Реферат на тему: «Лабораторная оценка гуморального и клеточного иммунитета» Оглавление Клеточный иммунитет ............................................................................................ 2 Иммунофенотипирование ...................................................................................... 3 Когда назначается исследование? ......................................................................... 4 Что означают результаты?...................................................................................... 4 Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) ................................................... 7 С3 и С4-компоненты комлемента.......................................................................... 8 Список литературы ............................................................................................... 11 Клеточный иммунитет (англ. Cell-mediated immunity) — такой тип иммунного ответа, в котором не участвуют ни антитела, ни система комплемента. В процессе клеточного иммунитета активируются макрофаги, натуральные киллеры, антигенспецифичные цитотоксические Т-лимфоциты, и в ответ на антиген выделяются цитокины. Иммунная система исторически описывается состоящей из двух частей — системы гуморального иммунитета и системы клеточного иммунитета. В случае гуморального иммунитета защитные функции выполняют молекулы, находящиеся в плазме крови, а не клеточные элементы. В то время как в случае клеточного иммунитета защитная функция связана именно с клетками иммунной системы. Лимфоциты кластера дифференцировки CD4 или Тхелперы осуществляют защиту против различных патогенов. Система клеточного иммунитета выполняет защитные функции следующими способами: путём активации антиген-специфических цитотоксичных Тлимфоцитов, которые могут вызывать апоптоз соматических клеток, демонстрируя на поверхности эпитопы чужеродных антигенов, например, клеток, заражённых вирусами, содержащими бактерии и клеток опухолей, демонстрирующих опухолевые антигены; путём активации макрофагов и натуральных киллеров, которые разрушают внутриклеточные патогены; путём стимулирования секреции цитокинов, которые оказывают влияние на другие клетки иммунной системы, принимающие участие в адаптивном иммунном ответе и врождённом иммунном ответе.[2] Клеточный иммунитет направлен преимущественно против микроорганизмов, которые выживают в фагоцитах и против микроорганизмов, поражающие другие клетки. Система клеточного иммунитета особенно эффективна против клеток, инфицированных вирусами, и принимает участие в защите от грибов, простейших, внутриклеточных бактерий и против клеток опухолей. Также система клеточного иммунитета играет важную роль в отторжении тканей. В современном понимании иммунный статус человека - это совокупность лабораторных показателей, характеризующих количественную и функциональную активность клеток иммунной системы в данный момент. Оценка иммунного статуса проводится с помощью иммунологического лабораторного обследования - иммунограммы. Иммунограмма крови не отражает избирательно состояние патологически измененного органа или системы, но позволяет оценить иммунную систему в целом (суммарный 2 эффект изменения активности иммунной системы в ответ на чужеродный антиген). Иммунофенотипирование Оценка клеточного состава (иммунофенотипирование) лимфоцитов крови человека - основной компонент в оценке иммунного статуса выполняется методом проточной цитофлуориметрии. Иммунофенотипирование характеристика клеток при помощи моноклональных антител или каких-либо других зондов, позволяющих судить об их типе и функциональном состоянии по наличию того или иного набора клеточных маркеров. Иммунофенотипирование лейкоцитов заключается в обнаружении на их поверхности маркеров дифференциации, или CD антигенов. Лейкоциты экспрессируют ряд поверхностных и цитоплазматических антигенов, уникальных для своей субпопуляции и стадии развития. CD антигены (англ. cluster of differentiation antigens) - это антигены на поверхности клеток, маркеры, отличающие одни типы клеток от других. Дифференциации этих антигенов изучены и стандартизованы, им присвоены определенные номера. CD могут быть распознаны с помощью соответствующих моноклональных антител. Используя флюоресцентно-меченые моноклональные антитела, связывающиеся с определенными CD, можно с помощью метода проточной цитометрии произвести подсчёт содержания лимфоцитов, относящихся к различным по функции или стадии развития субпопуляциям. В основе проточной цитофлуориметрии лежит проведение фотометрических и флюоресцентных измерений отдельных клеток, пересекающих одна за другой вместе с потоком жидкости луч монохроматического света, обычно света лазера. Метод позволяет не только определить количественное соотношение основных популяций лимфоцитов: Т-лимфоциты (CD3+CD19-); Т-хелперы/индукторы (CD3+CD4+CD45+); Т-цитотоксические лимфоциты (Т-ЦТЛ) (CD3+CD8+CD45+); истинные "натуральные киллеры" (NK-клетки) (CD3CD56+CD45+); истинные "натуральные киллеры" (NK-клетки) (CD3CD16+CD45+); В-лимфоциты (CD19+CD3-); - но и оценить малые клеточные популяции, а также изучить их функциональную активность: Т-лимфоциты, экспрессирующие маркеры NK-клеток (Т-NKклетки) (CD3+CD56+CD45+); NK-клетки, экспрессирующие α-цепь антигена CD8 (CD3СD8+CD45+). 3 Когда назначается исследование? Рекомендовано для комплексного обследования пациентов, входящих в группу риска по четырем основным иммунопатологическим синдромам. С инфекционным синдромом: частые ОРВИ, хронические инфекции ЛОР-органов: гнойные синуситы, отиты, периодически встречающиеся лимфадениты, пневмонии с тенденцией к рецидивированию, бронхоплевропневмонии; бактериальные инфекции кожи и подкожной клетчатки (пиодермии, фурункулез, абсцессы, флегмоны, септические гранулемы, рецидивирующий парапроктит у взрослых); урогенитальные инфекции; грибковые поражения кожи и слизистых оболочек, кандидоз, паразитарные инвазии; рецидивирующий герпес различной локализации; гастроэнтеропатия с хронической диареей неясной этиологии, дисбактериозом; длительный субфебрилитет, лихорадка неясной этиологии; генерализованные инфекции: сепсис, гнойные менингиты. С аллергическим (атопическим) синдромом: атопический дерматит; нейродермит; экзема с инфекционным компонентом; тяжелая атопическая бронхиальная астма, поллиноз, хронический астматический бронхит. С аутоиммунным синдромом: ревматоидный артрит; рассеянный склероз; диффузные заболевания соединительной ткани (системная красная волчанка, склеродермия, дерматомиозит); аутоиммунный тиреоидит; неспецифический язвенный колит. С иммунопролиферативным синдромом: опухолевые процессы в иммунной системе (лимфомы, болезнь Ходжкина, острый и хронический лимфолейкоз, саркома Капоши). Что означают результаты? Изменения различных клеточных популяций лимфоцитов в сторону повышения или понижения развиваются при различных патологических 4 процессах в организме, таких как инфекции, аутоиммунные и онкологические заболевания, иммунодефициты, в постоперационном периоде, при трансплантации органов. Ниже представлена таблица с клиническими ситуациями, которые могут приводить к изменениям в субпопуляционном составе лимфоцитов. Субпопуляция лимфоцитов T-лимфоциты (CD3+CD19-) Повышение показателя Понижение показателя Т-хелперы (CD3+CD4+CD45+ ) Острые и хронические инфекции; гормональный дисбаланс; длительный прием лекарственных препаратов (особенно монотерапия); прием биологически активных добавок; интенсивные занятия спортом; беременность; Т-клеточные лейкозы. Ряд аутоиммунных заболеваний; гормональный дисбаланс; некоторые инфекции; отдельные Тклеточные лейкозы; отравление 5 Некоторые виды инфекций; иммунодефицитные состояния; алкогольный цирроз печени; карцинома печени; аутоиммунные заболевания; прием иммуносупрессивны х препаратов. Иммунодефицитны е состояния (основной лабораторный признак вторичного иммунодефицита); алкогольная болезнь печени; аутоиммунные заболевания; прием солями бериллия. Тцитотоксические лимфоциты (CD3+CD8+CD45+ ) В-лимфоциты (CD19CD3-) иммуносупрессивны х препаратов или стероидов. Некоторые вирусные инфекции; ряд Тклеточных лейкозов; наркоз; острая фаза аллергии; ряд аутоиммунных патологий. Ряд аутоиммунных патологий; стресс; В-клеточные лимфомы; длительная экспозиция формальдегидо м. "Натуральные киллеры" (CD3CD56+CD45+), (CD3CD16+CD45+) Фаза восстановления после вирусных инфекций (гепатит В, С); ряд аутоиммунных заболеваний; онкологически е заболевания; 6 Некоторые виды аутоиммунных, аллергических заболеваний; иммуносупрессивна я терапия. Гипореактивность, перераспределение в очаги воспаления; общий вариабельный иммунодефицит; наследственный иммунодефицит; внутривенное введение иммуноглобулинов; алкогольный цирроз печени. Ряд инфекций; ряд аутоиммунных заболеваний; интенсивное курение; иммуносупрессивна я терапия и терапия стероидами. Т-"натуральные киллеры", НК-Т (CD3+CD56+CD4 5+) беременность; алкогольный цирроз печени. Длительные хронические воспалительные процессы; тяжелое течение воспалительных процессов; длительная персистенция антигена в организме. Не имеет диагностического значения. В совокупности с клиническими данными, симптоматикой, другими методами лабораторных исследований вышеуказанные изменения являются диагностическим признаком возникновения этих патологических процессов в организме человека. Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) представляют собой комплексы, состоящие из антител, антигена и компонентов комплемента. Образование ЦИК – нормальный механизм защиты организма, но иногда, вследствие избыточного накопления, ЦИК сохраняются в течение длительного времени и откладываются в различных тканях и органах, приводя к их поражению (при системной красной волчанке (СКВ). Уровень ЦИК в крови – показатель развития различных воспалительных процессов в организме и показатель активности течения аутоиммунных заболеваний. Показания · диагностика и наблюдение за течением аутоиммунных и ревматоидных заболеваний (диффузных болезней соединительной ткани, системных васкулитов. СКВ, болезни Крона, аутоиммунного гепатита, коллагенозов и др.); · диагностика и наблюдение за течением хронических инфекционных заболеваний (ВИЧ-инфекции, подострого инфекционного эндокардита и др. вирусных, бактериальных и грибковых заболеваний); · наблюдение за течением хронических воспалительных заболеваний почек (гломерулонефрита); 7 · в комплексе с другими исследованиями для диагностики иммунодефицитных состояний (входит в исследование иммунного статуса) Методика Определение ЦИК в сыворотке крови осуществляется методом иммунного турбидиметрического анализа. С3 и С4-компоненты комлемента Белки компонента комплемена синтезируются в печени и в норме присутствуют в плазме в неактивной форме. Пусковыми механизмами активации системы комплемента является проникновение в организм бактерий и вирусов, грибов, простейших. Показания: диагностика болезней иммунных комплексов - системная красная волчанка (СКВ), генерализованные васкулиты, гломерулонефрит, энтеропатии (болезнь Крона, неспецифический язвенный колит), аутоиммунная гемолитическая анемия. При рецидивирующих инфекциях: стрептококковом и стафилококковом сепсисе, бактериальных и вирусных менингитах, паразитарных инвазиях. Мониторинг лечения болезней иммунных комплексоваутоиммунный тиреоидит, ювенильный дерматомиозит. СКВ, Диагностика наследственного дефицита компонентов комплемента ангионевротический отек или болезнь Квинке, дефицит С3 при рекуррентных инфекциях, дефицит С4 при СКВ. Методика Определение С3 и С4 – компонентов комплемента осуществляется турбодиметрическим методом на биохимическом анализаторе «АRCHITECT с8000» Иммунный статус (субпопуляционное определение абсолютного и относительного количества лимфоцитов CD3+, CD4+, CD8+, CD19+, естественных киллеров CD16+, общих IgA, IgM, IgG, ЦИК, подсчет ИРИ) Для оценки клеточного иммунитета определяются его основные параметры (относительное содержание клеток в крови): зрелые Т-клетки, Т-хелперы, Тсупрессоры /цитотоксические, В-клетки, NK-клетки (естественные киллеры) и иммуно-регуляторный индекс (ИРИ) – соотношение Т-хелперов и Тсупрессоров/цитотоксических. Показания · выявление первичного и вторичного иммунодефицита, · контроль за проведением иммуностимулирующей терапии. 8 Методика Определение основных параметров клеточного иммунитета проводится методом проточной цитометрии с использованием реагентов «Лаборатория КОНСТАНТА» на проточном цитометре «Partec CyFlow». Кроме показателей клеточного иммунитета, в иммунный статус входят показатели гуморального иммунитета: общие IgA, IgM, IgG, и ЦИК. Подготовка Взятие крови предпочтительно проводить утром натощак, после 8 – 14 часов ночного периода голодания (воду пить можно), допустимо днем через 4 часа после легкого приема пищи. Накануне исследования необходимо исключить психоэмоциональные и физические нагрузки (спортивные тренировки), прием алкоголя, за час до исследования – курение. Отказаться от приема лекарственных препаратов: даназол, гидралазин, фенитоин, антибактериальных препаратов пенициллинового ряда, метилдопа, цимстидин, пероральные контрацептивы. Оценка иммунологической реактивности человека в настоящее время предполагает дифференцированную характеристику функциональной активности Т- и В-систем иммунитета. Для этого разработан и внедрен в клиническую практику ряд тестов. Мы приведем здесь только те тесты, которые наиболее широко используются в клинике. Для оценки В-системы иммунитета применяют: Определение количества В-лимфоцитов. Это исследование проводится с помощью иммунофлюоресцентного метода и моноклональных антител к поверхностному рецептору В-лимфоцитов (СВ21+моноклональные антитела). До недавнего времени количество В-лимфоцитов определялось с помощью теста розеткообразования, который основан на том, что Влимфоциты человека образуют розетки с мышиными эритроцитами. С помощью иммунофлюоресцентного метода, применяя антиглобу-линовые сыворотки, можно обнаружить и посчитать все лимфоциты, несущие иммуноглобулиновые детерминанты, т.е. В-лимфоциты. Исследование функциональной активности В-лимфоцитов. Определяют по уровню пролиферативной активности этих лимфоцитов в присутствии митогена лаконоса (pookweed mitogen, PWM) или липополисахарида (LPS), которые могут вызвать поликлональную стимуляцию В-лимфоцитов, а также по способности В-лимфоцитов секретировать иммуноглобулины, которые выявляют в цитоплазме иммунофлюоре-сцентным методом с использованием антииммуноглобулиновых сывороток. Для оценки Т-системы иммунитета применяют: Определение количества Т-лимфоцитов, Т-хелперов, Т-супрессоров и лимфоцитов-киллеров. Проводится с помощью иммунофлюоресцентного 9 метода и моноклональных антител к поверхностным рецепторам этих клеток: CD3+ все Т-лимфоциты, СВ4+-хелперы, СВ8+-супрессоры, СО16+киллеры. До недавнего времени для количественной характеристики Тлимфоцитов и их подклассов (хелперов, супрессо-ров, киллеров) использовался тест розеткообразования, т.е. способность лимфоцитов формировать розетки с эритроцитами барана. Однако в настоящее время этот тест утрачивает свое значение, уступая место менее сложному и более специфичному иммунофлюоресцентному методу с использованием моноклональных антител к поверхностным рецепторам лимфоцитов. Упоминание здесь о тестах розеткообразования обусловлено тем, что некоторые результаты, о которых речь пойдет далее, получены с их помощью. Оценка функциональной активности Т-лимфоцитов. Этот тест основан на способности Т-лимфоцитов пролиферировать в ответ на стимуляцию неспецифическим митогеном (субстанциями, названными так из-за способности вызывать митозы в лимфоцитах) и продуцировать интерлейкины (ИЛ-1 и ИЛ-2). Необходимо отметить, что раньше пролиферативную активность лимфоцитов оценивали по количеству бластов (бласттрансформация) и митозов, появляющихся в стимулированной митогеном культуре, в настоящее время — используя радиоактивную метку и ее подсчет на сцинтилляционном счетчике. Оценка системы натуральных киллеров. Для этого используется цитотоксический тест, в котором клетками-мишенями чаще всего служит линия клеток К-562, меченная 3Н-уридином. Тестируемые лимфоциты вносят в культуру К-562, инкубируют в присутствии РНКазы, а затем оценивают уровень радиоактивного уридина, высвободившегося из лизированных клеток-мишеней. Для выявления аутоантител используют рутинные серологические реакции, среди которых особое место занимает реакция связывания комплемента. Она относится к сложным серологическим реакциям, в которых, кроме антигена и антитела, участвует гемолитическая система, с помощью которой выявляется результат реакции. Реакция протекает в две фазы: первая — взаимодействие антигена и антитела с участием комплемента; вторая — выявление степени связывания комплемента, что достигается добавлением гемолитической системы (эритроциты + гемолитическая сыворотка). Антитимоцитарные (цитотоксические) антитела определяются с помощью цитотоксического теста по методу Gorer и OGorman в модификации Б.Д. Брондза (1964). 10 Список литературы: 1. Хаитов, Р.М. Аллергология и иммунология : национальное руководство / под ред. Р.М. Хаитова, Н.И. Ильиной. – М. : ГЭОТАР-Медиа, 2009. – 656 с. 2. Хаитов, Р.М. Руководство по клинической иммунологии. Диагностика заболеваний иммунной системы : руководство для врачей / Р.М. Хаитов, Б.В. Пинегин, А.А. Ярилин. – М. : ГЭОТАРМедиа, 2009. – 352 с. 3. Зуева Е.Е. Иммунная система, иммунограмма : рекомендации по назначению и применению в лечебно диагностическом процессе /Е.Е Зуева, Е.Б. Русанова, А.В. Куртова, А.П. Рыжак, М.В. горчакова, О.В. Галкина – СПб. – Тверь: ООО "издательство "Триада", 2008. – 60 с. 4. Кетлинский, С.А. Иммунология для врача / С.А. Кетлинский, Н.М. Калинина. СПб. : Гиппократ, 1998. – 156 с. Ярилин, А.А. Иммунология : учебник / А.А. Ярилин. – М. : ГЭОТАР-Медиа, 2010. – 752 с. 11
