ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ - программа президиума РАН

Название проекта: “Преклиническая стадия болезни Паркинсона: экспериментальное
моделирование и поиск диагностических маркеров”
Название Института – головного исполнителя проекта:
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.
Названия Институтов (Организаций) – соисполнителей:
Институт фармакологии РАМН,
Институт общей патологии РАМН,
Клиника нервных болезней РГМУ РФ,
ЦКБ РАН
Руководитель проекта:
УГРЮМОВ Михаил Вениаминович, зав. лабораторией, академик.
Состав коллектива, участвующего в работе по проекту:
Лаборатория гормональных регуляций:
внс Нанаев А.К., 1948 г.р., дмн (прикомандирован)
снс Сапронова А. Я., 1948 г.р., кбн
снс Пронина Т.С., 1973 г.р., кбн
снс Ершов П.В., 1973 г.р., к.м.н.
снс Люпина Ю. кбн (прикоманд.)
нс Воронова С.Н., 1957 г.р., кбн
нс Лаврентьева А.В., 1976 г.р., кбн (прикоманд.)
мнс Сорокин А.А., 1980 г.р.
мнс Насырова Д.И., 1980 г.р
мнс Уртикова Н.А., 1980 г.р.
асп. Балбашев А.В., 1981 г.р.
асп. Зиязетдинова Г.З., 1980 г.р.
асп. Киясова В.А., 1981 г.р.
асп. Кононов Д., 1981 г.р.
асп. Хаиндрава В., 1983 г.р.
Выполнены ли все поставленные задачи:
Поставленные задачи выполнены полностью.
Оригинальность полученных результатов:
Полученные результаты оригинальны, а их интерпретация в русле сформулированной
нами концепции не имеет аналогов в отечественной и мировой литературе.
Научная продукция по проекту (2007 гг.):
Получено решение о выдаче патента на изобретение. Заявка N 2006127268 /14(029632)
(Способ доклинической диагностики болезни Паркинсона у практически здоровых людей).
Абрамова М.А., Угрюмов М.В., Калас А. Вазопрессинергические нейроны у крыс в
онтогенезе: реакция на осмотическую стимуляцию и ее модулирование
норадренергическими афферентами. Российский физиол. журнал им. И.М. Сеченова,
2007, 93, 8, 827-833.
Пронина Т. С., Калас А., Сейф И., Воронова С. Н., Нанаев А. К., Угрюмов М. В.
1
Миграция и дифференцировка нейронов, продуцирующих гонадотропин-рилизинггормон, в условиях избытка серотонина в мозгу у плодов мышей. Журнал эволюц.
биохимии и физиологии, 2007, 43, 3, 299-305
Угрюмов М.В. Нейроны мозга, частично экспрессирующие моноаминергический
фенотип: локализация, развитие и функциональное значение. Успехи физиол. наук. 2007,
38, 2, 3-25
Угрюмов М.В. Экспрессия ферментов синтеза дофамина в недофаминергических
нейронах: функциональное значение и регуляция. Успехи физиол. наук, 2007, 38, 4, 3-20
Us K.S., Klodt P.M., Kudrin V.S., Sapronova A.Ya., Ostrovskaya R.U., Ugrumov M.V., and
Rayevsky K.S. The Effect of the Synthetic Neuroprotective Dipeptide Noopept on Glutamate
Release from Rat Brain Cortex Slices. Neurochemical Journal, 2007, v.1, №2, 138-142
Зиязетдинова Г.З., Сапронова А.Я., Киясова В.А., Нанаев А.К., Кудрин В.С., , Мартина Н.,
Тийе И., Угрюмов М.В. Компенсаторная реакция при дегенерации дофаминергических
нейронов аркуатного ядра у крыс. Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 2008,
44, 1, 72-77.
Ugrumov M.V. (2008) Brain neurons partly expressing monoaminergic phenotype: distribution,
development and functional significance in norm and pathology. Heidelberg, Springer,
Handbook of Neurochemistry and Molecular Neurobiology.
ОТЧЕТ ПО ПРОЕКТУ
“Преклиническая стадия болезни Паркинсона: экспериментальное моделирование и поиск
диагностических маркеров” за 2007 г.
Введение
Мозг, участвующий в регуляции важнейших функций организма, представляет
собой совокупность огромного количества нейрональных ансамблей. Межнейрональные
взаимодействия в пределах нейрональных сетей и регуляторного влияния на клетки и
органы-мишени
обеспечиваются
химическими
сигнальными
молекулами
нейротрансмиттерами, нейромодуляторами и нейрогормонами (Угрюмов, 1999).
Нарушение метаболизма этих сигнальных молекул, возникающее при гибели
синтезирующих их нейронов, у человека приводит к тяжелейшим нейродегенеративным
заболеваниям (НДЗ). К ним в частности относится болезнь Паркинсона (БП), ведущим
патогенетическим звеном которой является дегенерация дофаминергических (ДАергических) нейронов нигростриатной система мозга (Pogarell and Oertel, 1999).
В развитии НДЗ выделяют две основные стадии. Так, БП, как, вероятно, и другие
хронические НДЗ, в течение первых 20-30-ти лет протекает без проявления клинических
симптомов, а поэтому эта стадия названа преклинической, или досимптомной. После
проявления симптомов, уже в клинической стадии, обычно в возрасте 50-60 лет,
заболевание быстро прогрессирует и, несмотря на проведение патогенетического лечения,
приводит сначала к инвалидизации больного, а затем и к летальному исходу.
Более детальный анализ показал, что первые симптомы проявляются при
дегенерации 80% ДА-ергических нейронов нигростриатной системы. При этом был
сделан вывод о том, что нормальная регуляция моторного поведения может
обеспечиваться 20% ДА-ергических нейронов, а, следовательно, оправдана современная
методика лечения больных, направленная на поддержание функциональной активности
сохранившихся нейронов (Berheimer et al., 1973; Kish et al., 1988).
В рамках программы «Фундаментальные науки – медицине» и проекта "Новые
представления о патогенезе нейроэндокринопатий (синдром гиперпролактинемии) и
неврологических заболеваний (болезнь Паркинсона), обусловленных дегенерацией
2
дофаминергических нейронов мозга" (2002-2006 гг.) нами было показано, что по мере
дегенерации ДА-ергических нейронов включаются механизмы пластичности мозга,
направленные на компенсацию функциональной недостаточности дегенерирующих
нейронов, а в конечном итоге на устранение дефицита ДА, ключевого химического
сигнала, вовлеченного в регуляцию моторного поведения (Угрюмов, 2007а,б; Ugrumov,
2008). Исходя из этих данных переход заболевания из преклинической в клиническую
стадию означает то, что регуляторная ДА-ергическая система необратимо разрушена и
резервы компенсаторных процессов истощены, а, следовательно, лечение этих больных a
priori не может быть эффективным. Очевидно, поэтому в течение почти двухсот лет со
времени идентификации БП как нозологической формы не было вылечено ни одного
больного. При этом становится очевидной необходимость разработки преклинической
диагностики и профилактического лечения, которое следует начинать как можно раньше в
преклинической стадии.
Клиническим
исследованиям
должно
предшествовать
адекватное
экспериментальное моделирование БП. Однако большинство используемых в настоящее
время моделей воспроизводят с помощью нейротоксинов острую клиническую стадию
заболевания, вызывая быструю дегенерацию 70-80% ДА-ергических нейронов в 50-100
раз более короткий период времени, чем это происходит у больного с учетом видовой
продолжительности жизни. Очевидно, что такой короткий период развития
паркинсонизма недостаточен для проявления в полной степени компенсаторных
механизмов. Отсюда вытекает необходимость создания экспериментальной модели
паркинсонизма в досимптомной фазе, что позволило бы в полной степени изучить
развивающиеся при этом компенсаторные механизмы, а также осуществить поиск
эндогенных физиологических, биохимических, электрофизиологических и молекулярных
маркеров преклинической фазы болезни Паркинсона.
Целью проекта 2007 г. явилось продолжение разработки экспериментальной модели
досимптомной стадии БП и поиск периферических биологических маркеров у больных.
Задачи:
 Разработка модели досимптомной стадии паркинсонизма у мышей;
 Оценка уровня пролактина как потенциального маркера преклинической стадии
БП в крови у пациентов.
6. Полученные результаты и их обсуждение
Разработка модели пролонгированной преклинической стадии БП у мышей
Согласно нашим предварительным данным, полученным в 2006 году, для
моделирования досимптомной стадии паркинсонизма
достаточно использовать
однократное
введение
1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина
(МФТП),
специфического нейротоксина. Основными характеристиками модели были выбраны: (а)
моторное поведение, определяемое по скорости перемещения животного, времени
замирания животных, числу стоек и длине шага; (б) метаболизм ДА в черной субстанции
– в области локализации тел ДА-ергических нейронов, и в стриатуме – в области проекций
аксонов ДА-ергических нейронов черной субстанции, оцениваемый с помощью
высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией; (в)
числа ДА-ергических нейронов в черной субстанции, выявляемых иммуноцитохимически
по наличию тирозингидроксилазы – первого скорость-лимитирующего фермента синтеза
ДА.
3
В 2007 году проводился поиск: (а) максимальной дозы МФТП, при которой бы еще
не происходило нарушение моторной функции и отсутствовали бы метаболические и
органические изменения в нигростриатной ДА-ергической системе, (б) минимальной дозы
МФТП, при которой проявилось бы нарушение моторной функции на фоне выраженных
метаболических и органических изменений в нигростриатной ДА-ергической системе, (в)
промежуточных доз, при которых отсутствовали бы изменения моторного поведения, но
проявились бы изменения в метаболизме ДА в нигростриатной системе и дегенерировала
бы часть ДА-ергических нейронов. МФТП вводили мышам обычно однократно и лишь в
одном опыте двукратно подкожно, оценивая эффект через две недели, т.е. в то время,
когда МФТП мог уже вызвать дегенерацию ДА-ергических нейронов и соответствующие
изменения метаболизма ДА.
При минимальных используемых дозах 4 мг/кг и 8 мг/кг отсутствовали изменения
по всем показателям, хотя у отдельных животных проявилась незначительная тенденция
к снижению содержания ДА в стриатуме. Другими словами, введение нейротоксина в
дозе по крайней мере до 8 мг/кг не вызывает патологических изменений в нигростриатной
ДА-ергической системе и не приводит к развитию паркинсонизма даже в досимптомной
стадии.
При максимальной используемой дозе 20 мг/кг наблюдалось: (а) изменение
моторного поведения, однако только по одному - наиболее чувствительному показателю –
длине шага (уменьшение); (б) снижение содержания ДА в черной субстанции на 50% и в
стриатуме на 75%; (в) снижение числа ДА-ергических нейронов в черной субстанции на
75%. Это означает, что МФТП в дозе 20 мг/кг вызывает развитие паркинсонизма,
имитируя раннюю клиническую стадию.
При использовании промежуточных доз МФТП 12 мг/кг и 16 мг/кг отсутствовали
изменения моторного поведения по всем использованным показателям, а также
отсутствовали метаболические изменения ДА в черной субстанции. При этом
концентрация ДА в стриатуме снижалась соответственно на 40% и 50%, а число ДАергических нейронов в черной субстанции уменьшалось на 25% и 35%. Эти данные
являются показателем того, что однократное введение МФТП в дозе от 12 мг/кг до 16
мг/кг приводит к развитию досимптомной (преклинической) стадии паркинсонизма, т.е.
отвечает всем сформулированным ранее требованиям к этой модели – отсутствию
изменения моторного поведения, снижению синтеза ДА в ДА-ергических нейронах
нигростриатной системы не более чем на 75%, дегенерации ДА-ергических нейронов
черной субстанции не более чем на 80%. Особый интерес вызывает тот факт, что в черной
субстанции не изменилась концентрация ДА и, вероятно, уровень его синтеза, несмотря на
дегенерацию около трети всех ДА-ергических нейронов. По всей вероятности, это
объясняется компенсаторным усилением синтеза ДА в выживших нейронах за счет
усиления экспрессии тирозингидроксилазы и/или активности этого фермента, что следует
выяснить в будущих исследованиях. В этом случае необходимо понять, почему при
компенсаторном усилении синтеза ДА и его повышенном содержании в телах ДАергических нейронов черной субстанции, в аксонах этих же нейронов в стриатуме
содержание ДА снижено. Скорее всего это является результатом компенсаторного
усиления выделения ДА из терминалей аксонов для поддержания нормального уровня
межклеточного ДА.
В отличие от предыдущих экспериментов, в одном из опытов было использовано
двукратное введение МФТП в дозе 8 мг/кг с интервалом в одну неделю. Через две недели
после первого ведения и, следовательно, через неделю после второго введения
отсутствовали изменения моторного поведения по всем использованным тестам, а также
метаболизма ДА в черной субстанции. При этом наблюдалось снижение содержания ДА в
стриатуме на 25% и уменьшение числа ДА-ергических нейронов в черной субстанции на
15%. Эта модель, также как и предыдущая модель с однократным введением МФТП,
имитирует досимптомную фазу болезни Паркинсона. При этом она открывает новые
4
возможности имитации постепенной растянутой во времени дегенерации ДА-ергических
нейронов черной нигростриатной системы у одного и того же животного, что и
происходит у больного при болезни Паркинсона.
(Работа проводилась совместно с Институтом фармакологии РАМН (зав. лабораторией член-корреспондент РАМН К.С. Раевский) и Институтом общей патологии РАМН (зав.
лабораторий - академик РАМН Г.Н. Крыжановский)
Оценка уровня пролактина в крови как потенциального маркера преклинической стадии
БП в крови у пациентов.
В клиническом исследовании в крови у девяти пациентов с подозрением на БП, т.е.
сразу же после появления у них первых симптомов и до начало специфической терапии
ДОФА-содержащими
препаратами,
была
оценена
концентрация
пролактина
потенциального биологического периферического маркера преклинической стадии БП.
Диагноз БП со временем подтвердился у семи больных. Кровь у больных и у контрольных
испытуемых брали несколько раз в течение суток. Если в дневное время различий в
концентрации пролактина в крови у больных и в контроле не было, то в ранние утренние
часы уровень пролактина у трех больных был существенно выше, чем в контроле. Эти
предварительные данные свидетельствуют о том, что одним из относительно
специфичных биологических маркеров БП могут быть особенности циркадных ритмов
секреции пролактина. Поскольку гиперпролактинемия – синдром, проявляющийся не
только при дегенерации ДА-ергических нейронов гипоталамуса, но и при других видах
патологии немозгового происхождения, уровень пролактина в крови является
относительно специфичным маркером, который и в нашем исследовании проявился
только у части больных.
Работа по скринингу биологических маркеров БП у больных проводится на базе ЦКБ
РАН совместно с Клиникой нервных болезней РГМУ (рук. – академик РАМН Е.И. Гусев).
Эти исследования будут неизбежно сильно растянуты во времени ввиду объективных
трудностей поиска такого рода больных и работы с ними. Поэтому в этом году получен
только небольшой объем предварительных данных, которые необходимо существенно
дополнить для того, чтобы придти к определенным выводам.
Заключение
В 2007 году была разработана экспериментальная модель досимптомной стадии
паркинсонизма у мышей путем однократного системного введения МФТП,
специфического нейротоксина ДА-ергических нейронов. Поиск оптимальной дозы
МФТП, приводящий к развитию досимптомной стадии БП, проводили на основе
комплексной физиологической, биохимической и морфологической оценки влияния этого
нейротоксина на моторное поведение животных, метаболизм ДА в ДА-ергических
нейронах нигростриатной системы и гибель ДА-ергических нейронов. Показано, что
МФТП в дозе 12 и 16 мкг/кг веса тела не влияет на моторное поведение, однако снижает
концентрацию ДА в стриатуме на 40-50% и вызывает дегенерацию 25-35% ДА-ергических
нейронов в черной субстанции. При этом по косвенным данным компенсаторно
повышается уровень синтез ДА в выживших ДА-ергических нейронов в черной
субстанции и усиливается выделение ДА из терминалей ДА-ергических аксонов в
стриатуме. Разработка модели досимптомной стадии паркинсонизма позволит начать в
ближайшее время изучение компенсаторных механизмов, включающихся при
дегенерации ДА-ергических нейронов, и поиск биологических периферических маркеров
дегенерации этих нейронов в мозге.
Получены предварительные данные, свидетельствующие о том, что циркадные ритмы
секреции пролактина у пациентов на ранней клинической стадии БП отличаются от
таковых у контрольных испытуемых. Эти данные позволяют предположить, что
5
пролактин является потенциальным
преклинической стадии БП.
биологическим
периферическим
маркером
Цитируемая литература
Угрюмов М.В. (1999) Механизмы нейроэндокринной регуляции. Москва, Наука.
Угрюмов М.В. (2007а) Нейроны мозга, частично экспрессирующие моноаминергический
фенотип: локализация, развитие и функциональное значение. Успехи
физиологических наук. 2007, 38, 2, 3-25
Угрюмов М.В. (2007б) Экспрессия ферментов синтеза дофамина в недофаминергических
нейронах: функциональное значение и регуляция. Успехи физиол. наук, 2007, 38, 4,
3-20
Berheimer, H., Birkmayer, W., Hornykiewicz, O., Jellinger, K., and Seitelberger, F., 1973, Brain
dopamine and the syndromes of Parkinson and Huntington: clinical, morphological and
neurochemical correlations. J. Neurol. Sci. 20, 415.
Kish, S.J., Shannak, K., and Hornykiewicz, O., 1988, Uneven pattern of dopamine loss in the
striatum of patients with idiopathic Parkinson’s disease: pathophysiologic and clinical
implications, N. Engl. J. Med., 318, 876.
Pogarell, O., and Oertel, W.H., 1999, Parkinsonian syndromes and Parkinson’s disease:
diagnosis and differential diagnosis, in: Parkinson's Disease, The Treatment Options, P.
LeWitt, and W. Oertel, eds., Martin Dunitz Ltd.:629-635.
Ugrumov M.V. (2008) Brain neurons partly expressing monoaminergic phenotype: distribution,
development and functional significance in norm and pathology. Heidelberg, Springer,
Hanbook of Neurochemistry and Molecular Neurobiology.
Руководитель проекта
академик
М.В. Угрюмов
6