недееспособный энзим-субстрат-ингибиторный комплекс (EIS).
Предупреждение образования этого комплекса или вытеснение из него тяжелого металла возможно с помощью реактиваторов или противоядий.
Работа 1. Определение активности ацетилхолинэстеразы крови.
Субстратное и конкурентное торможение.
ОБОРУДОВАНИЕ: ФЭК.
ПРИНЦИП МЕТОДА (метод Хестрина).
В основе метода лежит способность гидроксиламина взаимодействовать в
щелочной среде с ацетилхолином. В результате взаимодействия получается
гидроксамовая кислота, которая в кислой среде дает с хлорным железом хорошо растворимый желто-коричневый комплекс. Интенсивность его окраски
пропорциональна концентрации ацетилхолина.
Активность фермента определяется по разности между количеством ацетилхолина, взятого для инкубации, и ацетилхолином, оставшимся негидролизованным (контрольный ацетилхолин) за время инкубации.
ХОД РАБОТЫ .
Работу проводит бригада студентов из 6 человек. Каждый студент готовит
одну пробирку с инкубационной смесью по схеме, которая приведена в таблице:
РЕАКТИВЫ
АКТИВНОСТЬ АХЭ
(мг/час)
ХАРАКТЕР
РАБОТЫ
№№
Дист
пробы вода,
мл
Кровь
мл
Физ.
р-р,
мл
Про
зерин,
мл
30
Ацетилхолин
0.5%,
мл
Ацетилхолин
1,0 %,
мл
Фосфатный
буфер,
рН=7,4,
мл
Активность
АХЭ
без ингибиторов
Конкурентный ингибитор
(прозерин)
Субстратное
ингибирование
(избыток
субстрата)
1к
1.0
2о
1.0
3к
4о
1.0
1.0
5к
1.0
6о
1.0
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
1.0
2.0
1.0
2.0
1.0
1.0
2.0
2.0
0.1
0.1
1.0
2.0
1.0
2.0
После приготовления инкубационной среды пробирки поместить в термостат (37 градусов) на 60 минут.
После термостатирования работу вести одинаково со всеми пробирками:
1. К содержимому пробирки добавить 0,5 мл 50% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ) для осаждения белков.
2. Содержимое пробирки профильтровать.
3. В чистую пробирку отмерить 1 мл фильтрата и добавить к нему 2 мл
щелочного раствора гидроксиламина.
4. Через 2 минуты в пробирку добавить 1 мл соляной кислоты.
5. В пробирку добавить 1 мл 0,37 М раствора хлорного железа, пробирку
хорошо встряхнуть.
6. Содержимое пробирки колориметрировать на ФЭКе с зеленым светофильтром против воды (540 нм; толщина кюветы 5 мм).
7. Расчет активности фермента:
а) для 1-го и 2-го опытов с учетом того, что оптическая плотность контрольного раствора соответствует 5 мг ацетилхолина:
Дк------------------ 5 мг
До-------------------х мг
Х- это количество ацетилхолина, оставшегося в пробе в результате инкубации, а количество ацетилхолина, разложившегося за час инкубации будет
У= 5 мг - Х мг.
б) для 3-го опыта - оптическая плотность контроля будет соответствовать
10 мг ацетилхолина;
Дк----------------10мг
До-----------------Х мг
У=10мг –Х мг
31
РЕЗУЛЬТАТЫ занести в правый столбец таблицы.
ВЫВОД (оценить эффективность конкурентного и субстратного ингибирования):
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:
1. Конкурентный, неконкурентный типы ингибирования ферментативной активности. Привести примеры. Особенности ферментативной кинетики.
2. Химическая модификация ферментов. Привести примеры.
3. Структурная модификация (ограниченный протеолиз). Привести примеры.
4. Аллостерическая регуляция олигомерных ферментов. Кинетика их действия. Явление кооперативности.
5. Множественные молекулярные формы ферментов. Изоферменты как особая группа олигомерных и изофункциональных белков, клиническое значение их определения (на примере лактатдегидрогеназы).
6. Применение лекарственных препаратов как ингибиторов ферментов.
ЗАНЯТИЕ 9
КОЛЛОКВИУМ ПО ТЕМЕ: СТРУКТУРА, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ
БЕЛКОВ И ФЕРМЕНТОВ.
ЗАНЯТИЕ 10.
ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ ОБМЕН. ЦИКЛ ТРИКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ.
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ:
Главная функция ЦТК состоит в том, что он является общим конечным
путем окисления углеводов, липидов и белков. Кроме того, ЦТК играет главную роль в процессах глюконеогенеза, переаминирования, дезаминирования,
липогенеза. Хотя все эти процессы протекают во многих тканях, печень единственный орган, в котором идут все перечисленные процессы. Поэтому
повреждения большого числа клеток печени или замещение их соединительной тканью, как это имеет место при циррозе, приводят к летальному исходу. Ферменты цикла Кребса находятся в матриксе митохондрий. Появление ферментов цикла Кребса в крови может свидетельствовать о деструкции тех или иных органов. Появление митохондриального изофермента малатдегидрогеназы в сыворотке крови может быть проявлением тяжелого
клеточного повреждения. Высокая активность изоцитратдегидрогеназы в
32
сыворотке крови наблюдается при гепатите, обструктивной желтухе, что
обусловлено разрушением печеночных клеток.
Витамины группы В (В1,В2,В3,В5), липоевая кислота, являются кофакторами ферментов цикла Кребса. Их недостаточность приводит к ингибированию цикла. В качестве медицинского препарата для стимуляции цикла Кребса применяют кокарбоксилазу - фосфорилированную форму витаминаВ1. У
человека не существует генетически обусловленных изменений ферментов,
катализирующих реакции цикла, так как наличие таких нарушений несовместимо с нормальным развитием организма.
Работа 1. Определение активности дегидрогеназ цикла Кребса в
печени.
ОБОРУДОВАНИЕ: термостат на 380С.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Определение дегидрогеназной активности проводят тетразолиевым методом. Дегидрогеназы - ферменты, окисляющие соответствующие субстраты. В
качестве акцептора водорода используется 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид,
который восстанавливается до формазана, имеющего красную окраску. Интенсивность окраски раствора зависит от количества образующегося формазана и свидетельствует об активности фермента. В качестве субстратов используют пируват, изоцитрат, альфа-кетоглутарат, сукцинат и малат натрия.
ХОД РАБОТЫ.
1 В работе испозьзуется 10% гомогенат ткани печени.
2.Постановка опыта. Взять две пробирки (опытную и контрольную):
В опытную пробирку(1) отмерить:
1мл гомогената печени + 1мл раствора фосфатного буфера (рН = 7,4) +
0,5мл раствора субстрата (выбрать в соответствии с заданием) + 0,5мл раствора хлорида тетразолия.
В контрольную пробирку(2) отмерить:
1мл гомогената печени + 1мл раствора фосфатного буфера (рН = 7,4) +
0,5мл раствора субстрата (того же, что и в опытной пробирке) + 0,5 мл дистиллированной воды.
Содержимое пробирок перемешать и поместить в термостат при температуре 38оС на 30 мин.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОДЫ:
33
Работа 2. Определение активности сукцинатдегидрогеназы в разных тканях. Ингибирование сукцинатдегидрогеназы избытком оксалоацетата.
ОБОРУДОВАНИЕ: термостат на 380С.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Определение дегидрогеназной активности тетразолиевым методом (см. работу 1).
ХОД РАБОТЫ.
В работе использовать 10%-ный гомогенат тканей мозга, сердца, печени,
почек, скелетной мышцы, легкого.
Постановка опыта.
Взять три пробирки (две опытные и одна контрольная):
В первую опытную пробирку(1) отмерить:
0,5мл гомогената ткани + 2,5мл раствора фосфатного буфера (рН = 7,4) +
0,5мл раствора сукцината натрия +0,5мл раствора хлорида тетразолия.
Во вторую опытную пробирку(2) налить:
0,5мл гомогената ткани + 2,5мл раствора фосфатного буфера (рН = 7,4) +
0,5мл раствора сукцината натрия +0,5мл раствора хлорида тетразолия +0,5мл
раствора оксалоацетата
В контрольную пробирку (3) налить:
0,5мл гомогената ткани +2,5мл раствора фосфатного буфера (рН = 7,4) +
0,5мл раствора сукцината натрия +0,5мл дистиллированной воды.
Содержимое пробирок встряхнуть и поместить в термостат при температуре 38 оС на 30 мин.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
После инкубации сравнить интенсивность окраски:
- в опытной (1) и контрольной(3) пробирках
- в опытной (1) и опытной(2) пробирках
- интенсивность окраски в опытных пробирках(1) разных тканей.
ВЫВОДЫ:
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:
1. Окислительное декарбоксилирование пирувата. Суммарная реакция. Ферментативный состав пируватдегидрогеназного комплекса, его функция, регуляция.
2. Субстраты цикла Кребса, их образование. Ферменты, катализирующие
эти реакции, их регуляция.
34
3. Синтез лимонной кислоты. Роль ацетил КоА и оксалоацетата в регуляции
этого процесса.
4. Сукцинил КоА - участник субстратного фосфорилирования. Механизм
субстратного фосфорилирования.
5. Значение образования НАДН2 и сукцината в лимонном цикле.
6. Энергетический эффект окисления пирувата и ацетилКоА в цикле.
7. Значение цикла Кребса для метаболических процессов в организме.
8. Регуляция цикла.
ЗАНЯТИЕ 11.
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ.
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ:
Тканевое дыхание - основной поставщик энергии в организме. Гипоксия
(снижение поступления кислорода к тканям) - наиболее частая причина гипоэнергетических состояний, а гипоксия мозга - наиболее частая непосредственная причина смерти. Поэтому среди реанимационных процедур ведущее место занимают меры, направленные на восстановление снабжения органов кислородом. Введение кислорода может спасти жизнь больных, у которых нарушено дыхание или кровообращение. В ряде случаев успешно проводится кислородотерапия. Следует помнить, что интенсивная или продолжительная кислородотерапия под давлением может вызвать кислородное отравление. Клиницистам следует знать, что существуют вещества,
ингибирующие тканевое дыхание.
Ингибиторы дегидрогеназ препятствуют окислению субстратов и снижают поступление водорода в дыхательную цепь. К ним относятся противотуберкулезные препараты, являющиеся конкуретными ингибиторами
НАД-зависимых дегидрогеназ. Арсенаты и ионы тяжелых металлов блокируют SH-группы дегидрогеназ. Амитал, барбитал, прогестерон блокируют
звено FeS белок- КоQ. Цианиды, азиды, оксид углерода - ингибиторы цитохромоксидазы.
Работа 1. Открытие НАДН-дегидрогеназной активности в тканях.
ОБОРУДОВАНИЕ: термостат на 38 0С.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Тетразолиевый (см. занятие 10).
ХОД РАБОТЫ.
В работе использовать 10%-ный раствор гомогената тканей: сердца, мозга,
скелетной мышцы, печени, легкого.
Постановка опыта.
Взять две пробирки - опытную(1) и контрольную(2)
В опытную пробирку(1) налить:
2мл гомогената ткани +1мл раствора фосфатного буфера (рН = 7,4) + 0,5мл
раствора субстрата (раствора НАДН2) +0,5мл раствора хлорида тетразолия.
35
В контрольную пробирку(2) налить:
2 мл гомогената +1мл раствора фосфатного буфера (рН = 7,4) + 0,5мл раствора субстрата (раствора НАДН2)+ 0,5 мл дистиллированной воды.
Содержимое обеих пробирок перемешать и поместить в термостат при
37оС на 45 мин.
После инкубации сравнить интенсивность окраски:
- в опытной (1) и контрольной (2) пробирках;
- в опытной (1) пробирке с опытными пробирками других тканей.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОДЫ:
Работа 2. Определение редокс-потенциалов компонентов дыхательной цепи.
ОБОРУДОВАНИЕ: иономер ЭВ-74 с платиновым электродом.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Электрод благородного металла (платина), погруженный в редокс-систему
обменивается с ней электронами. Электрод приобретает окислительновосстановительный потенциал, величина которого зависит от способности
вещества отдавать и принимать электроны.
ХОД РАБОТЫ.
Для определения редокс-потенциала используют иономер с платиновым
электродом (измерительный электрод). Электродом сравнения служит хлорсеребряный электрод. Отсчет величины ЭДС в( mv) производится по нижней
шкале прибора, цифры которой показывают сотни милливольт.
ПОРЯДОК РАБОТЫ НА ИОНОМЕРЕ.
1. Включить в сеть, прогреть 15 минут.
2. Промыть электроды водой, обсушить и опустить электроды в стаканчик
с исследуемым раствором.
3. Нажать на кнопку "mv" и кнопку интервала измерения "-1 - 19".
4. Снять показание с нижней шкалы прибора, умножив его на 100.
5. Если стрелка гальванометра отклоняется влево за пределы шкалы, нужно нажать на кнопку "анионы/катионы"/ При нажатой кнопке "анионы/катионы" показания на шкале имеют отрицательное значение.
6. Используя величину ЭДС, определенную с помощь прибора, вычислить
величину редокс-потенциала .
E о/в = ЭДС+ E всп., где Е всп. = 222 mv
36
ЗАДАНИЕ:
1. Определить нормальный редокс-потенциал следующих систем:
- НАД/НАДН2
- КоQ/КоQН2
- цитохром с ферри-/ферро- цитохром а ферри-/ферро2. Распределить эти системы по степени возрастания редокс-потенциала.
3. Рассчитать разность окислительно-восстановительного потенциала
между компонентами дыхательной цепи.
4. Вычислить выход свободной энергии по формуле.
G = - n F ∆Е о/в, где
G - изменение свободной энергии редокс-системы в кДж/моль
n - число электронов
F - число Фарадея (96, кДж/М),
ео/в
разность
редокс-потенциалов
двух
окислительновосстановительных систем
5. Ответить на вопрос: возможен ли синтез АТФ в изучаемых участках.
РЕЗУЛЬТАТЫ (заполнить таблицу):
О/В системы
ЭДС mv
E о/в (v)
∆Ео/в
G кДж
ВЫВОДЫ:
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:
1.Биологическое окисление . Пути потребления кислорода в реакции окисления. Оксидазные, оксигеназные, дегидрогеназные реакции.
2. Современные представления об окислительно - восстановительных реакциях. Окислительно-восстановительные системы дыхательной цепи.
3. Тканевое дыхание и его значение.
4. Окисление субстратов путем дегидрирования. Строение коферментов
(НАД, НАДФ) и простетических групп (ФМН, ФАД) дегидрогеназ. Структурные формулы части кофакторов, передающей протоны и электроны (в
окисленной и восстановленной формах).
5. Пиридиновые и флавиновые дегидрогеназы.
6. Функциональные комплексы дыхательной цепи, их название, состав. Регуляция комплексов.
7. Строение убихинона и его роль в дыхательной цепи.
37
8. Электронотранспортная система цитохромов. Строение простетической
группы и ее участие в транспорте электронов.
9. Окислительно-восстановительный потенциал - движущая сила транспорта
электронов по дыхательной цепи.
ЗАНЯТИЕ 12.
ОКИСЛИТЕЛЬНОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ.
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ:
Живая клетка нуждается в АТФ непрерывно. За сутки в организме образуется и расходуется около 60 кг АТФ. Основной путь синтеза АТФ в организме - окислительное фосфорилирование. Снижение синтеза АТФ вызывает гипоэнергетическое состояние. Гипоэнергетическое состояние проявляется при гипоксии, голодании, гиповитаминозе и т.д.
Гипоксия возникает при недостаточности кислорода во вдыхаемом воздухе, при нарушении легочной вентиляции, пороках сердца, кровопотере, спазме сосудов, шоке , гемоглобинемии, блокировании гемоглобина ядами, нарушении митохондрий. В процессе энергетического обмена участвуют коферменты, содержащие витамины В1,В2,В3,В5 Недостаточность этих витаминов приводит к гипоэнергетическому состоянию. Окислительное фосфорилирование является столь жизненно важным процессом, что нарушение
его нормального хода несовместимо с жизнью.
Работа 1. Обнаружение АТФ в различных тканях.
ОБОРУДОВАНИЕ: центрифуга.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
АТФ в виде нерастворимой бариевой соли осаждается из раствора в щелочной среде после добавления уксуснокислого бария.
ХОД РАБОТЫ.
1. В работе использовать 10%-ный раствор гомогената тканей сердца, мозга,
печени, скелетной мышцы, почек и т.д.
2.Осаждение белка.
К 4 мл гомогената добавить 4 мл 25% раствора трихлоруксусной кислоты
(ТХУ), перемешать. Через 5 минут слить в центрифужные пробирки и центрифугировать 10 минут при 1500об/мин.
Надосадочную жидкость слить в чистую пробирку.
2. Обнаружение АТФ.
Взять 5 мл безбелкового фильтрата (надосадочная жидкость), добавить 2
капли фенолфталеина и подщелочить 10% раствором NаОН до слабо розового окрашивания. При тщательном встряхивании добавить по каплям 25%
раствора уксуснокислого бария до полноты осаждения, следя за тем, чтобы
38
раствор после добавления уксуснокислого бария оставался щелочным ( бледно-розовым).
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОДЫ:
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:
1.Окислительное фосфорилирование, его отличие от субстратного фосфорилирования.
2. Сопряжение окисления (дыхания) и фосфорилирования в дыхательной цепи, участки сопряжения. Коэффициент сопряженности. Понятие о свободном
дыхании (разобщении). Примеры разобщителей. Ингибиторы дыхательной
цепи.
3.Механизм энергетического сопряжения в митохондриях (хемиосмотическая
теория Митчелла).
4. Понятие о митохондриальных болезнях.
5. Макроэргические соединения организма. Структура, энергетическая характеристика.
ЗАНЯТИЕ 13.
КОЛЛОКВИУМ ПО ТЕМЕ: ЦИКЛ КРЕБСА. БИОЛОГИЧЕСКОЕ
ОКИСЛЕНИЕ. ОКИСЛИТЕЛЬНОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ.
ЗАНЯТИЕ 14.
БИОХИМИЯ ГОРМОНОВ.
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ:
Гормоны выполняют функцию регуляторов активности ферментов тканей. Как увеличение, так и снижение выработки гормонов приводит к развитию эндокринных заболеваний. Например, снижение выработки инсулина
приводит к развитию сахарного диабета. Опухоль из мозгового слоя надпочечников – феохромацитома - приводит к увеличению концентрации в крови
адреналина, что сопровождается повышением кровяного давления, основного обмена, содержания сахара в крови, уровня свободных жирных кислот,
появлением глюкозурии.
Многие гормоны используются с лечебной целью при лечении эндокринных
заболеваний. Кроме того, ряд лекарственных препаратов могут модулиро39
вать действие гормонов. Производные ксантинов (кофеин, теофиллин, эуфиллин ) ингибируют фосфодиэстеразу, способствуя накоплению цАМФ, а
трентал - накоплению цГМФ. Использование этих препаратов потенцирует
эффект гормонов, в качестве вторичных посредников которых выступают
циклические нуклеотиды.
Работа 1. Качественные реакции на гормоны.
1. Обнаружение инсулина сульфосалициловой кислотой.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Органические кислоты легко вызывают денатурацию белка, в результате
чего выпадает осадок .
Осаждение белка сульфосалициловой кислотой высокоспецифичная и чувствительная реакция.
ХОД РАБОТЫ.
В пробирку налить 1 мл исследуемого раствора инсулина и добавить 3-5
капель раствора сульфосалициловой кислоты. При наличии в растворе инсулина выпадает осадок.
2. Биуретовая реакция на гормоны белковой и полипептидной природы.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Белки и пептиды взаимодействуют с CuSO4 в щелочной среде, образуя
комплексное соединение. Реакция обусловлена наличием в структуре пептидной связи. Образовавшееся комплексное соединение меди (биуретовый
комплекс) дает фиолетовую окраску.
ХОД РАБОТЫ.
В пробирку вносят 1-5 капель исследуемого раствора адренокортикотропного гормона (АКТГ), 5 капель 10% раствора NаОН, 1 каплю 1% раствора
CuSО4. Наблюдается появление фиолетовой окраски.
3. Обнаружение адреналина хлоридом железа.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Адреналин (метиламиноэтанолпирокатехин) дает реакции, характерные
для пирокатехинов. С ионами железа он образует соединение изумруднозеленого цвета типа фенолята. Адреналин легко окисляется, что характерно
для пирокатехинов. Если к раствору адреналина или его соединению с железом добавить щелочь, образуется адренохром красного цвета.
ХОД РАБОТЫ.
В пробирку вносят 10 капель раствора 0,1% раствора адреналина и добавляют 1 каплю 1% раствора FeCl3. Появляется изумрудно-зеленая окраска. К
полученному раствору добавить 1 каплю 5% раствора щелочи. Окраска становится вишнево-красной.
4. Обнаружение йода в тироксине.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
40
Гормоны щитовидной железы (тироксин, трийодтиронин) содержат в своем составе йод. Если их подвергнуть щелочному гидролизу (кипячению с
КНСО3), то выделится йодит калия, из которого при добавлении йодата калия выделяется йод. Свободный йод обнаруживаются с помощью крахмала.
ХОД РАБОТЫ.
К 1 мл щелочного гидролизата гормонов щитовидной железы добавляют
серную кислоту до кислой реакции (4-5 капель), 2 капли 1% раствора крахмала и 5 капель 20% раствора йодата калия. Появляется синяя окраска.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ИССЛЕДУЕОсажде- Биуретовая Реакция на пиро- Реакция
МЫЙ
ние белка реакция
катехин
на йод
РАСТВОР
РЕЗУЛЬТАТЫ РЕАКЦИЙ
1. Р-р инсулина
для инъекций
2 Р-р АКТГ.
3. Р-р адреналина
4.
Щелочной
гидролизат гормонов щитовидной железы.
ВЫВОДЫ (охарактеризовать гормоны по химической природе):
Работа 2. Изучение влияния инсулина, адреналина и кортизола на
содержание глюкозы в крови.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
К числу специфических регуляторов обмена углеводов относятся гормоны
надпочечников: мозгового вещества - адреналин, коркового слоя - глюкокортикоиды (кортизол и др.) и два гормона поджелудочной железы - инсулин и
глюкагон.
Для оценки влияния гормонов на уровень глюкозы в крови берут кровь у
животных до введения гормона и через 30, 60, 120 мин. после введения гормона (инсулин, адреналин) или через 6, 12, 24 час. после введения кортизола.
Определение глюкозы проводится глюкозооксидазным методом (см. занятие
5 ).
Схема постановки эксперимента:
1. У кролика из ушной вены взять 0,1 мл крови с помощью микропипетки,
осадить белки и определить в надосадочной жидкости содержание глюкозы.
41
2. Медленно подкожно ввести необходимое количество инсулина (из расчета 1 клиническая единица на 1 кг веса), продезинфицировать место укола.
3. Через 30, 60, 120 минут вновь взять 0,1 мл крови и повторно определить содержание глюкозы.
4. Аналогично провести опыт с введением адреналина (0,5 мг подкожно),
а затем через 30, 60, 120 минут определить содержание глюкозы в крови.
5. Эксперимент повторить с введением кортизола (через 6, 12, 24 часа).
ХОД РАБОТЫ.
К 1 мл надосадочной жидкости , полученной после осаждения белков крови, (до и после введения соответствующего гормона ) добавить 3 мл рабочего
реактива, хорошо перемешать и через 15 минут колориметрировать на ФЭКе
против воды ( красный светофильтр, 670 нм ).
Стандартная проба для расчета готовится точно также, как опытная проба,
но вместо надосадочной жидкости необходимо взять 1 мл стандартного раствора глюкозы с концентрацией 5,5 мМ/л ( см. занятие 5, работа 2 ).
РЕЗУЛЬТАТЫ.
Полученные результаты по содержанию глюкозы в крови под влиянием
адреналина, инсулина и кортизола занести в таблицу и построить графики,
отображающие динамику изменения концентрации глюкозы в крови с течением времени под воздействием соответствующего гормона.
ИНСУЛИН
до
30
введ мин
АДРЕНАЛИН
60
мин
120
мин
до
30
введ мин
60
мин
КОРТИЗОЛ
120
мин
до
6
введ час
12
час
Глюкоза крови
мМ/л
30/6
60/12
90/18
120/ 24 Время после введения
гормона (мин/час)
42
24
час
ВЫВОДЫ ( по результатам сделать выводы о влиянии данных гормонов на
углеводный обмен):
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:
1. Общее понятие о гормонах.
2. Классификация гормонов по химической природе.
3. Гормоны- производные белка, аминокислот и стерана.
4. Иерархия действия гормонов.
5. Характеристика рецепторов.
6. Транспорт гормонов, синтез гормонов.
7. Внутриклеточный механизм действия гормонов.
8. Мембранный механизм действия гормонов.
9. Посредники реализации действия гормонального сигнала:
 циклические нуклеотиды;
 кальций - кальмодулин;
 производные распада фосфолипидов - диацилглицеролы и инозитолтрифосфат.
10.Каскадный механизм действия мембранных гормонов.
11. Роль ионов кальция в механизме гормональной регуляции.
12. Роль диацилглицерола и инозитолтрифосфата.
13. Рецептор инсулина и механизм действия инсулина.
14. Эйкозаноиды и их действие.
Для фармацевтического факультета:
1. Применение гормонов и их синтетических аналогов в медицине.
ЗАНЯТИЕ 15.
ПЕРЕВАРИВАНИЕ УГЛЕВОДОВ. ОСНОВНЫЕ УГЛЕВОДЫ ОРГАНИЗМА. ГЛИКОГЕН: СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ, СИНТЕЗ И
РАСПАД.
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.
Нарушение пищеварения вызывается недостатком ферментов и биохимическими или механическими нарушениями процессов всасывания веществ в кишечнике.
Нарушения переваривания углеводов проявляются при недостатке (врожденном или приобретенном) амилолитических ферментов. Основным признаком этой патологии служит непереносимость отдельных углеводов. Часто наблюдается непереносимость лактозы, особенно у детей раннего возраста, вскармливаемых в течение длительного времени грудным молоком.
43
Синдром мальабсорбции - нарушение всасывания нутриентов из пищеварительного тракта.
Наиболее важным углеводом организма человека является глюкоза. Она
поступает с пищей, в глюкозу превращаются углеводы в печени, из глюкозы
могут образоваться все остальные углеводы в организме. Она является универсальным топливом. Глюкоза превращается в гликоген в печени, и гликоген
служит источником глюкозы в организме. Ряд наследственных заболеваний
связан с нарушением обмена гликогена. Эти болезни получили название гликогенозов. Они возникают в связи с дефицитом или полным отсутствием
ферментов, катализирующих процессы распада или синтеза гликогена, и характеризуются его избыточным накоплением в различных органах и тканях.
Различают 9 типов гликогенозов (I-IX).
Работа 1. Влияние слюны, желудочного сока и панкреатина на
крахмал.
ОБОРУДОВАНИЕ: термостат на 38оС, водяная баня на 100оС.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Крахмал подвергается перевариванию в желудочно-кишечном тракте до
образования продуктов, имеющих свободный полуацетальный гидроксил
(мальтоза, глюкоза).
Для выявления продуктов переваривания применяют реакцию Троммера
(см. занятие 5, работа 1).
ХОД РАБОТЫ.
В 4 пробирки отмерить следующие реактивы:
№№ 1 % рас- слюна
желудоч- панкреатин результат пробы
про- твор крах- 1:10,
ный сок, мл.
Троммера
бы
мала, мл
мл
мл
1.
1.0
1.0
2.
1.0
1.0
3.
1.0
1.0
1.0
4.
1.0
2.0
Для инкубации пробирки поместить в термостат при 370 на 30 минут. После инкубации содержимое каждой пробирки проанализировать на присутствие продуктов расщепления полисахаридов с помощью реакции Троммера.
РЕЗУЛЬТАТЫ: (занести в таблицу)
ВЫВОДЫ (по результатам пробы сделать вывод о влиянии различных пищеварительных соков на крахмал):
44
Работа 2.Адсорбция глюкозы на волокнах целлюлозы.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Целлюлоза – один из наиболее распространенных видов пищевых волокон
– полисахаридов, которые не перевариваются в желудочно-кишечном тракте
под влиянием пищеварительных ферментов, но играют важную роль в регуляции функций кишечника. В данной работе в качестве модели пищевого волокна используется вата, которая представляет собой практически чистую
целлюлозу. Способность глюкозы адсорбироваться на поверхности волокон
целлюлозы изучается с помощью количественного определения глюкозы в
пробе глюкозоксидазным методом (работа описана в занятии «Ферменты.
Специфичность действия»).
ХОД РАБОТЫ.
Опытная проба. В пробирку отмерить 1 мл стандартного раствора глюкозы
с концентрацией 5,5 мМ/л, внести 0,1 г сухой гидрофильной ваты и поставить пробирку в термостат при 38оС на 1 час. После инкубации добавить 3 мл
рабочего реактива, размешать стеклянной палочкой и оставить пробирку на
15 минут при комнатной температуре для развития окраски. Затем жидкость
перенести в кювету для колориметрии (в пробирке отжать вату стеклянной
палочкой) и определить оптическую плотность при красном светофильтре.
Контрольная проба. В пробирку отмерить 1 мл стандартного раствора глюкозы с концентрацией 5,5 мМ/л, поставить пробирку в термостат при 38 оС на
1 час. После термостатирования добавить 3 мл рабочего реактива и оставить
пробирку на 15 минут при комнатной температуре для развития окраски. Затем жидкость перенести в кювету для колориметрии и определить оптическую плотность при красном светофильтре.
РАСЧЕТ. Величину адсорбции можно определить как разность концентрации глюкозы в опытной и контрольной пробах.
В контрольной пробе концентрация известна: 5,5 мМ/л.
В опытной пробе остаточную концентрацию глюкозы рассчитать по формуле:
Dо . 5,5
Сх = ---------- , где
Dк
Dо – оптическая плотность пробы,
D к – оптическая плотность контрольной пробы.
Величина адсорбции равна: 5,5мМ - Сх
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОДЫ:
45
Работа 3. Выделение гликогена из печени сытого и голодного животного.
ОБОРУДОВАНИЕ: фарфоровые ступки.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Метод основан на том, что гликоген растворим в воде и достаточно устойчив в слабокислой среде. Поэтому выделение гликогена осуществляется следующим образом: разрушается ткань, экстракция гликогена производится
раствором трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Основная масса белков при этом
денатурирует, их легко удалить из раствора фильтрацией. В опыте использовать печень сытого и голодного животного. Печень забитых животных быстро извлечь, разрезать на тонкие пластинки, немедленно опустить их в стакан
с кипящим физиологическим раствором для инактивации фермента гликогенфосфорилазы на 10-15 минут. Дальнейшее исследование печени сытого и голодного животного провести параллельно.
ХОД РАБОТЫ.
1. Отвесить на весах по 0,5 г печени сытого и голодного животного. Поместить в ступку, налить 3 мл 5% раствора ТХУ и растереть. Затем к экстракту
добавить 3 мл дистиллированной воды, суспензию перемешать и профильтровать через смоченный водой бумажный фильтр в чистую пробирку.
2. С полученными фильтратами выполнить качественную реакцию на гликоген.
В первую пробирку налить 1 мл дистиллированной воды (контрольная
пробирка), во вторую и третью - по 1 мл фильтратов сытого и голодного животного.
После этого в каждую пробирку добавить по 1-2 капли раствора Люголя и
сравнить окраску.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОДЫ:
46
Работа 4. Фосфоролиз гликогена в мышечной ткани.
ОБОРУДОВАНИЕ: фарфоровые ступки, термостат на 38оС.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Фосфоролитический распад гликогена в мышечной ткани идет по уравнению:
+ Н3РО4
[глюкоза]n------------------------------ Глюкозо-1фосфат + [глюкоза]n-1
гликоген
фосфорилаза
гликоген
Судят о течении реакции фосфоролиза по изменению количества фосфорной кислоты в процессе инкубации.
ХОД РАБОТЫ.
1. Растереть в ступке 300 мг ткани, а затем добавить 2 мл раствора фосфатного буфера (рН = 7,2) и 2 мл раствора фтористого натрия (фторид натрия
добавляется для ингибирования дальнейших превращений
глюкозо-1фосфата).
2. Все содержимое ступки перенести в пробирку, в которую добавить 2 мл
раствора гликогена. Пробирку маркировать как "опытная".
3. Вновь в ступке растереть 300 мг ткани с 2 мл раствора фосфатного буфера и 2 мл раствора фтористого натрия. Содержимое ступки перенести в
другую пробирку, но гликогена в нее не добавлять. Эту пробирку маркировать как "контрольная". Ее использовать для сравнения, так как реакция в
этой пробирке из-за отсутствия субстрата не идет.
4. Обе пробирки поставить в термостат при 38о на 60 минут.
5. После инкубации в контрольную пробирку добавить 2 мл раствора гликогена, и объем содержимого в опытной и контрольной пробирках станет
одинаковым.
6.В обе пробирки добавить по 2 мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты для остановки реакции и осаждения белков.
7. Через 5 минут содержимое пробирок отфильтровать через фильтр.
8.В чистые пробирки отмерить по 2 мл безбелкового фильтрата. Далее в
каждую пробирку прибавить реактивы для цветной реакции на фосфорную
кислоту: 2 мл раствора молибденовой кислоты, 0,5 мл раствора гидрохинона
и (ОСТОРОЖНО ПО КАПЛЯМ, СЛЕГКА ВСТРЯХИВАЯ!) 4 мл смеси раствора карбоната и сульфита.
Через 10 минут сравнить интенсивность окраски в опытной и контрольной
пробирках.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОДЫ:
47
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:
1. Общая характеристика углеводов. Классификация. Особенности строения
полисахаридов (крахмал, гликоген).
2. Углеводы организма человека. Протеогликаны и гликопротеины. Общая
характеристика, распространение в организме. Глюкозамингликаны, классификация, структура.
3. Переваривание дисахаридов.
4. Переваривание полисахаридов: действие амилазы слюны, панкреатической амилазы, ферментов эпителия кишечника (олиго- амило-1,6гликозидазы, мальтазы, изомальтазы).
-Перевариваемые и неперевариваемые полисахариды.
-Всасывание углеводов в кишечнике.
5. Пути мобилизации гликогена - амилолитический и фосфоролитический.
Распад гликогена в печени, ферменты, субстраты, продукты реакций.
6. Характеристика фосфорилазы, "каскадный" тип гормональной регуляции
этого фермента.
7. Синтез гликогена в печени. Энергетическое и ферментативное обеспечение процесса, ферменты, субстраты, продукты реакций. Характеристика гликогенсинтазы, регуляция, влияние гормонов.
8. Гликогенозы, причины их возникновения.
ЗАНЯТИЕ 16.
КАТАБОЛИЗМ ГЛЮКОЗЫ. ГЛИКОЛИЗ.
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.
Большое значение имеет способность гликолиза к образованию АТФ в отсутствии кислорода (при гипоксии). Ткани с повышенной гликолитической
активностью способны сохранять свою функцию в период кислородного голодания. В быстро растущих опухолевых клетках гликолиз идет со скоростью выше ЦТК, в результате образование ПВК превышает его потребление, образуется молочная кислота и наблюдается локальное повышение кислотности в опухолевой ткани .Это используется в терапии некоторых
форм опухолей. В сердечной мышце возможности гликолиза ограничены, она
тяжело переносит гипоксию. Известно несколько болезней, обусловленных
недостаточной активностью ферментов гликолиза (например, пируваткиназы), при этих состояниях развивается гемолитическая анемия.
Пентозофосфатный путь(ПФП) поставляет НАДФН2 для восстановительных синтезов (синтез жирных кислот, стероидов, нуклеотидов), обеспечивает рибозой синтез нуклеотидов и нуклеиновых кислот, поставляет
48
СО2 для реакций карбоксилирования. Недостаточность ряда ферментов
ПФП является причиной гемолиза эритроцитов.
Работа 1. Определение активности лактатдегидрогеназы в разных
тканях.
ОБОРУДОВАНИЕ: фарфоровые ступки, термостат на 38оС.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Дегидрогеназа молочной кислоты (лактатдегидрогеназа, ЛДГ) окисляет
молочную кислоту в пировиноградную при наличии акцептора водорода 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида, который восстанавливается до формазана, имеющего красную окраску. Интенсивность окраски зависит от количества образовавшегося формазана и свидетельствует об активности дегидрогеназы.
ХОД РАБОТЫ.
Работа выполняется бригадой студентов, каждый из которых исследует активность ЛДГ в определенной ткани.
1.Для работы используют гомогенаты разных тканей (печень, сердце,
мозг, селезенка, скелетная мышца, почка и другие).
2. Постановка опыта.
Пробирка №1 /опыт/.
Отмерить 1 мл раствора лактата натрия, 2мл раствора фосфатного буфера
(pН = 7.4), 1мл раствора хлорида 2,3,5-трифенилтетразолия и 1мл профильтрованного экстракта ткани.
Пробирка №2 /контроль/.
Отмерить 1мл лактата натрия, 2 мл раствора фосфатного буфера pH=7,4;
1мл воды вместо раствора тетразолия, 1мл профильтрованного экстракта.
Пробирки встряхнуть, поместить в термостат на 1 час (38 0С). Через час
сравнить интенсивность окраски в опытной и контрольной пробирках.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОДЫ:
Работа 2. Обнаружение молочной кислоты в мышечной ткани.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
При взаимодействии хлорного железа с фенолом образуется фенолят железа аметисто-фиолетового цвета. В присутствии молочной кислоты образуется
комплексное соединение желтого цвета.
49
ХОД РАБОТЫ.
Кусочек мышечной ткани растереть в ступке с 5мл фосфатного буфера
(pН=7,4). Полученную вытяжку слить в чистую пробирку (№ 1). Во другую
пробирку (№ 2) отмерить 2-3 мл раствора фенола, добавить несколько капель
раствора хлорного железа до появления аметисто-фиолетового окрашивания.
Во вторую пробирку добавить 5 мл вытяжки из мышцы (первая пробирка),
а затем по каплям - 10% раствора NaOH до появления желтого окрашивания.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОДЫ:
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:
1. Глюкозо-6-фосфат - узловой метаболит. Пути его образования и
возможные пути превращения.
2. Определение понятий "гликолиз" и "гликогенолиз".
3. Последовательность реакций гликолиза. Ферменты, кофакторы,
субстраты, продукты реакций. Особенности функционирования и
регуляции гликолитических ферментов.
4. Гликолитическая оксидоредукция: cущность процесса и значение.
5. Механизм субстратного фосфорилирования в процессе гликолиза:
субстраты и продукты реакций, ферментативное обеспечение, энергетический эффект.
6. Энергетическое значение процессов гликолиза и гликогенолиза.
Энергетический эффект полного окисления одной молекулы глюкозы
до углекислого газа и воды.
7. Аэробный и анаэробный гликолиз. Молочная кислота как тупиковый
метаболит.
8. Значение процессов гликолиза и гликогенолиза.
9. Включение других углеводов в процесс гликолиза.
10. Регуляция гликолиза. Факторы, влияющие на скорость реакций.
ЗАНЯТИЕ 17.
ГЛЮКОНЕОГЕНЕЗ. ПЕНТОЗОФОСФАТНЫЙ ПУТЬ.
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.
Глюконеогенез обеспечивает потребности организма в глюкозе, если диета
содержит недостаточное количество углеводов. Механизм глюконеогенеза
50
используется для удаления из крови продуктов тканевого метаболизма,
например, лактата, образующегося в мышцах и эритроцитах, и глицерола,
образующегося в жировой ткани.
Работа 1. Количественное определение фосфоенолпирувата в печени и мышцах.
ОБОРУДОВАНИЕ: ФЭК
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Метод основан на том, что фосфоенолпируват в щелочной среде окисляется йодом с отщеплением неорганического фосфата. По количеству неорганического фосфата, выделившегося в этих условиях, рассчитывают содержание
фосфоенолпирувата.
ХОД РАБОТЫ.
Работа выполняется двумя студентами: один работает с мышечной тканью,
другой - с печенью.
1. Приготовление экстракта.
0,5г мышцы или печени растереть в ступке с 5 мл 2,5 % раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ), перелить в пробирки, экстрагировать на холоду 10 минут, помешивая стеклянной палочкой. Затем в каждую пробирку
добавить по 5мл дистиллированной воды, профильтровать через бумажный
фильтр.
2. Постановка опыта.
В пробирку с делением на 10 мл налить 2 мл фильтрата мышцы или печени, 1мл 2М раствора NaOH и 1 мл раствора йода, перемешать, оставить на 15
мин. при комнатной температуре.
Затем в эту же пробирку налить 2,5 мл 2 М раствора HСL и по каплям долить раствор соляной кислоты до появления темно-желтого окрашивания.
Потом добавить 2 мл тиосульфата Na и по каплям, постоянно помешивая,
окраску довести тиосульфатом Na до светло-желтой. По окончании титрования общий объем в пробирке довести дистилированной водой до 10 мл.
После этого в другую мерную пробирку на 10 мл взять 2мл полученного
раствора, добавить 0,5 мл раствора молибденово-кислого аммония и 0,5мл
раствора аскорбиновой кислоты, довести до 10 мл водой и оставить на 10
минут, после чего проколориметрировать на ФЭКе с красным светофильтром
против воды (толщина кюветы 5 мм).
По калибровочному графику рассчитать количество фосфоенолпирувата в
мышце и печени.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОДЫ:
51
Работа 2. Определение активности глюкозо-6-фосфатазы.
ОБОРУДОВАНИЕ: иономер ЭВ-74 или И – 160 М, термостат на 380 С.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Глюкозо-6-фосфатаза (КФ 3.1.3.9) – один из ключевых ферментов
глюконеогенеза, прочно связанный с мембраной эндоплазматической сети.
Фермент катализирует гидролиз глюкозо-6-фосфата или гексозо-6-фосфатов
на различные сахара. Активность глюкозо-6-фосфатазы определяется по
скорости глюкозо-6-фосфатазной реакции электрометрическим методом
путем измерения рН реакционной среды. Глюкозо-6-фосфатазная реакция
сопровождается поглощением протонов из среды инкубации согласно
уравнению:
Глюкозо-6-фосфат +
nH+ +
H2O

глюкоза +
Рi
В этом уравнении фактор n есть количество грамм-ионов исчезающих
протонов в расчете на моль расщепленного глюкозо-6-фосфата, его значение
зависит от рН среды инкубации. Таким образом, при работе фермента из
реакционной среды уходят протоны и происходит увеличение рН. Реакция
идет только в условиях оптимальной ионной силы. Полное отсутствие
фермента характерно для болезни Гирке (гликогеноз 1 типа).
ПОСТАНОВКА ЭКСПЕРИМЕНТА.
В работе используется взвесь микросом из печени крысы, которые
выделялись из разрушеннного эндоплазматического ретикулума гепатоцитов
с помощью дифференциального центрифугирования. Осадок микросом
суспендировался в 0,25 М сахарозе до концентрации белка 5 мг/мл и
доводилась рН с помощью 0,1 н NH4OH до рН 9,5-9,8 . Затем суспензия
инкубировалась в термостате при 38С в течение 20 минут, после чего
проводилась нейтрализация разбавленной уксусной кислотой до рН 7,3 - 7,6.
Охлажденная
до комнатной температуры суспензия микросом
центрифугировалась в течение 1 часа при 100000 g. Полученные микросомы
вновь суспендировались в 0,25 М сахарозе до концентрации белка 20 - 25
мг/мл и сохранялись в замороженном виде до использования.
ХОД РАБОТЫ.
Контроль
1. В пробирку отмерить 2 мл суспензии микросом из печени крыс
2. Добавить 1 мл раствора глюкозо-6-фосфат в концентрации 5 мМ.
3. Добавить 1 мл воды дистиллированной.
4. Поставить на инкубацию в термостат на 20 минут при температуре 37  С.
Опыт
1. В пробирку отмерить 2 мл суспензии микросом из печени крыс.
2. Добавить 1 мл раствора глюкозо-6-фосфат в концентрации 5 мМ.
52
3. Добавить 1 мл рабочего реактива (раствор фосфатный рН 7,3-7,8 с 40 мМ
KCl, добавляемого для повышения ионной силы среды).
4. Поставить на инкубацию в термостат на 20 минут при температуре 37  С.
После инкубации остановить реакцию, добавив 0,5 мл фторида натрия
(ингибитор глюкозо-6-фосфатазы) в обе пробирки. Тщательно перемешать и
измерить рН растворов в опытной ( о) и контрольной ( к ) пробирке.
Вычислить разницу значений рН между опытной и контрольной
пробиркой.
 рН( о ) = рН ( о ) – рН ( к )
На калибровочном графике найти значение активности глюкозо-6фосфатазы в мг/мл.
Активность глюкозо-6-фосфатазы в норме 2,5 + 0,5 мг/мл.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОДЫ:
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:
1. Глюконеогенез. Стадии процесса, отличающие его от обращения реакций гликолиза. Энергообеспечение.
2. Митохондриальный и цитоплазматический этапы образования фосфоенолпирувата. Ферменты, участники реакций, регуляция.
3. Пути обхода фосфофруктокиназной и гексокиназной реакций гликолиза.
4. Регуляция глюконеогенеза. Влияние глюкагона и инсулина на глюконеогенез. Значение пируваткиназы и бифункционального фермента в
регуляции глюконеогенеза и гликолиза.
5. Цикл Кори.
6. Пентозофосфатный цикл - путь прямого окисления глюкозы. Значение понятий "прямое окисление", "альтернативный путь" окисления
углеводов.
7. Химизм окислительной части процесса: субстраты, ферменты, продукты реакций, их дальнейшее использование.
8. Значение неокислительной части пентозофосфатного пути. Связь
пентозного цикла с гликолизом.
9. Значение пентозофосфатного пути. Участие СО2, НАДФН2 и пентоз
в синтетических процессах.
ЗАНЯТИЕ 18.
РЕГУЛЯЦИЯ УГЛЕВОДНОГО ОБМЕНА.
53
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.
Существует два уровня контроля метаболических процессов:
1) нейрогормональный
2) метаболический
Активность углеводного обмена находится под контролем целого ряда
гормонов (АКТГ, глюкагон, адреналин, глюкокортикоиды, тиреоидные гормоны, инсулин и др.). Многие из них действуют через цАМФ и протеинкиназу.
На активность ферментов углеводного обмена влияют концентрации субстратов и продуктов реакций, кислородный режим, концентрация коферментов и др. В этом случае регуляция осуществляется в основном через изменение концентрации АТФ, АДФ, АМФ, НАД, НАДН и промежуточных метаболитов путем аллостерической регуляции и химической модификации
ферментов.
Уровень глюкозы в крови имеет огромное значение для организма. Как
снижение уровня глюкозы в крови (гипогликемия), так и повышение (гипергликемия) могут приводить к развитию гипо- и гипергликемических ком. Различные состояния организма сопровождаются изменением уровня глюкозы в
крови, но наиболее распространенное заболевание - сахарный диабет. Для
выявления нарушений углеводного обмена проводят пробу с сахарной нагрузкой (тест на толерантность к глюкозе).
При повышении концентрации глюкозы в крови выше почечного порога
(9-10 мМ/л) глюкоза начинает поступать в мочу, возникает глюкозурия.
Определение глюкозы в моче имеет диагностическое значение.
Работа1. Влияние сахарной нагрузки на содержание глюкозы в
крови.
ОБОРУДОВАНИЕ: ФЭК.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Достоверные сведения о состоянии углеводного обмена дает не однократное определение сахара крови, а исследование его содержания через определенные промежутки времени после нагрузки глюкозой.
Утром натощак у больного берут кровь из пальца и определяют в ней содержание глюкозы глюкозоксидазным методом (см. Протокол №5 1-го семестра). После этого больному дают выпить от 50 до 100 г глюкозы в 200 мл
теплой кипяченой воды (из расчета 1г глюкозы на 1кг массы тела) или сахарозы (из расчета 1,5 г сахара на 1кг массы тела). Затем повторно исследуют
содержание глюкозы в крови, беря кровь из пальца через каждые 15 минут в
течение 1,5 - 2 часов. На основании полученных данных строят график, откладывая на оси ординат содержание глюкозы в крови в мМ/л, а на оси абсцисс - время взятия пробы в минутах. Полученный график представляет гликемическую кривую после однократной нагрузки.
ХОД РАБОТЫ.
Работу необходимо выполнить бригадой по 6 человек. Каждому студенту
взять пробирку с 1 мл надосадочной жидкости, соответствующую опреде54
ленному времени исследования крови, добавить 3 мл раствора рабочего реактива, через 15 минут проколориметрировать на ФЭКе при красном светофильтре против воды. Аналогично проводят работу со стандартным раствором глюкозы ( см. занятие 5, работа 2, а также занятие 16, работа 2 ).
РЕЗУЛЬТАТЫ занести в таблицу и построить сахарную кривую.
натощак
через 15
мин.
через 30
мин.
через 45
мин.
через 60
мин.
через 90
мин.
Dx
Cx
Глюкоза крови
мМ/л
15
30
45
60
75
90 Время (мин)
ВЫВОДЫ:
Работа 2. Качественное определение глюкозы в моче (проба
Троммера).
ПРИНЦИП МЕТОДА.
См. занятие 5, работу 1.
55
ХОД РАБОТЫ.
К 5 каплям исследуемой мочи прибавить 5 капель 10% раствора едкого
натра, 5 капель 1% раствора сернокислой меди и нагреть на кипящей водяной бане. В присутствии углеводов развивается желтая или красная окраска
осадка. Работу выполнить с нормальной мочой и с мочой, содержащей сахар.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОДЫ:
Работа 3. Количественное определение сахара в моче (по методу
Альтгаузена).
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Метод основан на том, что при действии на альдегиды небольшим количеством разбавленной щелочи происходит полимеризация альдегидов. Продукты этой реакции называют альдолями, а рассматриваемую реакцию - альдольной конденсацией. При нагревании альдегидов с концентрированной
щелочью они превращаются в смолистые вещества бурого цвета.
ХОД РАБОТЫ.
Работу выполнить с нормальной мочой и с мочой, содержащей сахар. 4 мл
мочи смешать с 1 мл 10% раствора едкого натра и кипятить в течение 1 минуты. Через 10 минут развившуюся окраску сравнить со стандартной цветной
шкалой. На шкале указано содержание сахара в процентах, соответствующее
определенному окрашиванию жидкости в пробирке. Если полученный цвет
жидкости интенсивнее цвета одной полоски таблицы, но слабее следующей,
то содержание сахара будет средней величиной между обозначенными на
этих полосках. Мочу, содержащую сахар более 4%, необходимо разбавить
водой в 2 или 3 раза и с уже разведенной провести определение. Полученный процент сахара в этом случае надо умножить на степень разведения.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОДЫ:
56
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:
1. Глюкоза крови, ее происхождение, содержание в норме. Участие печени в
поддержании уровня глюкозы в крови.
2. Гормональная регуляция уровня глюкозы в крови.
3. Гипо- и гипергликемии, факторы, способствующие их развитию.
Глюкозурия, причины ее возникновения.
4.Влияние концентрации АТФ и АДФ на активность метаболических путей
углеводного обмена.
5. Влияние инсулина, глюкагона, адреналина на процессы синтеза и распада
гликогена через изменение концентрации цАМФ и активности протеинкиназы. «Каскадный механизм» регуляции.
6. Влияние инсулина и глюкагона на процессы гликолиза и глюконеогенеза
через изменение концентрации фруктозо-2,6-бисфосфата.
7. Нарушения углеводного обмена при голодании, сахарном диабете, гликогенозах. Инсулиновый рецептор. Инсулинорезистентность.
8. Методика проведения пробы с сахарной нагрузкой (тест на толерантность
к глюкозе - ТТГ).
9. "Сахарные" (гликемические) кривые и их особенности в норме и при патологии.
ЗАНЯТИЕ 19.
КОЛЛОКВИУМ ПО ТЕМЕ: ГОРМОНЫ. ОБМЕН УГЛЕВОДОВ.
57
СЕМЕСТР 2.
ЗАНЯТИЕ 1.
ВАЖНЕЙШИЕ ЛИПИДЫ ОРГАНИЗМА. ПЕРЕВАРИВАНИЕ ЛИПИДОВ.
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
Нарушения переваривания и всасывания липидов могут быть обусловлены
разными причинами: нарушение синтеза панкреатической липазы, закупорка
желчных протоков, воспалительные процессы в кишечнике. Дефицит липазы
чаще всего связан с заболеваниями поджелудочной железы и сопровождается панкреатической стеатореей. Нарушение экскреторной функции поджелудочной железы при перекрытии ее протока ( закупорка камнем, воспалительный процесс) при панкреатитах или непосредственном повреждении
ткани железы ( опухоль, атеросклероз сосудов, кровоизлияние и др.) существенно сказывается на жировом обмене. При стеаторее организм теряет
воду и электролиты, затрудняется всасывание жирорастворимых витаминов.
Работа 1. Определение активности липазы в дуоденальном содержимом.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Метод основан на электрометрическом определении активности липазы по
концентрации жирных кислот, освобождающихся при гидролизе эмульгированного жира под действием панкреатической липазы.
ХОД РАБОТЫ.
Приготовить смесь реактивов в трех пробирках (1-я - контрольная,
2-я и 3-я - опытные) по следующей схеме:
Реактивы
Контроль
Опыт 1
Опыт 2 с желчными
кислотами
1. Молоко
1,5 мл
1,5 мл
1,5 мл
2.
Дистиллированная 1 мл
1 мл
0,5 мл
вода
3. Трис-буфер, рН = 8,0 0,5 мл
0,5 мл
0,5 мл
4. Дуоденальное содер- _
0,5 мл
0,5 мл
жимое
5. Желчные кислоты
--0,5 мл
Измерить на иономере величину pHо смеси в контрольной пробирке до
инкубации и записать в таблицу с результатами (до инкубации, для всех пробирок).
Все пробирки поместить в термостат и инкубировать при температуре 37о
в течение 1 часа.
По окончании инкубации во все пробирки добавить по 1,5 мл этилового
спирта для ингибирования действия фермента.
58
В контрольную пробирку также внести 0,5 мл дуоденального содержимого, перемешать.
В каждой пробирке после инкубации определить pH1.
РЕЗУЛЬТАТЫ (занести в таблицу и произвести расчеты):
Контроль
Опыт 1
Опыт 2
До инкубации
PHо
После
ции
инкуба- pH1
pH1
pHконт = рНо – pH = рНо - рН1
рН1
pH - pHконт =
pH1
pH = рНо - рН1
pH -pHконт=
pH контроля вычесть из pH 1 и 2 пробирки за время инкубации. По величине полученной разницы найти активность липазы в 1 и 2 пробирках с
помощью калибровочного графика. Активность фермента выражена в условных единицах. За условную единицу принимается количество фермента,
освобождающее из триглицерола 1 мкМ жирной кислоты в минуту в расчете
на 1 мл дуоденального содержимого. В норме активность панкреатической
липазы в дуоденальном содержимом 400-700 ед./мл.
ВЫВОДЫ (сравнить активность липазы в опыте 1 и 2; сделать вывод о
влиянии желчных кислот на активность фермента):
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:
1.Классификация липидов. Знать структуру триацилглицеролов, фосфатидов
(фосфатидилхолин, фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин).Знать и уметь
писать структуры стеариновой, пальмитиновой, олеиновой жирных кислот.
3. Свободные жирные кислоты, значение насыщенных и ненасыщенных
жирных кислот.
4. Биологические функции нейтральных жиров.
5. Строение и функция фосфолипидов, сфинголипидов, гликолипидов.
6. Переваривание липидов.
-Переваривание липидов в кишечнике: действие панкреатических ферментов (липазы, фосфолипазы, холестеролэстеразы), функция желчи,
значение желудочной липазы у детей.
- Всасывание липидов в кишечнике, факторы, влияющие на всасывание;
липиды кала, стеаторея.
59
ЗАНЯТИЕ 2.
ВНУТРИТКАНЕВЫЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ ЛИПИДОВ. КЕТОНОВЫЕ
ТЕЛА.
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.
Кетоновые тела - нормальный продукт липидного обмена. Значение кетоновых тел - энергетическое.
Кетоз возникает при патологических состояниях, связанных с недостатком углеводов в тканях (сахарный диабет, голодание, мальабсорбция
пищевых сахаров у детей младшего возраста, токсикозы беременности и
др.). Кетоз сопровождается ацидозом тканей, что приводит к нарушению
метаболизма. При этом определяется повышение уровня кетоновых тел в
крови - кетонемия и появление их в моче - кетонурия.
Работа 1. Образование и окисление кетоновых тел в тканях организма.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Смесь нитропруссида Nа и аммиака при наличие кетоновых тел в тканях
дает малиновое окрашивание.
ХОД РАБОТЫ.
1. Получение экстрактов из тканей, печени, почек, сердца, скелетной
мышцы, мозга.
Навеску каждой ткани (кроме печени) - 1г всухую растереть в охлажденной ступке, постепенно добавляя 10 мл дистилированной воды. Гомогенаты профильтровать в охлажденные пробирки. Готовые фильтраты ( экстракты) использовать для опыта как источник ферментов, окисляющих ацетоновые тела. Ткань печени используется полностью, растирается в охлажденной ступке с постепенным добавлением 25 мл дистиллированной воды,
фильтруется в охлажденный стаканчик. Экстракт используется как источник
ацетоновых тел.
2. С экстрактами каждой ткани проделать реакцию на наличие кетоновых тел. Для этого взять по 1мл экстракта печени, сердца, мозга почки и по
7 капель реактива Имберта, тщательно перемешать и осторожно по стенке
наслоить примерно 1 мл 25% раствора аммиака. При наличии кетоновых тел
на границе двух жидкостей возникает малиновое кольцо.
3. Подготовить пробирки для инкубации.
В чистую пробирку добавить 1мл соответствующей ткани, 1мл экстракта печени как источник кетоновых тел и 1мл раствора фосфатного буфера,
перемешать, закрыть пробкой и поставить в термостат на 1 час при температуре 45о.
В контрольную пробирку налить 2мл экстракта печени и 1мл раствора
фосфатного буфера, закрыть пробкой и поставить в термостат на 1час.
4. Через 1час после инкубации со всеми пробирками проделать реакции
на кетоновые тела так же, как описано выше.
60
РЕЗУЛЬТАТЫ – появление или отсутствие кольца обозначить знаком
(+) или (-) и занести в таблицу.
Ткань
Печень
Сердце
Почки
Мышца
Мозг
До инкубации
После инкубации
ВЫВОДЫ (сделать вывод о том, какие органы синтезируют кетоновые тела и
какие органы используют их в качестве источников энергии):
Работа 2. Определение кетоновых тел в моче.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
К ацетоновым или кетоновым телам относятся ацетон, -оксимасляная и
ацетоуксусная кислоты.
Обнаружение в моче ацетона основано на взаимодействии его с нитропруссидом натрия и образовании окрашенного соединения. Качественное
выявление ацетоуксусной кислоты основано на образовании комплексного
соединения железа с енольной формой ацетоуксусной кислоты.
ХОД РАБОТЫ:
1. Экспресс-метод определения ацетона в моче( по Лестраде).*
На предметное стекло, помещенное на лист белой бумаги, нанести небольшое количество порошка, состоящего из смеси натрия нитропруссидного, аммония сернокислого, натрия углекислого и добавить 2-3 капли исследуемой мочи. При наличии ацетона максимальное вишневое окрашивание
наступает обычно через 1-2 минуты. Пробу считать отрицательной, если изменения цвета мочи не наступает, положительной - при отчетливо фиолетовой окраске, появляющейся через 1-3 минуты.
2. Реакция Легаля на ацетон с нитропруссидом натрия.*2
К небольшому количеству ( 1 мл) исследуемой мочи прибавить несколько
капель раствора нитропруссида натрия и затем 3-4 капли 10% раствора едкого натрия. Образуется красное окрашивание. Затем жидкость подкислить
*.реакции провести с нормальной мочой и мочой, содержащей ацетоновые тела
61
10% раствором уксусной кислотой. При этом в присутствии ацетона красная
окраска приобретает вишневый оттенок, а если ацетона нет, то при добавлении уксусной кислоты красное окрашивание исчезает.
3. Реакция Герхарда на ацетоуксусную кислоту.*
В пробирку налить 1-2 мл исследуемой мочи и прибавить 4-5 капель расттвора хлорного железа. Наблюдается вишнево-красное окрашивание, если
присутствует ацетоуксусная кислота.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОДЫ:
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:
1. Мобилизация жира из жировых депо /липолиз/, гормональная регуляция липолиза, гормончувствительная липаза.
2. Окисление глицерина в тканях. Энергетический эффект окисления
глицерина до углекислого газа и воды.
3. Механизм окисления жирных кислот в тканях. Особенности окисления ненасыщенных жирных кислот.
4. Энергетический эффект полного окисления пальмитиновой и стеариновой жирных кислот.
5. Синтез кетоновых тел в печени. Пути образования ацетоуксусной
кислоты.
6. Пути активации ацетоуксусной кислоты.
7. Нарушения, приводящие к накоплению кетоновых тел в тканях. Кетонемия, кетонурия.
.реакции провести с нормальной мочой и мочой, содержащей ацетоновые тела
62
ЗАНЯТИЕ 3.
АНАБОЛИЗМ ЛИПИДОВ.
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.
В организме большая часть липидов представлена в виде триацилглицеролов, которые являются главными липидами пищи и жировых отложений.
Фосфолипиды являются основными компонентами мембран и могут выполнять особые функции . Например, дипальмитолецитин является основным
элементом сурфактанта, поверхностно-активного вещества легких. Инозитолфосфатиды являются мессенджерами при действии гормонов. Гликосфинголипиды входят в состав гликокаликса клеточной поверхности.
Фосфолипиды являются липотропными веществами, которые предохраняют печень от жирового перерождения. Лецитин (фосфатидилхолин)
участвует в метаболизме липопротеинов, активируя липопротеинлипазу.
Фосфолипиды составляют оболочку транспортных форм липидов – липопротеинов сыворотки крови.
Увеличение содержания фосфолипидов отмечается при холестазе, лёгкой
форме гепатита, гиперлипопротеинемии 11, алкоголизме, циррозе печени,
панкреатите и т.д.
Снижение концентрации фосфолипидов имеет место при тяжёлых вирусных гепатитах, гипертиреозе, пернициозной анемии, рассеянном склерозе
и т.д.
Работа 1. Количественное определение общих фосфолипидов сыворотки крови по фосфору.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Фосфолипиды осаждают трихлоруксусной кислотой (ТХУ) вместе с белками крови. Полученный осадок минерализуют и в остатке определяют неорганический фосфат. О содержании фосфолипидов судят косвенно – по количеству фосфорной кислоты, полученной расчетным методом после колориметрии.
ХОД РАБОТЫ.
Опытная пробирка.
1. В центрифужную пробирку, куда уже добавлено 0,2 мл сыворотки
крови, добавить 2,5 мл дистиллированной воды, взболтать.
2. Добавить 3 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ),
встряхнуть, размешать стеклянной палочкой и оставить на 2 минуты.
3. Центрифугировать 10 минут (после предварительного уравновешивания на центрифужных весах).
4. Слить надосадочную жидкость и работать с осадком.
5. К осадку прибавить 1 мл 57% раствора хлорной кислоты и тщательно
размешать стеклянной палочкой.
6. Добавить 6 мл дистиллированной воды, размешать, профильтровать
через бумажный фильтр.
63
7. В пробирку с фильтратом добавить 1 мл 4% раствора молибденовокислого аммония , перемешать и добавить 1 мл эйконогена (раствора
аминонафтолсульфоновой кислоты).
8. Довести водой объем до 10 мл и оставить для развития окраски на 10
минут.
9. Колориметрировать на ФЭКе против воды с красным светофильтром
(670 нм) в кювете толщиной 1 см.
Приготовление стандарта.
1. В пробирку прилить 2 мл стандартного раствора однозамещенного
фосфорнокислого калия и прибавить 0,8 мл 57% раствора хлорной
кислоты, перемешать.
2. Довести водой объем до 7 мл.
3. Добавить 1 мл раствора молибденовокислого аммония и 1 мл эйконогена.
4. Объем довести дистиллированной водой до 10 мл и оставить для
развития окраски на 10 минут.
5. Колориметрировать на ФЭКе против воды с красным светофильтром
(670 нм) в кювете толщиной 1 см.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
Липоидный фосфор в 100 мл сыворотки крови в мг/дл рассчитывается по
формуле:
Еоп х 0,02х100
Е оп.
Х = ------------------------= ------- Х 10
Ест. х 0,2
Е ст.
где Х – липоидный фосфор в мг /дл
Е оп. – оптическая плотность опытной пробы.
Е ст. – оптическая плотность стандартной пробы.
0,02 – содержание фосфора в 2 мл стандартной пробы (мг).
0,2 – количество сыворотки в опыте (мл).
Норма концентрации липоидного фосфора у взрослых от 6,1 до 14,5
мг/дл или 1,97 – 4,68 ммоль/л (коэффициент пересчета 0,323).
ВЫВОДЫ:
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ.
1. Особенности транспорта ацетил-КоА из митохондрий в цитоплазму.
Регуляция процесса.
2. Строение синтетазы жирных кислот. Синтез пальмитиновой кислоты.
64
Регуляция процесса.
3. Особенности синтеза ненасыщенных жирных кислот и длинноцепочечных высших жирных кислот.
4. Синтез триглицеролов.
5. Синтез фосфатидов. Влияние липотропных веществ на синтез фосфатидов.
6. Особенности синтеза холестерина. Регуляция процесса.
7. Роль ацетил-КоА в интеграции углеводного и липидного обменов.
8. Взаимосвязь углеводного и липидного обменов. Пути образования узловых метаболитов.
ЗАНЯТИЕ 4.
ЛИПОПРОТЕИНЫ СЫВОРОТКИ КРОВИ.
ТРАНСПОРТ ХОЛЕСТЕРОЛА.
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.
В крови здорового человека, взятой натощак, содержатся только ЛПВП,
ЛПНП и ЛПОНП. Хиломикроны в ней отсутствуют. Они появляются только при нарушениях липидного обмена. В ряде патологических состояний в
крови могут обнаруживаться липопротеины промежуточной плотности
ЛППП. Гиперлипопротеинемия- повышение содержания определенных классов липопротеинов в плазме крови. Развитие атеросклероза сопровождается повышением количества ЛПНП и ЛПОНП - атерогенных фракций - и
снижением ЛПВП – антиатерогенной фракции.
На содержание холестерола в сыворотке крови влияют различные факторы: наследственность, питание, состояние эндокринных желез и внутренних органов ( печень, почки). Так, например, повышение уровня холестерола в сыворотке крови наблюдается при атеросклерозе, семейной гиперхолестеринемии, гипотиреозе, декомпенсированном сахарном диабете,
нефротическом синдроме и др. Понижение концентрации холестерола происходит при остром гепатите, гипертириреозе, кахексии, анемии и др. Исследуется роль холестерола в процессах нейродегенерации.
Работа 1. Определение - и пре--липопротеинов в сыворотке крови.
ОБОРУДОВАНИЕ: ФЭК.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Метод основан на способности гепарина образовывать с - и пре- - липопротеинами сыворотки крови комплекс, который под действием хлористого
кальция выпадает в осадок. Концентрацию  - и пре- -липопротеинов сыворотки крови определяют по степени мутности, которая пропорциональна
концентрации липопротеинов.
65
ХОД РАБОТЫ.
В пробирку, содержащую 0,2 мл сыворотки крови, прилить 2 мл 0,05М
хлористого кальция. Определить исходную величину оптической плотности
/Д1/ на ФЭКе /красный светофильтр, 630-690 нм, кювета 0,5 см/. Перенести
содержимое кюветы обратно в пробирку. К содержимому пробирки добавить
микропипеткой точно! 0,04 мл гепарина, несколько раз промыв пипетку содержимым пробирки. Ровно через 5 минут измерить величину оптической
плотности /Д2./ на ФЭКе.
РАСЧЕТ:
Содержание - и пре--липопротеинов в сыворотке крови рассчитывают
по формуле:
х=(Д2 - Д1) . 12
где 12-эмпирический коэффициент для выражения -липопротеинов в г/л.
По полученным данным рассчитать содержание - и пре--липопротеинов
в исследуемой сыворотке крови.
В норме содержание - и пре--липопротеинов в сыворотке крови человека составляет 3,0-7,2 г/л.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОДЫ:
Работа 2. Количественное определение холестерола в сыворотке
крови.
ОБОРУДОВАНИЕ: ФЭК.
ПРИНЦИП МЕТОДА
Холестерол в присутствии уксусного ангидрида и смеси уксусной кислоты
и серной кислоты дает зеленое окрашивание – метод Илька.
ХОД РАБОТЫ
К 2,1 мл реактива Илька добавить 0,1 мл сыворотки крови,
очень
медленно, по стенке пробирки. Пробирку встряхнуть несколько раз, закрыть
пробкой и поставить в термостат на 20 минут. (температура 370С). Пробирку
из- под реактива Илька сразу промыть водой.
Колориметрировать на ФЭКе при красном светофильтре (630 – 690 нм) в
кювете шириной 5 мм против воды.
Пользуясь калибровочным графиком, вычислить концентрацию холестерола в ммоль/л.
Норма 3,9 – 6,3 ммоль/л.
66
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОДЫ:
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:
1. Ресинтез жиров в кишечнике. Образование хиломикронов.
2. Липопротеины сыворотки крови. Классификация, строение, состав.
3. Апопротеины, классификация, функции.
4. Липопротеинлипаза, значение в метаболизме хиломикронов и ЛПОНП.
5. ЛПОНП, место синтеза, особенности состава, функции.
6. ЛПНП, образование, особенности состава. Участие ЛПОНП и ЛПНП в
транспорте холестерола к тканям. ВЕ-рецепторы.
7. ЛПВП, особенности строения. Значение в обмене холестерола, лецитинхолестерол-ацилтрасфераза (ЛХАТ).
8. Гиперхолестеролемия, гиперлипопротеинемия как факторы риска развития
атеросклероза.
ЗАНЯТИЕ 5.
МЕТАБОЛИЗМ МЕМБРАН. ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ.
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.
Биологические мембраны играют важную роль как в структурной организации, так и в функционировании клеток и клеточных органелл. Неадекватная активация перекисного окисления липидов грозит тканям нарушением
биохимических процессов в клетке с полным ее разрушением. Свободнорадикальное окисление липидов играет ведущую роль в развитии ряда заболеваний, в том числе атеросклероза, ревматоидного артрита, онкологических,
воспалительных и инфекционных заболеваний, диабета и др. Синдром пероксидации проявляется также при низком уровне антиоксидантов, стрессе
любого происхождения, действии синтетических лекарств и ксенобиотиков,
гиподинамии, старении организма, гипоксических состояниях, воздействии
радиоактивного и ультрафиолетового излучений. При патологии снижается
активность ферментов защиты, наблюдается недостаток антиоксидантов ( витаминов Е,С ).
67
Работа 1. Количественное определение малонового диальдегида в
ткани печени.
ОБОРУДОВАНИЕ: баня, ФЭК.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Основан на определении малонового диальдегида (МДА) как показателя
перекисного окисления липидов при инкубации гомогенатов тканей в присутствии кислорода. В присутствии прооксидантов МДА определяется по
специфической цветной реакции в кислой среде с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК).
ХОД РАБОТЫ.
В трех центрифужных пробирках приготовить инкубационную смесь реактивов по следующей схеме:
1 пробир- 2 пробирка
ка
“контроль”
“опытная”
Трис-буфер 0,15 М
Сульфат
железа
FeSO4
Аскорбиновая кислота
ТХУ 10 раствор
с ЭДТА
Гомогенат печени
3,4 мл
-
3,4 мл
-
3 пробирка
“опытная”
с добавлением прооксидантов
1,4 мл
1 мл
-
-
1 мл
-
1 мл
-
1,0 мл
1,0 мл
1,0 мл
Все пробирки поместить в термостат при 37оС на 15 минут. После инкубации остановить реакцию в 1 и 3 пробирках, добавляя в них по 1 мл ТХУ с
ЭДТА, перемешать. Все пробирки центрифугировать в течение 20 минут при
3000 об/мин. Надосадочную жидкость осторожно слить в чистые пробирки.
Затем в другие чистые пробирки отобрать по 4 мл надосадочной жидкости,
добавить по 2 мл свежеприготовленного раствора ТБК (тиобарбитуровая
кислота) и поместить пробирки в кипящую баню на 15 минут. Пробирки
охладить в холодной воде и определить оптическую плотность на ФЭКе с зеленым светофильтром (длина волны 540 нм) в кювете 10 мм.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
Активность ПОЛ выражается количеством микромолей МДА, накопленного за период инкубации в 1 мл гомогената
.
D
 Dконтр.
X  опыт.
, где

Х - количество МДА, накопленного за период инкубации в 1 мл гомогената,
68
- молярный коэффициент экстинкции для малонового диальдегида при ре-
акции с ТБК, численно равный 0.156.
Dоп и D конт - оптические плотности "опытной" и "контрольной" пробирок
соответственно.
Рассчитать активность ПОЛ в 1 и 3 пробирках и сделать вывод об активности ПОЛ и влиянии ионов Fe2+ и аскорбата на перекисное окисление липидов.
ВЫВОДЫ:
Работа 2. Количественное определение каталазы в крови.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
В основе количественного определения активности каталазы лежит определение количества перекиси водорода, разложенной ферментом за определенный промежуток времени. О количестве расщепленной перекиси водорода судят по разности количества перманганата калия. израсходованного на
титрование перекиси водорода до и после действия каталазы .
Активность каталазы выражают с помощью каталазного числа. Каталазным числом называют количество мг перекиси водорода, которое разлагается
под действием 1 мкл крови.
ХОД РАБОТЫ.
Работу проводят по следующей схеме:
Реактивы
Стаканчик № 1
Стаканчик № 2
(опыт)
(контроль)
Кровь
1 мл
1 мл
Вода дистиллированная
7 мл
7 мл
Перекись водорода 1%
2 мл
Серная кислота 10%
5 мл
Стаканчики оставляют на 30 мин при комн. t, изредка встряхивая
Через 30 мин
Перекись водорода 1%
2 мл
Серная кислота 10 %
5 мл
Действие каталазы в кислой среде прекращается, т. к. этот фермент
действует при рН=7,4. Поскольку в контрольную пробу серную кислоту приливали до добавления перекиси водорода, то в контроле все добавленное количество перекиси водорода остается нерасщепленным.
69
Содержимое каждого стаканчика необходимо титровать раствором перманганата калия до розового окрашивания, не исчезающего в течение 30 сек.
Рассчитать каталазное число (КЧ) по формуле:
КЧ = (А - В) х 1,7,
где:
А - кол-во 0,1 N раствора КМnО4, пошедшее на титрование контрольной
пробы в мл.
В - кол-во 0,1N раствора КМnО4, пошедшее на титрование опытной пробы
в мл.
1,7 - это коэффициент, показывающий, сколько мг Н2О2 содержится в 1мл
0,1н. раствора Н2О2.
В норме каталазное число колеблется от 10 до 15 единиц у взрослых и 7,5
- 9,9 единиц у детей.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОДЫ:
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:
1. Структурная организация метаболических мембран.
2. Роль липидов в построении мембран.
3. Группа белков, участвующих в построении мембран.
4. Биологические функции мембран.
5. Виды транспорта веществ через мембрану.
6. Метаболизм мембран. Перекисное окисление липидов. Показатели
перекисного окисления, определяемые в клинике.
7. Регуляторы перекисного окисления в клетке (прооксиданты, антиоксиданты).
Для фармацевтического факультета:
1. Липосомы как модельная система биомембран, их применение в фармации и медицине.
ЗАНЯТИЕ 6.
КОЛЛОКВИУМ ПО ТЕМЕ: ОБМЕН ЛИПИДОВ
70
ЗАНЯТИЕ 7
ПЕРЕВАРИВАНИЕ БЕЛКОВ.
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ:
Желудочный сок представляет собой бесцветную жидкость, в состав
которой входят вода, белки, ферменты, муцин, соляная кислота, гидрофосфаты и некоторые другие соединения. Кислая реакция желудочного сока
обусловлена присутствием соляной кислоты, гидрофосфатов, а при патологических процессах – молочной кислоты и жирных кислот. Совокупность
всех веществ, способных быть донорами протонов, желудочного сока, составляют общую кислотность. Соляную кислоту, связанную с белками и
продуктами их переваривания, называют связанной соляной кислотой, а
находящуюся в несвязанном виде – свободной соляной кислотой. Содержание
последней подвержено значительным колебаниям, тогда как количество
связанной соляной кислоты достаточно постоянно.
При многих заболеваниях желучно-кишечного тракта нарушается секреция соляной кислоты и пепсиногена в желудке. При патологии кислотность
желудочного сока может быть нулевой, повышенной или пониженной. Отсутствие соляной кислоты и пепсина (ахилия ) часто наблюдается при тяжелых атрофических гастритах, злокачественных новообразованиях желудка. Пониженная кислотность ( гипохлоргидрия ) встречается при гипоацидном гастрите, раке желудка. Повышенная кислотность ( гиперхлоргидрия ) бывает при гиперацидном гастрите, язве желудка. Частым следствием ахилии является злокачественная анемия, поскольку отсутствует внутренний фактор Касла, необходимый для всасывания витамина В12 и наступает гиповитаминоз.
У новорожденных низкая активность протеолитических ферментов и
высокая проницаемость слизистой кишечника могут привести к всасыванию
нативных белков пищи и вызвать повышенную чувствительность к ним организма (пищевая аллергия ).
Работа 1. Определение свободной, связанной, общей соляной кислоты и общей кислотности желудочного сока раздельно и в общей
пробе.
ОБОРУДОВАНИЕ: бюретки для титрования.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Для определения общей кислотности и свободной соляной кислоты используется метод титрования 0,1н раствором NаОН в присутствии соответствующих индикаторов (фенолфталеина и диметиламиноазобензола). Кислотность желудочного сока оценивается в единицах кислотности по количеству миллилитров 0,1н раствора NAOH, необходимого для нейтрализации
100 мл желудочного сока.
1.Количественное определение общей кислотности желудочного сока
ХОД РАБОТЫ.
В тщательно вымытую водой и ополоснутую соляной кислотой колбу
71
прилить 10 мл профильтрованного желудочного содержимого, добавить 12 капли 0,5% раствора фенолфталеина* (зона перехода окраски индикатора
при рН=8,2-10,0).
Провести титрование 0,1н раствором едкого натра до появления слаборозового окрашивания, неисчезающего в течение 1 минуты. При титровании
колбочка ставится на лист белой бумаги.
РЕЗУЛЬТАТЫ: (выразить в условных единицах кислотности, сравнить с
нормой)
2. Количественное определение свободной соляной кислоты
ХОД РАБОТЫ.
К 10 мл желудочного сока добавить 1-2 капли спиртового раствора диметиламиноазобензола (зона перехода окраски в пределах рН=2,9-4,2). Титрование вести 0,1н раствором NаОН до появления оранжевой окраски. Свободная соляная кислота почти вся оттитровывается при рН=3.
РЕЗУЛЬТАТЫ (выразить в единицах кислотности, сравнить с нормой)
3. Количественное определение общей кислотности, общей соляной кислоты, свободной соляной кислоты и связанной соляной кислоты желудочного
сока в одной пробе.
ХОД РАБОТЫ.
Определение перечисленных видов кислотности в одной пробе желудочного сока титрованием 0,1н раствором NаОН с одновременным присутствием
двух индикаторов; диметиламиноазобензола и фенолфталеина.
В колбочку отмерить 10 мл фильтрата желудочного сока, добавить 1-2
капли диметиламиноазобензола и 2 капли фенолфталеина. Титрование ведется 0,1н раствором едкого натра до появления желтовато-красной (оранжевой)
окраски. Далее продолжается титрование до лимонно-желтого цвета (вторая
отметка) и, наконец, до появления розовой окраски (третья отметка), не исчезающей в течение 1 минуты. В каждом случае регистрировать количество мл
0,1н раствора едкого натра, потраченного на титрование.
Первый результат титрования находится в соответствии с количеством
свободной кислоты, второй используется для вычисления связанной соляной
кислоты, по последнему - рассчитывается общая кислотность.
Среднее арифметическое между вторым и третьим титрованием используется для расчета содержания общей соляной кислоты.
Пример: до первой метки (оранжевый цвет) на титрование пошло 3,2 мл
0,1н раствора едкого натра, до второй - 4,5 мл (лимонно-желтый цвет), до
Перед каждым титрованием колбочку тщательно вымыть водой, ополоснуть соляной кислотой и вновь
ополоснуть дистиллированной водой.
*
72
третьей - 5,5 мл (розовый цвет). Среднее арифметическое между второй и
третьей отметкой:
4.5 + 5.5 = 5.
2
Свободная соляная кислота 3.2 . 10 = 32 ед.
Общая соляная кислота 5.0 . 10 = 50 ед.
Связанная соляная кислота 50 -32 =18 ед.
Общая кислотность 5.5 . 10 = 55 ед.
Показатели кислотности желудочного сока в норме:
Общая кислотность – 40 – 60 ед.
Общая HCl
– 30 – 50 ед.
Свободная HCl
– 20 – 40 ед.
Связанная HCl
– 8 – 16 ед.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
Кол-во мл 0.1 н раствора В желудочном со- В задаче
NaOH,
ке с нормальной
№
пошедшего на титрование кислотностью
а) До первой отметки
б) До второй отметки
в) До третьей отметки
Результаты расчета кислотности желудочного сока (ед)
1. Свободная HCL
2.Общая HCL
3. Связанная HCL
4. Общая кислотность
ВЫВОДЫ (результаты задачи сравнить с показателями нормальной кислотности желудочного сока):
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:
1. Азотистый баланс, биологическая ценность белков.
2. Переваривание белков:
-переваривание белков в желудке, превращение профермента в фермент,
пепсин, значение соляной кислоты в переваривании белков,
-переваривание в кишечнике под действием ферментов поджелудочного и
кишечного соков (трипсин, химотрипсин, карбоксипептидазы А и В, эластаза, аминопептидаза),
-всасывание аминокислот из кишечника,
-гниение белков в кишечнике.
3. Пристеночное пищеварение.
73
ЗАНЯТИЕ 8.
ВНУТРИТКАНЕВЫЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ.
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.
Нарушения обмена аминокислот в организме вызывает ряд патологий:
1.Врожденные энзимопатии обмена аминокислот.
Следствием такого дефекта является накопление промежуточных неспецифических продуктов обмена, оказывающих токсическое влияние на организм и в первую очередь на ЦНС. К врожденным энзимопатиям аминокислотного обмена относятся такие заболевания, как фенилкетонурия, алкаптонурия, альбинизм, тирозиноз, болезнь Хатрнупа и др.
2.Нарушения синтеза и инактивации биогенных аминов.
Нарушения в синтезе или в инактивации биологически активных веществ
могут вызвать различные заболевания. Так снижение образования ацетилхолина в синапсах вызывает миастению (мышечную слабость). Недостаточность ДОФамина в черной субстанции мозга приводит к болезни Паркинсона. Гиперсекреция ДОФамина в височной доле мозга связана с шизофренией.
Клиническое значение определения трансаминаз.
Для клинических целей наибольшее значение имеют аспартатаминотрансфераза (АсАТ) и аланинаминотрансфераза (АлАТ).
В сыворотке крови здоровых людей активность трансаминаз в тысячи раз
ниже, чем в паренхиматозных органах. При острых и хронических заболеваниях, сопровождающихся деструкцией клеток, происходит выход трансаминаз из очага поражения в кровь. При нарушениях целостности клеток
печени в крови резко повышается уровень АлАТ, при инфаркте миокарда повышается уровень АсАТ.
Работа 1. Определение активности аланинаминотрансферазы в
крови и гомогенатах тканей.
ОБОРУДОВАНИЕ: ФЭК, термостат.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Процесс переаминирования можно наблюдать на примере обратимого переноса аминогрупп между аланином и альфа-кетоглутаровой кислотой. Реакцию катализирует фермент аланинаминотрансфераза. Непосредственным
продуктом реакции является пировиноградная кислота. При добавлении кислого 2.4-динитрофенилгидразина (2,4 ДНФГ) реакция прекращается и одновременно образуется гидразон пировиноградной кислоты, который в щелочной среде образует окрашенное соединение. Интенсивность его окраски - от
желтого до коричневого цвета - пропорциональна количеству образующейся
пировиноградной кислоты.
74
ХОД РАБОТЫ.
1. опытная проба
В пробирку, содержащую 0,2 мл гомогената ткани (крови), добавить 1 мл
смеси субстратов (аланин+альфа-кетоглутаровая кислота) и поместить
пробирку в термостат на 30 минут при 37 оС.
После инкубации в пробирку прилить 1 мл раствора динитрофенилгидразина (ДНФГ) и выдержать при комнатной температуре 20 минут.
2. контрольная проба
В пробирку, содержащую 0,2 мл гомогената ткани (крови), добавить 1 мл
динитрофенилгидразина (ДНФГ) и 1 мл смеси субстратов (аланин+ альфакетоглутарата). Выдержать пробирку при комнатной температуре 20 минут.
3. Через 20 минут после добавления ДНФГ в опытной и контрольной пробирках определить содержание пировиноградной кислоты (ПВК). Для этого к
контрольной и опытной пробиркам добавить по 10мл 0,4 N раствора NаОH и
колориметрировать через 5 минут на ФЭКе с зеленым светофильтром против
воды.
РАСЧЕТ:
Dk ( контрольная пробирка )
Dо (опытная пробирка)
D=Do-Dк
D используется для определения концентрации ПВК (мкМ) по соответствующему графику.
Расчет активности аланинаминотрансферазы (АлАТ) в крови:
А
ПВК  мкМоль / л
0,2  88
где:
А - активность АлАт в мКМ/мл за 30 мин. инкубации,
[ПВК] - концентрация пирувата в пробе,
0.2 - объем сыворотки (мл),
88 - коэффициент пересчета для перевода в систему СИ.
Расчет активности АлАт в тканях:
А
ПВК  разведение _ гомогената мкМоль / л
0,2  88
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОДЫ: (сравнить активность аланинаминотрансферазы в разных тканях.
Объяснить клиническое значение определения активности аланинаминотрансферазы в крови.)
75
Работа 2. Обнаружение фенилпирувата в моче (проба Фелинга).
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Фенилпировиноградная кислота образует с ионами трехвалентного железа
комплексное соединение, окрашенное в сине-зеленый цвет.
ХОД РАБОТЫ.
К 2 мл мочи прилить 4-5 капель 10% раствора хлорного железа. При наличии в моче фенилпировиноградной кислоты появляется сине-зеленое окрашивание.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОДЫ: (объяснить причину появления фенилпирувата в моче)
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:
1.Трансаминирование аминокислот: доноры и акцепторы NH2 группы,
характеристика трансаминаз (строение небелковой части, ее связь с витаминами, участие в реакциях трансаминирования) биологическое значение процесса, диагностическое значение определения трансаминаз.
2. Окислительное дезаминирование аминокислот (прямое дезаминирование). Оксидазы аминокислот, их характеристика.
3. Трансдезаминирование (непрямое дезаминирование).
Последовательность реакций, ферменты. Характеристика глутаматдегидрогеназы, биологическое значение процесса.
4. Декарбоксилирование аминокислот и образование биогенных аминов, химизм процесса и значение. Образование биогенных аминов: гистамина, серотонина, ГАМК. Роль биогенных аминов в регуляции
функций. Инактивация биогенных аминов с участим ферментов МАО и
ДАО.
5. Обмен фенилаланина и тирозина. Использование их для синтеза катехоламинов, меланинов, тироксина.
6. Внутритканевые превращения фенилаланина и тирозина, распад до
фумаровой и ацетоуксусной кислот. Химизм процесса.
7. Наследственные нарушения обмена фенилаланина и тирозина. Фенилкетонурия, алкаптонурия, тирозиноз, альбинизм.
8. Понятие глюкогенные и кетогенные аминокислоты.
Для фармацевтического факультета:
1. Аминокислоты и их производные как лекарственные вещества.
2. Ингибиторы аминооксидаз как фармпрепараты.
3. Антигистаминные препараты.
76
ЗАНЯТИЕ 9.
КОНЕЧНЫЕ ПРОДУКТЫ БЕЛКОВОГО ОБМЕНА.
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.
Аммиак, образующийся при распаде белков токсичен для человека. Наиболее частая причина гипераммониемии - нарушение функционирования ферментов орнитинового цикла. Точный диагноз типа гипераммониемии устанавливают путем определения метаболитов орнитинового цикла в крови и
моче.
Появление креатина в моче - креатинурия обнаруживается у взрослых и
связана с нарушением превращения креатина в креатинин. Это происходит
при заболеваниях мышц, миопатиях, прогрессирующей мышечной дистрофии, судорожных состояниях и других заболеваниях.
Креатинин - конечный продукт распада креатина. Суточное выделение
креатинина с мочой для каждого человека - величина довольно постоянная и
отражает в основном его мышечную массу. Креатинин не реабсорбируется
из первичной мочи в канальцах нефронов, поэтому количество выделяемого
креатинина отражает величину клубочковой фильтрации.
Определение в сыворотке остаточного азота и , особенно мочевины, имеет большое клиническое значение. При ряде патологических состояний уровень небелкового азота в крови повышается. Азотемия подразделяется на
ретенционную и продукционную. Ретенционная азотемия может быть почечной и внепочечной. Ретенционная азотемия наступает в результате недостаточного выделения с мочой азотосодержащих продуктов при нормальном поступлении их в кровяное русло. Продукционная азотемия наблюдается при избыточном поступлении азотосодержащих продуктов в кровь,
как следствие усиленного распада тканевых белков при обширных воспалениях, ранениях, ожогах, кахексии.
Работа 1. Диализ белка.
ОБОРУДОВАНИЕ: диализаторы.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Диализ - разделение веществ с помощью полупроницаемых мембран, через
поры которых не способны проходить молекулы высокомолекулярных соединений. Молекулы белков, обладая значительными размерами, не проникают через полупроницаемые мембраны, в то время как молекулы низкомолекулярных веществ свободно через них проходят.
ХОД РАБОТЫ.
Внутренний сосуд диализатора на одну треть объема заполнить раствором
белка с примесью какого-либо низкомолекулярного вещества (глюкозы, хлоридов, сульфатов и др.). Погрузить заполненный внутренний сосуд в стакан с
дистиллированной водой, так, чтобы уровень воды при погружении был несколько выше уровня пленки внутреннего сосуда. С содержимым внутреннего (исследуемый раствор) и внешнего (дистиллированная вода) сосудов
77
предварительно проделать качественные реакции на белок и низкомолекулярное соединения (описание качественных реакций см. ниже).
Через 60 минут после проведения диализа с содержимым внутреннего и
наружного сосудов проделать биуретовую реакцию и качественную реакцию
на низкомолекулярное соединение, находящееся в составе исследуемого раствора.
Биуретовая реакция (см. протокол занятия № 3).
Проба на хлориды: 1 мл исследуемого раствора + 1-2 капли 1% АgNO3.
Проба на сульфаты: 1 мл исследуемого раствора + 1-2 капли 1% ВаСl2.
Проба на глюкозу (реакция Троммера): 1 мл исследуемого раствора + 0.5
мл 10% NaOH + 5 капель 1% CuSO4. Пробирку нагревают в кипящей водяной бане в течение 1-2 минут до появления осадка красно-оранжевого цвета
(положительная реакция на глюкозу).
РЕЗУЛЬТАТЫ:
(в таблицу занести результаты качественных реакций на белок и низкомолекулярное соединение):
До
диализа
Внутренний
Сосуд
Наружный
сосуд
Белок
Низкомолекулярное соединение
После диализа
Белок
Низкомолекулярное соединение
ВЫВОДЫ:
Работа 2. Влияние гемодиализа на содержание остаточного азота
крови.
ОБОРУДОВАНИЕ:ФЭК.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Гемодиализ - диффузное отделение высокомолекулярных белков крови
больного от низкомолекулярных азотосодержащих веществ с помощью полупроницаемых мембран. Эффективность гемодиализа оценивается по содержанию остаточного азота в крови до гемодиализа, в процессе гемодиализа
и после его окончания.
78
Остаточный азот - азот всех небелковых азотсодержащих веществ крови,
оставшихся после осаждения белков. Для определения остаточного азота
крови необходимо:
1. Осадить белки трихлоруксусной кислотой, профильтровать
2. Полученный фильтрат минерализовать (т.е. подвергнуть сжиганию органические вещества в присутствии концентрированной серной кислоты и
катализатора.) При этом все азотсодержащие органические вещества переходят в форму сульфата аммония.
3. Сернокислый аммоний определить фотоэлектроколориметрическим методом.
Взаимодействие сернокислого аммония с реактивом Несслера, в состав которого входят соли ртути, дает желто-оранжевое окрашивание, интенсивность которого прямо пропорциональна концентрации азота.
ХОД РАБОТЫ.
К 0,8 мл минерализата безбелкового фильтрата крови добавить дистиллированную воду до половины объема мерной (на 10мл) пробирки.
Влить 0.4 мл заранее отмеренного реактива Несслера и довести водой до
общего объема (до 10 мл).
Через 10 минут окрашенный раствор колориметрируют на ФЭКе с синим
светофильтром (440нм) против дистиллированной воды в кюветах с толщиной слоя 10 мм.
Для расчета количественного содержания азота в сыворотке крови используют калибровочный график. Результат, полученный по графику умножить
на 10 (т.к. минерализат был получен в результате сжигания 3 мл безбелкового фильтрата, что соответствует 0,1 мл крови).
Содержание остаточного азота в сыворотке крови выражают в ммоль/л.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
Полученные данные занести в таблицу:
Содержание остаточного азота в мМоль/л
До гемодиа- В процессе гемодиализа
лиза
через 1 час Через 3 часа через
час.
После гемодиализа
5 через
через
1 сутки
5 суток
ВЫВОДЫ: (оценить эффективность диализа, сравнить результаты с нормой).
79
Работа 3. Количественное определение креатинина в моче.
ОБОРУДОВАНИЕ: ФЭК.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Количественное определение креатинина в моче основано на цветной реакции креатинина с пикриновой кислотой в щелочной среде.
Ход работы.
1. Опытная проба.
В мерную колбочку емкостью 25 мл налить 0,5 мл мочи, 0,25 мл 10% раствора едкого натрия и 0,5 мл пикриновой кислоты.
2. Контрольная проба.
В мерную колбочку емкостью 25 мл налить 0,5 мл дистиллированной воды, 0,25 мл 10% раствора едкого натрия и 0,5 мл пикриновой кислоты.
3. Содержимое опытной и контрольных колбочек тщательно перемешать и
оставить стоять на 5 минут.
4. Довести содержимое колбочек дистиллированной водой до метки .
5. Окрашенный раствор опытной пробы колориметрируют на ФЭКе с синим
светофильтром (400нм) в кюветах с толщиной слоя 5 мм против контрольной пробы.
РАСЧЕТ:
Количество креатинина (мг) определить по калибровочному графику, построенному по стандартным растворам креатинина. Содержание креатинина
в суточном диурезе рассчитать по формуле:
X= мг креатинина Х суточный диурез
0,5 мл мочи
В НОРМЕ у мужчин с мочой за сутки выделяется 1,0-2,0 г креатинина
у женщин --0,8-1,8 г .
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОДЫ:
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ :
1. Образование конечных продуктов азотистого обмена: солей аммония
и мочевины. Биосинтез мочевины, последовательность реакций. Величина
суточного выделения мочевины. Гипераммониемия. Энзимопатии ферментов
орнитинового цикла.
2. Важнейшие тканевые механизмы временного связывания аммиака:
80
образование глутаминовой кислоты, глутамина, трансреаминирование,
глюкозо-аланиновый цикл.
3. Распад глутамина в тканях.
4. Центральная роль глутаминовой кислоты в аминокислотном обмене.
5. Синтез креатина , химизм реакций.
6. Креатинфосфат, его образование и роль в обмене веществ. Креатинфосфокиназа, ее изоферменты.
7. Образование креатинина и клиническое значение его количественного определения в моче.
8. Остаточный азот крови, количественное значение его определения.
Нормальное содержание остаточного азота в сыворотке крови.
9. Для лечебного, педиатрического и фармацевтического факультетов:
Образование и метаболизм оксида азота. Метаболическое и регуляторное
действия оксида азота. Синтаза оксида азота, ее изоформы.
10. Для медико-профилактического факультета:
Серусодержащие аминокислоты. Их роль в обмене веществ: в образовании
кофакторов, структурной организации белка, в реакциях трансаминирования.
ЗАНЯТИЕ 10.
КОЛЛОКВИУМ ПО ТЕМЕ: ОБМЕН БЕЛКОВ.
ЗАНЯТИЕ 11.
ОБМЕН НУКЛЕОТИДОВ.
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.
Нарушения пуринового обмена проявляются гиперурикемией, которая
может носить метаболический (первичный) или вторичный (опосредованный) характер.
К метаболической гиперурикемии относят патологическое состояние,
вызванное повышенной продукцией мочевой кислоты или снижением ее секреции. Увеличение продукции мочевой кислоты могут вызвать энзимодефекты, связанные с синтезом нуклеотидов, ускоренный гемолиз, серповидноклеточная анемия и т.д.
Вторичную (опосредованную) гиперурикемию вызывают некоторые заболевания крови, почек, отравления свинцом, передозировка мочегонных препаратов, несахарный диабет.
Гиперурикемия - основная причина подагры. Отложение уратов в почках
приводит к почечной недостаточности, мочекаменной болезни. При лечении
и предупреждении подагры используют аллопуринол - структурный аналог
гипоксантина.
81
Работа 1. Количественное определение мочевой кислоты в моче.
ОБОРУДОВАНИЕ: бюретки для титрования.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Количественное определение мочевой кислоты в моче основано на ее способности восстанавливать фосфорно-вольфрамовый реактив в фосфорновольфрамовую синь. Количество образовавшейся фосфорно-вольфрамовой
сини определяют путем титрования феррицианидом калия: 1 мл феррицианида калия соответствует 0.66 мг мочевой кислоты.
ХОД РАБОТЫ.
1. В стаканчик для титрования влить 5 мл мочи, добавить 2 мл фосфорновольфрамого реактива, 10 мл 20% раствора углекислого натрия и перемешать
содержимое пробы. Появляется синее окрашивание, интенсивность которого
пропорциональна количеству мочевой кислоты.
2. Из бюретки осторожно, по каплям провести титрование данной пробы
раствором феррицианида калия до обесцвечивания (появления желтого цвета).
Расчет по формуле:
0,66  A  B
,
X
5
где: x - суточная экскреция мочевой кислоты в мг,
А - количество мл феррицианида К, пошедшего на титрование,
В - количество мл мочи, собранной за сутки,
5 - количество мл титруемой мочи,
0.66 - количество мг мочевой кислоты, титруемой 1 мл феррицианида К.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОДЫ (Оценить полученные результаты относительно нормы):
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:
1. Переваривание нуклеопротеинов в желудочно-кишечном тракте.
Ферменты и продукты преобразования. Всасывание продуктов распада.
2. Реакция образования 5-фосфорибозил-1 пирофосфата в синтезе пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов.
3. Соединения, являющиеся источниками атомов азота и углерода в
синтеза пуринового и пиримидинового колец .
82
4. Пути реутилизации аденина и гуанина в процессе биосинтеза нуклеотидов, особенности биосинтеза дезоксирибонуклеотидов.
5. Распад нуклеиновых кислот. Распад пуриновых нуклеотидов и нуклеозидов. Химизм преобразования аденина и гуанина. Ферменты и
конечные продукты. Нарушения пуринового обмена.
6. Распад пиримидиновых нуклеотидов и нуклеозидов. Химизм реакций
превращений цитозина и урацила. Ферменты и конечные продукты.
ЗАНЯТИЕ 12.
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ. СИНТЕЗ БЕЛКА.
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.
Наследуемые изменения первичной структуры ДНК ведут либо к прекращению синтеза белка, кодируемого поврежденным геном, либо к синтезу "неправильного" белка. Мутации могут быть как полезными, так и вредными. К
настоящему времени у человека найдены мутации во многих генах, кодирующих как структурные белки клеток и тканей, так и ферменты. Например,
серповидно-клеточная анемия, гемофилия, энзимопатии обмена аминокислот или липидов относятся к наследственным заболеваниям. До 90% заболеваний раком у человека обусловлены действием вредных химических и физических агентов. Действие антибиотиков на синтез белка микроорганизмов
является основой для их лекарственного применения.
Работа 1. Количественное определение ДНК в различных тканях.
ОБОРУДОВАНИЕ: ФЭК.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Метод основан на определении количества фосфора, входящего в состав
ДНК, который выделяется в свободном виде в результате сжигания (минерализации) ДНК. ДНК предварительно выделяют из 10 мг соответствующей
ткани (селезенки, печени, поджелудочной железы, скелетной мышцы) и подвергают минерализации.
Фосфор в минерализате определяют колориметрическим методом по реакции с молибдатом аммония в присутствии восстановителя. Продукт реакции
-молибденовая синь окрашивает раствор в синий цвет, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна количеству фосфора в пробе.
ХОД РАБОТЫ.
1. Ко всему объему готового минерализата из ткани селезенки, печени,
поджелудочной железы или мышцы добавить реактивы для цветной реакции
на фосфорную кислоту: 0,5 мл 2,5% раствора молибденовой кислоты и 0,5
мл 10% раствора аскорбиновой кислоты.
83
2. Через 10 минут определить оптическую плотность окрашенного раствора на фотоэлектроколориметре при красном светофильтре (длина волны
670 нм, толщина кюветы 5 мм).
3. Расчет содержания фосфора произвести по калибровочному графику,
построенному по данным определения оптической плотности стандартных
растворов химически чистого однозамещенного фосфата калия. Найденную
экстинкцию умножить на 10 (концентрация ДНК выражается в мкг фосфора
в расчете на 100 мг ткани).
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОДЫ:
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:
1.Общая характеристика нуклеиновых кислот, химический состав. Отличие
ДНК от РНК. Структура нуклеозида, нуклеотида.
2. Строение и ступени пространственной организации ДНК.
3. Структурная организация ДНК в хромосомах. Характеристика белкового
компонента, ДНК-протеины.
4. Первичная, вторичная , третичная структура РНК. Виды РНК.
5. Биосинтез ДНК. Характеристика процесса репликации. Репарация. Ферменты, обеспечивающие данные процессы.
6. Стадия транскрипции (синтез РНК). Избыточность генома ДНК (интроны,
экзоны). Посттранскрипционный процессинг.
7. Последовательность нуклеотидов в полинуклеотидной цепи как способ записи информации. ДНК- источник генетической информации в клетке. Характеристика генетического кода, его свойства.
8. Характеристика генома ДНК. Понятие гена.
9. Общие представления о теории матричного синтеза белка.
10.Стадия трансляции:
а) рекогниция, значение транспортной РНК и фермента АРСазы.
б) рибосомальный цикл: фазы инициации, элонгации, терминации. Роль белковых факторов.
в) посттрансляционный процессинг.
12. Регуляция биосинтеза белка. Теория Жакоба и Моно.
13. Антибиотики - ингибиторы синтеза белка.
84
ЗАНЯТИЕ 13.
КОЛЛОКВИУМ ПО ТЕМЕ: НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ. ОБМЕН
НУКЛЕОПРОТЕИНОВ. СИНТЕЗ БЕЛКА.
ЗАНЯТИЕ 14.
БИОХИМИЯ КРОВИ.
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.
Биохимический анализ крови является самым распространенным лабораторным исследованием в медицине и назначается практически при всех заболеваниях. Биохимический анализ крови используется как один из критериев
оценки регуляторных систем организма, контролирующих гомеостаз, а
также для диагностики ряда заболеваний.
Работа 1. Определение общего белка плазмы крови биуретовым
методом.
ОБОРУДОВАНИЕ: ФЭК.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Белки, реагируя в щелочной среде с сульфатом меди, образуют соединение, имеющее розово-фиолетовую окраску . Интенсивность получаемой
окраски, прямо пропорциональной концентрации белка в растворе, измеряется с помощью фотоэлектроколориметра.
ХОД РАБОТЫ.
1. В опытную пробирку, содержащую 0.1 мл плазмы крови, налить 5 мл
раствора биуретового реактива, перемешать и оставить при комнатной температуре на 30 минут.
2. В контрольную пробирку налить 0,1 мл 0.9 % раствора хлорида натрия и
добавить 5 мл раствора биуретового реактива, перемешать и оставить при
комнатной температуре на 30 минут.
3.Колориметрировать опытную пробирку против контрольной в кюветах
толщиной 10 мм при зеленом светофильтре (длина волны 540-560 нм).
4. По калибровочному графику рассчитать содержание белка в пробе.
НОРМА - 65-85 г/л.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОДЫ:
85
Работа 2. Разделение белков плазмы крови методом электрофореза
на бумаге.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Под влиянием постоянного электрического поля белки, заряжаясь отрицательно в щелочной среде при рН - 8,6-8,9, передвигаются по смоченной буферным раствором бумаге в направлении анода со скоростью, зависящей от
величины заряда и молекулярной массы белка.
При помощи электрофореза на бумаге сыворотку крови можно разделить
на 5 фракций и определить относительное содержание белка в каждой из них.
ХОД РАБОТЫ.
1. Определить на электрофореграмме 5 белковых фракций - альбумины,
1-, 2-, - и -глобулины.
2.Вырезать полученные фракции, нарезать их в виде щеточки и каждую из
них поместить в пронумерованную пробирку.
3. Для извлечения связанного белками красителя добавить 5 мл 0.01н раствора едкого натра в пробирку с альбуминами и по 2.5 мл раствора щелочи в
пробирки с глобулиновыми фракциями.
4. Пробирки взболтать и оставить на 30 минут в темном месте для полного
извлечения окраски.
5. Колориметрировать при длине волны 500-560 нм ( зеленый светофильтр)
против раствора 0.01н едкого натра в 5 мм кюветах.
6.Расчет.
Содержание белковых фракций рассчитывают в относительных и абсолютных величинах: для расчета относительного (процентного) содержания
значения экстинкций для альбуминов умножают на два и к полученному результату прибавляют величину экстинкций всех четырех глобулиновых
фракций.
2*Е(альбуминов)+Е +Е +Е +Е=100%
Общую сумму показаний экстинкций всех фракции принимают за 100% и
рассчитывают, какой процент по отношению к ней составляет экстинкция
каждой фракции. Например, если сумма всех величин экстинкции составляет
0,84, а для альбуминов она составляет 0,52, то относительное содержание
этой фракции можно рассчитать по следующей пропорции:
0,84 ---- 100 %
2*0,24 ---- х %
х=57,14%
Содержание остальных фракций вычисляют аналогичным образом.
Содержание белковых фракций в норме:
Альбумины -52 - 65 % (0,49-0,86 г/л);
α1 - глобулины -2,5 - 5 % (1 - 4 г/л);
α2- глобулины -7 - 13 % (4 - 12 г/л);
β- глобулины -8 - 14 % (5 - 11 г/л);
γ- глобулины -12 - 22 % (5 - 16 г/л).
РЕЗУЛЬТАТЫ:
86
ВЫВОДЫ:
Работа 3. Бензидиновая проба на гемовую группировку гемоглобина.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Реакция обусловлена способностью гемоглобина катализировать окисление бензидина (бесцветен) перекисью водорода в хинондиимид (синий цвет).
ХОД РАБОТЫ.
К 5 каплям разбавленной крови добавить 5 капель 0.2% спиртового раствора бензидина и несколько капель перекиси водорода. Жидкость окрашивается в синий или зеленый цвет.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОДЫ:
Работа 4. Биохимический анализ крови.
Группа студентов проводит разбор карты "Биохимический анализ крови".
Необходимо определить биохимические показатели, которые выходят за
пределы нормы, и объяснить возможные причины этих отклонений.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
Занести выявленные показатели, отклоняющиеся от нормы, в таблицу и сделать по ним лабораторное заключение.
Биохимические показатели:
Выше или ниже нормы
ВЫВОДЫ:
87
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:
1.Функция крови. Белки плазмы крови. Физиологическая роль белков плазмы
крови.
2.Белки плазмы крови:
а) альбумины и преальбумины, их роль в организме.
б) α1, α2, β, γ-глобулины, характеристика отдельных представителей.
Привести примеры индивидуальных белков, их роль в организме.
3.Особенности синтеза белков плазмы крови.
4. Гемоглобин - основной белок эритроцитов, его структурная организация.
5.Дыхательная функция крови, роль в переносе О2, СО2, Н+ -ионов. Механизмы, регулирующие сродство гемоглобина к кислороду.
6.Полиморфизм гемоглобина. Гетерогенные гемоглобины, гемоглобинопатии.
7. Синтез гема.
8. Ферменты крови. Диагностическое значение исследования ферментативного состава крови.
ЗАНЯТИЕ 15.
БИОХИМИЯ ПЕЧЕНИ.
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ:
Печень играет важнейшую роль в обмене веществ, контролируя и регулируя
белковый, липидный и углеводный обмены. Одна из важнейших функций печени - обезвреживающая. Нарушение обезвреживания билирубина приводит
к желтухам разного генеза.
Работа 1. Количественное определение общего, прямого и непрямого билирубина в сыворотке крови по методу Иендрашика.
ОБОРУДОВАНИЕ: ФЭК.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
При добавлении к сыворотке крови кофеинового реактива билирубин переходит в растворимое диссоциированное состояние. Такой билирубин со
смесью диазореактивов дает розово-фиолетовое окрашивание, которое под
действием реактива Фелинга переходит в зеленое.
По интенсивности последнего фотоколориметрически определяют концентрацию фракций билирубина.
Работу проводят по следующей схеме, используя 3 пробирки с сывороткой
крови.
88
ХОД РАБОТЫ.
№№ Реактивы
Общий били- Прямой били- Контроль
рубин
рубин
К
А
В
1.
Сыворотка крови
0,5 мл
0,5 мл
0,5 мл
2.
Кофеиновый реактив 1,75 мл
1,75 мл
3.
Физиологический рас- 1,75 мл
0,25 мл
твор, 0,9%
4.
Смесь диазореактивов 0,25 мл
0,25 мл
Через 10 минут
5.
Реактив Фелинга
0,5 мл
0,5 мл
0,5 мл
Колориметрировать на ФЭКе при красном светофильтре (длина волны 670
нм) против воды в кюветах толщиной 5 мм. Из показателей, полученных при
колориметрии общего и прямого билирубина, вычесть показатель контроля.
Расчет провести по калибровочному графику. Найти содержание общего и
прямого билирубина в микромолях на литр. Для определения уровня непрямого билирубина из общего его содержания вычесть показатель прямого билирубина.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОДЫ:
РАБОТА 2. Определение индикана в моче.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Индикан – калиевая или натриевая соль индоксилсерной кислоты, продукт преобразования триптофана.
В нормальной моче содержится в следовых количествах. Много индикана в моче травоядных животных и в моче человека при усиленном гниении
белков в кишечнике, при запорах и завороте кишечника.
Метод определения основан на способности индоксила окисляться в
синее индиго.
ХОД РАБОТЫ.
К 1 мл мочи прилить равный объем соляной кислоты, что приведет к
гидролитическому расщеплению индикана с образованием индоксила. Прибавить 1-2 капли раствора хлорного железа и хорошо взболтать 1-2 минуты.
Хлорное железо окисляет индоксил в синее индиго.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
89
ВЫВОДЫ:
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:
1. Роль печени в углеводном обмене.
2. Роль печени в липидном обмене.
3. Роль печени в белковом обмене.
4. Распад гемоглобина в клетках ретикулоэндотелиальной системы.
5. Прямой билирубин как продукт превращения непрямого билирубина в
гепатоцитах.
6. Обезвреживание билирубина глюкуроновой кислотой.
7. Превращение билирубина в желудочно - кишечном тракте.
8. Содержание желчных пигментов в крови и в моче в норме.
9. Нарушения пигментного обмена - надпеченочная, печеночная, подпеченочная желтухи.
10. Антитоксическая функция печени.
11. Конъюгация ксенобиотиков, ее механизм и значение: глюкуронидная,
сульфатная, метильная, ацетильная, пептидная, тиоцианатная.
12. Метаболические преобразования чужеродных веществ: микросомальное
и немикросомальное окисление, реакции восстановления. гидролиза. Метаболизм этанола.
ЗАНЯТИЕ 16.
БИОХИМИЯ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ И МИНЕРАЛИЗОВАННОЙ ТКАНЕЙ. БИОХИМИЯ МЫШЦ.
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ:
Соединительная ткань составляет около 50% массы тела, обеспечивает
поддержание целостности других тканей и органов, формируя их строму.
Костная ткань- это особый вид соединительной ткани, включающий компоненты органической и неорганической природы.
Заболевания соединительной ткани ( коллагенозы) проявляются генерализованной альтерацией внеклеточных компонентов соединительной ткани, в
основном коллагеновых волокон. К коллагенозам относятся ревматизм, системная красная волчанка, склеродермия и др.
Мукополисахаридозы – это форма гликозидозов, связанная с наследственным дефектом ферментов, гидролизующих гликозаминогликаны.
90
Щелочная фосфатаза- маркерный фермент костной ткани. Содержание
фермента в костной ткани и в плазме крови зависит от активности остеобластов.
Креатинфосфокиназа /КК/ обладает органоспецифичностью и содержится
в большом количестве в мышечной, сердечной и мозговой тканях. В норме
активность креатинфосфокиназы в крови очень мала. Определение активности КК и ее изоформ в крови используется в медицине для диагностики
таких заболеваний, как инфаркт миокарда, мышечные дистрофии и др.
Работа 1. Определение активности щелочной фосфатазы в крови.
ОБОРУДОВАНИЕ: ФЭК, центрифуга.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Фосфатазы - ферменты, отщепляющие остаток фосфорной кислоты от ее
органических эфирных соединений. В зависимости от рН, при котором проявляется их большая ферментативная активность, различают кислую и щелочную фосфатазы. Кислая фосфатаза активна при рН 4,4 - 6,2, а щелочная
фосфатаза имеет оптимум рН 8,6 - 10.
Эти ферменты поступают в кровь из костной ткани, печени, почек, селезенки, предстательной железы.
Щелочная фосфатаза вызывает гидролиз моноэфиров ортофосфата в щелочной среде рН=9,0. В качестве субстрата для щелочной фосфатазы используют глицерофосфат, от которого под действием фермента гидролитическим
путем отщепляется фосфор. По количеству неорганического фосфата, образованного в процессе гидролиза, судят об активности фермента. Фосфор
определяют колориметрическим методом по реакции с молибденовым реактивом в присутствии восстановителя - аскорбиновой кислоты. Продукт реакции - молибденовый синий дает синее окрашивание раствора, интенсивность
окраски которого прямо пропорциональна количеству фосфора в пробе.
Активность щелочной фосфатазы увеличивается при болезнях печени,
например при механической желтухе. Резко возрастает при рахите и аденоме.
ХОД РАБОТЫ.
В двух центрифужных пробирках приготовить смесь реактивов по последующей схеме:
№№
глицерофоссыворотка Инкубация
проби- фатный буфер, крови
1 час
рок
рН = 8,92
1
5.0 мл
0.5 мл
37оС
опыт
2 кон- 5.0 мл
0.5 мл
Комнатная
троль
tо
Первая пробирка служит для определения суммарного неорганического
фосфата, включающего фосфор, гидролизованный щелочной фосфатазой.
Вторая пробирка - для определения негидролизованного неорганического
фосфата, содержащегося в сыворотке.
91
После инкубации к обеим пробиркам прилить по 4,5мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Содержимое пробирок центрифугировать при
3000 об/мин в течение 10 минут.
В чистые пробирки отобрать по 3 мл безбелкового центрифугата и провести цветную реакцию на фосфор - добавить в каждую пробирку по 1 мл молибденового реактива и 1 мл 1% раствора аскорбиновой кислоты. Оставить
стоять 15 мин. при комнатной температуре для развития окраски.
Измерение оптической плотности обеих пробирок провести на ФЭКе при
красном светофильтре (670 нм) в кюветах толщиной 0,5 см против воды.
Используя разность экстинкций (Д1 - Д2), определить по калибровочному
графику количество фосфора (в мг), разложившегося под действием щелочной фосфатазы в единицах активности (единицы Боданского - ВЕ). Эту величину умножить на 200. За единицу активности щелочной фосфатазы у взрослых принимают прирост 1 мг фосфата на 1 мл сыворотки.
Нормальная активность щелочной фосфатазы у взрослых 2 -5 ВЕ,
у детей -5 - 15 ВЕ.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОДЫ: (сравнить полученные результаты с нормой)
Работа 2. Определение активности креатинкиназы в мышечной
ткани и в сыворотке крови.
ПРИНЦИП МЕТОДА
Метод основан на том, что в щелочной среде реакция
Креатин+АТФ4 - АДФ3 -+Креатинфосфат+Н+
сопровождается выделением ионов Н+. Регистрируя изменения рН в процессе
реакции ( до и после инкубанции), можно оценить активность фермента.
ХОД РАБОТЫ.
1. Приготовить смесь реактивов:
1,5 мл креатина, 1,0 мл АТФ,
1,0 мл трис- буфера (рН = 7,4),
0,5 мл гомогената мышечной ткани (или сыворотки крови).
2. Определить исходный уровень рНо инкубационной смеси на иономере.
3. Поместить пробирку с инкубационной смесью в термостат на 45 минут.
4. Через 45 минут после термостатирования определить рН1 инкубационной
среды.
5. Вычислить разницу показателей рНо - рН1= рН.
92
По величине полученной разницы найти активность креатинкиназы с помощью калибровочного графика. Активность фермента /КК/ выражена в
условных единицах. За условную единицу принимается количество фермента, высвобождающего 1мкг экв.Н+/за 45 минут, что сопряжено с высвобождением 1 мкМ АДФ.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОДЫ: (сравнить активность КК в крови и в мышечной ткани)
Работа 3. Определение общего азота в эмали и дентине зуба.
ОБОРУДОВАНИЕ: ФЭК.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Определение общего азота производится в минерализате эмали и дентина
зуба. При минерализации все азотсодержащие органические вещества переходят в форму сульфата аммония. Взаимодействие сульфата аммония с реактивом Несслера, в состав которого входят соли ртути, дает желто-оранжевое
окрашивание, интенсивность которого прямо пропорционально концентрации азота.
ХОД РАБОТЫ.
В мерную пробирку на 10 мл, содержащую минерализат эмали (дентина),
добавить дистиллированную воду немного более половины пробирки (6-7
мл). Перемешать !
В эту же пробирку добавить 0,4 мл заранее отмеренного в другой пробирке реактива Несслера, затем довести объем пробирки дистиллированной водой до уровня 10 мл. Снова тщательно перемешать (осадок недопустим!).
Приготовленная таким образом смесь остается на 10 минут для развития
окраски, после чего содержимое пробирки колориметрируется на ФЭКе с синим светофильтром (440 нм) против воды в кюветах на 10 мм.
Расчет количества общего азота производится по калибровочному графику, построенному по раствору сульфата аммония. Сравнить результаты определения концентрации общего азота в эмали и дентине.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОДЫ:
93
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:
1. Коллаген - специфический белок соединительной ткани. Особенности химического состава. Структурная организация. Участие витамина С в
созревании коллагена. Экскреция оксипролина - показатель скорости распада
коллагена.
2. Эластин, его свойства, химический состав и молекулярная структура.
3. Протеогликаны - основные белки межклеточного вещества соединительной ткани, значение, структурная организация. Гликозамингликаны,
структура и функция.
Для стоматологического факультета:
4. Химический состав минерализованных тканей. Апатиты. Особенности строения и свойств различных типов апатитов.
5. Особенности минерального состава зуба (эмали, дентина, цемента).
6. Белки кости и зуба. Коллаген. Строение коллагена. Процессинг коллагена. Особенности коллагена костной ткани.
7. Неколлагеновые белки кости: протеогликаны, гликопротеины,
остеонектин, остеокальцин и др. Ферменты кости.
8. Небелковые органические компоненты кости и зуба. Роль цитрата в
метаболизме костной ткани.
9. Пульпа зуба. Ее биохимическая характеристика.
10. Теория минерализации кости и зуба.
11. Белковые регуляторные факторы остеогенеза (митогены, морфогены, хемиатрактанты, антагонисты митогенов и морфогенов).
12. Гормоны - регуляторы остеогенеза. Паратгормон и кальцитонин, их
влияние на обмен кальция и фосфора.
13. Витамины группы Д. Провитамины. Роль витамина Д в поддержании гомеостаза кальция.
14. Влияние питания на состояние зубов. Роль пищевых белков, углеводов, микроэлементов и витаминов.
15. Микроэлементы: фтор, стронций, их значение для минерализации
кости и зуба. Патологические состояния, связанные с неоптимальным поступлением в организм.
Для лечебного, педиатрического, медико-профилактического и фармацевтического факультетов:
16. Миофибриллярные и саркоплазматические белки мышечной ткани
и их значение. Характеристика миозина, актина, тропонина, тропомиозина.
Особенности строения и молекулярной организации.
17. Биохимический механизм мышечного сокращения и расслабления.
Роль ионов кальция и АТФ в регуляции мышечного сокращения.
18. Источник ресинтеза АТФ в мышечной ткани. Роль креатинкиназного механизма в регенерации АТФ при мышечной работе.
19. Особенности химического состава и метаболизм сердечной мышцы.
94
ЗАНЯТИЕ 17.
БИОХИМИЯ СЛЮНЫ.
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ:
Слюна имеет рН, близкий к нейтральной (6,7-7,2). Сдвиг в кислую сторону
нарушает процесс минерализации и способствует развитию кариеса, сдвиг
рН в щелочную сторону способствует возникновению зубного камня. Так же
создаются условия для воздействия кислых протеиназ на ткани пародонта.
Диагностическое значение: в норме в слюне активность протеиназ в
пределах 1,5-10,0 мкМ/мин/л
При воспалительных процессах, большом количестве налета на зубах активность протеиназ повышается.
В слюне курильщиков велико содержание роданидов, что связано с поступлением в их организм синильной кислоты табачного дыма. Синильная
кислота под действием роданезы (тиосульфат-сульфит-трансферазы) превращается в тканях в роданиды и в их составе выводится из организма.
Работа 1. Определение рН слюны.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Индикатор в зависимости от активной реакции среды дает различную
окраску.
ХОД РАБОТЫ.
Каплю слюны нанести на универсальную индикаторную бумажку. Немедленно сравнить со стандартной шкалой.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОДЫ:
Работа 2. Определение активности пептидил-пептидгидролазы в
слюне.
ОБОРУДОВАНИЕ: термостат на 38оС, центрифуга, ФЭК.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Основан на определении количества тирозина и других циклических аминокислот, образовавшихся после гидролиза протеиназами слюны денатурированного гемоглобина. В щелочной среде образуются комплексные соединения аминокислот с реактивом Фолина и медью, дающие голубое окрашивание.
95
ХОД РАБОТЫ.
Опыт ставить в мерных центрифужных пробирках в соответствии с таблицей:
Реагенты
Опыт
Контроль
Стандарт
Гемоглобин дена- 0.5 мл
0.5 мл
турированный 2%
рН=7.5
Слюна
0.25 мл
И Н К У Б А Ц И Я
38оС 1 ЧАС
ТХУ 5%
1.25 мл
1.25 мл
Слюна
0.25 мл
Ц Е Н Т Р И Ф У Г И Р О В А Н И Е
3000 об/мин
20 мин
Центрифугат
(в 1 мл
1 мл
чистые,
сухие
пробирки)
Раствор тирозина 1 мл
NaOH 0.5 н
2 мл
2 мл
2 мл
Реактив Фолина
0.5 мл
0.5 мл
0.5 мл
Через 15 минут интенсивность окраски определить на ФЭКе при красном
светофильтре (длина волны 670 нм) против контроля в кюветах толщиной 5
мм. Расчет по формуле:
2  0,16  D оп  1000
X=
МкМ / мин  л
, где:
D ст  60  0,25
Х - активность пептидил-пептидгидролазы в мкМ/мин.л,
0.16 - кол-во микромолей тирозина в 1 мл,
0.25 - кол-во слюны в пробе,
2 - объем пробы,
Dоп и Dст - оптическая плотность "опытной" и "стандартной" пробирки соответственно,
1000 - пересчет на 1мл слюны,
60 - время инкубации в мин.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОДЫ:
96
Работа 3. Выделение муцина из слюны.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Метод основан на способности муцина давать осадок, нерастворимый в
избытке уксусной кислоты.
Углеводный компонент (глюкозу) в муцине выявляют действием концентрированной серной кислоты и альфа-нафтола, в результате которого получается окрашенный продукт.
ХОД РАБОТЫ.
В две пробирки собрать примерно по 2 мл слюны и по каплям (4-5 капель)
прибавить концентрированную уксусную кислоту. Выпадает осадок муцина.
Изучить состав муцина:
1. Обнаружение белка в осадке муцина.
Провести биуретовую реакцию на белок (см. занятие № 3 1-го семестра).
2. Обнаружение углеводного компонента в муцине.
К осадку муцина добавить 1-2 капли 1% спиртового раствора альфанафтола, перемешать и по стенке ОСТОРОЖНО! спустить 10-20 капель
концентрированной серной кислоты.
На границе двух слоев жидкости постепенно появляется фиолетовокрасное кольцо, хорошо заметное на белом фоне.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОДЫ (Охарактеризовать структуру муцина):
Работа 4. Обнаружение роданидов в слюне.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
При взаимодействии CNS- ионов с ионами железа образуется комплексное
соединение красного цвета.
ХОД РАБОТЫ.
К 5 каплям слюны добавить 2 капли 2 % раствора НСL и 2 капли 1%
раствора хлорного железа. Появляется красное окрашивание.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОДЫ:
97
Работа 5. Качественная реакция на амилазу слюны.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Метод основан на специфичности действия амилазы на полисахариды, содержащие 1,4 -альфа-гликозидную связь. Продукты гидролиза крахмала
(декстрины, мальтоза) дают иное окрашивание с йодом, чем исходный субстрат (крахмал).
ХОД РАБОТЫ.
На предметное стекло нанести каплю 0.5% раствора крахмала, смешать с
1 каплей слюны и оставить на 5 минут при комнатной температуре, после чего добавить каплю раствора Люголя.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОДЫ:
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:
1. Общая ротовая жидкость (смешанная слюна), слюна индивидуальных слюнных желез, особенности состава, свойства, зависимость от стимуляции слюноотделения. Физиологическая роль слюны.
2. Десневая (гингевальная жидкость). Особенности ее химического состава.
3. Белки слюны, общая характеристика. Муцин. Иммуноглобулины и
другие гликопротеины. Специфические белки слюны, их роль в функциях
слюны.
4. Ферменты слюны: амилаза, лизоцим, пероксидаза, фосфатаза, пептидилпептидгидролаза (каллекреин) и др. Их происхождение и значение.
5. Небелковые низкомолекулярные органические компоненты слюны:
глюкоза, карбоновые кислоты, липиды, витамины и др.
6. Неорганические компоненты слюны, их распределение в слюне,
стимулируемой и нестимулируемой. Активная реакция (рН) слюны. Буферы
слюны. Причины и значение ацидотического сдвига рН.
7. Неорганиеские компоненты слюны, катионный и анионный состав.
Кальций, фосфор, роданиды.
8. Слюнные факторы защиты зубов.
9. Патохимические аспекты патогенеза кариеса зуба.
10. Клинико - диагностическое и судебно - медицинское значение исследования состава слюны.
11. Роль изменений химического состава ротовой жидкости в развитии
заболеваний пародонта.
12. Мягкий зубной налет, зубной камень. Биохимическая характеристика.
98
ЗАНЯТИЕ 18.
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ.
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.
Биохимические исследования проводятся при разработке новых лекарственных форм, стандартизации, контроле качества, анализе и производстве лекарственных препаратов. Также необходима оценка эффективности
действия препарата и подбор индивидуальных доз для конкретного больного.
Ксенобиотики, в том числе и лекарственные препараты, подвергаются в печени реакциям конъюгации (соединение с молекулами глюкуроновой, серной,
уксусной кислот, глицина, глутатиона и др.). Сульфатной конъюгации подвергаются, как правило, циклические структуры, содержащие -ОН и-NН2
группы: индол, скатол, фенолы, стероиды, иодтиронины, токоферолы,
нафтохиноны и др.
Основной путь инактивации сульфаниламидных препаратов - ацетилирование и глюкуронирование, однако, активно идут и процессы сульфатирования.
Сульфаниламидные препараты после инактивации увеличивают количество
общей и связанной серной кислоты. Чем быстрее происходит связывание
сульфаниламида, тем меньше его бактериостатическая активность. Скорость конъюгации зависит от активности ферментативных систем печени. В результате конъюгации происходят большие изменения в свойствах
лекарства или другого ксенобиотика. Меняются их биохимическая активность и липидная растворимость и, соответственно, подвижность в тканях.
Работа 1. Определение сульфатов в моче.
ОБОРУДОВАНИЕ: бюретки для титрования.
Продукты обезвреживания ксенобиотиков выводятся с мочой. Рост связанной серной кислоты в моче отмечается вследствие усиления сульфатной
конъюгации в печени. В обычных условиях неорганические сульфаты составляют 85-95 % всего количества содержащейся в моче серы, и только
остальные 5-15% выделяются в связанном виде. При усилении процессов
конъюгации происходит увеличение содержания эфиросерных кислот в моче.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Сульфаты осаждаются раствором бензидина и количество серной кислоты
определяется титрованием едким натром. 1 мл 0,02 н раствора едкого натра
соответствует 0.98 мг серной кислоты.
Проводят определение свободной и общей серной кислоты в моче. По разнице между общей и свободной серной кислотой можно вычислить связанную серную кислоту.
Работы по определению содержания свободной и общей серной кислоты
проводятся студентами со 2 пункта описания методик, и заключаются в
титровании растворенного осадка едким натром.
99
Схема постановки эксперимента.
1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СВОБОДНОЙ СЕРНОЙ КИСЛОТЫ.
1). В центрифужную пробирку внести 2 мл мочи, прилить, помешивая, 10
мл бензидинового реактива, затем 02 мл 0,05% раствора динитрофенола и по
каплям разведенную соляную кислоту (1:4) до исчезновения желтого цвета,
после чего прибавить еще 0,5 мл НСl. Через 10 минут отцентрифугировать,
надосадочную жидкость слить. Осадок промыть 2 раза раствором сернокислого бензидина .
К осадку, соответствующему 2 мл мочи, добавить 5 мл дистиллированной
воды и нагреть на водяной бане до растворения осадка.
ХОД РАБОТЫ.
2). В колбочку отмерить 5 мл полученного растворенного осадка, прибавить 5 капель фенолфталеина и титровать 0,02 н раствором NaOH до появления слабо-розового окрашивания.
2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО КОЛИЧЕСТВА СЕРНОЙ КИСЛОТЫ.
1). В колбочку отмерить 25 мл мочи и 10 мл концентрированной HСl, кипятить 15 минут, добавить 1 г активированного угля и вновь осторожно кипятить 3 минуты,
довести водой до метки 25 мл и профильтровать.
К 2 мл фильтрата (соответствует 2 мл мочи) прилить 10 мл бензидинового
реактива далее работа проводится как при определении свободной серной
кислоты.
К осадку, соответствующему 2 мл мочи, прилить 5 мл дистиллированной
воды, нагреть на водяной бане до растворения осадка.
ХОД РАБОТЫ.
2). В колбочку отмерить 5 мл растворенного осадка, прибавить 5 капель
фенолфталеина и титровать 0,02 н раствором NaOH до появления слаборозового окрашивания.
РАСЧЕТ свободной серной кислоты и общего количества серной кислоты
проводится по формуле:
V х 0,98 х 100
Х= --------------------------2
Х - содержание сульфатов в мг на 100 мл мочи
V - количество мл 0,02 н раствора NaOH, пошедшего на титрование
0,98 мг - количество мг серной кислоты, титруемой 1 мл раствора
NaOH
2 мл - количество мл мочи, взятой для анализа.
В нормальных условиях с мочой выделяется 180-210 мг свободной серной кислоты и 220-240 мг общей серной кислоты (на 100 мл мочи).
100
ВЫВОДЫ (на основании полученных результатов):
1) установить наличие процесса инактивации сульфаниламидных препаратов
в печени.
2) оценить возможность усиления процесса конъюгации в печени в результате поступления в организм каких-либо иных ксенобиотиков.
Работа 2. Выявление ацетилирования гидразида изоникотиновой
кислоты (ГИНК) в организме.
ОБОРУДОВАНИЕ: ФЭК, водяная баня.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Метод основан на выявлении свободной формы ГИНК, которая с метаванадатом аммония в кислой среде дает комплексное соединение коричневокрасного цвета. Разница в окраске между пробами мочи до и после гидролиза
указывает на степень ацетилирования ГИНК в организме.
Реакция N-ацетилирования ГИНК осуществляется ацетилтрансферазой, содержащейся в различных тканях организма. Часть ГИНК не подвергается
превращениям и выделяется с мочой в свободном виде. По степени ацетилирования ГИНК устанавливается эффективная индивидуальная доза препарата
и осуществляется прогнозирование побочного действия препарата. У больных, которые являются слабыми инактиваторами, есть вероятность развития
побочных реакций.
По количеству связанного ГИНК больных делят на сильных, средних и слабых инактиваторов ( в зависимости от способности печени к обезвреживанию препарата).
-ацетилировано 100-90% ГИНК – сильный инактиватор.
-ацетилировано 89-85% ГИНК – средний инактиватор.
-ацетилировано менее 84% ГИНК – слабый инактиватор.
ХОД РАБОТЫ.
Собранную мочу развести в 20 раз дистиллированной водой. В две пробирки внести по 1 мл разведенной мочи. В первую пробирку добавить 1 мл
0,5 М раствора соляной кислоты (определение общего ГИНК), во вторую
пробирку добавить 1 мл дистиллированной воды (определение свободного
ГИНК).
Первую пробирку закрыть пробкой и поставить на 20 минут в кипящую водяную баню, после чего охладить под струей воды. В обе пробирки налить по
101
2 мл 0,1% раствора метаванадата аммония и колориметрировать на ФЭКе с
зеленым светофильтром против воды.
Расчет провести по формуле:
( Е 1 - Е2 ) х 100%
Х= -------------------------Е1
Х - ацетилирующая способность организма, % ацетилированного ГИНК
Е1 -экстинкция общего ГИНК
Е2 - экстинкция свободного ГИНК
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОДЫ:
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:
1. Основные закономерности метаболизма лекарственных средств. Локализация метаболических превращений лекарств в организме.
2. Значение эндоплазматического ретикулума печени в биотрансформации лекарств. Основные типы реакций метаболизма ксенобиотиков и
лекарственных веществ.
3. Синтетичесие пути трансформации лекарственных препаратов.
4. Значение микросомального и немикросомального окисления в метаболизме лекарственных веществ.
102
СПИСОК ОСНОВНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1.
Биохимия: Учебник / Под ред. Е.С.Северина. – 3-е изд., испр. – М.:
Гэотар-Медиа, 2005. – 784 с.: ил.
2.
Николаев А.Я. Биологическая химия. - 3-е изд., перераб. и доп. – М.:
Медицинское информационное агентство. – 2004. – 556 с.: ил.
3.
Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химии: Учебник. -3-е
изд. переработ. и доп.- М.: Медицина, 1998. -704 с.: ил.
СПИСОК ДОПОЛНИТЕЛЬНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1.
Щербак И.Г. Биологическая химия: Учебник. - СПб.: Издательство
СПбГМУ, 2005. – 480 с. - для стоматологического факультета
2.
Комов В.П. Биохимия: Учебник для вузов / В.П.Комов,
В.Н.Шведова. – М.: Дрофа, 2004. – 640 с.: ил. - для фармацевтического фак-та
3.
Равич – Щербо М.И., Новиков В.В. Физическая и коллоидная
химия: Учебник.- М.: Высшая школа, 1975. - 255 с.: ил.
4.
Строев Е.А. Биологическая химия: Учебник для фармац. ин-тов и
фармац. фак. мед. ин-тов. – М.: Высшая школа, 1986. – 479 с.: ил.
5.
А. Уайт и др. Основы биохимии: в 3-х томах. - Пер. с англ. - М.:
Мир, 1981.
6.
Л. Страйер Биохимия: в 3-х томах. - Пер. с англ. - М.: Мир, 1984.
7.
А. Ленинджер Основы биохимии : в 3-х томах. - Пер. с англ. - М.:
Мир, 1985.
8.
Р. Марри и др. Биохимия человека: в 2-х томах. - Пер. с англ. - М.:
Мир, 1993.
9.
В.Эллиот, Д.Эллиот. Биохимия и молекулярная биология.- Пер.на
русский язык .- НИИ биомед. химии РАМН, 1999.- 372 с.: ил.
10. Биохимия. Краткий курс с упражнениями и задачами./ Под ред.
Е.С.Северина и А.Я.Николаева. - 2-е изд., испр. и доп. – М.: Гоэтар Мед,
2002.- 448 с.
11. Забросаева Л.И., Козлов Н.Б. Биохимия слюны: учебнометодическое пособие. - Смоленск: СГМИ, - 1992. - для стоматологического факультета.
103
СОДЕРЖАНИЕ
ИНСТРУКЦИЯ ПО ТЕХНИКЕ БЕЗОПАСНОСТИ…………………………………………...4
СЕМЕСТР 1.
ЗАНЯТИЕ 1. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В БИОХИМИИ
Работа 1. Определение pH биологических жидкостей с помощью рН-метра
(иономера)..………………………………………………………………………………………6
Работа 2. Определение рН биологических жидкостей с помощью универсальной индикаторной бумаги………………………………………………………..………………………….7
ЗАНЯТИЕ 2. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В БИОХИМИИ. ФОТОМЕТРИЯ
Работа 1. Количественное определение ионов железа в растворе
фотоэлектроколориметрическим методом……………………………………………………..7
ЗАНЯТИЕ 3. СТРУКТУРА И СВОЙСТВА БЕЛКОВ. ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА
БЕЛКОВ.
Работа 1. Анализ хроматограмм гидролизатов различных белков………………………….10
Работа 2. Определение концентрации белка в сыворотке крови рефрактометрическим
методом………………………………………………………………………………………….12
Работа 3. Биуретовая реакция на пептидную связь (реакция Пиотровского)…….………..15
ЗАНЯТИЕ 4. ПРОСТРАНСТВЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БЕЛКОВОЙ МОЛЕКУЛЫ.
Работа 1.Высаливание ……………………………………………………………..…………16
Работа 2. Определение изоэлектрической точки казеина……………………………………17
Работа 3. Необратимые способы осаждения белка из раствора……………………………..18
ЗАНЯТИЕ 5. ФЕРМЕНТЫ. СПЕЦИФИЧНОСТЬ ДЕЙСТВИЯ.
Работа 1. Специфичность действия амилазы и сахаразы……………………………............19
Работа 2. Количественное определение глюкозы в крови глюкозооксидазным методом……………………………………………………………………………………………….20
ЗАНЯТИЕ 6. СТРОЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ. ВИТАМИНЫ КАК УЧАСТНИКИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ.
Работа 1. Открытие апофермента и кофермента в аспартатаминотрансферазе………...….22
Работа 2. Количественное определение аскорбиновой кислоты в
различных пищевых продуктах………………………………………………………..………23
Работа 3 Количественное определение витамина Р в разных сортах чая………….……….25
ЗАНЯТИЕ 7. НЕСПЕЦИФИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ
Работа 1. Влияние реакции среды на активность ферментов (определение оптимума
рН амилазы слюны)……………………………………………………………………………27
Работа 2. Термолабильность ферментов……………………………………………………..28
104
ЗАНЯТИЕ 8. СПЕЦИФИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ.
РАБОТА 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АЦЕТИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ КРОВИ. СУБСТРАТНОЕ И КОНКУРЕНТНОЕ ТОРМОЖЕНИЕ……………………………………………………………………….30
ЗАНЯТИЕ 9. КОЛЛОКВИУМ ПО ТЕМЕ: СТРУКТУРА, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ БЕЛКОВ И ФЕРМЕНТОВ…………………………………………………………………………..32
ЗАНЯТИЕ 10. ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ ОБМЕН. ЦИКЛ ТРИКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ.
Работа 1. Определение активности дегидрогеназ цикла Кребса в печени………………….33
Работа 2. Определение активности сукцинатдегидрогеназы в разных тканях.
Ингибирование сукцинатдегидрогеназы избытком оксалоацетата………………………...34
ЗАНЯТИЕ 11. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ.
Работа 1. Открытие НАДН-дегидрогеназной активности в тканях………………………....36
Работа 2. Определение редокс-потенциалов компонентов дыхательной цепи…………….36
ЗАНЯТИЕ 12. ОКИСЛИТЕЛЬНОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ.
Работа 1. Обнаружение АТФ в различных тканях………………………………………...…38
ЗАНЯТИЕ 13. КОЛЛОКВИУМ ПО ТЕМЕ: ЦИКЛ КРЕБСА. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ. ОКИСЛИТЕЛЬНОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ……………………………………39
ЗАНЯТИЕ 14. БИОХИМИЯ ГОРМОНОВ.
Работа 1. Качественные реакции на гормоны………………………...………………………40
Работа 2. Изучение влияния инсулина, адреналина и кортизола на содержание
глюкозы в крови……………………………………...…………………………………………42
ЗАНЯТИЕ 15. ОСНОВНЫЕ УГЛЕВОДЫ ОРГАНИЗМА. ГЛИКОГЕН: СТРУКТУРНАЯ
ОРГАНИЗАЦИЯ, СИНТЕЗ И РАСПАД.
Работа 1. Влияние слюны, желудочного сока и панкреатина на крахмал………….…..…..44
Работа 2.Адсорбция глюкозы на волокнах целлюлозы ……………………………………..45
Работа 3. Выделение гликогена из печени сытого и голодного животного……….…….…46
Работа 4. Фосфоролиз гликогена в мышечной ткани………………………….……………..47
ЗАНЯТИЕ 16. ГЛИКОЛИЗ.
Работа 1. Определение активности лактатдегидрогеназы в разных тканях……..…………49
Работа 2. Обнаружение молочной кислоты в мышечной ткани………….…..……………..50
ЗАНЯТИЕ 17. ГЛЮКОНЕОГЕНЕЗ И ПЕНТОЗНЫЙ ПУТЬ ПРЕОБРАЗОВАНИЯ ГЛЮКОЗЫ.
Работа 1. Количественное определение фосфоенолпирувата в печени и мышцах...............51
Работа 2.Определение активности глюкозо-6-фосфатазы……….…….…………….………52
ЗАНЯТИЕ 18. РЕГУЛЯЦИЯ УГЛЕВОДНОГО ОБМЕНА.
Работа1. Влияние сахарной нагрузки на содержание глюкозы в крови……………....…….54
Работа 2. Качественное определение глюкозы в моче /проба Троммера/…………………..56
Работа 3. Количественное определение сахара в моче (по методу Альтгаузена)……..…...56
ЗАНЯТИЕ 19. КОЛЛОКВИУМ ПО ТЕМЕ: ГОРМОНЫ. ОБМЕН УГЛЕВОДОВ…….......57
105
СЕМЕСТР 2.
ЗАНЯТИЕ 1. ВАЖНЕЙШИЕ ЛИПИДЫ ОРГАНИЗМА. ПЕРЕВАРИВАНИЕ ЛИПИДОВ.
Работа 1 Определение активности липазы в дуоденальном содержимом………………….58
ЗАНЯТИЕ 2. ВНУТРИТКАНЕВЫЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ ЛИПИДОВ. КЕТОНОВЫЕ ТЕЛА.
Работа 1. Образование и окисление кетоновых тел в тканях организма……….…………..60
Работа 2. Определение кетоновых тел в моче………………………………………………..61
ЗАНЯТИЕ 3. АНАБОЛИЗМ ЛИПИДОВ.
Работа 1. Количественное определение общих фосфолипидов в сыворотке крови по фосфору……………………………………………………………………………………………...63
ЗАНЯТИЕ 4. ЛИПОПРОТЕИНЫ СЫВОРОТКИ КРОВИ. ТРАНСПОРТ ХОЛЕСТЕРИНА.
Работа 1. Определение - и пре--липопротеинов в сыворотке крови…………………….65
Работа 2. Количественное определение холестерина в сыворотке крови………………….66
ЗАНЯТИЕ 5. МЕТАБОЛИЗМ МЕМБРАН. ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ.
Работа 1. Количественное определение малонового диальдегида в ткании печени………68
Работа 2. Количественное определение каталазы в крови…………………………………..69
ЗАНЯТИЕ 6. КОЛЛОКВИУМ ПО ТЕМЕ: ОБМЕН ЛИПИДОВ……………………………70
ЗАНЯТИЕ 7. ПЕРЕВАРИВАНИЕ БЕЛКОВ.
Работа 1. Определение свободной, связанной, общей соляной кислоты и общей кислотности желудочного сока раздельно и в общей пробе…………………………………………...71
ЗАНЯТИЕ 8. ВНУТРИТКАНЕВЫЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ.
Работа 1. Определение активности аланинаминотрансферазы в крови и гомогенатах тканей……………………………………………………………………………….………………74
Работа 2. Обнаружение фенилпирувата в моче (проба Фелинга)…………………………...76
ЗАНЯТИЕ 9. КОНЕЧНЫЕ ПРОДУКТЫ БЕЛКОВОГО ОБМЕНА.
Работа 1. Диализ белка…………………………………………………………………………77
Работа 2. Влияние гемодиализа на содержание остаточного азота крови………………….78
Работа 3. Количественное определение креатинина в моче…………………………….…..80
ЗАНЯТИЕ 10. КОЛЛОКВИУМ ПО ТЕМЕ: ОБМЕН БЕЛКОВ…………………..………….81
ЗАНЯТИЕ 11. ОБМЕН НУКЛЕОТИДОВ.
Работа 1. Количественное определение мочевой кислоты в моче…………………………..82
ЗАНЯТИЕ 12. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ. СИНТЕЗ БЕЛКА.
106
Работа 1. Количественное определение ДНК в различных тканях………….………….…...83
ЗАНЯТИЕ 11. КОЛЛОКВИУМ ПО ТЕМЕ: НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ. ОБМЕН
НУКЛЕОТИДОВ. СИНТЕЗ БЕЛКА………………………………………………………….85
ЗАНЯТИЕ 14. БИОХИМИЯ КРОВИ.
Работа 1. Определение общего белка плазмы крови биуретовым методом………………..85
Работа 2. Разделение белков плазмы крови методом электрофореза на бумаге…………...86
Работа 3. Бензидиновая проба на гемовую группировку гемоглобина……………………..87
Работа 4. Биохимический анализ крови……………………………...……………………….87
ЗАНЯТИЕ 15. БИОХИМИЯ ПЕЧЕНИ.
Работа 1. Количественное определение общего, прямого и непрямого билирубина в сыворотке крови по методу Иендрашика………………………………….……………………….88
Работа 2. Определение индикана в моче……………………………………………………...89
ЗАНЯТИЕ 16. БИОХИМИЯ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ И МИНЕРАЛИЗОВАННЫХ
ТКАНЕЙ.
Работа 1. Определение активности щелочной фосфатазы в крови………………………….91
Работа 2. Определение активности креатинкиназы в мышечной ткани и
сыворотке крови………………………………………………………………………………...92
Работа 3. Определение общего азота в эмали и дентине зуба……………………………….93
ЗАНЯТИЕ 17. БИОХИМИЯ СЛЮНЫ.
Работа 1. Определение рН слюны……………………………………………………………..95
Работа 2. Определение активности пептидил-пептидгидролазы в слюне……………...…..95
Работа 3. Выделение муцина из слюны……………………………………………..………..97
Работа 4. Обнаружение роданидов в слюне…………………………………………..……....97
Работа 5. Качественная реакция на амилазу слюны…………………………………...……..98
ЗАНЯТИЕ 18. ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ.
Работа1.Определение сульфатов в моче…………………………………...…………….........99
Работа2. Выявление ацетилирования гидразида изоникотиновой кислоты (ГИНК)
в организме…………………………………………………………………………………...101
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………….………………………………………....103
107
108