Фармацевтическая химия УДК 6 1 5 .3 2 2 :5 8 2 .9 4 9 .2 7 ПОЛУЧЕНИЕ ИЗВЛЕЧЕНИЙ ИЗ ЛИСТЬЕВ ШАЛФЕЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО, ОПТИМИЗИРОВАННЫХ ПО СОДЕРЖАНИЮ ДИТЕРПЕНОВЫХ КИСЛОТ И ИЗУЧЕНИЕ ИХ АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ © Авторы, 2013 Р.Ш. Хазиев к.б .н ., доцент, кафедра фармакологии, фармацевтический факультет с курсами фармакогнозии и ботаники, К а з а н с к и й го с у д а р с т в е н н ы й м е д и ц и н с к и й у н и в е р с и т е т E-mail: xaziev@ inbox.ru А.С. М акарова студентка, фармацевтический факультет, Казанский государственный медицинский университет E-mail: anela_90@ m ail.ru Л.Т. Мусина д .м .н., профессор, кафедра микробиологии, Казанский государственного медицинский университет E-mail: musina@ kgm u.kcn.ru Получены спиртовые и водные извлечения из листьев шалфея с высоким содержанием дитерпеновых кислот. Установлена кор­ реляция между их концентрацией и уровнем антибактериальной активности полученных извлечений. К лю чевы е слова: шалфей лекарственный, дитерпеновые кислоты, антимикробная активность. In our study w ere received ethanolic and aqueous sage leaves extracts with the high content of diterpenic acids and w ere studied a correlation between the concentration of diterpenic acids and the level of antibacterial activity. Keywords: sage, diterpenic adds, antimicrobial activity. Листья шалфея лекарственного (S a lv ia o f f ic in a lis L ., сем. L a m ia c e a e ) - одно из наиболее популяр­ ных растительных средств антимикробного и про­ тивовоспалительного действия. В настоящее время в отечественной медицине шалфей используется практически только в виде настоя. Зарегистриро­ ванные препараты «сальвина раствор спиртовой 1 %» и «сальвин-ВИФ» на рынке отсутствуют. Долгое время активным началом листьев шалфея считалось эфирное масло, по содержанию которого они стандартизуются согласно Государ­ ственной фармакопее СССР XI издания [1]. Ис­ следования последнего времени связывают проти­ вовоспалительную и антимикробную активность шалфея лекарственного с содержанием дитерпе­ новых кислот (карнозоловой и её производных) [3]. По содержанию этих соединений предлагается стандартизовать сырье шалфея лекарственного [4]. Цель и с с л е д о в а н и я - разработка способов получения спиртовых и водных извлече­ ний из листьев шалфея лекарственного с макси­ мальным выходом дитерпеновых кислот и оценка их антимикробных свойств для установления пря­ мой корреляционной взаимосвязи между содержа­ нием дитерпеновых кислот в полученных извлече­ ниях и их антибактериальной активностью. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Для исследований использовали шалфея лекарст­ венного листья в фильтр-пакетах производства ЗАО «Ст-Медифарм», приобретённые в розничной ап­ течной сети. Содержание дитерпеновых кислот в сырье определяли методом прямой спектрофотометрии [4]. Содержание дитерпеновых кислот в сырье составило 6,38 ± 0 ,6 9 % в пересчете на абсолютно сухое сырье. Для определения дитерпеновых кислот в спиртовых извлечениях использовали методику, приведенную в [4], упаривая этиловый спирт под ва­ куумом досуха. Для определения дитерпеновых ки­ слот в водных извлечениях подкисляли их I %-ным раствором хлористоводородной кислоты до кислой реакции и исчерпывающе экстрагировали в дели­ тельной воронке хлороформом. Хлороформ отгоня­ ли под вакуумом досуха и дальше определение про­ водили по методу, приведенному в [4]. Полноту очистки фракций дитерпеновых кислот подтвержда­ ли снятием УФ-спектров, которые имели отчетли­ вый максимум поглощения при 285 ± 3 нм и совпа­ дали со УФ-спектром карнозоловой кислоты [4]. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Спиртовые экстракты из листьев шалфея готовили из 10,0 г сырья методом повторной экстракции. ВОПРОСЫ БИОЛОГИЧЕСКОМ, МЕДИЦИНСКОМ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОМ ХИМИИ, №2, 2013 35 Фармацевтическая химия нагреванием на водяной бане с обратным холо­ дильником в течение 30 мин. Экстрагирование проводилось 100 и 50 мл 95 %-ного спирта в пер­ вой и второй экстракции соответственно (общее соотношение сырья и экстрагента 1:15). С учетом того, что дитерпеновые кислоты могут находиться в сырье в форме солей, хуже растворяющихся в органических растворителях, применили также предварительное смачивание сырья 1 %-ным рас­ твором кислоты хлористоводородной. Получен­ ные результаты приведены в табл. 1. Таким образом, используя предварительное смачивание сырья кислотой, удалось за две экс­ тракции извлечь почти 90 % всех дитерпеновых кислот. Для приготовления водных извлечений из ли­ стьев шалфея использовали технологию Государ­ ственной фармакопеи [2]: настаивание на кипящей водяной бане в течение 15 мин и последующее ох­ лаждение при комнатной температуре не менее 45 мин. Соотнош ение сырья и воды изменяли от предлагаемого фармакопеей 1:10 до рекомендуе­ мого производителями сырья 1:33 (два фильтрпакета по 1.5 г на 100 мл воды). По аналогии со спиртовыми извлечениями из листьев шалфея, для перевода дитерпеновых кислот в водорастворимые солевые формы применили также экстракцию 1 %-ным раствором натрия гидрокарбоната. Полу­ ченные результаты приведены в табл. 2. Таким образом, применяя экстракцию 1 %-ным раствором натрия гидрокарбоната, удалось повы­ сить степень извлечения дитерпеновых кислот в на­ стои в три и более раза при разных соотношениях сырья и экстрагента. Была изучена микробиологическая актив­ ность полученных спиртовых экстрактов и настоев листьев шалфея методом двухкратных серийных разведений в мясо-пептонном бульоне (МПБ) (pH 7,0) с тест-микробом S ta p h y lo c o c c u s a u re u s АТТС 6538-Р [5]. Однако метод серийных разве­ дений в МПБ не позволил визуально определить наличие или отсутствие роста из-за мутности пер­ воначального раствора. Чтобы устранить этот недостаток фармако­ пейной методики нами был разработан метод, где антибактериальную активность извлечений опре­ деляли, используя мясо-пептонный агар (МПА), на поверхность которого в чашках Петри методом репликаций из каждой пробирки делали пересев и инкубировали в термостате в течение 18...24 ч. Разведение извлечения, на котором отсутст­ вовал рост тест-штамма характеризовало его анти­ бактериальную активность (табл. 3). Полученные результаты показали, что анти­ микробная активность спиртовых и водных извле­ чений листьев шалфея являются сопоставимыми и прямо коррелируют с уровнем содержания в них суммы дитерпеновых кислот. Для получения на- Т; J 1 j 7 I с С г _с ст ре ра Bt во вь нь ем те; ла ТВ' Таблица 1. Содержание дитерпеновых кислот в спиртовых извлечениях из листьев шалфея, % С тепень экстр акц и и Э кс тр а ге н т С п и р т э ти л о в ы й 9 5 % -н ы й С п и р т э ти л о в ы й 9 5 % -н ы й * П р и м е ч а н и е : К о л и ч е ств о извлеченны х Кон цен тр ац ия дитерпенов ы х ки сл от д итерпенов ы х ки сл о т Первая П ов торная С ум м арная (% о т м ассы сы рья) в и звлечениях 3 3 .5 ± 2 . 2 3 2 0 ,4 5 ± 2 . 6 3 5 3 .9 6 ± 3 . 6 3 , 4 ± 0 ,2 2 0 .2 3 ± 0 .0 2 5 9 ,5 6 ± 4 . 3 6 2 6 .5 3 ± 3 . 2 3 8 6 ,2 3 ± 5 . 8 4 5 ,5 5 ± 0 , 7 3 0 , 3 7 ± 1 ,5 2 * - сы р ье с м о ч е н о I % -н ы м р а с тв о р о м х л о р и с т о в о д о р о д н о й ки с л о ты . Таблица 2. Содержание дитерпеновых кислот в водных извлечениях из листьев шалфея, % . Э кс тр а ге н т Г идромодуль С теп ень экстракц и и К о л и ч е ств о и звлеченны х Концентрация дитерпенов ы х ки сл от д итерпенов ы х ки сл от (% о т м ассы сы рья) в извлечениях Вода очищ енная I 10 9 , 7 2 ± 1 ,1 5 0 ,6 2 ± 0 ,0 9 0 ,0 6 ± 0 .0 0 9 1 % -н ы й р а с тв о р N a l l C O j 1 10 3 3 ,4 9 ± 2 , 2 9 2 .1 5 ± 0 .1 5 0 ,2 1 ± 0 , 0 2 Вода очищ енная 1 20 1 9 ,9 7 ± 1 ,4 3 1 ,2 5 ± 0 , 1 0 0 ,0 6 ± 0 ,0 0 4 1 % -н ы й р а с тв о р N a H C 0 3 1 20 6 9 ,2 3 ± 5 ,4 7 4 ,3 4 ± 0 ,3 2 0 ,2 2 ± 0 ,0 1 Вода очищ енная 1 33 2 4 ,2 4 ± 2 .2 2 1 .5 5 ± 0 , 2 3 0 .0 5 ± 0 . 0 0 4 1 % -н ы й р а с тв о р N a H C 0 3 1 33 7 5 ,3 9 ± 8 . 8 0 4 ,8 2 ± 0 ,5 9 0 ,1 4 ± 0 ,0 2 36 ВОПРОСЫ БИОЛОГИЧЕСКОЙ, МЕДИЦИНСКОЙ и ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, №2, 2013 А 01 Фармацевтическая химия Таблица 3. Антимикробная активность извлечений из листьев шалфея (на культуре Staphylococcus aureus АТТС 6538-Р) Кон цен тр ац ия И звл ечен ие д итерпенов ы х ки сл от в и звлечениях, % В о д н ы й н а с то й (1 :2 0 ) Н а с т о й н а 1 % -н о м в о д н о м р а с т в о р е N a H C C h ( 1 :2 0 ) М а кс и м а л ь н о е разбавл ение М ин им ал ь ная подавляю щ ая извл ечения, ко н центраци я и ннактивирую щ ее д и тер пено в ы х ки сл от, р азм н о ж ен и е стаф и лококко в м к г /м л 0 ,0 6 ± 0 ,0 0 9 1 :6 4 9 ,4 0 .2 2 ± 0 ,0 1 1 :2 5 6 8 ,6 0 ,2 3 ± 0 .0 2 1 :2 5 6 9 ,0 0 , 3 7 ± 0 .0 2 1 :5 1 2 С п и р т о в о й э к с т р а к т (1 :1 5 ), п о л у ч е н н ы й без о б р а б о тки сы рья Н С 1 С п и р т о в о й э к с т р а к т (1 :1 5 ), полученны й после обработки ! сы рья H C I стоев с высокой антибактериальной активностью рекомендуется вместо воды использовать 1 %-ный раствор натрия гидрокарбоната. ЛИТЕРАТУРА 1. Л и с ть я ш алф ея: ф ар м а ко п . ст. Г о с у д а р с тв е н н а я Ф а р м а ­ к о п е я С С С Р . 1 1 -е и з д . М 3 С С С Р . Л е к а р с т в е н н о е р а с т и ­ те л ь н о е сы рье. М .: 1 9 8 9 . В ы п . 2. С . 2 6 9 . ВЫВОДЫ 2. Н а с т о и и о тв ар ы : ф а р м а к о п . ст. Г о с у д а р с т в е н н а я Ф а р м а ­ к о п е я С С С Р . 1 1 -е и з д . М 3 С С С Р . Л е к а р с т в е н н о е р а с т и ­ 1. Разработаны способы получения спиртовых и водных извлечений из листьев шалфея с высоким выходом суммы дитерпеновых кислот. 2 . Антибактериальная активность получен­ ных извлечений прямо коррелирует с содержани­ ем в них дитерпеновых кислот. 3. Для получения настоев с высокой антибак­ териальной активностью из листьев шалфея пред­ лагается вместо воды использовать 1 %-ный рас­ твор натрия гидрокарбоната. те л ь н о е сы рье. М . 1 9 89. В ы п . 2. С . 147. 3. дилфикаров ПН. Д и т е р п е н ы и п о л и ф е н о л ы ш а л ф е я л е ­ к а р с тв е н н о го : (о б з о р перспекти вы л итературы ) // м е д и ц и н с ко го В естни к прим енения С а н к т -П е т е р б у р гс к о го у н и в е р с и те т а . 2 0 0 7 . В ы п . 3. С . 1 4 9 - 157. 4. З и л ф и ка р о в И .Н ., Ж и л и н А .В . О п р е д е л е н и е д и т е р п е н о ­ вы х к и с л о т в сы рье и п р е п а р а та х ш ал ф ея л е к а р с т в е н н о го / / Ф а р м а ц и я . 2 0 0 7 . С . 7—9 . 5. Ф С 4 2 -2 3 5 2 -8 5 . С ал ь н и н / Ф а р м а ко п е й н ы й го с у д а р с тв е н ­ н ы й к о м и т е т . В в е л . 0 5 .1 0 .8 5 . М . 1 9 8 5 . 4 с. П оступи л а после д о р аб о тки 10 м ая 2 0 1 2 г. A STU D Y ABO UT P R O D U C TIO N SAGE LEAVES EXTRACTS O P T IM IZ E D BY A M O U N T OF D IT E R P E N IC A C ID S A N D S T U D IN G T H E IR A N T IM IC R O B IA L A C T IV IT Y 8 Authors, 2013 R .Sh. K haziev, A .S . M a ka ro v a, L.T. Musina The purpose of this study was to produce a method of extraction from sage leaves with a high output of diterpenic acids and to learn the antimicrobial activity of these extracts. This study was done on sage leaves received from the retail pharmacy. The conditions pro­ viding high output of diterpenic acids, both in ethanolic and in aqueous extracts, were chosen. The estimation of antimicrobial activity of the received extract, measured using the culture of Staphylococcus aureus АТТС 6538-P, has shown direct relation between the amount of diterpenic acids in the extract and its antimicrobial activity. It is offered for the preparation of sage leaves infusions with high antibacterial activity to use 1 % solution of sodium hydrocarbonate instead of water. ВОПРОСЫ БИОЛОГИЧЕСКОЙ, МЕДИЦИНСКОЙ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, № 2, 2013 37
