Как правильно провести депирогенизацию? • Депирогенизация – процедура устранения (удаления) или разрушения (инактивации) пирогенов • Сухожаровая обработка • Гидролиз в щелочной среде • Окисление Липид А Устранение (удаление) эндотоксинов в процессе обработки контейнеров (пробирок) водой • Эффективность мытья пробирок повышается при использовании специальных реагентов. E-TOXA-CLEAN (Sigma), концентрат: - пробирки замочить на 12-15 ч в 1 % рабочем растворе E-TOXA-CLEAN; - промыть 8-10 раз теплой, проточной водой; - промыть 5 раз дистиллированной водой; - промыть 1 раз апирогенной водой; - поместить в сухожаровой шкаф. СУХОЖАРОВАЯ ОБРАБОТКА – НАИБОЛЕЕ ЭФФЕКТИВНЫЙ СПОСОБ ДЕПИРОГЕНИЗАЦИИ 170 °С; 2 ч Стерилизация не приводит к разрушению эндотоксинов 180 °С; 3 ч Депирогенизац ия приводит к деструкции эндотоксинов 250 °С; 30 мин Депирогенизац ия приводит к деструкции эндотоксинов Окисляющие ACC) агенты - гидроген пероксид (использует инактивирует липид А не удаляет биопленку - озон инактивирует липид А - гипохлорит натрия не вызывает деструкции эндотоксинов удаляет биопленку и инактивирует белки Алкилирующие агенты - формальдегид, глутаральдегид не вызывают деструкции эндотоксинов Четвертичные соединения аммония не вызывают деструкции эндотоксинов Cтерилизация этиленоксидом (ЕТО) не вызывает деструкции эндотоксинов оказывает влияние на взаимодействие эндотоксинов с лизатом амебоцитов Радиационная стерилизация (гаммаизлучение) инактивирует эндотоксины, разрушает ЛПС изменяет физико-химические свойства обрабатываемого объекта УФ-излучение инактивирует ферменты клетки, вызывает фотохимические мутации ДНК не вызывает деструкции эндотоксинов Тепловая обработка (нагревание, кипячение) 100 °С, 3 ч не вызывает деструкции эндотоксинов Автоклавирование не вызывает деструкции эндотоксинов Обратный осмос - стандартная процедура подготовки воды на фармацевтическом предприятии RO-мембрана эффективно удаляет эндотоксины (менее 0,25 МЕ/мл) Фильтрация (фильтры на основе активированного угля) удаляет эндотоксины снижает концентрацию активных веществ в результате сорбции Стерилизующая фильтрация - размер пор 0.22 мкм не удаляет эндотоксины Ультрафильтрация - фильтры с пределом разделения 10 000100 000 Дальтон - эффективность удаления эндотоксинов зависит от их агрегационного состояния Ультрафильтрация - агрегация эндотоксинов (и удержание на фильтре) повышается при увеличении молярности и снижении рН раствора - агрегационное состояние эндотоксинов определяет их молекулярную массу (мономерная форма 3 000 – 25 000 Да), образование мицелл и везикул повышает молекулярную массу (100 000 – 1 000 000 Да) • Процесс депирогенизации контейнеров, используемых в испытании «Бактериальные эндотоксины», следует валидировать • Согласно USP, <85> для валидационных испытаний используется лизат с чувствительностью - не менее 0,15 МЕ/мл ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ МЕТОДА ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ИСПЫТАНИЯ НА БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ЭНДОТОКСИНЫ Причины вариабельности реактивы (лизат амебоцитов, стандартный препарат эндотоксинов) метод (гель-тромб тест и инструментальные методы, процедура испытания) физико-химические свойства антибактериального препарата лаборатория (используемое оборудование, квалификация аналитика) Лизат амебоцитов Limulus polyphemus - чувствительность определена активностью комплекса ферментов - чувствительность установлена серией 2-х кратных разведений - чувствительность установлена относительно СПЭ - буферы и детергенты добавлены в процессе производства Cтандартный препарат эндотоксина - экзогенные эндотоксины не идентичны высокоочищенному липополисахариду стандартного препарата эндотоксина (СПЭ) - точность измерения снижена при агрегации эндотоксинов - физико-химические свойства образца влияют на доступность липида-А • Методология проведения испытания - в инструментальных методах степень извлечения эндотоксинов в положительном контроле на препарат зависит от используемых материалов (пробирки/микропланшеты) и оборудования (например, «Pyros Kinetix»/«LAL 5000»); - в инструментальных методах ошибка возрастает при использовании в серии разведений СПЭ наименьших концентраций эндотоксина стандартная кривая от 1.0 МЕ/мл до 0.1 МЕ/мл стандартная кривая 5.0 МЕ/мл до 0.005 МЕ/мл – вариабельность возрастает ПРИЧИНЫ ВАРИАБЕЛЬНОСТИ МЕТОДА • в гель-тромб методе чувствительность лизата подтверждается в диапазоне 50-200 %, что указывает на систематическую 2-кратную ошибку • лизат низкой (0.125 МЕ/мл) и высокой (0.03 МЕ/мл) чувствительности может давать различный результат Endosafe times, 2006, v, 12, No 1 КАК СНИЗИТЬ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ? • Для рутинных анализов серийные разведения (СПЭ, образца) не должны различаться между испытаниями • Основной раствор СПЭ готовят так, чтобы он содержал одно и то же количество эндотоксинов (например, 1000 МЕ/мл) КАК СНИЗИТЬ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ? • Воду для инъекций используют в качестве воды для БЭТ только на первых этапах разведения образца и только для образца с большим значением МДР • Испытание на подтверждение заявленной чувствительности лизата желательно повторить (до 3 раз каждым из 3 аналитиков) ОЦЕНКА ВАРИАБЕЛЬНОСТИ КИНЕТИЧЕСКОГО ИСПЫТАНИЯ Коэффициент вариации (%, СV) для значений, полученных в параллельных пробах, позволяет оценить испытания Коэффициент вариации определяют: СV = 100% × стандартное отклонение : среднее арифметическое значения Не существует абсолютного значения СV как алгоритма «удовлетворительного» или «неудовлетворительного» испытания СV < 3 % - оценивают как «очень хороший» результат СV < 10 % - считают приемлемым результатом испытания СV от 10 % до 30 % - получают для точек с наименьшими концентрациями эндотоксина, близкими к пределу обнаружения данным методом СV > 25 % - считают «атипичным» результатом испытания, что требует дополнительной оценки Проблема LER (Low Endotoxin Recovery) – недооценка содержания эндотоксинов в препарате • ГЛС, содержащие ПАВ (например, полисорбат) и хелатор металлов (например, цитрат), маскируют эндотоксины LER (Low Endotoxin Recovery) Рабочая гипотеза (Chen et al., 2013) Механизм маскирующего действия Эндотоксин хелатор Дестабилизация структуры сурфактант Изменение агрегационного состояния Потеря способности активировать фактор С Проблема LER (Low Endotoxin Recovery) – недооценка содержания эндотоксинов в препарате • Пирогенность препаратов с LER-эффектом иногда определяется в тесте на кроликах. • Возможная стратегия: предусмотреть контроль пирогенов в тесте на кроликах и разработать подходящий метод испытания in vitro Проблема LER (Low Endotoxin Recovery) – недооценка содержания эндотоксинов в препарате • Пирогенность препаратов с LER-эффектом не определяется в тесте на кроликах • Возможная стратегия: оценить риск; предусмотреть контроль эндотоксинов в препарате до внесения сурфактанта; микробиологический контроль входного материала; разработать подходящий метод испытания in vitro
