IMMUNKA KOLLOK 2 i 3 (1)

1.Цитокины
1.Определение и классификация цитокинов.
2.Основные характеристики и механизмы действия цитокинов.
3.Понятие о системе цитокинов: клетки-продуценты, клетки-мишени,
рецепторы цитокинов.
4.Характеристика отдельных групп цитокинов: интерлейкины,
интерфероны, факторы некроза опухоли, колониестимулирующие
факторы и др.
5.Характеристика основных продуцентов цитокинов (макрофаги, Тh1 и
Th2 клетки, Tr)
6.Цитокиновая сеть, основные каскады антителогенеза,
цитотоксичности, гемопоэза, воспаления. (рисуете отдельно каждый
каскад с цитокинами и все)
7.ИЛ-1, характеристика, клетки-продуценты. Эффекты ИЛ-1 на клетки
иммунной системы. Системное действие ИЛ-1.
8.ИЛ-2, характеристика, клетки-продуценты, основные биологические
эффекты.
9.Семейства цитокиновых рецепторов. Структура рецептора ИЛ-2.
10.Провоспалительные цитокины, характеристика, участие в развитии
воспаления.
11.Фактор, ингибирующий миграцию макрофагов (МИФ), современные
представления о природе и действии фактора. Тест торможения
миграции макрофагов.
12.Трансформирующий фактор роста, значение в иммунных реакциях.
2.Иммунный ответ.
1. Фазы развития иммунного ответа ( природа антигена. локализация,
роль Тh).
2.Активация лимфоцитов: определение, условия активации, основные
исходы, основные этапы процесса активации. Иммунный синапс, роль в
активации.
3. Активация лимфоцитов, основные типы стимуляторов,
характеристика.
4. Распознавание антигена, взаимодействие АПК и Т лимфоцитов.
5.Основные пути трансдукции сигнала при взаимодействии антигена с
Т-клеточным рецептором.
6.Особенности активации В лимфоцитов.
7.Основные маркеры активации лимфоцитов.
3.Клеточная цитотоксичность
1. Типы клеточной цитотоксичности . Характеристика.
2.Характеристика цитотоксических Т-лимфоцитов: антигензависимая
дифференцировка (роль Th и АПК), механизмы цитотоксичности.
Методы оценки количественной и функциональной активности ЦТЛ.
3.Характеристика естественных киллеров, дифференцировка, механизм
цитотоксичности. Оценка активности ЕК.
4.Антителозависимая клеточная цитотоксичность, характеристика,
механизм. Оценка активности К-клеток.
5.Цитотоксическое действие макрофагов.
6.Механизмы апоптоза и некроза клеток.
4.Гуморальный иммунный ответ (ээвита)
1.Взаимодействие клеток при развитии гуморального иммунного ответа
на тимусзависимые антигены.
2. Гуморальный иммунный ответ на тимуснезависимые антигены.
3.Основные этапы дифференцировки АОК, синтезирующих IgG и
методы их выявления.
4.Основные этапы дифференцировки АОК, синтезирующих IgM и
методы их выявления.
5.Схема цитокиновой регуляции антителогенеза
6.Методы выявления АОК (варианты локального гемолиза, Elispot,
иммунофлюоресцентный анализ).
7.Метод определения количества АОК, синтезирующих IgG на
растворимый антиген у экспериментальных животных.
5.Реакции клеточного иммунитета
1.Развитие реакции ГЗТ, основные клеточные элементы, их роль.
2.Механизмы отторжения трансплантата.
3.Реакция трансплантат против хозяина. Условия, необходимые для
развития реакции.
6.Генетика иммуноглобулинов
1.Генетика иммуноглобулинов, пути формирования разнообразия.
2.Механизм изотопического переключения иммуноглобулинов.
Цитокиновая регуляция.
Колок 3
Культуры клеток. классификации клеточных культур
Фаговые дисплеи
1.Цитокины
1.Определение и классификация цитокинов.
ЦИТОКИНЫ - класс пептидных медиаторов, контролирующих процессы
развития клеток иммунной системы, их функционирования и взаимодействия
с другими системами организма.
Классификация:
1. Интерлейкины (ИЛ-1…36) - Группа иммунорегуляторных цитокинов,
осуществляющих взаимодействие между клетками иммунной системы, а также
их взаимодействие с другими системами организма.
● ИЛ-1 – иммунорегуляторный медиатор, выделяемый при
воспалительных реакциях, тканевых поражениях и инфекциях
(провоспалительный цитокин). Стимулирует пролиферацию и
дифференцировку многих клеток лимфоидной и нелимфоидной
природы. Воздействует на клетки гипоталамуса и вызывает синтез
простагландинов (повышение температуры тела, лихорадка и т.д.).
Стимулирует клетки печени к синтезу и продукции белков острой фазы.
● ИЛ-2 – активирует Т-лимфоциты, поддерживает их пролиферацию.
Активирует CD8+ Т-лимфоциты и NKклетки, запуская цитотоксическое
действие. Стимулирует пролиферацию и дифференцировку Влимфоцитов в плазматические клетки.
● ИЛ-3 – действует как гемопоэтический фактор роста, стимулирует
пролиферацию стволовых клеток.
● ИЛ-4 – Усиливает пролиферацию В-лимфоцитов, стимулирует их
дифференцировку. Переключает синтез иммуноглобулинов на
продукцию IgE. Работает как противовоспалительный цитокин
(подавляет реакции клеточного типа).
● ИЛ-5 – Стимуляция пролиферации и дифференцировки эозинофилов.
Переключает синтез иммуноглобулинов на продукцию IgА.
● ИЛ-6 – мощный провоспалительный цитокин. Синергически действует
вместе с ИЛ-1, участвует в системных воспалительных реакциях.
Стимуляция продукции АТ.
● ИЛ-10 – Противоспалительный цитокин: угнетение продукции
провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО и др.)
● ИЛ-17 - Семейство интерлейкинов 17 (IL17)-это семейство провоспалительных
цитокинов. они в основном продуцируются группой Т-х 17-клеток в ответ на их
стимуляцию IL-23. Биологическая функция ИЛ17А направлена на обеспечение
взаимодействия между врожденным и приобретенным иммунитетом. Однако ИЛ17А
синтезируется не только Th17-лимфоцитами, но и макрофагами, тучными клетками,
нейтрофилами и другими клетками врожденного иммунного ответа. Мишенями для
ИЛ17А являются клетки, экспрессирующие рецептор к ИЛ17, включая кератиноциты,
синовиоциты, фибробласты, эпителиальные клетки.
2. Интерфероны (ИФН-,,,, ИФН) - Иммунорегуляторные молекулы,
обладающие противовирусным действием.
Интерфероны I - ИФН-α, β, κ, δ, ε, τ, ω, ζ
активирует гены, некоторые из которых кодируют образование продуктов с прямым
антивирусным действием — протеинкиназы и 2'5'-олигоаденилат-синтетазы (рис. 10-5).
Рис. 10-5. Механизмы антивирусного действия ИФН I. A— в иеинфицированных
вирусом клетках ИФН вызывает развитие «антивирусного состояния», блокируя
проникновение в них вирусов.
Интерфероны II – ИФН-гамма
Интерфероны III – ИФН-λ1, λ2, λ3 (=ИЛ-28А, ИЛ-28B, ИЛ-29) сходно с
действием ифн I
3. Факторы некроза опухоли - Иммунорегуляторные цитокины,
обладающие прямым цитотоксическим действием на опухолевые клетки.
● ФНО-альфа
● лимфотоксин альфа = ФНО-бэта
● лимфотоксин бэта = ФНО-C
4. Колониестимулирующие факторы - Цитокины, регулирующие
пролиферацию и дифференцировку клеток иммунной системы.
-ГМ-КСФ, Г-КСФ, М-КСФ
-ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-7, ИЛ-9
5. Хемокины - Вызывают хемотаксис клеток в очаг воспаления.
С, СС, СХС (=ИЛ-8), СХХС, СX3C
6. Факторы роста - Цитокины, регулирующие рост и пролиферацию клеток
нелимфоидных тканей.
ТФР-бэта (TGF-β), инсулин-подобный фактор роста, ЭФР - эпидермальный
фактор роста, ФРФ - фактора роста фибробластов.
ТФР-β оказывает регулирующее влияние на рост и дифференцировку
трофобласта и иммуносупрессивное действие
2.Основные характеристики и механизмы действия
цитокинов.
3.Понятие о системе цитокинов: клетки-продуценты, клеткимишени, рецепторы цитокинов.Матвей
Клетки-продуценты цитокинов, клетки-мишени, цитокины и их
антагонисты формируют единую медиаторную сеть, объединяющую
клетки иммунной системы в иммунном ответ и воспалении.
Клетки продуценты: ((смотри 5 вопрос)
1. Во врожденном иммунитете -- фагоциты, ДК,
стимулированные патогенами через TLRs
2. В адаптивном -- Тh1 и Th2
Наиболее многочисленный тип — цитокиновые
гемопоэтиновые рецепторы. Для их внеклеточных доменов
характерно наличие 4 остатков цистеина и присутствие
последовательности, содержащей остатки триптофана и серина —
WSXWS. Домены семейства фибронектина, содержащие 4 остатка
цистеина, составляют основу рецепторов интерферонов.
Характерная черта доменов, образующих внеклеточную часть
рецепторов семейства TNFR, — высокое содержание остатков
цистеина («богатые цистеином домены»). Эти домены содержат 6
остатков цистеина.
Группа рецепторов, внеклеточные домены которых относят к
суперсемейству иммуноглобулинов, включает две группы —
рецепторы для IL-1 и несколько рецепторов, цитоплазматическая
часть которых обладает тирозинкиназной активностью.
Тирозинкиназная активность свойственна цитоплазматической
части практически всех ростовых факторов (EGF, PDGF, FGF и т.д.)
Наконец, особую группу образуют родопсиноподобные
рецепторы хемокинов, 7-кратно пронизывающие мембрану.
Однако не все полипептидные цепи рецепторов соответствуют этой
классификации. Так, ни α-, ни β-цепи рецептора IL-2 не относят к
семействам, представленным в табл. 2.29 (α-цепь содержит домены
контроля комплемента). В основные группы также не входят
рецепторы IL-12, общая β-цепь рецепторов IL-3, IL-5, GMCSF и
некоторые другие полипептидные цепи рецепторов.
Как правило, рецепторы представлены на поверхности покоящихся
клеток в небольшом количестве и нередко в неполном
субъединичном составе. Обычно в таком состоянии рецепторы
обеспечивают адекватный ответ только при действии очень высоких
доз цитокинов. При активации клеток число мембранных
рецепторов цитокинов увеличивается на порядки, более того, эти
рецепторы «доукомплектовываются» полипептидными цепями, как
это было показано выше на примере рецептора для IL-2. Под
влиянием активации число молекул этого рецептора значительно
возрастает и в их составе появляется α-цепь, ген которой
экспрессируется в процессе активации.
4.Характеристика отдельных групп цитокинов:
интерлейкины, интерфероны, факторы некроза опухоли,
колониестимулирующие факторы и др.Матвей
1. Интерлейкины (ИЛ-1…36) - Группа иммунорегуляторных цитокинов,
осуществляющих взаимодействие между клетками иммунной системы, а также
их взаимодействие с другими системами организма.
● ИЛ-1 – иммунорегуляторный медиатор, выделяемый при
воспалительных реакциях, тканевых поражениях и инфекциях
(провоспалительный цитокин). Стимулирует пролиферацию и
дифференцировку многих клеток лимфоидной и нелимфоидной
природы. Воздействует на клетки гипоталамуса и вызывает синтез
простагландинов (повышение температуры тела, лихорадка и т.д.).
Стимулирует клетки печени к синтезу и продукции белков острой фазы.
● ИЛ-2 – активирует Т-лимфоциты, поддерживает их пролиферацию.
Активирует CD8+ Т-лимфоциты и NKклетки, запуская цитотоксическое
действие. Стимулирует пролиферацию и дифференцировку Влимфоцитов в плазматические клетки.
● ИЛ-3 – действует как гемопоэтический фактор роста, стимулирует
пролиферацию стволовых клеток.
● ИЛ-4 – Усиливает пролиферацию В-лимфоцитов, стимулирует их
дифференцировку. Переключает синтез иммуноглобулинов на
продукцию IgE. Работает как противовоспалительный цитокин
(подавляет реакции клеточного типа).
● ИЛ-5 – Стимуляция пролиферации и дифференцировки эозинофилов.
Переключает синтез иммуноглобулинов на продукцию IgА.
● ИЛ-6 – мощный провоспалительный цитокин. Синергически действует
вместе с ИЛ-1, участвует в системных воспалительных реакциях.
Стимуляция продукции АТ.
● ИЛ-10 – Противоспалительный цитокин: угнетение продукции
провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО и др.)
2. Интерфероны (ИФН-,,,, ИФН) - Иммунорегуляторные молекулы,
обладающие противовирусным действием.
Интерфероны I - ИФН-α, β, κ, δ, ε, τ, ω, ζ. Синтезируются фибробластами и
моноцитами, связываются IFNAR(IFNAR1 и IFNAR2 субъединицы) рецептором.
Вызывают блок синтеза вирусной ДНК. Их продукция блокируется ИЛ10
Интерфероны II – ИФН-гамма. Выделяется цитотоксическими Тлимфоцитами, Th1. Блокирует прол.иферацию Th0 -> Th2. Индуцирует Th0 ->
Th1. Связывается IFNGR(IFNGR1 и IFNGR2 субъединицы)
Интерфероны III – ИФН-λ1, λ2, λ3 (=ИЛ-28А, ИЛ-28B, ИЛ-29)
3. Факторы некроза опухоли - Иммунорегуляторные цитокины,
обладающие прямым цитотоксическим действием на опухолевые клетки.
● ФНО-альфа
● лимфотоксин альфа = ФНО-бэта
● лимфотоксин бэта = ФНО-C
4. Колониестимулирующие факторы - Цитокины, регулирующие
пролиферацию и дифференцировку клеток иммунной системы.
-ГМ-КСФ, Г-КСФ, М-КСФ
-ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-7, ИЛ-9
5. Хемокины - Вызывают хемотаксис клеток в очаг воспаления.
С, СС, СХС (=ИЛ-8), СХХС, СX3C
6. Факторы роста - Цитокины, регулирующие рост и пролиферацию клеток
нелимфоидных тканей.
ТФР-бэта, инсулин-подобный фактор роста, ЭФР - эпидермальный фактор
роста, ФРФ - фактора роста фибробластов.
ТФР-β оказывает регулирующее влияние на рост и дифференцировку
трофобласта и иммуносупрессивное действие
5.Характеристика основных продуцентов цитокинов
(макрофаги, Тh1 и Th2 клетки, Tr)
1.Основные продуценты цитокинов в реакциях врожденного иммунитета –
макрофаги, моноциты, дендритные клетки. После взаимодействия
микроорганизмов или их компонентов с паттерн-распознающими рецепторами
(PRR) запускается синтез двух основных групп цитокинов –
провоспалительные цитокины и интерфероны I типа.
Провоспалительные цитокины – ИЛ1, ИЛ6, ИЛ8, ФНОα, хемокины
участвуют в развитии и регуляции воспаления и защищают организм от
бактериальных инфекций.
Интерфероны I типа осуществляют противовирусную защиту за счет того,
что:
❖ блокируют репликацию вируса. Связываются с рецепторами
неинфицированных клеток или клеток с началом репродукции вирусов,
стимулируют синтез в них не менее 12 антивирусных белков,
тормозящих репликацию вирусной ДНК и РНК и сборку вирусных
частиц;
❖ активируют функцию NK, осуществляющих лизис зараженных клеток;
❖ стимулируют презентацию вирусных антигенов
антигенпрезентирующими клетками.
2.В адаптивном иммунитете основные продуценты цитокинов – Тхелперы, прежде всего Т-хелперы 1 и 2 типа.
Направление дифференцировки Th0 в Th1 или Th2 в периферических
лимфоидных органах определяется многими факторами, такими как природа
антигена, тип дендритной клетки, набор цитокинов, синтезируемых
дендритной клеткой. Так, ИЛ12 стимулирует образование Th1, а ИЛ4 – Th2.
Для образования Th17 необходимы TFRβ и ИЛ12, а Treg – TFRβ и ИЛ6.
❖ Т-хелперы 1 типа (Th1) вырабатывают ИФγ, ИЛ2, ИЛ3, ФНОα,
ФНОβ, ГМ-КСФ, усиливающие клеточно-опосредованный иммунитет
цитотоксического и воспалительного типа, направленный против
вирусов, внутриклеточных патогенов и опухолей. Активируют
макрофаги. Избыточная выработка Th1-цитокинов играет важную роль в
развитии аутоиммунных реакций.
❖ Т-хелперы 2 типа (Th2) дифференцируются под действием ИЛ4,
который синтезируются дендритной клеткой в ответ не поступление
аллергенов, гельминтов, бактерий. Th2 синтезируют типичные для них
цитокины (ИЛ4, ИЛ5, ИЛ6, ИЛ10, ИЛ13, ИЛ21, ИЛ23, ГМ-КСФ),
индуцирующие развитие гуморального иммунного ответа. При избытке
ИЛ4, ИЛ5, ИЛ13 развиваются аллергические реакции.
Th1 и Th2 негативно регулируют активность друг друга. ИЛ4 и ИЛ10 подавляют
функцию Th1, а ИФγ угнетает функцию Th2.
❖ Th17 участвуют в реакциях воспаления и развитии аутоиммунных
реакций. IL-4
❖ Tfh-клетки (T-follicular helper) локализованы в В-клеточных
фолликулах регионарных лимфатических узлов. Вырабатывают ИЛ21,
стимулирующий развитие В-клеток в антителопродуценты.
❖ Treg (CD4+ CD25+) – регуляторные клетки, способные подавлять
функцию, как Th1, так и Th2 через синтез ТФРβ и ИЛ10. Таким образом,
многочисленные популяции Т-хелперов крайне важны для запуска и
поддержание иммунного ответа. Нарушение функции тех или иных
субпопуляций лежит в основе большинства патологий иммунной
системы, включая иммунодефициты, аутоиммунные и аллергические
заболевания.
3.Клетки соединительной ткани, эпителия, эндотелия секретируют
аутокринные факторы роста (фактор роста фибробластов, эпителиальный
фактор роста, ТФРβ) и цитокины, поддерживающие пролиферацию
гемопоэтических клеток (ИЛ7, ИЛ15).
6.Цитокиновая сеть, основные каскады антителогенеза,
цитотоксичности, гемопоэза, воспаления. (рисуете
отдельно каждый каскад с цитокинами и все)
или
7.ИЛ-1, характеристика, клетки-продуценты. Эффекты ИЛ-1
на клетки иммунной системы. Системное действие ИЛ-1.
IL-1 представляет собой систему из трех ЦК: IL-1α, IL-1β, IL-1Ra
(антагонист рецептора IL-1), и двух рецепторов R1 и R2. IL-1α и β кодируются
разными (хотя и тесно сцепленными) генами и различаются по структуре и рI (α
– 5,0; β – 7,0). Гомология их структуры составляет лишь 26%. Несмотря на
незначительную гомологию, IL-1α и β конкурируют за один и тот же рецептор.
Преобладающей формой IL-1 является IL-1β.
Биологические свойства IL-1α и β очень сходны, либо идентичны. IL1α активирует преимущественно Т-лимфоциты, обладает аутокринным и
паракринным действием, в то время как IL-1β – многофункциональный ЦК с
широким спектром действия, играет ключевую роль в развитии и регуляции
неспецифической защиты и специфического иммунитета, один из первых
включается в ответную защитную реакцию организма при действии патогенных
факторов.
Основными продуцентами IL-1β являются макрофаги и моноциты. В
синтезе данного ЦК также могут принимать участие лимфоциты, фибробласты.
Клетки-мишени – иммунокомпетентные, эндотелиальные, эпителиальные
клетки, фибробласты и др. IL-1β инициирует и регулирует воспалительные,
иммунные процессы, активирует нейтрофилы, Т- и В-лимфоциты, стимулирует
синтез белков острой фазы, ЦК (IL-2, -3, -6, TNF-α), молекул адгезии (Еселектинов), прокоагулянтов, простагландинов. IL-1β повышает хемотаксис,
фагоцитоз, гемопоэз, проницаемость сосудистой стенки, цитотоксическую и
бактерицидную активность, оказывает пирогенный эффект и др.
IL-1 участвует в регуляции температуры тела, а его повышенная продукция
приводит к развитию лихорадки. Известны факторы, снижающие
биологическую активность IL-1. К ним прежде всего относят глюкокортикоиды
и простагландины. Из экзогенных факторов следует указать циклоспорин А.
Эндотелиальные клетки сосудов человека под влиянием IL-1α и β секретируют
полипептиды, подобные тромбоцитарному фактору роста. Эти полипептиды
могут стимулировать клеточную миграцию и пролиферацию и вызывать
освобождение сосудистых медиаторов воспаления, что при значительном
увеличении указанных ЦК может привести к диссеминированной
внутрисосудистой коагуляции.
ИЛ-1 очень быстро активирует практически все типы клеток, участвующих в
формировании локальной воспалительной реакции, включая фибробласты,
эндотелий, резидентные макрофаги и все типы лейкоцитов крови.
ИЛ-1 регулирует функции эндотелия и системы свертывания крови
● индуцируя прокоагулянтную активность,
● синтез провоспалительных цитокинов,
● экспрессию на поверхности эндотелия адгезионных молекул,
обеспечивающих
прикрепление
нейтрофильных
лейкоцитов
и
лимфоцитов,
● стимулирует выход нейтрофилов в очаг воспаления.
ИЛ-1 влияет на ПМЯЛ (полиморфно-ядерные лейкоциты) активируя
их активность:
●
●
●
●
усиливая адгезию,
хемотаксис,
фагоцитоз,
продукцию свободных форм кислорода.
Прямо не влияя на перечисленные функции нейтрофильных гранулоцитов,
проявляет свое действие опосредованно путем индукции синтеза макрофагами,
эндотелиальными клетками и фибробластами других цитокинов, главным
образом ИЛ-8.
8.ИЛ-2, характеристика, клетки-продуценты, основные
биологические эффекты.
Интерлейкин-2 — иммунорегулятор, относится к семейству цитокингемопоэтинов.
Продуцируется активированными Т-хелперами (Th1). Проявляет
активность после связывания со специфическим клеточным рецептором ИЛ2R.
Основными продуцентами являются: активированные Th1 CD4+, а также
цитотоксические CD8+ лимфоциты.
Продукцию ИЛ-2 вызывают два типа сигналов:
1. Возникает при связывании TCR с антигеном в MHC
2. Возникает при связывании с поверхностью Т-лимфоцита молекулу CD28
или CTLA-4 с B7-2 и B7-1 расположенных на поверхности АПК.
Максимальная продукция наблюдается при воздействии обоих сигналов. При
воздействии только первого сигнала возникает анергия Т-лимфоиты,
приводящая к неспособности клетки отвечать на повторный антигенный
сигнал. В этом случае Ил2 может заменять 2ой сигнал и предотвращать
анергию.
ИЛ-2 оказывает пролиферирующее (за счет эффекта преодоления точки
рестрикции между фазами клеточного цикла G1a иG1b — главное препятствие
для поступления лимфоцитов в митоз) и активирующее воздействие на Тлимфоциты (киллеры) и В-клетки, а также на натуральные
киллеры. Воздействует также на моноциты несущие рецептор к нему,
усиливая генерация АФК и перекисей.
Иммунобиологическая роль заключается в регуляции типа и длительности ИО
за счет контроля пролиферации, дифференцировки и выживаемости
иммунокомпетентных клеток. Цитокиновая регуляция осуществляется по
аутокринному, паракринному или эндокринному механизмам. Участвует в
реакциях как адаптивного, так и врожденного иммунитетах.
ИЛ-2 также принимает участие во всех воспалительных и аллергических
реакциях, противоопухолевом иммунитете. Недавно появились сообщения о
существовании сходных циркулирующих в крови рецепторах (при
ВИЧинфекции, раке, отторжении трансплантатов, артрите отмечается
существенное увеличение уровня свободного рецептора).
ИЛ-2 содействует активности LAK-клеток («лимфокин-активированных
киллеров») и TIL-клеток («тумор-инфильтрирующих лимфоцитов»)
Продукцию ИЛ-2 подавлют глюкокортикоидные гормоны, оксимочевина,
простагландины, факторы, повышающие уровень цАМФ.
9.Семейства цитокиновых рецепторов. Структура
рецептора ИЛ-2.
По особенностям структуры полипептидных цепей выделяют несколько
групп цитокиновых рецепторов. В состав одного рецептора могут входить цепи,
относящиеся к разным семействам. Важность этой классификации обусловлена
тем, что для разных типов полипептидных цепей рецепторов характерны
разные тирозинкиназы, адапторные белки и транскрипционные факторы.
(Лимфотоксин альфа= TNF бета)
Практически все цитокиновые рецепторы (кроме иммуноглобулиноподобных,
обладающих киназной активностью, о них в самом конце написала) состоят из
нескольких полипептидных цепей. Нередко разные рецепторы содержат общие
цепи. Наиболее яркий пример — γ-цепь, общая для рецепторов IL-2, IL-4, IL-7,
IL-9, IL-15, IL-21, обозначаемая как γ(с). Дефекты этой цепи играют важную
роль в развитии иммунодефицитной патологии (Х-сц ТКИН). Общая β-цепь
входит в состав рецепторов GM-CSF, IL-3 и IL-5. Общие цепи имеют IL-7 и TSLP
(α-цепь), а также IL-2 и IL-15, IL-4 и IL-13 (в обоих случаях — β-цепь).
Структура рецептора к ИЛ-2:
Все полипептидные цепи, входящие в его состав, участвуют в формировании
связывающего участка для IL-2.
3 варианта этого рецептора с разным сродством к IL-2
(низким, промежуточным и высоким).
● Отдельно экспрессируемая α-цепь способна связывать IL-2 с низким
сродством (Кd=10⁻ ⁸ М), но не способна передавать сигнал в клетку (см.
рис: на нем нет Як-киназы)
● Димер βγ обладает промежуточным сродством к IL-2 (Kd=10⁻ ⁹ M); этот
вариант присутствует на покоящихся клетках и NK, причем на NK он
передает сигнал.
● Активированные Т-клетки, а также Т-reg и некоторые NK экспрессируют
высокоаффинный тримерный рецептор состава αβγ с Kd=10⁻ ¹º М.
Как правило, цитокиновые рецепторы представлены на поверхности
покоящихся клеток в небольшом количестве и в неполном субъединичном
составе. Обычно в таком состоянии рецепторы обеспечивают адекватный ответ
только при действии очень высоких доз цитокинов. При активации клеток
число мембранных рецепторов цитокинов увеличивается на порядки, более
того, эти рецепторы «доукомплектовываются» полипептидными цепями, как
это было показано выше на примере рецептора для IL-2.Под влиянием
активации число молекул этого рецептора значительно возрастает и в их
составе появляется α-цепь, ген которой экспрессируется в процессе активации.
Благодаря таким изменениям лимфоцит приобретает способность
пролиферировать в ответ на действие IL-2.
Рецепторы, обладающие собственной киназной активностью (относящихся к
суперсемейству иммуноглобулинов). В состав С-концевой цитоплазматической
части входит домен, обладающий активностью тирозинкиназы. Например: cFms - киназа рецептора M-CSF, c-Kit - киназа рецептора SCF, киназа
гемопоэтического фактора — Flt-3 (Fms-like thyrosine kinase 3). Эти рецепторы,
обладающие собственной киназной активностью, запускают передачу сигнала
непосредственно (их киназа обусловливает фосфорилирование как самого
рецептора, так и прилежащих к нему молекул).
Еще пример: передача сигнала через домен TIR, общий для рецептора IL-1 и
TLR.
Вот пример тримера с сигнальными путями.
10.Провоспалительные цитокины, характеристика, участие
в развитии воспаления.
Выделяют 3 основных представителя группы провоспалительных цитокинов —
TNF, IL-1 и IL-6; относительно недавно к ним были добавлены IL-17 и IL-18.
Эти цитокины продуцируются в основном активированными
моноцитами и макрофагами преимущественно в очаге воспаления.
Провоспалительные цитокины могут вырабатываться также эпителиальными,
эндотелиальными клетками, нейтрофилами, дендритными клетками,
активированными В-, NK- и Т-лимфоцитами.
В очаге проникновения патогенов цитокины первыми начинают синтезировать
немногочисленные местные воспалительные макрофаги. Затем в процессе
эмиграции лейкоцитов из кровотока численность клеток-продуцентов
возрастает и их спектр расширяется. В частности, к синтезу провоспалительных
цитокинов подключаются стимулированные продуктами микроорганизмов и
факторами воспаления эпителиальные, эндотелиальные, синовиальные,
глиальные клетки, фибробласты.
Гены цитокинов относят к индуцибельным. Естественные индукторы их
экспрессии — патогены и их продукты, действующие через TLR и другие
патогенраспознающие рецепторы. Классический индуктор — бактериальный
ЛПС. В то же время некоторые провоспалительные цитокины (IL-1, TNF) сами
способны индуцировать синтез провоспалительных цитокинов.
Провоспалительные цитокины синтезируются и секретируются достаточно
быстро, хотя кинетика синтеза различных цитокинов этой группы
неодинакова. В типичных случаях (быстрый вариант) экспрессию их мРНК
отмечают через 15–30 мин после индукции, появление белкового продукта в
цитоплазме — через 30–60 мин, содержание его во внеклеточной среде
достигает максимума через 3–4 ч. Синтез цитокинов конкретной клеткой
продолжается довольно непродолжительное время — обычно немногим
больше суток. Не весь синтезируемый материал секретируется. Некоторое
количество цитокинов экспрессируется на поверхности клетки или содержится
в цитоплазматических гранулах. Выброс гранул могут вызывать те же
активирующие сигналы, что и продукция цитокинов. Это обеспечивает быстрое
(в течение 20 мин) поступление цитокинов в очаг поражения.
Основная роль — «организация» воспалительной реакции. Один из наиболее
важных и ранних эффектов провоспалительных цитокинов — усиление
экспрессии молекул адгезии на эндотелиальных клетках, а также на самих
лейкоцитах, что приводит к миграции в очаг воспаления лейкоцитов из
кровяного русла. Кроме того, цитокины индуцируют усиление кислородного
метаболизма клеток, экспрессии ими рецепторов для цитокинов и других
факторов воспаления, стимуляцию выработки цитокинов, бактерицидных
пептидов и т.д. Провоспалительные цитокины оказывают преимущественно
местное действие. Попадание избыточно секретируемых провоспалительных
цитокинов в циркуляцию способствует проявлению системных эффектов
воспаления, а также стимулирует выработку цитокинов клетками,
отдаленными от очага воспаления. На системном уровне провоспалительные
цитокины стимулируют продукцию белков острой фазы, вызывают повышение
температуры тела, действуют на эндокринную и нервную системы, а в высоких
дозах приводят к развитию патологических эффектов (вплоть до шока,
подобного септическому).
11.Фактор, ингибирующий миграцию макрофагов (МИФ),
современные представления о природе и действии
фактора. Тест торможения миграции макрофагов.
Фактор ингибирования миграции макрофагов (MIF) — один из первых
открытых цитокинов. Он был назван по первоначально открытой функции,
хотя он останавливает миграцию и гранулоцитов, и моноцитов, и макрофагов.
Благодаря такому действию этот цитокин способствует аккумуляции клеток в
очаге воспаления. Кроме того, у MIF описаны и другие свойства
провоспалительного цитокина. Наряду с TNF-a и IL-1 участвует в каскаде
реакций эндотоксического шока, возможно, контролируя уровень TNF-a
участвует в качестве эффекторной молекулы в развитии клеточного иммунного
ответа, реакций ГЗТ.
Тест торможения миграции Мф (иногда говорят в целом про
торможение миграции лейкоцитов, РТМЛ):
Торможение миграции макрофагов происходит под влиянием специфического
антигена. Существует несколько модификаций теста, наиболее
распространенный капиллярный. В лунку с питательной средой помещают
отрезок капилляра, заполненный клетками, и добавляют в нее испытуемый
антиген. После культивирования клеток в течение 24 ч при 37гр измеряют
один из параметров мигрировавших из капилляра клеток (диаметр, площадь
миграции и др.). Отношение опытного параметра к контрольному (без
антигена) составляет индекс миграции. Реакция считается положительной,
если опытные и контрольные показатели различаются более чем на 20%.
Описаны методы оценки миграции клеток из капли агарозы, содержащей
клетки, и миграции клеток из лунки под агарозу. В качестве тестируемых
клеток в клинике наиболее часто используют лейкоциты крови, а в
эксперименте макрофаги (в сборнике лаб брали перитонеальные Мф мышки,
например) и иногда лимфоциты. Тормозят миграцию клеток медиаторы,
выделяющиеся из сенсибилизированных к данному антигену лимфоцитов,
которые всегда присутствуют во взвеси испытуемых клеток: фактор
торможения миграции макрофагов (MIF), фактор торможения миграции
лейкоцитов (LIF) и др. Реакции торможения миграции макрофагов и
лейкоцитов отражают состояние ГЗТ.
В самом сборнике лаб другая модификация этого теста, с культурой клеток
(мне совсем не нравится):
MIF и глюкокортикоиды (ГК). В физиологических концентрациях ГК индуцируют
секрецию MIF макрофагами и Т-лимфоцитами, хотя секрецию других
провоспалительных цитокинов те же глюкокортикоиды подавляют. Очевидно, MIF
контролирует противовоспалительные эффекты глюкокортикоидов. Уровень MIF
может повышаться вследствие глюкокортикоидной терапии. Повышенный уровень
MIF контролирует иммуносупрессирующие эффекты эндогенных или введенных для
лечения ГК. Отсюда анти-MIF стратегия может быть полезна для повышения
иммуносупрессивного и противовоспалительного действия ГК.
12.Трансформирующий фактор роста, значение в
иммунных реакциях.
Трансформирующий фактор роста β (TGFβ). Свое название он получил в связи
со способностью индуцировать «трансформированный» фенотип у
нормальных клеток, растущих в культуре (потеря контактного торможения,
отделение от субстрата, реорганизация цитоскелета).
Он представляет собой гомодимер (молекулярная масса — 25 кДа).
Продуцентами TGFβ служит огромное число клеток, включая стромальные,
эпителиальные клетки, макрофаги, регуляторные Т-лимфоциты, многие
разновидности опухолевых клеток.
Он секретируется в неактивной форме: требуется протеолитическое
расщепление молекулы, чтобы она приобрела способность взаимодействовать с
высокоаффинными рецепторами. Последние содержат 2 цепи. Связывание
цитокина приводит к активации киназной активности внутриклеточного
домена цепи TGFβRII, вследствие чего происходят олигомеризация и
фосфорилирование цепей I и II и активация транскрипционных факторов
Smad2 и Smad3, а также запуск Smad-независимых путей активации клетки
включающих МАР-киназы и фосфоинозитид-3-киназу, а также факторы
RUNX-1 и RUNX-3.
Мишенями фактора служат также очень многие виды клеток,
экспрессирующие высокоаффинный рецептор TGFβ.
При действии TGFβ на иммунную систему преобладают ингибирующие
эффекты. Он подавляет пролиферацию Т- и В-клеток, иммунный ответ
цитотоксического и воспалительного типа, синтез воспалительных цитокинов,
ответ Т-лимфоцитов на ростовые цитокины, дифференцировку
цитотоксических Т-лимфоцитов, активность естественных киллеров. В то же
время TGFβ способствует развитию незрелых макрофагов, клеток Лангерганса
и дендритных клеток, мобилизации нейтрофилов и моноцитов в очаг
воспаления. Он усиливает синтез белков межклеточного матрикса, ускоряет
заживление ран, оказывает анаболический эффект. TGFβ способствует
переключению синтеза антител на изотип IgA и усиливает синтез этого
иммуноглобулина на посттранскрипционном уровне, тем самым способствуя
защите слизистых оболочек. TGFβ — фактор, необходимый для развития
провоспалительных Th17-клеток и супрессорных естественных регуляторных Тклеток. Являясь продуктом естественных и адаптивных регуляторных Т-клеток,
он отвечает за реализацию многих их эффектов. Выключение гена TGFβ
обусловливает развитие генерализованной воспалительной патологии с
гиперплазией лимфоидной ткани в кишечнике в сочетании с системными
аутоиммунными процессами. TGF оказывает комплексное влияние на
эффекторные клетки в ходе аллергических процессов. С одной стороны,
цитокин способен стимулировать хемотаксис и в то же время блокировать
экспрессию рецепторов FcRI тучными клетками. С другой — TGF принимает
участие в конверсии наивных CD4+CD25– T-клеток в функциональные
регуляторные Т-лимфоциты, индуцируя экспрессию FOXP3. Предполагается,
что TGF, продуцируемый эозинофилами и резидентными клетками тканей,
играет важную роль в восстановлении поврежденных клеток дыхательных
путей при астме. Он стимулирует синтез коллагена и подавляет продукцию
коллагеназы.
Кратко: TGFβ — важный супрессорный цитокин, подавляющий
преимущественно воспалительные процессы и связанные с ними формы Тклеточного иммунного ответа. Он служит важным регулятором системы
иммунитета, предотвращающим аутоиммунные процессы. В то же время TGFβ
способствует развитию воспалительных клеток и реализации начальных этапов
воспалительного процесса, а также регенерации тканей.
2.Иммунный ответ.
1. Фазы развития иммунного ответа ( природа антигена.
локализация, роль Тh).
Развитие иммунного ответа включает 2 фазы:
1.Индуктивную. Реализуется в течение 5-7 суток после попадания антигена в
организм, заключается в формировании эффекторных Т- и В- лимфоцитов и
клеток памяти, включает следующие процессы:
● переработка и презентация антигена антигенпрезентирующей клеткой
(АПК);
● распознавание антигена при взаимодействии АПК и Т-лимфоцита;
● активация и пролиферация специфического клона Т-лимфоцитов;
● дифференцировка лимфоцитов, направленная на формирование
эффекторных функций и клеток памяти.
2.Эффекторную. Длится около 2-х недель, заключается в реализации
клеточного и гуморального иммунного ответа, элиминации антигена и
формировании клеток памяти.
Антигены - вещества, несущие признаки чужеродной генетической
информации, которые при попадании в организм способны индуцировать
иммунный ответ, направленный на их удаление
Природа антигена:
● Про происхождению
○ Ксеноантигены - антиген другого биологического вида
■ Видоспецифичные антигены
■ PAMP
○ Аллоантигены - антиген другой особи того же вида
○ Изоантиген - антиген биологического клона
○ Аутоантигены - компоненты собственного организма
■ DAMP
● По химичес кой природе
● По физико-химическим свойствам
○ Корпускулярные
Частицы вирусов, бактериальные клетки, пыльца
Несут множество простых эпитопов
○ Растворимые
Бактериальные токсины, зоотоксины
❖ Вирусы, опухоли, трансплантационные АГ, внутриклеточные патогены
вызывают клеточный ИО.
❖ Аллергены, АГ бактерий и гельминтов вызывают гуморальный ИО.
Тh — Т-лимфоциты, главной функцией которых является усиление
адаптивного иммунного ответа. Активируют Т-киллеры, В-лимфоциты,
моноциты, NK-клетки, презентуя им фрагменты чужеродного Аг при прямом
контакте, а также гуморальном, выделяя цитокины. Основным
фенотипическим признаком Тh служит наличие CD4. Th распознают Аг при
взаимодействии TCR с Аг, связанным с молекулами MHC2.
Выделяют:
● Th0 — наивные, недифференцированные Т-хелперы.
● Th1 — преимущественно способствуют развитию клеточного ИО,
активируя макрофаги, через цитокины. Основной продуцируемый
цитокин — ИФН-гамма.
● Th2 — участвуют в гуморальном ИО, противопаразитарном и
аллергических реакциях. Продуцируют ИЛ-4, 5, 13. Располагаются в
тканях, а не в герминативных центрах лимфоузлов.
● Th3 (T-reg) — экспрессируют на поверхности CD25 и транскрипционный
фактор Foxp3, секретируют Ил-10 и трансформирующий фактор-бета
(TGF-бета) и подавляют ИО.
● Th17 — подтип Т-хелперов, который в больших количествах продуцирует
провоспалительный цитокин — Ил-17. Могут принимать участие в
развитии аутоиммунной патологии.
● Th22 — выявлены при воспалительных заболеваниях кожи, значение их
не ясно. Продуцируют провоспалительный цитокин — Ил22
2.Активация лимфоцитов: определение, условия
активации, основные исходы, основные этапы процесса
активации. Иммунный синапс, роль в активации.
Активация клеток (в общем смысле) - их переход из состояния покоя в
функционально активное состояние. Для лимфоцитов активация означает
вход в клеточный цикл, при этом их любой функциональной активности
должно предшествовать их деление. Исключение: NK-клетки - их активация
не означает начало пролиферации, но означает переход в состояние готовности
выполнять свою цитотоксическую функцию.
Условия активации:
1. Плотная адгезия АПК и Т-клетки, правильно организованный
иммунный синапс.
2. Контакт с антигеном, встроенным в MHC, к которому есть аффинность.
TCR/CD8+ - с АГ в MHC-I, TCR/CD4+ - с АГ в MHC-II.
3. Контакт с антигеном, встроенным в MHC профессиональной
антигенпрезентирующей клетки - чтобы были костимулирующие
сигналы (стандартно: CD28 с CD80/CD86). Без костимулирующих
сигналов активации не будет, молекулы, поставляющие
костимулирующие сигналы, есть только на АПК.
Исходы активации: Как говорится, есть два стула… (а на самом деле даже
целых три)
У TCR есть два ITAM фрагмента. Нас интересует только их дзета-цепь, на
которой расположены три сайта фосфорилирования.
Случай 1: сигнала нет - фосфорилирования не происходит - клетка идет в
апоптоз
Случай 2: сигнал не достаточен - фосфорилирование только одного из сайтов клетка продолжает жить, но активации не происходит (фосфорилирование
одного сайт необходимо для поддержания жизнеспособности клетки!!!)
Случай 3: сигнал достаточен - происходит фосфорилирование всех трех сайтов
- клетка активирована
Этапы активации:
см. вопрос ниже, там расписано
Иммунный синапс.
Возникает между АПК (мы рассматриваем первичный и. о., поэтому можно
сказать зрелая ДК) + Th. Все это нужно нам для презентации Th антигена.
Нахера вообще этот синапс:
1. устраняются стерические помехи для взаимодействия клеток
2. образование контакта и его стабилизация молекулами адгезии (CD58 и
CD2)
3. оптимизация активирующего сигнала
3 стадии формирования:
Поляризация клеток.
В процессе сближения клетки направляют хемокины (ДК: CCL19, CCL21 и CCL7
у Th). Происходит ориентация мембранных и внутриклеточных компонентов > облегчение установления контактов и передачи сигнала. Есть лидирующий и
хвостовой концы. Принимают участие актиносодержащие компоненты
цитоскелет.
Формирование первичного контакта.
Требуется остановка движения клеток (передаются сигналы от ТКР и СД4).
Происходит перераспределение мембранных молекул: в лидирующий конец
выходит ICAM (DK) и бета2-интегрин (LFA1) у Th. плюс сд58 и сд 2
соответственно. Зона адгезивного взаимодействия окружена ТКР(альфабета) и
МНС2
Зрелый контакт.
ТКР и МНС2 вытесняют молекулы адгезии на переферию. Привлекаются
корецепторы, киназы и прочие белки. Все эти штуки нужно обзывать рафтами
(это сд8 сд4, Lck киназа, сд28, LAT и прочая хуета) – молекулы не
растворяются в детергентах и при установлении контакта рафты
перемещаются на переферию.
!TCR рафтом не является, но связан лиюо сд4 либо сд8 (в зависимости от того,
какой лимфоцит) и именно за их счёт передвигается в центр синапса.
3. Активация лимфоцитов, основные типы стимуляторов,
характеристика.
https://medach.pro/post/1541 здесь хорошо написано про активацию Т
Под активацией понимают индукцию выживаемости клеток, их
пролиферацию, перестройку цитоскелета, изменение метаболической
активности, изменение экспрессии генов. Для активации Т-клеток
требуется формирование трех транскрипционных факторов — NF-AT, NFκB и AP-1.
Активаторы: CD28, CD30-CD30L, OX40-OX40L, ICOS
Главным рецептором Т-лимфоцитов является CD28, его несут все наивные Тлимфоциты. Лигандами CD28 на АПК являются CD80 и CD86. Связывание CD28 с
лигандами приводит к активации фосфолипазы С, Akt и Vav, т.е. усиливает
большинство эффектов TCR сигналинга. Все они возможны только при сочетании двух
сигналов. Рецепторы семейства TNF (OX40, 4-1BB, CD30, and CD27) — главные костимулирующие рецепторы В-лимфоцитов - активируют Akt и NFκB. Кроме того, в
качестве стимуляции может выступить непосредственное взаимодействие патогена с
распознающими рецепторами такими, как TLR.
ICOS (inducible T-cell co-stimulator) — член семейства рецепторов CD28 — другой
важный ко-стимулирующий рецептор. Сейчас он активно рассматривается в контексте
лечения реакции "трансплантат-против-хозяина". Помимо усиления
противоопухолевого Т-клеточного ответа, данный рецептор может активировать Трегуляторные клетки и, следовательно, вносить вклад в иммуносупрессию. Недостаток
ICOS вызывает иммунодефициты с широким спектром клинических проявлений,
включая повышенную предрасположенность к инфекционным заболеваниям и
злокачественным опухолям
4. Распознавание антигена, взаимодействие АПК и Т
лимфоцитов.
молекулы АПК
молекулы Т-лимфоцита
Установка иммунного синапса:
1. Под действием цитокинов, вырабатываемых АПК (CCL19, CCL21),
действующих на рецептор CCR7 на Т происходит их сближение и
поляризация самих клеток: ориентация цитоскелета и др.
внутриклеточных компонентов так, чтобы облегчить дальнейший обмен
сигналами.
2. Адгезивные взаимодействия, чтобы клетки закрепились рядом друг с
другом. DC-SIGN + ICAM-1,2,3 | ICAM-1,2,3 + LFA-1 | LFA-1 + ICAM-1,2,3 |
CD58 + CD2.
3. Адгезия успешна → АГ-распознающее взаимодействие TCR + MHC/АГ. Тхелперы (TCR/CD4+) - с MHC-II. Т-киллеры (TCR/CD8+) - с MHC-I. Будет,
если TCR подходит по аффинности. Распознавание антигена - контакт
TCR с комплексом MHC/АГ, запускающий такие изменения в TCR,
которые приводят к запуску внутриклеточных каскадов, приводящих к
развитию у Т-лимфоцита эффекторной активности при условии наличия
костимулирующих сигналов.
4. АГ-распознающее взаимодействие успешно → костимулирующие
взаимодействия: CD28 + CD80 / CD86. Если костимулирующее
взаимодействие не прошло, а АГ-распознающее - прошло, лимфоцит
уходит в анергию. Если костимуляция есть, всё случается и в Тлимфоците запустятся процессы, приводящие к развитию эффекторной
активности.
5. Трансдукция сигнала, активация лимфоцита.
Вопрос вроде сам по себе всё, но походу предполагает много дополнительных.
5.Основные пути трансдукции сигнала при взаимодействии
антигена с Т-клеточным рецептором.
Для Т-хэлперов:
TCR (по-русски - ТКР) + MHC/АГ →
→ Конформационные изменения ТКР →
→ Активация тирозинкиназ, с ним ассоциированных: Lck (у CD4), Fyn (y
CD3). Это киназы семейства Src. Имеют домены: SH1 - с ферментативной
активностью; SH2 и SH3 - взаимодействуют с другими киназами и адапторными
белками. →
→ дефосфорилирование SH2 домена (до этого он был гиперфосфорилирован,
для работы надо немного убавить) →
→ фосфорилирование: ауто; других киназ (--> какие-то процессы другие,
которые мы не обговаривали, плюс тоже путь к ZAP-70); ТКР по ИТАМпоследовательностям (ITAM - активирующие последовательности) дзета цепей
→
→ фосфорилированные дзета взаимодействуют с остатками тирозина в
домене SH2 тирозинкиназы ZAP-70 →
→ фосфатная группа становится для них общей →
→ фосфорилирование ферментативного домена ZAP-70 →
→ ZAP-70 активируется →
→ активирует LAT. LAT - линкер активации Т-клеток. Является адапторным
белком, эта функция включается после фосфорилирования: после
фосфорилирования он приобретает способность связывать все остальные
белки (SLP-76 и др., см. ниже) для того, чтобы они смогли
провзаимодействовать друг с другом и запустить сигнал дальше. →
1. → Комплекс LAT, SLP-76, Vav, Sos, Grb2 как-то называется. ???как??? Но
суть в том, что все эти белки “собраны” на белке LAT. Именно от этого
комплекса идёт самая большая группа сигналов (три из пяти основных):
три MAP-каскада, там всё какие-то киназы киназ киназ…,
заканчивающиеся образованием транскрипционного фактора AP-1.
Экспрессия активируемых им генов приводит к синтезу Т-клеткой IL2 и рецептора к нему.
2. → Активированный LAT приводит к активации фосфолипазы С гамма
(PLCy), которая катализирует расщепление находящегося в мембране
фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата (PIP2) на остающийся в мембране
1,2-диацилглицерол и свободный инозитолтрифосфат (IP3, ИТФ) → ИТФ
взаимодействует со своими рецепторами на эндоплазматическом
ретикулуме → а это кальциевые каналы → кальций выходит из ЭПР в
цитоплазму → (в это время, чтобы кальция в цитоплазме стало ещё
больше, происходит следующее: истощение кальция внутри ЭПР
приводит каким-то образом к агрегации находящихся в мембране ЭПР
белков STIM1, агрегированные STIM1 связываются с каналами ORAI, что
в мембране клеточной, и через эти каналы в цитоплазму входит ещё и
внеклеточный кальций) → в цитоплазме много кальция → кальций
активирует белок кальциневрин - это фосфатаза(кальцийкальмодулинзависимая), после активации дефосфорилирующая
цитоплазматический компонент транскрипционного фактора NF-AT →
NF-AT свободен действовать как ТрФ. Экспрессия активируемых им
генов приводит к синтезу Т-клеткой IL-2, GM-CSF, IL-3 и IFN-γ.
Это были пути от ТКР. А есть ещё самый главный для собстна активации путь от костимулирующего взаимодействия через CD28:
С CD28 ассоциирована фосфатидилинозитол-3-киназа (PI3K) → она активирует
белок Vav, который связан с цитоскелетом и за счёт этого, будучи активным,
транспортирует PKC-тета (протеинкиназа С тета) → дальше каскад см. на
картинке → выключается ингибиторный белок IkB комплекса NEMO → без
ингибитора происходит становление Nf-kB как транскрипционного фактора,
он мигрирует в ядро. Экспрессия активируемых им генов приводит к синтезу
Т-клеткой IL-2 и рецептора к нему.
Сигнал от CD28 также влияет на запуск всех трёх MAP-каскадов, т.к. от этого
сигнала зависит активность Vav, а Vav входит в тот белковый комплекс, с
которого запускаются MAP-пути.
Самое главное из того, ради чего всё это было - IL-2 и IL-2R (CD25):
IL-2 + CD25 → формирование циклин-киназных комплексов → движение клетки
по клеточному циклу → митоз → пролиферация клона → примерно
одновременно с этим клон проходит дифференцировку: либо в Th1, либо в Th2,
либо в Th17, либо в какие там ещё есть, но наверное это уже другой вопрос:
● В Тх1, если: крайние дозы антигена, повышенное сродство АГ к
ТКР → ТрФ Т-бет, STAT-4 (← IFNy, IL12 (через Jak) ← зрелая ДК) →
продукция Ifny, IL2, IL12, TNF, GM-CSF → работа как Тх1: участие в
пролиферации и дифференцировке Тк; выделение цитокинов для
привлечения всякого врождённого иммунитета (макрофагов
особенно).
● В Тх2, если: средние дозы антигена, ниже сродство АГ к ТКР,
присутствует гистамин → ТрФ STAT-6 ( ← IL4), GATA3 ( ← TCR) →
продукция IL4,5,6,9,10,13 → участие в активации В-лимфоцитов и
эозинофилов.
● В Тх17, если: подействовали такие цитокины, как IL6,23,1,18 → ТрФ
RORc → продуцируют ИЛ17 → он привлекает нейтрофилы.
Для Т-киллеров:
Всё то же самое, только CD8 вместо CD4 и очень нужен IL-2, вырабатываемый
Th1, для нормальной пролиферации и нормального превращения в
цитотоксический Т-лимфоцит. У них результатом образования
транскрипционных факторов, помимо темы IL-2 и других
противоапоптотических сигналов, будет также экспрессия генов,
ответственных за образование гранул с перфорином, гранзимом, гранулизином
и всем таким.
Также суть того, чтобы именно Т-хэлперы были первыми, в том, что они после
своей активации будут выделять цитокины-хемокины, привлекающие к
причинному месту уже Т-киллеров, где те пройдут всё необходимое. И не
только Т-киллеров, но и кого-нибудь ещё в зависимости от того, в какой
именно подтип Т-хэлпер дифференцировался.
6.Особенности активации В лимфоцитов.
Первая особенность состоит в том, что есть как бы два этапа активации:
“предактивация” чисто от взаимодействия с АГ, запускающая процессы,
которые позволят случиться реальной активации, и сама реальная активация,
запускаемая взаимодействием с активированным тем же антигеном Тлимфоцитом.
Вторая - в сложной миграции для завершения полноценной дифференцировки
в плазматическую клетку, продуцирующую конкретные антитела (АТ) против
конкретного антигена (АГ).
Третья - “помогают” провзаимодействовать с АГ им особые клетки фолликулярные дендритные клетки. И они обеспечивают им хемокины для
миграции.
Этап 0: карта мира:
Есть иммунный орган. Селезёнка или лимфоузел. В нём есть В-клеточные (Взависимые) зоны и Т-клеточные (Т-зависимые) зоны.
АГ попадает в организм, путешествует в крови , оказывается в этом органе
(или Аг в области входных ворот сразу ловят обычные ДК и транспортируют в
лимфоузел) и:
1. Накапливается в Т-клеточной зоне.Там он встречается с самыми
обычными местными дендритными клетками, они его перерабатывают и
выставляют в составе MHC для презентации Т-лимфоцитам.
2. В В-зависимой зоне встречается с В-лимфоцитами и с фолликулярными
дендритными клетками В-зоны (ФДК). ФДК его перерыбытывают,
“хранят” длительное время на поверхности в особых белковых
комплексах (иккосомах) и предоставляют В-лимфоцитам, чтобы те уже
работали с этим АГ.
Этап 1.1: Т-зависимая зона:
1. ДК презентирует АГ Тh0.
2. Тh0 активируются.
3. Помимо всего, что как обычно является следствием активации, они вопервых не проходят полную дифференцировку в Th1 или Th2, а
становятся недо-то и недо-это - T-fn лимфоцитами, а во-вторых
начинают экспрессировать рецепторы CXCR5. Это - рецепторы к
хемокину CXCL12, который вырабатывают ФДК, находящиеся в Вклеточной зоне.
4. Двигаясь по этому хемокиновому градиенту, T-fn мигрируют к границе
Т-клеточной зоны и пока ждут.
Этап 1.2: В-зависимая зона:
1. BCR + АГ → конформационные изменения BCR, агрегация BCR →
конформационные изменения CD79a/b → активация Src-киназ,
сигнальные пути (вроде те же MAP, PKC и IP3 до тех же AP-1, Nf-kB и
NFAT соответственно) → это усиливает экспрессию MHC-II, CD28 и
рецепторов CXCR5 (рецептор к CXCL12, который вырабатывается
местной стромой и ФДК), CCR7 (рецептор к CCL19 и CCL21, которые
вырабатываются дендритными клетками Т-зависимой зоны) и EBI2 →
всё это обеспечивает ему повышение способности к работе в качестве
антигенпрезентирующей клетки и миграцию на границу В-клеточной
зоны.
2. Также АГ интернализуется в клетку в составе рецептора, там
перерабатывается и принимает вид, в котором сможет выходить в
составе MHC.
Этап 2: встреча:
1. И Т-fn, и предактивированные В-лимфоциты с кучей АГ, торчащих из
кучи MHC-II, двигаясь по градиентам своих хемокинов благодаря тому,
что антигенная активация привела к формированию у них рецепторов к
этим хемокинам, встречаются на границе своих зон и начинают
взаимодействовать.
2. Адгезия.
3. Антигенраспознающее взаимодействие: [MHC-II/АГ на В-лимфоците] +
[TCR/CD4 на T-fn лимфоците].
4. Костимулирующее взаимодействие первое: [CD28] + [CD80/86] → T-fn
начинают:
a. Секретировать IL-21. IL-21:
i.
Аутоактивирует T-fn.
ii.
Секретирует IL-6, TGF-B, IFN-y, IL-4. Они нужны будут
потом, для поставления сигналов, которые будут
регулировать тип продуцируемого антитела.
iii.
Воздействует через свои рецепторы (которые тоже уже
должны там иметься) на В-лимфоцит → активация в нём
STAT-3 → ***.
b. Экспрессировать CD154. Это лиганд для находящейся на Влимфоците CD40.
5. Костимулирующее взаимодействие второе: [CD40] + [CD154]. Это
запускает процессы в В-лимфоците, как и всегда этих процессов много,
основные:
a. Активация неканонического сигнального пути для Nf-kB через NIK
(это Nf-kB индуцирующая киназа) → Nf-kB в ядро, как ТрФ →
экспрессия гена молекулы Bcl-2 → ***.
i.
На активацию этого пути влияет также путь, начинающийся
с белка TRAF-3, который активируется в результате
взаимодействия В-лимфоцита с BAFF (BAFF - фактор
активации В-клеток, рецептор к нему - CD268), который
секретируют ФДК.
b. CD40 ассоциирована с белками TRAF1,2,6. Через них идёт каскад,
смешивающийся с каскадами от BCR (да, чуть-чуть Ярилина, но только в
плане каскадов - в Джанвее с ними чё-т как-то не очень понятно, есть они вообще или
нет, всё остальное - как надо, по Джанвею):
6.
→ *** → выживание, пролиферация и дифференцировка В-лимфоцита.
7. ((Примерно на этом этапе происходит экспрессия В-лимфоцитами ICOSL
(лиганд индуцибельного костимулятора Т-лимфоцитов) → он
взаимодействует с ICOS на Т → это завершает дифференцировку Th в
T-fn и приводит к продукции ТрФ Bcl-6 и c-Mrf → продукция SAP → SAP
влияет на SLAM → SLAM - молекула адгезии → хорошая адгезия Т и В →
замыкание процесса куда-то в самое начало.))
Этап 3: В-лимфоцит идёт дальше:
1. Продолжающие выживать, пролиферировать и дифференцироваться Влимфоциты мигрируют во внешний фолликул или в
межфолликулярные области благодаря тому, что в нём снижается
экспрессия CCR7, а экспрессия упомянутого раньше только единожды,
но важного EBI2 - не снижается. У этого EBI2 хемокин - 7альфа,25холестерин, который в тех зонах вырабатывается, и В движется по нему.
2. В-лимфоциты группируются в межфолликулярных областях (если в
селезёнке - вблизи красной пульпы).
a. Только в селезёнке после этого иногда бывает следующее: такие
В-лимфоциты формируют первичный фокус → размножаются там
→ дифференцируются в IgM-продуцирующие плазмобласты → они
делятся и продуцируют IgM → но потом перестают и погибают.
3.
4.
5.
6.
7.
Конец ветки.
Во всех остальных случаях процесс продолжается.
Сгруппировавшиеся в межфолликулярных областях или вблизи красной
пульпы В-лимфоциты мигрируют в первичный фолликул вместе с T-fn.
Пролиферация и подавление экспрессии EBI2.
Образование герминативного центра в фолликуле - фолликул стал
вторичным.
Пролиферирующие В-лимфоциты герминативного центра вытесняют
покоящиеся В-лимфоциты, которые просто были в первичном
фолликуле, по направлению к периферии фолликула - образуется
мантийная зона покоящихся клеток вокруг двух различимых областей
активированных В, называемых светлой зоной и тёмной зоной.
a. В пролиферируют следующим образом: пролиферируют →
центробласты [CXCR4+ (рецептор к CXCR12, который
вырабатывается местной стромой); CXCR5+; IgD-] → центроциты
[CXCR4-; CXCR5+ (рецептор к CXCL13, который вырабатывается
ФДК)] → центроциты перемещаются в светлую зону.
8. В итоге происходит так, что В-лимфоциты в герминативном центре
дифференцируются в IgG-продуцирующие плазмобласты.
9. Затем - переключение изотипов Ig, созревание аффинности.
10. После переключения и созревания - окончательная дифференцировка в
плазматические клетки [ТрФ IRF4 → экспрессия BLIMP-1 → это
транскрипционный репрессор → он выключает гены, необходимые для
пролиферации В, переключения изотипов и созревания аффинности; а
также уменьшается содержание ТрФ, репрессирующих
дифференцировку в плазматическую клетку - Pax5 и Bcl-6 (их меньше процесс дифференцировки в ПК идёт)].
11. Плазматические клетки: не пролиферируют, увеличивают синтез и
секрецию АТ, снижают экспрессию CXCR5, увеличивают экспрессию
CXCR4 и интегринов альфа4бета1.
12. Вследствие этого плазматические клетки могут покидать
герминативные центры и мигрировать в периферические ткани:
a. Если в красный костный мозг - это будут долгоживущие
плазматические клетки. Конец ветки.
b. Если в медуллярные тяжи лимфатических узлов и красную
пульпу селезёнки - это будут короткоживущие плазматические
клетки. Конец ветки.
c. Если это всё случилось в лимфатических узлах слизистой и
плазматические клетки вышли в слизистую - там они и останутся,
это будут плазматические клетки слизистой. Конец ветки.
7.Основные маркеры активации лимфоцитов.
При активации Т-лимфоцитов:
1. рост экспрессии генов IL2 и IL2R, соответственно, секреция IL2 и альфацепи его рецептора начинается спустя 3-4 часа после роста экспрессии
этих генов. Через сутки прекращается.
2. Экспрессия генов c-Myc и N-Myc - ранние активационные гены.
3. CD69 - самый ранний активационный антиген
4. CD25 - ранний маркер активации (альфа-цепь рецептора к IL2)
5. IFNγ, IL-4, IL-5, IL-6
6. CD71 появляется через сутки после воздействия стимулятора. Это
рецептора для трансферрина. Этот фактор играет важную роль в
пролиферации, поскольку для ее осуществления необходимы ионы
железа.
7. В последующие дни (3–6 сут) экспрессируются молекулы MHC-II,
относимые к поздним маркерам активации Т-клеток
8. β1-интегрины, обозначаемые как очень поздние активационные
антигены — VLA (Very late activation antigens)
9. секретируются хемокины.
ранние: Il2, IL2R, CD69, CD25, CD71
поздние: β1-интегрины, MHC-II (для T-клеток)
3.Клеточная цитотоксичность
1. Типы клеточной цитотоксичности . Характеристика.
Клеточная цитотоксичность – способность ряда клеток разрушать клетки
собственного организма, проявляющие свойство чужеродности.
Цитотоксическую активность могут проявлять несколько типов клеток:
- цитотоксические Т-лимфоциты (CTL);
- NK-клетки
- К-клетки
Цитотоксические Т-лимфоциты (CTL).
Цитотоксический иммунный ответ осуществляют Т-лимфоциты,
экспрессирующие корецептор CD8. Это определяет главную особенность
процесса распознавания антигенов при цитотоксическом ответе: антигенный
пептид презентируется в составе молекул MHC-I. Молекулы MHC-I
локализуются на всех ядросодержащих клетках организма, а не только на
специализированных АПК. T-клетки могут формировать иммунологическую
память.
NK-клетки.
Основными их маркерами являются CD16 и CD56.
Наиболее важные функции NK-клеток — цитотоксическая активность в
отношении измененных (трансформированных, инфицированных вирусами,
подвергшихся действию стресса) клеток организма и секреция цитокинов (в
первую очередь IFNγ), что играет важную роль в регуляции иммунных
процессов. Эти свойства реализуются за счет поликлонального распознавания
маркеров клеточного стресса в сочетании с контролем «свой–чужой» (по
экспрессии клетками-мишенями молекул MHC-I). NK-клетки не распознают
конкретные антигены возбудителя и не формируют иммунологическую
память.
В таблице приведена сравнительная характеристика естественного цитолиза,
который обеспечивается NK-клетками, и иммунного цитолиза, который
обеспечивается цитотоксическими лимфоцитами.
К-клетки. Это неоднородная группа клеток, несущая на своей поверхности
рецепторы к Fc- фрагменту IgG и способны к антителозависимой клеточной
цитотоксичности. К ним относятся моноциты, нейтрофилы, макрофаги,
эозинофилы, конечно NK и некоторые лимфоциты. Антителозависимая
клеточноопосредованная цитотоксичность (АЗКЦ) является своеобразным
отражением связи между гуморальным и клеточным звеньями иммунной
системы. Антитела выступают в роли «наводчиков» клеток-эффекторов на
клетки-мишени, несущие чужеродные антигены.
2.Характеристика цитотоксических Т-лимфоцитов:
антигензависимая дифференцировка (роль Th и АПК),
механизмы цитотоксичности. Методы оценки
количественной и функциональной активности ЦТЛ.
Маркеры:
Исчезает CCR7 (рецептор к CCL19, 21).
Экспрессируется Fas-лиганд, также внутри в гранулах образуются
цитотоксические в-ва (перфорин, гранзим, гранулизин и т.д).
Наивные Т экспрессиют CD45RA (белок, содержащий всё, что может дать ему
его ген). Эффекторные - CD45RB и CD45RC - промежуточный формы молекулы
(кое-что из гена в процессе пролиферации и дифференцировки вырезалось), а
также CD45R0. Т-память - только CD45R0 (всё, что можно, вырезалось в
процессе сплайсинга). Вообще этот CD45 - это рецептор, передающий
активационные сигналы от цитокинов.
Процесс:
Цитотоксический Т-клеточный иммунный ответ осуществляют Т-лимфоциты,
экспрессирующие молекулу CD8, которая может взаимодействовать с MHC-I.
Этот вид иммунного ответа направлен на патоген, который локализуется в
цитозоле клетки, например, на вирусы.
Этапы цитотоксического T-клеточного иммунного ответа.
1. Презентация дендритными клетками антигена CD8+ Т-лимфоцитам,
приводящая к их активации.
2. ИЛ-2-зависимая пролиферация CD8+ Т-клеток, аутокринная или
индуцируемая CD4+ Т-лимфоцитами.
3. Дифференцировка CD8+ Т-клеток в цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ),
сопутствующая пролиферации.
4. Реализация цитолиза клеток-мишеней.
Рассмотрим по этапам.
1) Дендритные клетки после взаимодействия с патогеном мигрируют в лимфу,
где приобретают форму вуалевых клеток. Одновременно происходит
процессинг (расщепление) антигена и экспрессия (представление) комплекса
антиген-MHC-I и антиген- MHC-II. С током лимфы дендритная клетка
попадает в Т-зависимые зоны региональных лимфатических узлов. В
лимфатическом узле происходит взаимодействие дендритных клеток, как с
наивными Т-киллерами, так и наивными Т-хелперами (Th0).
Канонический механизм включения антигенного пептида в молекулу MHC-I
может быть реализован только при инфицировании АПК вирусом. Но обычно
вирус или его антигены попадают в АПК в результате эндоцитоза и
встраиваются в молекулы MHC-II. За счет механизма перекрестной
презентации (транспортировка антигенного материала из компартмента MIIC
в цитозоль или непосредственно в эндоплазматический ретикулум, в котором
происходит встраивание фрагментов антигена внеклеточного происхождения в
молекулы МНC-I) вирусный антиген оказывается встроенный в молекулы
МНC-I. Это создает возможность распознавания такого пептида CD8+ Тклетками — будущими цитотоксическими Т-лимфоцитами.
- Презентация антигена дендритными клетками наивным Ткиллерам
Презентация пептида CD8+ Т-клетке осуществляется с участием иммунного
синапса и включает:
1. Рецепторные взаимодействия: взаимодействие комплекса антиген-MHC-I на
дендритной клетке и рецептора к антигену TCR (CD3) на Т-киллере с участием
корецептора CD8.
2.Корецепторные взаимодействия: взаимодействие молекулы CD28 на Тлимфоците и CD80 на дендритной клетке. Взаимодействие CD40L на Тлимфоците и CD40 на дендритной клетке приводит к активации дендритной
клетки, увеличению синтеза ИЛ-12, способствующего активации Т-лимфоцита.
Происходит запуск пролиферации и дифференцировки Т-киллеров в
эффекторные клетки за счет сигнальных каскадов.
2) Для эффективной пролиферации CD8+ Т-клетки должны получить стимулы
от CD4+ Т-клеток (Th1).
Но предварительно происходит презентация АГ в составе молекулы MHC-II ДК
наивным Т-хелперам (Th0) → Th1 (образование Th1-лимфоцитов идет под
действием IL-12.) При взаимодействии ДК и хелпера образуется все тот же
иммунный синапс, только за место CD8 у хелперов CD4:
Th1 экспрессируют ростовой фактор IL-2. Т-киллеры его тоже экспрессируют,
но слабее, чем хелперы. Для эффективной пролиферативной экспансии клонов
CD8+ Т-лимфоцитов очень важен IL-2, поэтому помощь хелперов часто
необходима.
Кроме того Th1 секретируют IFNγ, усиливающий экспрессию молекул MHC
обоих классов → повышение числа мембранных молекул, несущих антигенный
пептид → увеличивается число взаимодействий с TCR → передача сигнала
более эффективная.
IL-12, секретируемый макрофагами и дендритными клетками, усиливает
экспрессию как молекул MHC, так и костимулирующих молекул.
3) Дифференцировка цитотоксических Т-лимфоцитов начинается в процессе
их пролиферативной экспансии. Основа этого процесса — экспрессия
комплекса генов, кодирующих молекулы, которые обеспечивают реализацию
цитотоксической функции, прежде всего белков перфоринового комплекса и
Fas-лиганда.
АГ-зависимая дифференцировка CD8+ T-лимфоцитов (Т-киллеров) приводит к
образованию цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ) способных разрушать
измененные клетки организма.
• После завершения иммунного ответа оставшиеся активированные (но не
дифференцировавшиеся в ЦТЛ) Т-киллеры образуют клетки
иммунологической памяти.
При дифференцировке Т-клеток в эффекторы и клетки памяти происходят
изменения во внеклеточных доменах молекулы СD45:
- CD45RA (содержит домены внеклеточные A, B, C) – на наивных Т-клетках.
- CD45RB (содержит внеклеточные домены B, C) – эффекторные Т-клетки.
- CD45RC (содержит внеклеточный домен С) – эффекторные Т-клетки.
- CD45R0 (не содержит доменов А, В, С) – эффекторные Т-клетки и клетки
памяти.
Эффекторные Т-клетки теряют мембранные молекулы (CD62L, CCR7),
направляющие их в Т-клеточные зоны вторичных лимфоидных органов. И
приобретают молекулы, осуществляющие миграцию в барьерные ткани, очаги
воспаления и обеспечивающие контакт с клеткой-мишенью.
4) Цитолиз клеток Т-лимфоцитами происходит также в 4 этапа:
1. распознавание клетки-мишени цитотоксическим Тлимфоцитом.
Осуществляется с участием практически тех же молекул, которые формируют
иммунный синапс при презентации антигенного пептида АПК.
Центральное событие при этом — распознавание комплекса антигенного
пептида с молекулой MHC-I (эта молекула на всех ядросодержащих клетках,
соответственно на клетке-мишени она тоже есть), осуществляемое TCR и
корецептором CD8.
Наиболее существенное отличие состоит в том, что клетки-мишени лишены
костимулирующих молекул, и поэтому костимуляция при распознавании
клетки-мишени отсутствует.
2. формирование конъюгата киллера и клетки-мишени с их
поляризацией
Между цитотоксическим Т-лимфоцитом и клеткой-мишенью формируется
синапс, называемый цитолитическим.
3. экзоцитоз гранул (программирование лизиса)
Происходит поляризация Т-клетки (как и клетки-мишени) и ориентация
элементов ее цитоскелета (микротрубочек и микрофиламентов) на
осуществление экзоцитоза. Одновременно происходит формирование в
синапсе микрополости, в которую секретируются перфорин и гранзимы.
4. индукция гибели клетки-мишени
Через перфорин-гранзимный механизм/ за счет Fas-зависимого
цитолиза/цитокинов. Это подробнее должно в другом вопросе разбираться.
МЕТОДЫ ОЦЕНКИ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ
ЦТЛ
Хромовый тест. Под «хромом» имеют в виду соль хромата натрия,
содержащую радиоактивный изотоп хрома - Na2CrO4, которую используют для
мечения клетки-мишени (КМ).
Метку свободно проникает в живые клетки и не выходить оттуда, пока клетка
жива. Метка не вступает в прочные соединения с внутриклеточными
структурами и имеет возможность выйти во внеклеточную среду из
погибающей КМ.
1)
КМ инкубируют в среде, содержащей соль хромата натрия. Потом
тщательно промывают от не вошедшего в клетки изотопа.
2)
КМ подсчитывают и раскапывают в подобранной дозе в лунки
культуральных круглодонных микропланшетов.
3)
В те же лунки вносят КЭ (клетки эффекторы) и культивируют.
4)
По завершении культивирования плашки центрифугируют при 250 g в
течение 5 мин для плотного осаждения клеток.
5)
Супернатанты собирают в специальные пробирки, в которых
радиоактивность подсчитывают в γ-счетчике.
Цитотоксичность в опытных лунках рассчитывают обычно по следующей
формуле:
где число импульсов в минуту в:
- экспериментальных лунках – СРМn;
- в лунках со спонтанным высвобождением метки – СРМ спонтанно
(контроль, в котором культивируются КМ без КЭ).
Использованием проточного цитофлуориметра. Сначала метят КМ
флуорохромом, который проникает в клетки, не повреждая их, и
флуоресцирует, возбужденный лазерным излучением. Затем к КМ добавляют
КЭ, инкубируют их совместно, чтобы дать возможность реализоваться
киллерной атаке, и добавляют к смеси второй реагент, превращающийся во
флуорохром только в живых клетках под действием их ферментов-эстераз. В
результате в итоговой картине КЭ станут светиться одним цветом «живого
флуорохрома», живые КМ будут двухцветными, погибшие КМ - одноцветными
по первому флуорохрому.
3.Характеристика естественных киллеров,
дифференцировка, механизм цитотоксичности. Оценка
активности ЕК.
Естественные киллеры, или NK-клетки - это эффекторные клетки
врожденного иммунитета, осуществляющие прямую цитотоксическую
функцию в отношении некоторых опухолевых, а также инфицированных
вирусами клеток, без предварительной активации.
NK-клетки имеют лимфоидный предшественник.
Главное отличие NK-клеток от других популяций лимфоцитов — отсутствие на
естественных киллерах антигенспецифических рецепторов → отсутствие
клональной структуры популяции NK-клеток: все естественные киллерные
клетки идентичны по строению их ключевых рецепторов.
Дифференцировка:
Основные стадии развития естественных киллеров: общий предшественник
NK- и Т-лимфоцитов (Т/NKP; на стадии DN2 под действием транскр.фактора
Id2 возможно развитие NK), специализированный предшественник NK-клеток
(NKP), зрелая NK-клетка.
Субпопуляции NK-клеток:
- CD56loCD16+ – Эффекторные NK.
- СD56hiCD16- – Регуляторные NK. Активные продуценты IFNγ и других
цитокинов (TNFα и β, GM-CSF, IL-10).
Основная функция естественных киллеров — цитолиз клеток, несущих
признаки трансформации, инфицирования или клеточного стресса, при
отсутствии на них собственных молекул MHC-I.
Функции естественных киллеров осуществляются за счет их рецепторов:
- Ингибирующие рецепторы естественных киллеров. Основная
функция ингибирующих рецепторов — предотвращение контактного цитолиза
клеток-мишеней, несущих те же молекулы МНС-I, что и сама NK-клетка. К
рецепторам первой группы относят CD94/NKG2 и LILR. Содержат ITIM-мотив.
- Активирующие рецепторы естественных киллеров. Например,
рецептор NKG2D. Лигандами NKG2D служит особый тип молекул, кодируемых
генами MHC I класса MICA и MICB. Роль этих молекул как объекта
распознавания NK-клетками обусловлена их экспрессией только на
трансформированных, инфицированых или подвергшихся стрессорному
воздействию клетках.
В реакции контактного цитолиза выделяют 4 этапа:
- распознавание естественным киллером клетки-мишени и формирование с
ней контакта;
- активация естественных киллеров;
- программирование гибели клеток-мишеней;
- уничтожение клетки-мишени.
1) Формирование иммунного синапса происходит с участием двух классов
молекул — молекул адгезии, формирующих контакт между клетками, и
рецепторных молекул и их мишеней, обусловливающих специфический
характер взаимодействия.
Решающую роль на начальном этапе формирования синапса играют молекулы
адгезии — β2-интегрины (LFA-1, Mac-1 — со стороны киллера) и их рецепторы
(особенно ICAM-1, ICAM-2 — со стороны клетки-мишени), а также молекула
CD2 и ее рецептор CD58.
В центре синапса на мембране NK-клеток расположены активационные
рецепторы, а на мембране клеток-мишеней — их лиганды. Взаимодействии
активационного рецептора NKG2D с молекулами стресса (MICA и MICB)
приводит к активации NK-клетки. В результате внутриклеточных каскадов
происходит мобилизация ионов Са2+ из внутриклеточных депо и индукция
ряда транскрипционных факторов (в частности NFκB и AP-1), ответственных за
экспрессию активационных генов.
Если в зоне контакта ингибирующие рецепторы распознают сингенные
молекулы МНС-I, формируется ингибиторный иммунный синапс → нарушение
контакта между клетками, цитолиз не будет происходить.
2) Периферия зрелого иммунного синапса представляет зону прочной
адгезии, образованную β2-интегринами и их рецепторами. Эта адгезия
сохраняется и после получения NK-клетками активационного сигнала. В то
же время в центральной части синапса межмолекулярные контакты
разрушаются. В результате образуется микрополость.
При формировании межклеточного контакта и иммунного синапса происходит
взаимная поляризация взаимодействующих клеток → организация цитоскелета
→ движение гранул, содержащих перфорин и гранзимы, в зону контакта
направляют микротрубочки, ориентированные в направлении клетки-мишени.
Сокращение актиновых волокон приводит к выбросу гранул в зону контакта, что
гарантирует адресность их действия и безопасность этого процесса для
окружающих клеток.
3) Запуск перфорин-гранзимного механизма.
4) Апоптоз клетки-мишени.
Выделяют еще один механизм проявления NK-клетками цитолитической
активности — антителозависимый. Запуск цитолиза по этому пути происходит
при распознавании Fc-рецепторами естественных киллеров FcγRIII (CD16)
специфических участков в доменах C2 и С3 антител (подклассы IgG1 и IgG3),
связавшихся с клетками-мишенями.
ОЦЕНКА АКТИВНОСТИ NK-КЛЕТОК
1. Функциональная активность NK оценивается по способности убивать КМ
(например, клетки эритромиелоидной линии К562 человека, меченные
радиоактивными изотопами 51Cr или 3Н-уридином).
1. КМ (клетки-мишени) К-562 метят изотопом 3Н-уридином (встраивается
в РНК) и инкубируют . Затем клетки трижды отмывают культуральной средой.
2. Цитотоксическую реакцию проводят в круглодонных 96-луночных
микропланшетах. В каждую ячейку помещают суспензию меченых КМ, РНКазы и суспензии мононуклеарных клеток. В контрольных пробах меченые КМ
инкубируют без мононуклеарных клеток.
3. После инкубации содержимое лунок переносят на фильтры с помощью
собирателя клеток - харвестра. Фильтры высушивают, помещают в
сцинтилляционную жидкость, проводят учет реакции с помощью β-счетчика.
Показатель функциональной активности естественных киллеров выражают в
виде индекса цитотоксичности (ИЦ), который определяют по формуле:
Если КМ погибла РНКаза расщепляет РНК с меченым нуклеотидом и эта метка
свободно проходит через фильтр (не задерживается на нем).
2. Оценка функциональной активности NK-клеток с использованием
проточной цитометрии.
В качестве метки для КМ применяют флуоресцентный краситель 5-, 6карбоксифлуоресцеин диацетатсукцинилмидиловый эфир (КФДЭ), который
образует прочную ковалентную связь с внутриклеточными белками и в
используемой концентрации не влияет на жизнеспособность клетки.
Первоначально нефлуоресцирующий КФДЭ проникает через клеточную
мембрану. Карбоксифлуоресцеины связываются с внутриклеточными
молекулами, формируя конъюгаты, обеспечивая стойкое флуоресцентное
окрашивание клетки. Окрашенные таким образом КМ К-562 смешивают с КЭ и
инкубируют в течение нескольких часов. После окончания культивирования
клетки окрашивают пропидий йодидом для определения убитых в ходе
реакции КМ. По количеству убитых К-562 определяют активность NK-клеток.
Анализ проводят на проточном цитофлуориметре и определяют количество
КМ, включивших КФДЭ (зеленое свечение), и количество убитых клеток,
включивших пропидий йодид (красное свечение).
4.Антителозависимая клеточная цитотоксичность,
характеристика, механизм. Оценка активности К-клеток.
Хуйня полная
К-клетки. Это неоднородная группа клеток, несущая на своей поверхности
рецепторы к Fc- фрагменту IgG и способны к антителозависимой клеточной
цитотоксичности. К ним относятся моноциты, нейтрофилы, макрофаги,
эозинофилы, конечно NK и некоторые лимфоциты. Антителозависимая
клеточноопосредованная цитотоксичность (АЗКЦ) является своеобразным
отражением связи между гуморальным и клеточным звеньями иммунной
системы. Антитела выступают в роли «наводчиков» клеток-эффекторов на
клетки-мишени, несущие чужеродные антигены.
1. Fc-рецепторы на фагоцитах активируются антителами,
связанными с поверхностью патогенов, и позволяют
фагоцитам поглощать и уничтожать патогены:
У некоторых бактериальных патогенов есть полисахаридные капсулы —
массивная структура снаружи мембраны бактерий, противостоящая прямому
поглощению фагоцитами.
Такие патогены становятся восприимчивыми к фагоцитозу только тогда, когда
покрыты антителами и компонентами системы комплемента,
которые взаимодействуют с рецепторами Fсγ или Fсα и рецептором для
компонентов системы комплемента CR1 на фагоцитах, приводя к поглощению
бактерии.
● Многие бактерии сопротивляются фагоцитозу макрофагами и
нейтрофилами.
● Однако антитела, связанные с этими бактериями, позволяют поглощать
и разрушать их посредством взаимодействия многочисленных Fc,
расположенных на поверхности бактерий, с Fc-рецепторами на
поверхности фагоцитов.
● Покрытие патогена антителами также индуцирует активацию системы
комплемента и связывание компонентов системы комплемента с
поверхностью бактерии. Они могут взаимодействовать с рецепторами
для компонентов системы комплемента (например, CR1) на фагоците.
● Fc-рецепторы и рецепторы для компонентов системы комплемента
взаимодействуют при индуцировании фагоцитоза.
● Таким образом, бактерии, покрытые IgG и компонентами системы
комплемента, легче поглощаются, чем те, которые покрыты только IgG.
● Связывание Fc и рецепторов для компонентов системы комплемента
передает сигнал фагоциту о необходимости увеличить скорость
фагоцитоза, слить лизосомы с фагосомами и увеличить бактерицидную
активность.
● Фагоцитоз приводит к заключению патогена (или частицы) в
закисленную цитоплазматическую везикулу — фагосому.
● Затем он сливается с одной или несколькими лизосомами для
формирования фаголизосомы; лизосомальные ферменты
высвобождаются в везикулу, где они уничтожают бактерии
Некоторые частицы слишком велики для заглатывания фагоцитами;
паразитические черви — один из примеров.
● В этом случае фагоцит прикрепляется к поверхности паразита,
покрытого антителами, через Fcγ-рецепторы, Fcα-рецепторы или Fcεрецепторы,
● Содержимое секреторных гранул или лизосом фагоцита высвобождается
путем экзоцитоза.
● Содержимое выбрасывается непосредственно на поверхность паразита и
повреждает его.
Таким образом, стимуляция Fсу-рецепторов и Fca-рецепторов может
спровоцировать либо интернализацию внешних частиц фагоцитозом,
либо экстернализацию внутренних везикул экзоцитозом.
Основными лейкоцитами, участвующими в уничтожении бактерий, являются
макрофаги и нейтрофилы, тогда как крупные паразиты, такие как гельминты,
обычно атакуются эозинофилами — нефагоцитирующими клетками,
способными связываться с паразитами, покрытыми антителами, с помощью
нескольких различных Fc-рецепторов.
2. Fc-рецепторы активируют NK-клетки, чтобы уничтожить
мишени, покрытые антителами:
Клетки, инфицированные вирусом, обычно разрушаются T-лимфоцитами,
которые распознают белки вирусного происхождения, связанные с MHC на
поверхности клеток.
Клетки, инфицированные некоторыми вирусами, также передают сигнал о
наличии внутриклеточной инфекции путем экспрессии на своих
поверхностях белков (белки вирусной оболочки), которые могут
быть распознаны антителами, изначально продуцированными против
частиц вируса.
Несмотря на принадлежность к лимфоидной линии, NK-клетки экспрессируют
ограниченный репертуар инвариантных рецепторов, распознающих ряд
лигандов, которые индуцируются в аномальных клетках, подобных клеткам,
инфицированным вирусами.
При распознавании лиганда NK-клетка непосредственно уничтожает клеткумишень, и ей для этого не нужны антитела. NK-клетки играют важную роль во
врожденном иммунитете на ранних стадиях вирусной инфекции.
Помимо этой врожденной функции NK-клетки могут распоз­навать и
уничтожать покрытые антителами клетки-мишени в
про­цессе, называемом антителозависимой клеточной
цитотоксично­стью (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,
ADCC).
● Она инициируется, когда антитело, связанное с поверхностью клет­ки,
взаимодействует с Fc-рецепторами на NK-клетке.
● NK-клетки экспрессируют рецептор FcyRIII (CD16), который рас­познает
подклассы IgGl и IgG3.
● Киллерный механизм аналогичен механизму действия цитотоксических
T-лимфоцитов, включаю­щему выделение цитоплазматических гранул,
содержащих перфо­рин и гранзимы.
ОЦЕНКА КЛЕТОЧНОЙ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ:
Хромовый тест:
Кормим клетки хромом и получаем цитохромы (С)
1. 1*106 клеток-мишеней инкубируют в среде, содержащей радиоактивный
изотоп хрома Na251CrO4 при 37 градусах Цельсия в течение 1-1,5 ч, после
чего тщательно отмывают от не вошедшего в клетки изотопа.
2. Клетки-мишени подсчитывают и раскапывают в подобранной дозе в
лунки культуральных круглодонных микропланшетов.
3. В те же лунки вносят клетки-эффекторы. Соотношение мишеней и
эффекторов обычно составляет от 1:10 до 1:500 в пользу эффекторов.
4. Плашки подвергаются мягкому центрифугированию - 150 g в течение 1
мин, после чего помещают в CO2-инкубатор при 37 градусах на 4-6 ч.
5. По завершении культивирования плашки центрифугируют при 250 g в
течение 5 мин до плотного осаждения клеток.
6. Супернатанты собирают в специальные пробирки, в которых
радиоактивность подсчитывают в гамма-счетчике.
7. В качестве контроля используют:
a. Лунки с мишенями, в которые не вносят эффекторы - это контроль
спонтанного выхода метки;
b. Лунки с мишенями, в которые вместо эффекторов вносят
детергент Triton X-100 1% (v/v) - это контроль максимально
возможного высвобождения метки из клеток-мишеней.
8. Цитотоксичность в опытных лунках рассчитывают обычно по формуле:
5.Цитотоксическое действие макрофагов.
Цитотоксичность будет реализовываться через секреты и фагоцитоз.
Биологически активные вещества, секретируемые макрофагами
1) гидролитические ферменты (кислые гидролазы, лизосомальные гидролазы,
лизоцим, коллагеназа, эластаза, активатор плазминогена);
2) ингибиторы ферментов (α2-макроглобулин, ингибиторы плазминогена и др.);
3) продукты окисления арахидоновой кислоты (ПГЕ2, Е1, F1 и F2, тромбоксан);
4) компоненты комплемента (С1, С2, С3, С4, инактиваторы и др.);
5) факторы коагуляции (протромбин, активатор плазминогена);
6) медиаторы (ИЛ-2, ФНО, ИФН – α, β, КСФ-М, КСФ-ГМ).
6.Механизмы апоптоза и некроза клеток.
Внутренние пути: перфорин-гранзимный путь.
Перфорины-формируют поры, через них проходят гранзимы. Например,
гранзим В, который является сериновой протеазой. Он расщепляет прокаспазы, что переводит их в активную форму каспаз. Дальнейшие каскады
схожи с Fas, TNF(через митохондрии, или каскад каспаз)
Внешние пути апоптоза: Fas-зависимый цитолиз, TNF-зависимый цитолиз
Строение Fas
При связывание лиганда в цитоплазме образуется комплекс DISC, который
содержит:
❏ каспазу 8, 10
❏ адаптер/активатор FADD
❏ модулятор FAP-1
❏ домены смерти DD
❏ домен CARD(RAIDD)
Fas-зависимый цитолиз(вариант 1):
1. Связывание лиганда и Fas-интернализация рецептора.
2. Связывание доменов смерти, находящихся в FADD-FAS.
3. Связывание DED( часть FADD) с каспазой 8(и возможно 10).
4. Активация каспазы посредством протеолиза и образование
активного гетеротетрамера.
5. Активация каспаз 3 и 7.
6. Расщепление эффекторный белков: например, ICAD ингибитор
CAD(ДНКаза), PARP(ламины).
Fas-зависимый цитолиз(вариант 2):
1. Все что было до этого-активация каспазы 8.
2. Она расщепляет проапоптический белок BID семейства BCL-2.
3. tBID перемещаться из цитозоля на внешнюю митохондриальную
мембрану(связывается со своим рецептором) и способствует активации
проапоптических белков BAX,BAK.
4. BAX, BAK увеличивают внешнюю проницаемость мембраны
митохондрий, что способствует высвобождению проапоптических
белков цитохром C и Smac/DIABLO, антагониста ингибиторов белков
апоптоза (IAPs).
5. Сборка апоптосомы: APAF-1-Cyt-c.
6. Активация каспазы 9.
7. Активация каспазы 3 и 7.
TNF-зависимый цитолиз:
1. При активации TNFR1 домены смерти связываются с TRADD.
2. Высвобождение димера TRADD в цитозоль и его связывание с FADD.
3. Димеризованный FADD взаимодействует с инициаторной каспазой-8 и 10 и
активирует ее.
4. Далее как в предыдущем варианте апоптоз может идти через
митохондрии(BID-BAX-цитохром С-апоптосома) или каспазы 8 и 10
непосредственно активируют каспазы 3,7.
● На картинке также показаны ингибиторы XIAP, C-FLIP.
Помимо апотоза открыли еще один путь запрограммированной гибели клеткинекроптоз. Он также связан с рецепторами Fas,TNF, но передача сигнала не
идет через каспазы. Этот механизм защищает организм от вирусов, которые
ингибируют каспазы. https://wikichi.ru/wiki/Necroptosis
Вообще некроз относится к незапрограмированной клеточной гибели.
Механизм связан с механическими повреждениями, ишемией, комплементом,
токсинами, цитокинами(АФК, NO). Без каких либо каскадов и рецепторов,
клетка дохнет, например, от осмотического давления.
4.Гуморальный иммунный ответ (ээвита)
1.Взаимодействие клеток при развитии гуморального
иммунного ответа на тимусзависимые антигены.
Белковые антигены сами по себе не способны индуцировать иммунный ответ
у животных и человека с недостаточностью T-лимфоцитов, поэтому белковые
антигены называют тимус-зависимыми антигенами.
Встреча В-клетки с Аг - в лимфоидном узле в В-клет.зоне, туда Аг поступает с
током афферентной лимфы. Этот Аг может быть опсонизирован компонентами
комплемента С3b и C3dg - в таком случае они соединяются с CR1 и СR2
рецепторами на FDC ИЛИ опсонизированные Аг удерживаются
специализированными макрофагами субкапсулярного синуса
Итак, В-клетка связала своим BCR какой-то Аг - это 1-ый активационный
сигнал (1B). Начинается повышенная экспрессия MHCII, CD80 и CD86. Но Вклеткам еще нужна ко-стимуляция от антиген-специфичных T-лимфоцитов.
Этими клетками являются TFH-лимфоциты, которые находятся в лимфоидных
тканях и представляют собой не полностью дифференцированные TH1лимфоциты, TH2-лимфоциты или TH17-лимфоциты. Встреча с ними
происходит на границе B- и T-клеточных зон фолликула (вероятность встречи
очень мала, в этом участвуют хемокины: CCL19 вырабатывается дендритными
клетками Т-зоны. Рецептор к нему - CCR7, он экспрессируется Т-клетками и
активированными В-клетками, чтобы они подошли к границе Т-зоны, где
можно встретиться с фолликулярным Тх. + рецептор к EBI2 на В-клетках).
Чтобы получить помощь от T-лимфоцита, B-лимфоциты должны
презентировать Аг в комплексе с МНС2 (антиген сначала связывается с
поверхностным IgM на B-лимфоците, поглощается и деградирует,
образованные пептиды возвращаются на поверхность клетки в комплексе с
MHCII). Когда TFH-лимфоцит распознает комплексы «MHC-пептид» и
образуется контакт между клетками, в B-лимфоците индуцируются сигналы,
которые способствуют выживанию и индуцируют пролиферацию несколькими
способами:
1. Взаимодействие CD40 на B-лимфоцитах с CD40L на TFHлимфоците - 2-ой активационный сигнал (2В). Сигнал от CD40 в Вклетке активирует неканонический путь активации NFκB, повышает
экспрессию антиапоптотических молекул, таких как Всl-2.
2. продукция различных цитокинов TFH-лимфоцитами, включая
IL-21. Сигнал от IL-21 активирует STAT3 в В-клетках и усиливает
пролиферацию и дифференцировку клеток в плазматические клетки и
B-клетки памяти. Другие цитокины, продуцируемые TFH-лимфоцитами
(IL-6, TGF-β, IFN-γ и IL-4) обеспечивают регуляцию переключения на
определенный изотип. Эти цитокины образуются и другими
дифференцированными эффекторными субпопуляциями, но TFHлимфоциты в этом процессе все-таки основные, т.к. к примеру в них
транскрипция гена IL-4 не зависит от факторов транскрипции GATA-3 и
STAT6, а у TH2 зависит.
3. SLAM
4. CD30
5. CD84
6. Ly108
7. ICOS
Принципиально важно, что в состав MHC-II избирательно включаются
не те эпитопы, которые распознаются BCR, а другие — Т-клеточные эпитопы. Например, B-лимфоцит, распознающий эпитоп на вирусной оболочке,
полностью поглотит частицу вируса. B-лимфоцит может процессировать до
пептидов несколько вирусных белков и презентировать их на своей
поверхности в комплексе с MHCII. Свяжется с ним определенный TFH,
специфичный к одному из презентированных вирусных пептидов. Да кто этот
ваш TFH нахуй? Вот его история: CD4 Т-клетки могли быть активированы
дендритными клетками ранее при инфекции; некоторые из них будут
дифференцироваться в TFH-лимфоциты. Ранее говорилось, что TFH являются
неполностью дифференцированными TH1, TH2 или TH17-лимфоцитами.
Не забываем, что рецепторный комплекс B-клеточного рецептора содержит
поверхностные белки CD19, CD21 и CD81. Когда CD21 (рецептор для
компонентов системы комплемента 2, CR2), связывается с фрагментами
системы комплемента C3d и C3dg, прикрепившимися к поверхности клетки
микроорганизма, происходит его сближение с активированным B-клеточным
рецептором, связанным с той же поверхностью. CD21 и CD 19 ассоциируются
друг с другом, и происходит фосфорилирование CD 19 активированным Bклеточным рецептором. Это вовлекает PI3K, которая затем стимулирует
несколько нижележащих путей передачи сигнала, усиливая пролиферацию,
дифференцировку и продукцию антител.
2. Гуморальный иммунный ответ на тимуснезависимые
антигены.
Тимуснезависимые аг способны активировать В-клетки сразу, т.к. при их
связывании с поверхностным IgМ сигнал выходит достаточно сильный
(сигналы поддерживющие выживание, пролиферацию). Это объясняется тем,
что Т-независимые АГ обычно являются молекулами с повторяющимися
участками (например полисахариды клеточной стенки бактерий), и они могут
кластеризовать BCR. В таких случаях второй сигнал может быть получен от
прямого распознавания общего компонента микроорганизма, такого как
липополисахарид, через TLR в B-лимфоците, активируя сигнальный путь
NFkB. Тимус-независимое образование антител обеспечивает определенную
защиту от внеклеточных бактерий.
3.Основные этапы дифференцировки АОК, синтезирующих
IgG и методы их выявления.
Выделяют 4 этапа превращения В-лимфоцитов при гуморальном иммунном ответе
I. Стимуляция В-клетки антигеном с участием Т-фолликулярных хелперов.
II. Активация и пролиферация В-клеток (экспансия клона).
III. Переключение изотипа рецептора В-клетки и «созревание» его
аффинитета.
IV. Дифференцировка В-клеток в плазматические клетки и В-клетки
памяти.
(Два первых этапа укладываются в индуктивную фазу гуморального иммунного
ответа, третий частично относится к продуктивной фазе, а четвертый составляет его
основное содержание)
1. Через 2-3 сут после активации у B-лимфоцитов начинает снижаться экспрессия
CCR7 и усиливаться экспрессия EBI2. Сниженная экспрессия CCR7 заставляет Bлимфоциты мигрировать от границы с T-клеточной зоной. EBI2 направляет их
миграцию обратно в межфолликулярные пространства. Здесь некоторые Bлимфоциты формируют агрегат дифференцирующихся B-лимфоцитов, называемый
первичным фокусом (проявляются через 5 сут после встречи антигеном, с которым
ранее организм не сталкивался)
B-лимфоциты размножаются в первичном фокусе в течение нескольких
дней, и это составляет первую фазу первичного гуморального иммунного ответа.
Некоторые из этих пролиферирующих B-лимфоцитов дифференцируются в
плазмобласты в первичном фокусе. Плазмобласты - это клетки, начавшие
секретировать антитела (только IgM, переключения у них нет), но все еще делящиеся и
проявляющие множество характеристик активированных B-лимфоцитов, которые
позволяют им взаимодействовать с T-лимфоцитами. Через несколько дней
плазмобласты в первичном фокусе перестают делиться и могут в конечном итоге
погибнуть. Еще могут переселиться в костный мозг, где продолжат секретировать Ат.
2. Не все B-лимфоциты со связанным TFH будут мигрировать из пограничной зоны в
первичный фокус. Некоторые из них мигрируют вместе со связанными с ним TFH
(связаны оченб крепко…) в лимфоидный фолликул, где они образуют
герминативный центр. Они могут в конечном итоге дифференцироваться в АОК.
Герминативные центры присутствуют примерно в течение 3-4 нед после
первоначального воздействия антигена. Здесь происходит:
1. Переключение изотипа (есть отдельный билет)
2. Соматическая гипермутация (отдельный билет)
a. Если благодаря мутации лучше связывает Аг - созревание аффинитета
b. Если хуже пошол нахуй
4.Основные этапы дифференцировки АОК, синтезирующих
IgM и методы их выявления.
Выделяют 4 этапа превращения В-лимфоцитов при гуморальном иммунном ответе
I. Стимуляция В-клетки антигеном с участием Т-фолликулярных хелперов.
II. Активация и пролиферация В-клеток (экспансия клона).
(раз
IV. Дифференцировка В-клеток в плазматические клетки и В-клетки
памяти.
Плазмобласты в первичных фокусах в первую очередь выделяют антитела изотипа
IgM - немедленная помощь в борьбе с патогенами.
Прямой метод Йерне - для IgM
5.Схема цитокиновой регуляции антителогенеза
6.Методы выявления АОК (варианты локального гемолиза,
Elispot, иммунофлюоресцентный анализ).
Локальный гемолиз - это и есть метод Йерне. Варианты - прямой и непрямой.
Метод ИФА: то же самое только планшет много лунок (можно посмотреть много
образцов) полистироловый
7.Метод определения количества АОК, синтезирующих IgG
на растворимый антиген у экспериментальных животных.
Непрямой метод Йерне - для IgG
встретились как то раз
эритроцит барана, кролик и мышь…
5.Реакции клеточного иммунитета
1.Развитие реакции ГЗТ, основные клеточные элементы, их
роль.
Реакция гиперчувствительности замедленного типа (IV тип) — это группа
реакций, которые развиваются у сенсибилизированных людей через 48-72 часа
после контакта с аллергеном. Типичным примером является положительная
кожная реакция на туберкулин у сенсибилизированных людей к антигенам
туберкулезной микобактерии — реакция манту. Еще пример служит дерматит
от сережек, содержащих хром.
Для ГЗТ характерно время реакции и то что Ат участия в ней не принимают,
основная роль принадлежит сенсибилизированным лимфоцитам.
Механизмы реакции схожи с механизмами клеточного иммунитета. Различия
между ними выявляются только на конечном этапе, когда развивается
повреждение тканей.
Механизм: в ответ на попадание в организм аллергена образуются
сенсибилизированные лимфоциты. Т-эффекторы = Т-киллеры. На их
мембране находится TCR, которые специфичны к Аг. При повторном
попадании аллергена он соединяется с сенсибилизированными лимфоцитами.
Это ведет к ряду морфологических и биохимических трансформация
приводящих к пролиферации, усилению синтеза ДНК, РНК, белков и секреции
различным медиаторов — лимфокинов.
Под влиянием одних лимфокинов несенсибилизированые лимфоциты
приобретают повышенную чувствительность к аллергену.
Под влиянием лимфокинов с хемотаксической активность (Ил-8) происходит
хемотаксис макрофагов и полиморфных клеток к месту нахождения аллергена,
а под влиянием других медиаторов (МИФ, ИФН-гамма) они задерживаются в
этой, и происходит активация и фагоцитарной активности.
Сенсибилизированные лимфоциты оказывают и прямое цитотоксическое
действие на клетки- мишени.
Накопление клеток, клеточная инфильтрация области, где произошло
соединение лимфоцита с соответствующим антигеном, развивается на
протяжении многих часов и достигает максимума через 2-3 сут. В этой области
происходит разрушение клеток-мишеней, их фагоцитоз, повышение
проницаемости сосудов. Все это проявляется в виде воспалительной реакции
продуктивного типа, которая обычно проходит после элиминации аллергена.
● Гаптены приобретают способность инициировать реакции
гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) после взаимодействия с
высокомолекулярными соединениями, в частности с белками. В свою
очередь белки вызывают гиперчувствительность замедленного типа
(ГЗТ) при длительной иммунизации малыми дозами в сочетании с
адъювантами. Многие низкомолекулярные органические вещества или
неорганические вещества (например, хром), связываясь с белками кожи,
выполняют роль гаптенов и сенсибилизируют организм при длительном
контакте. В результате развивается контактная аллергия, клинически
проявляющаяся контактными дерматитами.
●
Способность отвечать развитием гиперчувствительности замедленного
типа (ГЗТ) на различные микробные продукты (например, Аг
возбудителей туберкулёза, бруцеллёза) применяют при постановке
кожных проб для диагностики инфекционного процесса или
установления возможного контакта организма с возбудителем.
2.Механизмы отторжения трансплантата.
Аутотрансплантация – пересадка в пределах одного организма.
Аутотрансплантаты.
Аллотрансплантация – пересадка между разными организмами одного вида.
Аллотрансплантаты, сингенные трансплантаты (трансплантаты от другого
генетически идентичного организма).
Ксенотрансплантация – пересадка между разными видами.
Ксенотрансплантаты.
Аллоантигены – антигены, отражающие генетический полиморфизм внутри
одного вида. У разных организмов они разные.
Самые известные аллоАГ: MHC, антигены групп крови.
Генетически другое - чужеродное - будет реакция иммунной системы.
Законы трансплантации (4 шт.)
1. сингенные трансплантаты (внутри генетически чистой линии или между
однояйцовыми близнецами) приживаются;
2. аллогенные трансплантаты (между мышами разных линий) отторгаются;
3. трансплантаты от мышей родительской линии приживаются у гибридов
первого поколения (F1) с мышами другой линии;
4. трансплантаты от гибридов F1 приживаются у F1, но отторгаются у
мышей обеих родительских линий.
Два механизма распознаваниячужого MHC Т-лимфоцитами: прямой и
непрямой.
Прямой:
TCR + аллогенная MHC на клетке-пассажире (АПК донора, попавшая в
трансплантат). Может реализовываться и для Th, и для Tk, но чаще это именно
включение Tk и обеспечиваемая ими реакция острого отторжения. Развитие
реакции – вследствие костимулирующих сигналов с клетки-пассажира
(обычные клетки донора костимулирующих сигналов не поставляют, это же
обычные клетки, всё как обычно). АГ на этой MHC не играет роли – реакция
только на неё саму, на её отличающуюся структуру.
Почему только на MHC: в процессе созревания TCR отбирается по
аффинности к MHC (должна быть – средней силы) и собственным АГ (не
должна быть). Но в конечном итоге реакция зависит от аффинности к
суммарному комплексу MHC+АГ. Даже если на АГ реакции нет, т.е. в организме
реципиента есть такой же, аффинность TCR донора к MHC реципиента может
оказаться слишком сильной, и АГ просто не важен.
Это обеспечивает активацию Т-киллеров как цитотоксичных по отношению
к данным антигенам, и они начнут убивать трансплантат.
Непрямой:
Аллогенная MHC (МНС донора) попадает в дендритную клетку организма
реципиента (один из способов: трогоцитоз - "откусывание" дендритной клеткой
реципиента куска мембраны с этой МНС от дендритных клеток донора и
встраивание этого куска мембраны в свою) --> обычный процессинг, если это
был не трогоцитоз --> включение в состав MHC-II дендритных клеток
реципиента её эпитопов --> презентация как антигена.
Обеспечивает включение Th и они запускают воспалительный иммунный ответ:
Формирующиеся эффекторные Т-клетки обоих типов (Th1-клетки и
цитототоксические Т-лимфоциты) поступают в циркуляцию и в результате
экспрессии на их поверхности хемокиновых рецепторов (ССR1, ССR2, ССR3,
CCR5 и др.), мигрируют в очаги воспаления, всегда сопутствующего
трансплантации, и инициируют реакции, приводящие к отторжению ткани.
Наряду с этими антигенспецифическими клетками в трансплантат мигрируют
естественные киллеры, а также воспалительные клетки, прежде всего
макрофаги. Лимфоидная инфильтрация — одно из самых типичных
морфологических проявлений трансплантационной реакции.
Клеточный ответ воспалительного типа, опосредованный CD4+ T-клетками и
макрофагами, создает фон для реализации цитотоксического ответа .
Вызываемое этими клетками иммунное воспаление инициируется
взаимодействием Th1-клеток с макрофагами. При этом Th1-лимфоциты
повторно стимулируются пептидными фрагментами молекул MHC-II донора,
представляемыми макрофагами. Такие активированные Th1-клетки в свою
очередь стимулируют макрофаги через костимулирующую молекулу CD40.
Th1-лимфоциты выделяют IFNγ и TNFα. Эти цитокины, с одной стороны,
служат дополнительными активаторами макрофагов, а с другой — сами по
себе появляют провоспалительную и деструктивную активность.
Активированные макрофаги выделяют провоспалительные цитокины, а также
активные формы кислорода, оксид азота, ферменты и другие факторы,
оказывающие при инфицировании бактерицидное действие, а при
трансплантации участвуют в разрушении пересаженных тканей. Кроме того,
продукты макрофагов способствуют развитию локального воспаления,
сопровождающегося нарушением микроциркуляции, формированием тромбов
и другими изменениями, что нарушает трофику трансплантата и приводит к его
отторжению.
В итоге – нарушения питания трансплантата, деградация тканей.
3.Реакция трансплантат против хозяина. Условия,
необходимые для развития реакции.
Развивается при пересадке иммунокомпетентных тканей. Главная из таких
– костный мозг, но возможно развитие реакции и при переливании лимфоидных
клеток, и при пересадке органов, богатых лимфоидными тканями (лёгкие,
фрагменты кишечника).
Проявляется в виде поражений эпидермиса, эпителия желчных протоков и
слизистой оболочки ЖКТ.
- Острая: развивается в течение ста суток после пересадки. Поражения
некротические.
- Хроническая: развивается дольше, возникает позже, чем через сто суток
после пересадки. Проявляется фиброзами и атрофическими процессами без
некрозов.
Механизм:
TCR донора + MHC на АПК реципиента --> активация T-лимфоцитов донора как
эффекторных по отношению к клеткам реципиента.
Варианты:
1. Реакция Т на незнакомые АГ.
Т-лимфоциты донора не проходили отбор на неспособность распознавать АГ
реципиента (отсутствие центральной толерантности), могут попасться
аффинные к таким АГ TCR. Часто эти АГ – минорные АГ гистовместимости
(MiHA: существуют структуры помимо MHC, тоже кодируемые генами с
аллельными полиморфизмами. Часто это некие специфические
узконаправленные белки отдельных тканей. Такие гены в основном
биаллельны, и иммуногенной, т.е. приводящей к образованию продукта,
который будет включен в MHC, часто является только одна аллель. Продукты
таких аллелей – это и есть минорные антигены гистосовместимости. При этом
каждый MiHA как продукт своей одной аллели может быть включен только в
один вариант MHC, являющийся продуктом своей одной аллели (редко – в
несколько вариантов MHC).).
2. Реакция Т на незнакомый MHC.
Если такое реализуется в трансплантационной реакции «иммунные клетки
реципиента --> донорская ткань» (см. выше), возможна и обратная ситуация.
Почему это работает: в процессе созревания TCR отбирается по
аффинности к MHC (должна быть – средней силы) и собственным АГ (не
должна быть). Но в конечном итоге реакция зависит от аффинности к
суммарному комплексу MHC+АГ. Даже если на АГ реакции нет, т.е. в организме
донора был такой же или просто так получилось, аффинность TCR донора к
MHC реципиента может оказаться слишком сильной, и АГ просто не важен.
Путь активации Т-лимфоциты проходят классический: сначала активация за
счёт контакта с АПК и её костимулирующими сигналами, потом – эффекторные
действия.
ОСТРАЯ РТПХ:
TCR/CD4+ + MHC-II АПК --> активация как Th1 --> работа как Th1: выделение
провоспалительных цитокинов (основные: IFNy, TNF, IL-1, IL-6) -->
многонаправленное системное действие.
Также провоспалительные цитокины активно выделяются клетками самого
реципиента как следствие предтрансплантационной подготовки
(кондиционирование) химио- или радиотерапией, которое повреждает
здоровые клетки быстрообновляющихся тканей --> они выделяют DAMPs -->
запуск воспаления, опосредованного системами врождённого иммунитета.
Суть самой оРТПХ состоит в развитии цитокинового шторма:
Изначально секретируемые активированными презентацией лимфоцитами
цитокины и воспалительные каскады, запущенные из-за мер
предтрансплантационной подготовки --> активируют всё больше Т-лимфоцитов
и клеток врождённого иммунитета --> они активируют друг друга в рамках
привлечения адаптивных систем не справляющимися врождёнными [вр -->
цитокины --> активация АПК (на поверхности клеток увеличивается экспрессия
молекул адгезии ICAM-1 и VCAM-1, а также самих MHC --> улучшение
презентации) --> адапт] и воспалительного иммунного ответа [адапт --> вр] -->
избыточная продукция всевозможных провоспалительных цитокинов
всевозможными клетками --> острая воспалительная реакция --> развитие
некроза; цитотоксическая иммунная активность (существует также процесс –
«кросс-презентация», обеспечивающий презентацию экзогенных АГ в MHC-I).
Также, когда уже произошли повреждения, которые в барьерных органах, в
организм в больших количествах проникают PAMPs существовавших там
бактерий --> ещё большая активация систем врождённого иммунитета через
TLR, NLR и т.д. --> активация NF-kB, AP-1 и IRF-3 образующих каскадов --> ещё
большая продукция цитокинов; ещё большее привлечение систем адаптивного
--> опять продукция цитокинов; опять цитотоксическая активность.
Короче, есть три этапа:
1. Повреждающее действие предтрансплантационной подготовки --> в
организме развивается DAMP-ассоциированное воспаление. (УСЛОВИЕ
РАЗВИТИЯ)
2. Сама трансплантация --> в организм поступают иммунные клетки, которые
скорее всего будут распознавать его антигены как чужеродные и реагировать
на это.
3. Эффекторная фаза --> комплексная реакция.
ХРОНИЧЕСКАЯ РТПХ:
TCR/CD8+ + MHC-I АПК --> активация как эффекторных Т-киллеров --> работа
как эффекторных Т-киллеров (столкнутся с несущей АГ клеткой – проявят
активность).
Процессы оРТПХ актуальны и для хРТПХ, но происходят не так быстро и
интенсивно.
Это может быть связано с полиморфизмами генов, ответственных за сами
цитокины. Некоторые аллели обеспечивают более интенсивную продукцию,
чем интенсивнее продукция, тем выше вероятность острой реакции. Более
низкий синтез цитокинов может приводить к «хроническому» течению.
Когда могут быть Ат против трансплантата уже заранее?
- переливание крови
- неудавшаяся первая трансплантация
- беременность
6.Генетика иммуноглобулинов
1.Генетика иммуноглобулинов, пути формирования
разнообразия.
Структура написания :
- буквы, обозначающие молекулу, в состав которой входит кодируемая
цепь (IG или TR),
- затем название цепи в латинском эквиваленте (Н, К, L, A и т.д.)
- и завершает обозначение тип кодируемого участка молекулы
(вариабельный или константный — V или C).
Гены расположены на четырех хромосомах — 2 (κ), 7 (β, γ), 14 (Н, α, δ) и 22 (λ).
Выделяют 6 кластеров (групп) генов, кодирующих молекулы полипептидных
цепей антигенраспознающих молекул СМ В ТАБЛИЦУ (первые три столбца)
Последовательности, кодирующие δ-цепь ТCR, расположены внутри гена αцепи, но обычно их рассматривают как отдельный, 7-й генетический кластер.
В каждом кластере присутствуют гены, кодирующие константные домены — Сгены (в случае кластера IGH — 9, по числу изотипов Н-цепей).
V-сегменты и C-гены пространственно разобщены.
Между ними на значительном расстоянии от V-сегментов расположены
короткие сегменты — J (соединительные — от Joining), содержащие 35–50
пар оснований, а в некоторых кластерах (Н, B, D) — также D-сегменты (от Divеrsity).
Между V-, D- и J-сегментами расположены рекомбинационные
сигнальные последовательности (RSS — Recombination signal sequences).
Структура локусов иммуноглобулиновых генов :
● На 3’-конце от V-гена расположена консервативная последовательность из 7
нуклеотидных остатков (гептамер) 5’CACAGTG3’,
● далее — соединительный участок (спейсер), содержащий 12 или 23 основания,
и нонамер (5’ACAAAAACC3’).
● После участка с «нерегламентированной» последовательностью следует
нонамер, участок из 23 или 12 оснований,
● гептамер
● и J- или D-сегмент.
«Правило 12/23» соблюдается всегда: если правее (на 3’-конце) первого кодирующего
участка (например, V) расположен 12-членный спейсер, то левее (на 5’-конце) второго
участка (например, J) должен располагаться 23-членный спейсер, и наоборот. на
рисунке
Кластеры генов TCR организованы аналогичным образом.
● Будет ли на 3`-конце V-сегмента RSS-12 или RSS-23, зависит от локуса,
где находится V-сегмент
● J-сегменты всех локусов TCR и локуса IGLV имеют на 3`-конце RSS-12,
в то время как IGHV и IGKV несут RSS-23.
● У D-сегментов локуса IGHV и на 5`-конце, и на 3`-конце находятся
последовательности RSS-12, а у D-сегментов локусов TRBV и TRDV на 5`конце располагается RSS-12, а на 3`-конце — RSS-23.
*Приведенное выше строение кластеров рецепторных генов характерно для
всех клеток, кроме зрелых лимфоцитов. ЗАРОДЫШЕВАЯ КОНФИГУРАЦИЯ
В зрелых лимфоцитах
● зрелый V-ген, кодирующий полный V-домен (образован за счет
присоединения к зародышевому V-сегменту одного из DJ-сегментов).
Реаранжировка генов рецепторов лимфоцитов начинается с экспрессии под
влиянием дифференцировочных стимулов генов V(D) J-
рекомбинационного комплекса.
Этот комплекс содержит 6 компонентов:
– димер рекомбиназ (экзонуклеаз) RAG-1/RAG-2;
– ДНК-зависимую протеинкиназу;
– ДНК-лигазу IV;
– терминальную дезоксинуклеотидилтрансферазу (TdT), кодирующую
нематричный синтез олигодезоксинуклеотидов;
– гетеродимер HMG 1/2;
– гетеродимер Ku70/Ku80.
При наличии сегмента D (гены H-цепи иммуноглобулинов, β- и δ-цепей
TCR)
● сначала происходит перестройка на участке между D- и J-сегментами с
формированием тандема DJ.
● Далее перестройка захватывает участок между V- и DJ-сегментами.
● В обоих случаях сначала происходит реорганизация пространства между
перестраиваемыми участками с помощью RSS.
● Этот процесс начинается с экспрессии генов RAG.
● Молекулы RAG-1 и RAG-2 присоединяются к концам
последовательностей 12 и 23 соединяемых участков гена.
● Затем субъединицы RAG димеризуются и происходит сближение
связанных с ними участков.
● Этому способствует комплементарное взаимодействие пар гептамеров и
нонамеров, основанное на палиндромности этих последовательностей.
СМ РИСУНОК ВЫШЕ
● Этот процесс осуществляется с участием гетеродимера HMG1/2.
● В местах примыкания RSS к кодирующим последовательностям
происходит разрыв двух нитей ДНК (он катализируется рекомбиназой
RAG), причем не в точно определенной позиции, а с возможными
отклонениями в несколько нуклеотидных остатков.
● Разорванные нити ДНК замыкаются друг на друга.
● В результате формируется «шпилька», в которой ведущая нить ДНК
переходит в комплементарную ей нить.
● Вырезанный отрезок, содержащий RSS, замыкается при соединении
разорванных нитей. В результате формируется кольцевая структура —
рекомбинационное вырезанное кольцо (REC — от Recombination excision
circle).
На следующем этапе происходит «разрешение» шпилек с обеих сторон от
места разрыва: при участии ДНК-зависимой протеинкиназы
● эндонуклеаза повторно разрывает ДНК, но не на вершине «шпильки», а
сбоку, образуемые при этом отрезки ДНК различаются по длине.
● Более длинная нить разворачивается, и на ней комплементарно
достраивается вторая.
● Описанные события приводят к появлению в составе ДНК новой
последовательности, палиндромной по отношению к исходной.
● Такую последовательность называют «Р-вставка» (от Palindromic).
● В этот же очень короткий промежуток времени с участием TdT
происходит добавление на свободных концах ДНК олигонуклеотида
случайного состава.
● Поскольку синтез этого олигонуклеотида происходит не на матрице
ДНК, такой вариант вставки называют N-вставкой (от Nоntemplate).
● Протяженность N-вставок не превышает 20 нуклеотидов (обычно
меньше 10).
● Только после этого происходит воссоединение нитей ДНК с 5’- и 3’концов.
● В процессах репарации ДНК участвуют ДНК-лигаза IV, ДНКзависимая протеинкиназа и димер Ku70/Ku80.
● На этом процесс реаранжировки конкретного гена завершается.
● Сформированный зрелый ген может транскрибироваться.
● После сплайсинга мРНК с нее транслируется белок — цепь
иммуноглобулина или молекулы TCR
Описанные процессы происходят в 3’-концевой части V-гена — в участке,
сформированном при участии DJ-сегментов.
● Эта область соответствует третьему гипервариабельному участку —
CDR3. В результате этот участок значительно превосходит по
вариабельности CDR1 и CDR2, структура которых при реаранжировке Vгенов не изменяется.
2.Механизм изотипического переключения
иммуноглобулинов. Цитокиновая регуляция
Переключение константных генов иммуноглобулинов
В кластере генов IGH присутствует несколько С-генов, экспрессируемых в
определенной последовательности в комбинации с одним и тем же V-геном
благодаря особому механизму переключения.
Это служит молекулярной основой изотипического разнообразия
иммуноглобулинов и последовательной смены их классов при активации и
антигензависимой дифференцировке В-лимфоцитов.
Последовательность расположения С-генов в кластере IGH такова :
– у мышей — Сμ, Сδ, Сγ3, Сγ1, Сγ2b, Cγ2a, Cε, Cα;
– у человека — Cμ, Cδ, Cγ3, Cγ1, Cα1, Cγ2, Cγ4, Cε, Cα2.
У человека между Cγ1 и Сα1 расположен псевдоген, гомологичный Сε. С
учетом этого можно предположить, что расположение и набор С-генов у
человека отражает последствия дупликации (Сγ3, Сγ1, ψСε, Сα1 и Сγ2, Сγ4, Сε,
Сα2 представляют гомологичные наборы генов).
В наивных В-клетках при экспрессии генов кластера IGH информация
считывается с генов IGHV, IGHCM и IGHCD.
● В результате сплайсинга из мРНК удаляется интрон, расположенный
между генами V и Cμ, и формируется мРНК, кодирующая μ-цепь, или
удаляются упомянутый интрон и участок, кодирующий μ-цепь, и
формируется мРНК, кодирующая δ-цепь.
● В конечном счете одновременно синтезируются IgM и IgD,
одновременно экспрессируемые на поверхности наивной зрелой Вклетки.
Переключение изотипов Н-цепей запускается в процессе иммунного ответа.
● Для этого необходимо взаимодействие с Т-клетками, реализуемое через
молекулы CD40 и CD154, а также при помощи цитокинов.
● Основную роль в переключении играет последовательность S (от
switch — переключение), расположенная после V-гена и перед каждым Сгеном, кроме Cδ.
● S-последовательность имеет состав — GAGCT или GGGGGT.
● Переключению предшествует ее полимеризация (до 150 повторов).
● Одновременно происходит реорганизация хроматина с повышением
доступности для ферментов участков, вовлекаемых в переключение.
● Происходит сближение полимерных участков S и формируется петля, в
которую попадают С-гены, расположенные между V-геном и
«избранным» для экспрессии С-геном.
● Полимеризация S-сайтов делает их чувствительными к ДНКазе
(эндонуклеазе), осуществляющей двунитевые разрывы.
● Свободные концы сближаемых участков немедленно воссоединяются.
● разные С-гены соединяются с одним и тем же V-геном — единственным,
присутствующим в данной В-клетке, т.е. специфичность антител разных
классов, продуцируемых данной клеткой, не изменяется.
Процесс переключения изотипов :
Обычно переключение — необратимый процесс, поскольку при этом
происходит утрата материала, попадающего в вырезаемую петлю.
Для переключения необходимо действие цитокинов, секретируемых в
основном Т-хелперами.
● Именно поэтому переключение изотипов происходит преимущественно
при Т-зависимом иммунном ответе.
На схеме отражено дифференцированное действие цитокинов при
переключении на различные изотипы иммуноглобулинов.
У мышей :
Известно, что IL-4 обеспечивает переключение на IgG1 и (особенно
специфично) на IgE, а IFNγ — на IgG2a (c меньшей определенностью — на
IgG3).
Еще один цитокин — трансформирующий фактор роста β (TGFβ) —
способствует переключению на IgA и, вероятно, на IgG2b.
У человека :
IL-4 - переключении на IgE.
Переключение классов и с. Гипермутагенез (это я для себя, но если разберете
текст, пользуйтесь на Здоровье)
Колок 3
1. Культуры клеток. классификации клеточных культур
Культивирование клеток — процесс, посредством которого in vitro отдельные клетки
прокариот или эукариот выращиваются в контролируемых условиях.
Классификация:
2. Фаговые дисплеи
Фаговый дисплей - это лабораторный метод исследования белок-белок,
белок - пептид и взаимодействия белок-ДНК, в которых используются
бактериофаги (вирусы , заражающие бактерии ) для связывания белков с
генетической информацией, которая кодирует их . В этом методе ген,
кодирующий интересующий белок, вставляют в ген белка оболочки фага ,
заставляя фаг «отображать» белок на своей внешней стороне, в то время
как ген этого белка находится внутри, в результате чего в связи между
генотипом и фенотипом . Затем эти отображающие фаги можно
подвергнуть скринингу против других белков, пептидов или
последовательностей ДНК, чтобы обнаружить взаимодействие между
отображаемым белком и этими другими молекулами. Таким образом,
большие библиотеки белков могут быть подвергнуты скринингу и
амплифицированы в процессе, называемом in vitro отбор, который
аналогичен естественному отбору .
Наиболее распространенными бактериофагами, используемыми в фаговом
дисплее, являются M13 и fd нитчатый фаг , хотя также использовались
фаги T4,T7и λ.
Принцип метода:
Как и двухгибридная система , фаговый дисплей используется для пропускной скрининг белковых взаимодействий. В случае дисплея
нитчатого фага M13 ДНК, кодирующая интересующий белок или пептид
лигируется с геном pIII или pVIII, кодирующим либо минорный, либо
мажорный белок оболочки. соответственно. Множественные сайты
клонирования иногда используются, чтобы гарантировать, что фрагменты
вставлены во все три возможных рамки считывания , так что кДНК
фрагмент транслируется в правильном кадре. Затем фаговый ген и вставка
ДНК-гибрид вставляют (процесс, известный как «трансдукция ») в E. coli ,
такие как TG1, SS320, ER2738 или XL1-Blue E. coli. Если используется
«фагмида » вектор (вектор упрощенной дисплейной конструкции) фаговые
частицы не будут высвобождаться из клеток E. coli, пока они не будут
инфицированы фаг-помощник , который обеспечивает упаковку ДНК фага
и сборку зрелых вирионов с соответствующим фрагментом белка как
частью их внешней оболочки на минорном (pIII) или большом (pVIII) )
белок оболочки. Путем иммобилизации соответствующей ДНК или
белковой мишени на поверхности лунки микротитровального планшета
фаг, который отображает белок, который связывается с одной из этих
мишеней на своей поверхности, останется, в то время как другие будут
удалены промыванием. . Те, что остались, можно элюировать ,
использовать для продуцирования большего количества фага
(посредством бактериальной инфекции с помощью фага-помощника) и для
получения смеси фагов, обогащенной релевантным (т.е. связывающимся)
фагом. Повторяющееся циклическое выполнение этих шагов называется
«панорамированием» в отношении обогащения образца золота путем
удаления нежелательных материалов. Фаг, элюированный на последней
стадии, может быть использован для заражения подходящего
бактериального хозяина, из которого могут быть собраны фагмиды, а
соответствующая последовательность ДНК вырезана и секвенирована для
идентификации релевантных взаимодействующих белков или белковых
фрагментов.
Использование фага-помощника можно исключить с помощью технологии
«бактериальной упаковывающей клеточной линии».
Элюирование можно проводить, комбинируя элюцию с низким pH
буфером с обработкой ультразвуком, который, помимо ослабления
взаимодействия пептид-мишень, также служит для отделения молекулымишени от поверхности иммобилизации. Этот метод на основе
ультразвука обеспечивает одноэтапный выбор пептида с высоким
сродством.