На правах рукописи ЧМЫХОВА Анастасия Николаевна СИСТЕМА АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ И ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СТАТУС У ЖИВОТНЫХ ПРИ РАСПРОСТРАНЕННОМ ПЕРИТОНИТЕ 03.01.04 – биохимия 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизотология, микология с микотоксикологией и иммунология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Курск – 2014 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова» Научные руководители: Доктор биологических наук Артюшкова Елена Борисовна Заслуженный ветеринарный врач РФ, доктор биологических наук, профессор Сеин Олег Борисович Официальные оппоненты: Фурман Юрий Васильевич, доктор биологических наук, профессор ФГБОУ ВПО КИСО (филиал) РГСУ, заведующий кафедрой истории, теории и технологии социальной работы Лебедева Марина Георгиевна, кандидат ветеринарных наук, ОБУ «Станция по борьбе с болезнями животных (СББЖ) Курского района», руководитель Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии» РАСХН Защита диссертации состоится «27» июня 2014 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 220.040.03 при ФГБОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова» (305021, г. Курск, ул. К. Маркса, 70. Тел. (4712) 53-13-30, факс (4712) 58-50-49. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова» и на сайте www.kgsha.ru. Автореферат разослан «___» __________ 2014 г. Ученый секретарь диссертационного совета 2 Рыжкова Галина Федоровна ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Согласно современным исследованиям тяжелый распространенный перитонит сопровождается развитием системной воспалительной реакции, а также активацией целого ряда факторов, влияющих на характер течения и исход заболевания, важное значение среди которых имеют активация процессов свободнорадикального окисления, нарушение синтеза оксида азота, выброс значительного количества медиаторов воспаления, повреждение сосудистого эндотелия, нарушения микроциркуляции (Савельев В.С., Петухов В.А., 2012; Ермола Ю.А., Кубышкин А.В., 2012; Ашрафов Р.А., Лычкова А.Э., 2012; Блинков Ю.Ю., 2012; Суковатых Б.С. и др., 2011; Фролова О.Г, 2011). Возникающий дисбаланс усиливает деструктивные процессы в паренхиматозных органах и, как следствие, приводит к прогрессированию полиорганной недостаточности. Выполненные на сегодняшний день клинические исследования не позволяют сделать однозначные выводы о целесообразности применения в комплексной терапии распространенного перитонита только лекарственных средств с антиоксидантным действием. Последние десятилетия ведутся поиски природных веществ, связывающих активные формы кислорода. Перспективным представителем данного направления является дигидрокверцетин (3,5,7,3',4'-пента-гидроксифлаванон), антиоксидант из лиственницы, антиоксидантная активность которого превосходит антиоксидантный эффект кверцетина, рутина и бета-каротина (Потапович А.И., Костюк В.А., 2003; Кравченко Л.В. и др., 2005; Бабкин В.Н., 2011). Прямая антирадикальная активность ДГК осуществляется преимущественно за счет взаимодействия с липидными радикалами или супероксидными анионами. В результате многоплановых исследований с использованием различных модельных систем установлено, что ДГК ингибирует свободнорадикальное окисление как водорастворимых (люминол), так и жирорастворимых субстратов (липиды липосомальных и микросомальных мембран). При этом, ДГК может действовать как ловушка активных форм кислорода, хелатор металлов с переменной валентностью или обрывающий цепь агент (Щукина О.Г. и др., 2008; Бабкин В.А., 2011; Deng W., Fang X., Wu J., 1997). В настоящее время опубликованы работы, свидетельствующие о том, что на всех стадиях перитонит протекает на фоне иммунодефицита, а в терминальной стадии (полиорганной недостаточности) этот дефицит наиболее выражен, возможность выведения из которого в значительной степени определяет успех их лечения (Станулис А. И., Гришина Т.И. и др. 2002; Сухоруков А.Л., 2005; Алешин Д.А., 2009). Учитывая это, одной из важных задач экспериментальных исследований является изучение комбинированного применения дигидрокверцетина и отечественного синтетического ® ® иммуномодулятора Галавита . Галавит является 5-амино-1,2,3,4тетрагидрофталазин-1,4-диона натриевой солью, которая известна в качестве противовоспалительного и иммуномодулирующего препарата (Добрица В.П., Ботерашвили Н.М. и др., 2001; Донцов В.И., Подколзин А.А., 2001; Коробкова Л.И., Вельшер Л.З. и др., 2004). 3 Таким образом, наиболее актуальным в настоящее время является внедрение эффективных и патогенетически обоснованных методов антиоксидантной терапии и иммунокоррекции при распространенном перитоните. В этой связи определенный интерес может представлять изучение возможности коррекции системной воспалительной реакции при перитоните путем применения антиоксиданта из лиственницы – дигидрокверцетина и иммуномодулятора Галавита® в качестве дополнения к стандартной терапии при распространенном перитоните. Цель исследования. Изучение антиоксидантного и иммунобиологического статуса у животных при распространенном перитоните на фоне применения природного антиоксиданта дигидрокверцетина. Задачи исследования. 1. Оценить изменение параметров оксидантно-антиоксидантного статуса, уровня провоспалительных цитокинов и конечных стабильных метаболитов оксида азота на фоне введения природного антиоксиданта дигидрокверцетина, антиоксидантного препарата Мексикор®, иммуномодулятора Галавит® и комбинаций дигидрокверцетина с Галавитом®, Мексикора® с Галавитом® при моделировании распространенного перитонита. 2. Дать оценку иммунобиологического статуса при моделировании распространенного перитонита у крыс на фоне применения природного антиоксиданта дигидрокверцетина, антиоксидантного препарата Мексикор®, иммуномодулятора Галавит® и комбинаций дигидрокверцетина с Галавитом®, Мексикора® с Галавитом®. 3. Изучить эффективность применения природного антиоксиданта дигидрокверцетина, антиоксидантного препарата Мексикор®, иммуномодулятора Галавит® и комбинаций дигидрокверцетина с Галавитом®, Мексикора® с Галавитом® при микроциркуляторных нарушениях в стенке тонкой кишки крыс, вызванных моделированием распространенного перитонита. 4. Изучить органопротективную активность природного антиоксиданта дигидрокверцетина, антиоксидантного препарата Мексикор®, иммуномодулятора Галавит® и комбинаций дигидрокверцетина с Галавитом®, Мексикора® с Галавитом® по результатам морфологических исследований при моделировании распространенного перитонита. 5. Оценить влияние природного антиоксиданта дигидрокверцетина, антиоксидантного препарата Мексикор®, иммуномодулятора Галавит® и комбинаций дигидрокверцетина с Галавитом®, Мексикора® с Галавитом® на показатель общей летальности крыс при моделировании распространенного перитонита. Научная новизна. На основании комплексных исследований впервые изучен антиоксидантный и иммунобиологический статус при моделировании распространенного перитонита у крыс на фоне применения природного антиоксиданта дигидрокверцетина, антиоксидантного препарата Мексикор®, иммуномодулятора Галавит® и комбинаций дигидрокверцетина с Галавитом®, Мексикора® с Галавитом®. 4 Впервые экспериментально обосновано применение природного антиоксиданта дигидрокверцетина 7,7 мг/кг в качестве дополнения к стандартной терапии распространенного перитонита. Монотерапия дигидрокверцетином способствовала эффективному повышению уровня регионарного кровотока в стенке тонкой кишки крыс, нормализации биохимических маркеров свободнорадикального окисления, снижению провоспалительных цитокинов, повышению антиоксидантной системы защиты и иммунобиологического статуса, а также восстановлению NO-продуцирующей функции эндотелия. В ходе проведенного исследования выявлена органопротективная активность дигидрокверцетина 7,7 мг/кг в сторону регресса гистоморфологических изменений изучаемых внутренних органов и признаки стимуляции лимфоидной ткани в кишечнике и селезенке. В работе впервые предложен эффективный способ комбинированного лечения экспериментального распространенного перитонита с использованием природного антиоксиданта дигидрокверцетина 7,7 мг/кг с иммуномодулятором Галавит® 8,6 мг/кг и антиоксидантного препарата Мексикор® 60 мг/кг с иммуномодулятором Галавит® 8,6 мг/кг. Изучение оксидантноантиоксидантного, иммунобиологического и цитокинового статуса, NО-продуцирующей функции эндотелия, а также уровня микроциркуляции в стенке тонкой кишки и морфологических изменений внутренних органов крыс обнаружили выраженный сопоставимый фармакологический эффект исследуемых комбинаций. Применение комбинаций способствовало более раннему восстановлению нарушенных биохимических показателей и микроциркуляции до уровня интактных животных по сравнению с монотерапией дигидрокверцетином 7,7 мг/кг. Эффективность проводимой терапии была подтверждена результатом оценки уровня общей летальности экспериментальных животных. Впервые отмечено снижение общей летальности с 62% в группе с распространенным перитонитом до 26% на фоне введения комбинации дигидрокверцетин 7,7 мг/кг + Галавит® 8,6 мг/кг; до 32 % на фоне введения дигидрокверцетина 7,7 мг/кг и до 34% на фоне введения комбинации Мексикор® 60 мг/кг + Галавит® 8,6 мг/кг. Теоретическая и практическая значимость. В работе обоснована эффективность фармакологической коррекции распространенного перитонита природным антиоксидантом дигидрокверцетином, антиоксидантным препаратом Мексикор®, а также комбинациями дигидрокверцетина с иммуномодулятором Галавит® и препарата Мексикор® с иммуномодулятором Галавит®. При этом преимущество дигидрокверцетина перед препаратом Мексикор® выявлялось как при монотерапии, так и в комбинации с иммуномодулятором Галавит®. По результатам исследования нами получено, что наибольшему снижению процента общей летальности крыс сопутствовала более эффективная коррекция оксидантно-антиоксидантного, иммунобиологического и цитокинового статуса, NO-продуцирующей функции эндотелия, восстановление микроциркуляторных нарушений в стенке тонкой кишки и 5 морфологических изменений, развившихся на фоне моделирования распространенного перитонита. С практической точки зрения результаты настоящего исследования свидетельствуют о том, что из числа испытанных препаратов предпочтение следует отдавать тем препаратам и комбинациям, которые оказали существенное влияние на снижение общей летальности крыс в ходе выполненного эксперимента. Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные доклинические и клинические испытания природного антиоксиданта дигидрокверцетина, а также комбинаций дигидрокверцетина с иммуномодулятором Галавит® и антиоксидантного препарата Мексикор® с иммуномодулятором Галавит® в качестве дополнительной терапии к общепринятым хирургическим и фармакологическим методам лечения распространенного перитонита. Внедрение результатов научных исследований. Материалы диссертационного исследования, касающиеся обоснования эффективности фармакологической коррекции природным антиоксидантом дигидрокверцетином оксидантно-антиоксидантного статуса, уровня провоспалительных цитокинов и NO-продуцирующей функции эндотелия включены в состав документов, поданных на регистрацию в ФБУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора. Получено свидетельство о государственной регистрации на биологически активную добавку к пище, содержащую 257,0±25,0 мг/мл дигидрокверцетина в глицерине № RU.77.99.11.003.Е.003227.04.13 от 24.04.2013 г. Результаты работы используются в лекционных курсах кафедры терапии и акушерства ФГБОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова», в лекционных курсах кафедры фармакологии, клинической фармакологии и при выполнении экспериментальных исследований в НИИ экологической медицины ГБОУ ВПО КГМУ. Положения, выносимые на защиту. 1. Дигидрокверцетин 7,7 мг/кг/сут, препараты Мексикор® 60 мг/кг/сут и Галавит® 8,6 мг/кг/сут оказывают корригирующее действие на показатели оксидантно-антиоксидантного статуса, провоспалительных цитокинов и NOпродуцирующую функцию эндотелия на фоне моделирования распространенного перитонита, наиболее выраженный протективный эффект получен при комбинированном введении дигидрокверцетина с Галавитом® и препарата Мексикор® с Галавитом®. 2. Применение комбинаций дигидрокверцетина 7,7 мг/кг + Галавит® 8,6 мг/кг и Мексикор® 60 мг/кг + Галавит® 8,6 мг/кг, а также монотерапия препаратом Галавит® и монотерапия дигидрокверцетином оказывает стимулирующее влияние на гуморальное звено иммунной системы крыс при моделировании распространенного перитонита. 3. Дигидрокверцетин 7,7 мг/кг/сут, препараты Мексикор® 60 мг/кг/сут и Галавит® 8,6 мг/кг/сут оказывают протективное действие на коррекцию 6 морфологических изменений, а также повышают уровень регионарного кровотока в стенке тонкой кишки относительно контрольной группы животных с моделированием распространенного перитонита, при этом, дигидрокверцетин проявлял более выраженный эффект, сопоставимый с комбинированным введением дигидрокверцетина с Галавитом® и препарата Мексикор® с Галавитом®. 4. Оценка общей летальности экспериментальных животных при моделировании распространенного перитонита представляет эффективность фармакологического действия исследуемых антиоксидантов и иммуномодулятора, а также их комбинаций в следующей последовательности: ДГК+Галавит® > ДГК > Мексикор®+Галавит® > Мексикор® > Галавит®. 5. Дигидрокверцетин 7,7 мг/кг/сут проявляет более выраженную эффективность при лечении распространенного перитонита по сравнению с препаратом Мексикор® 60 мг/кг/сут при оценке оксидантно-антиоксидантного, иммунобиологического и цитокинового статуса, NO-продуцирующей функции эндотелия, микроциркуляции в стенке тонкой кишки крыс, морфологических изменений и общей летальности экспериментальных животных. Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены на 3 научных конференциях: – Международной научно-производственной конференции «Проблемы и перспективы инновационного развития животноводства» (15-16 мая 2013 г.) – Белгород, 2013; – Международной научно-практической конференции «Научният потенциал на света» (17-25 сентября 2013 г.) – София, 2013; – Международной научно-практической конференции «Научное обеспечение агропромышленного производства» (29-31 января 2014 г.) – Курск, 2014. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных статей, в том числе 3 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов экспериментальных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка используемой литературы, включающего 215 источников, из них 184 отечественных и 31 зарубежного автора. Диссертация изложена на 159 страницах машинописного текста, содержит 25 таблиц и 46 рисунков. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Исследование выполнено на половозрелых крысах-самцах линии «Wistar», массой тела 200-250 г. Эксперимент проведен в соответствии с Национальным стандартом Российской Федерации ГОСТ Р 53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики», Приказом Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении Правил лабораторной практики», «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» под общей ред. чл.-корр. РАМН, профессора Р.У. Хабриева (2005). 7 Нами была использована модель распространенного гнойного перитонита (РГП) (Лазаренко В.А. и др., 2008) с синдромом интраабдоминальной гипертензии (ИАГ) на крысах (рацпредложение №190410 от 11.01.10; рацпредложение №1877-09 от 28.04.09 ГОУ ВПО КГМУ Минздравсоцразвития России), с помощью которой изучалась эффективность применения природного антиоксиданта флавоноида дигидрокверцетина (ДГК), антиоксидантного препарата Мексикор®, иммуномодулятора Галавит®, а также комбинаций: ДГК+Галавит® и Мексикор®+Галавит®, в коррекции нарушений оксидантно-антиоксидантного, иммунобиологического и цитокинового статуса, NО-продуцирующей функции эндотелия, а также уровня микроциркуляции в стенке тонкой кишки и морфологических изменений внутренних органов у лабораторных животных. В качестве средства для наркоза использовали хлоралгидрат, который вводили внутрибрюшинно в дозе 300 мг/кг массы животного. Под наркозом с соблюдением правил асептики и антисептики крысам выполнялась срединная лапаротомия, распространенный перитонит вызывался путем внутрибрюшного введения 10 % каловой взвеси крысы, которая вводилась в разных направлениях в объеме 0,5 мл на 100 г массы животного (Лазаренко В.А. и др., 2008). Далее создавалась дубликатура в 1 см апоневроза передней брюшной стенки, которая фиксировалась П-образными швами с последующей фиксацией узловыми швами. Животные всех исследуемых групп (контрольная и опытные) получали внутримышечно антибактериальную терапию путем введения цефотаксима в дозе 0,085 г на 1 кг массы тела, ежедневно в течение 5 дней. Через 48 часов от начала эксперимента в контрольной и исследуемых группах выполнялась повторная операция – релапаротомия, санация брюшной полости антисептическим раствором (0,02% раствор фурациллина), устранение дубликатуры передней брюшной стенки путем закрытия лапаротомной раны «край в край» (Фролова О.Г. дисс. … к-та мед. наук, 2011). Обоснование доз исследуемых препаратов. Дозы исследуемых препаратов в опытных группах рассчитывались исходя из средней терапевтической дозы для человека с учетом коэффициента пересчета доз с человека на животных согласно «Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2005). Согласно Требованиям безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов «Единых санитарно-эпидемиологических и гигиенических требований к товарам, подлежащих санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю)» Таможенного союза, а также Техническому регламенту Таможенного союза «О безопасности пищевой продукции» (ТР ТС 021/2011) уровень суточного потребления природного антиоксиданта дигидрокверцетина для взрослых составляет 25-100 мг. В настоящем экспериментальном исследовании фармакологические эффекты дигидрокверцетина (3,5,7,3',4'-пента-гидроксифлаванон) (антиоксиданты из лиственницы «Дигидрокверцетин (Таксифолин)» СГР № RU.77.99.11.003.Е.018404.05.11) производства ООО «Таксифолия», Россия изучались исходя из суточной дозы потребления 90 мг для человека массой 8 70 кг, которая в результате переноса доз на крысу составила 7,7 мг/кг/сут. Так как растворимость дигидрокверцетина в воде и водосодержащих продуктах недостаточна для осуществления точного дозирования препарата с целью достижения необходимой биодоступности, то введение дигидрокверцетина лабораторным животным осуществлялось внутрижелудочно в виде 20% раствора на основе разрешенного к применению в пищевой промышленности растворителе – глицерине (ТУ 9197-012-66975341-2010 "Сырье для производства БАД к пище и пищевой промышленности "Флавомикс-G"). Эффективность антиоксидантного препарата Мексикор® (2-этил-6метил-3-оксипиридина сукцинат) ООО «ЭкоФармИнвест», производства Государственный завод медицинских препаратов ФГУП, Россия исследовалась при внутримышечном введении лабораторным животным в дозе 60 мг/кг/сут, исходя из максимальной суточной дозы 800 мг для человека массой 70 кг. Доза вводимого препарата была рассчитана с учетом коэффициента пересчета на площадь поверхности тела человека, равному 39,0, и коэффициента пересчета на площадь поверхности тела крысы массой 250 г, равному 7,0. При изучении эффективности иммуномодулятора Галавит® (5-амино1,2,3,4-тетрагидрофталазин-1,4-диона натриевая соль) производства ЗАО «Центр современной медицины «МЕДИКОР», Россия препарат вводился животным внутримышечно в дозе 8,6 мг/кг/сут, исходя из средней терапевтической суточной дозы 100 мг для человека массой 70 кг. Доза вводимого препарата была рассчитана с учетом коэффициента пересчета на площадь поверхности тела человека, равному 39,0, и коэффициента пересчета на площадь поверхности тела крысы массой 250 г, равному 7,0. В случае комбинированного лечения препараты вводились в тех же дозах, что и при монотерапии. В хронических экспериментах при моделировании распространенного перитонита исследуемые препараты вводились в соответствующих дозах один раз в сутки в течение 10 дней. Принятая схема соответствует основной массе экспериментальных исследований, выполненных на крысах, на данной модели патологии (Фролова О.Г. дисс. … к-та мед. наук, 2011; Блинков Ю.Ю. дисс. … д-ра мед. наук, 2012). Измерение микроциркуляторных показателей. Измерение микроциркуляции в стенке тонкой кишки производилось с помощью лазерного доплеровского флуометра (ЛДФ) фирмы «Biopac Systems, Inc.» МР100 с датчиком TSD–144 и программы Acqknowledge 3.8.1. Измерения производились в 6 точках на расстоянии 1 см, 2 см, 3 см, 4 см, 5 см и 7 см от илеоцекального угла в стенке тонкой кишки. Показатели микроциркуляции имели вид ЛДФ-грамм и выражались в перфузионных единицах (перф. ед.). Запись кривой уровня микроциркуляции проводили в течение 30 сек. в каждой точке, затем из полученных значений выводили средние, которые вносили в Протокол исследования. Определение биохимических и иммунологических показателей. Выраженность перекисного окисления липидов в крови животных оценивали 9 по содержанию малонового диальдегида (Бенисевич В.И., Идельсон Л.И., 1973; Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И., 1983). Кроме того, определяли активность каталазы (Королюк М.А. и др. 1988), супероксиддисмутазы (Макаренко Е.В., 1988) и общую антиокислительную активность сыворотки крови крыс (Клебанов Г.И. и др., 1988). Уровень метаболитов оксида азота (суммарную концентрацию нитратов и нитритов, NOx) определяли колориметрическим методом по развитию окраски в реакции диазотирования нитритом сульфаниламида, входящим в состав реактива Грисса (Метельская В.А., 2004). Количественное содержание ИЛ-6, ФНО-α определяли с помощью ИФА наборов для крыс «Rat TNF-α Platinum ELISA» и «Rat IL-6 Platinum ELISA» фирмы «eBioscience», Австрия. Метод определения основан на «сэндвич» варианте твердофазного иммуноферментного анализа с применением биотинконъюгированных поликлональных антител против крысиных ФНО-α и биотин-конъюгированных моноклональных антител против крысиных ИЛ-6. Концентрацию иммуноглобулинов IgG, IgM и IgA в сыворотке крови определяли иммунотурбидиметрическим методом на автоматическом анализаторе для биохимического и иммунотурбидиметрического анализа Vitalit 1000 (Италия) в соответствии с программами, разработанными фирмойпроизводителем, с использованием наборов «Иммуноглобулин G-Витал», «Иммуноглобулин М-Витал» и «Иммуноглобулин А-Витал». Морфологические исследования. При вскрытии животных обращали внимание на общий вид внутренних органов, наличие и отсутствие жидкостей в серозных полостях. Для морфологического подтверждения развития моделируемой патологии и в комплексной оценке эффективности препаратов проводили гистологическое исследование тонкого и толстого кишечника, печени, почек, легкого и селезенки интактных, контрольных крыс и крыс, получавших исследуемые препараты. С этой целью кусочки данных органов фиксировали в растворе 10% нейтрального формалина и заливали в парафин по общепринятым методикам (Меркулов Г.А., 1969). Парафиновые срезы толщиной 8-10 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Проводили морфометрию. Статистическая обработка результатов исследований. Достоверность наблюдавшихся при действии исследованных препаратов изменений параметров, как абсолютных, так и в процентах от исходного уровня, определяли путем расчета средней арифметической (М), ошибки средней арифметической (±m) и оценки достоверности различий сравниваемых параметров между группами с использованием t-test для групп с разными дисперсиями, достоверными считались различия сравниваемых параметров при р<0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Изучение влияния дигидрокверцетина в сравнении с препаратом Мексикор®, а также их комбинаций с иммуномодулятором Галавит® на оксидантно-антиоксидантный, иммунобиологический статус, уровень 10 провоспалительных цитокинов и NO-продуцирующую функцию эндотелия при моделировании распространенного перитонита у крыс. Моделирование экспериментального распространенного перитонита вызывает активацию процессов свободнорадикального окисления, угнетение системы антиоксидантной защиты, повышение уровней провоспалительных цитокинов, нарушение синтеза оксида азота. Так, в сыворотке крови нелеченных животных отмечается достоверное повышение концентрации малонового диальдегида. Сравнительное изучение влияния исследуемых препаратов и их комбинаций выявило значительное снижение концентрации МДА на фоне введения дигидрокверцетина, а также комбинаций препаратов дигидрокверцетин+Галавит® и Мексикор® + Галавит®, начиная со 2-х суток эксперимента, в сравнении с контрольной группой без достижения уровня интактных животных. В то время как наиболее выраженный эффект снижения продуктов перекисного окисления липидов до уровня интактных животных, на примере МДА, получен на фоне лечения комбинацией дигидрокверцетина с препаратом Галавит®, начиная с 5-х суток и до конца эксперимента (рис. 1-а). Определение антиокислительного потенциала включало исследование активности ферментов антиоксидантной защиты – супероксиддисмутазы, каталазы и общей антиокислительной активности. Об угнетении антиоксидантной системы защиты при моделировании распространенного перитонита свидетельствовало снижение активности СОД, каталазы и ОАА (рис. 1-б, 1-в, 1-г) относительно интактной группы животных. При введении ДГК и препарата Мексикор® отмечалось с третьих суток эксперимента достоверное повышение СОД относительно контрольной группы, а к 10-м суткам имело место превышение значений интактной группы (рис. 1-б). Использование комбинаций ДГК+Галавит® и Мексикор®+Галавит® приводило к более раннему повышению уровня СОД, начиная со вторых суток (рис. 1-б) и на всем протяжении эксперимента, относительно контрольной группы и достоверному повышению показателя на 5-е, 7-е и 10-е сутки – от интактных крыс. На фоне введения ДГК, препарата Мексикор®, а также комбинаций ДГК+Галавит® и Мексикор®+Галавит®, начиная с 3-х суток, активировалась антиоксидантная система защиты, что подтверждалось статистически достоверным повышением активности каталазы в сыворотке крови крыс от уровня, определяемого не только в контрольной группе животных, но и повышением относительно интактных крыс (рис. 1-в). Изучение состояния ОАА выявило, что в условиях патологии чрезмерная активация процессов свободнорадикального окисления приводит к стойкому снижению показателя в 2 раза на протяжении всего эксперимента. На фоне введения дигидрокверцетина и препарата Мексикор®, а также комбинаций ДГК+ Галавит® и Мексикор®+Галавит® получено статистически достоверное повышение показателя ОАА относительно контрольной группы, начиная со 2-х суток эксперимента, а начиная с 5-х суток ОАА практически не отличался от значений интактной группы. Следует отметить, что использование комбинации ДГК+Галавит® приводит к более раннему повышению значений ОАА к уровню интактных животных, начиная уже с 3-х суток исследования (рис. 1-г). 11 Рис. 1-а Малоновый диальдегид (МДА, мкмоль/л) Рис. 1-б Рис. 1-в Каталаза (мкат/л) Рис. 1-г Общая антиокислительная активность (ОАА, %) Рис.1-д Интерлейкин-6 (ИЛ-6, пг/мл) Рис. 1-е Фактор некроза опухоли-α (ФНО-α, пг/мл) Супероксиддисмутаза (СОД, усл.ед/мл) Рис. 1-ж Конечные стабильные метаболиты NO (NOх, мкмоль/л) Рис. 1. Влияние дигидрокверцетина 7,7 мг/кг, препарата Мексикор® 60 мг/кг, Галавит® 8,6 мг/кг, а также комбинаций препаратов дигидрокверцетин 7,7 мг/кг+Галавит® 8,6 мг/кг и Мексикор® 60 мг/кг+Галавит® 8,6 мг/кг на биохимические показатели сыворотки крови крыс при моделировании распространенного перитонита. Примечание: х – при р<0,05 в сравнении с интактной группой; у – при р<0,05 в сравнении с контрольной группой 12 После моделирования перитонита на 3-и сутки исследования наблюдалось повышение активности гуморального звена иммунитета, характеризующееся достоверным увеличением концентрации иммуноглобулинов IgG и IgМ, которые играют важную роль в процессах противоинфекционной защиты. При этом концентрация иммуноглобулина IgА достоверно уменьшалась по сравнению с интактной группой животных, что может свидетельствовать о снижении местной защиты слизистых оболочек от инфекции. У крыс контрольной группы на 5-е и 10-е сутки имело место снижение уровня всех классов иммуноглобулинов: IgG, IgМ и IgА относительно интактных животных (р<0,05), что подчеркивает степень тяжести развивающейся патологии (табл. 1). Таблица 1 Влияние дигидрокверцетина, препарата Мексикор®, Галавит®, а также комбинаций препаратов дигидрокверцетин +Галавит® и Мексикор®+Галавит® на иммунологические показатели гуморального иммунитета крыс при моделировании распространенного перитонита (М±m) Сутки исследования ИммунолоИсследуемые 3-и сутки гические группы (до релапаро5-е сутки 10-е сутки показатели томии) интактные 1,78±0,08у 1,82±0,06у 1,75±0,05у контроль 2,18±0,08х 1,06±0,11х 1,05±0,15х ДГК 1,60±0,07у 1,53±0,09ху 1,93±0,10у IgG, г/л Мексикор® 2,09±0,06х 1,15±0,09х 0,94±0,12х Галавит® 3,03±0,14ху 3,23±0,07ху 3,42±0,12ху ДГК + Галавит® 3,31±0,14ху 3,58±0,10ху 3,87±0,13ху Мексикор®+Галавит® 3,14±0,11ху 3,25±0,08ху 3,56±0,06ху интактные 0,260±0,025у 0,244±0,013у 0,253±0,020у контроль 0,462±0,046х 0,142±0,038х 0,124±0,033х ДГК 0,309±0,036у 0,264±0,022у 0,289±0,041у IgM, Мексикор® 0,489±0,029х 0,123±0,044х 0,108±0,032х г/л Галавит® 0,607±0,040ху 0,557±0,039ху 0,526±0,045ху ДГК + Галавит® 0,626±,041ху 0,563±0,035ху 0,572±0,029ху Мексикор®+Галавит® 0,577±0,023ху 0,529±0,027ху 0,516±0,019ху интактные 0,069±0,018у 0,071±0,022у 0,074±0,016у контроль 0,029±0,005х 0,028±0,009х 0,031±0,012х ДГК 0,061±0,028 0,066±0,014у 0,082±0,007у IgA, Мексикор® 0,036±0,007х 0,023±0,010х 0,042±0,012х г/л Галавит® 0,102±0,011у 0,134±0,007ху 0,140±0,006ху ДГК + Галавит® 0,128±0,020ху 0,147±0,025ху 0,164±0,020ху Мексикор®+Галавит® 0,094±0,013у 0,116±0,012у 0,135±0,008ху Примечание: х – при р<0,05 в сравнении с интактной группой; у – при р<0,05 в сравнении с контрольной группой. На фоне применения дигидрокверцетина на 3-и сутки после моделирования перитонита концентрация IgG и IgМ соответствовала значениям интактных 13 животных (р>0,05), однако, была достоверно ниже значений в контрольной группе (р<0,05). На 5-е и 10-е сутки в контрольной группе уровень IgG одинаково снижался в 1,7 раза, а IgМ – в 1,7 и 2 раза, соответственно, по сравнению с показателями интактной группы. Введение дигидрокверцетина приводило к восстановлению концентрации иммуноглобулинов IgG, IgМ и IgA на 5-е и 10-е сутки исследования до нормальных значений интактных животных (табл. 1). При изучении динамики изменений иммунологических показателей получено, что введение препарата Мексикор® не вызывает заметных изменений в показателях, характеризующих гуморальное звено иммунитета: концентрации IgG, IgМ и IgA в сыворотке крови крыс не восстанавливались до нормальных значений интактных животных на всех сроках исследования (табл. 1). На фоне применения препарата Галавит® на 3-и сутки эксперимента наблюдалось более выраженное иммуностимулирующее действие по сравнению с контрольной группой, характеризующееся увеличением IgG и IgМ (р<0,05). Напротив, концентрация IgA в контрольной группе на 3-и сутки снижалась более чем в 2 раза, в то время как введение препарата Галавит® способствовало достоверному повышению значений IgA относительно контрольной группы до уровня интактных животных. Введение животным иммуномодулятора Галавит® после моделирования перитонита приводило к достоверному повышению концентрации IgG, IgМ и IgА не только относительно контрольной группы, но и превышало уровень интактных крыс в 1,5 раза, в 2,3 раза и в 1,9 раза, соответственно, на 5-е сутки и в 1,9 раза, 2 раза и в 1,9 раза, соответственно, на 10-е сутки исследования (р<0,05) (табл. 1). На фоне применения комбинаций ДГК+Галавит® и Мексикор®+ Галавит® на 3-и сутки наблюдалось более выраженное иммуностимулирующее действие по сравнению с контрольной группой, характеризующееся увеличением IgG, IgМ и IgA (р<0,05). Следует отметить, что введение комбинации ДГК+Галавит® оказывало более заметное влияние на показатели иммунного ответа по сравнению с монотерапией дигидрокверцетином, увеличивая на 3-и сутки концентрацию IgG, IgМ и IgA в 2 раза. Введение комбинации Мексикор®+ Галавит® также оказывало влияние на показатели гуморального иммунитета по сравнению с монотерапией препаратом Мексикор®, увеличивая концентрацию IgG в 1,5 раза, IgМ – в 1,2 раза, IgA – в 2,6 раза (табл. 1). Введение комбинаций ДГК+Галавит® и Мексикор®+Галавит® приводило к достоверному повышению концентрации IgG, IgМ и IgА не только относительно контрольной группы, но и превышало уровень интактных крыс на 5-е и 10-е сутки исследования (р<0,05). В то же время следует подчеркнуть, что добавление к дигидрокверцетину иммуномодулятора Галавит® способствовало повышению концентрации IgG, IgМ и IgА в 2,3 раза, в 2,1 раза и в 2,2 раза на 5-е сутки, соответственно, по сравнению с монотерапией дигидрокверцетином. На 10-е сутки сохранялось преимущество комбинированного применения ДГК+Галавит®, что выражалось в повышении IgG, IgМ и IgА в 2 раза по сравнению с монотерапией дигидрокверцетином (табл. 1). Добавление к препарату Мексикор® иммуномодулятора Галавит® способствовало повышению концентрации иммуноглобулинов IgG, IgМ и IgА в 2,8 раза, в 4,3 раза и в 5,0 раза на 5-е сутки, соответственно, по сравнению с монотерапией препаратом Мексикор®. На 10-е сутки также сохранялось преимущество комбинированного применения Мексикор®+Галавит®, что выражалось в повышении IgG, IgМ и IgА в 3,8 раза, в 4,8 раза и в 3,2 раза, соответственно, по сравнению с монотерапией препаратом Мексикор® (табл. 1). 14 При изучении влияния монотерапии препаратом Галавит® и препаратом Мексикор® на уровень провоспалительных цитокинов нами было получено снижение ИЛ-6 (начиная с 4-х и 5-х суток, соответственно) и ФНО-α (начиная с 3-х и 4-х суток, соответственно) относительно контрольной группы животных, сопоставимое для исследуемых групп. При комбинированном применении дигидрокверцетина и препарата Мексикор® с препаратом Галавит® отмечалось более эффективное снижение цитокинов относительно контрольных животных, начиная со 2-х суток исследования (рис. 1-д, 1-е) и, что особо важно, достижение значений интактных животных в отношении ИЛ-6 и ФНО-α в исследуемых комбинациях достигалось одновременно на 7-е и 10-е сутки. При этом считаем примечательным наблюдаемый на фоне монотерапии дигидрокверцетином эффект аналогичный комбинациям, выражающийся в снижении ИЛ-6 в 6 раз, а ФНО-α – в 3,7 раза от уровня контрольной группы на 10-е сутки (рис. 1-д, 1-е). Изучив динамику концентрации конечных стабильных метаболитов оксида азота, в контрольной группе мы подтвердили нарушение NOпродуцирующей функции эндотелия, выражающееся в повышении концентрации конечных стабильных метаболитов оксида азота NOx с 1-х по 10-е сутки эксперимента по сравнению с интактной группой животных. Заслуживает внимания тот факт, что исследуемые препараты: ДГК, Мексикор® и их комбинации в разной степени достоверно снижали концентрацию NOx относительно контрольной группы уже с 1-х суток исследования (рис. 1-ж), что может свидетельствовать об их эндотелиопротективных свойствах. При этом наиболее выраженный эффект демонстрировали ДГК, комбинации препаратов ДГК+Галавит® и Мексикор®+Галавит®, восстанавливая концентрацию NOx до уровня интактной группы, начиная с 5-х по 10-е сутки исследования. В то время как под действием монотерапии препаратом Мексикор® уровень интактных крыс достигался лишь на 10-е сутки, а на фоне введения препарата Галавит® целевые значения интактной группы в ходе эксперимента достигнуты не были (рис. 1-ж). Таким образом, комбинации дигидрокверцетина+Галавит® и Мексикор®+Галавит® при моделировании распространенного перитонита в эксперименте оказывают более выраженное корригирующее действие на показатели оксидантно-антиоксидантного статуса, провоспалительных цитокинов и NO-продуцирующую функцию эндотелия по сравнению с монотерапией, где наиболее сопоставимую положительную динамику на показатели МДА, СОД, ИЛ-6, ФНО-α и NOx продемонстрировала монотерапия дигидрокверцетином. 2. Изучение влияния дигидрокверцетина в сравнении с препаратом Мексикор®, а также их комбинаций с иммуномодулятором Галавит® на микроциркуляторные и морфологические изменения при моделировании распространенного перитонита у крыс. При исследовании микроциркуляции в стенке тонкой кишки крыс выявлены значительные нарушения кровотока, сопровождающиеся достоверным снижением показателей микроциркуляции на протяжении всего исследования по сравнению с интактной группой животных (р<0,05). К 10-м суткам не происходило полного восстановления микроциркуляции, значения которой оставались достоверно ниже на 42,3 % относительно группы интактных животных (рис. 2). 15 Рис. 2. Динамика микроциркуляции в стенке тонкой кишки крыс, получавших дигидрокверцетин 7,7 мг/кг, Галавит® 8,6 мг/кг и комбинацию дигидрокверцетин 7,7 мг/кг+Галавит® 8,6 мг/кг при экспериментальном перитоните, в абсолютных значениях. Примечание: X – при р<0,05 в сравнении с интактной группой; Y – при р<0,05 в сравнении с контрольной группой. Рис. 3. Динамика микроциркуляции в стенке тонкой кишки крыс, получавших Мексикор® (60 мг/кг), Галавит® (8,6 мг/кг) и комбинацию Мексикор® (60 мг/кг)+Галавит® (8,6 мг/кг) при экспериментальном перитоните, в абсолютных значениях. Примечание: X – при р<0,05 в сравнении с интактной группой; Y – при р<0,05 в сравнении с контрольной группой. 16 Дигидрокверцетин в качестве монотерапии, комбинация препаратов ДГК+Галавит® при моделировании распространенного перитонита у крыс способствовали эффективному повышению уровня регионарного кровотока в стенке тонкой кишки относительно контрольной группы животных. Введение экспериментальным животным комбинации способствовало более раннему (начиная с 5-х суток) восстановлению микроциркуляции в стенке тонкой кишки до уровня интактных животных (р>0,05) по сравнению с монотерапией ДГК, в которой уровень интактных животных достигался на 10-е сутки (рис. 2). Комбинация препаратов Мексикор®+Галавит®, а также монотерапия препаратом Мексикор® и в меньшей степени монотерапия препаратом Галавит® при моделировании распространенного перитонита у крыс приводит к эффективному повышению уровня регионарного кровотока в стенке тонкой кишки по сравнению с контрольной группой. Введение экспериментальным животным комбинации способствовало (начиная с 7-х суток) восстановлению микроциркуляции до уровня интактных животных (р>0,05) в отличие от монотерапии препаратом Мексикор® и препаратом Галавит®, на фоне введения которых уровень интактных животных достигнут не был (рис. 3). В наших экспериментах показано, что нарушения микроциркуляции возникали уже на реактивной стадии перитонита и сопровождались дистрофическими изменениями тонкой кишки и других органов-мишеней, достигшими в токсической фазе максимальной выраженности. Морфологические изменения у крыс с нелеченным перитонитом заключались в развитии распространенных нарушений кровообращения, дистрофических и воспалительных изменений в кишечнике, печени, почках и легких. Описанный морфологический симптомокомплекс свидетельствует о развитии при перитоните у крыс полиорганной недостаточности. Морфологические исследования подтвердили высокую органопротективную активность монотерапии дигидрокверцетином в дозе 7,7 мг/кг/сут и препаратом Мексикор® в дозе 60 мг/кг/сут в сторону регресса гистоморфологических изменений в париетальной брюшине, в тонком и толстом кишечнике, печени, почках и легких, вызванных моделированием распространенного перитонита (рис. 4-5). К концу эксперимента обнаруживаемые в контрольной группе нарушения кровообращения, дистрофические и воспалительные изменения не определяются. Кроме этого на фоне применения дигидрокверцетина 7,7 мг/кг/сут выявляются признаки стимуляции лимфоидной ткани в кишечнике и селезенке (рис. 6), что может быть обусловлено иммуномодулирующим действием дигидрокверцитина. При введении препарата Галавит® в дозе 8,6 мг/кг/сут в тонком и толстом кишечнике (рис. 7), легких и селезенке (рис. 8) отмечается выраженная гиперплазия лимфоидной ткани, что может быть обусловлено иммуномодулирующим действием препарата Галавит®. Также морфологические исследования подтвердили высокую органопротективную активность комбинаций ДГК+Галавит® и ® ® Мексикор +Галавит на фоне моделирования распространенного перитонита. 17 Рис. 4. Перитонит на фоне введения ДГК, 4 сут. Воспалительная инфильтрация ворсин тонкого кишечника с их заметным утолщением, язв нет. Окраска гематоксилином и эозином. х 56. Рис. 5. Перитонит на фоне введения препарата Мексикор®, 2 сут. Мелкокапельная жировая дистрофия гепатоцитов. Окраска гематоксилином и эозином. х400. Рис.6. Перитонит на фоне введения ДГК 7,7 мг/кг, 10 сут. Гиперплазия лимфоидных фолликулов селезенки. Окраска гематоксилином и эозином. х56. Рис. 7. Перитонит на фоне введения препарата Галавит®, 7 сут. Выраженная гиперплазия лимфоидного аппарата тонкой кишки. Окраска гематоксилином и эозином. х 56. Рис. 8. Перитонит на фоне введения препарата Галавит®, 10 сут. Лимфоидные фолликулы селезенки крупные, имеются реактивные центры. Окраска гематоксилином и эозином. х 70. Рис. 9. Перитонит на фоне введения комбинации ДГК+Галавит®, 10 сут. Тонкий кишечник, гиперплазия лимфоидной ткани. Окраска гематоксилином и эозином. х 56. 18 При этом на фоне применения комбинации ДГК+Галавит® морфологические изменения в париетальной брюшине, кишечнике, печени, почках, легких и селезенке были в целом аналогичны таковым у крыс, получавших монотерапию дигидрокверцетином. В то же время на фоне введения комбинации Мексикор®+Галавит® патологические изменения в структуре изученных органов были выражены в меньшей степени, чем в группе монотерапии препаратом Мексикор®. Следует отметить значительную гиперплазию лимфоидной ткани тонкого кишечника в результате применения комбинации ДГК+Галавит® (рис. 9). Можно предположить, что полученный результат связан с иммуномодулирующим действием испытуемых препаратов. В отличие от группы животных, получавших лечение препаратом Мексикор®, при комбинированной терапии Мексикор®+Галавит® отмечается выраженная гиперплазия лимфоидной ткани тонкого кишечника, что, вероятно, связано с иммуномодулирующим действием препарата Галавит®. 3. Изучение влияния дигидрокверцетина в сравнении с препаратом Мексикор®, а также их комбинаций с иммуномодулятором Галавит® на летальность при моделировании распространенного перитонита у крыс. Одним из основных и наиболее информативных критериев, характеризующих эффективность лечения, является оценка уровня летальности в ходе эксперимента. В результате проведенного исследования видно, что фармакологическая коррекция распространенного перитонита препаратом Галавит® привела к снижению показателя общей летальности на 16% относительно контрольной группы животных, в то время как эффективность монотерапии препаратом Мексикор® была несколько выше, что подтверждалось снижением данного показателя на 22%. Рис. 10. Влияние дигидрокверцетина 7,7 мг/кг, препарата Мексикор® 60 мг/кг, Галавит® 8,6 мг/кг, а также комбинаций препаратов дигидрокверцетин 7,7 мг/кг+Галавит® 8,6 мг/кг и Мексикор® 60 мг/кг+ Галавит® 8,6 мг/кг на показатель общей летальности крыс при моделировании распространенного перитонита. 19 Комбинированное использование препаратов Мексикор®+Галавит® значительно сократило количество павших животных и, тем самым, снизило летальность на 28%, в то время как монотерапия ДГК привела к аналогичному результату, снизив общую летальность на 30%. Преимущество комбинации ДГК+Галавит® подтвердилось максимальным снижением общей летальности на 36% относительно контрольной группы животных. Таким образом, представляется возможным расположить исследуемые препараты и их комбинации по степени снижения общей летальности в следующем порядке: ДГК+Галавит® < ДГК < Мексикор®+Галавит® < Мексикор® < Галавит® (рис. 10). В заключение необходимо отметить, что перспективным направлением в послеоперационной интенсивной терапии распространенного перитонита, наряду с общепринятыми хирургическими и фармакологическими методами, является дополнительное применение природного флавоноида дигидрокверцетина, который приводит к нормализации показателей свободнорадикального окисления, активирует антиоксидантную систему защиты, нормализует иммунологические показатели гуморального звена иммунитета, снижает уровень провоспалительных цитокинов, способствует снижению избыточного синтеза оксида азота, восстанавливает уровень регионарного кровотока в стенке тонкой кишки. Приведенные в данной работе результаты патоморфологических исследований и оценки общей летальности также свидетельствуют об эффективности дигидрокверцетина и целесообразности проведения дальнейших целенаправленных доклинических и клинических испытаний при лечении распространенного перитонита. ВЫВОДЫ 1. Введение комбинаций дигидрокверцетина 7,7 мг/кг + Галавит® 8,6 мг/кг и Мексикор® 60 мг/кг + Галавит® 8,6 мг/кг при моделировании распространенного перитонита в эксперименте оказывает более выраженное корригирующее действие на показатели оксидантно-антиоксидантного статуса, провоспалительных цитокинов и NO-продуцирующую функцию эндотелия по сравнению с монотерапией, где наиболее сопоставимую положительную динамику на показатели МДА, СОД, ИЛ-6, ФНО-α и NOx продемонстрировала монотерапия дигидрокверцетином 7,7 мг/кг. 2. Применение комбинаций дигидрокверцетина 7,7 мг/кг + Галавит® 8,6 мг/кг и Мексикор® 60 мг/кг + Галавит® 8,6 мг/кг, а также монотерапии препаратом Галавит® оказывает выраженное стимулирующее влияние на гуморальное звено иммунной системы крыс, что проявлялось в достоверном повышении концентраций иммуноглобулинов IgG, IgM, IgA по сравнению с контрольной группой животных, а также превышало значения интактных крыс. Монотерапия дигидрокверцетином оказывает иммуномодулирующее действие и сохраняет относительную стабильность IgG, IgM, IgA на уровне интактных животных, проявляя тенденцию к повышению концентраций иммуноглобулинов всех фракций. 20 3. Дигидрокверцетин 7,7 мг/кг, Мексикор® 60 мг/кг и Галавит® 8,6 мг/кг в качестве монотерапии, комбинации дигидрокверцетин 7,7 мг/кг + Галавит® 8,6 мг/кг и Мексикор® 60 мг/кг + Галавит® 8,6 мг/кг при моделировании распространенного перитонита у крыс способствовали повышению уровня регионарного кровотока в стенке тонкой кишки относительно контрольной группы. Введение экспериментальным животным комбинаций: дигидрокверцетин 7,7 мг/кг + Галавит® 8,6 мг/кг и Мексикор® 60 мг/кг + Галавит® 8,6 мг/кг приводило к более раннему (начиная с 5-х и 7-х суток, соответственно) восстановлению микроциркуляции в стенке тонкой кишки до уровня интактных животных (р>0,05) по сравнению с монотерапией дигидрокверцетином 7,7 мг/кг, в которой уровень интактных животных достигался на 10-е сутки. 4. Морфологические исследования подтвердили высокую органопротективную активность комбинаций: дигидрокверцетин 7,7 мг/кг + Галавит® 8,6 мг/кг и Мексикор® 60 мг/кг + Галавит® 8,6 мг/кг, а также монотерапии дигидрокверцетином 7,7 мг/кг и препаратом Мексикор® 60 мг/кг при моделировании распространенного перитонита. Введение дигидрокверцетина 7,7 мг/кг и комбинаций: дигидрокверцетин 7,7 мг/кг + Галавит® 8,6 мг/кг и Мексикор® 60 мг/кг + Галавит® 8,6 мг/кг приводило к выраженной гиперплазии лимфоидной ткани в кишечнике и селезенке, характерной для монотерапии иммуномодулятором Галавит® 8,6 мг/кг. 5. Комбинированное лечение дигидрокверцетин 7,7 мг/кг + Галавит® 8,6 мг/кг, Мексикор® 60 мг/кг + Галавит® 8,6 мг/кг и монотерапия дигидрокверцетином 7,7 мг/кг привело к максимальному снижению общей летальности с 62% в контрольной группе до 26%, 34% и 32%, соответственно. Монотерапия препаратами Мексикор® 60 мг/кг и Галавит® 8,6 мг/кг способствовала снижению общей летальности на 22% и 16%, соответственно. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 1. Для коррекции нарушений в системе антиоксидантной защиты и иммунобиологического статуса при распространенном перитоните у животных рекомендовано в качестве дополнения к стандартной терапии применение природного антиоксиданта из лиственницы – дигидрокверцетина в дозе 7,7 мг/кг/сут 1 раз в день внутрижелудочно в течение 10 суток. 2. Материал диссертационной работы может быть рекомендован для использования: – в учебном процессе при чтении лекций и проведении практических занятий на биологических, ветеринарных, медицинских факультетах высших учебных заведений; – при написании соответствующих разделов учебников, монографий, справочных руководств и пособий по биохимии, ветеринарной микробиологии, вирусологии, эпизотологии, микологии с микотоксикологией и иммунологии; – при проведении научно-исследовательских работ аспирантами, научными сотрудниками биологического и ветеринарного профиля. 21 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Экспериментальное обоснование применения дигидрокверцетина при распространенном перитоните / А.Н. Чмыхова, Е.Б. Артюшкова, О.Б. Сеин, Е.В. Артюшкова // Вестн. Курск. ГСХА. – 2013. – № 6. – С. 71-75. 2. Влияние флавоноида природного происхождения дигидрокверцетина на биохимические показатели крови при экспериментальном перитоните. Т. 15. Лекарство / А.Н. Чмыхова, Е.В. Артюшкова, О.Б. Сеин, И.Ю. Уханова // Научният потенциал на света : материалы 9 Междунар. науч. практ. конф. (София, 17-25 сент. 2013 г.). – София, 2013. – С. 59-61. 3. Исследование влияния дигидрокверцетина на уровень микроциркуляции и морфологические показатели при перитоните (экспериментальное исследование). Т. 15. Лекарство / А.Н. Чмыхова, Е.Б. Артюшкова, О.Б. Сеин, В.С. Барсуков // Научният потенциал на света : материалы 9 Междунар. науч. практ. конф. (София, 17-25 сент. 2013 г.). – София, 2013. – С. 62-66. 4. Оценка эффективности применения антиоксидантов дигидрокверцетина и Мексикора® в комплексном лечении распространенного перитонита в эксперименте [Электронный ресурс] / А.Н. Чмыхова, Е.Б. Артюшкова, О.Б. Сеин, Е.В. Артюшкова // Современные проблемы науки и образования. – 2013. – № 6. – Режим доступа: http://www.scienceeducation.ru/113-11043, свободный (дата обращения: 09.12.2013). 5. Чмыхова, А.Н. Перспектива применения природного флавоноида дигидрокверцетина и его комбинации с иммуномодулятором Галавит® в комплексном лечении распространенного перитонита в эксперименте / А.Н. Чмыхова, Е.Б. Артюшкова, Е.В. Артюшкова // Вестн. Курск. ГСХА. – 2014. – № 1. – С. 62-65. 6. Чмыхова, А.Н. Экспериментальное обоснование комбинированного применения дигидрокверцетина и Галавита® при распространенном перитоните / А.Н. Чмыхова // Проблемы и перспективы инновационного развития животноводства : материалы Междунар. науч.-произв. конф. (15-16 мая 2013 г.). – Белгород, 2013. – С. 72. 7. Фармакологическая коррекция биохимических изменений при распространенном перитоните в эксперименте / А.Н. Чмыхова, Е.Б. Артюшкова, О.Б. Сеин // Интегративные тенденции в медицине и образовании: материалы Междунар. науч.-практ.. конф. – Москва, 2013. – С. 97-99. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ДГК – дигидрокверцетин ИЛ-6 – интерлейкин 6 КАТ – каталаза МДА – малоновый диальдегид ОАА – общая антиоксидантная активность NO – оксид азота 22 РГП – распространенный гнойный перитонит СОД – супероксиддисмутаза ФНО-α – фактор некроза опухоли- α IgА – иммуноглобулин А IgM – иммуноглобулин М IgG – иммуноглобулин G Формат 60х84 1/16. Бумага для множительных аппаратов. Печать на копировальном аппарате КГСХА. Усл. печ. л. 1,0. Уч.-изд.л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 115. 23 24