ИНСТРУКЦИЯ ПО ОСВОЕНИЮ СИСТЕМЫ ОБРАБОТКИ ДАННЫХ Agilent ChemStation Фирма Agilent Technologies Каталожный номер: G2070-91115 Редакция: 06/03 Документ издан в Германии 2 Авторское право фирмы Agilent Technologies на данный документ зарегистрировано в 2003 году. Никакая часть этого документа не подлежит заимствованию, копированию или воспроизведению в любом виде и любыми средствами (включая ксерокопирование, запись в электронную память, использование в поисковых системах или перевод) без получения на то письменного разрешения фирмы Agilent Technologies Inc. (за исключением случаев, предусмотренных международными Законами об авторских правах). "Microsoft" - торговая марка, зарегистрированная фирмой "Microsoft Corporation" Этот документ соответствует вариантам A.10.xx программного обеспечения Agilent ChemStation (где xx – числа, отображающие небольшие изменения программного обеспечения и не влияющие на пригодность документации). Гарантийные обязательства Информация, приведенная в данном документе, может меняться (при последующих переизданиях) без уведомления. Кроме того, в максимальной степени (дозволенной действующим законом), фирма Agilent не несет никаких гарантийных обязательств по излагаемому материалу, включая гарантийные обязательства по пригодности к перепродаже и по пригодности для конкретных целей (отказ от гарантийных обязательств не ограничивается теми, которые названы выше). Фирма Agilent не несет ответственности за допущенные в данном документе ошибки, за случайные или последственные повреждения, связанные с качеством этого документа или пользованием документом. Если же фирма Agilent и покупатель заключили специальное письменное соглашение о гарантийных обязательствах, касающихся данного документа (и если эти обязательства противоречат сделанным выше оговоркам), действующими становятся формулировки такого подписанного соглашения. Лицензирование технических решений Аппаратурная оснастка и (или) программное обеспечение, описанные в этом документе, защищены лицензией. Могут использоваться или копироваться только при соблюдении условий, сформулированных в тексте этой лицензии. Предупреждения и предостережения об опасных ситуациях Предостережения ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ предупреждает об опасности; обращает внимание на процедуру, способ работы и т.д., которые (при неправильном выполнении и при отступлении от указаний) могут привести к повреждению прибора или к потере важных данных. Не выполняйте действия, указанные за ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕМ, до тех пор, пока его смысл не будет полностью осознан. 3 ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ предостерегает об опасности; обращает внимание на процедуру, способ работы и т.д., которые (при неправильном выполнении и при отступлении от указаний) могут привести к получению травмы или к смертельному исходу. Не выполняйте действия, указанные за ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕМ, до тех пор, пока его смысл не будет полностью осознан. Сведения о данном документе В данном документе описаны различные функции, реализуемые системой Agilent ChemStation. Описание должно помочь вам освоить эту систему. Раздел 1. Особенности системы Agilent ChemStation В этом разделе рассматриваются особенности программного обеспечения ChemStation и основные его позиции. Для получения дополнительной информации, касающейся решения конкретных прикладных задач, см. подсказывающие изображения, выводимые на экран непосредственно во время работы (в ответ на запрос помощи [Help]) или воспользуйтесь программой-самоучителем (такая программа встроена в предоставляемое программное обеспечение ChemStation). Раздел 2. Методы Этот раздел посвящен описанию методов и правил их использования. Раздел 3. Сбор данных В этом разделе описываются подходы к сбору данных, файлы данных, протокольный журнал. Приводятся дополнительные сведения. Раздел 4. Интегрирование Раздел посвящен рассмотрению алгоритмов интегрирования, обеспечиваемых системой обработки данных ChemStation. Раздел 5. Стандартный алгоритм интегрирования В этом разделе описаны стандартный алгоритм интегрирования, процесс интегрирования, управление интегрированием вручную. Раздел 6. Усовершенствованный алгоритм интегрирования Раздел посвящен рассмотрению усовершенствованного алгоритма интегрирования. Поясняется как добиться правильного интегрирования пиков реальных хроматограмм (электрофореграмм), как пользоваться усовершенствованной системой интегрирования. 4 Раздел 7. Опознание пиков В этом разделе поясняются подходы к опознанию пиков. Раздел 8. Количественный анализ Описывается, каким образом система ChemStation производит количественный анализ. Подробно рассматриваются подсчеты по проценту площади (area%), по проценту высоты (height%), метод внешнего стандарта (ESTD), подсчет нормализационного процента (norm%), метод внутреннего стандарта (ISTD), подходы к количественному подсчету по тем пикам, которые не были опознаны. Раздел 9. Калибровка Этот раздел посвящен калибровке, выполняемой системой ChemStation. Раздел 10. Автоматизация В разделе рассматриваются способы автоматизации. Поясняется, как пользоваться заданными системе ChemStation программами анализов; что происходит при реализации программ анализов. Даются указания по составлению специфичных программ анализов. Раздел 11. Быстрый просмотр результатов анализа серии образцов Обсуждается подход к быстрому просмотру результатов анализа серии образцов (Batch Review). Описаны групповой файл; функции, реализуемые при скоростном просмотре результатов; вывод сообщения итогов быстрого просмотра. Раздел 12. Сообщения результатов Поясняется состав сообщения результатов. Подробно обсуждаются сообщаемые итоги анализов; количественные результаты; виды сообщений результатов; адреса, по которым выводятся сообщения результатов; получение краткого сообщения результатов выполнения программы анализов. Раздел 13. Оценка пригодности системы Раздел 14. Метрологическая аттестация системы 5 СОДЕРЖАНИЕ РАЗДЕЛ 1. ОСОБЕННОСТИ СИСТЕМЫ AGILENT CHEMSTATION.......................... 15 Общее описание..............................................................................................................................15 Вспомогательные модули ...........................................................................................................16 Вспомогательные части программного обеспечения, обслуживающие обработку информации..................................................................................................................................16 Системы Agilent ChemStation, ответственные только за обработку информации ................17 Аппаратурная оснастка системы Agilent ChemStation ..........................................................18 О программном обеспечении ChemStation ...............................................................................18 Операционная система ................................................................................................................18 Методы и программы анализов..................................................................................................18 Конфигурация системы...............................................................................................................18 Модель сбора данных..................................................................................................................18 Информация, выводимая на экран для наглядного общения оператора с системой ............19 Сбор данных.................................................................................................................................20 Анализ данных - выводимая на экран информация .................................................................21 Анализ данных - интегрирование ..............................................................................................22 Анализ данных - количественная оценка ..................................................................................24 Анализ данных - вывод стандартного сообщения результатов ..............................................24 Анализ данных - получение специализированных распечаток результатов .........................24 Обслуживающие программы и совместимость систем ...........................................................28 Приспособление системы к решению специфичных задач.....................................................29 Автоматизация .............................................................................................................................30 Требования к организации работ в лаборатории......................................................................31 Управление работой прибора......................................................................................................34 Подключение к информационной сети .....................................................................................34 Документация.................................................................................................................................35 Структура заголовков, используемых системой ChemStation .............................................37 РАЗДЕЛ 2. МЕТОДЫ ..................................................................................................... 41 Что представляет собой метод? ..................................................................................................41 Части метода...................................................................................................................................41 Информация о методе (Method Information) .............................................................................42 Управление работой прибора (Instrument Control)...................................................................42 Анализ данных (Data Analysis)...................................................................................................42 Программа того, что подлежит выполнению во время обслуживания разгонки, до нее и после ее завершения (Run Time Checklist) ......................................................................43 Состояние методов ........................................................................................................................44 Метод, записанный в память (Stored Method)...........................................................................44 Текущий метод (Current Method) ...............................................................................................44 6 Создание методов...........................................................................................................................44 Редактирование методов ..............................................................................................................45 Части метода, подлежащие редактированию (Methods Parts to Edit) .....................................45 Структура заголовков, под которые записываются файлы методов .................................46 Что происходит при реализации метода? .................................................................................47 Реализация метода .......................................................................................................................48 Команда или макрокоманда, подлежащая отработке до начала обслуживания разгонки (Prerun Command or Macro) ........................................................................................49 Сбор данных (Data Acquisition)..................................................................................................49 Анализ данных (Data Analysis)...................................................................................................49 Приспособленный (нестандартный) вариант анализа данных (Customized Data Analysis) .......................................................................................................................................51 Запись данных в память согласно требованиям GLP (Требованиям к организации работ в лаборатории) [Save GLP Data) ......................................................................................51 Команда или макрокоманда, подлежащая отработке после завершения хроматографической разгонки (Postrun Command or Macro) ..................................................51 Запись копии метода в память вместе с данными (Save Copy of Method with Data) ............51 Краткое указание того, что обеспечивается при реализации метода .................................52 РАЗДЕЛ 3. СБОР ДАННЫХ .......................................................................................... 53 Что представляет собой сбор данных? ......................................................................................53 Файлы данных ...............................................................................................................................53 Вид информации, выводимой на экран в реальном масштабе времени ............................54 Просмотр сигнала в реальном масштабе времени ...................................................................55 Просмотр спектрограмм в реальном масштабе времени.........................................................55 Протокольные записи (Logbook) ................................................................................................55 Информация о состоянии системы ChemStation.....................................................................55 Планка со сведениями о состоянии ...........................................................................................56 Показ схемы системы на экране.................................................................................................56 РАЗДЕЛ 4. ИНТЕГРИРОВАНИЕ ................................................................................... 57 Что представляет собой интегрирование? ...............................................................................57 Что делается при интегрировании?...........................................................................................57 Алгоритмы интегрирования, предусмотренные системой Agilent ChemStation ..............58 Краткая история внедрения стандартного алгоритма интегрирования .................................58 Совместимость .............................................................................................................................58 Внедрение улучшенного алгоритма интегрирования ..............................................................59 Общие (для двух алгоритмов) реализуемые возможности......................................................59 Улучшенные возможности, предоставляемые новым алгоритмом интегрирования............60 7 РАЗДЕЛ 5. СТАНДАРТНЫЙ АЛГОРИТМ ИНТЕГРИРОВАНИЯ ................................. 60 Стандартный алгоритм интегрирования .................................................................................61 Как обеспечивается интегрирование?.......................................................................................61 Выявление пика.............................................................................................................................62 Интегрирование обособленных пиков.......................................................................................62 Уточнение положения базовой линии .......................................................................................65 Коды коррекции базовой линии .................................................................................................65 Изменение логики проведения базовой линии .........................................................................67 Заходы за базовую линию...........................................................................................................68 Выборка по касательной .............................................................................................................68 Измерение площади пиков ..........................................................................................................68 Параметры, определяющие режим интегрирования .............................................................71 Исходные параметры, определяющие режим интегрирования ..............................................71 Ширина пиков (Peak Width)........................................................................................................71 Изменение порога и ширины пика.............................................................................................74 Специфичная подстройка режимов интегрирования ...............................................................75 Программируемые по времени события ...................................................................................76 Таблицы с параметрами, определяющими режим интегрирования (Integration Events) ..............................................................................................................................................77 Методы интегрирования..............................................................................................................77 Автоматическое интегрирование (Autointegration) ..................................................................77 Интегрирование по команде Integratе........................................................................................78 Управление интегрированием вручную (Manual Integration)..................................................79 РАЗДЕЛ 6. УЛУЧШЕННЫЙ АЛГОРИТМ ИНТЕГРИРОВАНИЯ .................................. 82 Улучшенный алгоритм интегрирования..................................................................................82 Как можно приспособить улучшенный алгоритм интегрирования к конкретной имеющейся системе? .....................................................................................................................83 Неизменные параметры, определяющие режим интегрирования ..........................................83 Приспосабливаемые параметры, определяющие режим интегрирования.............................83 Как выполняется улучшенное интегрирование?....................................................................84 Выявление исходной базовой линии .........................................................................................85 Прослеживание базовой линии ..................................................................................................85 Выявление базовой линии ..........................................................................................................86 Выявление начала, конца и вершины пика ...............................................................................86 Интегрирование пиков реальных хроматограмм (электрофореграмм).............................87 Более подробная информация об улучшенном алгоритме интегрирования.....................88 8 Выявление пиков...........................................................................................................................88 Параметр "ширина пика" (Peak Width)......................................................................................88 Фильтры, употребляемые для выявления пика ........................................................................89 Группировка данных ...................................................................................................................90 Алгоритм выявления пика ..........................................................................................................91 Алгоритм выявления вершины пика .........................................................................................92 Подсчеты, выполняемые применительно к пикам, имеющим не гауссовскую форму ........92 Выявление базовой линии ...........................................................................................................93 Подход к выявлению базовой линии, предполагаемый самой системой автоматически ....94 Начальный участок базовой линии............................................................................................94 Маркерные риски.........................................................................................................................95 Конечный участок базовой линии..............................................................................................95 Коды коррекции базовой линии .................................................................................................95 Изменение логики проведения базовой линии .........................................................................97 Заходы за базовую линию...........................................................................................................98 Выборка по касательной .............................................................................................................98 Зона, площадь которой не вошла в пик .....................................................................................99 Измерение площади пиков ........................................................................................................100 Симметричность пиков .............................................................................................................102 Параметры, определяющие режим интегрирования ...........................................................102 Исходные параметры, определяющие режим интегрирования ............................................102 Параметр Peak Width (ширина пика) .......................................................................................103 Изменение значений параметров Height Reject (исключаемая высота) и Peak Width (ширина пика) ............................................................................................................................104 Приспособление режима интегрирования для решения специфичных задач .....................105 Программируемые по времени параметры, определяющие режим интегрирования .........106 Таблицы с параметрами, определяющими режим интегрирования.................................106 Пользование улучшенным алгоритмом интегрирования...................................................107 Интегрирование (Integration) ....................................................................................................107 Автоматическое интегрирование (Autointegration) ..............................................................107 Ограничения...............................................................................................................................108 Управление интегрированием вручную (Manual Integration)............................................109 Коды коррекции базовой линии...............................................................................................110 Процесс управления интегрированием вручную ...................................................................110 Запись команд, соответствующих интегрированию вручную, в метод ...............................111 РАЗДЕЛ 7. ОПОЗНАНИЕ ПИКОВ ............................................................................... 112 Что представляет собой опознание пиков? ............................................................................112 Правила оценки совпадения пиков .........................................................................................113 9 Критерии, используемые при опознании пиков....................................................................113 Абсолютное время удерживания (время миграции) ..............................................................113 Относительное время удерживания (время миграции)..........................................................114 Подтверждающие пики .............................................................................................................114 Ограничения по количествам ...................................................................................................114 Абсолютное время удерживания (время миграции) ............................................................114 Относительное время удерживания (время миграции).......................................................116 Пользование одиночным контрольным пиком.......................................................................116 Пользование несколькими контрольными пиками ................................................................116 Подтверждающие пики ..............................................................................................................117 Соотнесение хроматограмм (электрофореграмм) ..................................................................118 Проверка по подтверждающим пикам ....................................................................................118 Подсчет подтверждающего отношения...................................................................................118 Процесс опознания ......................................................................................................................119 Поиск контрольных пиков ........................................................................................................119 Поиск пиков внутреннего стандарта .......................................................................................120 Поиск остальных прокалиброванных пиков...........................................................................120 Классификация тех пиков, которые не были опознаны.........................................................120 РАЗДЕЛ 8. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ ................................................................ 120 Что представляет собой количественный анализ? ...............................................................121 Подсчеты, выполняемые при количественном анализе......................................................122 Коэффициенты чувствительности ...........................................................................................122 Абсолютный коэффициент чувствительности (Absolute Response Factor)..........................122 Масштабный коэффициент (Multiplier)...................................................................................122 Коэффициент разбавления (Dilution Factor) ...........................................................................123 Количество образца (Sample Amount) .....................................................................................123 Способы подсчета без калибровки...........................................................................................123 Подсчет по проценту площади и по проценту высоты (Area% и Height%).........................123 Способы подсчета с калибровкой ............................................................................................124 Подсчет по методу внешнего стандарта (ESTD)....................................................................124 Процентный подсчет по методу нормализации (Norm %) ..................................................126 Подсчет по методу внутреннего стандарта (ISTD)................................................................126 Первая разгонка: калибровка....................................................................................................127 Вторая разгонка: анализ интересующего образца..................................................................128 Подсчет прокалиброванных пиков по методу внутреннего стандарта ................................128 Подсчет непрокалиброванных пиков по методу внутреннего стандарта ............................129 10 РАЗДЕЛ 9. КАЛИБРОВКА ........................................................................................... 130 Терминология...............................................................................................................................130 Калибровочная таблица .............................................................................................................131 Калибровочный график .............................................................................................................132 Исследуемые образцы .................................................................................................................133 Типы калибровки ........................................................................................................................134 Одноуровневая калибровка ......................................................................................................134 Многоуровневая калибровка ....................................................................................................136 Калибруемые диапазоны...........................................................................................................137 Виды подгонок калибровочных графиков ..............................................................................137 Учет начала координат..............................................................................................................137 Калибровка для группы веществ .............................................................................................140 Суммирование пиков..................................................................................................................140 Перекалибровка...........................................................................................................................141 Что представляет собой перекалибровка?...............................................................................141 Почему требуется перекалибровка? ........................................................................................141 Перекалибровка при введении данных вручную....................................................................142 Перекалибровки при пользовании суммированием пиков....................................................142 Варианты обновления данных при перекалибровке ..............................................................142 Способы перекалибровки .........................................................................................................143 Перекалибровка неопознанных пиков (Recalibration of Unidentified Peaks)........................143 РАЗДЕЛ 10. АВТОМАТИЗАЦИЯ................................................................................. 144 Что представляет собой автоматизация? ...............................................................................144 Что представляет собой программа анализов? .....................................................................144 Параметры, соответствующие программе анализов (Sequence Parameters) ...................145 Таблица последовательности (Sequence Table)......................................................................145 Создание программ анализов....................................................................................................146 Пользование клавишей Insert Vial Range... (указание диапазона образцов ...)....................146 Пользование клавишей Append Line (добавление строки)....................................................146 Работа с программами анализов ..............................................................................................146 Приоритетные образцы .............................................................................................................147 Указание контрольных образцов при составлении программ анализов ..............................147 Прекращение выполнения программы анализов подачей команды остановки (Stop) .......147 Отказ от выполнения программы анализов (с помощью функции Abort)...........................147 Приостановка выполнения программы анализов...................................................................147 Частичное выполнение программы анализов .........................................................................148 11 Файл с протоколом выполнения программы анализов ......................................................150 Что происходит при выполнении программы анализов? ...................................................150 Присвоение названий файлам при выполнении программы анализов ...........................151 Автоматическое присвоение названий файлам данных при выполнении программы анализов ......................................................................................................................................152 Присвоение названий файлом данных при выполнении программы анализов согласно указаниям, введенным вручную...............................................................................152 Работа системы после завершения выполнения программы анализов ...........................153 Отключение из-за того, что прибор не готов (только при обслуживании жидкостного хроматографа и системы для капиллярного электрофореза) ................................................154 Период ожидания после вызова метода (только при обслуживании жидкостного хроматографа и системы для капиллярного электрофореза) ................................................154 Автоматическая перекалибровка ............................................................................................154 Запрос проведения перекалибровок ........................................................................................154 Параметры для перекалибровки, записываемые в таблицу последовательности ...............155 Типы программ анализов ..........................................................................................................157 Программы анализов с перекалибровкой по указанию ......................................................157 Программы анализов с периодической 1-уровневой перекалибровкой ..........................157 Программы анализов с периодической многоуровневой перекалибровкой ...................157 Порядок выполнения анализов соответственно методу А ....................................................159 Порядок выполнения анализов соответственно методу В ....................................................159 Программа анализов с перекалибровкой по указанию и с периодической перекалибровкой .........................................................................................................................160 Пример ........................................................................................................................................160 Порядок выполнения анализов по методу SimpReg ..............................................................161 Программа анализов с периодической перекалибровкой, использующая метод охвата .............................................................................................................................................162 Пример ........................................................................................................................................162 Последовательность работы при пользовании методом охвата ...........................................163 Пример ........................................................................................................................................164 Порядок выполнения анализов при пользовании методом охвата.......................................165 Программа анализов с периодической перекалибровкой при работе с многими флаконами, в которые залит тот же самый раствор смеси стандартов ...........................166 Программа анализов, предусматривающая периодическую перекалибровку при пользовании калибровочными стандартами под большие серии сличительных анализов ......................................................................................................................................166 Периодическая перекалибровка с введением калибровочного образца каждый раз из нового флакона ...............................................................................................................168 12 Программа анализа, реализующая метод охвата и оговаривающая введение калибровочных стандартов из разных флаконов (из одного флакона перед анализом образца и из другого флакона после завершения этого анализа) .........................................168 РАЗДЕЛ 11. БЫСТРЫЙ ПРОСМОТР РЕЗУЛЬТАТОВ АНАЛИЗА СЕРИИ ОБРАЗЦОВ................................................................................................................... 170 Цель просмотра результатов анализа серии образцов.........................................................170 Указание серии образцов ...........................................................................................................170 Таблица содержимого группового файла (Batch Table) ........................................................171 Таблица веществ (Compound Table).........................................................................................171 Сообщение результатов анализа серии образцов ...................................................................172 Изображение, способствующее общению системы ChemStation с ее владельцем .............172 Функции, способствующие просмотру результатов.............................................................172 Сообщение итогов просмотра результатов анализа серии образцов ................................173 Сохранение сведений о пользовании групповым файлом (Batch History)...........................174 РАЗДЕЛ 12. СООБЩЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ .............................................................. 174 Что представляет собой сообщение?........................................................................................174 Сообщения результатов .............................................................................................................175 Сообщение результатов подсчета, проведенного без калибровки .......................................175 Сообщение результатов подсчета, выполненного после калибровки ..................................175 Сообщение результатов подсчета по методу внешнего стандарта (ESTD) .........................175 Сообщение результатов подсчета по методу внутреннего стандарта (ISTD) .....................176 Сообщение результатов с заполнением контрольных карт...................................................176 Результаты количественного анализа.....................................................................................176 Виды сообщений результатов (Report Styles).........................................................................177 Добавление бланка нестандартного сообщения результатов в перечень видов сообщений результатов.............................................................................................................180 Прочие параметры, определяющие вид сообщения результатов ......................................181 Таблица, обслуживающая суммирование пиков ....................................................................181 Вид сообщения о непрокалиброванных пиках .......................................................................181 Куда выводится сообщение результатов ................................................................................181 Форматы файлов сообщений результатов...............................................................................182 Получение распечатки сообщения сводных данных, полученных при выполнении программы анализов...........................................................................................183 Обзор...........................................................................................................................................183 Указание вида распечатки сообщения сводных данных, полученных при выполнении программы анализов............................................................................................184 13 РАЗДЕЛ 13. ОЦЕНКА ПРИГОДНОСТИ СИСТЕМЫ .................................................. 187 Определение уровня шума.........................................................................................................189 Подсчет уровня шума по 6-кратному стандартное отклонению от графика ухода базовой линии ............................................................................................................................190 Подсчет уровня шума от пика до пика ....................................................................................191 Подсчет уровня шума согласно методу, разработанному Американским обществом по испытанию материалов (ASTM) .....................................................................191 Подсчет отношения сигнала к шуму .......................................................................................193 Уход (Drift) и блуждание базовой линии (Wander)................................................................193 Подсчет симметричности пика .................................................................................................194 Формулы и подсчеты, используемые при проверке пригодности системы ....................195 Общие определения терминологии..........................................................................................196 Мертвый объем V (мл) ..............................................................................................................196 Время удерживания вещества, не способного удерживаться колонкой t(m) (мин) [иногда этот параметр называют мертвым объемом] ............................................................196 Определения параметров, используемых при оценке эффективности системы ............196 Статистические моменты..........................................................................................................196 Статистические моменты, перекос и избыточность ..............................................................197 Фактическая ширина пика Wх [мин или сек]..........................................................................197 Нагрузочный коэффициент k’ (фармакопея США), емкостное соотношение (Американское общество по испытанию материалов) ..........................................................198 Показатель затянутости t (фармакопея США)........................................................................198 Число теоретических тарелок на колонку (фармакопея США, Американское общество по испытанию материалов) .....................................................................................199 Число теоретических тарелок на метр, N [1/м].......................................................................200 Относительное удерживание (фармакопея США, Американское общество по испытанию материалов), селективность α..............................................................................200 Разрешающая способность R (фармакопея США, Американское общество по испытанию материалов)............................................................................................................200 Определения параметров, используемых при проверке воспроизводимости.................201 Среднее значение (M)................................................................................................................201 Стандартное отклонение (S) .....................................................................................................202 Относительное стандартное отклонение RSD[%] (фармакопея США) ...............................202 Стандартное отклонение среднего (SM) ..................................................................................202 Доверительный интервал (CI) ..................................................................................................203 Регрессионный анализ...............................................................................................................203 Регрессионный коэффициент (r) ..............................................................................................204 Стандартное отклонение (S) .....................................................................................................204 Доступ к записываемым в систему числам (значениям параметров), характеризующимся «удвоенной» точностью .......................................................................204 РАЗДЕЛ 14. МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ АТТЕСТАЦИЯ СИСТЕМЫ ............................... 208 Метрологическая аттестация системы ...................................................................................208 14 Поля просмотра аттестационной и диагностической информации......................................211 Регистр, в который записываются данные, предусмотренные Требованиями к организации работ в лаборатории (Требованиями GLP) ....................................................211 Проверка детектора с диодной матрицей ...............................................................................212 Просмотр результатов проверки детектора с диодной матрицей (Review DAD Test) .......213 15 Раздел 1. Особенности системы Agilent ChemStation Общее описание Системы ChemStation предназначены для обслуживания газовых хроматографов; жидкостных хроматографов; системы "жидкостной хроматограф - масс-селективный детектор"; системы для капиллярного электрофореза; обработки сигналов, снимаемых с аналого-цифровых преобразователей. Обслуживаются следующие приборы: • Газовые хроматографы HP 5890 Серии II и газовые хроматографы Agilent 6890 • Высокоэффективные жидкостные хроматографы Agilent HP 1100 и отдельные блоки этих хроматографов • Система "жидкостной хроматограф - масс-селективный детектор" (относящаяся к Серии Agilent 1100) • Высокоэффективные жидкостные хроматографы Серии HP 1090 • Высокоэффективные жидкостные хроматографы Серии HP 1050 и отдельные блоки этих хроматографов • Система Agilent для капиллярного электрофореза • 2-канальные устройства сопряжения (аналого-цифровые преобразователи) Agilent 35900E Программное обеспечение Agilent ChemStation загружается в персональные вычислительные машины, совместимые с IBM; работающие под оболочкой Microsoft Windows 2000 и Microsoft Windows XP Professional. Продается обслуживающее 1 прибор базовое программное обеспечение ChemStation, но в 5 вариантах. Этими 5 вариантами обслуживаются сбор данных, управление работой прибора, анализ данных (интегрирование, количественная оценка и сообщение результатов), автоматизация и приспособление (при работе с 1 аналитическим прибором) к решению нестандартных задач. Считается, что в конкретный период времени система способна обслуживать 1 прибор, но она может параллельно собирать данные от ряда различных детекторов. Возможна поставка следующих 5 вариантов системы: • Система Agilent ChemStation, обслуживающая 1 газовый хроматограф (системе присвоен номер G2070AA) • Система Agilent ChemStation, обслуживающая 1 жидкостной хроматограф (системе присвоен номер G2170AA) • Система Agilent ChemStation, обслуживающая систему "жидкостной хроматограф - массселективный детектор" (этой системе присвоен номер G2710AА) 16 • • Система Agilent ChemStation, обслуживающая 1 систему для капиллярного электрофореза (системе присвоен номер G1601A) Система (A/D) Agilent ChemStation, обслуживающая 1 аналого-цифровой преобразователь (без управления работой прибора; реализуются сбор аналоговых данных, подача сигналов и команд дистанционным устройствам [прием сигналов и команд от таких устройств]) [cистеме присвоен номер G2072AА] Способность систем Agilent ChemStation управлять работой оборудования может быть расширена благодаря покупке вспомогательных модулей, дающих возможность параллельной работы с несколькими приборами и в смешанном режиме управления (например, возможно управление работой жидкостного и газового хроматографов). Вспомогательные модули К таким дополнительным модулям (обслуживающим управление приборами и сбор данных) относятся: • Вспомогательный модуль для обслуживания работы с газовым хроматографом (управление и сбор данных) [номер модуля G2071AA] • Вспомогательный модуль для обслуживания работы с жидкостным хроматографом (управление и сбор данных) [номер модуля G2171AA] • Вспомогательный модуль для обслуживания работы с системой "жидкостной хроматограф - масс-селективный детектор" (управление, сбор данных и обработка информации) [номер модуля G2715AA] • Вспомогательный модуль для обслуживания работы с системой для капиллярного электрофореза (управление, сбор данных и обработка информации) [номер модуля G2172AA] • Вспомогательный модуль для обслуживания работы с аналого-цифровым преобразователем (сбор аналоговых данных) [номер модуля G2073AA] Вспомогательные части программного обеспечения, обслуживающие обработку информации Возможности обработки данных можно расширить и за счет приобретения вспомогательных частей программного обеспечения для решения специальных задач: • Вспомогательная часть программного обеспечения, обслуживающая сбор и обработку данных, поступающих с детектора с диодной матрицей (этой части присвоен номер G2180AA) 17 • Вспомогательная часть программного обеспечения, ответственная за обработку сведений об образцах и сбор банка результатов (этой части присвоены название ChemStore и номер G2181AA). • Вспомогательная часть программного обеспечения, ответственная за обработку сведений, поступающих с системы "жидкостной хроматограф - масс-селективный детектор" (этой частью программного обеспечения реализуются деконволюция и пересчет данных, приобретаемых в ходе биохимического анализа) [присвоен номер G2720AA] К каждой системе Agilent ChemStation можно подключать до 4 хроматографов). Если приборы оснащены детекторами с диодной матрицей (жидкостные хроматографы или системы для капиллярного электрофореза), необходимо учесть, что одна система Agilent ChemStation способна обслуживать не более 2 таких детекторов, из-за чего общее количество обслуживаемых приборов не может быть более трех. Когда система Agilent ChemStation, предназначенная для обслуживания системы "жидкостной хроматограф - массселективный детектор", используется для управления работой блоков жидкостного хроматографа (или хроматографа Agilent 1100, или хроматографа HP 1090 Серии II) и массселективного детектора, никаких других приборов подключить к вычислительной машине не удается. Системы Agilent ChemStation, ответственные только за обработку информации Существуют еще 3 варианта системы Agilent ChemStation, ведущие только обработку данных (не управляющие работой приборов). Эти системы предназначены только для оценки и анализа данных в конторских условиях: • Система Agilent ChemStation для оценки хроматографических данных (дает те же возможности оценки данных, что и основные варианты систем Agilent ChemStatiоn) [этой системе присвоен номер G2090AA] • Система Agilent ChemStation для оценки данных, собранных с помощью жидкостного хроматографа, и спектральной информации (дает те же возможности, что и основной вариант системы Agilent ChemStation, оснащенный вспомогательной частью программного обеспечения для обработки данных, собранных с помощью детектора с диодной матрицей) [этой системе присвоен номер G2190AA] • Система Agilent ChemStation для оценки данных, собранных с помощью системы "жидкостной хроматограф - масс-селективный детектор" (дает те же возможности, что и основной вариант системы Agilent ChemStation, оснащенный вспомогательной частью программного обеспечения для обработки данных, собранных с помощью детектора с диодной матрицей и с помощью масс-спектрометра) [этой системе присвоен номер G2730AA] 18 Аппаратурная оснастка системы Agilent ChemStation Для получения подробной информации об аппаратурной оснастке системы Agilent ChemStation, см. Инструкцию по установке системы обработки данных Agilent ChemStation. О программном обеспечении ChemStation Операционная система Программным обеспечением Agilent ChemStation используется операционная система Microsoft Windows 2000 Professional (SP2 или SP3) или Windows XP Professional (SP1a). Если необходимо пользоваться предусмотренными системой Agilent ChemStation контрольными картами (Control Chart), требуется дооснащение программным обеспечением Microsoft Excell 97. Методы и программы анализов Методом анализа полностью описывается конкретное выполняемое разделение; указываются все параметры, используемые для управления работой прибора, сбора данных и количественной их оценки (включая параметры, соответствующие интегрированию, количественной обработке информации и выводу сообщений результатов). Система способна проводить автоматический анализ серии образцов при пользовании разными методами. Управляющий файл, обслуживающий такую работу, называют файлом последовательности. В него записываются индивидуальные сведения об образцах, ссылки на соответствующие методы, правила выполнения автоматических перекалибровок. Для получения более подробной информации о методах и программах анализов, см. раздел 10 ("Автоматизация") и подсказывающие сообщения, выводимые на экран в ответ на запрос помощи (Help). Конфигурация системы Конфигурация аналитической системы указывается с помощью специальной редактирующей программы. Вам предоставляется возможность указать конкретные (подключенные) приборы и блоки, их адреса (для шины GPIB или шины LAN); заголовки для записи данных, программ анализов и методов; цвета, используемые для представления системой ChemStation информации на экране. Для получения более подробной информации, см. инструкции, поставляемые с отдельными модулями системы Agilent ChemStation. Модель сбора данных Системой Agilent ChemStation используется такая модель сбора данных, которая предусматривает запись сведений в ячейки памяти, называемые регистрами. Эти многоцелевые регистры способны удерживать 2-мерные аналитические данные и 19 информацию (например, данные о времени и амплитуде сигнала); 3-мерные аналитические данные и информацию (например, данные о времени, амплитуде сигнала и длине волны). Программным обеспечением ChemStation предоставляются команды и функции, обслуживающие создание, расширение регистров; извлечение информации из регистров и редактирование содержимого регистров (если это не приводит к изменению исходных данных). Для получения более подробных сведений, см. раздел Macro Programming Guide (руководство по пользованию макрокомандами) подсказывающих сообщений, выводимых на экран непосредственно в ходе работы, в ответ на запрос помощи (Help). Информация, выводимая на экран для наглядного общения оператора с системой Вывод информации обеспечивается через поля обзора (View), функционально распределенные под решение типичных аналитических задач. Под все варианты программного обеспечения отведены 3 стандартных поля обзора: • Просмотр методов и обслуживание управления разгонкой [разделением] (Method and Run Control). Это окно способствует управлению работой и сбору аналитических данных. • Выполнение анализа данных (Data Analysis). В таком окне производятся просмотр и обработка собранных данных. • Разработка вида сообщения результатов (Report Designer). Это окно дает возможность создания нестандартных распечаток сообщений результатов. Если приобретены дополнительные части программного обеспечения (под конкретные конфигурации оборудования), вводятся дополнительные поля обзора (кроме того, добавочные поля обзора могут быть отведены под диагностические функции и под метрологическую проверку [проверку работоспособности] системы). Когда владелец системы хочет управлять анализом образцов через удобные таблицы (в которые записывается все необходимое), добавляется поле обзора ChemStation Companion. В каждом поле обзора имеется набор стандартных элементов (включая перечни возможных функций и показ клавиш, которыми оператор может пользоваться). Стандартная планка с клавишами дает быстрый доступ к общей информации, определяющей характеристики и возможности системы (например, к методам и программам анализов). В поле для просмотра методов и обслуживание управления разгонкой [разделением] (Method and Run Control) размещаются планка с информацией о состоянии прибора; сектор под показ приобретаемых сведений об образце в реальном масштабе времени (поле обзора может быть приспособлено под обслуживание одиночных анализов или серии автоматизированных анализов). В этом же поле обзора может показываться структурная схема прибора (газового хроматографа, жидкостного хроматографа или системы для капиллярного электрофореза). В такой структурной схеме имеются ключевые точки, через которые обеспечивается быстрый доступ к параметрам, определяющим режим работы прибора. Через такие точки может быть вызван режим мультипликационного показа состояния отработки каждого анализа. Если в показе схемы прибора на экране не нуждаются, от такого показа можно отказаться (ради экономии расходуемой емкости памяти и других ресурсов, предусматриваемых программной оболочкой Windows). 20 В поле обзора, предназначенном под обеспечение анализа данных (Data Analysis), стандартный набор клавиш приспособлен под выполнение специфичных функций, связанных с анализом данных (таких, как интегрирование, калибровка, вывод сообщения результатов, введение в хроматограмму [электрофореграмму] надписей, сопоставление хроматограмм [электрофореграмм], отработка специфичных модулей программного обеспечения [если такие модули в систему загружены]). Реализации каждой из функций способствует показываемый на экране (специфичный для функции) набор клавиш. Поле обзора под разработку вида сообщения результатов (Report Designer) дает возможность графически определить стиль распечатки результатов (с распределением разных ее участков под конкретную информацию). Решению этой задачи тоже способствует набор специфичных клавиш. Сбор данных Состояние обслуживаемого прибора полностью контролируется благодаря выводу (постоянно обновляемой) информации на экран. Кроме того, на экран выводятся сведения о времени, истекшем с момента начала анализа (несмотря на то, представлена ли отработка программного обеспечения большим окном или лишь малым символическим изображением). Все события, происходящие во время анализа (включая обнаружение какихто ошибок и изменения состояний приборов в начале или в конце анализа), регистрируются в протокольном файле, часть извлеченной информации из которого добавляется в каждый файл данных. Информация о состоянии прибора (такая, как сведения о скорости протока, температуре, давлении, составе системы растворителей в жидкостном хроматографе) может записываться в каждый файл данных. Проверке качества каждого анализа способствует наблюдение за показываемыми на экране данными (включая представление хроматограмм или электрофореграмм в реальном масштабе времени). Точный вид регистрируемых параметров зависит как от типа обслуживаемого оборудования, так и от указанной его конфигурации. На экране могут иметься одно окно или несколько окон с графическим представлением приобретаемых данных в реальном масштабе времени. Показ производится с указанием реальных единиц измерения (таких, как миллиединицы абсорбции, Вольты, градусы или бары). В каждом из окон можно просматривать совмещенные хроматограммы (электрофореграммы) или параметры, характеризующие работу прибора (например, давление). Предполагаемый самой системой вид представления в окнах может быть изменен и записан в память системы (благодаря чему оператор будет пользоваться самостоятельно подобранным предпочтительным вариантом). Обеспечивается возможность просмотра любой части графика в увеличенном масштабе. Можно пользоваться указателем для выбора сведений о регистрируемом отклике детектора в любой момент времени. Параллельно с анализом, можно пользоваться всеми вариантами обработки прежде полученных данных (для чего переходят к автономному режиму эксплуатации системы ChemStation [режиму off-line]). Для тех, кого интересует возможность начала обработки только что накопленных данных перед завершением анализа, имеется команда Snapshot (фиксирование для предварительной обработки). 21 Схема расположения (на экране) окон с графическим показом изменения сигнала детектора и сведений о состоянии системы (включая показ функциональной схемы прибора) записывается в память автоматически. Для получения более подробной информации о сборе данных, см. раздел 3 ("Сбор данных") и пользуйтесь подсказывающими сообщениями, выводимыми на экран в ответ на запрос помощи (Help). Анализ данных - выводимая на экран информация В поле обзора, предназначенном под обеспечение анализа данных (Data Analysis), стандартный набор клавиш приспособлен под выполнение специфичных функций, связанных с анализом данных [таких, как интегрирование, калибровка, вывод сообщения результатов, введение в хроматограмму (электрофореграмму) надписей], сопоставление хроматограмм [электрофореграмм]). Возможно выполнение следующих ключевых операций с графиками: • Вывод на экран одной хроматограммы (электрофореграммы) или сразу нескольких (режим показа выбирается на этапе вызова зарегистрированного сигнала [сигналов]) • Совмещение хроматограмм (электрофореграмм) различных образцов • Вычитание одной хроматограммы (электрофореграммы) из другой • Графическое совмещение хроматограмм (электрофореграмм) по вертикали и горизонтали (способствует наглядному визуальному сопоставлению хроматограмм [электрофореграмм]) • Получение зеркального изображения ("переворачивание") сигнала для облегчения наглядного сопоставления • Представление в увеличенном масштабе и просмотр по частям • Подстройка элементов изображения (таких, как маркерные метки; показ базовой линии и осей; указание времен удерживания [миграции] и названий веществ). Кроме того, владелец системы может выбрать шрифт, используемый для указания времен удерживания [миграции] и названий веществ; подобрать размер и ориентацию окна с графическими данными; выбрать вид представления графиков (раздельный или совмещенный показ); подстроить масштаб. • Хроматограммы (электрофореграммы) могут быть совмещены с графиками изменения заданных прибору параметров (в зависимости от возможностей используемого аналитического оборудования) • В режиме общения с системой, ее владелец может вводить в графическое изображение надписи (выбирая тип и размер шрифта, угол поворота и цвет надписей). После такого 22 добавления надписей, эти надписи можно графически редактировать (смещать в другое место, изменять расположение, стирать) • Копирование графического изображения в ячейку для информационного обмена (clipboard) с использованием предусмотренных оболочкой Windows форматов (metafile и поразрядное отображение [bitmap]) • Пользование указателем для срочного получения сведений об интересующих точках данных (значений амплитуды сигнала детектора) • Перенос цифровых сведений об указанных точках (данных о времени или интенсивности сигнала) в ячейку для информационного обмена (clipboard) Анализ данных - интегрирование Системой ChemStation используется два алгоритма интегрирования. Стандартный алгоритм интегрирования успешно применялся в прежних вариантах системы ChemStation и в большинстве других вариантов программного обеспечения, созданного фирмой Agilent и ответственного за обработку информации, поступающей с аналитических приборов. Заложен и новый алгоритм интегрирования (первый вариант), созданный ради повышения надежности, точности и упрощения работы. При пользовании рассматриваемым здесь вариантом программного обеспечения, мы рекомендуем употреблять стандартный алгоритм при выполнении тех методов анализа, которые уже прошли метрологическую аттестацию, и новый (улучшенный) алгоритм - при создании новых методов. Общие (для двух алгоритмов) реализуемые возможности Оба алгоритма интегрирования реализуют следующие возможности: • подбор параметров, определяющих режим интегрирования, автоматически (autoinegrate) • составление индивидуальных таблиц параметров, определяющих режим интегрирования, для каждого из каналов (если регистрируются сигналы с нескольких детекторов или при пользовании многоканальной информацией, выводимой с одного детектора) • предоставление владельцу системы возможности указания интересующих моментов (под параметры, определяющие режим интегрирования) непосредственно на графике • графическое управление интегрированием хроматограмм (электрофореграмм) вручную (в тех случаях, когда сложность объекта требует такого вмешательства); подобранный нестандартный подход может быть вписан в метод (т.е. использован при последующей автоматической реализации серии анализов) • вывод на экран и распечатка результатов интегрирования • возможность проинтегрировать (по меньшей мере) 1000 пиков хроматограммы 23 Двумя алгоритмами интегрирования предусмотрены следующие группы команд: • Исходно определяющие и изменяющие основную настройку интегратора ("исключаемая площадь", "ширина пика" и "порог") [параметры, обеспечивающие подавление шума] • Параметры, управляющие выявлением базовой линии ("принудительное принятие данной точки за соответствующую базовой линии", "фиксирование уровня базовой линии", "принятие всех впадин между пиками за точки базовой линии", "принятие следующей впадины между пиками за точку базовой линии", "горизонтальное проведение базовой линии в обратном направлении из точки конца текущего пика") • Управляющие суммированием площадей пиков • Управляющие распознанием отрицательных пиков • Управляющие выборкой пиков с хвоста других пиков по касательной (включая команды, заставляющие распознать пики растворителя) • Команды, указывающие допуск по времени удерживания, используемый при выполнении конкретных функций интегратором Новый (улучшенный) алгоритм интегрирования Новый алгоритм интегрирования создает лучшие условия для: • Выявления базовой линии хроматограмм (электрофореграмм) с блуждающей базовой линией • Обнаружения "участков с отрицательной площадью" в пиках, выбираемых по касательной с хвоста затянутого пика; после такого обнаружения базовая линия проводится по-новому (ради избавления от возникших затруднений) • Определения площадей, находящихся между базовой линией и сигналом (хроматограммой или электрофореграммой); т.е. тех площадей, которые не приписаны какому-то распознанному пику. Эту функцию (которая дает возможность и получать сообщения о таких площадях) следует вызывать специально • Удаления шумовых выбросов сигнала (с помощью параметра "исходная высота пика") • Лучшего выявления фактической площади пика хроматограммы (электрофореграммы), характеризующейся избыточным уровнем шума • Выявления уступов на пиках по второй производной или за счет подсчета степени кривизны • Легкой эксплуатации (на экран выводится набор клавиш, соответствующих новому алгоритму; внимание фокусируется на основной информации) 24 Анализ данных - количественная оценка Поле обзора, соответствующее (выполняемым в целях анализа данных) калибровкам, дает возможность одновременного просмотра: • хроматограммы (электрофореграммы) или хроматограмм (электрофореграмм), по которым должна производиться калибровка с указанием текущего допуска на время удерживания (время миграции) • калибровочной таблицы, вид которой может быть задан благодаря исчерпывающему описанию параметров, используемых при калибровке • калибровочного графика для конкретного вещества (для которого выполняется калибровка) Все окна с информацией, соответствующей калибровочному режиму, связаны между собой так, что изменение в одном окне автоматически учитывается другими окнами. Такой подход дает возможность выбора и изменения калибровочных данных графически. Количественная оценка производится по методам процентного подсчета, нормализационного процентного подсчета, методу внешнего стандарта, процентного подсчета по методу внешнего стандарта, методу внутреннего стандарта, процентного подсчета по методу внутреннего стандарта. Вычисления обеспечиваются по площади или по высоте пиков. Могут использоваться многоуровневые калибровки; возможно пользование и несколькими внутренними стандартами. Информация о выполненных калибровках автоматически сохраняется, может употребляться с необходимым распределением весового вклада при перекалибровках. Для получения более подробной информации о калибровке и количественном анализе, см. раздел 8 ("Количественный анализ") и раздел 9 ("Калибровка"). Анализ данных - вывод стандартного сообщения результатов Стандартный набор (разработанных самим владельцем системы) стилей сообщений результатов дает возможность выбора нужного варианта (через выводимое на экран изображение, уточняющее характеристики сообщений результатов). Каждый стандартный стиль сообщения результатов включает группу стандартных информирующих данных и целый ряд вспомогательных сведений (которыми можно и не пользоваться). Для получения более подробной информации о предусмотренных видах сообщения результатов, см. раздел 12 ("Сообщения результатов"). Анализ данных - получение специализированных распечаток результатов Системой ChemStation предусмотрен целый ряд усовершенствованных возможностей получения более специализированного вида сообщений результатов. Могут выводиться статистические сообщения о качестве разделения; могут предоставляться результаты 25 анализа тенденций, выявленных при исследовании серии образцов; можно пользоваться нестандартными формами сообщений результатов. Сообщения о пригодности системы Сообщения о пригодности дают владельцу системы получать данные оценки эксплуатационных характеристик системы, необходимых для индивидуальных анализов. Существуют три варианта (вида) таких сообщений. Стандартное сообщение об эксплуатационных характеристиках представляет собой распечатку параметров для методов, реализуемых без калибровки. К таким параметрам относятся: • Время удерживания (время миграции) • Нагрузочный коэффициент (k') • Площадь пика • Высота пика • Симметричность пика • Ширина пика на уровне половины высоты • Эффективность (число теоретических тарелок) • Разрешающая способность • Селективность В случае методов, реализуемых с калибровкой, столбцы с указанием площади, высоты пика и селективности подменяются столбцами с указанием названия веществ и количеств. Состав заголовка распечатки сообщения: стандартная служебная информация в начале и в конце заголовка; блок сведений об образце; данные об аналитической колонке; хроматограмма [электрофореграмма] (если ее показ запрошен). В сообщении об эксплуатационных характеристиках и уровне шума к параметрам, указанным выше, добавляется оценка уровня шума в сигнале в оговоренных владельцем системы оценочных диапазонах (до 7 таких диапазонов). Параметры, соответствующие шуму, сообщаются в виде отношений сигнала к шуму для каждого пика или прокалиброванного вещества и в виде таблицы данных о шуме для каждого сигнала (хроматограммы или электрофореграммы). В каждой таблице данных о шуме указываются 26 шум в поле шестикратного стандартного отклонения; уровень шума от пика от пика; информация, соответствующая оценке шума по методам, разработанным Американским обществом по испытанию материалов; сведения о блуждании сигнала и уходе базовой линии. Расширенное сообщение об эксплуатационных характеристиках отличается добавлением графиков для каждого индивидуального пика, показывающих (графически) время начала и конца пика; ширину пика на уровне половины высоты и базовую линию. В этот вариант сообщения включаются следующие параметры (дополнительно к приводимым в стандартном сообщении об эксплуатационных характеристиках): • Площадь, высота и количество • Перекос • Избыточность • Показатель затянутости пика (согласно требованиям, оговоренным Фармакопеей США) • Период времени между двумя точками данных и число точек данных в каждом пике • Статистические моменты (от М0 до М4) • Ширина пика на уровне половины высоты, подсчитанная по методам оценки фактической ширины; ширины на уровне 5 σ; ширины, определяемой точками пересечения касательных с базовой линией; ширины для затянутого пика • Число теоретических тарелок на длину колонки и на метр, подсчитанное по ширине пика на уровне половины высоты; ширине на уровне 5 σ; ширине, определенной по точке пересечения касательных с базовой линией; ширине, определенной статистическими методами Владельцы системы могут задать интересующие диапазоны для оценки шума; допустимые критерии для параметров, определяющих эксплуатационные характеристики. О выходе значений за таким образом установленные границы будет делаться отметка в выводимых на распечатку сообщениях результатов. Для получения более подробной информации о вычислениях, производимых при оценке пригодности системы, см. раздел 13 ("Оценка пригодности системы"). Сводные распечатки результатов отработки программы анализов Такие распечатки выводятся системой в конце серии автоматизированных анализов. Вид сообщаемой информации может быть различным: от краткой сводки данных об исследовавшихся образцах до подробного графического отображения воспроизводимости или до анализа тенденций для выбранных владельцем системы параметров (для различных образцов, анализировавшихся с помощью одного и того же метода). В распечатки могут 27 включаться следующие вспомогательные данные (до 9 перечисленных ниже видов сведений): • Титульная страница (вид которой может задаваться владельцем системы) • Конфигурация прибора (включая номера программно-аппаратного обеспечения и перечни аналитических колонок [или капилляров для капиллярного электрофореза], с указанием их характеристик) • Перечень образцов, подлежавших анализу; последовательность анализов • Распечатка протокольного файла, в которой указывается, что исследовалось; документируются этапы сбора и обработки данных; отмечаются любые непредвиденные события • Распечатка методов анализа • Сообщения результатов анализа индивидуальных образцов • Статистические сведения об анализе калибровочных образцов • Статистические сведения об анализе исследуемых образцов • Страница итогов, на которой могут приводиться или сводка данных об образце (по одной строке информации о каждом анализе), или сводка данных о веществах (с краткой таблицей информации о веществах дополнительно к сводке данных об образце) Для получения более подробной информации о сводных распечатках результатов отработки программы анализов, см. подсказывающие сообщения, выводимые на экран в ответ на запрос помощи, и подраздел "Получение распечатки сводных данных, полученных в ходе выполнения программы анализов" (стр. 183). Нестандартные сообщения результатов На экран выводится изображение, дающее возможность разработать вид нестандартного сообщения результатов (для тех, кто предпочитает оговорить точные тип и содержание распечаток). Графически задается вид бланка, на котором могут иметься общая информация об образце, хроматограмма (или электрофореграмма), предоставление результатов интегрирования, итогов количественного анализа. Владелец системы может определить отдельные элементы (такие, как текст, таблицы и графики), указать размещение их в разделах с информацией, графически отрегулировать их относительные положения и размер, ориентацию каждого индивидуального элемента. Отдельные части сообщения могут добавляться, стираться, перестанавливаться (с изменением порядка) или вкладываться друг в друга. Владелец системы может оговорить заголовки и записи в нижнем поле каждой страницы; проставление времени на распечатках сообщений результатов; нумерацию страниц (все это 28 привязывается к графическим координатам по осям X и Y каждой страницы). К включаемой в сообщение информации могут относиться любые данные, предоставляемые самой системой СhemStation, или любой параметр, задаваемый владельцем системы. После того, как разработан вид нестандартного сообщения результатов, он может быть привязан к конкретному методу и задан, как предполагаемый (для конкретного типа анализа) самой системой автоматически. Нестандартные сообщения результатов могут выводиться на экран или на печатающее устройство. В появляющиеся на экране изображения входят и графики. Для получения более подробной информации об указании вида сообщения результатов, см. подсказывающую информацию, выводимую на экран в ответ на запрос помощи (Help). Сообщения результатов с переносом в контрольную карту Программным обеспечением Agilent ChemStation предусмотрено пользование контрольными картами (Control Chart). После того, как выбран режим пользования такими картами (в вычислительную машину должна быть загружена соответствующая часть программного обеспечения), владелец системы может следить за выбранным (характеризующим вещество) параметром при каждом анализе (согласно заданному методу). К прослеживаемым параметрам относятся количество (Amount); коэффициент чувствительности (Response Factor); время удерживания (Retention Time) и площадь (Area). Для получения более подробной информации о нестандартных сообщениях результатов и о пользовании контрольными картами (Control Chart), см. подсказывающие сообщения, выводимые на экран непосредственно во время работы (в ответ на запрос помощи [Help]). Обслуживающие программы и совместимость систем Общие сведения Система Agilent ChemStation может импортировать и экспортировать файлы данных (т.е. обмениваться данными с другими системами) с использованием хроматографического формата ANDI (сокращение образовано от английских слов Analytical Data Interchange "обмен аналитическими данными"), сформулированного Ассоциацией специалистов по аналитическому оборудованию (AIA) [вариант 1.0; авторское право на формат зарегистрировано в 1992 г.]. Импортируются данные с первым уровнем полноты описания (информация об образце и данные, описывающие сигнал); экспортируются данные со вторым уровнем полноты описания (информация об образце; данные, описывающие сигнал; результаты интегрирования). Программным обеспечением Agilent ChemStation предусмотрены команды и функции, реализующие динамический обмен данными (DDE), стандартный для платформы Microsoft Windows (система ChemStation способна работать и в качестве клиента, и в качестве обслуги). В набор команд входят команды, способствующие установлению и прекращению 29 связи; команды переноса в двух направлениях; функции отработки в режиме дистанционного управления. Кроме того, программным обеспечением Agilent ChemStation предусмотрены команды и функции, соответствующие стандарту доступа в открытый банк данных (стандарт ODBC, введенный фирмой "Microsoft"). Работа соответственно стандарту ODBC производится на первом уровне расширения. Более подробную информацию можно найти в документации программного обеспечения ChemStore. Системы Agilent ChemStation для высокоэффективной жидкостной хроматографии и капиллярного электрофореза Программным обеспечением Agilent ChemStation гарантируется совместимость файлов методов, файлов данных, спектральных библиотек и файлов программ анализов, созданных при пользовании ранее выпущенными вариантами обеспечения ChemStation для жидкостной хроматографии (варианты с A.01.00 по A.09.03). Программным обеспечением Agilent ChemStation предусмотрены 5 обслуживающих программ, способствующих приспособлению файлов хроматографических данных и спектральных библиотек, накопленных при пользовании системами, относящимися к Серии Pascal (системы, обслуживающие работу с жидкостными хроматографами). Преобразование всего необходимого (от макрокоманд [см. приводимый далее подраздел "Приспособление системы к решению специфичных задач"] до хроматографических данных) производится с переводом в новый формат. Обратите внимание на то, что указанные обслуживающие программы могут использоваться только при работе с оболочкой Windows 95. Обмен данными между системами Серии Pascal и системами Серии DOS производится за счет переноса информации на гибких магнитных дисках (с диаметром 3,5 дюйма); за счет подключения через канал последовательной передачи (с помощью кабеля, соединяющего контакты разъемов "один к одному") или за счет подключения к местной сети связи. Системы ChemStation HP 3365 Файлы методов, файлы данных и файлы программ анализов, накопленные при работе с системой ChemStation HP 3365 (Серия DOS), могут быть приспособлены с помощью соответствующей экспортирующей функции, заложенной в новый вариант системы Agilent ChemStation. После такого приспособления, файлы методов и файлы данных оказываются совместимыми. Импортированные файлы программ анализов могут употребляться только для пересчета данных. Приспособление системы к решению специфичных задач Система Agilent ChemStation может быть приспособлена к решению специфичных задач за счет использования мощного набора команд. Эти команды могут быть сгруппированы для отработки конкретной функции автоматически (такую группу команд называют макрокомандой). Составляемые владельцем системы макрокоманды могут использовать 30 нестандартные переменные; оговоренную логику отработки; вложенные циклы многократной отработки; могут обеспечивать ввод и вывод информации в режиме обращения с файлами; дозволены вложение одних макрокоманд в другие, составление расписания отработки, обмен информацией с другими прикладными программами (предусмотренными операционной системой MS-DOS или отрабатываемыми из под оболочки Windows). Для получения более подробной информации, см. тему Macro Programming Guide (руководство по составлению макрокоманд) в подсказывающих сообщениях, выводимых на экран непосредственно в ходе работы, в ответ на запрос помощи (Help). Программным обеспечением Agilent ChemStation реализуется протокол связи для доступа в открытый банк данных (стандарт ODBC, введенный фирмой "Microsoft"). Имеются команды доступа в банк данных и выхода из банка данных; команды восстановления статуса конкретной связи; команды добавления строк в таблицу банка данных и специальные операторы языка структурированных запросов (языка SQL; сокращение образовано от английских слов structured query language - "язык структурированных запросов"). Автоматизация Система Agilent ChemStation способна выполнять серии анализов, использующих целый набор методов. Может быть задан набор параметров, соответствующий программе анализов (предусматривающий использование автоматически создаваемых файлов или последовательно нумеруемых файлов [с записываемой владельцем системы приставкой, число знаков в которой может достигать 7]). Программа может требовать полного выполнения анализов или проведения только пересчета данных; можно воспользоваться одной (из специфичных для употребляемых подходов) отключающих команд или запрограммировать нестандартную отключающую макрокоманду (на случай прекращения выполнения программы анализов из-за обнаружения ошибки) или макрокоманду, вызываемую для отработки после того, как завершена запланированная серия анализов. Таблица последовательности (перечень запрашиваемых анализов) представляет собой крупномасштабную таблицу, дающую возможность оговаривать номера флаконов и названия образцов, методы анализа, параметры для количественного пересчета (включая количество образца, масштабный коэффициент и коэффициент разбавления, данные для калибровки и число многократных введений образца). Владелец системы может переходить от одного элемента таблицы к любому другому, копировать или подклеивать отдельные элементы или целые строки (ряд строк). Все это дает возможность быстро и эффективно составлять программы (последовательности) анализов. В таблице последовательности можно указывать следующие типы образцов: исследуемые образцы (sample); калибровочные образцы (calibration) и контрольные образцы (control). От указания типа зависит специфичный способ обработки информации: • информация об исследуемых образцах оценивается и сообщается согласно требованиям, заложенным в метод 31 • информация о калибровочных образцах употребляется для перекалибровки данных, используемых (согласно методу) при количественном анализе (такая перекалибровка описана далее) • информация о контрольных образцах дает возможность оценить соответствие требованиям, предъявляемым для обнаружения каждого вещества (соответствие допускам, записанным в метод). Если любой указанный параметр не укладывается в записанное для него поле допуска, выполнение программы анализов прекращается. Можно запросить выполнение простых калибровок, периодических калибровок или калибровок по методу охвата. Простой прекалибровкой предполагается, что перекалибровка обеспечивается всякий раз, когда в таблице последовательности (т.е. в составленной программе анализов) обнаруживается калибровочный образец. Периодические перекалибровки выполняются (во время анализа серии образцов) через заданные интервалы времени. При калибровке по методу охвата, ряд калибровок производится до анализа серии образцов (предшествующие калибровки) и после анализа этой серии (последующие калибровки); подсчет количественных результатов для исследовавшихся образцов будет выполняться с использованием калибровочной таблицы, данные для которой получены после усреднения результатов предшествующих и последующих калибровок. Может быть запрошена частичная отработка программы (последовательности) анализов, что дает возможность просмотреть порядок выполнения программы анализов, выбрать индивидуальные образцы, анализ которых следует повторить или данные о которых должны быть пересчитаны. Когда данные, подлежащие пересчету, уже накоплены, владелец системы может указать следует ли при таком пересчете пользоваться исходными параметрами для количественного анализа, или необходимо воспользоваться новыми параметрами (введенными в таблицу последовательности). Отработка программы (последовательности) анализов может быть приостановлена для обеспечения срочного одиночного анализа какого-то приоритетного образца (с использованием другого метода), после чего возобновлена (без нарушения задействованной логики автоматизации). Во время выполнения программы анализов, в соответствующую ей таблицу может добавляться указание дополнительных образцов. На печать могут выводиться обе таблицы (таблица, соответствующая полному выполнению программы анализов, и таблица, соответствующая частичной отработке программы анализов). Для получения более подробной информации о программах анализов, см. раздел 10 ("Автоматизация") и подсказывающие сообщения, выводимые на экран в ответ на запрос помощи (Help). Требования к организации работ в лаборатории Система ChemStation создана с учетом международных требований к организации работ в лаборатории (GLP [сокращение, образованное от английских слов Good Laboratory Practice]). Реализуется ряд особенностей, помогающих владельцам оборудования работать с соблюдением законодательно установленных норм. К таким особенностям относятся полное 32 описание метода; метрологическая оценка соответствия метода решаемым задачам; метрологическая аттестация системы; гарантирование прослеживаемости, подлинности и качества данных. Документирование процесса создания программного обеспечения В комплект документов к каждому программному обеспечению входит прилагаемый фирмой Agilent сертификат о том, что система была разработана и испытана согласно стандарту качества ISO-9001 (сокращением ISO обозначается Международная организация по стандартизации). Оригиналы документов вместе с протоколами перепроверки вложены в хранящуюся фирмой Agilent папку, которой присвоено английское название Validation Binder Agilent ChemStation for LC. Описание метода и пользование методами • Общие методы (полные характеристики режимов работы прибора и анализа данных) записаны в одном месте. Включены сведения о диапазоне концентраций каждого индивидуального вещества (что дает возможность убедиться, что уровни количественного содержания не выходят за прокалиброванный диапазон). • Протокольный журнал, в который записываются сведения об изменениях метода, дает возможность лицам, пользующимся аттестованным методом, получать автоматическую регистрацию сведений, когда и кем в метод вносились изменения. Кроме того, дополнительно предоставляется возможность вписать в этот журнал комментарий, поясняющий причину изменений. Обсуждаемый здесь журнал автоматически записывается (в двоичном формате) как часть метода. Такой подход предотвращает возможность неуполномоченного доступа к протокольным записям; кроме того, предусмотрено и предохранение самого метода по схеме, рассмотренной ниже. Протокольный журнал со сведениями об изменениях метода может выводиться на экран и на печатающее устройство. • В каждый метод могут записываться (установленные для каждого вещества) допуска на эксплуатационные параметры хроматографической системы (как уже обсуждалось в подразделе "Сообщения о пригодности системы"). При выходе результатов за эти допуска, прекратится выполнение программы анализов. О выходе за поле допуска будет сообщено и в соответствующей распечатке результатов анализа. • В сообщениях об эксплуатационных характеристиках и о пригодности системы (см. приведенный ранее подраздел "Сообщения о пригодности системы"; стр. 25) дается подробный анализ качества разделения. Конфигурация может быть указана системе ChemStation таким образом, что доступ к системе будет регламентироваться двумя уровнями: доступ для оператора и доступ для руководителя. Выход на уровень, предназначенный для руководителя (дающий возможность использовать все функции, предусмотренные программным обеспечением Agilent ChemStation), может быть предохранен записью пароля. Уровень для оператора позволяет лишь пользоваться клавишным пультом и заданными методами анализа. Этот уровень 33 предназначен для лабораторий, выполняющих рутинные анализы, и специфично защищает от модификации существующих методов и создания новых. Надежность метода Сводные распечатки результатов отработки программы анализов (см. приведенный ранее подраздел «Анализ данных - получение специализированных распечаток результатов»; стр. 24) дают возможность проверить надежность метода. Расширенные варианты сообщений результатов, включающие таблицы или графики тенденций (с выбором критериев, указанных владельцем системы), могут использоваться для оценки реальности решения задач. В метод могут быть записаны границы области достоверного анализа (для гарантии [благодаря анализу контрольных образцов], что сам метод не отличается от аттестованного). Проверка эксплуатационной пригодности системы Аттестационная (стандартная) часть программного обеспечения ChemStation автоматически проверяет правильность загрузки и эксплуатации других частей программного обеспечения, обеспечивающих анализ данных. Результаты, полученные при проверке, сопоставляются с предварительно закодированными значениями. Такая (аттестационная) часть программного обеспечения дает владельцу системы возможность указать собственные файлы данных и методы, являющиеся исходными для проверки. Прослеживаемость, подлинность и качество данных В протокольный файл записывается информация обо всем, что происходит с системой (включая сведения о любых необычных событиях [таких, как ошибки или изменение параметров во время разгонки]; состояние прибора до каждого анализа и после него). Уместная часть сведений из протокольного файла копируется в каждый файл данных и в нем хранится. Кроме того, регистрируются фактические условия работы прибора (такие, как давление, скорость протока и температура), отмечаемые во время каждого анализа (если оговоренный при указании прибор предоставляет такую информацию). Эти данные могут быть впоследствии представлены графически (совмещенными с хроматограммой или электрофореграммой) для пояснения фактического состояния прибора во время конкретного анализа; они же могут быть включены в распечатку сообщения результатов. В информации о методах, запоминаемой совместно с файлами данных, указывается фактический метод, использовавшийся во время анализа. Предоставляется возможность полного реконструирования сообщенных данных когда-то позже. Запись сведений о методе в память производится после завершения всех операций, связанных с анализом. Все распечатки сообщений результатов имеют указание времени и прослеживаемую нумерацию страниц (вводятся указания типа "страница X из общего числа страниц Y). 34 Владелец системы может выбрать степень подробности получаемого сообщения результатов (от упрощенного до максимально полного [см. приводимый ранее текст, посвященный сообщениям результатов]). В регистровые файлы, отведенные под информацию, запоминаемую в соответствии с Требованиями к организации работ в лаборатории (требованиями GLP) [пользование этими файлами оговаривается при указании нужных для метода параметров], записываются все исходные данные (включая информацию об образце; метод анализа данных; хроматограммы или электрофореграммы; состояние прибора; результаты интегрирования и количественного анализа; данные, включаемые в распечатку сообщения результатов; уместную скопированную часть из протокольного файла). Все эти сведения собираются в один файл, предохраненный по контрольной сумме. Используется не редактируемая запись в двоичной форме (чем гарантируется оригинальность результатов). Предусмотрена и запись варианта файла, указывающая были ли данные подвергнуты пересчету. В таблице последовательности могут быть указаны контрольные образцы (для автоматической проверки обеспечивает ли эксплуатационная эффективность системы правильность анализа таких образцов; по результатам проверки принимается решение о том, можно ли продолжать выполнение программы анализов без надзора оператора). Если результаты анализа контрольных образцов выходят за допустимые диапазоны, автоматическое выполнение программы анализов прекратится. Управление работой прибора Возможности системы ChemStation управлять работой прибора могут быть расширены благодаря закупке дополнительных частей программного обеспечения, превращающих систему в многоканальную (обслуживающую несколько приборов, типы и назначение которых могут быть разными). Для получения дополнительной информации, см. инструкции, поставляемые с дополнительными платами и вспомогательными частями программного обеспечения. Подключение к информационной сети Система ChemStation прошла испытания на совместимость с выпускаемым фирмой Agilent программным обеспечением сетей LanManager, сетевым обеспечением Novell NetWare, программным обеспечением Microsoft Windows 2000 Professional и Microsoft Windows XP Professional (с учетом требований IEEE 802.3 CSMA/CD). Фактически, гарантируется совместимость с любым сетевым оборудованием, при программировании режимов работы которого использованы подходы, стандартные для оболочки Microsoft Windows. Подключение к информационной сети дает системе ChemStation возможность пользоваться терминальными устройствами (такими, как печатающие устройства и графопостроители), соединенными с другими (имеющимся в лаборатории) вычислительным машинам; делиться информацией (например, файлами данных и методами). 35 Подключение к серверу Программное обеспечение Agilent ChemStation может быть загружено в подходящий сервер, откуда (когда требуется) обеспечивается доступ к обслуживаемой персональной вычислительной машине. Конфигурация каждой аналитической системы, в состав входит такая (местная) вычислительная машина, гарантирует правильность специфичного подхода к реализации различных методов химического анализа, а централизованная загрузка программного обеспечения избавляет от обременительной необходимости наличия многих копий того же самого программного обеспечения Agilent ChemStation. Управление работой прибора благодаря подключению к шине LAN Программным обеспечением Agilent ChemStation предусмотрена возможность пользования шиной LAN для управления работой приборов и сбором данных. Это реализуется при работе со следующими приборами: газовый хроматограф Agilent 6890; аналого-цифровой преобразователь Agilent 35900E; жидкостной хроматограф Agilent 1100. Благодаря подключению приборов к шине LAN (к которой подключена и вычислительная машина с загруженным программным обеспечением Agilent ChemStation), Вы получаете возможность удобного управления и слежения за работой приборов. Такая схема подключения позволяет устанавливать вычислительную машину (с загруженным в нее программным обеспечением ChemStation) в другом месте (на любом расстоянии от управляемого прибора). Документация В комплекте документации имеются специфичные разделы по • Загрузке и освоению программного обеспечения Agilent ChemStation • Пользованию программным обеспечением Agilent ChemStation • Пониманию принципов работы программного обеспечения • Приспособлению системы Agilent ChemStation к решению специфичных задач Загрузка и освоение программного обеспечения Каждый из вариантов программного обеспечения Agilent ChemStation (под разные аналитические методы) поступает с Инструкцией по загрузке. В этой инструкции подробно рассматриваются требования к персональной вычислительной машине и к программному обеспечению; установка платы устройства сопряжения; загрузка программного обеспечения Agilent ChemStation и подтверждение правильности установки. Содержание Инструкции по загрузке посвящено конкретно обслуживаемой конфигурации аналитической системы; в этом документе могут приводиться советы по поиску причин возникших затруднений; по ведению соответствующих системе записей и по техническому обслуживанию. 36 В каждую систему Agilent ChemStation загружена программа-самоучитель, посвященная пользованию конкретным вариантом программного обеспечения (под конкретные аналитические методы). Эта программа является основным пособием; составлена таким образом, что темп обучения определяется самим получателем системы. Подход к решению каждой аналитической задачи разбит на ряд четко сформулированных этапов. Даны указания по отработке этих этапов, но владельцы системы могут запросить систему показать выполнение таких этапов на экране (автоматически), после чего могут попрактиковаться самостоятельно. Пользование программным обеспечением Agilent ChemStation Для оказания помощи в рутинной эксплуатации системы, предусмотрены две дополнительные категории информации, выводимой на экран непосредственно в ходе работы. Программным обеспечением ChemStation предусмотрена система индексированной помощи, типичной для оболочки Windows (подсказка, уместная на данном [конкретном] этапе работ и предоставляющая необходимую информацию о пользовании программами). Такая помощь оказывается в ответ на запрос (Help). Поясняются каждое выводимое на экран изображение и смысл приводимых в нем параметров. Подробные пояснения даются и с помощью графического представления (когда это возможно), могут быть скопированы в ячейку для информационного обмена (clipboard) для включения владельцем системы в составляемую им собственную документацию или для вывода на печать. Запрос помощи через выбор функции How To (как сделать) приводит к появлению на экране перечня наиболее сложных (специфичных для конкретных областей анализа или общих хроматографических) задач. Этот перечень предназначен для тех, кому приходится обращаться за подсказкой менее часто, но кому все же необходимо подтверждение правильности настройки системы. Перечисленные темы непосредственно связны с более детальной оказываемой помощью (доступ к которой можно получить и через запрос Help). Понимание принципов работы программного обеспечения В Инструкции по освоению системы обработки данных Agilent ChemStation описаны принципы работы программного обеспечения и алгоритмы, используемые при манипулировании данными. Приспособление системы Agilent ChemStation к решению специфичных задач Опытные владельцы системы, желающие приспособить систему Agilent ChemStation для решения специфичных (нестандартных) задач или реализовать какие-то дополнительные возможности, могут сделать это благодаря составлению макрокоманд. В основном пособии, Macro Programming Guide (руководстве по составлению макрокоманд, выводимом на экран непосредственно в ходе работы, в ответ на запрос помощи [Help]), 37 приводится исчерпывающий набор примеров, поясняемый полным описанием команд и функций, внутренних типов данных, форматов и структур. Справки для программиста предоставляются файлом подсказок по пользованию командами. Доступ к этому файлу обеспечивается или за счет запроса помощи (Help) непосредственно в ходе работы, или через сектор Show Command (показ сведений о команде), используемый в режиме диалога. Даются пояснения синтаксиса записи и параметров; для многих команд приводятся примеры макрокоманд. Благодаря тому, что подсказка предоставляется непосредственно в ходе работы, владельцы системы могут скопировать примеры и правильные синтаксические записи команд непосредственно в составляемые самостоятельно файлы с макрокомандами. Структура заголовков, используемых системой ChemStation Пример, приведенный на следующей странице, поясняет структуру заголовков, типичную для системы Agilent ChemStation. Имеются общие заголовки, используемые всеми (оговоренными при указании конфигурации) приборами, и специфичные для конкретных приборов заголовки. Программа, используемая для загрузки программного обеспечения, создает подзаголовок (под тем заголовком, под который записывается программное обеспечение [самой системой автоматически предполагается заголовок HPCHEM]) для каждого (названного при указании конфигурации) прибора. Таким заголовком является номер прибора. Самой системой (автоматически) предусматривается запись (именно под этот заголовок!) файлов данных, файлов методов и файлов программ анализов. 38 Рис. 1. Структура заголовков, используемых системой ChemStation Далее дается пояснение заголовков, используемых системой ChemStation: 39 Таблица 1 Заголовок HPCHEM Заголовки, используемые системой ChemStation Содержимое Под этот заголовок записываются программы, используемые для указания конфигурации и для вызова программного обеспечения ChemStation. Этот заголовок является частью переменной PATH. Он добавляется загрузочной программой автоматически (если вы не указываете альтернативный заголовок) REPSTYLE Используется для записи шаблонов сообщений результатов (сообщений, оговоренных при создании нужных их стилей) CORE Используется для тех компонентов основной части программного обеспечения, которые предназначены для всех конфигураций хроматографического оборудования или системы для капиллярного электрофореза. Этот подзаголовок является рабочим подзаголовком системы ChemStation. PICTURES Под этот подзаголовок записываются графики, необходимые системе ChemStation LANGUAGE Используется под указывающий язык код (для данной части программного обеспечения) 1024 и 800 Под этот заголовок записываются файлы, ответственные за установку в исходное состояние той системы, которая ответственна за графическое общение с оператором. Ничего не меняйте SYS Под этот подзаголовок записываются общие компоненты, предназначенные для всех конфигураций хроматографического оборудования и капиллярного электрофореза. Запись \hpchem\sys должна являться частью переменной PATH. Загрузочная программа автоматически добавляет эту часть в указанную переменную HELPENU Используется англо-американским вариантом под запись файлов с информацией, выводимой в ответ на запрос помощи (тех файлов, которые относятся к основной части программного обеспечения ChemStation) LANGUAGE Используется под указывающий язык код (для специфичных частей программного обеспечения) BACKUP Используется для хранения копий старых файлов, переносимых под этот подзаголовок во время загрузки программного обеспечения DRIVERS Под этот подзаголовок записываются драйверы для тех частей аналитической системы, которые оговорены при указании конфигурации 1 Используется для прибора, названного при указании конфигурации (от 1 до 4 приборов). Под этот подзаголовок записываются 5 дополнительных подзаголовков: DATA, METHODS, SEQUENCE, VERIFY и TEMP 40 Заголовок DATA Содержимое Под этот подзаголовок записываются все подзаголовки, под которые заносятся результаты выполняемых вами анализов. Под подзаголовком DATA может иметься много подзаголовков, если (в ходе эксплуатации системы) вы предусматриваете их введение записями в сектор Sample Information (информация об образце) или Sequence Parameters (параметры, соответствующие программе анализов) [в сектор, используемый в режиме диалога]. Подзаголовки, предназначенные под запись результатов, опознаются по наличию дополнительной части .D. Для получения более подробных сведений о структуре файлов данных, см. подраздел "Файлы данных" (на стр. 53) METHODS Под этот подзаголовок записываются все заголовки методов, отличающиеся наличием дополнительной части .M. Для получения более подробных сведений о содержимом, см. подраздел "Структура заголовков, под которые записываются файлы метода" (на стр. 46) SEQUENCE Под этот подзаголовок записываются таблицы последовательностей. Заносимые файлы программ анализов (последовательностей) отличаются наличием дополнительной части .S VERIFY Под этот подзаголовок записываются файлы данных, методы и результаты обработки данных, хранимые в регистровых файлах (фалах с дополнительной частью .REG). Эти файлы используются при метрологической аттестации системы ChemStation (описанной в подсказывающем сообщении, выводимом на экран в ответ на запрос помощи). Один набор файлов (файл данных, файл метода и регистровый файл) используется при каждой аттестационной проверке TEMP Под подзаголовок TEMP записываются временные рабочие файлы и протокольные файлы. Например, для прибора 1 протокольный файл, соответствующий обслуживанию прибора в реальном масштабе времени, имеет название INSTR1.LOG, а файл, соответствующий работе не в реальном масштабе времени (режим offline) - название INSTR1-2.LOG LC,GC,CE Код, специфичный для драйвера прибора (код, записываемый в файл INI (LC жидкостной хроматограф; GC - газовый хроматограф; CE - система для капиллярного электрофореза). Такие подзаголовки имеются только в том случае, когда установлен специфичный прибор SPECLIBS Под этот подзаголовок записываются спектральные библиотеки (только в случае систем Agilent ChemStation, предназначенных для обслуживания жидкостных хроматографов, оснащенных детектором с диодной матрицей или масс-селективным детектором; систем Agilent ChemStation, обслуживающих работу с прибором для капиллярного электрофореза) 41 Раздел 2. Методы В этом разделе рассматриваются следующие вопросы: • Что представляет собой метод? • Составные части метода • Состояние методов • Создание методов • Редактирование методов • Структура заголовков, под которые записываются методы • Что происходит при реализации метода? Что представляет собой метод? Метод оговаривает все параметры, необходимые для сбора и анализа данных, наряду с задачами, подлежащими решению до начала обслуживания разгонки и после завершения разгонки (если такие задачи имеются). Т.е. предусматривается все, имеющее отношение к конкретному образцу. Части метода Метод опознается по названию, в качестве которого могут использоваться до 8 буквенночисловых знаков. К названию файла всегда приписывается дополнительная часть .M (указывающая, что в файл записан метод). Методы записываются под заголовки, предусмотренные операционной системой MS-DOS); под такими заголовками накапливаются индивидуальные файлы, имеющие отношение к частям метода. Каждый метод состоит из 4 частей: • Информация о методе • Управление работой прибора • Анализ данных • Программа того, что подлежит выполнению во время обслуживания разгонки, до нее и после ее завершения 42 Информация о методе (Method Information) Эта часть используется для записи пояснительной информации о методе. Управление работой прибора (Instrument Control) Указываются параметры, используемые для управления работой прибора или его частей. В случае работы с жидкостным хроматографом, к таким параметрам относятся состав подвижной фазы, скорость протока, вводимый объем образца, используемая детектором длина волны и т.д. (т.е. параметры, соответствующие управлению работой насоса, автоматического пробоотборника и детектора). В случае работы с газовым хроматографом, к этому виду параметров относятся температура устройства для введения образца, давление на вводящем образец устройстве, указываемые скорости протока газа-носителя через набивную колонку и т.д. Анализ данных (Data Analysis) Указываются параметры, контролирующие обработку данных. Подробные сведения о сигнале (Signal Details) Уточняются виды сигналов и их характеристики, которые будут использоваться при оценке данных. Программируемые по времени события, определяющие режим интегрирования (Integration Events) Указываются события, которые должны обеспечиваться в указанные моменты времени (отсчитываемые от начала обслуживания хроматографической разгонки или начала разделения в системе для капиллярного электрофореза) и влиять на обработку хроматограммы или электрофореграммы (т.е. на режим интегрирования). Опознание пиков (Peak Identification) Оговариваются параметры (используемые при обработке данных), от которых зависит опознание пиков, обнаруживаемых на хроматограмме или электрофореграмме. 43 Количественный подсчет по информации о пиках (Peak Quantification) Оговариваются параметры (используемые при обработке данных), которые влияют на вид количественного подсчета (определения количеств или концентраций компонентов образца, соответствующих каждому пику). Калибровка и перекалибровка (Calibration and Recalibration) Оговариваются параметры (используемые при обработке данных), которые влияют на калибровку и частоту перекалибровок. Сообщения результатов (Report) Указывается формат сообщений результатов, распечатываемых после завершения обслуживания разгонки. Программа того, что подлежит выполнению во время обслуживания разгонки, до нее и после ее завершения (Run Time Checklist) Оговариваются подлежащие реализации части метода. Вы можете пользоваться программой того, что подлежит выполнению во время обслуживания разгонки, до нее или после ее завершения, для: • Сбора данных, записи их в память и их обработки (в результате чего формируется сообщение результатов) • Реализации только части метода • Сбора и записи данных в память (без их анализа) • Проведения пересчета уже существующих файлов данных • Вызова самостоятельно составленных макрокоманд, обслуживающих анализ данных; обработку, вызываемую до начала разгонки (разделения) или после завершения разгонки (разделения) • Записи результатов анализа в регистр (ради соблюдений требований GLP [Требований к организации работ в лаборатории]) 44 Состояние методов Метод может находиться в 2 рассмотренных ниже состояниях. Метод, записанный в память (Stored Method) Это метод, записанный на диск в вычислительной машине. Название файлов с методами может составляться из буквенно-числовых знаков (не более 8) и отличается наличием дополнительной части .M. Текущий метод (Current Method) Когда метод, записанный в память, считан с диска в оперативное запоминающее устройство, он становится текущим методом. В оперативном запоминающем устройстве всегда имеется текущий метод. Когда система ChemStation запускается впервые, с самого начала процесса запуска всегда вводится метод, составленный фирмой Agilent Technologies и предполагаемый самой системой автоматически (т.е. заготовка метода). Например, в качестве такой заготовки метода используются: • Метод DEF_LC.M в случае работы с жидкостным хроматографом • Метод DEF_GC.M в случае работы с газовым хроматографом • Метод DEF_CE.M в случае работы с системой для капиллярного электрофореза Копия такого метода становится текущим методом. На этом этапе, вы можете ввести другой метод (который станет текущим). Перечисленными выше заготовками метода предусматривается пользование улучшенным алгоритмом интегрирования. Если вы хотите пользоваться стандартным алгоритмом интегрирования, следует (для создания метода) воспользоваться следующими заготовками: • Метод DEFOLDLC.M в случае работы с жидкостным хроматографом • Метод DEFOLDGC.M в случае работы с газовым хроматографом • Метод DEFOLDCE.M в случае работы с системой для капиллярного электрофореза Создание методов Создание новых методов всегда сводится к редактированию текущего метода (после чего полученный измененный метод может быть записан в память под новым названием). Всегда нужно помнить, что (после изменения текущего метода) записанный на диск вариант метода остается прежним (без изменений) до тех пор, пока результат редактирования не записан в память. 45 При создании метода, вам предоставляется выбор. Вы можете запросить реализацию одной или всех частей анализа. Например, можно составить метод, предусматривающий только сбор данных. Когда вы будете подготовлены к анализу данных и к получению сообщения результатов библиотечного поиска, вы можете изменить метод снова (заставить его решать эти задачи, связанные с обработкой данных). ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Не стирайте метод-заготовку (DEF_LC.M, DEF_GC.M или DEF_CE.M). Эти файлы методов используются в качестве шаблонов для создания новых методов. Редактирование методов Вы можете отредактировать метод, воспользовавшись функцией Edit Entire Method (редактирование всего метода) из перечня, вызываемого через слово Method (метод). На экран будут выводиться все (соответствующие редактированию) сектора, используемые в режиме диалога. После завершения редактирования, полученный метод может быть записан в память. Процесс редактирования показан ниже. Метод записан на диск Считывание метода Метод вводится в оперативное запоминающее устройство и становится текущим Из подсказывающего изображения, вызываемого через слово Method (метод), вызывается функция Edit Entire Method (редактирование всего метода) Метод редактируется Метод записывается в память Записывается под новым названием На диске создается новый метод Записывается под тем же названием Переписывается метод, имеющийся на диске Рис. 2. Редактирование методов Части метода, подлежащие редактированию (Methods Parts to Edit) Каждый метод состоит из 4 частей, которые можно редактировать По-отдельности. Некоторые из рассматриваемых далее подразделов соответствуют специфичным секторам, выводимым на экран и используемым в режиме диалога, а некоторые - лишь обобщенным описаниям. 46 В состав метода входят следующие части: • Информация о методе (Method Information), содержащая поле с текстовым описанием метода • Управление работой прибора (Instrument Control). Состав этой части зависит от указанной конфигурации. Например, оговариваются параметры для термостата газового хроматографа параметры для устройства, вводящего образцы параметры для детектора • Анализ данных (Data Analysis). В этой части указываются: подробные сведения о сигнале (Signal Details) параметры, определяющие режим интегрирования (Integration Parameters) параметры для количественного подсчета (Quantification Parameters) калибровочные параметры (Calibration parameters) параметры, определяющие вид сообщения результатов (Reporting Parameters) • Программа того, что подлежит выполнению во время обслуживания разгонки, до нее и после ее завершения (Run Time Checklist). Этой программой оговариваются части метода, подлежащие реализации Структура заголовков, под которые записываются файлы методов Метод состоит из группы файлов, записанных под соответствующий методу подзаголовок. Под заголовок METHODS записываются файлы методов, к которым приписана дополнительная часть .M. В файлах методов, отличающихся дополнительной частью .MTH, содержатся наборы параметров. Используется запись с употреблением стандартного американского кода для обмена информацией (ASCII). В файл INFO.MTH записаны соответствующие методу управляющие параметры. Файлы метода, содержащие параметры, навязываемые прибору, имеют название, созданное из наименования соответствующего блока аналитического прибора. Например: 47 Таблица 2 Примеры файлов метода LC1090.MTH Этот файл указывает метод сбора данных, принимаемых от жидкостного хроматографа HP 1090 GC5890.MTH Этот файл оговаривает метод сбора данных, принимаемых от газового хроматографа HP 5890 HPCE1.MTH Этот файл указывает метод сбора данных, принимаемых от системы для капиллярного электрофореза DAD1.MTH Этот файл содержит метод сбора данных, принимаемых от детектора с диодной матрицей, которым оснащен хроматограф HP 1090, HP 1050, или от детектора HP 1040 c диодной матрицей (английское сокращенное название детектора с диодной матрицей - DAD) FLD1.MTH Этот файл указывает метод сбора данных от флуориметрического детектора HP 1046 (английское сокращенное название такого детектора - FLD) ECD1.MTH Этот файл оговаривает метод сбора данных от электрохимического детектора HP 1049 (английское сокращенное название такого детектора - ECD) ADC1.MTH Этот файл содержит метод сбора данных от устройства сопряжения Agilent 35900 (от аналого-цифрового преобразователя). Если при указании конфигурации оговорено наличие двух таких устройств сопряжения, файлам метода присваиваются названия ADC1.MTH и ADC2.MTH (английское сокращенное название аналого-цифрового преобразователя: ADC) 1050VWD Этот файл указывает метод сбора данных от блока хроматографа HP 1050 (вид блока уточняется тремя последними буквами; в данном случае, данные собираются с помощью спектрофотометрического детектора с изменяемой длиной волны) DAMETHOD.REG Файл метода, используемый под оценку данных LALS1.REG Этот файл содержит параметры, указываемые для автоматического пробоотборника Agilent 1100. Файлы методов для других блоков жидкостного хроматографа Agilent 1100 имеют аналогичное название, составляемое с использованием синтаксиса lxxx1.reg, где ххх - сокращенное обозначение блока. Что происходит при реализации метода? Сектор с заголовком Run Time Checklist (программа того, что подлежит выполнению во время обслуживания разгонки, до нее или после завершения), используемый в режиме диалога, указывает подлежащие реализации части метода (реализация начинается по команде запуска). 48 Программа (Run Time Checklist) охватывает 8 частей: • Отработка команды или макрокоманды, подлежащей выполнению перед обслуживанием разгонки (Prerun command or macro) • Сбор данных (Data acquisition) • Стандартный анализ данных (Data analysis) • Метод анализа для обработки сигнала со второго канала (только при работе с газовым хроматографом) • Приспособленный (нестандартный) вариант анализа данных (Customized data analysis) • Запись данных в память согласно требованиям GLP (Save GLP data) • Отработка команды или макрокоманды, подлежащей выполнению после завершения разгонки (Postrun command or macro) • Запись копии метода в память вместе с данными (Save copy of method with data) Во время реализации метода, отрабатываются те его части, которые указаны в упомянутом выше секторе с заголовком Run Time Checklist (программа того, что подлежит выполнению во время обслуживания разгонки, до нее или после ее завершения). Реализация метода На рис. 3 показан обзор состояния системы ChemStation во время реализации метода, когда выбраны все части, предусмотренные сектором с заголовком Run Time Checklist (программа того, что подлежит выполнению во время обслуживания разгонки, до нее или после ее завершения). Рис. 3. То, что происходит при реализации метода 49 Команда или макрокоманда, подлежащая отработке до начала обслуживания разгонки (Prerun Command or Macro) Если указана команда или макрокоманда, подлежащая выполнению, она отрабатывается перед началом анализа. Эта часть метода обычно используется для приспособления метода к решению специфичных задач (употребляется совместно с другими вызываемыми подпрограммами). Сбор данных (Data Acquisition) • В текущем методе указываются все параметры, обеспечивающие установку исходных условий. • Если требуется, отрабатывается программа, ответственная за введение образца; введение производится из указанного на данный момент флакона. • На экран выводится информация, отображающая ход анализа (включая представление хроматограммы или электрофореграммы и спектральных данных [если они приобретаются]). • Собираются и записываются в файл данные. Анализ данных (Data Analysis) Когда будет достигнут момент, соответствующий остановке, хроматографический (электрофоретический) анализ прекращается и все необработанные данные записываются на жесткий диск (которым оснащена вычислительная машина). Начинается этап анализа (т.е. пересчета) данных (после того, как в память записаны все необработанные данные). Интегрирование • Те информационные объекты (из записи сигнала), которые представляют собой хроматограмму (или электрофореграмму), интегрируются. Используются параметры, указанные в секторе Integration Events (программируемые по времени параметры, определяющие режим интегрирования), употребляемом в режиме диалога. • Выявляются начало, вершина, время удерживания (время миграции) и конец пика. • Уточняется положение базовой линии под каждым пиком (что дает возможность окончательного определения высоты и площади пика). • Результаты интегрирования представляются в виде таблицы Integration Results 50 Опознание пиков и количественный подсчет • По временам удерживания (временам миграции) и подтверждающим пикам (если пользование такими пиками запрошено), программное обеспечение опознает пики (благодаря сопоставлению с информацией об известных веществах, указанных в калибровочной таблице). • По данным о высоте или площади пиков, программное обеспечение производит подсчет количества каждого вещества (пользуясь калибровочными параметрами, обозначенными в калибровочной таблице). Поиск в спектральной библиотеке (только в случае систем ChemStation для 3-мерной жидкостной хроматографии; систем LC/MS ChemStation и системы ChemStation для капиллярного электрофореза) Для всех пиков, для которых имеются спектрограммы, может быть произведен автоматический поиск в заранее указанной спектральной библиотеке. Это способствует опознанию компонентов образца на основе спектральных данных. Для уточнения подробностей, см. Инструкцию по загрузке и по освоению вспомогательной части программного обеспечения, соответствующей обработке спектральной информации. Проверка чистоты пика (только в случае систем ChemStation для 3-мерной жидкостной хроматографии; систем LC/MS ChemStation и системы ChemStation для капиллярного электрофореза) Для пиков, для которых зарегистрированы спектрограммы, может быть подсчитан коэффициент чистоты, записываемый в регистр. Чистота пика может контролироваться автоматически (в конце каждого анализа), если такой процесс запрашивается как часть метода. Введение такого запроса обеспечивается перечеркиванием квадрата, подтверждающего выбор функции Check Purity (проверка чистоты), при указании необходимости автоматического проведения библиотечного поиска. Для уточнения подробностей, см. Инструкцию по загрузке и по освоению вспомогательной части программного обеспечения, соответствующей обработке спектральной информации. Распечатка сообщения результатов (Print Report) На распечатку выводится сообщение результатов, в котором указываются названия веществ и их концентрации, подсчитанные по хроматограмме (электрофореграмме). 51 Приспособленный (нестандартный) вариант анализа данных (Customized Data Analysis) Обеспечивается возможность выполнения составленных вами макрокоманд, способствующих специфичной оценке аналитических данных. Запись данных в память согласно требованиям GLP (Требованиям к организации работ в лаборатории) [Save GLP Data) В память (под тот же подзаголовок, под который самой системой предусматривается запись файла данных) записываются сведения из двоичного регистра GLPSave.Reg и метод анализа. Пользование такой функцией помогает доказать подлинность данных и качество индивидуального анализа. В двоичном регистре GLPSave.Reg содержится следующая информация (записанная в не редактируемый, предохраненный по контрольной сумме регистровый файл): • Значения параметров, заданных прибору (могут быть представлены для просмотра в графическом виде) • Хроматограммы или электрофореграммы • Результаты интегрирования • Результаты количественного анализа • Метод анализа данных • Протокольный журнал Эти данные записываются в память только в том случае, когда (при указании программы того, что подлежит выполнению во время разгонки, до нее или после ее завершения) перечеркнут квадрат, подтверждающий выбор функции Save GLP Data (запись данных в память согласно требованиям GLP). Вся эта информация может быть выведена на экран для просмотра, но не может быть отредактирована. Команда или макрокоманда, подлежащая отработке после завершения хроматографической разгонки (Postrun Command or Macro) Если указана команда или макрокоманда, подлежащая выполнению, она отрабатывается после завершения оценки данных. Например, запрашивается копирование данных на диск. Запись копии метода в память вместе с данными (Save Copy of Method with Data) Такая запись обеспечивается после сбора данных и только в том случае, если (в программе того, что подлежит выполнению во время обслуживания разгонки, до нее или после ее 52 завершения) указана необходимость сбора данных (Data Acquisition). Текущий метод копируется под тот подзаголовок, под который записываются данные. Краткое указание того, что обеспечивается при реализации метода Далее приводится перечень операций, выполняемых при отработке метода (когда выбраны все части программы того, что подлежит выполнению во время обслуживания разгонки, до нее или после ее завершения): 1. Отрабатывается команда или макрокоманда, подлежащая выполнению до начала обслуживания разгонки Поставленная задача выполняется до начала анализа 2. Сбор данных Выполняется программа, заданная устройству для введения образца Вводится образец Собираются необработанные данные Данные записываются в память 3. Копия метода записывается в память вместе с данными 4. Анализ (пересчет) данных Вызывается файл данных Интегрируется записанная в файл информация Опознаются и количественно подсчитываются пики Проводится поиск в спектральной библиотеке (если такая библиотека имеется) Проверяется чистота (гомогенность) пика (если такая проверка возможна) Выводится распечатка сообщения результатов 5. Отработка приспособленного (нестандартного) варианта анализа данных Отрабатывается составленная вами макрокоманда 53 6. Запоминается информация, соответствующая требованиям GLP В память записывается информация из двоичного регистра LPSave.Reg 7. Отрабатывается команда или макрокоманда, подлежащая выполнению после завершения обслуживания разгонки После завершения анализа выполняется поставленная задача. Например, на распечатку выводится нестандартное сообщение результатов Раздел 3. Сбор данных В этом разделе описывается следующее: • Что представляет собой сбор данных? • Файлы данных • Структура используемых заголовков • Вид информации, выводимой на экран в реальном масштабе времени • Протокольные записи • Информация о состоянии системы • Показ схемы системы на экране Что представляет собой сбор данных? Во время сбора данных, все сигналы (принимаемые от аналитического прибора) преобразуются из аналоговых в цифровые. Цифровой сигнал вводится по кабелю в систему ChemStation и запоминается в виде файла с хроматограммой или электрофореграммой. Файлы данных Файл данных составляется из группы файлов, записываемых под подзаголовок DATA (группа файлов хранится под соответствующим подзаголовком, состоящим из названия файлов данных и дополнительной части .D). Используется следующая система присвоения названий: 54 Таблица 3 Название Файлы данных Пояснения Название.CH Файлы с записью хроматограмм или электрофореграмм. Название файла составляется из названия блока или типа детектора, номера блока, обозначения сигнала или канала. Например, ADC1A.CH, где ADC – тип блока (аналого-цифровой преобразователь), 1 - номер блока; А - обозначение сигнала; .CH - дополнительная часть, отличающая файл с хроматограммой или электрофореграммой Название.UV Файлы с записью спектральных данных. Название файла составляется из указания типа детектора и номера устройства (только в случае пользования детектором с диодной матрицей или флуориметрическим детектором) REPORT.TXT Файлы с данными, включаемыми в сообщение результатов, для соответствующих файлов с хроматограммами или электрофореграммами. Название файла составляется из указания типа детектора, номера устройства, обозначения сигнала или канала. Например, ADC1A.TXT SAMPLE.MAC Макрокоманда с информацией об образце RUN.LOG Протокольные записи, создающиеся во время обслуживания разгонки. Протоколируется ход анализа. В протокольные записи включаются все сообщения об ошибке; важнейшие изменения состояния системы ChemStation LCDIAG.REG Только для жидкостного хроматографа. В этот файл записаны графики, соответствующие работе прибора (графики градиентного изменения состава подвижной фазы, изменения температуры, давления и т.д.); сведения о вводимом объеме и описание системы растворителей ACQRES.REG В этот файл записывается информация о колонках. В случае работы с газовым хроматографом, заносятся данные и о вводимом объеме образца GLPSAVE.REG Когда выбрана функция "Save GLP Data" (запись данных в память согласно требованиям GLP), в этот файл записывается часть файла данных Наряду с файлами результатов, в память может записываться и метод. В этом случае, подзаголовок, под который записан метод, указывается под подзаголовком, под который записываются файлы данных. Вид информации, выводимой на экран в реальном масштабе времени Предусматривается вывод двух типов информации: просмотр сигнала (хроматограммы или электрофореграммы) в реальном масштабе времени и просмотр спектрограмм (тоже в реальном масштабе времени). 55 Просмотр сигнала в реальном масштабе времени Окно для просмотра сигнала (хроматограммы или электрофореграммы) в реальном масштабе времени дает возможность следить сразу за несколькими сигналами. Если аналитическим прибором может предоставляться информация об изменении заданных ему параметров во времени, графики изменения этих параметров могут вводиться в это же окно. Вам предоставляется удобная возможность выбора подлежащих просмотру сигналов, подстройки размаха осей времени и амплитуды сигнала (абсорбции). Если детектор обеспечивает возможность управления установкой сигнала на нуль, имеется клавиша Balance (установка на нуль) Вы можете проконтролировать абсолютную амплитуду сигнала (информация о которой выводится в строку сообщений), если будете удерживать нажатой левую клавишу мыши при помещении указателя в окно для просмотра сигнала. Просмотр спектрограмм в реальном масштабе времени В окне для просмотра спектрограмм (это окно появляется на экране при пользовании только теми системами Agilent ChemStation, которые дают возможность оценки спектральной информации) показывается зависимость абсорбции от длины волны. Вы можете отредактировать просматриваемый диапазон длин волн и размах шкалы абсорбции. Протокольные записи (Logbook) Протоколируются сообщения, выводимые аналитической системой. К таким сообщениям могут относиться сообщения об ошибках; подаваемые системой сообщения; сообщения о событиях, получаемых от блока хроматографа. Записи протоколируются независимо от того, выводятся ли сообщения на экран, или нет. Для получения более подробной информации о событии, записанном в протокольный журнал, установите указатель на интересующую строку журнала и дважды (быстро) нажмите левую клавишу мыши. На экране появится пояснительный текст. Информация о состоянии системы ChemStation В окно с информацией о состоянии системы (окно Status [состояние]) выводится сводка сведений о том, чем занята система ChemStation. Когда обслуживается одиночный анализ: • В первой строке окна Status сообщается о том, что система занята обслуживанием хроматографической разгонки. • Во второй строке указывается состояние отработки текущего метода. 56 • В третьей строке указываются название файла, в который записываются необработанные данные, и текущее время (отсчитываемое с момента начала разгонки). В случае работы с газовым хроматографом, указываются названия файлов, регистрируемых при пользовании передним и задним устройствами для введения образца В окнах с информацией о состоянии прибора (Instrument Status) указываются сведения о состоянии блоков прибора и детекторов. Cообщается состояние отдельных блоков и узлов (например, давление, отработка градиентного изменения состава подвижной фазы и сведения о скорости протока). Планка со сведениями о состоянии Системой графического общения с оператором обеспечивается показ планок с клавишами и планки со сведениями о состоянии в поле просмотра Method and Run Control (просмотр метода и управление обслуживанием разгонки). Планка со сведениями о состоянии информирует о состоянии системы, о методе и программе анализов, вызванных на данный момент времени. Если метод или программа анализов были изменены после вызова, они маркируются красным треугольничком. В случае работы с блоками жидкостного хроматографа Agilent 1100, желтый символ EMF (таким сокращением обозначается система обратной связи, заблаговременно предупреждающая о необходимости выполнения работ по техническому обслуживанию прибора) напоминает владельцу системы, что превышен (указанный самим владельцем) срок эксплуатации конкретных расходных деталей (например, лампы). Показ схемы системы на экране Если предусмотрен показ схемы обслуживаемого аналитического прибора на экране (например, в случае работы с блоками жидкостного хроматографа Agilent 1100 или с газовым хроматографом Agilent 6890), вы можете пользоваться таким графическим изображением для быстрой оценки состояния системы. Выбор функции System Diagram (схема системы) из перечня, вызываемого через слово View (просмотр) в поле обзора Method and Run Control (просмотр метода и управление обслуживанием разгонки) приводит к получению такого графического представления. Каждый компонент схемы представлен соответствующей картинкой. Для указания текущего состояния используется следующая система кодирования цветом: Таблица 4 Цвет Система кодирования состояния цветом Состояние Серый Устройство не работает или отсутствует Желтый Устройство не готово Зеленый Устройство готово Синий Обслуживается разгонка Красный Отмечена ошибка 57 Кроме того, вы можете запросить сводку указаний текущих параметров. Помимо выводимого на экран сообщения о состоянии, вы можете (через элементы показываемой схемы) вызвать на экран сектора, используемые в режиме диалога для указания параметров для каждого из компонентов или узлов системы. Для получения более подробной информации о пользовании графическим представлением схемы, запросите вывод подсказывающих сообщений (через функцию Help), имеющих отношение к работе прибора (раздел Instrument [прибор]). Раздел 4. Интегрирование Этот раздел посвящен обсуждению следующих тем: • Что представляет собой интегрирование? • Что делается при интегрировании ? • Алгоритмы интегрирования, предусмотренные системой Agilent ChemStation Что представляет собой интегрирование? Интегрирование обеспечивает выявление пиков на хроматограмме (электрофореграмме), определение их размера. Интегрирование - необходимый этап для: • Количественного анализа • Подсчета показателя чистоты пика (только в случае систем ChemStation для 3-мерной жидкостной хроматографии; систем LC/MS ChemStation и системы ChemStation для капиллярного электрофореза) • Проведения спектрального библиотечного поиска (только в случае систем ChemStation для 3-мерной жидкостной хроматографии; систем LC/MS ChemStation и системы ChemStation для капиллярного электрофореза) Что делается при интегрировании? В ходе интегрирования хроматограммы (электрофореграммы), программное обеспечение: • Выявляет начало и конец каждого пика; маркирует эти точки вертикальными рисками • Находит вершину пика (т.е. определяет время удерживания или время миграции) 58 • Проводит базовую линию • Подсчитывает площадь, высоту и ширину каждого пика Этот процесс контролируется параметрами, определяющими режим интегрирования. Алгоритмы интегрирования, предусмотренные системой Agilent ChemStation Cистемой ChemStation используется два алгоритма интегрирования. Стандартный алгоритм интегрирования успешно применялся в прежних вариантах системы ChemStation и в большинстве других вариантов программного обеспечения, ответственного за обработку информации, поступающей с аналитических приборов. Заложен и новый (улучшенный) алгоритм интегрирования (первый вариант), созданный ради повышения надежности, точности и упрощения работы. При пользовании рассматриваемым здесь вариантом программного обеспечения, мы рекомендуем употреблять стандартный алгоритм при реализации тех методов анализа, которые уже прошли метрологическую аттестацию, и новый (улучшенный) алгоритм - при создании новых методов. Краткая история внедрения стандартного алгоритма интегрирования Стандартный алгоритм интегрирования появился в 1980-х годах (впервые использовался в системе HP 3350, обеспечивающей обработку лабораторных данных). Позднее, этот алгоритм был заимствован системой обработки данных HP 3365 ChemStation. В конце концов, он же стал использоваться новой системой ChemStation. Стандартный алгоритм интегрирования был создан для обслуживания данных, поступающих с разнообразных аналитических приборов, при минимальном вмешательстве оператора в оптимизацию процесса пересчета. По мере расширения спектра выпускаемого аналитического оборудования, было понято, что ни один стандартный алгоритм интегрирования не может быть оптимальным для всех возможных прикладных задач, решаемых в 1990-е годы. В каких-то случаях, при пользовании таким алгоритмом приходится жертвовать эксплуатационными характеристиками. Совместимость Стандартный алгоритм интегрирования остается доступным для специалистов, уже разработавших под него множество методов. Кроме того, не для всех окажется удобным переход к усовершенствованному алгоритму на данный момент времени. Файлы данных, накопленные или обрабатывавшиеся с помощью стандартного алгоритма интегрирования, допускают пользование двумя существующими алгоритмами. 59 Внедрение улучшенного алгоритма интегрирования Отреагировав на советы покупателей оборудования, распознавших возможности повышения эффективности интегрирования, фирма "Хьюлетт-Паккард" создала усовершенствованный алгоритм. Выяснилось, что таким алгоритмом должна предусматриваться реализация целого ряда индивидуально подобранных функций, чтобы стало возможным решение различных аналитических задач, с которыми уже специалисты столкнулись или которые возникнут в будущем. Общие (для двух алгоритмов) реализуемые возможности Оба алгоритма интегрирования реализуют следующие возможности: • подбор параметров, определяющих режим интегрирования, автоматически (режим autoinegrate) • составление индивидуальных таблиц параметров, определяющих режим интегрирования, для каждого из каналов (если регистрируются сигналы с нескольких детекторов или при пользовании многоканальной информацией, выводимой с одного детектора) • предоставление владельцу системы возможности указания интересующих моментов (под параметры, определяющие режим интегрирования) непосредственно на графике • графическое управление интегрированием хроматограмм (электрофореграмм) вручную (в тех случаях, когда сложность объекта требует такого вмешательства); подобранный нестандартный подход может быть вписан в метод (т.е. использован при последующей автоматической реализации серии анализов) • вывод на экран и распечатка результатов интегрирования • возможность проинтегрировать (по меньшей мере) 1000 пиков хроматограммы (или электрофореграммы) Двумя алгоритмами интегрирования предусмотрены следующие группы команд: • Исходно определяющие и изменяющие основную настройку интегратора для исключения площадей, указания ширины пика и порога, при превышении которого производится опознание веществ (параметры, обеспечивающие подавление шума) • Параметры, управляющие выявлением базовой линии ("принудительное принятие данной точки за соответствующую базовой линии", "фиксирование уровня базовой линии", "принятие всех впадин между пиками за точки базовой линии", "принятие следующей впадины между пиками за точку базовой линии", "горизонтальное проведение базовой линии в обратном направлении из точки конца текущего пика") • Управляющие суммированием площадей пиков • Управляющие распознанием отрицательных пиков 60 • Управляющие выборкой пиков с хвоста других пиков по касательной (включая команды, заставляющие распознать пики растворителя) • Команды, указывающие допуск по времени удерживания, используемый при выполнении конкретных функций интегратором Улучшенные возможности, предоставляемые новым алгоритмом интегрирования Новый алгоритм интегрирования создает лучшие условия (по сравнению со стандартным) для: • Оптимизации выявления базовой линии с помощью параметров, указанных в индивидуальном методе, при обработке файлов данных • Удаления шумовых выбросов сигнала (с помощью параметра "исходная высота пика") • Лучшего выявления фактической площади пика хроматограммы (электрофореграммы), характеризующейся избыточным уровнем шума • Выявления уступов на пиках по второй производной или за счет подсчета степени кривизны • Более универсальной выборки пиков с хвоста пика хроматограммы (электрофореграммы). Используются разделение прямой линией, разделение по экспоненте, разделение с плавным переходом от экспоненты к прямой линии. • Улучшения выборки данных (с разбивкой не на равноудаленные точки; такая разбивка дает более высокую эффективность обработки файлов данных, зарегистрированных детектором с диодной матрицей, или данных, реконструированных по спектрограммам, снятым таким детектором). • Легкой эксплуатации (на экране показывается набор клавиш, соответствующих новому алгоритму; внимание фокусируется на основной информации) Оба алгоритма интегрирования описаны более подробно в разделе 5 ("Стандартный алгоритм интегрирования") и в разделе 6 ("Улучшенный алгоритм интегрирования"). Раздел 5. Стандартный алгоритм интегрирования В этом разделе обсуждаются: • Стандартный алгоритм интегрирования • Параметры, определяющие режим интегрирования 61 • Подходы к интегрированию • Автоматическое интегрирование • Отработка команды проинтегрировать • Управление интегрированием вручную Стандартный алгоритм интегрирования Стандартный алгоритм интегрирования использовался прежними вариантами программного обеспечения ChemStation и, кроме того, предусматривался большинством других разновидностей программного обеспечения, созданного фирмой Agilent Technologies для пересчета информации, поступившей с разных аналитических приборов. В этом разделе описывается, как производится отработка, соответствующая стандартному алгоритму. Когда хроматограмма (электрофореграмма) проинтегрирована, согласно стандартному алгоритму интегрирования: • распознаются моменты начала и конца каждого пика; эти точки маркируются вертикальными рисками • находится вершина каждого пика (т.е. устанавливается время удерживания [время миграции]) • выявляется базовая линия • подсчитываются высота, площадь и ширина всех пиков Этот процесс регулируется параметрами, определяющими режим интегрирования (возможно, с запрограммированным их изменением во времени). Двумя наиболее важными параметрами являются "порог" и "ширина пика". Программное обеспечение ChemStation дает вам возможность установить исходные значения этих и других параметров. Такими значениями определяется режим обработки начала хроматограммы (электрофореграммы). В большинстве случаев, для получения хороших результатов достаточно употребления только таких (исходных) значений параметров. Однако вы можете воспользоваться программированием изменения соответствующих параметров во времени. Для получения более подробной информации, см. подраздел "Программируемые по времени события" (стр. 76). Как обеспечивается интегрирование? Процесс интегрирования сводится к отработке следующих этапов: • Выявление пиков (нахождение ключевых точек) • Уточнение положения базовой линии 62 • Подсчет площади пика Выявление пика Первым этапом процесса интегрирования является выявление пиков, при котором последовательно отрабатываются следующие операции: • Поиск точки начала пика • Распознание вершины пика • Нахождение конца пика Интегрирование обособленных пиков Интегратор прослеживает поступающий цифровой сигнал предполагая, что первая точка сигнала попадает на базовую линию. По мере прослеживания данных, подсчитывается перемещающееся среднее значение за период времени, равный исходной ширине пика (это усредненное значение считается соответствующим базовой линии). Такой процесс продолжается столь долго, сколь долго кривизна изменений сигнала остается ниже конкретного значения, подсчитанного через значение порога. Когда отмечается превышение этого значения, может быть принято решение о выходе на начало пика (если превышение продолжается). Пик обрабатывается, после чего интегратор продолжает прослеживать базовую линию. Процесс выявления очевидного пика (см. рис. 4, приведенный на следующей странице): 1. Наклон и кривизна укладываются в границы: прослеживание базовой линии 2. Наклон и кривизна выходят за границы: возможно, выход на пик 3. Наклон остается выше границы: принимается решение о выходе на пик 4. Кривизна становится отрицательной: передняя точка перегиба 5. Наклон становится отрицательным: вершина пика 6. Кривизна становится положительной: задняя точка перегиба 7. Наклон и кривизна укладываются в границы: приближение к концу пика 8. Наклон и кривизна не выходят за границы: конец пика; прослеживание базовой линии 63 Рис. 4. Ключевые точки На этапах 3, 5 и 8 выявлены ключевые точки, соответствующие началу пика, вершине пика и концу пика. Наличие пика подтверждается, если результирующая ширина пика попадает в пределы, установленные параметром "ширина пика" (изменение которого может программироваться по времени). Для уточнения подробностей, см. подраздел "Ширина пиков (Peak Width)" (стр. 71). Нахождение вершины пика В точке, соответствующей вершине пика, наклон изменяет знак (становится отрицательным вместо положительного). Для подсчета времени удерживания и ширины пика, интегратор берет наивысшую точку данных и по одной точке с той и другой сторон; обеспечивает подгонку под квадратичную зависимость, после чего решает уравнение для нахождения наивысшей точки. Рис. 5. Выявление вершины пика 64 Интегрирование слившихся пиков Иногда, пики сливаются (между ними не обнаруживается базовой линии). В случае пика, регистрируемого от базовой линии до точки впадины (BV) и от точки впадины до базовой линии (VB), интегратор разделяет слившиеся пики проведением перпендикуляра (к базовой линии) из точки впадины. Сперва, интегратор находит начало первого пика и продолжает накапливать данные, пока не обнаружится точка впадины. При выявлении точки впадины, накопление выборок данных для первого пика прекращается. Начинается накопление выборок данных для второго пика. Когда интегратор находит конец второго пика, накопление выборок данных завершается. Для получения информации о кодах коррекции базовой линии, см. подраздел "Коды коррекции базовой линии" (стр. 65). Рис. 6. Слившиеся пики Интегрирование уступов Уступ представляет собой признак неотделенного пика на переднем или заднем склоне большого пика. Впадины (перехода от отрицательного наклона к положительному) не обнаруживается. Рис. 7. Уступы на пиках 65 Уступы обнаруживаются, а сообщаемое для них время соответствует обнаружению максимума отрицательной кривизны. В подсчитанную площадь большого пика входит и площадь уступа (уступов). Уточнение положения базовой линии После выявления пика, уточняется положение базовой линии (чтобы появилась возможность окончательного определения площади пика). Положение базовой линии зависит от изменений сигнала (хроматограммы или электрофореграммы). Интегратор проводит базовую линию в виде набора линейных сегментов между: • уровнем хроматограммы (электрофореграммы) с самого ее начала • маркерными рисками, отмечающими начало и конец пиков • уровнем сигнала в момент завершения разгонки; если в момент подачи команды прекращения обслуживания разгонки регистрируется пик, берется точка (соответствующая этому моменту), попадающая на горизонтальную линию, проведенную к концу хроматограммы из последней точки, принятой за соответствующую базовой линии Рис. 8. Вариант уточнения базовой линии, предусмотренный самой системой автоматически Коды коррекции базовой линии Каждому пику приписывается код из 2 букв, указывающий каким образом была проведена базовая линия. Первая буква соответствует выявлению базовой линии в начале пика; вторая - выявлению базовой линии в конце пика. А От интегрирования пика система отказалась (А – первая буква английского слова aborted – выброшен) 66 В Пик начался или закончился на базовой линии (B - первая буква английского слова baseline - базовая линия) Н Пик начался или закончился на базовой линии, проведенной горизонтально (H - первая буква английского слова horizontal - горизонтальная) N Пик отрицательный (N - первая буква английского слова negative - отрицательный) Р Пик начался или закончился точкой захода за базовую линию (P - первая буква английского слова penetration - проникновение) S Интегратор распознал данный пик, как пик растворителя (эта буква появляется только в качестве второй буквы в коде коррекции базовой линии) [S - первая буква английского слова solvent - растворитель] T Пик начался или закончился во время действия разрешения производить выборку по касательной (T - первая буква английского термина tangent skim - выборка по касательной) V Пик начался или закончился с проведения перпендикуляра из точки впадины до базовой линии (V - первая буква английского слова valley - впадина) + Пик был включен в группу пиков, площадь которых суммировалась - Пик отрицателен (оказался ниже базовой линии). Этот знак указывается после кода коррекции базовой линии, состоящего из 2 букв Если используется режим управления интегрированием вручную, вводятся некоторые дополнительные коды: М Пик был проинтегрирован при управлении интегрированием вручную (М - первая буква английского слова manually - вручную) F Площадь пика была принудительно изменена переходом к управлению интегрированием вручную. Если пик был отмечен перед началом интегрирования вручную и время окончания пика было изменено за счет перехода к такому интегрированию, пик считается подвергшимся принудительному изменению (F - первая буква английского слова forced - принудительно) R На подсчет пика растворителя повлияли введением управления интегрированием вручную; так, пик подвергшийся выборке по касательной, считается пересчитанным пиком растворителя (R - первая буква английского слова recalculated - пересчитанный) Если разрешено обнаружение уступов и такие уступы обнаружены, в столбец Type (код коррекции базовой линии) записывается код, состоящий из 4 букв: FSHO Уступ обнаружен на переднем склоне пика RSHO Уступ обнаружен на заднем склоне пика 67 Изменение логики проведения базовой линии При конкретных условиях, интегрирующая система изменяет логику проведения базовой линии для включения точек, определяемых с использованием ряда правил (оговоренных далее). См. рис. 9. Рис. 9. Измененный вариант уточнения положения базовой линии • Если пик заходит за базовую линию (BP и PB), базовая линия тоже заходит вниз, до самой нижней точки пика (см. точку 1 на рис. 9). • Если пик растворителя, обнаруженный благодаря выборке по касательной, не начинается на базовой линии, базовая линия проводится через точку (см. точку 2), соответствующую началу пика и расположенную на черте, горизонтально проведенной из последней точки, признанной соответствующей базовой линии. Код OSHB (переполнение при регистрации пика растворителя на горизонтальной базовой линии) означает, что сигнал превысил границу линейного диапазона детектора). • Если пик заканчивается очевидной точкой впадины, но площадь следующего пика оказывается попадающей под критерий исключаемой (т.е. площадь меньше указанного вами значения параметра "исключаемая площадь"), базовая линия проецируется из начала пика на следующую истинную точку базовой линии (см. точку 3 на рис. 9). Если аналогичная ситуация отмечается перед началом пика, применяется то же самое правило. • Для улучшения обработки затянутых пиков, отмечается время, в течение которого пик превышает критерии, предъявляемые к переднему склону и к заднему склону, после чего 1/4 этого времени добавляется в конце пика и лишь затем декларируется завершение пика (см. точку 4 на рис. 9). 68 Заходы за базовую линию Заход за базовую линию декларируется, когда уровень сигнала падает ниже проведенной базовой линии. Если отмечается такой заход, на этом участке базовая линия проводится заново. Рис. 10. Заход за базовую линию Выборка по касательной Выборка по касательной - вид коррекции базовой линии, выполняемой когда пик обнаруживается на заднем склоне любого пика, сочтенного пиком растворителя. Интегратор производит необходимый подсчет для проведения касательной из точки впадины перед пиком-наездником (находящимся на хвосте пика растворителя) до той точки пика растворителя, в которой наклон сигнал детектора совпадает с наклоном касательной. Рис. 11. Выборка по касательной Измерение площади пиков Последней операцией, выполняемой при интегрировании, является определение площади пика. Площадь подсчитывается (в процессе интегрирования) следующим образом: 69 В случае обособленных пиков (BB [т.е. начинающихся и заканчивающихся на базовой линии]), подсчитывается площадь выше базовой линии (между точками, отмеченными маркерными рисками). Рис. 12. Измерение площади пиков, начинающихся на базовой линии и заканчивающихся выходом на базовую линию В случае пиков, начинающихся с точки впадины и заканчивающихся точкой впадины (VV), площадь, оказывающаяся выше базовой линии, выделяется перпендикулярами, проведенными до базовой линии из точек с маркерными рисками. Рис. 13. Измерение площади слившихся пиков (от точки впадины до точки впадины) • В случае пиков, выбираемых по касательной (T), подсчитывается площадь над (проведенной по касательной) базовой линией. • Для пика растворителя (S), определяется площадь свыше линии, проведенной горизонтально из последней найденной точки базовой линии, и до базовой линии, проведенной в целях выборки пика-наездника (T) по касательной (т.е. в площадь пика растворителя не входит площадь пика-наездника). Увеличение амплитуды пика растворителя может оказываться слишком медленным (что не дает возможности автоматического его распознания как пика растворителя) или на каком-то отдаленном участке хроматограммы (электрофореграммы) может иметься группа пиков, которую вы предпочитаете обрабатывать как состоящую из пика растворителя (первого из группы) и пиков-наездников. Простое проведение перпендикуляра из точки впадины до базовой линии будет приводить к завышению площади пиков-наездников. В таких ситуациях, можно вынудить систему принять пик за пик растворителя (остальные пики будут обработаны методом выборки с хвоста первого пика по касательной). 70 Хотя понятие "пик растворителя" не применимо в случае работы с системами для капиллярного электрофореза, возможно, что код, соответствующий этим пикам, будет приписываться большим пикам системой Agilent ChemStation. Рис. 14. Измерение площади пика, выбираемого по касательной, и пика растворителя Ниже базовой линии могут обнаруживаться отрицательные пики, имеющие положительную площадь (как показано на рис. 15). Рис. 15. Измерение площади отрицательных пиков 71 Параметры, определяющие режим интегрирования Существуют 4 исходных параметра, определяющих режим интегрирования, и 19 программируемых (в тех же целях) событий. Многие события характеризуются лишь состояниями "подача", "отмена" или "начало", "окончание". Исходные параметры, определяющие режим интегрирования Исходная ширина пика (Initial Peak Width) Задается исходная ширина пика на уровне половины высоты Исходный порог (Initial Threshold) Указывается минимальный уровень сигнала, до которого сигнал не считается соответствующим пику Исходная исключаемая площадь (Initial Area Reject) Задается значение площади, пики с площадью ниже которого не рассматриваются Обнаружение уступов (Shoulder Detection) Разрешается (on) или запрещается (off) обнаружение уступов Ширина пиков (Peak Width) Стандартный алгоритм интегрирования подсчитывает ширину пика (W) по следующей формуле: Где: ti – выборка времени А – площадь пика Н – высота пика Результат подсчета по этой формуле соответствует ширине гауссовского пика на уровне половины высоты (для гаусссовского пика t2 + t3 и A/H всегда одинаковы). Если пик сколь нибудь затянут, ширина его оказывается больше (чем таким образом найденная ширина на уровне половины высоты), из-за чего результат подсчета числа теоретических тарелок для затянутых пиков окажется заниженным. Однако интегрирование продолжает давать пригодные значения даже в случае сильно слившихся пиков. См. рисунок, приведенный на следующей странице. 72 Рис. 16. Ширина пика Указание ширины пика регулирует селективность интегратора (его способность различать пики на фоне шума, имеющегося на базовой линии хроматограммы). Для выбора подходящего значения параметра "ширина пика" для одиночного интересующего пика, воспользуйтесь результатом измерения ширины пика (в минутах) на уровне половины высоты. Для успешного пользования параметром "ширина пика", должно быть подобрано наилучшее значение, при котором степень фильтрации лишь настолько высока, чтобы предотвращалось распознание шумовых выбросов сигнала в качестве пика (но при этом не оказывается столь большой, что искажается хроматографическая информация). Если принятое значение параметра "ширина пика" слишком мало, шумовые выбросы сигнала будут считаться пиками. В качестве исходного значения параметра "ширина пика" должно быть взято равное ширине наиболее узкого интересующего пика на хроматограмме. Обычно, при изократических разделениях в жидкостной хроматографии или при пользовании неизменной температурой колонки в газовой хроматографии, ширина пика возрастает по мере увеличения времени удерживания. В таких случаях, может понадобиться изменение ширины пика с помощью программируемых по времени событий. Может наблюдаться чередование широких и более узких пиков. Изменение величины параметра "ширина пика" для различных пиков можно программировать по времени, для чего пользуются параметром peak width (ширина пика), оговариваемым в секторе с заголовком Integration Events (программируемые по времени параметры, определяющие режим интегрирования) [сектор используется в режиме диалога]. Самой системой (даже без такого программирования) обеспечивается автоматическое изменение значения параметра "ширина пика" во время процесса интегрирования (т.е. по мере обнаружения последующих пиков на хроматограмме). Обновленное значение определяется взвешиванием согласно выражению (0,75) х (существующее значение ширины пика) + (0,25) х (ширина текущего пика) Изменение при обновлении не может превышать 25%. Если во время процесса интегрирования пользуются запрограммированным по времени изменением ширины пика, рассмотренный выше режим автоматического изменения значения параметра "ширина пика" отменяется. 73 Диапазон ширины пиков Диапазон ширины пиков - это диапазон, гарантирующий обнаружение пика. Если ширина пика на хроматограмме выходит за верхнюю или нижнюю границу этого диапазона, пик не будет обнаружен. Для получения более подробной информации, см. рис. 17 (стр. 75). Размах диапазона ширины пика зависит от характеризующего хроматограмму отношения сигнала к шуму. Если это отношение достаточно велико (например, 100:1 или более), нижняя граница диапазона будет составлять (примерно) 1/3 от указанного значения параметра "ширина пика", а верхняя граница - достигать (примерно) утроенного такого значения. Когда это отношение оказывается плохим (например, 5:1), диапазон ширины пиков будет сильно сужен (примерно, от 90% до 110% указанного значения параметра "ширина пика"). Порог (Threshold) Параметром "порог" обеспечивается подавление шума). Значением параметра "порог" указывается минимальная амплитуда сигнала, с которой допустимо интегрирование. Например, пики с высотой менее порогового уровня будут интегратором проигнорированы. Чем выше значение порога, тем больше должна быть высота (отсчитываемая от установленной базовой линии), чтобы точка данных была декларирована в качестве соответствующей началу пика. Порог подсчитывается по следующей формуле: Порог = с2n-6 , где: с - постоянная, зависящая от детектора; n - значение порога Значение порога задается в относительных единицах; попадает в диапазон от -20 до 25. В приводимой далее таблице показывается взаимосвязь указываемого значения порога с уровнем сигнала (в миллиединицах абсорбции) детекторов, которые могут использоваться при работе с системой ChemStation. К таким детекторам относятся детектор HP 1090 c диодной матрицей; детектор с диодной матрицей, используемый в системе для капиллярного электрофореза; флуориметрический детектор HP 1046, детектор HP 1050 с диодной матрицей; спектрофотометрический детектор HP 1050 с изменяемой длиной волны, многоволновый детектор HP 1050. Те же самые значения (но в мВ) применимы к случаю работы с 2-канальным устройством сопряжения (аналого-цифровым преобразователем) Agilent 35900C, Agilent 35900D или Agilent 35900E. Порогом нельзя пользоваться для подавления пиков, высота которых приближается к высоте наиболее малых интересующих пиков (для этих целей параметр "порог" не предназначен). Для исключения малых пиков, рекомендуется употреблять параметр "исключаемая площадь" (Area Reject). 74 Таблица 5 Значения параметра "порог" для детекторов жидкостного хроматографа Значение параметра «порог» (Threshold) -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Сигнал детектора жидкостного хроматографа (миллиединицы абсорбции) или аналого-цифрового преобразователя (мВ) 0,03125 0,0625 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16 31 62 125 250 500 1000 Исключаемая площадь (Area Reject) Параметр "исключаемая площадь" дает возможность исключить пики с конкретными величинами площади. Любые пики, площадь которых оказывается ниже минимального уровня, заданного в качестве значения параметра Area Reject (исключаемая площадь), не будут включаться в сообщение результатов. Выявление уступов (Shoulder Detection) Когда разрешено выявление уступов (on), интегратором используется более сложный алгоритм интегрирования пиков, дающий возможность обнаруживать уступы на пиках. Изменение порога и ширины пика Параметры "ширина пика" (Peak Width) и "порог" (Threshold) являются крайне важными для процесса интегрирования; изменение их значений может приводить к получению разных результатов. • Выгодно увеличивать и порог, и ширину пика, когда требуется обнаруживать относительно большие концентрации веществ на фоне довольно большого шума. 75 Увеличение значения параметра "ширина пика" повышает степень фильтрации сигнала; увеличение значения параметра "порог" гарантирует подавление хаотичного шума. • Снижать и порог, и ширину пика выгодно, когда необходимо обнаруживать и количественно подсчитывать содержание микропримесей, высота пиков которых приближается к уровню шума. Снижение значения параметра "ширина пика" уменьшает степень фильтрации сигнала, а снижение значения параметра "порог" гарантирует, что малые пики не будут исключены из рассмотрения из-за того, что они имеют недостаточно большую высоту. • В ситуации, когда пики имеют разную ширину, но приходится обнаруживать и количественно подсчитывать и широкие, и узкие пики (без возможности изменения значения параметра "ширина пика"), следует установить ширину пика, соответствующую наиболее узким интересующим пикам, а значение параметра "порог" уменьшить таким образом, чтобы наиболее широкие пики все еще обнаруживались. Специфичная подстройка режимов интегрирования Часто оказывается целесообразным изменение значений параметров "ширина пика", "порог" и "исключаемая площадь" ради специфичной подстройки режимов интегрирования регистрируемой хроматограммы или электрофореграммы. На рис. 17 показано влияние параметров "порог", "ширина пика" и "исключаемая площадь" на интегрирование имеющихся на хроматограмме 5 пиков. Рис. 17. Пользование исходными значениями параметров Таблица 6 Пик 1 110 Подсчитанная площадь (см. рис. 17) Пик 2 50 Пик 3 200 Пик 4 32 Пик 5 30 Пик 6 241 76 Пик интегрируется только тогда, когда удовлетворяются требования, предъявляемые всеми тремя параметрами, определяющими режим интегрирования. При установке тех значений параметров "ширина пика" (согласно пику 3), "исключаемая площадь" и "порог", которые показаны на рис. 17, проинтегрированными окажутся только пики 1 и 3. Таблица 7 Параметр, определяющий режим интегрирования Порог Диапазон ширины пика Исключаемая площадь Интегрируется ли пик? Зависимость от пороговых значений Пик 1 Пик 2 Пик 3 Пик 4 Пик 5 Пик 6 Выше Попадает Выше Попадает Выше Попадает Ниже Попадает Выше Ниже Выше Выше Выше Ниже Выше Ниже Ниже Выше Да Нет Да Нет Нет Нет Пик 1 интегрируется (поскольку удовлетворяются требования всех 3 параметров, определяющих режим интегрирования) Пик 2 исключается (поскольку его площадь меньше значения, заданного для параметра "исключаемая площадь) Пик 3 интегрируется (поскольку удовлетворяются требования всех 3 параметров, определяющих режим интегрирования) Пик 4 не интегрируется (поскольку его высота меньше заданного порога) Пик 5 не интегрируется (поскольку его ширина меньше нижнего предела диапазона ширины пика) Пик 6 не интегрируется (поскольку его ширина больше верхнего предела диапазона ширины пика) Программируемые по времени события Когда тот вариант установления положения базовой линии, который предполагается самим интегратором, не устраивает, можно воспользоваться программируемыми по времени параметрами, определяющими режим интегрирования. Такие параметры выгодны в случае необходимости сложения конечных площадей пиков и когда требуется скорректировать кратковременные или длительные уходы базовой линии. Для получения более подробной информации о программируемых по времени событиях, см. подсказывающие изображения, выводимые на экран непосредственно во время работы (в ответ на запрос помощи [Help]). 77 Таблицы с параметрами, определяющими режим интегрирования (Integration Events) Под каждый сигнал (хроматограмму или электрофореграмму), регистрируемый конкретным методом, может иметься собственный набор параметров, определяющих режим интегрирования и заданных в виде таблицы. Такими индивидуальными таблицами система не пользуется, если только • Они не составлены владельцем системы, указавшим события, определяющие режим интегрирования, через сектор Integration Events, используемый в режиме диалога • Владелец системы не выбрал режим автоматического интегрирования, при котором параметры оптимизируются для каждого из сигналов Если индивидуальная таблица с параметрами, определяющими режим интегрирования, не используется, действующей оказывается таблица, применимая для всех сигналов (с параметрами, предполагаемыми самой системой автоматически). Методы интегрирования Системой ChemStation предусмотрены следующие методы интегрирования: • Автоматическое интегрирование (Autointegration) • Интегрирование по команде Integration • Управление интегрированием вручную (Manual Integration) Автоматическое интегрирование (Autointegration) Режим автоматического интегрирования обеспечивает обследование начальной и конечной зон хроматограммы для установления значений параметров "порог" (Threshold) и исключаемая площадь" (Area Reject). Кроме того, при автоматическом интегрировании устанавливается временное значение параметра "ширина пика" (Peakwidth) с учетом продолжительности разгонки и критерия к минимальному порогу обнаружения. Пробное интегрирование выполняется при установке значения параметра "исключаемая площадь" (Area Reject) на нуль. Если при таком пробном интегрировании пиков не обнаруживается, значения параметров подстраиваются и пробное интегрирование производится снова (если потребуется, несколько раз). Данные о ширине первого обнаруженного пика объединяются, благодаря чему выясняется исходное значение параметра "ширина пика" (Peakwidth), которым система пользуется в режиме автоматического интегрирования для обработки хроматограммы. 78 Ограничения Автоматическое интегрирование является хорошим начальным подходом к обработке большинства хроматограмм (целесообразно им пользоваться на ранних этапах разработки методов). Однако, для получения качественных хроматографических данных и сведений об образце этот подход непригоден. В ходе автоматического интегрирования определяются значения для начальной зоны разгонки, из-за чего ограничивается применимость к необычным ситуациям и к специфичным участкам хроматограммы, которые регистрируются позже. Если в начальной зоне хроматограммы наблюдаются искажения базовой линии; когда в начальной или конечной точке хроматограммы имеется пик, пользование автоматическим интегрированием может привести к затруднениям. Фактически, к осложнениям приводят: • Отрицательные пики • Смещение базовой линии вверх или переходные процессы, обусловленные переключением клапанов или каналов, по которым регистрируется сигнал • Подъем базовой линии в конце хроматограммы (например, обусловленный постепенном уносом неподвижной фазы из колонки газового хроматографа) В тех случаях, когда одно лишь автоматическое интегрирование не дает удовлетворительных результатов, вы можете запрограммировать параметры, определяющие режим интегрирования. При обработке показанной выше хроматограммы, можно воспользоваться следующими программируемыми по времени параметрами (событиями): • Запрет интегрирования (Integrator Off) • Отмена запрета интегрирования (Integrator On); принятие всех точек впадин между пиками за соответствующие базовой линии (Baseline All Valleys) • Принятие данной точки за соответствующую базовой линии (Set Baseline) Кроме того, может потребоваться изменение параметров, дающих возможность обнаружения пиков, за счет программируемых по времени событий. Интегрирование по команде Integratе Хроматограмма (электрофореграмма) интегрируется в соответствии со значениями, записанными в таблицу параметров, определяющих режим интегрирования. Вы можете пользоваться таким режимом для подгонки результатов интегрирования (сперва изменяете параметры, определяющие режим интегрирования, а затем запрашиваете пересчет). 79 Результативны и автоматическое интегрирование (Autointegrate), и интегрирование по команде Integrate. Однако при автоматическом интегрировании система сама подсчитывает исходные параметры (порог и ширину пика), а пользование функцией Edit Integration Event (редактирование параметров, определяющих режим интегрирования) дает вам возможность или самостоятельно выбрать значения параметров, или воспользоваться значениями, предусматриваемыми самой системой автоматически. Управление интегрированием вручную (Manual Integration) Этот режим интегрирования дает вам возможность управлять подсчетом выбранных пиков или группы пиков. В зоне, указанной в качестве выбранной для интегрирования вручную, все параметры, определяющие режим интегрирования и вводимые самой системой ChemStation, игнорируются (кроме исходного значения исключаемой площади). Управление интегрированием вручную дает вам возможность указать точки начала и окончания пика, после чего соответственно пересчитанные площади включаются в результаты количественного подсчета (и в сообщение результатов). В распечатке сообщения результатов, пики, проинтегрированные благодаря управлению вручную, отмечаются введением кода М. Управление интегрированием вручную дает следующие возможности: Проведение базовой Указывается, каким образом должна быть проведена базовая линия линии (Draw под пиком или группой пиков. Кроме того, можно указать должны ли Baseline) пики в обозначенной зоне быть разделены во всех точках впадин Подсчет отрицательных пиков (Negative Peaks) Указывается, когда необходимо обрабатывать любые заходы за базовую линию как отрицательные пики. Кроме того, можно указать должны ли пики в обозначенной зоне быть разделены во всех точках впадин Выборка по касательной (Tangent Skim) Подсчитываются площади пиков, выбранных по касательной с основного пика. Кроме того, можно указать должны ли пики в обозначенной зоне быть разделены во всех точках впадин. Площадь пика, выбранного по касательной, исключается из площади основного пика Расщепление пика (Split Peak) Указывается точка, в которой пик должен быть расщеплен проведением перпендикуляра до базовой линии 80 Разделение во всех Функция All Valleys (разделение во всех точках впадин), точках впадин (All предусмотренная выводимым на экран подсказывающим изображением, Valleys) может быть запрошена (но можно ее и не запрашивать). Когда функция запрошена, в диапазоне (оговоренном в качестве соответствующего управлению интегрированием вручную) пики автоматически будут разделены во всех точках впадин (при пользовании одним из рассмотренных (на предыдущей странице) вариантов, тоже предусмотренных подсказывающим изображением: Draw Baseline [проведение базовой линии], Negative Peaks [подсчет отрицательных пиков], Tangent Skim [выборка по касательной]) Режим прослеживания (Trace Mode) Вводится такой режим, при котором вертикальная указательная стрелка не может быть смещена с хроматограммы (электрофореграммы). Этим обеспечивается, что указываемые начальные и конечные точки пиков будут лежать на хроматограмме (электрофореграмме). Стирание пика (пиков) [Delete Peak(s)] Стираются (только перестают интегрироваться) один или несколько пиков Коды коррекции базовой линии • Пики, подсчитанные при управлении интегрированием вручную, отмечаются в результатах интегрирования введением кода ММ (в качестве кода коррекции базовой линии). • Если перед пиком, проинтегрированным при управлении вручную, имеется пик и место обнаружения конечной точки такого пика из-за управления вручную изменилось, этот пик маркируется кодом F (принудительное интегрирование). • Пик растворителя, на обработку которого повлияли управлением интегрированием вручную (например, управлением выборкой по касательной), помечается кодом R, а не кодом S (буква R является первой буквой английского слова recalculated - пересчитанный [в данном случае, пересчитанный пик растворителя]). Процесс управления интегрированием вручную • Первым этапом управления интегрированием вручную является выбор участка хроматограммы или электрофореграммы, который должен подвергнуться такой обработке. Это обеспечивается благодаря просмотру интересующей области в увеличенном масштабе (функция zooming) • Затем, выбирают интересующую функцию: Draw Baseline (проведение базовой линии), Negative Peaks (подсчет отрицательных пиков), Tangent Skim (выборка по касательной) или Delete Peak(s) [стирание пика (пиков)]. 81 • Теперь, можно прочертить базовую линию, для чего перемещают мышь с нажатой ее левой клавишей. По мере перемещения мыши, линия проводится из начальной точки до точки, при достижении которой левую клавишу мыши отпускают. Если вызвана функция Delete Peak(s) [стирание пика (пиков)], вместо прочерчивания линии соответствующий участок охватывается (расширяющимся по мере перемещения мыши) прямоугольником. • Графический ввод информации обеспечивается в двух режимах: Absolute (абсолютные указания) [этот режим предполагается самой системой автоматически] или Trace (режим прослеживания). При пользовании любым из этих режимов, текущие координаты указателя (время и уровень сигнала) указываются в строке сообщений. • При пользовании режимом Trace (режим прослеживания), указатель (стрелка, обращенная вниз) скользит по хроматограмме или электрофореграмме (перемещаясь от одной точки данных к другой). Вы можете запросить переход к режиму прослеживания, когда указатель установлен на желательную точку начала пика, для чего нужно нажать правую клавишу мыши. • При пользовании режимом абсолютных указаний, форма указателя напоминает перекрестие оптического прицела; такой указатель не скользит по хроматограмме или электрофореграмме, но имеется возможность его установки в любое место экрана. Можно переходить от одного режима к другому (т.е. от режима абсолютных указаний к режиму прослеживания и наоборот) нажатием правой клавиши мыши. • Для каждого пика, подсчитанного при пользовании режимом интегрирования вручную, на экране появится указание подсчитанной площади с надпечаткой времени удерживания (времени миграции). Запись команд, соответствующих интегрированию вручную, в метод Программное обеспечение дает вам возможность скопировать те параметры, которые определяют режим интегрирования и были заданы при управлении вручную, в текущий введенный метод. Для этого, используется функция Copy Manual Events to Method (копирование команд, соответствующих интегрированию вручную, в метод) из подсказывающего изображения, вызываемого через слово Integration (интегрирование). Такие параметры, выбранные при интегрировании вручную, вписываются (после этого) в метод индивидуально. Их не удастся просмотреть или отредактировать через сектор Integration Events (параметры, определяющие режим интегрирования), используемый в режиме диалога. После ввода файла данных (хроматограммы или электрофореграммы), эти параметры будут задействованы только тогда, когда в секторе Integration Events (параметры, определяющие режим интегрирования) перечеркнут квадрат, подтверждающий выбор функции Apply Manual Integration Events (использование параметров, заданных при управлении интегрированием вручную), или если функция Apply Manual Events from Method (использование записанных в метод параметров, заданных при управлении интегрированием вручную) была выбрана из подсказывающего изображения, вызываемого через слово Integration (интегрирование). 82 Командами, соответствующими интегрированию вручную, используются абсолютные значения времени (т.е. не вводится поправка на уход времени удерживания или времени миграции). Раздел 6. Улучшенный алгоритм интегрирования В этом разделе описывается следующее: • Улучшенный алгоритм интегрирования • Как можно приспособить улучшенный алгоритм интегрирования к конкретной имеющейся системе • Как выполняется улучшенное интегрирование • Интегрирование пиков реальных хроматограмм (электрофореграмм) • Более подробное пояснение улучшенного алгоритма интегрирования • Уточнение положения базовой линии • Коды коррекции базовой линии • Выборка пиков по касательной • Измерение площади пиков • Параметры, определяющие режим интегрирования (включая программируемые по времени) • Пользование улучшенным алгоритмом интегрирования Улучшенный алгоритм интегрирования Улучшенный алгоритм интегрирования (реализуемый программным обеспечением Agilent ChemStation начиная с варианта A.04.01) представляет собой новый подход, дающий возможность повысить надежность результатов, точность и простоту использования. При эксплуатации нового варианта программного обеспечения (которому посвящен весь этот документ), мы рекомендуем пользоваться стандартным алгоритмом интегрирования при реализации ранее разработанных и уже аттестованных методов; новым алгоритмом интегрирования - при создании новых методов. 83 Как можно приспособить улучшенный алгоритм интегрирования к конкретной имеющейся системе? Улучшенный алгоритм интегрирования был создан для обеспечения оптимальной эксплуатационной эффективности благодаря использованию: • неизменных параметров, определяющих режим интегрирования • приспосабливаемых параметров, определяющих режим интегрирования Неизменные параметры, определяющие режим интегрирования Эти параметры считаются неизменными из-за того, что нет возможности их редактирования в ходе обычного общения оператора с системой. Большинство таких параметров подобрано фирмой Agilent Technologies для конкретного сочетания программно-аппаратного обеспечения и программного обеспечения. Однако некоторые из параметров могут быть подстроены по сведениям, получаемым из файлов методов и файлов данных. Для пояснения того, как это делается, обратим внимание на то, что различные хроматографические системы могут потребовать применения разных способов выявления вершины пика. Фирма Agilent Technologies имеет возможность заставить систему обнаруживать эту точку: по наибольшей амплитуде сигнала; благодаря подгонке под квадратичную зависимость; по первому моменту; по подгонке под гауссовскую кривую. Наиболее уместный подход выбран с учетом конкретной аппаратурной оснастки (детектора, типа колонки и т.д.) и конкретной прикладной задачи. Пример подхода к выявлению вершины пика мы выбрали лишь ради пояснения идеи пользования неизменными параметрами, определяющими режим интегрирования. На самом деле, имеется еще более дюжины таких параметров. Хотя эти параметры считаются неизменными большинством владельцев систем, опытные специалисты могут отредактировать параметры благодаря составлению подходящей макрокоманды так, как описано в разделе Macro Programming Guide (руководстве по пользованию макрокомандами) подсказывающих сообщений, вызываемых на экран непосредственно в ходе работы, в ответ на запрос помощи (Help). Приспосабливаемые параметры, определяющие режим интегрирования Приспосабливаемыми считаются те параметры, которые могут редактироваться владельцами системы. К приспосабливаемым параметрам относятся: • устанавливаемые до начала разгонки параметры, определяющие режим интегрирования ("исключаемая площадь" [Area Reject], "исходная ширина пика" [Initial PW] и т.д.) 84 • параметры, вводимые по некоторым программируемым по времени командам (подстраиваемые под вид хроматограммы или электрофореграммы) Как выполняется улучшенное интегрирование? При рассмотрении процесса интегрирования с разбивкой на основные этапы, оказывается что улучшенный алгоритм интегрирования реализуется так же, как любой иной алгоритм интегрирования. От того, как эти этапы отрабатываются, зависят точность и воспроизводимость результатов. При интегрировании хроматограммы (электрофореграммы) производится следующее: • выявляется исходная базовая линия • точки, соответствующие базовой линии, непрерывно прослеживаются и корректируются (т.е. сведения о базовой линии по мере необходимости корректируются) • распознаются моменты начала каждого пика; эти точки маркируются вертикальными рисками • находится вершина каждого пика (т.е. устанавливается время удерживания [время миграции]; эти данные выводятся на печать) • распознаются моменты конца каждого пика; эти точки маркируются вертикальными рисками • выявляется базовая линия • подсчитываются высота, площадь и ширина всех пиков Этот процесс регулируется параметрами, определяющими режим интегрирования (возможно, с запрограммированным их изменением во времени). Наиболее важными параметрами являются "исходная чувствительность к наклону" (Initial Slope Sensitivity); "ширина пика" (Peak Width) и "исключаемая высота" (Height Reject). Программное обеспечение Agilent ChemStation дает вам возможность установить исходные значения этих и других параметров. Этими значениями определяется режим обработки начала хроматограммы (электрофореграммы). В большинстве случаев, для получения хороших результатов достаточно употребления только таких (исходных) значений параметров. Однако вы можете воспользоваться программированием изменения соответствующих параметров во времени. Вы можете управлять процессом интегрирования: • за счет предусмотренных системой ChemStation параметров, программируемых по времени 85 • за счет применения макропрограммы, приспосабливающей алгоритм интегрирования к решению специфичных задач. Для получения более подробной информации, см. описание набора неизменных параметров, определяющих режим интегрирования, в разделе Macro Programming Guide (руководстве по пользованию макрокомандами) подсказывающих сообщений, выводимых на экран непосредственно во время работы, в ответ на запрос помощи (Help). Выявление исходной базовой линии Для оптимального выявления базовой линии (соответственно конкретным решаемым прикладным задачам), алгоритм интегрирования использует параметры, указанные в методе и соответствующие файлу данных. Перед тем, как система приступит к интегрированию пиков, она пытается выявить точку базовой линии. Когда начинается анализ, исходная базовая линия устанавливается благодаря взятию первой точки данных как предположительно принадлежащей базовой линии. Затем, система пытается уточнить реальное положение исходной базовой линии за счет усреднения обрабатываемого сигнала. Если не находится уточненная точка (т.е. сведения о базовой линии оказываются теми же самыми), первая точка данных считается потенциально принадлежащей базовой линии. Прослеживание базовой линии Выборки цифровой информации обеспечиваются со скоростью, определяемой параметром "исходная ширина пика" или по ширине пика, подсчитываемой в ходе регистрации данных. Каждая точка данных воспринимается как потенциально принадлежащая базовой линии. Для того чтобы точка была сочтена соответствующей базовой линии, должны удовлетворяться следующие условия: • точка данных должна попадать в установленное для базовой линии поле • кривизна в этой точке (определяемая по фильтрам, соответствующим производным сигнала) оказывается ниже критического значения, заданного текущим параметром "чувствительность к наклону" (Slope Sensitivity) Система определяет поле для базовой линии по наклону базовой линии благодаря использованию алгоритма прослеживания базовой линии (согласно которому наклон уточняется по первой производной, а кривизна - по второй производной). Данные об исходной точке базовой линии (найденной в самом начале анализа) постоянно обновляются со скоростью, определяемой параметром "ширина пика". Т.е. устанавливается смещающееся усредненное значение точек данных, попадающее в поле для базовой линии за период, определяемый параметром "ширина пика". Система прослеживает базовую линию и 86 периодически обновляет сведения о ней (для компенсации возможного ухода) так, как показано на рис. 18, до тех пор, пока не будет выявлен передний склон пика. Выявление базовой линии Система периодически уточняет положение базовой линии (периодичность определяется значением параметра "ширина пика"). После сбора сведений о конкретном числе точек данных, сведения об исходной базовой линии подменяются сведениями о текущей базовой линии. Затем, производится уточнение базовой линии по следующему набору точек данных. Этот процесс продолжается до тех пор, пока не обнаруживается начало пика. Рис. 18. Базовая линия Выявление начала, конца и вершины пика Система предполагает, что пик может начаться с потенциальных точек базовой линии, лежащих вне поля для базовой линии, и при превышении конкретного значения кривизны базовой линии, заданного параметром "чувствительность к наклону" (Slope Sensitivity). Если такие особенности продолжают подтверждаться, принимается решение о том, что действительно обнаружен передний склон пика и обработка данных производится так, как описано ниже (см. рис. 19). Рис. 19. Интегрируемый пик 87 Обнаружение начала пика (см. рис. 19): 1. Наклон и кривизна укладываются в границы: прослеживание базовой линии 2. Наклон и кривизна выходят за границы: возможно, выход на пик 3. Наклон остается выше границы: принимается решение о выходе на пик (ключевая точка) 4. Кривизна становится отрицательной: передняя точка перегиба Обнаружение вершины пика: 5. Наклон становится отрицательным: вершина пика (ключевая точка) 6. Кривизна становится положительной: задняя точка перегиба Обнаружение конца пика: 7. Наклон и кривизна укладываются в границы: приближение к концу пика 8. Наклон и кривизна не выходят за границы: конец пика (ключевая точка) 9. Система возвращается к режиму прослеживания базовой линии Ключевыми являются точки, выбранные системой для описания и количественного обсчета пика. Точки, соответствующие базовой линии, впадинам между пиками, вершине пика, и точки перегиба считаются ключевыми и сведения о них записываются в память. Каждой ключевой точке соответствуют горизонтальная координата (отсчет истекшего времени) и вертикальная координата (подъем над базовой линией). Для определения площади пиков система используется и другими параметрами. Интегрирование пиков реальных хроматограмм (электрофореграмм) В реальных условиях, интегрирующей системе приходится справляться с довольно сложными хроматограммами (электрофореграммами), имеющими сильно различающиеся по высоте пики (часто, пики интересующих веществ оказываются очень малыми). Помехи (такие, как шум, уход и блуждание базовой линии) могут затруднять выявление базовой линии, относительно которой приходится регистрировать высоту и площадь пиков. И, наконец, хроматографическое (или электрофоретическое) разделение довольно часто не обеспечивает разделения пиков на уровне базовой линии. Всякий раз (когда это возможно), первоначально следует попытаться улучшить разделение за счет подбора оптимального хроматографического (электрофоретического) процесса. Когда добиться полного разделения (по каким-то причинам) не удается, интегрирующей системе приходится справляться со слившимися пиками. 88 Таким образом, мы видим, что интегрирование пиков представляет собой весьма сложную задачу. Улучшенный алгоритм интегрирования не может полностью исправить ситуацию, обуславливаемую плохим разделением. Он позволяет справиться с шумом, уходом базовой линии и наличием слившихся пиков (т.е. с тем, что характерно для сложных хроматограмм или электрофореграмм). Более подробная информация об улучшенном алгоритме интегрирования Теперь давайте подробно рассмотрим, как система распознает начало пика, его вершину и конец; каким образом она находит ключевые точки для выявления базовой линии и подсчета площадей. Процесс интегрирования сводится к отработке следующих этапов: • Выявление пиков (нахождение ключевых точек) • Уточнение положения базовой линии • Подсчет площади пика Выявление пиков Улучшенным алгоритмом интегрирования для выявления пиков используется целый ряд параметров и приемов: • параметр "ширина пика" • фильтры, употребляемые при выявлении пика • группировка данных • алгоритм выявления пика • алгоритм выявления вершины пика • подсчеты, выполняемые применительно к пикам, имеющим не гауссовскую форму (затянутые пики, слившиеся пики и т.д.) Параметр "ширина пика" (Peak Width) Параметром "ширина пика" регулируется избирательное обличение пиков от базовой линии. Для получения хорошей эффективности, значение этого параметра должно быть достаточно близким к фактической ширине пиков на хроматограмме (электрофореграмме). 89 Существуют три способа изменения параметра "ширина пика": • до начала разгонки, владелец системы может указать значение параметра "исходная ширина пика" • в ходе обслуживания разгонки, интегратор автоматически изменяет значение параметра "ширина пика" настолько, насколько это требуется для обеспечения хорошего соответствия с фильтрами, употребляемыми для выявления пика • значение параметра "ширина пика" может быть задано или изменено (непосредственно во время обслуживания разгонки) через таблицу программируемых по времени параметров Фильтры, употребляемые для выявления пика Для обнаружения пиков системой используются 3 фильтра, дающие возможность отметить изменения наклона и кривизны смежных точек данных. Фильтры обеспечивают оценку обследуемых точек по первой производной (оценка наклона) и по второй производной (оценка кривизны). Используются следующие фильтры: Фильтр 1 Оценка значений наклона и кривизны для 2 смежных точек данных Фильтр 2 Оценка значений наклона и кривизны для 4 смежных точек данных Фильтр 3 Оценка значений наклона и кривизны для 8 смежных точек данных Вид фактически используемого фильтра определяется значением параметра "ширина пика". Например, в самом начале анализа может употребляться фильтр 1. Если значение параметра "ширина пика" в ходе обслуживания разгонки увеличивается, будут использоваться фильтр 2 и (в конце концов) фильтр 3. Для получения хороших результатов выявления пиков с помощью фильтров, значение параметра "ширина пика" должно быть установлено близким к фактической ширине пиков на хроматограмме (электрофореграмме). Чтобы обеспечились оптимальные условия интегрирования, система будет изменять (по необходимости) значение параметра "ширина пика". Улучшенный алгоритм интегрирования дает возможность системе самостоятельно вычислять ширину пика (для обновления заданного значения) несколькими способами (в зависимости от обслуживаемого аналитического прибора): В случае работы с жидкостным хроматографом или с системой для капиллярного электрофореза, значение параметра "ширина пика" подсчитывается самой системой автоматически по довольно сложной формуле: 0,3 х (правая точка перегиба - левая точка перегиба) + 0,7 х отношение площади к высоте В случае работы с газовым хроматографом, самой системой автоматически предполагается определение значения параметра "ширина пика" по отношению площади к высоте пика. Такой подход к вычислению не приводит к завышению ширины пика в случае пиков, слившихся на уровне свыше половины высоты. 90 При некоторых вариантах анализа, пики могут существенно расширяться с увеличением времени удерживания. Это наблюдается при разделении в газовом хроматографе с неизменной температурой или в жидкостном хроматографе без градиентного изменения состава подвижной фазы. Ради приспособления к такой ситуации, интегрирующая система автоматически обновляет значение параметра "ширина пика" по мере возрастания реальной ширины пиков. Однако возможен запрет автоматического обновления (запрет вводится и при указании специфичного значения параметра "ширина пика" в таблице программируемых по времени событий). Обновление значения параметра "ширина пика" обеспечивается с использованием следующего подхода к весовой оценке: Обновленное значение = [0,75 х (существующую ширину пика) + 0,25 х (ширину текущего пика)] Если запрещено изменение ширины пика с течением времени или если параметру "ширина пика" присвоено специфичное значение, автоматическая подстройка ширины пика не производится. Группировка данных Интегрирующая система не может бесконечно увеличивать значение параметра "ширина пика" для обработки все более расширяющихся пиков. В конце концов, пики становятся настолько широкими, что они не распознаются с помощью фильтров. Для преодоления этого ограничивающего обстоятельства, используется группировка (bunching). Благодаря объединению точек данных в группы, обеспечивается фактическое сужение пиков без искажения данных о площади. Таким образом, благодаря группировке ширина размытых пиков попадает в диапазон, эффективно обслуживаемый фильтрами (благодаря чему обеспечивается хорошая селективность). Когда группировка разрешена, по ожидаемой или отмеченной ширине пика определяется степень числа 2, от которой зависит ширина выборки данных. Алгоритм группировки поясняется таблицей 8. Таблица 8 Критерии, используемые при группировке Ожидаемая ширина пика (Т) 0 – 10 точек данных 8 – 16 точек данных 12 – 24 точек данных 16 – 32 точек данных 24 – 48 точек данных 32 – 96 точек данных 64 – 192 точек данных Используемые фильтры Первый Второй Третий Второй Третий Третий, второй Третий, второй Выполнение группировки Нет Нет Нет Один раз Один раз Дважды Три раза 91 Алгоритм выявления пика Система опознает начало пика на базовой линии, определенной с использованием алгоритма выявления пика. Согласно этому алгоритму, выходной сигнал с фильтров (ответственных за выявление пика) сопоставляется со значением исходной чувствительности к наклону для увеличения или уменьшения значения, записанного в накопитель, обслуживающий обнаружение переднего склона пика. Когда это значение становится равным 15 (или больше), система декларирует, что точка соответствует началу пика. Алгоритм выявления пика поясняется таблицами 9 и 10. Таблица 9 Приращение значений в накопителе, обслуживающем обнаружение переднего склона пика Выходные сигналы фильтров 1 – 3 (соответствующие производным) относительно чувствительности к наклону Наклон > чувствительности к наклону Кривизна > чувствительности к наклону Наклон < отрицательной чувствительности к наклону Наклон < |чувствительности к наклону| Кривизна < отрицательной чувствительности к наклону Фильтр 1 Фильтр 2 Фильтр 3 +8 +0 -8 -4 -0 +5 +2 -5 -2 -2 +3 +1 -3 -1 -1 От ожидаемой ширины пика зависит, для какого фильтра значения наклона и кривизны будут сравниваться с чувствительностью к наклону соответственно таблице 9. Например, если ожидаемая ширина пика мала, числа, соответствующие фильтру 1, добавляются в накопитель, обслуживающий обнаружение переднего склона пика. Если ожидаемая ширина пика увеличивается, будут использоваться числа для фильтра 2 (постепенно обеспечится переход и к числам, соответствующим фильтру 3). Когда это значение, записанное в накопитель, обслуживающий обнаружение переднего склона пика, становится равным 15 (или больше), система приходит к выводу, что отмеченная точка может соответствовать началу пика. Таблица 10 Приращение значений в накопителе, обслуживающем обнаружение заднего склона пика Выходные сигналы фильтров 1 – 3 (соответствующие производным) относительно чувствительности к наклону Наклон > чувствительности к наклону Кривизна > чувствительности к наклону Наклон < отрицательной чувствительности к наклону Наклон < |чувствительности к наклону| Кривизна < отрицательной чувствительности к наклону Фильтр 1 Фильтр 2 Фильтр 3 +8 +0 -11 -28 -0 +5 +2 -7 -18 -2 +3 +1 -4 -11 -1 От ожидаемой ширины пика зависит, для какого фильтра значения наклона и кривизны будут сравниваться с чувствительностью к наклону соответственно таблице 10. Например, 92 если ожидаемая ширина пика мала, числа, соответствующие фильтру 1, добавляются в накопитель, обслуживающий обнаружение заднего склона пика. Если ожидаемая ширина пика увеличивается, будут использоваться числа для фильтра 2 (постепенно обеспечится переход и к числам, соответствующим фильтру 3). Когда это значение, записанное в накопитель, обслуживающий обнаружение заднего склона пика, становится равным 15 (или больше), система приходит к выводу, что отмеченная точка может соответствовать концу пика. Алгоритм выявления вершины пика Вершина пика распознается по верхним точкам хроматограммы (электрофореграммы) благодаря попытке применения метода параболической подгонки к таким точкам. Подсчеты, выполняемые применительно к пикам, имеющим не гауссовскую форму Слившиеся пики Регистрируются когда новый пик начинается до того, как был обнаружен конец пика. Приведенный далее рисунок показывает, каким образом интегрирующая система обрабатывает слившиеся пики. Рис. 20. Слившиеся пики Интегрирующая система обрабатывает слившиеся пики следующим образом: 1. Суммируется площадь выборок данных для первого пика пока не обнаружится точки впадины. 2. При выявлении точки впадины, суммирование выборок данных для первого пика прекращается и начинается суммирование выборок данных для второго пика. 3. Когда система находит конец второго пика, суммирование выборок данных для этого пика прекращается. Разделение пиков обеспечивается проведением перпендикуляра из точки впадины до базовой линии. 93 Уступы на пике Уступ представляет собой признак неотделенного пика на переднем или заднем склоне большого пика. Впадины (перехода от отрицательного наклона к положительному) не обнаруживается. На пике может иметься любое число уступов (на переднем или заднем склонах). Рис. 21. Уступ на пике Уступы обнаруживаются по второй производной (т.е. по изменению кривизны, соответствующей пику). Когда кривизна доходит до 0, система опознает точку перегиба (наподобие точки "а", показанной на рис. 21). • Возможный уступ на переднем склоне обнаруживается, когда система находит вторую точку перегиба перед вершиной пика. Если наличие уступа подтверждается, начальной точкой уступа считается точка с максимальной возможной кривизной, предшествующая точке перегиба. • Возможный уступ на заднем склоне обнаруживается, когда система находит вторую точку перегиба перед концом пика или впадиной между пиками. Если наличие уступа подтверждается, начальной точкой уступа считается целевая точка, с которой начала изменяться кривизна. Время удерживания определяется по той точке уступа, которой соответствует максимальная отрицательная кривизна. При пользовании режимом обнаружения уступов, вводимым через таблицу программируемых по времени событий, улучшенный алгоритм интегрирования обеспечивает регистрацию площадей уступов так же, как регистрацию площадей слившихся пиков (т.е. благодаря проведению перпендикуляра из точки перегиба, отделяющей уступ от пика). Площадь уступа вычитается из площади основного пика. Уступы на пиках могут обрабатываться как обычные пики (при пользовании режимом обнаружения уступов, вводимым через таблицу программируемых по времени событий). Выявление базовой линии После завершения регистрации любого сгустка пиков и обнаружения выхода на базовую линию, система запрашивает отработку алгоритма выявления базовой линии (используется 94 метод "вколачивания клиньев и натягивания веревки между ними"). Нормализации базовой линии и поддерживания уровня ее наиболее низким способствует пользование трапецеидальной коррекцией площади и пропорциональным распределением по высоте. Алгоритм выявления базовой линии учитывает параметры из метода и файлов данных, по которым распознаются детектор и прикладная задача, для которой должны быть оптимизированы подсчеты, производимые интегрирующей системой. Подход к выявлению базовой линии, предполагаемый самой системой автоматически В простейших случаях, интегрирующая система проводит базовую линию в виде набора линейных сегментов между: • уровнем хроматограммы (электрофореграммы) с самого ее начала • маркерными рисками • концом пика Рис. 22. Подход к выявлению базовой линии, предполагаемый самой системой автоматически Начальный участок базовой линии Если на момент начала разгонки базовой линии не найдено, начальный участок базовой линии выявляется с помощью одного из следующих способов: • Проведением линии от начальной точки хроматограммы (электрофореграммы) до первой точки базовой линии, если начальная точка оказывается ниже первой точки базовой линии • Проведением линии от начальной точки хроматограммы (электрофореграммы) до первой точки впадины, если начальная точка оказывается ниже первой точки впадины 95 • Проведением линии от начальной точки хроматограммы (электрофореграммы) до первой точки впадины, если первая точка впадины заходит ниже воображаемой линии, соединяющей начальную точку с первой точкой базовой линии • Проведением линии от начальной точки хроматограммы (электрофореграммы) до горизонтальной линии, проведенной из первой точки базовой линии Маркерные риски Маркерными рисками указываются начало и конец пика. Положением этих рисок определяются момент начала и момент конца пика, записываемые в таблицу данных о пиках. Конечный участок базовой линии Последняя доступная точка базовой линии используется для указания конца такой линии. В тех случаях, когда разгонка заканчивается без выхода на базовую линию, конец базовой линии подсчитывается благодаря проведению базовой линии из последней доступной ее точки с учетом установленного смещения базовой линии. Коды коррекции базовой линии Каждому пику приписывается код из 2 букв, указывающий каким образом была проведена базовая линия. Эти коды сообщаются в распечатке сообщения результатов под заголовком Type (код коррекции базовой линии). Первая буква соответствует выявлению базовой линии в начале пика; вторая - выявлению базовой линии в конце пика. Все коды, встречающиеся в сообщениях результатов (выводимых на печать системой ChemStation), указаны ниже в алфавитном порядке (порядке, соответствующем английскому алфавиту). А От интегрирования пика система отказалась (А – первая буква английского слова aborted – выброшен) В Пик начался или закончился на базовой линии (B - первая буква английского слова baseline - базовая линия) Н Пик начался или закончился на базовой линии, проведенной горизонтально (H - первая буква английского слова horizontal - горизонтальная) N Пик отрицательный (N - первая буква английского слова negative - отрицательный) Р Пик начался или закончился точкой захода за базовую линию (P - первая буква английского слова penetration - проникновение) 96 S Интегратор распознал данный пик, как пик растворителя (S - первая буква английского слова solvent – растворитель) T Пик начался или закончился во время действия разрешения производить выборку по касательной (T - первая буква английского термина tangent skim - выборка по касательной [представляющей собой прямую линию]) U Маркируется начало или конец зоны, площадь которой не вошла в пик (U - первая буква английского слова unassigned [не распределенный]) V Пик начался или закончился с проведения перпендикуляра из точки впадины до базовой линии (V - первая буква английского слова valley - впадина) Х Выборка по касательной с использованием экспоненциальной кривой + Пик был включен в группу пиков, площадь которых суммировалась Если используется режим управления интегрированием вручную, вводятся некоторые дополнительные коды: М Пик был проинтегрирован при управлении интегрированием вручную (М - первая буква английского слова manually - вручную) F Площадь пика была принудительно изменена переходом к управлению интегрированием вручную. Если пик был отмечен перед началом интегрирования вручную и время окончания пика было изменено за счет перехода к такому интегрированию, пик считается подвергшимся принудительному изменению (F - первая буква английского слова forced - принудительно) R На подсчет пика растворителя повлияли введением управления интегрированием вручную; так, пик подвергшийся выборке по касательной, считается пересчитанным пиком растворителя (R - первая буква английского слова recalculated - пересчитанный) Если разрешено обнаружение уступов и такие уступы обнаружены, в столбец Type (код коррекции базовой линии) записывается код, третьей или четвертой буквой в котором оказывается одна из следующих: F Уступ обнаружен на переднем склоне пика; площадь подсчитана с разделением за счет проведения вертикальных линий В Уступ обнаружен на заднем склоне пика; площадь подсчитана с разделением за счет проведения вертикальных линий f Уступ обнаружен на переднем склоне пика; площадь подсчитана благодаря выборке площади по касательной b Уступ обнаружен на заднем склоне пика; площадь подсчитана благодаря выборке площади по касательной 97 Если в коде коррекции базовой линии имеется четвертая буква, она предоставляет дополнительную информацию о пике (т.е. такая буква является своеобразной меткой). Наличие буквы О в коде коррекции базовой линии указывает, что пик зарегистрирован с выходом за допустимый диапазон амплитуды (буква О является первой буквой английского слова over-range – выход за диапазон); буква U указывает, что значение оказалось ниже диапазона (U – первая буква английского слова under-range – до диапазона); буква D – что пик искажен (D – первая буква английского слова distorted – искажен). Изменение логики проведения базовой линии В большинстве случаев анализа, регистрируется довольно сложная хроматограмма (или электрофореграмма), наподобие показанной на рис. 23. Интегрирующая система изменяет логику проведения базовой линии с использованием ряда правил, оговоренных далее. Рис. 23. Измененный вариант уточнения положения базовой линии • Если пик заходит за базовую линию (BP и PB), базовая линия тоже заходит вниз, до самой нижней точки пика (см. точку 1 на рис. 23). • Если пик растворителя, обнаруженный благодаря выборке по касательной, не начинается на базовой линии, базовая линия проводится через точку (см. точку 2), соответствующую началу пика и расположенную на черте, горизонтально проведенной из последней точки, признанной соответствующей базовой линии. Код HBOS (переполнение при регистрации пика растворителя на горизонтальной базовой линии) означает, что сигнал превысил границу линейного диапазона детектора). • Если пик заканчивается очевидной точкой впадины, но площадь следующего пика оказывается попадающей под критерий заданной вами исключаемой, базовая линия проецируется из начала пика на следующую истинную точку базовой линии (см. точку 3 на рис. 23). Если аналогичная ситуация отмечается перед началом пика, применяется то же самое правило. 98 Заходы за базовую линию Заход за базовую линию декларируется, когда уровень сигнала падает ниже базовой линии, проведенной до точки "a". Если отмечается такой заход, на этом участке базовая линия проводится заново (как показано сегментами "b"). Рис. 24. Заход за базовую линию Выборка по касательной Выборка по касательной - вид коррекции базовой линии, выполняемой когда пик обнаруживается на заднем склоне любого пика, сочтенного пиком растворителя. Когда разрешен режим выборки по касательной (с помощью таблицы программируемых по времени событий), выборка производится с использованием следующих способов: • проведения прямой линии • проведения кривой, соответствующей экспоненциальной зависимости • перехода от кривой, соответствующей экспоненциальной зависимости, к прямой линии для обеспечения лучшей подгонки (этот вариант предполагается самой системой автоматически) Соответствующий вид выборки по касательной выбирается для конкретных прикладных задач соответственно указанию конфигурации, произведенному при загрузке программного обеспечения Agilent ChemStation. Самой системой автоматически предполагается переход от кривой, соответствующей экспоненциальной зависимости, к прямой линии для обеспечения лучшей подгонки. Стандартным алгоритмом интегрирования реализуется тот же самый подход к подсчету границы выборки. Переход от выборки по кривой, соответствующей экспоненциальной зависимости, к выборке по прямой линии обеспечивается ради исключения нарушения плавности перехода высот или площадей. • Когда выбираемая площадь находится достаточно высоко над базовой линией, используется выборка по кривой, соответствующей экспоненциальной зависимости • Когда выбираемая площадь попадает в установленное для базовой линии поле, используется выборка по прямой линии 99 О такой составной выборке сообщается, как о выборке по экспоненте (exponential skim) или о выборке по касательной (tangent skim). Когда выборка по касательной оговорена в таблице программируемых по времени параметров, интегрирующая система сравнивает сигнал в точках, соответствующих пересечению с касательными. Эти точки находятся благодаря подбору исходной точки пика, выбираемого с хвоста другого (как показано на рис. 25). Рис. 25. Выборка по касательной Иногда (в частности, при выборке малых пиков с хвоста пика растворителя [выборке по касательной]), обычный вариант выявления базовой линии приводит к обнаружению большой отрицательной площади. Если эту площадь добавить к площади, расположенной над базовой линией, произойдет большое завышение площади пика. Для избежания таких ошибок, интегрирующая система выискивает отрицательные площади и заново (иначе) проектирует базовую линию (как показано на рис. 26). Рис. 26. Небольшой пик, выбираемый по касательной, с хвоста пика растворителя Зона, площадь которой не вошла в пик При некоторых вариантах проведения базовой линии будут иметься небольшие зоны, расположенные над базовой линией но ниже хроматограммы (электрофореграммы). Площадь этих зон не входит ни в один распознанный пик. Обычно, площадь таких зон не регистрируется и не сообщается. Если же запрошено выявление таких зон (обозначаемых 100 английским термином unassigned peak), площадь их будет регистрироваться и включаться в сообщение результатов. "Время удерживания" таких зон устанавливается по средней точке между началом и концом зоны (как показано на рис. 27). Рис. 27. Зоны, площадь которых не вошла в пик Измерение площади пиков Последней операцией, выполняемой при интегрировании, является определение площади пика. Во время обслуживания разгонки, сведения о площади под базовой линией накапливаются и записываются в память. Площади пиков подсчитываются по содержимому файла, в который занесена информация о ключевых точках. Вспомните, что ключевыми названы точки, выбранные интегрирующей системой для описания пика и выполнения соответствующего количественного подсчета. К таким точкам относятся точки базовой линии; точки впадин между пиками; точки вершин пиков; точки на уровне половины высоты пиков. Каждой ключевой точке соответствуют горизонтальная координата (отсчет истекшего времени) и вертикальная координата (подъем над базовой линией). Для определения площади пиков система пользуется и другими параметрами. Рис. 28. Измерение площади пиков, начинающихся с базовой линии и заканчивающихся выходом на базовую линию 101 В случае обособленных пиков, подсчитывается площадь выше базовой линии (между точками начала и конца пика, отмеченными маркерными рисками). Площадь, подсчитываемая системой во время интегрирования, определяется следующим образом: • Если пик начинается с базовой линии и заканчивается выходом на базовую линию (случай ВВ), подсчитывается площадь выше базовой линии (между точками начала и конца пика, отмеченными маркерными рисками). • В случае пиков, начинающихся с точки впадины и заканчивающихся точкой впадины (VV), площадь, оказывающаяся выше базовой линии, выделяется перпендикулярами, проведенными до базовой линии из точек с маркерными рисками. Рис. 29. Измерение площади слившихся пиков (от точки впадины до точки впадины) • В случае пиков, выбираемых по касательной (T), подсчитывается площадь над новой выявленной базовой линией. • Для пика растворителя (S), определяется площадь свыше линии, проведенной горизонтально из последней найденной точки базовой линии, и до базовой линии, проведенной в целях выборки пика-наездника по касательной (т.е. в площадь пика растворителя не входит площадь пика-наездника). Увеличение амплитуды пика растворителя может оказываться слишком медленным (что не дает возможности автоматического его распознания как пика растворителя) или на каком-то отдаленном участке хроматограммы (электрофореграммы) может иметься группа пиков, которую вы предпочитаете обрабатывать как состоящую из пика растворителя (первого из группы) и пиков-наездников. Простое проведение перпендикуляра из точки впадины до базовой линии будет приводить к завышению площади пиков-наездников. В таких ситуациях, можно вынудить систему принять пик за пик растворителя (остальные пики будут обработаны методом выборки с хвоста первого пика по касательной). • Ниже базовой линии могут обнаруживаться отрицательные пики, имеющие положительную площадь (как показано на рис. 30, приведенном на следующей странице). 102 Рис. 30. Измерение площади отрицательных пиков Симметричность пиков Улучшенным алгоритмом интегрирования симметричность пика подсчитывается следующим образом: • Если ширина пика определяется благодаря делению площади на высоту, симметричность подсчитывается за счет деления площади передней половины пика на площадь задней его половины (такой подсчет используется, кроме того, когда не обнаружена точка перегиба на переднем или заднем склоне пика) • В противном случае, симметричность подсчитывается так, как предусмотрено стандартным алгоритмом интегрирования. Параметры, определяющие режим интегрирования Улучшенный алгоритм интегрирования дает владельцу системы возможность пользоваться рядом исходных параметров и набором программируемых по времени параметров, определяющих режим интегрирования. Многие из параметров характеризуются состоянием on (вкл), off (выкл) или парами состояний start (начало), stop (остановка). Исходные параметры, определяющие режим интегрирования Initial Peak Width (исходная ширина пика) Интегрирующей системе задается то значение параметра «ширина пика», которое должно употребляться с самого начала разгонки. Соответственно этому значению, определяется диапазон чисел, записываемых в накопители, обслуживающие обнаружение переднего и заднего склонов пика, обработку затянутого пика. По необходимости, интегрирующая система обновляет значение параметра "ширина пика" ради оптимизации условий интегрирования. Исходная величина задается владельцем системы в единицах времени соответственно ширине первого ожидаемого пика на уровне половины высоты (но не для пика растворителя). 103 Slope Sensitivity (чувствительность к наклону) Этим параметром определяется чувствительность интегрирующей системы к пику. При пользовании улучшенным алгоритмом интегрирования, значения чувствительности к наклону выбираются из линейного диапазона (при использовании стандартного алгоритма интегрирования, ситуация иная: указывается порог по высоте, представляющий собой степень числа 2). Height reject (исключаемая высота) Этот параметр используется владельцем системы для подавления шума при интегрировании. Пики с высотой меньше указанного значения будут интегрирующей системой игнорироваться. Чем больше значение параметра "исключаемая высота", тем выше должен быть уровень сигнала над выявленной базовой линией, чтобы первая точка данных могла декларироваться как соответствующая началу пика. Параметр "исключаемая высота" не должен использоваться для избавления от пиков, высота которых приближается к высоте наиболее малых интересующих пиков. Для устранения отклика на малые пики, пользуйтесь (вместо этого) параметром "исключаемая площадь" (Area Reject). Area reject (исключаемая площадь) Этим параметром вводится исключение пиков по конечной площади. Сведения о любых пиках, площадь которых меньше указанной исключаемой, не будут включаться в распечатку сообщения результатов. Shoulder detection (выявление уступов) Когда разрешено обнаружение уступов, интегрирующая система выявляет уступы по кривизне пика, определяемой по второй производной. Когда кривизна становится равной нулю, считается выявленной точка перегиба, соответствующая возможному уступу. Если интегрирующая система обнаруживает другую точку перегиба до вершины пика, этим подтверждается обнаружение уступа. Параметр Peak Width (ширина пика) Алгоритм подсчета ширины пика не изменился (используется тот же, который употребляется стандартной системой интегрирования). Пожалуйста, см. соответствующий подраздел в разделе, посвященном стандартной системе интегрирования [подраздел «Ширина пиков (Peak Width)» на стр. 71]. Параметром "ширина пика" регулируется селективность интегрирующей системы (способность различать пики на содержащей шум базовой линии). Для получения хорошей эффективности, значение этого параметра должно быть установлено близким к ширине фактических пиков на уровне половины высоты. Когда требуется, интегрирующая система обновляет значения параметра "ширина пика" (ради оптимизации условий интегрирования). 104 Выбор значения параметра "ширина пика" Выберите то значение, при котором степень фильтрации оказывается достаточной для предотвращения восприятия шумовых выбросов сигнала в качестве пиков, но без потери информации о полезном сигнале. • Для выбора подходящей исходной ширины пиков согласно одиночному интересующему пику, воспользуйтесь (в качестве справочного значения) шириной этого пика на уровне половины высоты • Для выбора подходящей исходной ширины согласно нескольким интересующим пикам, установите исходное значение не более ширины самого узкого интересующего пика (на уровне половины высоты). Это даст получение оптимальной селективности для пиков. Если выбрано слишком малое значение параметра "исходная ширина пика", шумовые выбросы сигнала могут быть сочтены пиками. Если на хроматограмме (электрофореграмме) имеются и широкие, и очень узкие пики, вы можете воспользоваться таблицей программируемых по времени событий для подстройки значения параметра "ширина пика" под обнаружение конкретных пиков. Иногда, пики становятся более размытыми к концу хроматограммы (электрофореграммы). Это наблюдается при разделениях в газовом хроматографе при неизменной температуре или при изократических разделениях в жидкостном хроматографе. Ради исправления такой ситуации, интегрирующая система автоматически изменяет параметр "ширина пика" по мере обслуживания разгонки (если такое автоматическое изменение не запрещено [например, запрещение вводится заданием параметра "ширина пика" через таблицу программируемых по времени событий]). Обновление значения параметра "ширина пика" обеспечивается с использованием следующего подхода к весовой оценке: Обновленное значение = [0,75 х (существующую ширину пика) + 0,25 * (ширину текущего пика)] Если запрещено изменение ширины пика с течением времени или если параметру "ширина пика" присвоено специфичное значение, автоматическая подстройка ширины пика не производится. Изменение значений параметров Height Reject (исключаемая высота) и Peak Width (ширина пика) Оба этих параметра оказывают очень важное влияние на процесс интегрирования. Изменяя значения этих параметров, можно добиваться разных результатов. • Увеличивайте значения параметров Height Reject (исключаемая высота) и Peak Width (ширина пика) когда требуется обнаружение весьма концентрированных веществ на фоне значительного шума. Повышение значения параметра "ширина пика" улучшает фильтрацию шума, а увеличение значения параметра "исключаемая высота" гарантирует, что будут проигнорированы произвольные шумовые выбросы сигнала. 105 • Снижайте значения параметров Height Reject (исключаемая высота) и Peak Width (ширина пика) когда требуется обнаружение микропримесей, высота пиков которых приближается к уровню шума. Снижение значения параметра "ширина пика" уменьшает степень фильтрации сигнала, а снижение значения параметра "исключаемая высота" гарантирует, что небольшие пики не будут исключены из рассмотрения из-за того, что обладают недостаточной высотой. Когда на хроматограмме (электрофореграмме) имеются пики с различной шириной, значение параметра "ширина пика" должно быть задано соответственно наиболее узким пикам, а значение параметра "исключаемая высота" должно быть уменьшено (чтобы размытые пики не были проигнорированы из-за того, что их высота снижена). Приспособление режима интегрирования для решения специфичных задач Ради приспособления режима интегрирования для решения специфичных задач, часто оказывается выгодной подстройка значений параметров "чувствительность к наклону", "ширина пика", "исключаемая высота" и "исключаемая площадь". На рис. 31 показано, как такие параметры влияют на интегрирование 5 пиков. Рис. 31. Пользование исходными значениями параметров, определяющих режим интегрирования Пик интегрируется только тогда, когда удовлетворяются требования, предъявляемые всеми тремя параметрами, определяющими режим интегрирования. При установке тех значений параметров "ширина пика" (согласно пику 3), "исключаемая площадь" и "чувствительность к наклону", которые показаны на рис. 31, проинтегрированными окажутся только пики 1 и 3. Пик 1 интегрируется (поскольку удовлетворяются требования всех 3 параметров, определяющих режим интегрирования) Пик 2 исключается (поскольку его площадь меньше значения, заданного для параметра "исключаемая площадь) 106 Пик 3 интегрируется (поскольку удовлетворяются требования всех 3 параметров, определяющих режим интегрирования) Пик 4 не интегрируется (поскольку его высота меньше заданного порога) Пик 5 интегрируется Пик 6 не интегрируется (поскольку его ширина меньше нижнего предела диапазона ширины пика) Пик 7 интегрируется Таблица 11 Зависимость опознания пика от влияния рассмотренных параметров Параметр, определяющий режим интегрирования Исключаемая высота Исключаемая площадь Минимальная ширина пика Пик интегрируется? Пик 1 Пик 2 Пик 3 Пик 4 Пик 5 Пик 6 Пик 7 Выше Выше Выше Выше Ниже Выше Выше Выше Выше Ниже Ниже Выше Выше Выше Выше Выше Выше Ниже Выше Выше Выше Да Нет Да Нет Да Нет Да Программируемые по времени параметры, определяющие режим интегрирования Когда тот вариант установления положения базовой линии, который предполагается самой интегрирующей системой, не устраивает, можно воспользоваться программируемыми по времени параметрами, определяющими режим интегрирования. Такие параметры выгодны в случае необходимости сложения конечных площадей пиков и когда требуется скорректировать кратковременные или длительные уходы базовой линии. Для получения более подробной информации о программируемых по времени параметрах, см. подсказывающие изображения, выводимые на экран непосредственно во время работы (в ответ на запрос помощи [Help]). Таблицы с параметрами, определяющими режим интегрирования Под каждый сигнал (хроматограмму или элекрофореграмму), регистрируемый конкретным методом, может иметься собственный набор параметров, определяющих режим интегрирования и заданных в виде таблицы. Владелец системы может создавать таблицы программируемых по времени параметров (Integrator Events Table), определяющих режим интегрирования, следующим образом: • вручную редактируя параметры, определяющие режим интегрирования 107 • выбрав режим Autointegration (автоматическое интегрирование), чтобы сама система подобрала исходные значения для каждого из сигналов (т.е. под каждый канал) Когда не пользуются индивидуальными таблицами программируемых параметров, определяющих режим интегрирования, под каждый сигнал (канал), все хроматограммы (электрофореграммы) будут интегрироваться с использованием предполагаемой самой системой таблицы программируемых параметров, определяющих режим интегрирования и соответствующих работе с конкретным детектором. Такие таблицы имеются под каждый детектор (например, под пламенно-ионизационный, под электронозахватный или под детектор с диодной матрицей). Предполагаемые самой системой таблицы программируемых параметров, определяющих режим интегрирования, не могут быть стерты и всегда являются частью метода, согласно которому выполняется анализ. Пользование улучшенным алгоритмом интегрирования Улучшенным алгоритмом интегрирования предусмотрены (при работе с системой ChemStation) следующие методы интегрирования: • Интегрирование (Integration) • Автоматическое интегрирование (Autointegration) • Управление интегрированием вручную (Manual Integration) Интегрирование (Integration) Хроматограмма (электрофореграмма) интегрируется в соответствии со значениями, записанными в таблицу параметров, определяющих режим интегрирования. Вы можете пользоваться таким режимом для подгонки результатов интегрирования (сперва изменяете параметры, определяющие режим интегрирования, а затем запрашиваете пересчет). Результативны и автоматическое интегрирование (Autointegration), и интегрирование по команде Integrate. Однако при автоматическом интегрировании система сама подсчитывает исходные параметры (порог и ширину пика), а пользование функцией Edit Integration Event (редактирование параметров, определяющих режим интегрирования) дает вам возможность или самостоятельно выбрать значения параметров, или воспользоваться значениями, предусматриваемыми самой системой автоматически. Автоматическое интегрирование (Autointegration) При приспособлении к улучшенному алгоритму интегрирования, режим автоматического интегрирования был изменен, чтобы выбранные параметры оказывались более надежными. 108 Предусмотрено уведомление владельца системы о затруднениях, обнаруженных системой при пользовании таким режимом интегрирования. Режим автоматического интегрирования обеспечивает обследование начальной и конечной зон хроматограммы для оценки уровня шума и установления исходных значений параметров "чувствительность к наклону" (Slope Sensitivity) и "исключаемая высота" (Height Reject). Кроме того, при автоматическом интегрировании устанавливается временное значение параметра "ширина пика" (Peakwidth) с учетом продолжительности разгонки и критерия к минимальному порогу обнаружения. Пробное интегрирование выполняется при установке значения параметра "исключаемая высота" (Height Reject) на нуль. Если при таком пробном интегрировании обнаруживается слишком мало пиков, значения параметров подстраиваются и пробное интегрирование производится снова (если потребуется, несколько раз). После удачного пробного интегрирования, данные о ширине первых обнаруженных пиков используются для подсчета "исходной ширины пика". Оценка симметричности пика дает возможность не учитывать при вычислениях пики с искаженной формой. Между обнаруженными пиками производится поиск подтвержденного сегмента базовой линии. Если такой сегмент находится, система пользуется данными о нем (наряду с данными о ширине пика [PeakWidth]) для уточнения значений параметров "чувствительность к наклону" (Slope Sensitivity) и "исключаемая высота" (Height Reject). Величина параметра "исключаемая высота" подсчитывается с учетом "исходной ширины пика" и уровня шума. В строку сообщений выводится предупреждающее сообщение, когда • оказались сниженными требования к симметричности пика, учитываемые при вычислении значения параметра "ширина пика" (PeakWidth) • число обнаруженных пиков оказывается недостаточным для точного подсчета значения параметра "ширина пика" (PeakWidth) • пиков не найдено (система, работающая в режиме автоматического интегрирования, старается обеспечить отношение сигнала к шуму, равное 10:1 [даже если именно это приводит к тому, что никаких пиков не обнаруживается]) Ограничения Автоматическое интегрирование является хорошим начальным подходом к обработке большинства хроматограмм (целесообразно им пользоваться на ранних этапах разработки методов). Однако для получения качественных хроматографических данных и сведений об образце этот подход непригоден. В ходе автоматического интегрирования определяются значения для начальной зоны разгонки, из-за чего ограничивается применимость к необычным ситуациям и к специфичным участкам хроматограммы, которые регистрируются позже. Если в начальной зоне хроматограммы наблюдаются искажения базовой линии; когда в начальной или конечной точке хроматограммы имеется пик, пользование автоматическим интегрированием может привести к затруднениям. 109 Фактически, к осложнениям приводят: • Отрицательные пики • Смещение базовой линии вверх или переходные процессы, обусловленные переключением клапанов или каналов, по которым регистрируется сигнал • Подъем базовой линии в конце хроматограммы (например, обусловленный постепенном уносом неподвижной фазы из колонки газового хроматографа) При обработке показанной выше хроматограммы, можно воспользоваться следующими программируемыми по времени параметрами (событиями): • Запрет интегрирования (Integrator Off) • Отмена запрета интегрирования (Integrator On); принятие всех точек впадин между пиками за соответствующие базовой линии (Baseline All Valleys) • Принятие данной точки за соответствующую базовой линии (Set Baseline) После того, как предусмотрены требуемые программируемые по времени события, автоматическое интегрирование может дать хорошие результаты. Управление интегрированием вручную (Manual Integration) Этот режим интегрирования дает вам возможность управлять подсчетом выбранных пиков или группы пиков. В зоне, указанной в качестве выбранной для интегрирования вручную, все параметры, определяющие режим интегрирования и вводимые самой системой ChemStation, игнорируются (кроме исходного значения исключаемой высоты). Управление интегрированием вручную дает вам возможность указать точки начала и окончания пика, после чего соответственно пересчитанные площади включаются в результаты количественного подсчета (и в сообщение результатов). В распечатке сообщения результатов, пики, проинтегрированные благодаря управлению вручную, отмечаются введением кода М. Управление интегрированием вручную дает следующие возможности: Проведение базовой линии (Draw Baseline) Указывается, каким образом должна быть проведена базовая линия под пиком или группой пиков. Кроме того, можно указать должны ли пики в обозначенной зоне быть разделены во всех точках впадин Подсчет отрицательных пиков (Negative Peaks) Указывается, когда необходимо обрабатывать любые заходы за базовую линию как отрицательные пики. Кроме того, можно указать должны ли пики в обозначенной зоне быть разделены во всех точках впадин 110 Выборка по касательной (Tangent Skim) Подсчитываются площади пиков, выбранных по каcательной из основного пика. Кроме того, можно указать, должны ли пики в обозначенной зоне быть разделены во всех точках впадин. Площадь пика, выбранного по касательной, исключается из площади основного пика Расщепление пика (Split Peak) Указывается точка, в которой пик должен быть расщеплен проведением перпендикуляра до базовой линии Разделение во всех точках впадин (All Valleys) Функция All Valleys (разделение во всех точках впадин), предусмотренная выводимым на экран подсказывающим изображением, может быть запрошена (но можно ее и не запрашивать). Когда функция запрошена, в диапазоне (оговоренном в качестве соответствующего управлению интегрированием вручную) пики автоматически будут разделены во всех точках впадин Стирание пика (пиков) [Delete Peak(s)] Стираются один или несколько пиков из результатов интегрирования Коды коррекции базовой линии • Пики, подсчитанные при управлении интегрированием вручную, отмечаются в результатах интегрирования введением кода ММ (в качестве кода коррекции базовой линии). • Если перед пиком, проинтегрированным при управлении вручную, имеется пик и место обнаружения конечной точки такого пика из-за управления вручную изменилось, этот пик маркируется кодом F (принудительное интегрирование). • Пик растворителя, на обработку которого повлияли управлением интегрированием вручную (например, управлением выборкой по касательной), помечается кодом R, а не кодом S (буква R является первой буквой английского слова recalculated - пересчитанный [в данном случае, пересчитанный пик растворителя]). Процесс управления интегрированием вручную • Первым этапом управления интегрированием вручную является выбор участка хроматограммы или электрофореграммы, который должен подвергнуться такой обработке. Это обеспечивается благодаря просмотру интересующей области в увеличенном масштабе (функция zooming) • Затем, выбирают интересующую функцию: Draw Baseline (проведение базовой линии), Negative Peaks (подсчет отрицательных пиков), Tangent Skim (выборка по касательной) или Delete Peak(s) [стирание пика (пиков)]. 111 • Теперь, можно прочертить базовую линию, для чего перемещают мышь с нажатой ее левой клавишей. По мере перемещения мыши, линия проводится из начальной точки до точки, при достижении которой левую клавишу мыши отпускают. Если вызвана функция Delete Peak(s) [стирание пика (пиков)], вместо прочерчивания линии соответствующий участок охватывается (расширяющимся по мере перемещения мыши) прямоугольником. • Графический ввод информации обеспечивается в двух режимах: Absolute (абсолютные указания) [этот режим предполагается самой системой автоматически] или Trace (режим прослеживания). При пользовании любым из этих режимов, текущие координаты указателя (время и уровень сигнала) указываются в строке сообщений. • При пользовании режимом Trace (режим прослеживания), указатель (стрелка, обращенная вниз) скользит по хроматограмме или электрофореграмме (перемещаясь от одной точки данных к другой). Вы можете запросить переход к режиму прослеживания, когда указатель установлен на желательную точку начала пика, для чего нужно нажать правую клавишу мыши. • При пользовании режимом абсолютных указаний, форма указателя напоминает перекрестие оптического прицела; такой указатель не скользит по хроматограмме или электрофореграмме, но имеется возможность его установки в любое место экрана. Можно переходить от одного режима к другому (т.е. от режима абсолютных указаний к режиму прослеживания и наоборот) нажатием правой клавиши мыши. • Для каждого пика, подсчитанного при пользовании режимом интегрирования вручную, на экране появится указание подсчитанной площади с надпечаткой времени удерживания (времени миграции). Запись команд, соответствующих интегрированию вручную, в метод Программное обеспечение дает вам возможность скопировать те параметры, которые определяют режим интегрирования и были заданы при управлении вручную, в текущий введенный метод. Для этого, используется функция Copy Manual Events to Method (копирование команд, соответствующих интегрированию вручную, в метод) из подсказывающего изображения, вызываемого через слово Integration (интегрирование). Такие параметры, выбранные при интегрировании вручную, вписываются (после этого) в метод индивидуально. Их не удастся просмотреть или отредактировать через сектор Integration Events (параметры, определяющие режим интегрирования), используемый в режиме диалога. После ввода файла данных (хроматограммы или электрофореграммы), эти параметры будут задействованы только тогда, когда в секторе Integration Events (параметры, определяющие режим интегрирования) перечеркнут квадрат, подтверждающий выбор функции Apply Manual Integration Events (использование параметров, заданных при управлении интегрированием вручную), или если функция Apply Manual Events from Method (использование записанных в метод параметров, заданных при управлении интегрированием вручную) была выбрана из подсказывающего изображения, вызываемого через слово Integration (интегрирование). Для параметров, соответствующих интегрированию вручную, используются абсолютные значения времени. Они не подстраиваются под уход сигнала. 112 Раздел 7. Опознание пиков В этом разделе рассматривается следующее: • Что представляет собой опознание пиков? • Правила оценки совпадения пиков • Критерии, используемые при опознании пиков • Абсолютное время удерживания (время миграции) • Относительное время удерживания (время миграции) • Подтверждающие пики • Процесс опознания Что представляет собой опознание пиков? Опознание пиков помогает установить наличие конкретных веществ в анализируемом образце на основе данных о характеристиках поведения этих веществ в хроматографической системе (системе для электрофореза), полученных при хроматографических (электрофоретических) разгонках хорошо известного калибровочного стандарта. Если аналитический метод требует оценки количественного содержания, опознание веществ - необходимый этап. Сведения о характеристиках поведения веществ в хроматографической системе (системе для электрофореза) записываются (для каждого интересующего вещества) в калибровочную таблицу, являющуюся частью метода. Опознание пиков необходимо для получения возможности сравнить каждый из пиков хроматограммы (электрофореграммы) с пиками, записанными в калибровочную таблицу. В калибровочной таблице приводятся ожидаемые времена удерживания (времена миграции) интересующих веществ. Пик на хроматограмме (электрофореграмме), время удерживания (время миграции) которого совпадает со временем удерживания (временем миграции) пика, записанным в калибровочной таблице, считается опознанным и ему приписываются характеристики, указанные в калибровочной таблице (например, такие характеристики, как название и коэффициент чувствительности). Те пики хроматограммы (электрофореграммы), которые не совпадают ни с каким пиком в калибровочной таблице, считаются неопознанными. Процесс регулируется следующими факторами: • Указанным в калибровочной таблице временем удерживания (временем миграции) для пиков, обозначенным в качестве контрольных (относительно которых вводятся поправки на смещение времени удерживания [времени миграции]) • Указанными в калибровочной таблице допусками на время удерживания (время миграции) для контрольных пиков 113 • Указанными в калибровочной таблице временами удерживания (временами миграции) для прокалиброванных пиков, не являющихся контрольными • Указанным в калибровочной таблице допуском на время удерживания (время миграции) прокалиброванных пиков, не являющихся контрольными • Наличием каких-то дополнительных подтверждающих пиков с заведомо известным соотношением площади этих пиков с площадью интересующих пиков Правила оценки совпадения пиков При оценке совпадения пиков, используются следующие правила: • Если пик образца попадает в поле допуска для пика вещества, указанного в калибровочной таблице, ему присваиваются характеристики этого вещества. • Если несколько пиков образца попадают в то же поле допуска, то в качестве искомого вещества опознается пик со временем удерживания (временем миграции), наиболее близким к ожидаемому. • Если пик является контрольным или пиком внутреннего стандарта, то в качестве искомого компонента выбирается наибольший пик, попавший в поле допуска. • Если используются также и подтверждающие пики, для проверки правильности опознания компонента употребляется соотношение пиков. • Если искомым пиком является подтверждающий, в качестве такого вещества опознается зарегистрированный пик, наиболее близкий к основному пику. • Если пик образца не попадает ни в какое поле допуска, он указывается в распечатке, как неопознанный (как неизвестное вещество). Критерии, используемые при опознании пиков Программным обеспечением ChemStation могут использоваться различные критерии при сопоставлении пика образца с данными, записанными в калибровочную таблицу. Абсолютное время удерживания (время миграции) Время удерживания (время миграции) пика образца сопоставляется с ожидаемым временем удерживания (временем миграции) для каждого компонента, записанным в калибровочную таблицу. 114 Относительное время удерживания (время миграции) Ожидаемое время удерживания (время миграции) компонентов корректируется с использованием фактического времени удерживания (времени миграции) одного или нескольких контрольных пиков; сопоставление производится по скорректированным (относительным) временам удерживания (временам миграции). В калибровочной таблице обязательно должны быть указаны контрольные пики (один или несколько). Подтверждающие пики Помимо опознания по времени удерживания (времени миграции), можно пользоваться и подтверждающими пиками, чтобы получить наиболее точный результат. Если в поле допуска по времени удерживания (времени миграции) попадают несколько пиков, для правильного опознания должны употребляться подтверждающие пики. Ограничения по количествам Для подтверждения опознания пика, используются ограничения по количествам, указанные в калибровочной таблице. Если количество опознаваемого вещества попадает в поле допуска по количеству, правильность опознания подтверждается присвоением названия пику в сообщении результатов. Абсолютное время удерживания (время миграции) При проверке совпадения пика используется допуск по времени удерживания (времени миграции). Центр этого поля допуска приходится на время удерживания (время миграции) ожидаемого пика. Любой пик образца, попадающий в такое поле допуска, может рассматриваться в качестве кандидата на признание искомым веществом. На рис. 32 показано поле допуска для пика 2; поле допуска простирается от 1,809 до 2,631 мин, а ожидаемое время удерживания (время миграции) равно 2,22 мин. Имеются два кандидата на опознание в качестве пика 2: один пик со временем удерживания (временем миграции) 1,85 мин, а другой - с временем удерживания (временем миграции) 2,33 мин. Если искомый пик не является контрольным, то выбранным окажется пик со временем удерживания (временем миграции) наиболее близким к 2,22 мин. Если искомый пик является контрольным или пиком внутреннего стандарта, будет выбран наибольший пик, попавший в поле допуска. 115 В том и в другом случаях, система ChemStation выбирает пик со временем удерживания (временем миграции) 2,33 мин. Если размер пиков одинаков, будет выбран пик, наиболее близкий к центру поля допуска. Рис. 32. Допуска на время удерживания (время миграции) При попытке найти пик используются три типа допусков: • Допуск для контрольных пиков [reference peak windows] (применим только к контрольным пикам) • Допуск для пиков, не являющихся контрольными [non-reference peak windows] (применим ко всем другим прокалиброванным пикам) • Специфичные поля допуска для индивидуальных компонентов; эти поля допуска задаются через сектор с заголовком Compound Details (подробная информация о веществах), используемый в режиме диалога. Значения для этих полей допуска, предполагаемые самой системой автоматически, вводятся в сектор Calibration Settings (указание параметров, соответствующих калибровке), используемый в режиме диалога. Допуск в ту и другую стороны от центра поля допуска определяется суммой абсолютного и процентного допусков. Указание допуска 5% означает, что пик должен иметь время удерживания (время миграции), попадающее в диапазон от -2,5% до +2,5% от времени удерживания (времени миграции) для данного пика, зарегистрированного при калибровке. Например, пик со временем удерживания (временем миграции) 2,00 при калибровочной разгонке должен появляться при попадании в границы поля от 1,95 до 2,05 мин. при последующих разгонках. Например, абсолютный допуск 0,20 мин и относительный допуск 10% с центром поля на 2,00 мин. дают поле допуска по времени удерживания (временем миграции) от 1,80 до 2,20 мин. 1,80 мин = 2,00 мин - 0,10 мин (0,20/2) - 0,10 мин (10% от 2,00) 2,20 мин = 2,00 мин + 0,10 мин (0,20/2) + 0,10 мин (10% от 2,00) 116 Относительное время удерживания (время миграции) Указание абсолютного времени удерживания (времени миграции) для выявления совпадений пиков может казаться более простым подходом, но этот способ не всегда надежен. Индивидуальные времена удерживания (времена миграции) могут слегка меняться из-за небольших отклонений условий (состояний хроматографичеcкой системы [системы для электрофореза]) или способа введения образца. В результате, пик может выпасть из поля допуска, из-за чего не будет опознан. В случае возможных смещений абсолютного времени удерживания (времени миграции), помогает указание времен удерживания (времен миграции) компонентов относительно одного или нескольких контрольных пиков. Контрольные пики обозначаются в калибровочной таблице записью в столбце "контрольный пик" (reference) для этого пика. При оценке совпадения по относительному времени удерживания (времени миграции), контрольный пик (или пики) используется для положения полей допуска ради компенсации смещения времен удерживания (времен миграции) пиков образца. Если контрольный пик в методе (т.е. в калибровочной таблице) не указан или если система ChemStation не может отыскать (по крайней мере один) контрольный пик во время разгонки, программным обеспечением при опознании используется указание абсолютных времен удерживания (времен миграции). Пользование одиночным контрольным пиком Центром поля допуска по времени удерживания (времени миграции) для контрольного пика оказывается время удерживания (время миграции) этого пика. Наибольший пик, попадающий в такое поле допуска, считается контрольным пиком. Ожидаемое время удерживания (время миграции) для всех пиков в калибровочной таблице корректируется пропорционально отношению ожидаемого времени удерживания (времени миграции) контрольного пика и фактического времени удерживания (времени миграции) контрольного пика. Пользование несколькими контрольными пиками При употреблении одиночного контрольного пика, поправки времени удерживания (времени миграции) вводятся исходя из предположения, что отклонение фактического времени удерживания (времени миграции) от ожидаемого однородно и линейно на протяжении всей разгонки. Часто, во время длительных разгонок, отклонения оказываются неоднородными. В таких случаях, лучших результатов добиваются указывая многие контрольные пики, удаленные друг от друга почти на одинаковые отрезки хроматограммы. Таким образом, хроматограмма (электрофореграмма) оказывается разбитой на отдельные зоны. Предполагается, что в каждой зоне отклонение времени удерживания (времени миграции) оказывается линейным, но скорость изменения определяется индивидуально для каждой зоны. 117 ПРИМЕЧАНИЕ: Алгоритм введения поправок небольших отклонений времен удерживания может не сработать, если несколько указанных контрольных пиков расположены слишком близко друг к другу (не распределены по хроматограмме). Подтверждающие пики Вещество может обнаруживаться в нескольких хроматограммах (электрофореграммах). Хотя многоканальная регистрация применима во всех видах хроматографии, несколькими детекторами или многоканальными детекторами (т.е. обнаружением по нескольким хроматограммам) обычно пользуются в жидкостной хроматографии (при работе с многоволновыми детекторами или детекторами с диодной матрицей). Обычно, для определения основного пика (указанного в калибровочной таблице), используется та длина волны, на которой абсорбция (площадь пика) наиболее велика. На рис. 33, это длина волны λ1. Другие длины волн, сведения для которых не даются в калибровочной таблице, могут использоваться для регистрации подтверждающих пиков. На рис. 33, это длины волн λ2 и λ3. Рис. 33. Подтверждающие пики Пики вещества характеризуются постоянным отношением откликов на разных длинах волн. Отклик на подтверждающий пику составляет конкретный процент от отклика на основной пику. Границы поля допуска на ожидаемый отклик могут быть указаны в калибровочной таблице, если выбран следующий вариант представления этой таблицы: Identification Details (конкретные сведения, способствующие опознанию). Если отношение отклика на длине волны λ1 (для основного пика) и отклика на длине волны для подтверждающего пика (например, λ3) укладывается в дозволенный допуск, оказывается подтвержденной правильность опознания вещества. 118 Соотнесение хроматограмм (электрофореграмм) Два пика, представленные сигналами различных детекторов и попадающие в заданное поле допуска, считаются соответствующими одному и тому же веществу. Поле допуска задается с помощью параметра SignalCorrWin в таблице QuantParam (параметры, используемые при количественном анализе) регистра _DaMethod. Указанием поля допуска, равного 0,0 мин., соотнесение сигналов запрещается (для получения более подробной информации, см. раздел Macro Programming Guide [руководство по пользованию макрокомандами] подсказывающих сообщений, выводимых на экран непосредственно в ходе работы, в ответ на запрос помощи [Help]). Когда соотнесение сигналов запрещено, пики, регистрируемые разными детекторами и имеющие то же самое время удерживания (время миграции), считаются соответствующими разным веществам. Самой системой автоматически предусматриваются следующие поля допуска для соотнесения сигналов (т.е. для подтверждения правильности опознания пиков): 0,03 мин в случае работы с жидкостным хроматографом, системой "жидкостной хроматограф - массселективный детектор" или системой для капиллярного электрофореза; 0,0 мин в случае работы с газовым хроматографом. Проверка по подтверждающим пикам Если разрешено соотнесение хроматограмм (электрофореграмм), для всех типов файлов данных (самой системой автоматически) дозволена проверка по подтверждающим пикам. Такая проверка может быть запрещена установкой метки UseQualifiers в предусмотренной методом таблице Quantification Parameters (параметры, используемые при количественном анализе). Для получения более подробной информации, см. раздел Macro Programming Guide (руководство по пользованию макрокомандами) подсказывающих сообщений, выводимых на экран непосредственно в ходе работы, в ответ на запрос помощи [Help]). Проверка по подтверждающим пикам запрещается и благодаря запрещению соотнесения хроматограмм (электрофореграмм). Подсчет подтверждающего отношения Когда разрешена проверка по подтверждающим пикам, отношение высоты или площади подтверждающего пика к высоте или площади основного пика сопоставляется с калибруемым допуском. Выбор соотносимого параметра (высоты или площади пиков) определяется указанием основы для вычислений, сделанным в секторе Specify Report (указание вида сообщения результатов и адреса, по которому оно должно выводиться). Калибровка подтверждающих пиков может производиться точно так же, как калибровка для интересующих веществ. Ожидаемого подтверждающего отношения владельцу системы указывать не нужно. Такое ожидаемое подтверждающее отношение подсчитывается автоматически: QualRespRatio = отклик на подтверждающий пик/отклик на основной пик где QualRespRatio - подтверждающее отношение , 119 Оба отклика измеряются в момент времени, соответствующий времени удерживания (времени миграции) вещества. Допуск на подтверждающее отношение (например, +20%) определяется параметром QualTolerance. Этот допуск может быть записан в калибровочную таблицу (благодаря выбору следующего варианта этой таблицы: Identification Details [конкретные сведения, способствующие опознанию]) и указывается в абсолютных процентах. Например, возможно такое указание абсолютного процента: Допуск = 50% + 20% = от 30% до 70% В случае многоуровневых калибровок, система ChemStation подсчитывает минимальный допуск на подтверждающее отношение (для чего пользуется измеренными подтверждающими отношениями для каждого калибровочного уровня). Минимальный допуск на подтверждающее отношение вычисляется согласно следующему уравнению: где qi – измеренное подтверждающее отношение для уровня i. Процесс опознания Пытаясь опознать пики, программное обеспечение трижды просматривает результаты интегрирования. Поиск контрольных пиков Первый просмотр производится ради поиска контрольных пиков (с помощью которых вводится поправка по времени). Предпринимается попытка найти пик, время удерживания (время миграции) которого попадает в поле допуска для контрольных пиков, указанных в калибровочной таблице. Пик считается контрольным, названным в калибровочной таблице, если обнаруживается попадание в это поле допуска. Если в поле допуска попадают несколько пиков, контрольным будет признан имеющий наибольшую площадь или высоту и прошедший последующую проверку по подтверждающему пику (если такая проверка предусмотрена). После того, как найден каждый контрольный пик, разница времени его удерживания (времени его миграции) и того времени удерживания (времени миграции), которое указано в калибровочной таблице, используется для корректировки ожидаемых времен удерживания (времен миграции), оговоренных в калибровочной таблице. 120 Поиск пиков внутреннего стандарта Второй просмотр производится ради поиска пиков внутренних стандартов, если они на данный момент еще не найдены. Пики внутренних стандартов могут быть обнаружены одновременно с контрольными пиками. Пики внутренних стандартов опознаются по попаданию в поле допуска на время удерживания (время миграции) и по подтверждающим пикам. Если в поле допуска для внутреннего стандарта попадают несколько пиков, выбран будет наибольший. Поиск остальных прокалиброванных пиков Третий просмотр производится ради поиска всех остальных пиков, упомянутых в калибровочной таблице. Указанные в этой таблице пики, не являющиеся контрольными, сопоставляются с зарегистрированными при хроматографической (электрофоретической) разгонке с учетом указанного поля допуска по времени удерживания (времени миграции). Для каждого прокалиброванного (но не являющегося контрольным) пика в калибровочной таблице оговорено время удерживания (время миграции). Это время удерживания (время миграции) откорректировано соответственно конкретной разгонке на основе предварительного опознания контрольных пиков. Поле допуска на время удерживания (время миграции) прокалиброванного пика обновляется по данным об откорректированном времени удерживания (времени миграции) для такого пика. Если в то же поле допуска попадают несколько пиков, выбирается пик со временем удерживания (временем миграции) наиболее близким к ожидаемому и прошедший проверку по подтверждающему пику. Классификация тех пиков, которые не были опознаны Если остаются пики, которые все еще не опознаны, они считаются пиками неизвестных веществ. Система ChemStation предпринимает попытку сгруппировать неизвестные пики, относящиеся к тому же самому веществу. Если пик обнаруживается в нескольких хроматограммах (электрофореграммах), пики с тем же самым временем удерживания (временем миграции) из каждой хроматограммы (электрофореграммы) группируются, как соответствующие одному и тому же веществу. Информация о неопознанных пиках включается в распечатку сообщения результатов, если это было затребовано в секторе с заголовком Calibration Setting (указание параметров, соответствующих калибровке), используемом в режиме диалога. Раздел 8. Количественный анализ В этом разделе обсуждаются следующие вопросы: • Что представляет собой количественный анализ? 121 • Подсчеты, выполняемые при количественном анализе • Подсчеты по проценту площади и проценту высоты • Подсчет по методу внешнего стандарта • Процентный подсчет по методу нормализации • Подсчет по методу внутреннего стандарта • Количественный подсчет неопознанных пиков Что представляет собой количественный анализ? После того, как пики проинтегрированы и опознаны, следующим этапом анализа является количественная оценка. При такой оценке, сведения о площади или высоте пика используются для определения концентрации вещества в образце. Количественный анализ может сводиться к отработке многих этапов, которые кратко перечислены ниже: • Распознание анализируемого вещества • Выбор метода для анализа образцов, содержащих это вещество • Анализ образца или образцов, содержащих известное количество (количества) этого вещества, в целях определения отклика на данное вещество. Вы можете проанализировать целый ряд таких образцов, содержащих интересующее вещество в различных концентрациях, если детектор характеризуется нелинейностью отклика. Такой процесс называют многоуровневой калибровкой. • Анализ исследуемого образца (количество вещества в котором неизвестно), чтобы получить информацию об отклике на неизвестное количество. • Сопоставление отклика на неизвестное количество с откликом на известное количество ради определения фактической концентрации вещества в исследуемом образце. Для получения возможности уместного сравнения отклика, полученного при анализе исследуемого образца, с откликом, зарегистрированном в ходе калибровочного анализа, данные должны собираться и обрабатываться при идентичных условиях. 122 Подсчеты, выполняемые при количественном анализе Система ChemStation реализует следующие варианты подсчета количества каждого компонента, присутствующего в образце: • Процентный подсчет • Нормализация • Подсчет по методу внешнего стандарта (ESTD) • Процентный подсчет по методу внешнего стандарта (ESTD%) • Подсчет по методу внутреннего стандарта (ISTD) • Процентный подсчет по методу внутреннего стандарта (ISTD%) Вид подсчета, используемый для определения количества вещества в исследуемом образце, зависит от типа количественного анализа. При каждом из подходов, используются сведения о площади или высоте пиков, но формируются различные виды сообщений результатов. Коэффициенты чувствительности При упомянутых подсчетах используются четыре вида коэффициентов чувствительности: абсолютный коэффициент чувствительности, масштабный коэффициент, коэффициент разбавления и количество образца. Употребление этих коэффициентов при калибровке дает возможность компенсировать неоднозначность отклика детектора на разные компоненты образца, концентрации; учесть разбавление образца и количества образца; перейти от одних единиц измерений количеств к другим. Абсолютный коэффициент чувствительности (Absolute Response Factor) Абсолютный коэффициент чувствительности для компонента образца представляет собой количество компонента, поделенное на измеренную площадь или высоту пика компонента (по данным, полученным при анализе калибровочной смеси). Абсолютный коэффициент чувствительности, используемый при каждом способе количественного подсчета, выполняемого после калибровки, дает возможность скорректировать неоднозначность отклика детектора на разные компоненты образца. Масштабный коэффициент (Multiplier) Масштабный коэффициент используется (соответственно формуле подсчета) для умножения результата, полученного для каждого компонента. Масштабный коэффициент дает 123 возможность компенсировать разбавление образца или перейти от одних единиц указания количеств к другим. Коэффициент разбавления (Dilution Factor) Коэффициент разбавления представляет собой число, на которое умножаются все подсчитанные результаты (перед распечаткой сообщения результатов). Вы можете воспользоваться коэффициентом разбавления для изменения шкалы представления результатов или введения поправок на изменения состава образца во время подготовки его к анализу. Кроме того, коэффициентом разбавления можно пользоваться и для других пересчетов, требующих наличия постоянного коэффициента. Количество образца (Sample Amount) Если выбран процентный подсчет по методу внешнего стандарта (ESTD%) или внутреннего стандарта (ISTD%), в сообщениях результатов указываются скорее относительные значения (чем абсолютные), т.е. количество каждого компонента сообщается в виде процента от количества образца. Таким образом, указание количества образца используется при подсчете по методу внешнего стандарта или внутреннего стандарта для преобразования абсолютных количеств определяемых веществ в относительные (преобразование за счет деления на указанное значение). Способы подсчета без калибровки При таких подсчетах, калибровочной таблицы не требуется. Подсчет по проценту площади и по проценту высоты (Area% и Height%) Подсчет по проценту площади (Area%) дает сообщение площади каждого пика хроматограммы в виде процента от суммарной площади всех пиков, зарегистрированных в ходе разгонки. Подсчет по проценту площади не требует проведения предварительной калибровки; результаты не зависят от введенного количества образца (если детектор способен все вещества зарегистрировать). Никаких коэффициентов чувствительности не используется. Если детектор реагирует на все вещества одинаково и все компоненты образца вышли из колонки (капилляра), подсчет по проценту площади дает достаточно пригодную (почти абсолютно достоверную) информацию об относительном содержании каждого из веществ. Обычно, подсчетом по проценту площади пользуются, когда интересует качественный состав образца, и для получения информации, нужной для создания калибровочной таблицы (без которой не возможна реализация тех методов подсчета, которые требуют калибровки). 124 Подсчет по проценту высоты (Height%) дает сообщение высоты каждого пика хроматограммы (электрофореграммы) в виде процента от суммарной высоты всех пиков, зарегистрированных в ходе разгонки. Способы подсчета с калибровкой Подсчеты по методу внешнего стандарта, по методу нормализации, по методу внутреннего стандарта заставляют пользоваться коэффициентами чувствительности и, поэтому, связаны с употреблением калибровочной таблицы. Калибровочная таблица дает возможность пересчета отклика детектора в те единицы определения количеств, для получения которых Вы составили метод. Подсчет по методу внешнего стандарта (ESTD) Подсчет по методу внешнего стандарта - основной способ количественной оценки, согласно которому калибровочные и исследуемые образцы анализируются в одинаковых условиях. Результаты разделения исследуемого образца сопоставляются с данными о разделении калибровочного образца, в результате чего появляется возможность определения количественного содержания в образце, состав которого ранее был неизвестен. При подсчете по методу внешнего стандарта, используются абсолютные коэффициенты чувствительности (в отличие от коэффициентов, употребляемых при пользовании методом внутреннего стандарта). Коэффициенты чувствительности определяются по результатам калибровочных разгонок, после чего записываются в память. При последующих анализах образцов, содержания веществ подсчитываются за счет пересчета зарегистрированных количеств компонентов с использованием соответствующих коэффициентов чувствительности. При таком подходе необходимо очень внимательно следить за тем, чтобы вводимые количества образца были одинаковыми от разгонки к разгонке (поскольку в образце нет какого-то стандарта, дающего возможность вводить поправки на изменения вводимых количеств или на потери при подготовке образца к анализу). При формировании сообщения результатов подсчета по методу внешнего стандарта, вычисление количества конкретного вещества в исследуемом образце производится за два этапа: 1. Подсчитывается уравнение, соответствующее графику, проходящему через калибровочные точки для конкретного вещества (используется тот тип подгонки, который был оговорен в секторе Calibration Setting [указание параметров, соответствующих калибровке] или в секторе Calibration Curve [калибровочный график]). 2. Подсчитывается количество вещества в неизвестном образце, для чего употребляется показанное далее уравнение. Это количество может быть включено в сообщение результатов, или может быть пересчитано с учетом масштабного коэффициента (Multiplier), коэффициента разбавления (Dilution Factor) или количества образца (Sample Amount). 125 Для подсчета абсолютного количества компонента х, используется следующее уравнение: Абсолютное количествох = (Отклик детектора на веществох) * (Коэффициент чувствительности для веществах) * (Масштабный коэффициент) * (Коэффициент разбавления) , где: Отклик детектора на веществох - площадь (или высота) пиках; Коэффициент чувствительности для веществах - коэффициент для компонента х, подсчитанный согласно выражению Коэффициент чувствительности для веществах = Количествох Площадьх Информация о масштабном коэффициенте (Multiplier) и коэффициенте разбавления (Dilution Factor) считывается или из сектора Calibration Settings (указание параметров, соответствующих калибровке), или из cектора Sample Information (информация об образца), используемого в режиме диалога. Если выбран процентный подсчет по методу внешнего стандарта (ESTD%), относительное (процентное) количество компонента х определяется по формуле: Абсолютное количествох * 100 Относительное количествох = —————————————— , Количество образца где: Абсолютное количествох подсчитывается согласно уравнению, показанному ранее (для случая обычного подсчета по методу внешнего стандарта); Количество образца считывается из сектора Sample Information (информация об образце) или из сектора Calibration Settings (указание параметров, соответствующих калибровке) в случае одиночных анализов. Если количество образца не указано, подсчет производится согласно обычному (не процентному) методу внешнего стандарта. 126 Процентный подсчет по методу нормализации (Norm %) При пользовании методом нормализации, площади (или высоты) пиков пересчитываются с использованием коэффициентов чувствительности ради компенсации различий чувствительности детектора к разным веществам. Подсчет процентных результатов нормализации производится точно так же, как и в случае метода внешнего стандарта (исключением является наличие дополнительного этапа подсчета относительных количеств [вместо абсолютных количеств]). Процентный подсчет по методу нормализации характеризуется теми же недостатками, что подсчеты по проценту площади или высоты. Любые изменения, влияющие на суммарную площадь пиков, сказываются на результатах определения концентрации для каждого индивидуального пика. Процентным подсчетом по методу нормализации следует пользоваться только тогда, когда все интересующие вещества выходят из колонки (капилляра) и соответствующие им пики интегрируются. Исключение выбранных пиков из сообщения результатов приведет к изменению результатов анализа образца. Для подсчета (по методу нормализации) процентного содержания компонента х, используется следующее уравнение: (Площадьх) * (Коэффициент чувствительностих) * 100 * Масш.коэфф. % содержаниях = ——————————————————————————————— * Σ (Площади*Коэффициенты чувствительности) * Коэффициент разбавления , где: Площадьх - площадь (или высота) пика х; Коэффициент чувствительностих - коэффициент чувствительности для пика х; Σ (Площади*Коэффициенты чувствительности) - cумма всех произведений (Площади*Коэффициенты чувствительности) для всех пиков (включая и пик х); Масш.коэфф. - масштабный коэффициент Информация о масштабном коэффициенте (Multiplier) и коэффициенте разбавления (Dilution Factor) считывается или из сектора Calibration Settings (указание параметров, соответствующих калибровке), или из cектора Sample Information (информация об образца), используемого в режиме диалога. Подсчет по методу внутреннего стандарта (ISTD) Подсчет по методу внутреннего стандарта устраняет недостатки, характерные для подсчета по методу внешнего стандарта; в образцы добавляется известное количество вещества, что 127 вводит нормализующий фактор. Такое вещество (внутренний стандарт) добавляется как в калибровочные, так и в исследуемые образцы. Программное обеспечение пользуется коэффициентами чувствительности, подсчитанными в ходе ранее проведенных калибровок (результаты которых записаны в память в составе метода). Через концентрацию внутреннего стандарта и площади пиков, зарегистрированных в ходе разгонки, подсчитываются концентрации компонентов. Вещество, используемое в качестве внутреннего стандарта, должно напоминать калибруемое вещество (как по химическому строению, так и по времени удерживания [времени миграции]), но должно быть отличимо в хроматограмме (электрофореграмме). Таблица 12 Метод внутреннего стандарта Достоинства Отклонения вводимого объема образца не оказывают столь существенного влияния С помощью внутреннего стандарта компенсируется инструментальный уход Недостатки Внутренний стандарт приходится добавлять во все образцы и смеси калибровочных стандартов Если химические свойства внутреннего стандарта походи на характерные для исследуемого вещества, зависимость от способов подготовки образца к анализу оказывается минимальной Если метод внутреннего стандарта используется для калибровок, при которых графики оказываются нелинейными, следует соблюдать осторожность, поскольку ошибки, типичные для такого подхода к подсчету, могут приводить к систематичным ошибкам. При многоуровневых калибровках, добавляемые количества внутреннего стандарта должны быть одинаковыми (т.е. теми же самыми для всех уровней, если калибровочный график нелинеен). При анализах, выполняемых согласно методу внутреннего стандарта, количество интересующего вещества соотносится с количеством внутреннего стандарта (благодаря учету отношений площадей двух пиков). При анализе по методу внутреннего стандарта, выполняемом за 2 разгонки, вычисление скорректированных отношений количеств конкретного вещества в исследуемом образце производится за счет отработки следующих этапов: Первая разгонка: калибровка 1. Получают калибровочные точки (за счет подсчета отношений количеств и отношений откликов для каждого уровня конкретного пика в калибровочной таблице). 128 Отношение количеств представляет собой результат деления количества компонента на количество внутреннего стандарта (для данного уровня). Отношение откликов представляет собой результат деления площади (или высоты) пика компонента на площадь (или высоту) пика внутреннего стандарта (для данного уровня). 2. Подсчитывается уравнение, соответствующее графику, проходящему через калибровочные точки для конкретного вещества (используется тот тип подгонки, который был оговорен в секторе Calibration Setting [указание параметров, соответствующих калибровке] или в секторе Calibration Curve [калибровочный график]). Отношение количеств Калибровочный коэффициент для вещества х = Отношение откликов детектора Рис. 34. Отношение количеств Вторая разгонка: анализ интересующего образца 1. Отклик на вещество в исследуемом образце делится на отклик на внутренний стандарт (в этом же образце), для получения отношения откликов (характеризующего исследуемый образец). 2. По калибровочному графику (полученному в результате соответствующей подгонки), вычисляется отношение количеств, характерное для исследуемого вещества Подсчет прокалиброванных пиков по методу внутреннего стандарта Для подсчета фактического количества прокалиброванного компонента х при 1-уровневой калибровке, используются следующие уравнения: Отношение откликов = Откликх Отклик на внутренний стандарт 129 Фактическое количество х = (Отношение количеств * коэффициент чувствительностих) * * (Фактическое количество внутреннего стандарта) * Масштабный коэффициент * * Коэффициент разбавления , где: Откликх - площадь (или высота) пика х; Отклик на внутренний стандарт - площадь (или высота) пика внутреннего стандарта; Фактическое количество внутреннего стандарта (Actual Amt) - значение, указанное в секторе Calibration Settings (указание параметров, соответствующих калибровке) или в секторе Sample Info (информация об образце), для внутреннего стандарта, добавленного в образец Если запрошено сообщение результатов процентного подсчета по методу внутреннего стандарта (ISTD%), для подсчета относительного (процентного) количества компонента х используется следующее уравнение: (Фактическое количество х)*100 Относительное количество х = ——————————————— Количество образца Подсчет непрокалиброванных пиков по методу внутреннего стандарта Предусмотрены два способа определения коэффициента чувствительности, используемого при подсчете количеств для неопознанных пиков. 1. Самим оператором задается неизменный коэффициент чувствительности, который будет использоваться для всех неопознанных пиков. Этот коэффициент записывается в поле With Rsp Factor (с использованием коэффициента чувствительности) сектора Calibration Settings (указание параметров, соответствующих калибровке). Вы можете выбрать точный коэффициент чувствительности (благодаря запросу коррекции по методу внутреннего стандарта). Фактическое количество х = (Коэффициент чувствительности для х) * (Отношение откликов для х) * (Количество внутреннего стандарта) * Масштабный коэффициент * * Коэффициент разбавления Отношение откликов = Откликх , Отклик на внутренний стандарт где: Коэффициент чувствительности для х – тот коэффициент, который записан в сектор Calibration Settings (указание параметров, соответствующих калибровке). 130 Как показывают эти формулы, отклонения отклика на внутренний стандарт используются для попрaвок результатов количественной оценки содержания интересующего вещества. 2. Используется коэффициент чувствительности, подсчитанный для прокалиброванного пика. В этом случае, такой коэффициент чувствительности приписывается неопознанным пикам. Благодаря этому, при количественном подсчете будет употребляться один и тот же коэффициент. Если коэффициент чувствительности, подсчитанный для прокалиброванного пика, изменяется, в той же степени изменится и коэффициент, применяемый для неопознанных пиков. Если калибровочная таблица уже составлена, вы можете выбрать вещество из поля Using Compound (используя вещество) сектора Calibration Settings (указание параметров, соответствующих калибровке). Коэффициент чувствительности для выбранного вещества и неопознанных пиков будет корректироваться при всех перекалибровках. Уравнение, используемое для подсчета фактического количества, соответствующего непрокалиброванному пику х, приведено выше. Раздел 9. Калибровка В этом разделе описывается следующее: • Терминология • Калибровочная таблица • Калибровочный график • Исследуемые образцы • Типы калибровки • Калибровка для группы веществ • Перекалибровка Терминология Калибровка Калибровка - это процесс определения поправочных коэффициентов на отклик детектора, дающих возможность подсчета абсолютных концентраций компонентов образца. Для обеспечения калибровки проводится хроматографических анализ специально подготовленных калибровочных образцов. Опознанию веществ тоже способствует калибровочная таблица (см. раздел 7, "Опознание пиков"). 131 Вещество При калибровке по нескольким каналам, одно вещество может дать несколько пиков (обычно, по 1 пику на хроматограмму или электрофореграмму). При калибровке, выполняемой с регистрацией по 1 каналу, обнаруживается 1 пик калибровочного вещества. Калибровочный уровень Калибровочный уровень дает набор калибровочных точек для одной концентрации калибровочного образца. При калибровке по нескольким каналам (т.е. с регистрацией нескольких хроматограмм или электрофореграмм), калибровочные точки могут быть распределены по разным каналам. Калибровочная точка Калибровочной точкой определяется отношение отклика к количеству на калибровочном графике для конкретного пика. Калибровочный образец Калибровочный образец (часто называемый калибровочным стандартом или смесью стандартов) содержит известное количество интересующего вещества. При описании рассматриваемого здесь программного обеспечения, разделением калибровочного образца называют результат анализа смеси, имевшейся в калибровочном флаконе. Калибровочные образцы могут быть куплены в магазинах химических реактивов или могут быть подготовлены растворением точно взвешенного количества чистого вещества. Содержание вещества в калибровочном образце обычно указывается в единицах концентрации (довольно часто, нг/мкл). Калибровочная таблица Калибровочная таблица дает информацию для преобразования площадей или высот пиков в те единицы, которые выбраны вами соответственно методу подсчета. В эту таблицу записан перечень времен удерживания (времен миграции), отмеченных при калибровочной разгонке. Времена удерживания (времена миграции) сопоставляются со временами удерживания (временами миграции), полученными при разгонке анализируемого образца. Когда отмечается совпадение, предполагается, что пик в образце соответствует тому же веществу, которое указано в калибровочной таблице (см. раздел 7, "Опознание пиков"). Во время анализа или при формировании сообщения результатов, количество, записанное в калибровочную таблицу для каждого пика, используется для вычисления количества веществ в образце (употребляется тот вид подсчета, который выбран для получения 132 сообщения результатов). Вид и количество сведений, требующихся при создании калибровочной таблицы, зависят от необходимого типа подсчета. Для создания калибровочной таблицы, нужна следующая информация: • Время удерживания (время миграции) для пика каждого компонента калибровочной смеси. • Количество каждого вещества, использованного для приготовления калибровочной смеси (выраженное в единицах концентрации). Калибровочный график Калибровочный график - это графическое представление данных о количестве и об отклике, полученное в результате анализа одного или нескольких калибровочных образцов. Обычно, в колонку (или в капилляр) вводят аликвотное количество калибровочного образца, получают хроматограмму (электрофореграмму), а отклик детектора определяют по подсчету площади пика (например, как показано на рис. 35). Рис. 35. Хроматограмма (электрофореграмма) и калибровочный график для вещества, концентрация которого в калибровочном образце равна 10 нг/мкл Вместе с калибровочным графиком, на экран выводится информация о корреляционном коэффициенте. Коэффициент позволяет оценить степень подгонки калибровочного графика под точки данных. Значение коэффициента сообщается с точностью до 3 знаков после десятичной запятой в диапазоне от 0,000 до 1,000, где 0,000 - подгонка не обеспечена 1,000 - идеальная подгонка Для каждого калибровочного уровня показывается информация об относительном остатке, вычисляемом по следующей формуле: 133 Откликпрокалиброванный - Откликподсчитанный Относительный остаток (в %) = ——————————————————— * 100 Откликподсчитанный Подсчитанный отклик представлен точками калибровочного графика. Стандартное отклонение остатка, приводимое в некоторых распечатках сообщений результатов и указываемое при выборе функции Print calibration table and curves (распечатка калибровочных таблицы и графиков), вычисляется по следующей формуле: где: Откликпрокалиброванныйi - прокалиброванный отклик для точки i Откликподсчитанныйi - подсчитанный отклик для точки i n - число калибровочных точек Исследуемые образцы Исследуемый образец - это тот, в котором содержание интересующего вещества (подлежащее количественному определению) неизвестно. Для получения информации о том, сколь много вещества содержится в анализируемом образце, вы должны: • создать калибровочный график для этого вещества • ввести аликвотное количество анализируемого образца и провести хроматографическую разгонку точно при таких же условиях, при которых выполнялась разгонка калибровочного образца • по хроматограмме (электрофореграмме), определить отклик (площадь или высоту пика, соответствующую определяемому количеству вещества) • воспользоваться калибровочным графиком для подсчета количества вещества в исследуемом образце 134 Например, если площадь пика в исследуемом образце равна 500, воспользовавшись показанным ниже калибровочным графиком вы можете определить, что количество вещества в анализируемом образце составляет 5 нг/мкл. Рис. 36. Хроматограмма (электрофореграмма) исследуемого образца и калибровочный график Типы калибровки Системой ChemStation предусмотрены 2 типа калибровки: одноуровневая и многоуровневая. Одноуровневая калибровка Калибровочный график, показанный на рис. 37 (см. следующую страницу), содержит 1 точку (т.е. 1 уровень). Для одноуровневой калибровки предполагается, что отклик детектора линеен во всем рабочем диапазоне концентраций интересующих образцов. Поправочный коэффициент на отклик детектора (для конкретного вещества) определяется величиной, обратной тангенсу угла наклона прямой линии, проходящей через установленную точку и начало координат. Недостатком 1-уровневой калибровки является то, что она основана на предположении, что график зависимости площади от концентрации линеен и проходит через начало координат. Это условие не всегда обеспечивается и подобное предположение может приводить к неточным результатам. 135 Рис. 37. График, соответствующий 1-уровневой калибровке Для получения точных количественных результатов, калибровочный график должен быть построен (по меньшей мере) для двух уровней. Количества веществ, предполагаемые в анализируемых образцах, должны охватываться уровнями с двух сторон. Рис. 38. 2-уровневый калибровочный график Например, если вы хотите узнать количество вещества и предполагается, что содержание его в исследуемом образце попадает в диапазон от 1 до 10 нг/мкл, калибровочный график должен иметь не менее 2 уровней (как показано на рис. 38). Ограничивающие количества Система ChemStation дает вам возможность указать те диапазоны количеств, при попадании в которые результаты уместны (оговариваются абсолютные количества для каждого вещества). 136 Многоуровневая калибровка Когда имеется предположение, что отклик детектора на вещество линеен, не отличается достаточной точностью, можно воспользоваться многоуровневой калибровкой (такую калибровку можно выполнять и просто в целях подтверждения линейности отклика в калибруемом диапазоне). Каждый калибровочный уровень соответствует конкретной концентрации веществ в калибровочном образце. Калибровочные образцы должны быть подготовлены таким образом, чтобы концентрация каждого компонента изменялась в диапазоне концентраций, ожидаемом в анализируемых образцах. Благодаря этому, можно проследить изменения отклика детектора в зависимости от концентраций и соответственно вычислить коэффициенты чувствительности. Рис. 39. Многоуровневый калибровочный график (с 3 уровнями) Проиллюстрированный выше многоуровневый калибровочный график проведен через 3 точки (использованы 3 уровня) и через начало координат. Подгонка показала, что график линеен. Метод подгонки под линию, проходящую через начало координат, дает результаты, аналогичные использованию 1-уровневого калибровочного графика. Предполагается, что отклик детектора на концентрацию линеен. Различия этих двух типов калибровочных графиков обуславливаются тем, что наклон графика отклика детектора может быть определен более точно при проведении через несколько точек (по одной на каждый уровень). Соответствующая калибровочная таблица (в которой содержится сводка информации, используемой для построения такого калибровочного графика, может напоминать показанную в виде табл. 13. Таблица 13 Уровень 1 2 3 Калибровочная таблица Количество (нг/мл) 1 5 10 Отклик (число отсчетов площади) 100 500 1000 Согласно рассматриваемому примеру, калибровочным образцам, использованным для получения данных о трех уровнях, были присвоены названия 1, 2 и 3. 137 Калибруемые диапазоны Результаты каждой многоуровневой калибровки уместны для того диапазона концентраций, который характеризовал калибровочные образцы. Экстраполяция калибровочного графика (особенно в тех случаях, когда он нелинеен) дает, в лучшем случае, лишь приближение. Действующий калибруемый диапазон для каждого вещества может быть указан в секторе Compound Details (подробная информация о веществах), используемом в режиме диалога. Каждая запись, соответствующая веществу, может быть представлена в виде нижней и верхней границ. Если обнаруживается выход за указанные границы, системой делается об этом соответствующая пометка в сообщении результатов. Виды подгонок калибровочных графиков При пользовании многоуровневой калибровкой, возможны различные типы подгонки графиков: • Кусочно-линейная (Piecewise Linear) • Линейная (Linear) • Логарифмическая (Log) • Степенная (Power) • Экспоненциальная (Exponent) • Квадратичная (Quadratic) • Кубическая (Cubic) • По результатам усреднения откликов на количества [Average (Response/Amount)] Подгонка нелинейной зависимости В некоторых случаях, отклик детектора на изменение концентрации образца нелинеен. Для таких типов анализа, метод калибровки с использованием линейной регрессии не подходит; приходится пользоваться многоуровневой калибровкой. Учет начала координат Существуют 4 способа учета начала координат при построении калибровочного графика: • Игнорирование начала координат (ignore) 138 • Проведение через начало координат (include) • Принудительное проведение через начало координат (force) • Соединение с началом координат (connect) Для принудительного проведения калибровочного графика через начало координат, зеркальное изображение калибровочных точек переносится из первого квадранта в третий. При регрессионном подсчете учитываются все полученные точки, благодаря чему гарантируется, что калибровочный график пройдет через начала координат. Этот подход поясняется рис. 40. Рис. 40. Принудительное проведение калибровочного графика через начало координат Для получения более подробной информации о видах подгонки калибровочных графиков и об учете начала координат, см. выводимые на экран подсказывающие сообщения (предоставляемые непосредственно в ходе работы в ответ на запрос помощи [Help]). Весовой вклад калибровочных точек Когда вы указываете системе принцип построения калибровочного графика (которым система должна впоследствии пользоваться автоматически), вы можете указать подход к относительному взвешиванию (или важности) различных калибровочных точек, используемых при получении графика. Предусмотрен выбор следующих вариантов (имеющих отношение ко взвешиванию): Взвешивание Равное (Equal) Пояснения Все калибровочные точки дают одинаковый весовой вклад в график 139 Взвешивание Пояснения Линейное по количеству [Linear (Amnt)] Калибровочная точка, характеризующаяся количеством х, дает весовой вклад 1/х, нормализованный относительно наименьшего количества (в результате чего наибольший весовой коэффициент равен 1). Нормализация обеспечивается путем умножения весового вклада на наименьшее количество. Например, весовой вклад для калибровочной точки с откликом х будет составлять 1/х * а, где а – наименьшее количество прокалиброванного вещества, имеющегося в смеси калибровочных стандартов. Если предусмотрен учет начала координат, такое начало координат дает основу для определения весового вклада других калибровочных точек Линейное по отклику [Linear (Resp)] Калибровочная точка, характеризующая отклик у, дает весовой вклад 1/у, нормализованный относительно наименьшего количества (в результате чего наибольший весовой коэффициент равен 1). Нормализация обеспечивается путем умножения весового вклада на наименьшее количество. Например, весовой вклад для калибровочной точки с откликом у будет составлять 1/у * b, где b – отклик, соответствующий наименьшему количеству калибровочного вещества, имеющегося в калибровочной смеси стандартов. точки. Если предусмотрен учет начала координат, такое начало координат дает основу для определения весового вклада других калибровочных точек Квадратичное Калибровочная точка, характеризующаяся количеством х, дает весовой вклад по 1/х2, нормализованный относительно наименьшего количества (в результате количеству чего наибольший весовой коэффициент равен 1). Нормализация [Qudratic обеспечивается путем умножения весового вклада на наименьшее (Amnt)] количество. Например, весовой вклад для калибровочной точки с количеством х будет составлять 1/х2 * a2, где a - наименьшее количество для прокалиброванного вещества, имеющегося в смеси калибровочных стандартов. Квадратичное по отклику [Qudratic (resp)] Калибровочная точка, характеризующаяся откликом y, дает весовой вклад 1/у2, нормализованный относительно наименьшего отклика (в результате чего наибольший весовой коэффициент равен 1). Нормализация обеспечивается путем умножения весового вклада на наименьший отклик. Например, весовой вклад для калибровочной точки с откликом у будет составлять 1/у2 * b2, где b - наименьшее количество для прокалиброванного вещества, имеющегося в смеси калибровочных стандартов. В зависимости от числа перекалибровок (# Calibrations) Весовой вклад калибровочной точки присваивается в зависимости от числа перекалибровок для этой точки. Нормализация не производится Например, квадратичным взвешиванием калибровочной точки можно воспользоваться для упорядочивания разброса калибровочных точек. Такой подход гарантирует, что калибровочные точки окажутся ближе к началу координат (т.е. в области, где измерения могут быть произведены более точно). Эти точки будут давать больший весовой вклад (чем 140 удаленные от начала координат и, возможно, характеризующиеся более высоким разбросом значений). Принять решение о том, каким способом взвешивания калибровочных точек пользоваться, можно с учетом требований конкретного аналитического метода. Калибровка для группы веществ Калибровкой для группы веществ приходится пользоваться, когда нет сведений об индивидуальных концентрациях, но известна сумма концентраций для всей группы (например, для группы изомеров). Калибровка производится для всего набора веществ. Используется следующая формула: КонцентрацияAB = Коэффициент чувствительностиA * ОткликA + + Коэффициент чувствительностиВ * ОткликВ , где: КонцентрацияAB - концентрация для группы веществ, состоящей из веществ А и В ОткликA - площадь (или высота) для вещества А Коэффициент чувствительностиA – коэффициент чувствительности для вещества А Мы предполагаем равенство коэффициентов чувствительности для всех веществ, входящих в группу: Коэффициент чувствительностиA = Коэффициент чувствительностиВ Следовательно, концентрация вещества в группе веществ подсчитывается следующим образом: КонцентрацияАВ * ОткликА КонцентрацияА = ————————————— ОткликА + ОткликВ Суммирование пиков Для решения конкретных прикладных задач, возникающих на нефтехимических и фармацевтических предприятиях, предусмотрена возможность создания таблицы, обслуживающей суммирование пиков. Реализуются следующие функции: • Суммирование площадей пиков, попадающих в конкретную зону хроматограммы (электрофореграммы), указанную владельцем системы 141 • Суммирование площадей пиков, попадающих в конкретную зону хроматограммы (электрофореграммы), указанную владельцем системы; последующий пересчет суммы (благодаря умножению на один коэффициент) • Суммирование площадей всех пиков, имеющих то же самое название Таблица, обслуживающая суммирование пиков, похожа на калибровочную таблицу (но имеет очевидные отличия от стандартной калибровочной таблицы). Так же как и калибровочная таблица, она связана с текущим методом. ПРИМЕЧАНИЕ: Вам необходимо создать (используемую при анализе) калибровочную таблицу перед тем, как перейдете к составлению таблицы, обслуживающей суммирование пиков. Перекалибровка Что представляет собой перекалибровка? Перекалибровка - это процесс, используемый когда вы хотите обновить уровень на калибровочном графике. В целях перекалибровки, вы проводите разгонку другого образца, в котором содержатся те же самые калибровочные вещества, что и в исходном образце, и (что наиболее важно) в тех же самых количествах. После такой разгонки, вы получаете откорректированные (обновленные) коэффициенты чувствительности и времена удерживания (времена миграции). Кроме того, вы можете запросить усреднение коэффициентов чувствительности за целый ряд калибровочных разгонок (с одинаковым весовым вкладом каждого результата). Почему требуется перекалибровка? Большинство результатов калибровки имеют ограниченный срок пригодности (из-за изменений, происходящих в хроматографичеcкой системе или в системе для капиллярного электрофореза). Например, предположим, что вы создали калибровочную таблицу для кофеина, которой пользуетесь всегда, когда требуется выполнить количественный анализ образцов, содержащих кофеин. На каком-то этапе работ вам пришлось заменить колонку (или капилляр). Хотя установлена другая колонка (установлен другой капилляр), того же типа, она (он) никогда не даст точно тех же результатов, получаемых при пользовании ранее установленной колонкой [установленным капилляром] (с помощью которой [которого] вы собрали данные о кофеине, записанные в калибровочную таблицу). Поэтому, для обеспечения достоверности результатов, вы должны обновить уровни (записанные в калибровочную таблицу) перед употреблением новой колонки (нового капилляра) для анализа образцов, содержащих кофеин. Лишь после этого можно гарантировать, что подсчет количества кофеина в исследуемых образцах будет производиться при условиях, совпадающих с условиями калибровки. 142 Перекалибровка при введении данных вручную Вы можете вводить калибровочные данные о пиках вручную и нормализовать записи, имеющиеся в калибровочной таблице (для этого необходимо выбрать кнопку Manual Setup [заполнение вручную] в секторе New Calibration Table [новая калибровочная таблица], используемом в режиме диалога). Обычно, новый метод количественного анализа, предусматривающего калибровку, получают производя разгонки смесей калибровочных стандартов; создавая калибровочную таблицу и записывая количества для всех калибруемых пиков (чтобы система сама подсчитала коэффициенты чувствительности). Такой подход нельзя назвать эффективным в случае решения некоторых конкретных прикладных задач (например, встречающихся на нефтехимических предприятиях, где в течение многих лет занимаются анализом одних и тех же веществ [уже известны коэффициенты чувствительности для разных химических соединений]). Вы создаете калибровочную таблицу вручную (записывая в таблицу пики и соответствующие им коэффициенты чувствительности). Затем, перекалибровываете метод по стандарту, в котором имеется (по меньшей мере) один (показывающий реальный отклик) проверочный пик; после этого, выбираете функцию Delta% update (обновление по процентному соотношению). Перекалибровки при пользовании суммированием пиков При проведении перекалибровок, будут обновляться диапазоны времен удерживания во входящей в метод таблице, обслуживающей суммирование пиков. Лишь после этого будет выполнена фактическая перекалибровка. Перекалибровки при пользовании суммированием пиков проводятся именно таким образом (ради гарантии того, что будут учтены возможные отклонения времен удерживания или времен миграции). Варианты обновления данных при перекалибровке Имеются несколько вариантов обновления результатов, записанных в калибровочную таблицу, с учетом новых калибровочных данных. Усреднение (Average) Усреднение данных всех калибровочных разгонок подсчитывается по следующей формуле: n * Отклик + Измеренный отклик Отклик = —————————————————— n+1 где: n - число предыдущих калибровок , 143 Скользящее усреднение (Floating Average) Подсчитывается взвешенное среднее для всех калибровочных разгонок. Новый вес записывается в сектор Recalibration Settings (параметры, используемые при калибровке). Вес Вес Отклик = (1 - ————) * Отклик + (————) * Измеренный отклик , 100 100 где: вес = отклик на новый вес, записанный в сектор Recalibration Settings (параметры, используемые при калибровке) Замена (Replace) Прежние значения отклика подменяются новыми. Способы перекалибровки Программное обеспечение ChemStation обеспечивает возможность использования двух подходов к калибровке. Перекалибровку можно производить в режиме взаимодействия оператора с системой, или перекалибровка может выполняться автоматически (во время автоматизированной отработки запрограммированной последовательности анализов). Перекалибровка в режиме взаимодействия оператора с системой производится тогда, когда вы непосредственно проходите через этап перекалибровки (пользуясь программным обеспечением ChemStation) после введения одного или нескольких калибровочных образцов. Перекалибровка согласно программе анализов выполняется тогда, когда вы указываете расписание необходимых перекалибровок, но за процесс отвечает та часть программного обеспечения, которая обслуживает автоматизацию работ. Для получения более подробной информации, см. подраздел "Автоматическая перекалибровка" (стр. 154). Для получения дополнительных сведений о выполнении перекалибровки с помощью программного обеспечения, см. подсказывающую информацию, выводимую на экран в ответ на запрос функции How To (как сделать) из перечня, вызываемого на экран через слово Help (запрос помощи), или воспользуйтесь программой-самоучителем. Перекалибровка неопознанных пиков (Recalibration of Unidentified Peaks) Предусмотрены три варианта, имеющие отношение к неопознанным пикам: Отказ от перекалибровки (No Recalibration) Если пик, указанный в калибровочной таблице, не может быть опознан в результатах интегрирования, система от калибровки отказывается. Когда такой случай отмечен при 144 выполнении программы анализов, система отказывается и от отработки этой программы анализов. Частичная перекалибровка (Partial Recalibration) Выбор этого варианта дает возможность перекалибровки только опознанных пиков. Если пики не обнаруживаются, система от калибровки не отказывается, но вводит пометку, что пиков не найдено. Перекалибровка с обновлением всех времен удерживания [времен миграции] (Recalibration of all Retention/Migration Times) Выбор этого варианта обеспечивает перекалибровку все опознанных и неопознанных пиков с обновлением времен удерживания (времен миграции). При этом используются сведения о временах удерживания (временах миграции) опознанных пиков. Коэффициенты чувствительности для неопознанных пиков не обновляются. Раздел 10. Автоматизация Что представляет собой автоматизация? Автоматизация дает возможность выполнения нескольких анализов (требующих введения более одного образца) без надзора оператора. Программным обеспечением ChemStation предусмотрено создание программ анализов, за счет которого автоматизируются сбор данных, оценка данных и формирование сообщений результатов. Что представляет собой программа анализов? Программа анализов - это набор команд, с помощью которых автоматизируется анализ образцов. Программа анализов может быть использована для автоматического введения каждого образца, сбора и анализа данных (в соответствии с методом, указанным для этого образца). Образцы из каждого флакона, указанного программой, могут анализироваться с употреблением различных методов (т.е. при разных хроматографических условиях [условиях электрофореза] и параметрах, согласно которым производится количественная оценка). 145 Параметры, соответствующие программе анализов (Sequence Parameters) Cектор Sequence Parameters (параметры, соответствующие программе анализов), используемый в режиме диалога, оговаривает информацию, общую для всех флаконов с образцами, подлежащими последовательному анализу. Пользуйтесь этим сектором для: • Введения информации о заголовке, под который должны записываться данные, и указания фамилии оператора. В секторе автоматически показывается та фамилия оператора, которая была указана в секторе, использовавшемся для определения уровня доступа к системе • Указания, каким образом должно обеспечиваться выполнение программы анализов (за счет выбора конкретных параметров из под заголовка Part of Methods to Run [подлежащие реализации части метода]). Например, вы можете выбрать: • Реализацию того, что предусмотрено одиночным методом (перечнем Run Time Checklist) • Только сбор данных • Выполнение только пересчета. Если выбран только пересчет, вы можете воспользоваться или теми данными об образце, которые были указаны на время исходного анализа образца, или (перечеркнув квадрат, подтверждающий выбор функции Use Sequence Table information [пользование информацией из таблицы последовательности]) можете ввести откорректированную информацию об образце в таблицу последовательности (т.е. можете воспользоваться новыми данными об образце). • Укажите, что должно произойти после завершения выполнения программы анализов (пользуясь параметрами, соответствующими отключению [Shutdown]) • Если аналитическая система оснащена приставкой для считывания штрихового кода, укажите должна ли использоваться (при выполнении программы анализов) информация, записанная в виде штрихового кода, и что от системы требуется в случае несоответствия штрихового кода Таблица последовательности (Sequence Table) Таблица последовательности определяет, какие методы должны использоваться для анализа образцов и порядок ввода образцов из флаконов. Кроме того, в этой таблице содержится информация о каждом образце (включая название и параметры для количественного подсчета; параметры для перекалибровки). Поле под заголовком Injector (устройство для введения образца) предусмотрено для случая работы с теми приборами, которые дают возможность введения образца через 2 входных канала (только газовые хроматографы). Выбор варианта Front (переднее) или Back (заднее) 146 приводит к показу строк таблицы последовательности и текущего состояния (Currently Running) для работы с указанным входным каналом. Для получения подробной информации о столбцах этой таблицы и о том, как они связаны с информацией, записанной в метод, см. подсказывающее сообщение, выводимое на экран (непосредственно во время работы) в ответ на запрос помощи (Help). Создание программ анализов Воспользуйтесь таблицей последовательности для указания образцов, методов и флаконов, образцы из которых должны последовательно анализироваться. В таблице последовательности сведения о каждом из образцов приводятся в том порядке, в каком образцы будут анализироваться (этими сведениями оговариваются флакон, метод и калибровочная информация для каждого образца). Пользование клавишей Insert Vial Range... (указание диапазона образцов ...) Если много образцов будут анализироваться с использованием того же самого метода, вы можете быстро записать эти образцы в таблицу последовательности с помощью нажатия клавиши Insert Vial Range ... (указание диапазона образцов ...). Благодаря такому нажатию (клавиши, показываемой на экране), копируются название метода; указания номера флакона, числа введений из каждого флакона и (если вы задавали) количества образца, количества внутреннего стандарта, масштабного коэффициента и коэффициента разбавления. Затем, система вводит информацию обо всех флаконах (согласно диапазону образцов) в таблицу последовательности. Пользование клавишей Append Line (добавление строки) Для добавления новой пустой строки в конец таблицы последовательности, выберите клавишу Append Line (добавление строки). Работа с программами анализов Для получения доступа к программам анализов или создания таких программ используется подсказывающее изображение, вызываемое через слово Sequence (программа анализов). Программы анализов могут создаваться и записываться в память таким же образом, как создаются и записываются в память методы. Когда запрашивается запоминание программы анализов, создается файл с дополнительной частью .S. Когда хотите воспользоваться программой анализов или отредактировать ее, для получения доступа используется функция Load Sequence ... (вызов программы анализов ...) из перечня, вызываемого через слово Sequence (программа анализов). 147 Приоритетные образцы Выполнение программы анализов может быть приостановлено после завершения всех операций, предусмотренных текущим методом. Такая приостановка может использоваться для обеспечения анализа приоритетного образца с помощью того же метода или другого метода. После этого, выполнение программы анализов можно возобновить (начиная с образца, при обработке которого выполнение программы было прервано). Указание контрольных образцов при составлении программ анализов В поле Sample Type (тип образца) таблицы последовательности может быть введено указание контрольных образцов (Control Sample). В методе, используемом для анализа контрольного образца, должна иметься калибровочная таблица, в которой указан допуск для одного из веществ, содержащихся в контрольном образце. Если (в ходе анализа) обнаруживается выход за поле допуска, выполнение программы анализов прекращается и в протокольный журнал записывается соответствующее сообщение. Если вы пользуетесь одним из предусмотренных системой ChemStation форматов сообщения результатов, в сообщении итогов проведенных анализов указываются допуски, заданные для контрольных образцов. Для получения более подробной информации о том, как составлять программы анализов с указанием контрольных образцов, см. подсказывающую информацию, выводимую на экран в ответ на запрос функции How To (как сделать), выбираемую из перечня, вызываемого на экран через слово Help (запрос помощи). Прекращение выполнения программы анализов подачей команды остановки (Stop) После подачи команды остановки (Stop), будет завершен уже начатый анализ. После такой остановки, возобновить выполнение программы анализов никогда не удастся. Отказ от выполнения программы анализов (с помощью функции Abort) Функция Abort (отказ) немедленно прекращает выполнение текущей программы анализов. Приостановка выполнения программы анализов Во время приостановки выполнения программы анализов, названия файлов, записанные в таблицу последовательности (Sequence Table), и названия файлов данных не могут быть изменены. В таблице последовательности можно лишь изменять строки, которые еще не были отработаны, или можно изменить номер флакона в текущей строке последовательности. Вы можете добавить, стереть или изменить строки последовательности, относящиеся к еще не выполненным анализам. 148 Например, может понадобиться отредактировать текущую программу анализов в целях добавления новой группы образцов. Вы можете изменить записи так, чтобы флаконы с этими образцами начали обрабатываться системой ChemStation после завершения работы с образцами, предусмотренными текущей отрабатываемой строкой последовательности. Частичное выполнение программы анализов Уже составленная таблица последовательности (Sequence Table) может быть отработана частично, для чего выбирают функцию Partial Sequence ... (частичное выполнение программы анализов ...) из перечня, вызываемого через слово Sequence (программа анализов). На экран выводится сектор Partial Sequence (частичное выполнение программы анализов), используемый в режиме диалога. Этот сектор дает возможность выбрать из таблицы индивидуальные образцы, подлежащие анализу. Каждой строкой сектора Partial Sequence (частичное выполнение программы анализов), используемого в режиме диалога, предусматривается одна разгонка. Для каждой разгонки оговорены флакон, метод, файл данных и название образца. Дополнительно, в столбцах Seq Tbl (таблица последовательности) и Calib:RF:RT (калибровка: коэффициент чувствительности: время удерживания [время миграции]) указывается кодированная информация. Для ознакомления с расшифровкой этих кодов, см. подсказывающее сообщение, выводимое на экран (непосредственно в ходе работы) в ответ на запрос помощи (Help). Вы можете запросить распечатку того, что запланировано при частичном выполнении программы анализов; для этого следует воспользоваться имеющейся в секторе клавишей Print (распечатка). Показанный далее сектор Partial Sequence (частичное выполнение программы анализов), используемый в режиме диалога, появляется на экране, когда текущими (действующими) являются метод SimpReg и таблица последовательности, оговоренные в приводимых далее таблицах 14 и 15. Например, может быть отмечена необходимость анализа образцов 1, 2, 4, 5 и 8. Рис. 41. Сектор Partial Sequence (частичное выполнение программы анализов), используемый в режиме диалога. Перевод имеющихся на рисунке надписей (приведен в порядке, совпадающем с порядком расположения строк): 149 Частичное выполнение программы анализов: прибор 1 - газовый хроматограф HP 6890 Выберите строки последовательности, подлежащие отработке. Выбор строки (или отказ от выбора) обеспечиваются нажатием клавиши интервалов Вы- Номер Фла- Метод бор раз- кон гонки Файл Таблиданных ца последовательности Калибровка: коэффициент чувствительности; время удерживания (время миграции) Название образца 1 1 SIMPREG С1F03001 F:03:01 1:01:усреднение: Калибровочная усреднение смесь А 2 1 SIMPREG C1F03002 F:03:02 1:01:усреддение: усреднение 1 SIMPREG С2F03001 F:03:01 2:02: усреднение: уреднение Калибровочная смесь А Калибровочная смесь А 4 2 SIMPREG 002F0301 F:03:01 Образец 1 5 1 SIMPREG С1F04001 F:04:01 1:01:усреднение: Калибровочная усреднение: смесь А 6 1 SIMPREG C1F04002 F:04:02 1:01:усреднение Калибровочная усреднение: смесь А 7 1 SIMPREG С2F04001 F:04:01 2:02:усреднение: усреднение Калибровочная смесь А 8 3 SIMPREG 003F0401 F:04:01 Образец 2 9 1 SIMPREG C1F05001 F:05:01 1:01:усреднение: Калибровочная усреднение: смесь А 10 1 SIMPREG C1F05002 F:05:02 1:01:усреднение: Калибровочная усреднение смесь А 11 1 SIMPREG C2F05001 F:05:01 2:02:усреднение: Калибровочная усреднение смесь А 12 4 SIMPREG 004F0501 F:05:01 13 1 SIMPREG C1F06001 F:06:01 1:01:усреднение: Калибровочная усреднение смесь А 3 Образец 3 150 14 1 SIMPREG C1F06002 F:06:02 1:01:усреднение: Калибровочная усреднение смесь А 15 1 SIMPREG C2F06001 F:06:01 2:02:усреднение: Калибровочная усреднение смесь А 16 1 SIMPREG С2F06001 F:06:01 17 1 SIMPREG C1F07001 F:07:01 1:01:усреднение: Калибровочная усреднение смесь А Контрольный образец ВЫБОР ОТКАЗ ОТ ВЫПОЛНЕНИЕ ОТМЕНА ЗАПРОС РАСПЕЧАТКА ВСЕХ ВЫБОРА ПРОГРАММЫ ПОМОЩИ АНАЛИЗОВ ПРИМЕЧАНИЕ: В показанных здесь столбцах, буквой F обозначается введение через передний входной канал газового хроматографа. (Примечание переводчика) Файл с протоколом выполнения программы анализов Создается специальный файл с протокольной записью того, что происходит во время выполнения программы анализов. Подобное протоколирование выгодно, поскольку дает возможность получить информацию об ошибках, которые обнаружились во время автоматической работы без надзора оператора (например, за ночь). Протокольный файл отличается наличием дополнительной части .log. Этот файл записывается под тот же заголовок, под который записываются данные, приобретаемые в ходе выполнения программы анализов. Что происходит при выполнении программы анализов? • Если аналитическая система оснащена автоматическим пробоотборником, программное обеспечение ChemStation сперва находит образец в автоматическом пробоотборнике (по номеру флакона, указанному в столбце Vial [флакон]). • Прибору передаются параметры, оговоренные в методе. • Отрабатывается макрокоманда, указанная в качестве подлежащей отработке до начала обслуживания разгонки. • Затем, образец вводится в хроматограф или систему для капиллярного электрофореза (вручную или автоматически) 151 • Производится предусмотренная методом оценка данных. Обеспечиваются интегрирование, количественная обработка, формирование сообщения результатов (с использованием макрокоманды, указанной владельцем системы). • Отрабатывается макрокоманда, указанная в качестве подлежащей выполнению после завершения обслуживания разгонки. • Во время всего процесса, система ChemStation прослеживает выполнение последовательности операций в реальном масштабе времени; производит записи в файл, в котором протоколируются события. Рис. 42. Этапы выполнения программы анализов Присвоение названий файлам при выполнении программы анализов Присвоение названий файлам при выполнении программы анализов может обеспечиваться: • автоматически • согласно указаниям, введенным вручную • с использованием приставки и показаний счетчика В каждом случае, вы должны указать подзаголовок, под который должны записываться файлы данных. См. подраздел "Параметры, соответствующие программе анализов (Sequence Parameters)" [стр. 145]. 152 Автоматическое присвоение названий файлам данных при выполнении программы анализов По номерам флаконов с образцами Например, 017-0103.D , где: - первыми 3 цифрами указывается номер флакона (например, 017); - четвертым знаком оказывается разделительная черточка (при работе с жидкостным хроматографом или с системой для капиллярного электрофореза); буквы F (передний канал) или B (задний канал) при работе с газовым хроматографом - пятой и шестой цифрами указывается строка последовательности, которой предусмотрено употребление оговоренного метода (например, 01 для первой строки последовательности); - седьмой и восьмой цифрами обозначается номер введения из этого флакона при пользовании оговоренным методом (например, 03 для третьего введения). Холостые разгонки Например, NV-0499.D , где: NV - без введения (сокращение образовано от английских слов no vial - нет флакона); - разделительный знак -; 0499 - 99-я холостая разгонка, предусмотренная строкой 4 последовательности. Присвоение названий файлом данных при выполнении программы анализов согласно указаниям, введенным вручную Один из столбцов таблицы последовательности имеет заголовок Data File (файл данных). Когда записи в этот столбец ввести не удается, это указывает на то, что уже выбрана схема присвоения названий файлам данных (автоматически или с использованием приставки и показаний счетчика). Если любой текст вписывается в столбец Data File, система ChemStation использует этот текст в качестве названия файла данных при указанной разгонке. Если при присвоении названий вручную в строке запрошено несколько введений из одного и того же флакона, система СhemStation автоматически укорачивает название, введенное владельцем системы, и добавляет к нему номер введения. Таким образом предотвращается возможность употребления одного и того же названия файла при реализации многократных введений. 153 Составление названий из приставки (Prefix) и показаний счетчика (Counter) Если названия файлов данных должны составляться из приставки и показаний счетчика, система ChemStation сама создает название файла для каждого анализа. В случае работы с такими аналитическими приборами, которыми обеспечивается анализ по 2 каналам (например, при работе с газовым хроматографом), система ChemStation создает название файла под каждый канал. Названия файлов данных составляются из указываемой владельцем системы приставки (от 1 до 7 буквенно-числовых знаков) и показаний счетчика (8 знаков минус число знаков, израсходованных под приставку). В показанном ниже примере, TEST - приставка, а 0001 - показание счетчика: TEST0001 Показания счетчика увеличиваются на единицу при каждом создании названия файла данных. Работа системы после завершения выполнения программы анализов Вы можете указать, что должно произойти после того, как завершилось обычное выполнение программы анализов, или если обнаружилась (во время выполнения программы) ошибка. При работе с жидкостным хроматографом, благодаря перечеркиванию квадрата, подтверждающего выбор функции Post-Sequence Cmd/Macro (команда или макрокоманда, подлежащая выполнению после выполнения программы анализов) в секторе Sequence Parameters (параметры, соответствующие программе анализов), вы можете: • запросить перевод системы в состояние STANDBY (дежурный режим), при котором насосы и лампы выключены • запросить перевод системы в состояние LAMPOFF (выключение всех ламп) [только в случае жидкостного хроматографа и системы для капиллярного электрофореза] • запросить перевод системы в состояние PUMPOFF (выключение всех насосов) [только в случае жидкостного хроматографа и системы для капиллярного электрофореза] • воспользоваться макрокомандой SHUTDOWN (макрокоманда, обслуживающая отключение так, как предполагается самой системой автоматически) или отредактировать макрокоманду SHUTDOWN.MAC, чтобы предусмотреть специфичный вариант отработки. Например, вы можете захотеть выключить систему после завершения выполнения программы анализов. Однако, возможны и другие варианты отработки: например, скорость протока может быть установлена на нуль или может начать медленно снижаться. 154 В секторе Sequence Parameters (параметры, соответствующие программе анализов) вы можете указать любую самостоятельно составленную макрокоманду. Для этого, нужно записать ее название в поле Post-Sequence Cmd/Macro (команда или макрокоманда, подлежащая отработке после выполнения программы анализов) и перечеркнуть квадрат, подтверждающий выбор. Отключение из-за того, что прибор не готов (только при обслуживании жидкостного хроматографа и системы для капиллярного электрофореза) Параметром Not Ready Timeout (период до отключения, если система не готова) в секторе Sequence Parameters (параметры, соответствующие программе анализов) задается период времени, в течение которого система будет дожидаться перехода прибора в состояние готовности. После завершения этого периода времени, система отключится. Период ожидания после вызова метода (только при обслуживании жидкостного хроматографа и системы для капиллярного электрофореза) Cектор Sequence Parameters (параметры, соответствующие программе анализов) дает вам возможность указать период ожидания после вызова метода (до первого введения образца согласно этому методу). Введение такой задержки может оказаться выгодным для того, чтобы колонка или капилляр могли быть отрегенерированы до перехода к новым условиям анализа. Автоматическая перекалибровка Часто, калибровку проводят после изменения рабочих условий (например, после замены колонки или капилляра). Автоматическая перекалибровка обычно производится в начале выполнения программы анализов или через регулярные периоды времени во время выполнения программы (предусматривается составляемой программой для того, чтобы компенсировать факторы, влияющие на эксплуатационные характеристики системы). Имеются два варианта программирования автоматической перекалибровки: • Перекалибровка по указанию • Периодическая перекалибровка. Запрос проведения перекалибровок Параметры для перекалибровок, которые должны производиться во время выполнения программы анализов, записываются непосредственно в таблицу последовательности. Этими параметрами указывается, как метод будет перекалибровываться. 155 Параметры для перекалибровки, записываемые в таблицу последовательности Обновление коэффициентов чувствительности и времен удерживания (времен миграции) может обеспечиваться несколькими способами. Командами, используемыми при анализе данных ради внесения данных перекалибровок в калибровочную таблицу являются указание калибровочного уровня, способов обновления коэффициентов чувствительности и обновления времен удерживания (времен миграции). Когда в столбец SampleType (тип образца) вводится запись Calibration (калибровка), становится возможным доступ в следующие столбцы (для редактирования): • Cal Level (калибровочный уровень) • Update RT (обновление времени удерживания) • Update RF (обновление коэффициентов чувствительности) • Interval (периодичность перекалибровки) Записи, которые можно ввести в каждый из этих столбцов, указаны в табл. 14. Таблица 14 Cal Level (калибровочный уровень) Номер уровня в калибровочной таблице (от 1 до 9999) Параметры для перекалибровки, записываемые в таблицу последовательности Update RT (обновление времени удерживания) No Update (без обновления) Update RF (обновление коэффициентов чувствительности) No Update (без обновления) Average (усреднение) Replace (подмена) Average (усреднение) Replace (подмена) Bracket (согласно методу охвата) Delta% (процентная разность) Interval (периодичность перекалибровок) Периодичность перекалибровок: от 1 до 999 Пробел В табл. 14 указаны возможные записи, вводимые в столбцы таблицы последовательности. Без обновления (No Update) Не изменяются ни коэффициенты чувствительности, ни времена удерживания (времена миграции). 156 Подмена (Replace) Ранее имевшиеся данные об отклике (о площадях или высотах пиков) заменяются полученными в ходе текущей разгонки. Для любого пика, не обнаруженного при этой калибровочной разгонке, сведения об отклике не изменяются. Усреднение (Average) Данные об отклике (о площадях или высотах пиков) для каждого пика, зарегистрированные при исходной калибровочной разгонке, усредняются с учетом новой приобретенной информации. Такое усреднение обеспечивается при всех последующих перекалибровках. Если пика при одной из перекалибровок не обнаруживается, на усредненном коэффициенте чувствительности для этого пика такое обстоятельство не сказывается. Метод охвата (Bracket) Калибровки проводятся перед анализом образцов и после такого анализа. Оценка данных производится уже после того, как проведена последняя калибровочная разгонка, предусмотренная методом охвата. При обеспечении первой же калибровки, выполняемой до анализа образцов, существующие калибровочные данные заменяются новыми. После проведения последней калибровки (производимой после анализа образцов), калибровочные результаты (записываемые в калибровочную таблицу) усредняются. Периодичность перекалибровок (Interval) Этим параметром определяется частота перекалибровок, производимых во время выполнения программы анализов. Указывается число введений образца перед очередной калибровочной разгонкой. В начале серии анализов, производится калибровка и ее результаты (коэффициенты чувствительности) записываются в калибровочную таблицу. Эти данные употребляются при последующих количественных подсчетах. После выполнения указанного числа анализов образцов, производится очередная калибровка. Получаемые при ней результаты вводятся в калибровочную таблицу (подменяют итоги предыдущей калибровочной разгонки). Процентная разность (Delta%) Подсчет процентной разности дает возможность сопоставить те коэффициенты чувствительности, которые были получены при анализе, с коэффициентами чувствительности, вписанными в калибровочную таблицу вручную. После такого вычисления, процентная разность становится действующей для всех прокалиброванных пиков (имеющихся в калибровочной таблице). Вы можете указать несколько внутренних стандартов; после этого, по соответствующим им коэффициентам чувствительности будет обеспечено вычисление новых коэффициентов чувствительности для остальных пиков. 157 Непосредственно в калибровочной таблице указывают по каким внутренним стандартом следует подсчитать процентную разность (delta%). Типы программ анализов Предусмотрены следующие типы программ анализов: • Программы анализов с перекалибровкой по указанию • Программы анализов с 1-уровневой калибровкой по указанию • Программы анализов с периодической многоуровневой перекалибровкой • Программы анализов с калибровкой по указанию и периодической перекалибровкой • Программы анализов с периодической перекалибровкой, выполняемой согласно методу охвата Программы анализов с перекалибровкой по указанию Перекалибровки выполняются по расписанию, вводимому в таблицу последовательности. Для выполнения программы анализов с перекалибровкой по указанию, калибровочные образцы называются без указания периодичности перекалибровки (Interval) в записанной в метод таблице последовательных перекалибровок. Перекалибровка производится однократно для каждой записи калибровочного образца в таблице последовательности. Программы анализов с периодической 1-уровневой перекалибровкой При выполнении такой программы анализов, калибровочный образец вводится из одного и того же флакона (после того, как выполнен анализ указанного количества образцов). Частота перекалибровок определяется параметром Interval (периодичность перекалибровок), записанным в таблицу последовательных перекалибровок. Например, указание значения 2 для параметра Interval означает, что перекалибровка (при выполнении программы анализов) будет производиться после анализа каждых двух образцов. Программы анализов с периодической многоуровневой перекалибровкой Этим типом программы анализов используются различные калибровочные образцы для реализации перекалибровки согласно многоуровневому методу. 158 Рассмотренный далее пример иллюстрирует программу анализов, использующую 2 метода (метод А и метод В) для анализа двух групп образцов. Оба метода предусматривают выполнение периодической многоуровневой калибровки (автоматической перекалибровки после указанного числа образцов). Для каждого метода, в таблицу последовательности (Sequence Table) сделано три записи: • два калибровочных уровня в строках 1 и 2 последовательности (в строках с указанием метода А) в строках 8 и 9 последовательности (в строках с указанием метода В) • пять записей, указывающих образцы в строках 3 - 7 последовательности (для метода А) в строках 10 - 14 последовательности (для метода В) Периодичность перекалибровок задана с помощью параметра Interval (периодичность перекалибровок). • Методом А предусмотрена перекалибровка после анализа каждых 2 образцов. • Методом В предусмотрена перекалибровка после анализа каждых 3 образцов. Приведенная далее таблица последовательности укорочена для упрощения рассмотрения. Таблица 15 Таблица последовательности для метода А и метода В Строка (Line) Флакон (Vial) 1 Название образца (Sample Name) Название метода (Method Name) Число введений из каждого флакона (Inj/Vial) 1 Метод А (Method A) 1 2 2 Метод А 1 3 4 5 6 7 8 10 11 12 13 14 3 Метод А Метод А Метод А Метод А Метод А Метод В 1 1 1 1 1 1 Тип образца (Sample Type) Калибровка (Calibration) Калибровка Калибровка Уровень калибровки (Cal Level) 1 2 1 Обновление коэффициентов чувствительности (Update RF) Усреднение (Average) Усреднение Усреднение Обновление времен удерживания (Update RT) Периодич-ность перекалибровок (Interval) .... Без обновления (No update) 2 .... Без обновления 2 ..... 3 ..... .... ..... ..... .... ..... Без обновления 159 9 5 Метод В 2 10 11 12 13 14 20 21 22 23 24 Метод В Метод В Метод В Метод В Метод В 1 1 1 1 1 Калибровка 2 Усреднение Без обновления 3 ..... .... ..... ..... ..... ..... Порядок выполнения анализов соответственно методу А В этом подразделе описывается порядок анализов соответственно методу А (т.е. первая часть последовательности, предусматривающей пользование 2 методами). Таблица 16 № введения 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Порядок выполнения анализов соответственно методу А Метод Флакон Что делается Метод А Метод А Метод А Метод А Метод А Метод А Метод А Метод А Метод А Метод А Метод А 1 2 10 11 1 2 12 13 1 2 14 Калибровка по уровню 1 и вывод сообщения результатов Калибровка по уровню 2 и вывод сообщения результатов Анализ образца и вывод сообщения результатов Анализ образца и вывод сообщения результатов Калибровка по уровню 1 и вывод сообщения результатов Калибровка по уровню 2 и вывод сообщения результатов Анализ образца и вывод сообщения результатов Анализ образца и вывод сообщения результатов Калибровка по уровню 1 и вывод сообщения результатов Калибровка по уровню 2 и вывод сообщения результатов Анализ образца и вывод сообщения результатов Порядок выполнения анализов соответственно методу В В этом подразделе описывается порядок анализов соответственно методу В (т.е. вторая часть последовательности, предусматривающей пользование 2 методами). Метод В характеризуется следующими отличиями от метода А: • Для калибровочного уровня 2 предусматриваются два введения из флакона • Периодичностью перекалибровки предусмотрено проведение перекалибровки после анализа каждых 3 образцов См. таблицу 17, приведенную на следующей странице. Обратите внимание на то, что выполнение всего запрошенного таблицами 16 и 17 может быть обеспечено (после составления таблицы последовательности) в режиме частичного 160 выполнения программы анализов (Partial Sequence) для проверки порядка выполнения операций. Таблица 17 № введения 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Порядок выполнения анализов соответственно методу В Метод Флакон Что делается Метод В Метод В Метод В Метод В Метод В Метод В Метод В Метод В Метод В Метод В Метод В 3 5 5 20 21 22 3 5 5 23 24 Калибровка по уровню 1 и вывод сообщения результатов Калибровка по уровню 2 и вывод сообщения результатов Калибровка по уровню 2 и вывод сообщения результатов Анализ образца и вывод сообщения результатов Анализ образца и вывод сообщения результатов Анализ образца и вывод сообщения результатов Калибровка по уровню 1 и вывод сообщения результатов Калибровка по уровню 2 и вывод сообщения результатов Калибровка по уровню 2 и вывод сообщения результатов Анализ образца и вывод сообщения результатов Анализ образца и вывод сообщения результатов Программа анализов с перекалибровкой по указанию и с периодической перекалибровкой В такой программе анализов объединены 2 вида перекалибровок. Это сочетание дает возможность полностью перекалибровать метод в начале выполнения программы анализов (благодаря перекалибровке по указанию), после чего периодически обновлять калибровочную информацию в ходе выполнения серии анализов. • Должны быть указаны две строки калибровки для каждого калибровочного уровня в составленной под метод таблице последовательности (Sequence Table). Одна строка калибровки используется для записи информации, соответствующей перекалибровке по указанию, вторая строка калибровки - для записи, соответствующей периодической перекалибровке. • В таблице последовательности (Sequence Table) должны иметься записи в каждой cтроке калибровки; все флаконы, употребляемые для периодической перекалибровки, должны быть оговорены перед записями, с помощью которых запрашиваются калибровка по указанию и анализ образцов. Пример Рассматриваемым примером предусматривается использование метода с 1-уровневой калибровкой (методу присвоено названием SimpReg). 161 Таблица последовательности для метода SimpReg, предусматривающего 1-уровневую калибровку, показана на следующей странице. Таблица укорочена для упрощения рассмотрения. Таблица 18 Таблица последовательности для метода SIMPREG 1 1 SimpReg 1 2 1 SimpReg 1 3 4 5 6 7 2 3 4 5 6 SimpReg SimpReg SimpReg SimpReg SimpReg 1 1 1 1 1 Калибровка (Calibration) Калибровка 1 Усреднение (Average) Подмена (Replace) Усреднение (Average) Подмена (Replace) 3 .... .... .... .... .... .... .... .... В таблице имеются 2 записи для одного калибровочного уровня. • Первая калибровочная строка составлена для того же самого уровня, но предусматривает усреднение калибровочных данных. Указывается, что перекалибровка должна выполняться после анализа каждых 3 образцов. • Второй записью запрашивается подмена всех калибровочных данных (т.е. выполнение всей калибровки заново). Указания периодичности переклибровки нет. Таблица последовательности (Sequence Table) Таблица последовательности составлена из 7 строк. В первой строке указана смесь стандартов, используемая для периодической перекалибровки. Второй строкой оговаривается, что перекалибровка по указанию должна выполняться только один раз: в начале выполнения программы анализов. Строками 3 - 7 оговариваются образцы, подлежащие анализу. Очень важен порядок внесения записей в таблицу последовательности. Все записи, соответствующие флаконам, используемым при периодической перекалибровке, должны находиться перед указанием флаконов с образцами или перед записями, сделанными для перекалибровки по указанию. Порядок выполнения анализов по методу SimpReg Таблицей 19 (приведенной на следующей странице) иллюстрируется порядок выполнения анализов по методу SimpReg. 162 Таблица 19 Строка (Line) 2 1 3 3 4 5 6 7 Порядок выполнения анализов по методу SimpReg № введения Метод (Inj No.) (Method) 1 SimpReg 2 SimpReg 3 SimpReg 4 SimpReg 5 SimpReg 6 SimpReg 7 SimpReg 8 SimpReg Флакон (Vial) 1 1 2 3 4 1 5 6 Что происходит Простая калибровка Периодическая перекалибровка Анализ образца Анализ образца Анализ образца Периодическая перекалибровка Анализ образца Анализ образца Программа анализов с периодической перекалибровкой, использующая метод охвата Такая программа обеспечивает анализ одного или нескольких образцов с интерполяцией данных калибровки, дающей возможность более точного учета отклика прибора на время анализа образцов. За счет употребления метода охвата, можно свести к минимуму влияние смещения эксплуатационных характеристик прибора на итоги калибровки. Пример Рассмотрим следующую ситуацию: • Наблюдается постепенное смещение сигнала детектора • Три раза вводятся идентичные 2-компонентные смеси • Два введения считаются введениями калибровочных стандартов; одно введение введением образца • Первое и третье введения соответствуют калибровочным стандартам • Второе введение соответствует анализу образца (см. рис. 43, приведенный на следующей странице) Для получения точного количественного результата, соответствующего второму введению (введению образца), проводится интерполяция результатов анализа 2 калибровочных стандартов (см. рис. 43). Такой подход принято называть методом охвата. 163 Рис. 43. Метод охвата Согласно программе анализов, предусматривающей периодическую перекалибровку и метод охвата, калибровочная таблица создается благодаря усреднению результатов текущей и предыдущей калибровок. После этого, записанные в таблицу сведения учитываются при подсчете количественного содержания веществ в анализируемом образце. Таким образом, обновленные записи в калибровочной таблице соответствуют более точному отображению отклика прибора (сигнала детектора) на время проведения анализа образца. Последовательность работы при пользовании методом охвата • Анализируется содержимое первых флаконов с калибровочными образцами. • Анализируется содержимое флаконов с исследуемыми образцами. • Анализируется содержимое следующих флаконов с калибровочными образцами. • В калибровочной таблице, имеющиеся коэффициенты чувствительности заменяются новыми, представляющими собой результаты усреднения последних и ранее выполненных калибровочных разгонок. • Подсчитывается содержание веществ в исследуемых образцах. Выводятся сообщения результатов. • Если должны быть проанализированы еще какие-то образцы, выполнение программы анализов возобновляется со второго этапа (указанного выше). 164 Пример Далее рассматривается пример программы анализов, использующей метод охвата. Анализ производится с употреблением одного метода, предусматривающего 2-уровневую периодическую перекалибровку и подсчет соответственно внутреннему стандарту (этому методу присвоено название Brack.M). Таблица последовательности (Sequence Table) Таблица последовательности, предусматривающая пользование методом Brack.M, укорочена для упрощения рассмотрения. В таблице имеются 7 строк. В первых двух строках указываются условия перекалибровки для каждого уровня. В остальных строках оговариваются подлежащие анализу образцы. В таблице последовательности, составленной под метод Brack.M, имеются: • Запись Bracket (метод охвата) в столбце Update Response (обновление отклика); этой записью указывается, что перед анализом образцов и после такого анализа должны выполняться калибровочные разгонки (т.е. должен быть реализован метод охвата) • Запись Replace (замена) в столбце Update Retention/Migration Times (обновление времен удерживания или времен миграции); этой записью оговаривается необходимость замены времен удерживания или времен миграции • Число 3 в столбце Interval (периодичность перекалибровки); таким образом запрашивается перекалибровка после анализа каждых трех образцов. Таблица 20 Таблица последовательности, соответствующая методу Brack.M 1 1 Brack 1 2 3 4 5 6 7 2 10 11 12 13 14 Brack Brack Brack Brack Brack Brack 1 1 1 1 1 1 Калибровка (Calibration) Калибровка 1 2 Метод охвата (Bracket) Метод охвата Подмена (Replace) Подмена 3 .... 3 .... .... .... .... .... .... 165 Порядок выполнения анализов при пользовании методом охвата Уровень (Level) Обновление коэффициента чувствительности (Upd RF) Обновление времен удерживания (Upd Ret) Что происходит 1 Название файла данных (DataFile Name) C1-03001.d 1 R R Brack.M 1 C1-03002.d 1 A R 3 Brack.M 2 C2-03001.d 2 R R 4 Brack.M 2 C2-03002.d 2 A R 5 Brack.M 10 010-0301/d 6 Brack.M 11 011-0301.d 7 Brack.M 12 012-0301.d 8 9 10 11 Brack.M Brack.M Brack.M Brack.M 1 1 2 2 C1-03003.d C1-03004.d C2-03003.d C2-03004.d 1 1 2 2 A A A A R R R R C1-03003.d 1 R C1-03004.d 1 A C2-03003.d 2 R C2-03004.d 2 A 1 1 2 2 A A A A C1-03005.d 1 R C1-03006.d 1 A C2-03005.d 2 R C2-03006.d 2 A Сообщение результатов калибровочной разгонки 1 Сообщение результатов калибровочной разгонки 2 Сообщение результатов калибровочной разгонки 3 Сообщение результатов калибровочной разгонки 4 Распечатка калибровочной таблицы Анализ образца, без сообщения результатов Анализ образца, без сообщения результатов Анализ образца, без сообщения результатов Калибровка, без сообщения результатов Калибровка, без сообщения результатов Калибровка, без сообщения результатов Калибровка, без сообщения результатов Распечатка калибровочной таблицы Сообщение итогов анализа образца (разгонка № 5) Сообщение итогов анализа образца (разгонка № 6) Сообщение итогов анализа образца (разгонка № 7) Сообщение итогов калибровки (разгонка № 8) Сообщение итогов калибровки (разгонка № 9) Сообщение итогов калибровки (разгонка № 10) Сообщение итогов калибровки (разгонка № 11) Анализ образца, без сообщения результатов Анализ образца, без сообщения результатов Калибровка, без сообщения результатов Калибровка, без сообщения результатов Калибровка, без сообщения результатов Калибровка, без сообщения результатов Распечатка калибровочной таблицы Сообщение итогов анализа образца (разгонка № 12) Сообщение итогов анализа образца (разгонка № 13) Сообщение итогов калибровки (разгонка № 14) Сообщение итогов калибровки (разгонка № 15) Сообщение итогов калибровки (разгонка № 16) Сообщение итогов калибровки (разгонка № 17) Номер разгонки (Run No.) Название метода (Method Name) Номер флакона (Vial No.) 1 Brack.M 2 010-0301d 011-0301.d 012-0301.d 12 Brack.M 13 013-0301.d 13 Brack.M 14 014-0301.d 14 15 16 17 Brack.M Brack.M Brack.M Brack.M 1 1 2 2 C1-03005.d C1-03006.d C2-03005.d C2-03006.d 013-0301.d 014-0301.d Где: А – усреднение; R - подмена R R R R 166 Программа анализов с периодической перекалибровкой при работе с многими флаконами, в которые залит тот же самый раствор смеси стандартов Программа анализов, предусматривающая периодическую перекалибровку при пользовании калибровочными стандартами под большие серии сличительных анализов При выполнении большой серии анализов, требующих проведения автоматической перекалибровки после анализа определенного числа образцов, существует потенциальный риск остаться с опустошенным флаконом (в котором раньше находилась калибровочная смесь) во время продолжения работ с образцами. Предусмотренная системой ChemStation таблица последовательности дает возможность пользоваться целым рядом флаконов, содержащих тот же самый раствор стандарта, во время реализации программы анализов большого количества образцов (например, во время сличительных анализов). Благодаря такой возможности, можно исследовать серии многочисленных образцов с выполнением периодических перекалибровок после истечения определенных периодов времени (под каждый калибровочный уровень отводится целый ряд флаконов; жидкость из калибровочных флаконов расходуется в той же самой степени). За счет предназначения соответствующего числа калибровочных флаконов можно даже обеспечить однократное введение калибровочной смеси из каждого флакона. Соблюдение такого требования оказывается важным в тех случаях, когда при каждой перекалибровке приходится пользоваться свежей калибровочной смесью веществ (например, из-за того, что интересующие вещества способны испаряться после первого же прокола прокладки или же начинают разрушаться после вступления в контакт со стальной иглой). В приводимом далее тексте обсуждается способ заполнения таблицы последовательности (таблицы, которой пользуется система ChemStation) для удовлетворения этих требований. Определите необходимое суммарное число калибровочных флаконов для каждого уровня (учтя расход калибровочных стандартов в ходе реализации всей серии анализов). Отведите отдельную строку, предусматривающую периодическую калибровку, под каждый калибровочный флакон. Строки, соответствующие одному и тому же калибровочному уровню, должны быть в таблице соседними (отведенные под флаконы гнезда тоже должны оказываться соседними). Для всех соответствующих калибровке строк укажите одинаковую периодичность перекалибровки. Например, программой анализов может предусматриваться перекалибровка после введения каждых 6 образцов. Ниже описан порядок выполнения операций, предусмотренных этой таблицей: • Введение из флакона 1 (калибровочный стандарт Cal1a) • Введение из флакона 5 (калибровочный стандарт Cal2a) • 6 введений образца из флакона 10 (образец 10) • Введение из флакона 2 (калибровочный стандарт Cal1b) 167 • Введение из флакона 6 (калибровочный стандарт Cal2b) • 6 введений образца из флакона 11 (образец 11) • Введение из флакона 3 (калибровочный стандарт Cal1c) • Введение из флакона 7 (калибровочный стандарт Cal2c) • 6 введений образца из флакона 12 (образец 12) • Введение из флакона 1 (калибровочный стандарт Cal1a) • Введение из флакона 5 (калибровочный стандарт Cal2a) • 6 введений образца из флакона 13 (образец 13) • Введение из флакона 2 (калибровочный стандарт Cal1b) • Введение из флакона 6 (калибровочный стандарт Cal2b) • и т.д. Таблица 21 Последовательность периодической перекалибровки с распределением 3 флаконов под каждый уровень № флакона (Vial No.) Название образца (Sample Name) Тип образца (Sample Type) Название метода (Method Name) Число введений (No. Of In.) Уровень (Lvl) Обновление времен удерживания (Upd RT) Обновление коэффициента чувствительности (Upd Rf) Периодичность перекалибровок (Interval) 1 Cal1a Calib 1 1 Avg Avg 6 2 Cal1b Calib 1 1 Avg Avg 6 3 Cal1c Calib 1 1 Avg Avg 6 5 Cal2a Calib 1 2 Avg Avg 6 6 Cal2b Calib 1 2 Avg Avg 6 7 Cal2c Calib 1 2 Avg Avg 6 10 Sample 10 Sample 11 Sample 12 Sample 13 Sample 14 Sample Method A Method A Method A Method A Method A Method A Method A Method A Method A Method A Method A 11 12 13 14 Sample Sample Sample Sample 6 6 6 6 6 168 В таблице использованы следующие сокращения и английские слова: Calib – калибровочный стандарт; Avg – усреднение; Sample – образец Периодическая перекалибровка с введением калибровочного образца каждый раз из нового флакона Чтобы из каждого калибровочного флакона введение производилось лишь один раз, программой анализов должно быть названо достаточное количество разных калибровочных флаконов (чтобы не использовался оговоренный в рассмотренном выше примере последовательный возврат к флаконам, из которых стандарт уже вводился). Если программой анализов предусматривается анализ 80 образцов, а перекалибровка требуется после введения каждых 10 образцов, в таблице последовательности должно иметься 80/10+1=9 строк для каждого уровня. Как и в рассмотренном ранее примере, калибровочные строки в таблице последовательности должны быть соседними и должны ссылаться на соседние гнезда с флаконами. Программа анализа, реализующая метод охвата и оговаривающая введение калибровочных стандартов из разных флаконов (из одного флакона перед анализом образца и из другого флакона после завершения этого анализа) Такими же возможностями можно воспользоваться при составлении программ анализов, реализующих метод охвата. Следует указать калибровочные флаконы таким образом, чтобы перед переходом к анализу образца и после завершения анализа образца введение калибровочных стандартов производилось из разных флаконов. В этом случае тоже калибровочные строки в таблице последовательности должны быть соседними и должны ссылаться на соседние гнезда с флаконами. Суммарное количество калибровочных флаконов для каждого уровня и число перекалибровок, необходимых для выполнения программы анализов, зависят от того, должен ли производиться сличительный анализ или должно ли обеспечиваться лишь однократное введение из каждого калибровочного флакона. Далее рассматривается пример, соответствующий анализу 3 образцов с употреблением метода охвата. Перед анализом образца калибровочный стандарт вводится из одного флакона; после анализа образца - из другого флакона. Перекалибровки необходимы после каждого введения образца, поэтому периодичность перекалибровок равна единице. Число калибровочных строк на уровень на единицу больше числа образцов. 169 Таблица 22 Метод охвата; введение калибровочного стандарта перед анализом образца из одного флакона, после анализа образца - из другого флакона № флакона (Vial No.) Название образца (Sample Name) Тип образца (Sample Type) Название метода (Method Name) Число введений (No. Of Inj.) Уровень (Lvl) Обновление времен удерживания (Upd RT) Обновление коэффициента чувствительности (Upd Rf) Периодичность перекалибровок (Interval) 1 Cal1a Calib 1 1 Brkt Brkt 1 2 Cal1b Calib 1 1 Brkt Brkt 1 3 Cal1c Calib 1 1 Brkt Brkt 1 4 Cal1d Calib 1 1 Brkt Brkt 1 10 Sample 10 Sample 11 Sample 12 Sample Method A Method A Method A Method A Method A Method A Method A 11 12 Sample Sample 1 1 1 В таблице использованы следующие сокращения и английские слова: Calib – калибровочный стандарт; Brkt – метод охвата; Sample – образец Ниже описан порядок выполнения операций, предусмотренных этой таблицей: • Введение из флакона 1 (калибровочный стандарт Cal1a); производится перед анализом первого образца • Введение из флакона 10 (образец 10) • Введение из флакона 2 (калибровочный стандарт Cal1b); производится после анализа первого образца (перед анализом второго образца) • Введение из флакона 11 (образец 11) • Введение из флакона 3 (калибровочный стандарт Cal1с); производится после анализа второго образца (перед анализом третьего образца) • Введение из флакона 12 (образец 12) • Введение из флакона 4 (калибровочный стандарт Cal1d); производится после анализа третьего образца 170 Раздел 11. Быстрый просмотр результатов анализа серии образцов В этом разделе рассматривается следующее: • Цель просмотра результатов анализа серии образцов • Указание серии образцов • Функции, способствующие просмотру результатов • Сообщение итогов просмотра результатов анализа серии образцов Цель просмотра результатов анализа серии образцов Возможность просмотра результатов анализа серии образцов (пока проведение анализов еще продолжается) создана для того, чтобы владелец системы мог провести "первый просмотр" итогов выполнения программы анализов; легко и быстро выбрав интересующие разгонки. Это позволяет сэкономить время (особенно при обработке очень больших количеств образцов). Всякий раз, при выполнении программы последовательности анализов, автоматически создается групповой файл (с дополнительной частью .b), помещаемый под тот же заголовок, под который записываются и файлы данных. В этом групповом файле имеются указатели заложенных в него файлов данных. После вызова группового файла, владельцу системы нужно только выбрать подходящий метод анализа, после чего индивидуально выбрать интересующие файлы данных (подлежащие групповому просмотру). Перед одобрением полученных результатов, можно проверить точность калибровки, эксплуатационную эффективность прибора и индивидуальные параметры, определяющие режим интегрирования. Любые из таких параметров (определяющих режим интегрирования), специфичные для хроматограмм (или электрофореграмм) и подвергнутые изменению, могут быть запомнены непосредственно с файлом данных (ради обеспечения возможности проследить то, что было сделано). Возможность такого общения владельца с системой ChemStation предусматривает обеспечение полного доступа и к другим средствам анализа собранной информации (таким, как проверка чистоты пика, проведение библиотечного поиска и т.д.). При просмотре результатов анализа серии образцов используются те же самые регистры (ChromReg и ChromRes), что и при обычном анализе данных. Поэтому, пока система выполняет заданную программу анализов, просмотр не может производиться в реальном масштабе времени (т.е. приходится переходить к режиму работы с отключенным прибором [к режиму off-line]). Указание серии образцов Выбираемая владельцем системы серия файлов данных подвергается анализу с помощью метода (тоже выбранного владельцем системы). Все входящие в серию файлы анализируются с помощью одного и того же метода. Каждый раз, когда для просмотра 171 вызывается новый файл, могут быть выбраны интересующие этапы обработки (интегрирование, качественный или количественный анализ, вывод сообщения результатов). Все калибровочные разгонки, вошедшие в групповой файл, используются для получения одиночной калибровочной таблицы, которая (затем) позволяет выполнить количественный анализ. Таблица содержимого группового файла (Batch Table) Файлы данных указываются в таблице, вид которой может быть определен самим владельцем системы. • Может быть указано число и содержимое столбцов таблицы • Файлы данных могут быть рассортированы по номеру разгонки (согласно порядку их накопления), независимо от любых других критериев типу образцов (сперва контрольные образцы; затем - калибровочные стандарты; после этого - обычные образцы); подразделенные типы образцов затем сортируются по номеру разгонки использованному методу (если при накоплении файлов данных пользовались несколькими методами); подразделенные типы образцов затем сортируются по номеру разгонки • Типы образцов (исследуемые образцы, калибровочные стандарты и контрольные образцы) могут в таблице указываться, или от такого указания можно отказаться Под каждую выбранную разгонку в таблице содержимого группового файла отводится отдельная строка. Вы можете убрать указание конкретного файла данных из таблицы, для чего нужно записать в соответствующую строку слово Removed (удален) вместо указания типа образца. Таблица веществ (Compound Table) Результаты (обнаруженные вещества) указываются в таблице веществ, вид которой может быть определен самим владельцем системы. Однако содержимое этой таблицы зависит от типа образцов, имеющихся в таблице содержимого группового файла. • В перечне веществ указываются все вещества, найденные согласно методу, вызванному для просмотра результатов анализа серии образцов • Если в таблице содержимого группового файла указываются только калибровочные стандарты (образцы и контрольные образцы из этой таблицы удалены), в таблице веществ показываются дополнительные столбцы со сведениями, имеющими отношение к калибровке (ожидаемые количества, относительная ошибка и абсолютная ошибка) 172 • Если в таблице содержимого группового файла указываются только контрольные образцы (исследуемые образцы и калибровочные стандарты из этой таблицы удалены), в таблице веществ показываются дополнительные столбцы со сведениями о любых установленных требованиях к контрольным образцам Применительно к столбцам, содержащим сведения о конкретных веществах, вы можете включить в таблицу (непосредственно в ее заголовок) указания названий веществ (для чего нужно добавить запись %s при оговорке содержимого столбца). Сообщение результатов анализа серии образцов В сообщении результатов анализа серии образцов имеются 2 таблицы, по существу аналогичные таблице содержимого группового файла и таблице веществ. Вид этих таблиц может быть определен самим владельцем системы. Применительно к столбцам, содержащим сведения о конкретных веществах, вы можете включить в таблицу (непосредственно в ее заголовок) указания названий веществ (для чего нужно добавить запись %s при оговорке содержимого столбца). Дозволено пользование заголовками, состоящими из нескольких строк (вы вводите знак "|" в том месте, где хотите произвести разбивку на разные строки). Изображение, способствующее общению системы ChemStation с ее владельцем Просмотру результатов анализа серии образцов способствуют два изображения: • Стандартное изображение, в котором имеется планка с клавишами (на клавишах надписано большинство функций, выбираемых из перечня, вызываемого через слово Batch [просмотр результатов анализа серии образцов]); кроме того, имеются таблица содержимого группового файла и таблица веществ. • Укороченное изображение, в котором имеется планка с клавишами (похожая на типичную для стандартного изображения; однако, таблицы содержимого группового файла и таблицы веществ подменены объединенным сектором, в котором содержится только информация, указанная в таблице содержимого группового файла. В таком укороченном изображении нет клавиш, имеющих отношение к таблице содержимого группового файла и таблице веществ. Функции, способствующие просмотру результатов С содержимым файлов данных можно ознакомиться двумя способами: • Благодаря выбору интересующего файла (из таблицы) вручную 173 • Автоматически (переход от одного файла данных к другому обеспечивается через заведомо указанный период времени). При пользовании автоматическим режимом, показывается информация только о тех типах образцов, которые указаны в таблице. Результаты разгонок выводятся на экран в порядке, соответствующем порядку записи в таблице. Автоматическую смену можно приостановить, после чего возобновить или отказаться от нее вовсе. При просмотре результатов анализа серии образцов можно пользоваться стандартными функциями, предусмотренными системой ChemStation. К таким функциям относятся калибровка, управление обработкой хроматограмм вручную (например, сглаживание или указание параметров, соответствующих интегрированию, вручную). Любые изменения, введенные в файл данных, могут быть зафиксированы и записаны в память (в тот же групповой файл). Хроматограммы (электрофореграммы), вид которых оказался измененным, оказываются помеченными (в таблице содержимого группового файла) звездочкой. Кроме того, вам предоставляется возможность отказаться от изменений, которым подверглась только текущая хроматограмма (электрофореграмма), или от изменений, внесенных во все хроматограммы (электрофореграммы), записанные в групповой файл. Когда вызван файл с записью результатов разгонки, он подвергается выбранным вариантам обработки. Если хроматограмма (электрофореграмма) была уже обработана (результаты ее подсчитаны и записаны в память), вызываются уже результаты обработки. В этом случае, процесс вывода для представления на экране реализуется более быстро (чем вывод данных, не подвергавшихся обработке), поскольку не требуется затрат времени на обработку. Сообщение итогов просмотра результатов анализа серии образцов Таблица содержимого группового файла (Batch Table; см. стр. 171) может быть выведена на распечатку (на печатающее устройство). Кроме того, она может быть выведена на экран или записана в файл (в названии которого используется приставка, указываемая владельцем системы). При записи в файл используется один из следующих форматов: • Текстовый файл (с дополнительной частью .TXT); создается с использованием стандартного американского кода для обмена информацией (ASCII) • С использованием формата DIF (формат для обмена данными). Название такого файла отличается наличием дополнительной части .DIF • С использованием формата CSV (значения, разделенные запятой). Название такого файла имеет дополнительную часть .CSV • С использованием формата, предусмотренного программным обеспечением Microsoft Excel. Название такого файла отличается наличием дополнительной части .XLS При выборе варианта вывода сообщения результатов предоставляется возможность сортировки образцов (по номеру разгонки, по типу образцов, по используемым методам). Сортировка производится независимо от метода сортировки, выбранного для представления 174 в таблице содержимого группового файла (таблице Batch Table). При сортировке используются те же приоритеты, описанные в подразделе "Таблица содержимого группового файла (Batch Table)" [см. стр. 171]. Сохранение сведений о пользовании групповым файлом (Batch History) При просмотре результатов анализа серии образцов составляется протокольный файл, в который записываются все (проделанные с текущим групповым файлом) операции (например, изменение вида показываемой хроматограммы [электрофореграммы]; изменение указания типа образца; вызов группового файла и запись этого файла в память). Каждой операции соответствует отдельная строка протокольного файла (с указанием даты, времени суток; фамилии работавшего оператора). Кроме того, вы можете дописать в протокольный файл свои комментарии. Имеющиеся в этом файле сведения о предшествующем пользовании редактированию не поддаются; доступ к файлу обеспечивается только благодаря выбору функции Batch History (сведения о пользовании групповым файлом) из появляющегося на экране перечня. Доступ (к сделанным в файл записям) каким-то другим путем невозможен. Раздел 12. Сообщение результатов В этом разделе рассматривается следующее: • Что представляет собой сообщение? • Сообщения результатов • Сообщения результатов количественного анализа • Виды сообщений результатов • Куда выводится сообщение результатов • Распечатка сообщения сводных данных о выполнении программы анализов Что представляет собой сообщение? Сообщение может содержать количественную и качественную информацию об анализируемом образце. Оно может быть выведено на распечатку, показано в окне или записано в файл. В сообщение могут входить сведения о пиках, обнаруженных в ходе обслуживания разгонки; зарегистрированные хроматограммы или электрофореграммы. 175 Сообщения результатов Существуют два типа сообщения результатов: • Сообщение результатов подсчета, проведенного без калибровки (результаты не скорректированы с учетом коэффициентов чувствительности) • Сообщение результатов подсчета, выполненного после калибровки (результаты скорректированы с учетом коэффициентов чувствительности для разных компонентов образца) Сообщение результатов подсчета, проведенного без калибровки К таким сообщениям относятся сообщения результатов подсчета по проценту площади (Area%) или по проценту высоты (Height%). Эти виды сообщений используются, в основном, для подготовки сообщений результатов подсчета, выполненного после калибровки. Если количества веществ, требуемые для получения единицы отсчета площади или высоты пиков интересующих веществ, одинаковы, такое сообщение (полученное без калибровки) может являться окончательным. Сообщение результатов подсчета, выполненного после калибровки Такие сообщения получают после корректировки с учетом коэффициента чувствительности к регистрируемым веществам. Приходится провести одну или несколько разгонок калибровочных образцов (концентрации веществ в которых известны) при тех же условиях, при которых анализируются исследуемые образцы. Результаты интегрирования хроматограмм (электрофореграмм), полученных при разделении калибровочных образцов, используются для подготовки калибровочной таблицы. Эта таблица содержит перечень времен удерживания (времен миграции), количеств и откликов детектора. Результаты подсчета, выполненного после калибровки, основаны на пользовании двумя подходами к калибровке: калибровке с использованием внешнего стандарта или калибровке с использованием внутреннего стандарта. Сообщение результатов подсчета по методу внешнего стандарта (ESTD) В сообщении результатов подсчета по методу внешнего стандарта, результаты указываются в выбранных вами единицах или в виде процентов от общего содержания всех имеющихся веществ. Метод внешнего стандарта требует, чтобы точно были известны относительные вводимые объемы калибровочных и исследуемых образцов. Надежность метода внешнего стандарта ограничена воспроизводимостью введений образца и любыми другими факторами, которые могут изменяться от образца к образцу. 176 Сообщение результатов подсчета по методу внутреннего стандарта (ISTD) Недостатки подсчета по методу внешнего стандарта могут быть устранены подсчетом по методу внутреннего стандарта. Точно известное (не обязательно то же самое) количество внутреннего стандарта добавляется в калибровочный образец (калибровочные образцы) и исследуемые образцы. Отклик детектора на каждое интересующее вещество делится на отклик на внутренний стандарт (в результате чего получают отношение откликов). Калибровочные графики представляют собой графическое отображение зависимости отношения откликов от отношения количеств. Информация о такой зависимости используется для подсчета сообщаемых результатов. Таким образом, удается избавиться от неизбежных ошибок дозирования вводимого объема и от погрешностей, обусловленных небольшими изменениями в хроматографической системе (или в системе для капиллярного электрофореза). В сообщении результатов подсчета по методу внутреннего стандарта указываются выбранные вами единицы измерений. Сообщение результатов с заполнением контрольных карт При пользовании таким сообщением результатов, прослеживаются результаты многих анализов, полученные для указанного одиночного прокалиброванного вещества. Загрузка программного обеспечения, дающего возможность пользоваться контрольными картами (Control Charts), производится уже после того, как налажена работы системы ChemStation. Методы, предусматривающие пользование контрольными картами, после завершения каждой разгонки переносят прослеживаемый результат в рабочую таблицу, типичную для программного обеспечения Microsoft Excel. Вывод итогового сообщения на печать контролируется программой Microsoft Excel. Результаты количественного анализа Тип подсчета опознается по указанию (в сообщении результатов) названия использованного метода подсчета (например, ISTD - подсчет по методу внутреннего стандарта). Каждый тип кратко рассмотрен далее. Виды подсчета, используемые для получения сообщения результатов, были описаны в разделе 8 ("Количественный анализ"). Подсчет по проценту площади (Area%) дает наиболее простое сообщение результатов; не требуется калибровочных данных (поскольку не производится коэффициентов чувствительности детектора к разным веществам). В частности, подсчет по проценту площади выгоден для создания калибровочной таблицы (получаемыми данными можно пользоваться при выборе и других вариантов сообщения результатов). Такой подход может употребляться при анализе веществ, в ходе которого не наблюдается существенного различия отклика детектора на компоненты образца. Подсчет по проценту высоты (Height%) приводит к результатам, аналогичным получаемым при подсчете по проценту площади (отличие заключается лишь в том, что вместо сведений о площади сообщаются данные о высоте). 177 Нормализационный процентный подсчет (Norm %) дает сообщение результатов, в котором содержание каждого компонента представлено в виде процента от содержания всех зарегистрированных веществ. До подсчета величины, соответствующей каждому пику, используется коэффициент чувствительности. Подсчет по методу внешнего стандарта (ESTD) дает сообщение результатов с указанием фактического количественного содержания каждого вещества с использованием выбранных вами единиц. Количества подсчитывается с помощью предварительно составленной калибровочной таблицы. Для пользования методом внешнего стандарта необходимо, чтобы был известен вводившийся объем калибровочной смеси. Процентный подсчет по методу внешнего стандарта (ESTD%) дает сообщение результатов с указанием относительного содержания каждого вещества в виде процентов от общего количества введенного образца. Количества подсчитывается с помощью предварительно составленной калибровочной таблицы. Для пользования методом внешнего стандарта необходимо, чтобы был известен вводившийся объем калибровочной смеси. Подсчет по методу внутреннего стандарта (ISTD) тоже дает сообщение результатов с указанием фактического количественного содержания каждого вещества. Количества определяются с помощью предварительно полученного калибровочного графика. Пользование внутренним стандартом и в образце, и в калибровочной смеси исключает необходимость точно следить за вводимым объемом образца. Кроме того, исключается и влияние некоторого ухода характеристик прибора при переходе от разгонки к разгонке. Процентный подсчет по методу внутреннего стандарта (ISTD%) дает сообщение результатов с указанием относительного содержания каждого вещества в виде процентов от общего количества введенного образца. Употребление внутреннего стандарта и в образце, и в калибровочной смеси исключает необходимость точно следить за вводимым объемом образца. Кроме того, исключается и влияние некоторого ухода характеристик прибора при переходе от разгонки к разгонке. Виды сообщений результатов (Report Styles) Возможно получение таких сообщений результатов, какие описаны далее. Вы указываете необходимость добавления хроматограммы (или электрофореграммы) к любому виду сообщения результатов благодаря перечеркиванию соответствующего квадрата, подтверждающего выбор, в секторе Specify Report (указание вида сообщения результатов и адреса, по которому оно должно выводиться). None (без текстового сообщения) Текстовое сообщение не печатается. Хроматограмма (электрофореграмма) вводится в сообщение результатов только в том случае, если выбран вариант Add Chromatogram Output (добавление хроматограммы в выводимое сообщение). 178 Краткое (Short) Текстовое сообщение количественных результатов, соответствующих всем проинтегрированным хроматограммам (или электрофореграммам), которые указаны в секторе Signal Details (подробная информация о сигналах) [только при работе с жидкостными хроматографами] или в секторе Signal Dialog (диалог, соответствующий регистрации сигналов) [только при работе с газовым хроматографом]. Подробное (Detail) Содержит заголовок, текстовое сообщение количественных результатов и калибровочные графики. Заголовок хранится в файле с названием RPTHEAD.TXT (файл записан под тот же заголовок, под который записан метод). Вы можете изменить заголовок с помощью редактирующей тексты программы (ради добавления специфичного для метода текста). Заголовок + краткое (Header + Short) Дополнительно к текстовому сообщению количественных результатов распечатывается записанный в файл заголовок. Такой заголовок хранится в файле с названием RPTHEAD.TXT (файле, записанном под тот же заголовок, под который записан файл метода). С помощью программы, редактирующей тексты, можно изменять заголовок (чтобы дописывать нужный текст, соответствующий методу). Данные, соответствующие требованиям GLP, + краткое (GLP + Short) В сообщение результатов входят заголовок, информация об образце, указание условий работы прибора, распечатка протокольных записей, хроматограмма (или электрофореграмма), количественные результаты. Заголовок хранится в файле с названием RPTHEAD.TXT (файле, записанном под тот же заголовок, под который записан файл метода). С помощью программы, редактирующей тексты, можно изменять заголовок (чтобы дописывать нужный текст, соответствующий методу). Данные, соответствующие требованиям GLP, + подробное (GLP + Detail) В сообщение результатов входят заголовок, информация об образце, указание условий работы прибора, распечатка протокольных записей, хроматограмма (или электрофореграмма), количественные результаты и калибровочные графики. Заголовок хранится в файле с названием RPTHEAD.TXT (файле, записанном под тот же заголовок, под который записан файл метода). С помощью программы, редактирующей тексты, можно изменять заголовок (чтобы дописывать нужный текст, соответствующий методу). 179 Полное (Full) В сообщение результатов входят заголовок; информация об образце; указание условий работы прибора; распечатка протокольных записей; хроматограмма (или электрофореграмма); количественные результаты. Заголовок хранится в файле с названием RPTHEAD.TXT (файле, записанном под тот же заголовок, под который записан файл метода). С помощью программы, редактирующей тексты, можно изменять заголовок (чтобы дописывать нужный текст, соответствующий методу). Результаты проверки эксплуатационных характеристик (Performance) Получают сообщение результатов в соответствии с указаниями, введенными в сектор Edit Performance Limits (редактирование допустимых показателей эксплуатационных характеристик), вызываемый через перечень, появляющийся после выбора слов System Suitability (пригодность системы). Для методов, не предусматривающих калибровку, к включаемым в сообщение результатов параметрам относятся номер пика; время удерживания (время миграции); площадь пика; высота пика; описание сигнала; фактическая ширина пика на уровне половины высоты; симметричность; k'; эффективность (число теоретических тарелок); разрешающая способность для каждого пика. В случае методов, предусматривающих калибровку, к включаемым в сообщение результатов параметрам относятся номер пика; время удерживания (время миграции); название вещества; количество; описание сигнала; фактическая ширина пика на уровне половины высоты; симметричность; k'; эффективность (число теоретических тарелок); разрешающая способность для каждого пика. Ширина пика подсчитывается на уровне, соответствующем точкам перегиба кривой пика. Применяется не та формула определения ширины пика, которая обычно предусмотрена интегрирующей системой (для подсчета, в данном случае, используется менее сложная формула). Значения эффективности и разрешающей способности определяются на основе именно этого вычисления ширины. В заголовке сообщения результатов содержится вся соответствующая методу информация (включая параметры, заданные прибору; описание колонки (капилляра), образца; параметры, соответствующие сбору данных). Кроме того, приводится хроматограмма (электрофореграмма). Результаты проверки эксплуатационных характеристик + уровень шума (Performanсe + Noise) Описанные выше сообщение результатов проверки эксплуатационных характеристик объединяется с выводом результатом подсчета уровня шума для диапазонов, оговоренных в секторе Edit Noise Range (редактирование диапазонов для определения шума), вызываемом через перечень, появляющийся после выбора слов System Suitability (пригодность системы). Кроме того, приводятся уровни шума, определяемые по 6-кратному стандартному 180 отклонению, от пика до пика и по методу, предложенному Американским обществом по испытанию материалов; степень ухода и степень блуждания базовой линии. Результаты проверки эксплуатационных характеристик + расширенное сообщение (Performance + Extended) Выводится расширенное сообщение результатов с указанием всех параметров, получаемых в ходе проверки эксплуатационных характеристик, и с индивидуальными графиками для каждого пика. На графиках показаны базовая линия, касательные, варианты определения ширины пика по различным уровням. В этот вариант сообщения включены данные только о прокалиброванных пиках. Помимо параметров, представляющих типичные результаты проверки эксплуатационных характеристик, сообщаются времена "удерживания" (миграции) для начальной и конечной точек пика; перекос; избыточность; ширина пика; показатель затянутости (определяемый соответственно требованиям Фармакопеи США); промежуток времени между точками выборки данных; число точек данных; статистические моменты; число теоретических тарелок; число теоретических тарелок на метр; селективность и разрешающая способность для каждого пика. Ширина пика, число теоретических тарелок, число теоретических тарелок на метр, селективность и разрешающая способность подсчитаны для фактической ширины пика на уровне половины высоты; для ширины пика, соответствующей 5σ; для ширины пика, определенных с помощью касательных и с учетом затянутости пика. В заголовке сообщения результатов содержится вся соответствующая методу информация (включая параметры, заданные прибору; описание колонки (капилляра), образца; параметры, соответствующие сбору данных). Кроме того, приводится хроматограмма (электрофореграмма). Для ознакомления с полным перечнем формул, употребляемых для определения характеризующих пик параметров, см. подраздел "Определения параметров, используемых при оценке эффективности системы" (стр. 196). Виды сообщений результатов со спектральной информацией (краткое + спектрограмма; подробное + спектрограмма; результаты проверки эксплуатационных характеристик + результаты библиотечного поиска) описаны в отдельно изданной Инструкции по загрузке и по освоению вспомогательной части программного обеспечения, соответствующей обработке спектральной информации. Добавление бланка нестандартного сообщения результатов в перечень видов сообщений результатов Вы можете добавить созданный вами бланк нестандартного сообщения результатов (бланк, созданный при пользовании функции Report Layout, выбранной из перечня, вызываемого через слово View [просмотр]) в перечень доступных видов сообщений результатов. ПРИМЕЧАНИЕ: Во всех сообщениях результатов, не относящихся к сообщениям эксплуатационных характеристик (сообщениям с заголовком Performance), ширина пика подсчитывается интегратором по более сложной формуле. Для получения более подробной 181 информации о вычислении ширины пика, см. подраздел «Ширина пиков (Peak Width)» на стр. 71, 72. Прочие параметры, определяющие вид сообщения результатов Таблица, обслуживающая суммирование пиков Для решения конкретных прикладных задач, возникающих на нефтехимических и фармацевтических предприятиях, предусмотрена возможность создания таблицы, обслуживающей суммирование пиков. Реализуются следующие функции: • Суммирование площадей пиков, попадающих в конкретную зону хроматограммы (электрофореграммы), указанную владельцем системы • Суммирование площадей пиков, попадающих в конкретную зону хроматограммы (электрофореграммы), указанную владельцем системы; последующий пересчет суммы (благодаря умножению на один коэффициент) • Суммирование площадей всех пиков, имеющих то же самое название Когда формируется сообщение результатов, система ChemStation пользуется рассматриваемой здесь таблицей для составления сообщения о сумме пиков (это сообщение выводится на печать после сообщения результатов стандартного подсчета; исключением является лишь один случай: результаты процентного подсчета по методу нормализации [Norm %] полностью подменяются сообщением о сумме пиков). Вид сообщения о непрокалиброванных пиках Для изменения вида сообщения о непрокалиброванных пиках, выберите один из рассмотренных ниже вариантов в секторе Specify Report (выбор вида сообщения результатов и адреса, по которому оно должно выводится), используемом в режиме диалога: • Separately (отдельно). Сообщение о непорокалиброванных пиках будет представлено в отдельной таблице (если выбрана сортировка по времени удерживания [времени миграции]) или в отдельных таблицах (когда выбрана сортировка по сигналу). • With Calibrated Peaks (вместе с прокалиброванными пиками). Сообщение о непрокалиброванных пиках будет объединено с сообщением о прокалиброванных пиках. • Do Not Report (сообщения о непрокалиброванных пиках не требуется). Куда выводится сообщение результатов Сообщение результатов может быть выведено: 182 • На экран (Screen) Сообщение (состоящее из текста и графиков) выводится на экран в окне, предназначенном для просмотра перед распечаткой [в окне report preview] (из этого окна возможна распечатка). • На печатающее устройство (Printer) Сообщение (представляющее собой и текст, и графики) распечатывается (на данный момент указанным) печатающим устройством • В файл (File) Сообщение записывается в файл. Когда данные перенесены в файл, возможна их переработка с помощью другой программы (например, Microsoft Windows EXCEL). Форматы файлов сообщений результатов Сообщение результатов может быть записано в память с использованием 4 различных форматов, каждый из которых отличается и дополнительной частью к названию файла. Можно выбрать сразу несколько форматов сообщения результатов. .TXT Текстовое сообщение результатов записывается в файл с использованием стандартного американского кода для обмена информацией (ASCII) .WMF Каждое графическое сообщение результатов (хроматограмма [электрофореграмма] или калибровочный график) записывается в мета-файл (WMF), предусмотренный программным обеспечением Microsoft Windows. Т.е. формат сообщения соответствует стандартному мета-файлу, сведения о котором можно получить в документации по пользованию обеспечением Windows. Возможно использование нескольких файлов .WMF в одном сообщении результатов. Эти файлы совместимы с форматом Aldus Placeable Metafile (APM), используемым рядом пакетов прикладных программ. .DIF Табличная часть сообщения результатов, записанная в память с использованием формата DIF (формат для обмена данными). Этот формат принимается программами, обслуживающими работу с крупномасштабными таблицами (например, программой Microsoft Windows EXCEL). Независимо от выбранного вида сообщения результатов, записана в память будет только информация, соответствующая краткому сообщению (Short). .CSV Это сообщение результатов составляется с использованием формата CSV (значения, разделенные запятой). Такой (очень простой) формат записи табличных данных принимается многими программами, обслуживающими работу с крупномасштабными таблицами, и банками данных. Независимо от выбранного вида сообщения результатов, записана в память будет только информация, соответствующая краткому сообщению (Short). 183 Одиночное сообщение результатов может состоять из нескольких файлов .DIF и .CSV. В каждом блоке сообщений, первый файл (например, REPORT00.CSV содержит информацию, соответствующую заголовку). В последующие файлы записаны табличные результаты. Если результаты отсортированы по времени удерживания (времени миграции), только один файл необходим для составления полной таблицы. Например, файл REPORT01.CSV. Если результаты отсортированы по сигналу, для каждого из сигналов требуется отдельная таблица. В таком случае, названия присваиваются файлам следующим образом: от Report 01.CSV до Report NN.CSV, где NN - номер сигнала. .XLS Сообщение результатов преобразовано в формат, используемый программным обеспечением Microsoft Excel для работы с крупномасштабными таблицами (в формат XLS). Как правило, подобные данные требуют дополнительной обработки. Получение распечатки сообщения сводных данных, полученных при выполнении программы анализов Обзор Система ChemStation может выводить на печать разнообразные сообщения результатов индивидуальных анализов. Дополнительным вариантом сообщения является сообщение сводки данных, полученных при выполнении программы анализов. Этот вариант дает возможность подсчета параметров и получения результатов для целой серии различных анализов. Пользоваться подобными сведениями выгодно (например) для проверки пригодности прибора и надежности нового метода. В распечатку сообщения сводки данных, полученных при выполнении программы анализов, могут входить: • Страница заголовка • Указание конфигурации прибора (включая сообщение номеров программно-аппаратного обеспечения прибора; подробную информацию о применяемой аналитической колонке [капилляре]) • Распечатка таблицы последовательности, в которой описывается очередность автоматизированных анализов • Распечатка протокольного файла, в которой указывается, что фактически предусматривалось программой анализов (включая сообщение о любых неожиданных событиях, отмеченных во время отработки программы анализов) • Распечатка методов 184 • Индивидуальные сообщения результатов для каждого образца • Результаты статистической обработки итогов анализов с использованием выбранных критериев. Статистические данные сообщаются только для прокалиброванных веществ • Оглавление с указанием номеров страниц более подробных частей сообщения результатов Указание вида распечатки сообщения сводных данных, полученных при выполнении программы анализов При указании вида распечатки, вы можете выбрать любое сочетание рассмотренных далее 9 категорий информации благодаря перечеркиванию соответствующих квадратов, подтверждающих выбор, и (когда это уместно) выбрать стиль сообщения результатов из перечня шаблонов (Template). Каждым шаблоном оговаривается содержимое и общий вид конкретной части целой распечатки сообщения сводных данных, накопленных при выполнении программы анализов. Вам предоставляется возможность выбора следующих категорий информации: • Одна страница с заголовком (One Page Header) Соответствующий требованиям GLP шаблон обеспечивает распечатку заголовка GLP (большими буквами) [этот заголовок используется на титульной странице]. Кроме того, указывается дата и оставляется место под подпись. • Указание конфигурации (Configuration) Если вы хотите включить в сообщение указание конфигурации прибора и характеристик аналитической колонки (капилляра), выберите вариант Configuration (конфигурация). • Таблица последовательности (Sequence Table) Для включения (в сообщение результатов) перечня образцов; параметров, используемых при количественном анализе; названий методов, выберите вариант Sequence table (таблица последовательности). Будет приведена программа того, что система должна была сделать. • Протокольные записи (Logbook) Для получения распечатки анализов, выполненных системой (включая указание заданных прибору условий и любых необычных событий, которые были отмечены при анализе образцов), выберите вариант Logbook (протокольный файл). 185 • Методы (Methods) Для получения распечатки перечня методов, использовавшихся при автоматическом выполнении серии анализов, выберите вариант Methods (методы). • Сообщения результатов анализа (Analysis Reports) Для получения распечаток индивидуальных результатов анализов (с использованном стиля распечатки, оговоренного в методе), выберите вариант Analysis reports (сообщения результатов анализа). Помимо включаемых в сводную распечатку, могут быть и распечатки сообщений результатов индивидуальных анализов (выводимые на печать после завершения каждого отдельного анализа; с использованием стиля распечатки, оговоренного в каждом методе). См. подраздел "Куда выводиться сообщение результатов" (стр. 181). • Статистическая информация о калибровочных разгонках и анализах образцов Выбор варианта Statistics cal. runs (статистические результаты для калибровочных разгонок) приведет к получению распечаток статистического анализа тенденций, наблюдавшихся при разгонках калибровочных образцов. Выбор варианта Statistics sample runs (статистические результаты для исследуемых образцов) даст распечатки статистического анализа тенденций, отмечаемых при анализе исследуемых образцов. Для того и другого вариантов имеются шаблоны Standard Statistic (стандартные статистические данные) и Extended Statistics (расширенные статистические данные). Шаблон Extended Statistics предусматривает представление статистических тенденций в виде графиков, а шаблон Standard Statistic - только в виде текстового сообщения. Дополнительные указания, сделанные в секторе Items and Limits for Extended Statistics (позиции и диапазоны для расширенных статистических данных), применимы только в том случае, когда вы выбрали вариант Extended Statistic в секторе Sequence Summary Parameters (параметры для распечатки сообщения сводных данных, полученных при выполнении программы анализов), используемом в режиме диалога. Если вы именно такой выбор и сделали, сообщаются статистические данные о следующих параметрах: ¾ Время удерживания (время миграции) ¾ Площадь ¾ Высота ¾ Количество ¾ Ширина пика на уровне половины высоты ¾ Симметричность 186 При статистических вычислениях не производится подразделения различных калибровочных уровней при выполнении программы анализов, в которой используются методы с многоуровневыми калибровками. Это значит, что зависимые от концентрации позиции (площадь, высота, количество [см. сектор Items and Limits for Extended Statistics (позиции и диапазоны для расширенных статистических данных)] берутся в совокупности, независимо от калибровочного уровня. По этой причине, "статистические данные для калибровочных разгонок" не имеют большого смысла при пользовании многоуровневыми калибровочными методами при автоматической выполнении серии анализов • Сводная информация (Summary) Выбор варианта Summary (сводная информация) обеспечит получение распечатки обзорных данных о проанализированных образцах и использовавшихся методах. Если вариант Summary выбран совместно с другими позициями для распечатки сообщения сводных данных о выполнении программы анализов, будут указаны номера страниц других частей такой распечатки. Возможно получение двух видов распечатки сводной информации (Summary): Шаблоном Sample Summary (сводная информация об образцах) предусматривается вывод таблицы подробных сведений об анализах образцов, выполненных согласно заданной программе (с сообщением таких данных, как название образца, название файла данных, название метода и номера флакона). Шаблоном Compound Summary (сводная информация о веществах) предусматривается вывод таблицы подробных сведений с основными количественными результатами для каждого прокалиброванного вещества (или каждого пика), в зависимости от метода. • Указание того, куда должно выводиться сообщение Указание того, куда должно выводиться сообщение (через сектор Sequеnce Output [указание того, куда должно выводиться сводное сообщение о выполнении программы анализов], определяет адрес. Выбор варианта Report to file (запись сообщения в файл) и указание названия файла приводит к записи в названный файл. Самой системой автоматически предполагается, что данные записываются в файл GLPrprt.txt. При работе с газовыми хроматографами (когда имеется возможность введения образцов через передний и задний входные каналы), информация поступает в файлы GLPrptF.txt (для переднего канала) и GLPrptB.txt (для заднего канала). Выбор варианта Report to printer (вывод сообщения на печатающее устройство) обеспечивает распечатку сообщения печатающим устройством. Выбор варианта Print individual reports for each run (распечатка индивидуальных сообщений результатов каждой разгонки) приводит к распечатке результатов индивидуальных анализов (согласно указаниям, сделанным в методе) после каждого анализа. Эти распечатки окажутся дополнительными к получаемым при распечатке сообщениям сводных данных о выполнении программы анализов (после 187 завершения выполнения всей программы анализов). Вы можете ввести новую информацию о том, куда должны выводиться эти сообщения результатов, в секторе Sequence Output (указание того, куда должно выводиться сообщение о выполнении программы анализов), используемом в режиме диалога, или воспользоваться выводом по адресу, названному в индивидуальных методах. Раздел 13. Оценка пригодности системы Тем, кто продуманно занимается анализом, рекомендовано проводить оценку пригодности аналитического прибора (перед использования его для анализа образцов) и метода анализа (перед началом его рутинного употребления). Кроме того, целесообразно проверять эксплуатационные характеристики аналитических систем перед рутинными анализами и в ходе выполнения таких анализов. Программное обеспечение ChemStation дает возможность автоматического выполнения этих трех типов проверки. Оценка пригодности прибора может сводиться к проверке чувствительности детектора, воспроизводимости времен удерживания (времен миграции) и площадей пиков. Проверка метода может предусматривать оценку точности времен удерживания (времен миграции), определения количеств, селективности, надежности метода при тех отклонениях, которые встречаются при многодневной работе. Проверка пригодности системы может проводиться благодаря исследованию воспроизводимости определяемых количеств, разрешающей способности (по двум специфичным пикам) и степени затянутости пиков. Лаборатории, в которых должны удовлетворяться условия, оговоренные • Требованиями к организации работ в лабораториях (GLP) • Требованиями к организации работ на производстве (GMP) и Действующими правилами организации работ на производстве (cGMP) • Требованиями к автоматизации работ в лаборатории (GALP), вынуждены проводить подобные проверки и тщательно протоколировать их результаты. Например, лаборатории, занятые контролем качества, обязаны соблюдать требования ISO9000, чтобы иметь возможность доказать правильность работы аналитического оборудования. Система ChemStation сравнивает результаты нескольких разгонок и оценивает их статистически (представляя в виде сводного сообщения результатов, накопленных в ходе выполнения программы анализов). Результаты проверок протоколируются с использованием формата, обычно принимаемого поверяющими организациями и независимыми аудиторами. К статистически обрабатываемым параметрам относятся: • Время удерживания пиков (время миграции) • Площадь пиков 188 • Количества • Высота пиков • Ширина пика на уровне половины высоты • Симметричность пика • Затянутость пика • Нагрузочный коэффициент (k') • Число теоретических тарелок • Разрешающая способность (для 2 пиков) • Селективность (относительно предыдущего пика) • Перекос • Избыточность Подсчитываются среднее значение, стандартное отклонение, относительное стандартное отклонение и доверительный интервал. Для каждого из этих параметров вы можете указать дозволенные пределы. Если обнаруживается выход значений за установленный диапазон, в сообщение результатов вводится предупреждающая пометка (чтобы привлечь ваше внимание). Качество данных, приобретенных в ходе анализа, может быть доказано протокольными записями фактических условий, обеспечивавшихся на время проведения измерений. Система ChemStation записывает в протокольный файл состояние прибора, предшествовавшее разгонке и отмечавшееся после разгонки. Эти сведения заносятся в память вместе с данными и сообщаются при выводе результатов анализов. Графики, показывающие состояние прибора, могут регистрироваться во время всего анализа, и записываются в файл данных. Если конструкцией прибора это допускается, такие графики могут совмещаться с хроматограммой (электрофореграммой) и могут быть запрошены (например, во время аудиторской проверки). Автоматически могут регистрироваться шум на базовой линии и уход базовой линии. Может быть подсчитан минимальный обнаруживаемый уровень концентрации (на основании сведений о высоте пика) для каждого прокалиброванного вещества, оговоренного методом. И, наконец, в каждое сообщение результатов могут вводиться сведения о конфигурации аналитической системы, о заводских номерах приборов, об используемой колонке (используемом капилляре); дополнительно могут добавляться записанные вами пояснения. Результаты расширенной проверки работоспособности системы определяются только для тех веществ, которые прокалиброваны соответственно используемому методу (вещества распознаются по временам удерживания [временам миграции] и по указанным названиям). 189 В типичном сообщении результатов оценки эксплуатационных характеристик системы содержатся следующие сведения: • Подробная информация о приборе • Сведения о колонке (капилляре) • Данные о методе анализа • Информация об образце • Сведения об условиях сбора данных • Описание сигналов и результаты определения шума на базовой линии • Хроматограмма (электрофореграмма) с надпечатками или времен удерживания (времен миграции), или названий веществ Кроме того, для каждого прокалиброванного вещества, показанного на хроматограмме (электрофореграмме), сообщается следующая информация: • Время удерживания (время миграции) • k' • Симметричность • Ширина пика • Число теоретических тарелок • Разрешающая способность • Отношение сигнала к шуму • Название вещества. Определение уровня шума Уровень шума может определяться по точкам данным на выбранном участке записи сигнала. Шум оценивается тремя различными способами: • Как 6-кратное стандартное отклонение от графика ухода базовой линии, определенного методом линейной регрессии. • От пика до пика (при введении поправки на уход базовой линии). 190 • Согласно методу, разработанному Американским обществом по испытанию материалов (метод ASTM E 685-93). Для подсчета уровня шума могут быть использованы несколько зон хроматограммы (электрофореграммы) [ до 7 зон]. Зоны указываются благодаря вызову функции Edit Noise Ranges… (указание зон, используемых для определения уровня шума…) через строку System Suitabiliy (оценка пригодности системы) из перечня, вызываемого через слово Report (сообщение результатов). Подсчет уровня шума по 6-кратному стандартное отклонению от графика ухода базовой линии Рис. 44. Шум, определяемый как 6-кратное стандартное отклонение Линейному регрессионному анализу подвергаются все точки данных, попавшие в указанную зону времени (см. подраздел «Регрессионный анализ», приведенный на стр. 203). Уровень шума подсчитывается по формуле: Шум = 6 х σ , где σ − стандартное отклонение от графика ухода базовой линии, определенного методом линейной регрессии (с учетом всех точек данных в указанной зоне). 191 Подсчет уровня шума от пика до пика Рис. 45. Шум, определяемый от пика до пика Сперва определяется уход базовой линии (за счет линейного регрессионного анализа всех точек данных, попавших в указанную зону [см. подраздел «Регрессионный анализ», приведенный на стр. 203]). Для получения сигнала, из которого вычтен уход базовой линии, из всех точек данных (в выбранной зоне) вычитается величина, соответствующая регрессионному графику. После этого, уровень шума от пика до пика вычисляется по формуле: где N – шум от пика до пика; Imax – интенсивность наибольшего (максимального) пика; Imin – интенсивность наименьшего пика (направленного в обратную сторону) в выбранной зоне. Подсчет уровня шума согласно методу, разработанному Американским обществом по испытанию материалов (ASTM) Рис. 46. Определение уровня шума по методу, разработанному Американским обществом по испытанию материалов Метод, разработанный Американским обществом по испытанию материалов для оценки уровня шума (метод ASTM E 685-93), основан на стандартном подходе к испытаниям спектрофотометрических детекторов жидкостных хроматографов, сформулированном этим же Американским обществом (ASTM). Регистрируемые виды шума можно подразделить на 192 три типа (по продолжительности диапазона времени). Оценка уровня шума (в выбранном диапазоне времени) производится от пика до пика. Продолжительность цикла оценки (t) 1. Долговременный шум: максимальная амплитуда всех хаотичных изменений сигнала детектора с частотой от 6 до 60 циклов за час. Долговременный шум определяют при выборе диапазона времени свыше 1 часа. Продолжительность каждого цикла (dt) устанавливается равной 10 минутам, что дает (по меньшей мере) 6 циклов в выбранном диапазоне времени. 2. Кратковременный шум: максимальная амплитуда всех хаотичных изменений сигнала детектора с частотой свыше 1 цикла в минуту. Кратковременный шум определяют при выборе диапазона времени от 10 до 60 минут. Продолжительность каждого цикла (dt) устанавливается равной 1 минуте, что дает (по меньшей мере) 10 циклов в выбранном диапазоне времени. 3. Мгновенный шум (регистрация не предусмотрена методом ASTM E 685-93): это понятие введено для описания максимальной амплитуды всех хаотичных изменений сигнала детектора с частотой свыше 1 цикла за 0,1 минуты. Мгновенный шум определяют при выборе диапазона времени от 1 до 10 минут. Продолжительность каждого цикла (dt) устанавливается равной 0,1 мин., что дает (по меньшей мере) 10 циклов в выбранном диапазоне времени. Определение числа циклов (n) где t – продолжительность цикла; ttot – общий период времени, в течение которого производится подсчет шума. Подсчет уровня шума от пика для пика для каждого цикла Сперва определяется уход базовой линии (за счет линейного регрессионного анализа всех точек данных, попавших в указанную зону [см. подраздел «Регрессионный анализ», приведенный на стр. 203]). Для получения сигнала, из которого вычтен уход базовой линии, из всех точек данных (в выбранной зоне) вычитается величина, соответствующая регрессионному графику. После этого, уровень шума от пика до пика вычисляется по формуле: 193 где N – шум от пика до пика; Imax – интенсивность наибольшего (максимального) пика; Imin – интенсивность наименьшего пика (направленного в обратную сторону) в выбранной зоне. Подсчет уровня шума согласно методу, разработанному Американским обществом по испытанию материалов (ASTM) где NASTM – уровень шума, подсчитанный по методу ASTM. Если выбран диапазон времени менее 1 минуты, оценка шума согласно методу, разработанный Американским обществом по испытанию материалов, производиться не может. В зависимости от диапазона (если выбранный диапазон времени составляет не менее 1 минуты), шум определяется по одному из методов, разработанных Американским обществом по испытанию материалов (так, как описано выше). При подсчете, число точек данных на цикл должно быть не менее 7. При автоматизированном определении уровня шума, циклы выбираются с перекрытием на 10%. Подсчет отношения сигнала к шуму Для вычисления отношения сигнала к шуму, система ChemStation использует 6-кратное стандартное отклонение (sd) от графика ухода базовой линии, определенного методом линейной регрессии. Из зон, указанных для проверки пригодности системы*, выбирается ближайшая к пику зона. Отношение сигнала к шуму вычисляется по формуле: Высота пика Отношение сигнала к шуму = -------------------------------------------Уровень шума в ближайшей зоне *Зоны указываются благодаря вызову функции Edit Noise Ranges… (указание зон, используемых для определения уровня шума…) через строку System Suitabiliy (оценка пригодности системы) из перечня, вызываемого через слово Report (сообщение результатов). Отношение сигнала к шуму подсчитывается для всех пиков, имеющихся на хроматограмме (электрофореграмме). Если система ChemStation не может определить величину шума, вместо сообщения отношения сигнала к шуму печатается прочерк (“ –”). Уход (Drift) и блуждание базовой линии (Wander) Уход базовой линии определяется по наклону графика, определенного методом линейной регрессии (см. рис. 44, приведенный на стр. 190). Блуждание базовой линии вычисляется по 194 средним значениям шума от пика до пика в течение циклов уровня шума согласно методу ASTM (см. рис. 46, приведенный на стр. 191). Подсчет симметричности пика Система ChemStation не определяет коэффициент асимметричности пика, обычно оцениваемый благодаря сопоставлению половин ширины пика на уровне высоты 10% или 5% (что рекомендуется Управлением по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств при министерстве торговли США). Симметричность пика подсчитывается интегрирующей системой (как псевдомомент) при пользовании следующими уравнениями (соответствующими определению момента): Если точек перегиба не обнаружено или если отмечена лишь одна точка перегиба, симметричность пика определяется по формуле: См. рис. 47, приведенный на следующей странице. 195 где: ai - площадь выборки данных ti - продолжительность выборки данных Hf - высота точки перегиба на переднем склоне пика Hr - высота точки перегиба на заднем склоне пика H - высота вершины пика Рис. 47. Подсчет коэффициента симметричности пика Формулы и подсчеты, используемые при проверке пригодности системы Cистема ChemStation пользуется рассмотренными далее формулами для получения результатов различных проверок пригодности. Включение этих результатов в распечатку предусмотрено следующими вариантами сообщений результатов: результаты проверки эксплуатационных характеристик (Performance), результаты проверок эксплуатационных характеристик + уровень шума (Performance + Noise) и результаты проверки эксплуатационных характеристик + расширенное сообщение результатов (Performance + Extended). Когда указано, что конкретный параметр определяется согласно методам, разработанным Американским обществом по испытанию материалов (ASTM) или Фармакопеей США (USP), это значит, что способ оценки точно совпадает с рассмотренным в документах, изданных этими организациями. Однако, используемые здесь обозначения могут и не совпадать со встречающимися в этих документах. Мы упоминаем два литературных источника: 1. ASTM: Section E 682 - 93, Annual Book of ASTM Standards, Vol. 14.01 2. USP: The United States Pharmacopeia, XX. Revision, pp. 943-946 196 Общие определения терминологии Мертвый объем V (мл) где: d - диаметр колонки (см) - константа (отношение длины окружности к диаметру круга) l - длина колонки (см) f - часть объема колонки, не занятая неподвижной фазой, но доступная для подвижной фазы; самой системой предполагается значение f = 0,68 (для наполнительного материала Hypersil) Время удерживания вещества, не способного удерживаться колонкой t(m) (мин) [иногда этот параметр называют мертвым объемом] где: F - скорость протока через колонку жидкостного хроматографа (мл/мин) Определения параметров, используемых при оценке эффективности системы Статистические моменты Где: N – число выборок площади Ai – значение выборки площади, которой присвоен индекс i - сумма дискретных значений от начального индекса i до конечного индекса N dt – период времени между соседними выборками площади 197 d0 – момент обнаружения первой выборки площади Статистические моменты, перекос и избыточность Вместо определения асимметричности формы пиков, подсчитываются статистические моменты. Фактически, число характеризующих пик моментов бесконечно. Однако применительно к хроматографическим пикам используются только 5 первых. Им присвоены названия момент 0, момент 1, момент 2, момент 3, момент 4. Момент 0 соответствует площади пика. Момент 1 соответствует среднему времени удерживания (или времени удерживания, измеренному по центру тяжести пика). Если пик не симметричен, момент 1 отличается от хроматографического времени удерживания, определяемого в точке вершины пика. Момент 2 соответствует дисперсии пика (т.е. является мерой уширения). Он определяется суммой вкладов в дисперсию (вкладов различными частями системы прибора). Момент 3 описывает вертикальную симметрию или прекос. Это мера отклонения формы пика от гауссовской. Сведения о перекосе дополнительно вводятся в сообщение результатов проверки эксплуатационных характеристик + расширенное сообщение результатов (в безразмерном виде). Для симметричного пика перекос равен нулю. Затянутые пики характеризуются положительным перекосом и для них момент 1 больше времени удерживания, Пики с избыточно крутым передним фронтом характеризуются отрицательным перекосом и для них момент 1 меньше времени удерживания (времени миграции). Момент 4 (или избыточность) является мерой сжатия или растяжения пика по вертикальной оси (мерой отступления от гауссовской формы; для гауссовского пика момент 4 равен нулю). Изменение этого параметра может быть проиллюстрировано сжатием или растяжением боковых склонов гауссовского пика таким образом, чтобы площадь пика оставалась неизменной. Если пик по вертикальной оси сжимают (из-за чего он расплющивается), избыточность отрицательна. Если пик по вертикальной оси вытягивают, избыточность положительна. Сведения об избыточности приводятся в сообщении результатов проверки эксплуатационных характеристик + расширенном сообщении результатов (в безразмерном виде). Фактическая ширина пика Wх [мин или сек] Wх - ширина пика на уровне х% от общей высоты 198 Специальные случаи: WВ - ширина пика на уровне базовой линии, 4σ, определенная по пересечению касательных, проведенных через точки перегиба, с базовой линией W4,4 - ширина пика на уровне 4,4% высоты; ширина 5σ W5,0 - ширина пика на уровне 5% высоты; используется для подсчета показателя затянутости (согласно требованиям фармакопеи США) W50,0 - ширина пика на уровне 50% высоты; 2,35σ (для уточнения подробностей, см. рис. 46, приведенный на следующей странице) Нагрузочный коэффициент k’ (фармакопея США), емкостное соотношение (Американское общество по испытанию материалов) где: TR - время удерживания пика [мин] T0 - время, затрачиваемое на преодоление мертвого объема (мин) Показатель затянутости t (фармакопея США) где: tw - расстояние от передней части пика до TR на уровне 5% от высоты пика (мин); см. рисунок 48, приведенный на следующей странице W5,0 – ширина пика на 5% высоты (мин) 199 Рис. 48. Параметры, используемые при определении эксплуатационных характеристик Число теоретических тарелок на колонку (фармакопея США, Американское общество по испытанию материалов) Число теоретических тарелок, определенное с помощью касательных (фармакопея США, Американское общество по испытанию материалов) Где: WB – ширина на уровне базовой линии (мин); см. рис. 46 Число теоретических тарелок, определенное на уровне половины высоты (Американское общество по испытанию материалов) Где: W50 – ширина пика на уровне половины высоты (мин); см. рис. 46 Число теоретических тарелок, определенное по 5 σ Где: W4,4 – ширина пика на уровне 4,4% высоты (мин) 200 Число теоретических тарелок, определенное по дисперсии Где: Мх – статистический момент х (см. подраздел «Статистические моменты, перекос и избыточность»; стр. 197) Число теоретических тарелок на метр, N [1/м] Где: n – число теоретических тарелок l - длина колонки [cм] Относительное удерживание (фармакопея США, Американское общество по испытанию материалов), селективность α Имеет отношение к пикам a и b; TR для пика а < TR для пика b где: k'(x) - нагрузочный коэффициент для пика х Разрешающая способность R (фармакопея США, Американское общество по испытанию материалов) Имеет отношение к пикам a и b; TR для пика а < TR для пика b Разрешающая способность, определенная по 5 σ 201 Разрешающая способность, определенная по ширине на уровне половины высоты Разрешающая способность, определенная статистическим методом где: M1(x) - среднее время удерживания (миграции) для пика х (первый статистический момент) WB(x) - ширина пика х на уровне базовой линии W4,4(x) - ширина пика х на уровне 4,4% высоты W50(x) - ширина пика х на уровне 50% высоты WS(x) - ширина пика х, подсчитанная через статистические моменты для пика х (мин); см. подраздел «Статистические моменты, перекос и избыточность»; стр. 197) Определения параметров, используемых при проверке воспроизводимости Для статистической проверки воспроизводимости оценка производится по выборке результатов, взятой (как предполагается) из бесконечного числа итогов экспериментов. Ради получения полного набора результатов, требовались бы неограниченные количество материала образца и неограниченное время. Строго статистические данные можно выбрать только из реально полученного набора результатов или популяции данных. Поэтому, обязательно требуется, чтобы выбранный образец можно было считать типичным. Среднее значение (M) Среднее значение М для произвольной выборки из N измерений подсчитывается по ограниченному набору из N полученных значений Хi (с индексацией по i согласно приводимой ниже формуле): где: N - число дискретных результатов измерений Xi - величина при i-том дискретном измерении 202 Стандартное отклонение (S) Рассматривается произвольная выборка результатов N измерений. Стандартное отклонение S определяется по конечному числу данных (из большой популяции данных) согласно следующей формуле: Стандартное (для выборки) отклонение S отличается от стандартного отклонения для популяции s двумя особенностями: • Вместо реального среднего значения используется только среднее значение M для выборки • Производится деление на N-1 вместо деления на N Относительное стандартное отклонение RSD[%] (фармакопея США) Относительное стандартное отклонение подсчитывается по формуле: Стандартное отклонение среднего (SM) Обозначим символом M среднее значение для выборки, а символом S – стандартное отклонение для выборки [или для (N-1)]. Стандартное отклонение среднего SM, подсчитанное по среднему значению М, будет определяться формулой Пример (рассматривается здесь для дополнительного пояснения): При том, что время удерживания (или время миграции) конкретного вещества может лишь незначительно отличаться от вычисленного среднего значения для одной серии анализов, данные для другой серии анализов могут характеризоваться большим разбросом (из-за изменений температуры, постепенного ухудшения эксплуатационных характеристик колонки и т.д.). Для определения такого разброса может подсчитываться (по приведенной выше формуле) стандартное отклонение среднего SM. 203 Доверительный интервал (CI) Доверительный интервал (CI) определяют, чтобы получить информацию о том насколько хороша оценка среднего значения, если эту оценку распространить не только на выборку данных, но и на всю популяцию данных. Доверительный интервал 100 х (1- α)% подсчитывается по формуле Где: процентная точка из таблицы распределения t риска вероятности α В кратком сообщении итогов выполнения программы анализов, если запрошена расширенная статистическая обработка (extended statistics), может использоваться 95процентый доверительный интервал (α = 0,05). Распределение t (иногда называемым «распределением Стьюдента») должно оцениваться только при обследовании небольшого количества образцов. В случае большого числа образцов, результаты оценки распределения t перестанут отличаться от нормального (гауссовского) распределения. Поэтому, при количестве образцов свыше 30 можно оценивать нормальное распределение (будет очень сложно оценить распределение t для большого числа образцов; наилучшей приблизительной окажется оценка нормального распределения). Пример (95-процентный доверительный интервал для 6 образцов): 1 – α =0,95 N=6 Правильное значение (для t) должно быт взято из таблицы распределения t для 5 (N-1) степеней свободы и для значения α/2, равного 0,025. Это приведет к употреблению следующей формулы, дающей возможность подсчитать доверительный интервал CI: Регрессионный анализ Предположим, что: N - число дискретных отсчетов Xi - независимая переменная, i-тый отсчет Yi - независимая переменная, i-тый отсчет Линейная функция: Коэффициенты будут определяться выражениями, приведенными на следующей странице: 204 где: Регрессионный коэффициент (r) где: Стандартное отклонение (S) Доступ к записываемым в систему числам (значениям параметров), характеризующимся «удвоенной» точностью При метрологической аттестации может потребоваться вручную пересчитать результаты, вычисленные системой ChemStation (такие, как калибровочные графики, корреляционные коэффициенты, число теоретических тарелок и т.д.). При выполнении такого пересчета приходится учитывать формат чисел, хранимых системой ChemStation. 205 Для всех записываемых в систему чисел используется формат «С» («удвоенный»): т.е. для каждого числа записываются 14 значащих цифр. Подобная запись данных соответствует стандарту IEEE (Института инженеров по электротехнике и радиоэлектронике) для формата «С», учтенному фирмой Microsoft, и соответствующим правилам округления (см. документы Q42980, Q145889 и Q125056, опубликование фирмой Microsoft). Из-за того, что в калибровочной таблице может использоваться неограниченное число параметров, не удается точно вычислить ошибку, возникающую из-за распространения и накопления ошибок округления. Однако, тщательное обследование процесса создания различных калибровочных графиков показало, что может быть гарантирована точность до 10 знаков. С учетом того, что воспроизводимость площадей, высот пиков и времен удерживания обычно характеризуется точностью до 3 значащих цифр, указанных 10 значащих цифр для подобных вычислений достаточно. По этой причине, в калибровочных и прочих таблицах показывается не более 10 значащих цифр. Если для метрологической аттестации требуется внешний (производимый вручную) пересчет, рекомендуется использовать все цифры, употребляемые для подсчета самой системой ChemStation. Если пользоваться показываемыми и (или) округленными значениями, такой «внешний» пересчет может дать результаты, отличающиеся от используемых системой ChemStation (за счет ошибок округления). В приводимых далее параграфах описывается как получить доступ к цифрам и числам, хранимым в системе ChemStation (ради самостоятельного выполнения вычислений).Во всех случаях, необходимо вызвать файл данных и получить соответствующую распечатку сообщения результатов; лишь затем удастся воспользоваться перечисленными командами. Все команды вводятся (через показываемую системой ChemStation) командную строку (запрос показа этой строки подается с помощью перечня, вызываемого через слово View [вид]). С информацией, хранимой в файле C:\HPCHEM\TEMP.TXT, можно ознакомиться воспользовавшись редактирующей тексты программой (например, программой NOTEPAD). Сведения о необработанных пиках • Retention Time (время удерживания или время миграции) • Area (площадь) • Height (высота) • Width (ширина [определенная интегратором]) • Symmetry (симметричность) • Peak Start Time (момент начала пика) • Peak End Time (момент конца пика) 206 Пользуйтесь следующей записью в командную строку: DUMPTABLE CHROMREG, INTRESULTS, “C:\HPCHEM\1\TEMP\INTRES.TXT” Сведения об обработанных пиках • Measured Retention Time (зарегистрированное время удерживания) • Expected Retention Time (ожидаемое время удерживания) • Area (площадь) • Height (высота) • Width (ширина [определенная интегратором]) • Symmetry (симметричность) • Half Width – Half Peak Hight (ширина на уровне половины высоты; приводится в сообщении результатов оценки эксплуатационных характеристик [Performance и Extended Performance]) • Tailng Factor (показатель затянутости пика; приводится в сообщении результатов оценки эксплуатационных характеристик [Performance и Extended Performance]) • Selectivity (селективность; приводится в сообщении результатов оценки эксплуатационных характеристик [Performance и Extended Performance]) • K’ (приводится в сообщении результатов оценки эксплуатационных характеристик [Extended Performance]) • Tangent Peak Width (ширина пика, определенная с помощью касательных; приводится в сообщении результатов оценки эксплуатационных характеристик [Extended Performance]) • Skew (перекос; приводится в сообщении результатов оценки эксплуатационных характеристик [Extended Performance]) • Theoretical Plates – Half Width (число теоретических тарелок, определенное на уровне половины ширины; приводится в сообщении результатов оценки эксплуатационных характеристик [Performance и Extended Performance]) • Theoretical Plates – Tangent (число теоретических тарелок, определенное с помощью проведения касательных; приводится в сообщении результатов оценки эксплуатационных характеристик [Extended Performance]) • Theoretical Plates – 5 σ (число теоретических тарелок, определенное по 5 σ; приводится в сообщении результатов оценки эксплуатационных характеристик [Extended Performance]) 207 • Theoretical Plates – Statistical (определенное статистически число теоретических тарелок; приводится в сообщении результатов оценки эксплуатационных характеристик [Extended Performance]) • Resolution – Half Width (разрешающая способность, определенная на уровне половины ширины; приводится в сообщении результатов оценки эксплуатационных характеристик [Performance и Extended Performance]) • Resolution – Tangent (разрешающая способность, определенная с помощью проведения касательных; приводится в сообщении результатов оценки эксплуатационных характеристик [Extended Performance]) • Resolution – 5 σ (разрешающая способность, определенная по 5 σ; приводится в сообщении результатов оценки эксплуатационных характеристик [Extended Performance]) • Resolution – Statistical (статистически определенная разрешающая способность; приводится в сообщении результатов оценки эксплуатационных характеристик [Extended Performance]) Пользуйтесь следующей записью в командную строку: DUMPTABLE CHROMRES, PEAK, “C:\HPCHEM\1\TEMP\PEAK.TXT” Подсчитанные сведения о веществах • Calculated Amount (подсчитанное количество) Пользуйтесь следующей записью в командную строку: DUMPTABLE CHROMRES, COMPOUND, “C:\HPCHEM\1\TEMP\COMPOUND.TXT” Сведения из калибровочной таблицы • Level Number (номер уровня) • Amount (количество) • Area (площадь) • Height (высота) Пользуйтесь следующей записью в командную строку: DUMPTABLE_DAMETHOD, CALPOINT, “C:\HPCHEM\1\TEMP\CALIB.TXT” 208 Сведения о результатах подсчета по методу линейной регрессии • Y-Intercept (CurveParm1) [пересечение с осью Y (параметр 1, соответствующий калибровочному графику)] • Slope (curveParm2 [наклон (параметр 1, соответствующий калибровочному графику)] • Correlation Coefficient (корреляционный коэффициент) Пользуйтесь следующей записью в командную строку: DUMPTABLE_DAMETHOD, PAEK, “C:\HPCHEM\1\TEMP\REGRESS.TXT” Раздел 14. Метрологическая аттестация системы Метрологическая аттестация системы Метрологическая аттестация системы - ключевой фактор для рутинного использования аналитического прибора в аккредитованной лаборатории. Рассмотренные ниже возможности аттестации системы ChemStation в соответствии с требованиями GLP (Требований к организации работ в лаборатории) созданы для того, чтобы помочь вам доказать, что программное обеспечение (или соответствующие части программного обеспечения) работают оптимально (или работали оптимально во время выполнения конкретного анализа). Реализуемая системой ChemStation функция Verification (аттестация) дает возможность проверки правильности работы программного обеспечения ChemStation. Вы можете провести такую проверку благодаря пересчету файлов данных с использованием специфичных методов, после чего результаты сопоставляются с заведомо определенным эталоном. В частности, пользование функцией Verification крайне важно для доказывания правильности интегрирования и количественных результатов. Для испытаний различных комбинаций алгоритмов программного обеспечения, вы можете воспользоваться стандартным вариантом аттестационной проверки или самостоятельно создать варианты проверок, использующих вами составленные методы и файлы данных. Аттестационной проверкой предусмотрено использование защищенного файла (в который не могут быть внесены изменения и который не может быть стерт). Функция Verification (аттестация), имеющаяся в подсказывающем изображении, вызываемом через слово View (просмотр) в поле обзора Data Analysis (анализ данных), дает вам возможность выбрать любые варианты из следующих: • Выполнение аттестационной проверки, записанной в банк данных • Создание нового вида аттестационной проверки и запись его в банк данных • Стирание вида аттестационной проверки из банка данных 209 Для получения информации о проведении этих проверок, вы можете воспользоваться сведениями, запрашиваемыми через функцию How To (как сделать) из перечня, вызываемого на экран через слово Help (запрос помощи). Когда запрашивается выполнение аттестационной проверки системы ChemStation, вы можете решить, должна ли производиться полная проверка, или следует воспользоваться каким-то сочетанием отдельных ее частей. Результаты аттестационной проверки записываются в двоичной форме под заголовок с:\hpchem\1\Verify (предполагаемый самой системой автоматически) наряду с файлом метода и файлами данных. Подзаголовок Verify находится на том же уровне, что и подзаголовки sequence, methods и data. Вы можете запросить вывод результатов на печатающее устройство или запись их в файл. Возможны только два результата проверки (включая итог полной аттестационной проверки): удовлетворительный (pass) или неудовлетворительный (fail). Далее рассматриваются отдельные части аттестационной проверки: Проверка цифровых электронных схем (только для детектора с диодной матрицей HP 1050 или Agilent 1100) В детектор с диодной матрицей записана контрольная хроматограмма. Эта хроматограмма передается системе ChemStation после того, как пройдет некоторые этапы обработки, которым подвергаются обычные необработанные данные (считываемые с фотодиодов). Получаемые сведения сравниваются с исходными, уже ранее записанными в систему ChemStation для такой контрольной хроматограммы. Если обнаруживается несовпадение, результат проверки считается неудовлетворительным. Такая проверка дает возможность удостовериться, что те электронные схемы детектора с диодной матрицей, которые ответственны за обработку данных, работают правильно. Поскольку используется записанная в память контрольная хроматограмма, лампы и сама матрица фотодиодов не проверяются. Их можно проверить пользуясь "проверкой детектора с диодной матрицей", описанной на стр. 212. Проверка интегрирования пиков Информация из файла данных интегрируется снова, с использованием исходного метода. Результаты сопоставляются с ранее полученными результатами интегрирования, записанными в проверочный регистр. Если отмечается несовпадение, итог проверки считается неудовлетворительным. Проверка подсчета количества веществ Информация о веществах, записанная в файл данных, подвергается количественному пересчету снова. Итог сопоставляется с ранее полученными результатами количественной оценки, записанными в проверочный регистр. Если отмечается несовпадение, результат проверки считается неудовлетворительным. 210 Проверка распечатки сообщения результатов Ранее сформированное сообщение результатов выводится на печать снова. Далее показан пример сообщения результатов успешно отработанной аттестационной проверки. Перевод имеющихся на рисунке надписей (приведен в порядке, совпадающем с порядком расположения строк): Сообщение результатов аттестационной проверки системы ChemStation Конфигурация проверявшейся системы: Компонент Вариант Заводской номер HPLC 2D ChemStation A.05.01 нет Microsoft Windows 3.95 (улучшенный режим) нет MS-DOS 7.0 нет Процессор Pentium нет Вспомогательный процессор имеется нет Подробная информация об аттестационной проверке системы ChemStation Название файла метода :C:\HPCHEM\1\VERIFY\DEFAULT.M Исходный файл данных: :C:\HPCHEM\1\VERIFY\DATA\NV-0019.D Исходный метод сбора данных: :TC1ISO2.M Исходный метод анализа данных: TC1ISO2.M Фамилия оператора, проводившего исходный анализ: Hewlett-Packard Дата исходного введения образца: среда, 17 февраля 1997 г. 8 часов 59 мин 51 сек Исходное название образца: Проверявшиеся сигналы: Сигнал 1: канал А детектора с диодной матрицей; измерительная длина волны 254 нм; ширина полосы 4 нм; контрольная длина волны 450 нм; ширина полосы 80 нм; данные из файла NV-0019.D 211 Сигнал 2: канал А спектрофотометрического детектора с изменяемой длиной волны; длина волны 254 нм; данные из файла NV-0019.D Результаты аттестационной проверки системы ChemStation: Часть программы Выбрана для Результаты проверок аттестации испытаний Проверка цифровых электронных схем Нет Отсутствуют Проверка интегрирования Да Положительный Проверка количественного анализа Да Положительный Проверка распечатки сообщения результатов анализа Нет Отсутствуют Итог общей аттестационной проверки системы ChemStation: система прошла проверку Поля просмотра аттестационной и диагностической информации Если вывод такой информации предусмотрен прибором, оговоренным при указании конфигурации (например, блоки жидкостного хроматографа Agilent 1100), система ChemStation выводит на экран два дополнительных поля просмотра (под аттестационную и диагностическую информацию). Для получения более подробных сведений, см. выводимые на экран подсказывающие сообщения (появляющиеся в ответ на запрос помощи [Help]) и Инструкцию по проверке эксплуатационных характеристик (Performance Verification manual). Регистр, в который записываются данные, предусмотренные Требованиями к организации работ в лаборатории (Требованиями GLP) Записи в этот регистр вводятся в конце каждого анализа (когда сохранение такой информации предусмотрено перечнем того, что подлежит выполнению во время обслуживания разгонки). Записывается следующее: • хроматограммы (электрофореграммы) • протокольный журнал • таблица результатов интегрирования • таблица количественных результатов • данные о использованных режимах работы прибора • метод анализа данных 212 Заложенные в регистр сведения (накопленные в ходе анализа) полностью защищены от изменений. Вы можете вызвать их в любой момент времени (чтобы доказать объективность использовавшихся аналитических методов). Функция GLPsave Register (регистр, в который записываются данные, предусмотренные требованиями GLP), выбираемая из перечня, вызываемого через слово View (просмотр) в поле обзора Data Analysis (анализ данных), дает возможность доступа к такому регистру в любой момент времени. Файл предохранен по контрольной сумме; информация записана в виде двоичного кода (для того, чтобы никаким образом не удавалось изменить ее). Через сектор, используемый в режиме диалога для обеспечения просмотра содержимого регистра GLPsave, вы можете выбрать следующие варианты: • вызов исходного метода • вызов исходных сигналов (хроматограмм или электрофореграмм) • вызов данных об использованных режимах работы прибора • распечатка исходного метода • распечатка исходных результатов интегрирования • распечатка исходных результатов количественного анализа • формирование исходного сообщения результатов (с использованием исходных метода и хроматограмм [электрофореграмм]) Вы можете воспользоваться выводом данных, запротоколированных согласно требованиям GLP, для доказательства их подлинности, доказательства качества анализа (с подтверждением настройки прибора на конкретные режимы), доказательства правильности интерпретации данных. Например, вы можете: • вызвать и распечатать ту часть метода, которая соответствовала анализу данных, для доказательства, что оценка данных (выполнявшаяся при обработке результатов анализа) никаким образом не была подтасована • просмотреть (не производя пересчет) результаты интегрирования и количественного анализа (для доказательства подлинности сообщения результатов) Проверка детектора с диодной матрицей Проверка детектора может выполняться как отдельный этап рутинной аттестации аналитического прибора в аккредитованной лаборатории. 213 Эта проверка дает возможность оценить эксплутационную эффективность детектора с диодной матрицей. Когда вы выбрали функцию DAD test (проверка детектора с диодной матрицей) из перечня, выводимого на экран благодаря выбору слова Instrument (прибор) [только при пользовании системами LC3D и 3DCE; т.е. жидкостным хроматографом или системой для капиллярного электрофореза], обеспечиваются проверки светоотдачи лампы (ламп) и калибровки длин волн. Итоги проверки автоматически записываются в банк данных о проверке детектора с диодной матрицей (банк DADTest); регистровый файл DADTest.Reg имеется под тем заголовком, который предусматривается самой системой автоматически под запись сведений о приборе. Просмотр результатов проверки детектора с диодной матрицей (Review DAD Test) Функция Review DAD Test (просмотр результатов проверки детектора с диодной матрицей), выбираемая из перечня, вызываемого через слово View (просмотр) поля обзора Data Analysis (анализ данных), дает возможность просмотреть содержимое регистрового файла DADTest.Reg в любой момент времени. Этот файл предохранен по контрольной сумме; информация записана в виде двоичного кода (чтобы предотвращалась возможность каких-то изменений). Вы можете выбрать из регистра (для просмотра) следующие сведения: Показ спектрограммы фильтра из окиси гольмия (Show Holmium Spectra) Все снятые спектрограммы фильтра из окиси гольмия перечислены в таблице DAD Test review (просмотр результатов проверки детектора с диодной матрицей). Выбранная спектрограмма оказывается помеченной. Показ спектрограммы, соответствующей проверке светоотдачи (Show Intensity Spectra) На экран могут быть выведены (для просмотра) все спектрограммы, соответствующие проверке светоотдаче (перечисленные в таблице DAD Test review [просмотр результатов проверки детектора с диодной матрицей]). Выбранная спектрограмма оказывается помеченной. Запись в новый банк данных (Save as New Database) Если вы заменили лампу в детекторе с диодной матрицей, вы можете стереть любые устаревшие сведения о проверках из таблицы и, после этого, воспользоваться функцией Save as New Database (запись в новый банк данных). 214 Показ выбранной спектрограммы (Show Selected Spectra) Вывод на экран любой спектрограммы, выбранной из таблицы. Показ графика, соответствующего светоотдаче (Show Intensity Graph) Вы можете запросить вывод на экран графика, соответствующего светоотдаче, чтобы проверить характеристики лампы (ламп) детектора с диодной матрицей (т.е. убедиться в том, что срок службы еще не истек). График отображает изменение максимальной светоотдачи лампы (ламп) со временем.
