Рост и развитие Задача 1. Биотест для определения биологической активности веществ ауксиновой природы. 1 Биотест (биопроба) – это метод обнаружения и определения активности гормонов и фенольных ингибиторов по реакции целых растений, их органов, тканей и клеток, обладающих повышенной специфической чувствительностью к этим соединениям. Биотесты используют для 1) качественного обнаружения фитогормона в смесях неизвестных веществ; 2) оценки количества гормона или фенольного ингибитора в исследуемой смеси; 3) обнаружения (или изучения) физиологических процессов, в которых участвуют физиологически активные вещества; 4) анализа свойств новых синтетических регуляторов роста. Объекты, используемые для биотеста должны удовлетворять следующим требованиям: 1) стандартность исходного материала и его ответных реакций; 2) легкая воспроизводимость результатов; 3) высокая чувствительность к данному веществу. Тест-объект должен реагировать на маленькие концентрации исследуемого вещества, а это возможно при низкой исходной концентрации вещества в клетках; 4) специфичность (ответные реакции только на определенную группу физиологически активных веществ). По характеру физиологических реакций, вызываемых гормонами, биотесты делят на группы: ростовые, пигментные и ферментные. Ростовые: изгибание и удлинение отрезков стеблей или колеоптилей у злаков, рост каллуса, прорастание семян. Пигментные: синтез хлорофилла (зеленение листьев), накопление каротиноидов. Ферментные: гормоны могут стимулировать синтез ферментов, например α-амилазы. [1] Ауксины - гормоны, вырабатываемые в апикальных меристемах побегов. Наиболее чувствительны к ауксинам корни, затем почки и, наконец, стебли растений. Установлено, что низкие концентрации ускоряют, а высокие тормозят рост этих частей растений. Ауксины влияют на рост в фазе растяжения, тропизмы, дифференцировку ксилемы и закладку корней, апикальное доминирование, опадание листьев, цветение, рост пыльцевых трубок, завязывание и рост плодов, образование клубней и луковиц, прорастание семян. [2] Кроме природных ауксинов химикам удалось синтезировать вещества, вызывающие такой же физиологический эффект. Поскольку они не встречаются в растениях, их называют синтетическими аналогами ауксинов. Среди них упомянем лишь 2,4-Дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д) и -нафтилуксусную кислоту (НУК). Синтетические аналоги эффективно связываются с рецепторами ауксина, однако слабо взаимодействуют с системой транспорта или окислительной деградации естественных ауксинов. Цель задачи: изучить влияние ауксинов на прорастание семян капусты. Объект исследования: Реактивы и оборудование. Стерильные колбы с агаризованной средой Мурасиге и Скуга (МS) 300 мл, 70%-ый раствор этилового спирта; диметилсульфоксид (DMSO), раствор β-индолилуксусной кислоты (ИУК) (4мг в 1000мкл DMSO), 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-D) (5мг в 1500мкл DMSO) либо α-нафтилуксусной кислоты (НУК) (3мг в 1500мкл DMSO); стерильный раствор 5% Н2О2 на 960 этиловом спирте; автоматические пипетки (5-40мкл и 40-200 мкл) и стерильные наконечники, стерильные пробирки Эппендорф (объемом 1,5 мл), стерильные стаканчики на 50 мл, стерильные чашки Петри (5 шт. диаметром 9 см и 1шт. диаметром 6см), стерильные фильтры, ножницы, пинцеты, парафилм или пленка. Рост и развитие 2 Ход работы: 1. Плавят на водяной бане агаризованную среду. 2. Подготавливают ламинар-бокс к работе: включают продувку воздуха ламинар-бокса на 5 мин, протирают всю внутреннюю поверхность ламинар-бокса 70% спиртом. После этого приступают к работе. Продувка ламинара продолжается в течение всей работы. 3. Рассчитывают величину вносимого в среду объема гормона для каждого варианта концентрации (на 50мл среды). ИУК / 2.4D / НУК Концентрация гормона [мг/л] вносимый V исходного р-ра [мкл] контроль 0 0,002 0,02 0,2 2 вносимый V разведенного р-ра [мкл] DMSO V [мкл] Перед работой моют руки и протирают их спиртом. Все последующие процедуры проводят в стерильных условиях в ламинаре. (Закрывание/открывание эппендорфов, открывание стаканчиков с помощью предварительно обожженного над горелкой пинцета и т.д.). 6. (Если необходимо, готовят исходный раствор фитогормона нужной концентрации.) 7. Отливают 50 мл среды в стаканчик. Пробку с колбы снимают в стерильных условиях. Перед тем как отлить питательную среду, горло колбы обжигают над горелкой. 8. Добавляют концентрированный раствор гормонов в необходимом объеме (для получения следующих концентраций фитогормона в среде: 0,002 мг/л, 0,02 мг/л, 0,2 мг/л или 2 мг/л) в стаканчик со средой, контроль не содержит гормона. 9. Добавляют необходимый объем растворителя (DMSO). Перемешивают среду. 10. Переливают среду в чашку Петри в стерильных условиях (перед тем как перелить питательную среду, горло стакана обжигают над горелкой), накрывают крышкой. 11. Оставляют среду застывать при комнатной температуре. 12. Повторяют все для каждой концентрации гормона (с 5 по 8 пункты). 13. Стерилизуют растительный материал по схеме: Заранее готовят стерильный раствор 5% Н2О2 на 960 этиловом спирте и хранят в темноте. Семена раскладывают в один слой в 6см чашку Петри на стерильный бумажный фильтр и с помощью пипетки наносят раствор по капле на 3 минуты (пока не испарится спирт). 14. Семена сажают в 9см чашку Петри пинцетом, по 25-30 семян (семена можно не промывать после стерилизации). 15. Герметизируют чашки Петри парафилмом или пленкой. Дальнейшую работу можно проводить в нестерильных условиях. 16. Надписывают чашки Петри (указывают группу, число посадки, название и концентрацию гормона). 17. Чашки помещают на 16-ти часовой световой день и t=+200С. 18. Через две недели визуально оценивают различия проростков в чашках с различной концентрацией гормона, если есть фиксируют нарушения геотропизма, проводят измерения гипокотиля и корня каждого выросшего растения, отмечают, если произошло заражение. Полученные результаты заносят в таблицу, проводят статистический анализ (подсчет средних значений и стандартных отклонений для оценки достоверности полученных результатов), строят графики зависимости длины гипокотиля/корня от концентрации в среде ИУК/2,4D/НУК. Объясняют результаты. 4. 5. ЛИТЕРАТУРА к зачету: Полевой В.В. «Физиология растений»: Учеб. для вузов. М.: "Высш. шк.", 1989. Бутенко Р.Г Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М., ФБК-ПРЕСС, 1999. Медведев «Физиология растений» Бутенко Р.Г. Экспериментальный морфогенез и дифференциация в культуре клеток растений // 35—е Тимирязевское чтение. М., 1985. Гудвин Т., Месер С. Введение в биохимию растений. Т 1,2. М., Мир, 1986. Гэлстон К., Девис П., Сэттер Р. Жизнь зеленого растения. М., 1983. Дерфлинг К. Гормоны растений. М., 1985 Кулаева О.Н. Гормональная регуляция физиологических процессов у растений на уровне синтеза РНК и белка// 41-е Тимирязевское чтение. М., 1982. Полевой В.В. Фитогормоны. Л., 1982. Полевой В.В. Роль ауксина в системах регуляции растений // 44-е Тимирязевское чтение. Л., 1986 Уоринг Ф., Филлипс И. Рост растений и дифференцировка. М., 1984.