Хворилова Н.А. Доклад на тему планируемой диссертации

реклама
МОДИФИКАЦИЯ МОНОЦИТОВ
ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ АДЕНОЗИНОМ
С ЦЕЛЬЮ ПОВЫШЕНИЯ ИХ
РЕГЕНЕРАТИВНОГО ПОТЕНЦИАЛА ПРИ
АУТОЛОГИЧЕСКОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ
м.н.с. ЦНИЛ Хворилова Ксения
Актуальность
Нейродегенеративные
болезни
Аутоиммунная патология
Клеточная терапия
Онкологическая
патология
Наследственные
болезни
Сердечно-сосудистая
патология
Ожоги
Актуальность
- Клеточная терапия стволовыми клетками способствует восстановлению
структуры ткани [Andrade C. et al., 2006; Baraniak P., McDevitt T., 2010].
- Паракринные факторы, обеспечивающие эффект терапии, не являются
уникальными для стволовых клеток и вырабатываются, хотя и в меньшей
степени, также клетками периферической крови, которые при этом не
обладают онкогенной активностью.
- Широким спектром секретируемых цитокинов обладают моноциты. Их
легко выделить из крови человека в количестве, достаточном для культивации
и последующей аутологической трансплантации.
- Аденозин (эндогенный нуклеозид), образующийся в повышенных
количествах при повреждении ткани, в условиях воспаления и гипоксии,
влияет на выработку паракринных факторов различными клетками, в том
числе моноцитами.
Цель:
исследовать механизмы модификации моноцитов периферической крови
аденозином и разработать подходы для усиления продукции моноцитами
необходимых для регенерации тканей и органов паракринных факторов.
Задачи:
1. Определить уровень экспрессии мРНК 4 типов аденозиновых рецепторов в
культурах стимулированных и нестимулированных аденозином моноцитов
периферической крови для оценки характера ответа клеток на аденозиновую
стимуляцию.
2.
Определить уровень экспрессии мРНК про- и противовоспалительных
паракринных факторов в культурах стимулированных и нестимулированных
аденозином моноцитов периферической крови.
3. Определить секрецию про- и противовоспалительных паракринных факторов
культурами стимулированных и нестимулированных аденозином моноцитов
периферической крови.
4.
Осуществить экспериментальную оценку регенеративного
модифицированных аденозином клеток в модели in vivo.
потенциала
Дизайн исследования in vitro
Определение титра IgE
ИФА
Забор крови у 40
здоровых доноров
Выделение
моноцитарной фракции
Стимуляция и
культивирование
24 часа
NECA
30 мкМ
DMSO
NECA
100 мкМ
Анализ полученных клеток
Проточная
цитофлюориметрия
ИФА
Real-time PCR
72 часа
DMSO
Результаты
Иммунофенотип клеток
* *
* *
*
* - статистически значимые различия по
сравнению с показателями клеток ,
культивируемых с DMSO (p<0.05)
Результаты
Экспресиия мРНК аденозиновых рецепторов
*
*
*
*
* - статистически значимые различия по
сравнению с показателями клеток ,
культивируемых с DMSO (p<0.05)
Результаты
Экспрессия паракринных факторов
24 часа культивирования
*
*
*
* - статистически значимые различия по
сравнению с показателями клеток ,
культивируемых с DMSO (p<0.05)
Результаты
Экспрессия паракринных факторов
72 часа культивирования
*
*
*
*
* - статистически значимые различия по
сравнению с показателями клеток ,
культивируемых с DMSO (p<0.05)
Результаты
Секреция паракринных факторов
24 часа культивирования
72 часа культивирования
*
*
* - статистически значимые различия по
сравнению с показателями клеток ,
культивируемых с DMSO (p<0.05)
Дизайн исследования in vivo
36 мышей линии C57Bl/6JY
30 мышей
Моделирование термического ожога
Введение
физиологического
раствора
6 мышей
Получение суспензии клеток
костного мозга
+ NECA
Введение
модифицированных
клеток
Введение
немодифицированных
клеток
Гистологическая оценка образцов (5, 7, 14 сутки)
+ DMSO
Результаты
Гистологическая картина препаратов кожи
на 5 сутки
Физиологический
раствор
Немодифицированные
клетки
Модифицированные
клетки
Результаты
Гистологическая картина препаратов кожи
на 7 сутки
Физиологический
раствор
Немодифицированные
клетки
Модифицированные
клетки
Результаты
Гистологическая картина препаратов кожи
на 14 сутки
Физиологический
раствор
Немодифицированные
клетки
Модифицированные
клетки
Выводы

Были обнаружены изменения в профиле аденозиновых рецепторов моноцитов
периферической крови при стимуляции аналогом аденозина NECA: значительное
повышение уровня экспрессии мРНК А2А и А3 аденозиновых рецепторов.

Модификация моноцитов периферической крови аденозином привела к
статистически достоверному подъему уровней экспрессии генов IL-8, IL-10, IL-1b,
bFGF, IP-10 и VEGF.

В ответ на стимуляцию аденозином наблюдалось увеличение уровня секреции
моноцитами сосудисто-эндотелиального фактора роста.

При анализе функциональных особенностей модифицированных моноцитов было
установлено, что наиболее эффективным для модификации моноцитов является
режим, характеризующийся добавлением 100 мкм NECA и последующим
культивированием в течение 72 часов (по сравнению со стимуляцией 30 мкм NECA
с последующим инкубированием в течение 24 часов).

В
экспериментах
in
vivo
(моделирование
ожогового
повреждения)
модифицированные аденозином клетки костного мозга показали положительный
пролиферативный эффект на ангиогенез, фиброгенез и эпителизацию раневой
поверхности.
Благодарю за внимание!
Дизайн исследования in vivo
45 лабораторных животных
Контрольная группа
Забор крови
Опытная группа 1
Забор крови
Культивирование клеток
+ DMSO
Введение физ. раствора
в область ожога
Введение клеток
в область ожога
Опытная группа 2
Забор крови
Культивирование клеток
+ NECA
Введение клеток
в область ожога
Вывод животных из эксперимента с последующей гистологической
оценкой образцов (7, 14, 21 сутки)
Скачать