Пластичность нигростриатной дофаминергической системы при

На правах рукописи
Козина Елена Александровна
ПЛАСТИЧНОСТЬ НИГРОСТРИАТНОЙ ДОФАМИНЕРГИЧЕСКОЙ
СИСТЕМЫ ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ПАРКИНСОНИЗМА У МЫШЕЙ
03.03.01. – физиология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва - 2012
Работа выполнена в лаборатории гормональных регуляций Федерального
государственного бюджетного учреждения науки Института биологии развития
им. Н.К. Кольцова Российской академии наук
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор, академик РАН
Угрюмов Михаил Вениаминович
Официальные оппоненты:
Раевский Владимир Вячеславович - доктор биологических наук, профессор,
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высшей
нервной деятельности и нейрофизиологии Российской академии наук,
руководитель лаборатории нейроонтогенеза
Ковалев Георгий Иванович - доктор медицинских наук, профессор,
Федеральное
государственное
бюджетное
учреждение
«Научноисследовательский институт имени В.В. Закусова» Российской академии
медицинских наук, руководитель лаборатории радиоизотопных методов
исследований
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Московский научноисследовательский институт психиатрии» Министерства здравоохранения и
социального развития Российской Федерации
Защита диссертации состоится « 18 » апреля 2012 г. В 1400 часов на заседании
Диссертационного совета Д 002.238.01 при Федеральном государственном
бюджетном учреждении науки Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова
Российской академии наук по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, 26
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального
государственного бюджетного учреждения науки Института биологии развития
им. Н.К. Кольцова Российской академии наук по адресу: 119334, Москва, ул.
Вавилова, 26
Автореферат разослан «
» марта 2012 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета,
кандидат биологических наук
e-mail:
ele0806@yandex.ru
Е.Б. Абрамова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Одним из наиболее распространенных
нейромедиаторов в мозге является дофамин. Нарушение метаболизма
дофамина при гибели синтезирующих его нейронов у человека приводит к
развитию одного из тяжелейших нейродегенеративных заболеваний - болезни
Паркинсона (БП) (Bernheimer et al., 1973; Agid, 1991). В основе патогенеза БП
лежит деградация дофаминергической нигростриатной системы мозга,
обеспечивающей
регуляцию
двигательных
функций.
Характерной
особенностью БП является длительное бессимптомное течение на протяжении
многих лет, что, предположительно, обусловлено включением механизмов
пластичности мозга. Появление со временем симптомов БП связывают не
только со значительной деградацией нигростриатной системы, но и с
практически полным истощением компенсаторных резервов мозга (Agid, 1991).
В силу невозможности изучения эндогенных процессов, протекающих в
мозге человека на досимптомной стадии БП, вопрос о развитии
нейродегенеративных и компенсаторных процессов на ранних стадиях
заболевания до сих пор остается открытым и является актуальной проблемой
нейронауки. Важно отметить, что фармакотерапия БП, которая начинает
проводиться только после появления двигательных нарушений, со временем
становится менее эффективной и приводит к появлению ряда осложнений
(Mones et al., 1971; Poewe, 2006). В данной ситуации становится очевидной
необходимость разработки доклинической диагностики и превентивного
лечения БП. Однако создание подобных технологий невозможно без
комплексного изучения механизмов пластичности мозга на ранней
досимптомной стадии заболевания. Единственно возможным способом
изучения ранних нейродегенеративных и компенсаторных изменений в мозге
является экспериментальное моделирование БП на животных, причем основной
акцент при моделировании необходимо сделать на длительное развитие
нейродегенеративных процессов. В большинстве экспериментальных
исследований БП, создаются модели, при которых у животных в течение
короткого времени развивается симптомная стадия заболевания. При таких
способах моделирования невозможно оценить не только компенсаторные
процессы, включающиеся на длительной досимптомной стадии, но и те
изменения, которые запускают переход заболевания из одной стадии в другую.
Именно эти изменения могут служить в дальнейшем мишенью для поиска
лекарственных средств, предотвращающих появление симптомов заболевания.
3
Таким образом, вопрос о разработке экспериментальной модели
пролонгированной досимптомной стадии БП до сих пор остается актуальным,
причем особый акцент при моделировании необходимо сделать на медленное и
постепенное развитие патологических процессов в нигростриатной
дофаминергической системе.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлась разработка
экспериментальной модели пролонгированной во времени досимптомной
стадии БП, а также изучение механизмов пластичности мозга на досимптомной
стадии различной протяженности (коротко- и длительно-развивающейся).
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. С помощью нейротоксина 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин
(МФТП) разработать модель пролонгированного развития БП.
2. На моделях досимптомной и симптомной стадий БП в черной субстанции
и в стриатуме оценить:
а) содержание моноаминов и их метаболитов;
б) количество тел дофаминергических нейронов и терминалей их
аксонов;
в) содержание мРНК и белка тирозингидроксилазы, а также ее
ферментативную активность.
г) Содержание мРНК Д2-рецепторов
3. Провести анализ иннервации дорзального стриатума при моделировании
БП.
4. Оценить метаболизм МФТП в дофаминергической нигростриатной
системе при его хроническом введении.
Научная новизна. Впервые путем введения нейротоксина МФТП в
течение длительного времени смоделировано несколько последовательных фаз
хронической досимптомной стадии БП и ее дальнейший переход в симптомную
стадию. Получен ряд важных данных о замедлении скорости развития
нейродегенеративного процесса, а именно - замедлении скорости снижения
уровня дофамина и дегенерации дофаминергических терминалей в стриатуме, а
также активации компенсаторных процессов в нигростриатной системе и за ее
пределами при длительном введении МФТП.
Впервые показано, что при моделировании БП с помощью МФТП у
животных развиваются адаптационные процессы, происходящие на уровне
изменения захвата нейротоксина в дофаминергические нейроны и
направленные на выработку устойчивости нейронов к токсическому действию
МФТП.
4
Научная и практическая значимость работы. Разработанная модель
хронической досимптомной стадии БП в дальнейшем может быть использована
для:
а) поиска периферических эндогенных маркеров досимптомной стадии БП;
б) разработки превентивной лекарственной терапии, основанной на
снижении чувствительности нейронов нигростриатной системы к
действию экзогенного или эндогенного токсина и направленной на
остановку или замедление дегенерации дофаминергических нейронов.
Личное участие автора. Автором были спланированы и выполнены все
эксперименты, описанные в работе, за исключением части экспериментов по
анализу моторного поведения животных и высокоэффективной жидкостной
хроматографии, которые были проведены совместно с Институтом патологии и
общей патофизиологии РАМН и Институтом фармакологии РАМН.
Поставленные задачи были решены с применением современных методов
физиологии, клеточной и молекулярной биологии. Выводы сформулированы на
основе собственных оригинальных данных.
Апробация работы. Материалы диссертации были обсуждены на
российских и международных симпозиумах: конференция «Механизмы
нервных и нейроэндокринных регуляций» (Москва, 2008); «2-й Съезд
физиологов СНГ» (Кишинев, 2008); конференция «Нейрохимические
механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга»
(Санкт-Петербург, 2008); «39th annual meeting Society for Neuroscience» (Чикаго,
2009); «The Second International Workshop on Image Mining - Theory and
Applications» (Lisboa, 2009); «XXI съезд Физиологического общества им. И.П.
Павлова» (Калуга, 2010); «II Национальный Конгресс по болезни Паркинсона
и расстройствам движений» (Москва, 2011); «41st annual meeting Society for
Neuroscience» (Вашингтон, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статей в
рецензируемых журналах из списка ВАК, 1 статья в зарубежном
рецензируемом журнале, 1 глава в коллективной монографии и 27 тезисов
конференций.
Работа поддержана грантами: РФФИ 09-04-12106-офи_м; Российский фонд
гуманитарных наук 09-06-00543a; Научные школы 2110.2008.4; Программа
Президиума РАН “Фундаментальные науки - медицине”; РФФИ-10-04-93108НЦНИЛ_а.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения,
обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов,
5
обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 342 источника.
Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, содержит 38
рисунков и 9 таблиц.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Животные, схема эксперимента. В работе использовано 260
мышей-самцов линии C57BL/6 в возрасте 2-2,5 месяца и весом 22-26 г на
момент начала эксперимента. Для моделирования хронически развивающегося
паркинсонизма животным однократно раз в неделю подкожно вводили МФТП
(Sigma, США) в дозе 12 мг/кг в течение 5, 7 и 10 недель (обозначается как 5х12,
7х12, 10х12). В контроле животным, по аналогичной опытным животным
схеме, вводили физиологический раствор (0.9% NaCl). В экспериментах по
определению активности тирозингидроксилазы (ТГ) опытным и контрольным
животным за 30 минут до декапитации внутрибрюшинно вводили ингибитор
второго фермента синтеза дофамина (ДА) – декарбоксилазы ароматических Lаминокислот (ДАА) - 3-гидроксибензилгидразин (NSD-1015) (Sigma, США) в
концентрации 100 мг/кг (Carlsson, 1973).
Для воспроизведения модели быстроразвивающегося паркинсонизма
(«острая» модель) использовались следующие схемы введения МФТП: (а)
двукратно с 2-х часовым интервалом в дозе 12 мг/кг для моделирования
поздней досимптомной стадии (обозначается как 2х12); (б) четырехкратно с 2-х
часовым интервалом в дозе 12 мг/кг для моделирования ранней симптомной
стадии (обозначается как 4х12).
Оценка поведения. В хронических экспериментах каждые 7 дней
(накануне перед следующей инъекцией МФТП) животных тестировали в
"открытом поле" (Opto-Varimex-3, "Columbus instruments", США). В течение 3-х
минут измеряли пройденный путь, время без движений и число вертикальных
стоек (Kryzhanovsky et al. 1997). Дополнительно определяли длину шага
(Tillerson et al. 2003). Используемые поведенческие тесты позволяют выявить
основные симптомы БП – гипокинезию, атаксию и ригидность (Muralikrishnan
and Mohanakumar 1998; Sedelis et al., 2001).
Взятие материала. В хронических экспериментах сбор материала
проводили через неделю после последней инъекции МФТП. Животных из
экспериментальных и контрольных групп декапитировали, извлекали мозг и
разрезали его по среднесагиттальной плоскости. Из правой половины мозга
выделяли черную субстанцию (ЧС) и стриатум (Козина и др., 2010), а затем в
образцах измеряли содержание моноаминов с помощью высокоэффективной
6
жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (ВЭЖХ-ЭД).
Левую половину мозга фиксировали иммерсией в 4% параформальдегиде,
промывали в фосфатно-солевом буфере, инкубировали в 20%-й сахарозе и
замораживали в гексане (Lecbiopharm, Россия). Для проведения ПЦР и
определения активности ТГ, ЧС и стриатум выделяли из обоих полушарий
мозга. В экспериментах с использованием острой модели БП (2х12 и 4х12) сбор
материала проводили через 2 недели после введения МФТП.
ВЭЖХ.
Определение
содержания
ДА,
метаболитов
ДА
дигидроксифенилуксусной кислоты (ДОФУК), гомованилиновой кислоты
(ГВК), а также норадреналина (НА), серотонина (5-гидрокситриптамин, 5-ГТ) и
метаболита серотонина - 5-гидроксииндолуксусной кислоты (5-ГИУК) в ЧС и в
стриатуме проводили на обращѐнно-фазной колонке ReproSil-Pur, ODS-3,
4×100 мм с диаметром пор 3 мкм (Dr. Majsch GMBH, «Элсико», Россия) в 0.1M
цитратно-фосфатном буфере, содержащем 1.1 мM октансульфоновую кислоту,
0.1 мM ЭДТА и 9% ацетонитрил с последующей электрохимической детекцией
на стеклоугольном электроде (+0.85 V). В экспериментах по определению
активности ТГ в собранных образцах оценивали содержание L-3,4дигидроксифенилаланина (L-ДОФА), которое является показателем активности
данного фермента.
Кроме этого, после десяти недель введений МФТП в опыте и 0.9% NaCl в
контроле определяли содержание 1-метил-4-фенил-пиридин иона (МФП+) в ЧС
и в стриатуме. Для этого всем животным на 11-й неделе дополнительно
однократно вводили МФТП в дозе 12 мг/кг и через 20 минут после инъекции
выделяли ЧС и стриатум. Определение содержания МФП+ проводили при
помощи ВЭЖХ-УФ по модифицированной методике, описанной ранее
Кавасаки с соавторами (Kawasaki et al., 2007). Измерение проводили на
хроматографе Agilent 1100 с диодно-матричным детектором при длине волны
поглощения 295 нм. В состав мобильной фазы входили 50 мМ KH 2PO4 и 15%
ацетонитрил. Все биохимические данные представлены в виде изменения
содержания измеряемых веществ в опыте по отношению к контролю,
принятому за 100%.
Стереотаксические инъекции. Для анализа иннервации стриатума при
моделировании БП через 2 недели после четырехкратного введения МФТП в
дозе 12 мг/кг (4х12) в опыте и 0.9% NaCl в контроле проводили
стереотаксические инъекции флуоресцентного ретроградного трейсера в
стриатум. Инъекции (0.5 мкл) 10% раствора трейсера (FluoroRuby, Invitrogen,
США) проводили в область дорзального стриатума правой половины мозга.
7
Через неделю после инъекции трейсера проводили транскардиальную
перфузию сначала 0.02 М фосфатно-солевым буфером в течение 15 минут, а
затем охлажденным (до +4°С) 4% параформальдегидом на 0.2 М фосфатном
буфере в течение 15 мин. После этого мозг постфиксировали погружением в
тот же фиксатор, промывали в 0.02 М фосфатно-солевом буфере, инкубировали
в 20% сахарозе и замораживали в гексане.
Иммуноцитохимия. Для моно-иммуномечения ТГ на криостате Leica
(Leica CM1850, Германия) приготавливали фронтальные серийные срезы ЧС
толщиной 20 мкм и фронтальные срезы стриатума толщиной 12 мкм. В работе
использовали кроличьи поликлональные антитела к ТГ (1:2000) (предоставлены
проф. Тибо, Франция), вторые биотинилированные антитела (1:200) (Vector
Laboratories, США) и авидин-биотиновый комплекс, связанный с пероксидазой
(Vector Laboratories, США). Пероксидазу авидин-биотинового комплекса
выявляли инкубацией с диаминобензидином (Sigma, США) и H2O2.
Для двойного иммунофлуоресцентного мечения ТГ и ДАА в аксонах
стриатума на «плавающих» срезах толщиной 30 мкм использовали овечьи
поликлональные антитела к ТГ (1:700) (Chemicon, США), поликлональные
антитела к ДАА (1:300) (Abcam, США), вторые антитела, меченные
флуоресцеинизотиоционатом (FITC) (1:40) (Sigma, США) и вторые антитела,
меченные цианином (Су3) (1:500) (Sigma, США).
Микроскопия, анализ изображений. Срезы ЧС после моноиммуномечения на ТГ исследовали в микроскопе Olympus BX51 (Япония),
оснащенном цифровой камерой Olympus DP70 (Япония), при увеличении
объектива ×10. Изображения срезов анализировали с помощью программы
АnalySIS 5.0. (Olympus, Япония): на каждом срезе обводили область компактной
части ЧС, содержащей тела ДА-ергических нейронов, после чего подсчитывали
число нейронов, причем только с видимым ядром. Для исключения двойного
подсчета нейронов, расположенных на соседних срезах, использовали метод
Аберкромби (Abercrombie, 1946).
Для количественного анализа терминалей аксонов срезы стриатума после
двойного иммуномечения на ТГ и ДАА исследовали с помощью конфокального
микроскопа Leica TCS SP1 (Германия). Полученные в конфокальном
микроскопе «оптические» срезы толщиной 0.2 мкм анализировали с помощью
программы ImageJ (NIH, США). Аксональные терминали подсчитывали в
дорзальном стриатуме на площади среза 900 мкм2.
Для полуколичественного анализа ТГ в нейронах ЧС на каждом десятом
срезе обводили все нейроны в компактной части ЧС. Оптическую плотность
8
нейронов, коррелирующую с концентрацией ТГ, определяли как «уровень
серого» по следующей формуле: оптическая плотность = log (уровень серогофона
/уровень серогосигнала). Для полуколичественного анализа ТГ в волокнах
стриатума использовалась разработанная совместно с Вычислительным
Центром им. А.А. Дородницына РАН в ходе данной работы программа
«Striatum Image Analysis» (Gurevich et. al., 2010).
ПЦР в реальном времени. Содержание мРНК ТГ и Д2-рецепторов в ЧС и в
стриатуме оценивали методом ПЦР в реальном времени. После выделения РНК
из образцов проводили реакцию обратной транскрипции с помощью кита
RevertAid™ H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, США), после
чего проводили ПЦР с использованием интеркалирующего красителя
SYBRGreen (Maxima SYBR Green Kit, Fermentas) на приборе IQ5 Cycler (Biorad,
США). Для определения содержания мРНК ТГ использовали следующие
праймеры:
5'-CGCTGGATACGAGAGGCATAG-3',
5'
GTCAGAGGAGCCCGAGGTC-3' (Синтол, Россия). Для определения
содержания мРНК Д2-рецепторов использовали следующие праймеры: 5'GTGGTGACTGGGAGGGATGG-3', 5'-GTGAACAGGCGGAGAATGGATG-3'.
При стандартизации реакции определяли содержание мРНК актина (housekeeping
gene)
по
двум
последовательностям
праймеров:
5'CCAGAGGCATACAGGGACAGC-3' и 5'-TGGCACCACACCTTCTACAATG-3'.
Количественную разницу в экспрессии между опытными и контрольными
образцами определяли по формуле: 2-∆∆C(t).
Определение активности транспортера дофамина в срезах мозга ex
vivo. После десяти недель введений МФТП для определения активности
транспортера ДА использовали метод инкубации срезов ЧС и стриатума с
меченым тритием ДА (3Н-ДА), описанный ранее (Хакимова и др., 2011).
Статистическая обработка результатов. Полученные данные
обрабатывали статистически с помощью F-теста для определения однородности
выборки и t-теста Стьюдента для определения достоверности различий.
Результаты и обсуждение
Двигательная активность животных. Через неделю после инъекций
МФТП в дозе 12 мг/кг в течение 5 и 7 недель в экспериментальных группах по
сравнению с контрольными не обнаружено различий по всем используемым
показателям двигательной активности (Табл. 1). Однако через 10 недель
введений МФТП наблюдались изменения двух показателей из четырех пройденный путь и длина шага снизились по сравнению с контролем на 23% и
9
17% соответственно (Табл. 1). Таким образом, через 5 и 7 недель введений
МФТП была получена модель досимптомной стадии паркинсонизма, а через 10
недель - модель ранней симптомной стадии.
Биохимические изменения в нигростриатной системе. Через 5 недель
введений МФТП содержание ДА в ЧС увеличилось на 40%, а в дальнейшем
наблюдалось снижение его содержания – через 7 недель введений МФТП - до
уровня контроля, а через 10 недель - на 40% относительно контроля (Рис. 1А).
Табл. 1. Показатели двигательной активности животных через 5, 7 и 10 недель введений
МФТП в эксперименте и 0.9% NaCl в контроле.
Показатель
Схема
введения
МФТП
5х12 мг/кг
7х12 мг/кг
10х12 мг/кг
Пройденный путь (см)
Число стоек
Время без
движения (сек)
0,9% NaCl
МФТП
0,9% NaCl
МФТП
727,3 91,7
726,6 139,0
8,0 1,4
11,0 3,0
60,7 7,2
65,6 9,4
4,5 0,3
4,6 0,3
1000,2 111,7 1008,6 125,6 14,5 2,1
10,6 2,3
42,7 4,6
45,4 7,9
4,7 0,4
4,6 0,5
14,1 1,7
51,8 5,3
64,2 5,9
5,2 0,2
4,3 0,2*
989,3 57,1
756,7 51,6*
18,8 2,9
0,9% NaCl МФТП
Длина шага (см)
0,9% NaCl МФТП
*P<0,05 по сравнению с контролем.
При этом в стриатуме снижение содержания ДА наблюдалось уже через 5
недель введений МФТП и далее продолжало постепенно снижаться (Рис. 1Б).
При этом после 10 недель введений достигло порога (80%-го снижения), что,
вероятнее всего, и привело к появлению двигательных нарушений. Помимо ДА,
в ЧС и в стриатуме на всех стадиях были проанализированы метаболиты ДА –
ДОФУК и ГВК, а также моноамины – НА, 5-ГТ и 5-ГИУК. Изменений в
содержании НА или 5-ГТ в ЧС ни на одном из сроков обнаружено не было. В
стриатуме ни на одной из полученных моделей не было обнаружено
достоверных изменений в уровне 5-ГТ, однако на модели ранней досимптомной
стадии (через 5 недель введений МФТП) наблюдалось снижение уровня НА на
44%, при этом в дальнейшем его уровень в стриатуме оставался неизменным
(Табл. 2). Можно предположить, что уменьшение концентрации НА в
стриатуме является показателем нарушения НА-ергической иннервации
стриатума на ранней стадии развития патологического процесса в
нигростриатной системе. Дальнейшее отсутствие изменений в содержании НА
в стриатуме относительно контроля может являться компенсаторным
проявлением, так называемой, недофаминергической нейротрансмиссии
(Rousselet et al., 2003), наблюдаемой при истощении ДА-ергической
нигростриатной системы.
10
Важным функциональным показателем при анализе состояния
нигростриатной
ДА-ергической
системы
является
соотношение
метаболит/медиатор, который в литературе рассматривается как показатель
оборота ДА, включающего в себя синтез, распад, выделение и обратный захват
ДА.
МФТП
160
А
120
*
120
80
*
40
0
5х12
7х12
10х12
МФТП, мг/кг
Концентрация ДА в
стриатуме, %
Содержание ДА в ЧС,%
0,9% NaCl
Б
80
*
40
0
*
5х12
*
7х12
10х12
МФТП, мг/кг
Рис. 1. Содержание ДА в черной субстанции (ЧС) (А) и концентрация в стриатуме (Б) через
5, 7 и 10 недель введений МФТП. Контроль принят за 100%. *P<0,05 по сравнению с
контролем.
Увеличение этого соотношения может интерпретироваться как
компенсаторное усиление дофаминовой ейротрансмиссии. В данной работе
увеличение соотношения ДОФУК/ДА и ГВК/ДА в стриатуме было обнаружено
через 7 недель введений МФТП, т.е. на поздней досимптомной стадии, а через
10 недель введений МФТП – с появлением первых симптомов, данное
соотношения значительно снижалось (Табл. 2).
Морфологические изменения в нигростриатной системе. Несмотря на
наличие биохимических изменений в ЧС, в компактной части ЧС отсутствовала
дегенерация ДА-ергических нейронов через 5, 7 и 10 недель введений МФТП
(Рис. 2, 3А). Также отсутствовали изменения размера (площадь и диаметр)
нейронов. При отсутствии дегенерации нейронов в компактной части ЧС, в
стриатуме на всех стадиях наблюдалась дегенерация терминалей ДАергических аксонов, содержащих оба фермента синтеза ДА - ТГ и ДАА (Рис.
3Б, 4), при этом размер выживших после введения МФТП терминалей аксонов
не изменялся.
Табл. 2. Содержание биогенных аминов и их метаболитов в стриатуме через 5, 7 и 10
недель введений МФТП в опыте и 0.9% NaCl в контроле. Контроль принят за 100%.
11
Схема введения
5х12 мг/кг
МФТП
Моноамины
0,9% NaCl
МФТП
и метаболиты
ДОФУК
100 9,3
58,3 3,6*
7х12 мг/кг
10х12 мг/кг
0,9% NaCl
МФТП
0,9% NaCl
МФТП
100 5,9
41,6 2,7*
100 4,3
15,2 2,0*
ГВК
100 10,8
57,1 3,4*
100 6,4
55,4 4,1*
100 8,2
33,9 1,5*
ДОФУК/ДА
100 2,5
116,2 4,2
100 4,8
137,7 6,5*
100 5,2
65,2 8,0*
ГВК/ДА
НА
100 8,1
100 13,1
115,4 9,6
56,8 10,2*
100 4,5
100 18,3
184,5 9,7*
114 20,8
100 7,9
100 16,3
143,3 5,1*
110,2 12,5
5-ГТ
100 4,5
94 4,2
100 2,4
107,8 6,6
100 11,8
107,5 3,5
5-ГИУК
100 8,3
104,5 8
100 2,6
107,9 6,9
100 11,7
93,7 3,5
5-ГИУК/5-ГТ
100 6,5
103,6 2,7
100 4,5
89,1 3,4
100 12,1
82,4 4,5
*P<0,05 по сравнению с контролем.
Б
А
ЧСк
ЧСр
ЧСк
ВТО
ЧСр
ВТО
Г
В
ЧСк
ЧСр
ЧСк
ЧСр
ВТО
ВТО
Рис. 2. Световая микроскопия. ТГ-иммунореактивные нейроны в компактной части черной
субстанции (ЧСк) в контроле (А) и через 5 (Б), 7 (В) и 10 (Г) недель введений МФТП.
Объектив ×10. ВТО – вентральная тегментная область; ЧСр – ретикулярная часть черной
субстанции.
12
Интересно отметить, что помимо терминалей аксонов, содержащих оба
фермента синтеза ДА, в стриатуме были обнаружены терминали, содержащие
только один из ферментов синтеза ДА - либо ТГ, либо ДАА, при этом число
моноферментных ДАА-иммунореактивных терминалей аксонов уменьшалось
после введения МФТП, а число моноферментных ТГ-иммунореактивных увеличивалось. Аналогичные результаты по изменению иннервации стриатума,
а именно увеличение количества моноферментных ТГ-иммунореактивных
терминалей аксонов, были продемонстрированы и на острых моделях БП. В
связи с этим острая модель была выбрана нами как наиболее удобная и быстровоспроизводимая модель для дальнейшего выяснения происхождения
моноферментных ТГ-иммунореактивных терминалей и аксонов стриатума.
Сочетание методов ретроградного мечения нейронов флуоресцентным
маркером (трейсером) и иммуногистохимии на ТГ позволило проанализировать
все группы нейронов, которые иннервируют стриатум в норме и после введения
МФТП. У животных после введения МФТП не было обнаружено групп
нейронов, содержащих флуоресцентный трейсер и экспрессирущих ТГ,
отличных от контрольных животных. Однако были обнаружены единичные
нейроны такого фенотипа в цингулярной коре (Рис. 5А, Б) и гранулярном слое
обонятельных луковиц (Рис. 5В, Г).
2800
А
2100
1400
700
0
5х12
МФТП
Число ТГ+/ДАА+
терминалей / срез, %
Число ТГ+ нейронов / кЧС
0,9% NaCl
7х12 10х12 10х12
МФТП, мг/кг +2х12
120
Б
100
80
60
*
*
40
*
*
20
0
5х12
7х12 10х12 10х12
МФТП, мг/кг +2х12
Рис. 3. Количество ТГ-иммунореактивных (ТГ+) нейронов в компактной части черной
субстанции (ЧС) (А) и терминалей аксонов в стриатуме (ТГ+/ДАА+ иммунореактивных) (Б)
через 5, 7 и 10 недель введений МФТП, а также аналогичные показатели через 10 недель
введений и дополнительных инъекций МФТП (10х12+2х12). Контроль принят за
100%.*P<0,05 по сравнению с контролем.
13
Таким образом, был сделан вывод, что после введения МФТП может
усиливаться регенерация (обратное отрастание) поврежденных ДА-ергических
волокон из компактной части ЧС, при этом компенсаторное усиление
экспрессии ТГ выражено ярче, чем ДАА, т.к. именно ТГ определяет скорость
синтеза ДА. Также не исключается, что может происходить снижение
экспрессии ДАА в выживших после действия нейротоксина ДА-ергических
терминалях и аксонах стриатума.
Суммируя данные о биохимических и морфологических изменениях в
стриатуме можно сделать вывод, что по мере введения МФТП происходит
замедление скорости снижения ДА и дегенерации терминалей ДА-ергических
аксонов: после первых пяти недель введений МФТП уровень ДА и число
терминалей ДА-ергических аксонов в стриатуме снизились на 50% и 47%
относительно контроля, тогда как после десяти недель введений - на 80% и 70%
относительно контроля (Рис. 6). Таким образом, при хроническом
моделировании БП наблюдается медленное и постепенное нарушение
функционирования ДА-ергической нигростриатной системы.
Компенсаторные и адаптивные изменения в нигростриатной системе.
Замедление скорости снижения ДА в стриатуме может быть связано с
увеличением активности ТГ - ключевого фермента синтеза ДА - в выживших
терминалях ДА-ергических аксонов стриатума. Действительно, оказалось, что
активность ТГ (оцениваемая по накоплению L-ДОФА через 30 минут после
введения ингибитора ДАА) в одинаковой степени снижается относительно
контроля во всех анализируемых моделях (Рис. 7). С учетом количества
дегенерировавших терминалей ДА-ергических аксонов стриатума, можно
сделать вывод о компенсаторном увеличении активности ТГ в выживших
терминалях ДА-ергических аксонов стриатума, что, вероятнее всего, и привело
к отсутствию дальнейшего снижения в них содержания ДА.
Рис. 4. Конфокальная микроскопия. Изображения аксонов и терминалей аксонов
стриатума, меченых по ТГ (А, Б, В, Г), ДАА (А', Б', В', Г') и совмещенные изображения (А'',
Б'', В'', Г'') в контроле (А, А', А'') и после 5 недель (Б, Б', Б''), 7 недель (В, В', В'') и 10 недель
(Г, Г', Г'') введений МФТП. Бар – 10 мкм.
Стрелками отмечены терминали разного фенотипа.
Рис. 5. Флуоресцентная микроскопия. Изображения нейронов, меченых трейсером (А, В) и
ТГ-иммунореактивных нейронов (Б, Г) в цингулярной коре (А, Б) и гранулярном слое
обонятельных луковиц (В, Г) после четырехкратного введения МФТП в дозе 12 мг/кг.
Объектив х40. Бар – 100 мкм.
14
Рис. 4.
А
А'
А''
Б
Б'
Б''
В
В'
В''
Г
Г'
Г''
Рис. 5.
А
b
Б
В
Г
15
160
%
ЧЕРНАЯ СУБСТАНЦИЯ
дофамин
тела нейронов
120 %
НОРМА
100
120
40%
% от контроля
140
% от контроля
СТРИАТУМ
дофамин
терминали
аксонов
НОРМА
100
80
50%
60
порог
40
появление симптомов
20
80
50%
60
20%
40
20
порог
появление симптомов
0
0
5х12
7х12
10х12
7х12
5х12
10х12
30%
Рис. 6. Графическое представление развития нейродегенеративного процесса в стриатуме
и в черной субстанции при хроническом введении МФТП в течение 5, 7 и 10 недель.
150
А
100
50
0
МФТП
Активность ТГ
в стриатуме, %
Активность ТГ в ЧС, %
0,9% NaCl
5х12
150
100
*
50
0
7х12
10х12
МФТП, мг/кг
Б
*
*
5х12
7х12 10х12
МФТП, мг/кг
Рис. 7. Активность тирозингидроксилазы (ТГ) в черной субстанции (ЧС) (А) и стриатуме
(Б) через 5, 7 и 10 недель введений МФТП. Контроль принят за 100%. *P<0,05 по сравнению
с контролем.
Несмотря на увеличение ферментативной активности ТГ в выживших
терминалях аксонов стриатума, было обнаружено, что в терминалях
происходит уменьшение содержания белка ТГ (Рис. 8Б), при этом в нейронах
компактной части ЧС практически на всех сроках введения МФТП происходит
компенсаторное увеличение содержания белка ТГ (Рис. 8А). Наиболее ярко
данный эффект был выражен через 10 недель введений МФТП. Возможными
причинами данного явления могут быть нарушение быстрого антероградного
аксонального транспорта, с помощью которого происходит перенос ТГ от тела
16
нейрона к его отростку и/или усиление активности пептидаз, разрушающих ТГ,
в терминалях стриатума. Несмотря на увеличение внутринейронального
содержания белка ТГ, после введения МФТП в нейронах ЧС не происходило
увеличение уровня мРНК ТГ (Рис. 9А), что может свидетельствовать об
увеличении скорости трансляции молекулы ТГ.
150
А
*
*
*
100
50
0
5х12
МФТП
Оптическая плотность
ТГ+ терминалей, %
Оптическая плотность
ТГ+ нейронов, %
0,9% NaCl
7х12 10х12
МФТП, мг/кг
150
100
Б
*
*
*
50
0
5х12
7х12
10х12
МФТП, мг/кг
Рис. 8. Оптическая плотность ТГ-иммунореактивных (ТГ+) нейронов компактной части
черной субстанции (А), а также ТГ-иммунореактивных терминалей стриатума (Б) через 5,
7 и 10 недель введений МФТП. Контроль принят за 100%. *P<0,05 по сравнению с
контролем.
Интересно отметить, что в стриатуме на ранней симптомной стадии
(10х12) происходило повышение содержания мРНК ТГ (Рис. 9Б). Аналогичные
результаты были получены и на ранней симптомной стадии острой модели БП,
когда после четырехкратного введения МФТП в дозе 12 мг/кг с 2-х часовым
интервалом увеличивалось содержание мРНК ТГ в стриатуме (Рис. 9В). При
этом мРНК ТГ в ЧС оставалась на неизменном уровне во всех исследуемых
моделях (Рис. 9А). Исходя из полученных данных, можно предположить, что
при значительной деградации нигростриатной системы может усиливаться
экспрессия гена ТГ в аксональных терминалях и/или «включаться» экспрессия
гена ТГ в недофаминергических нейронах стриатума.
Наряду с усилением экспрессии гена ТГ в стриатуме, на ранней
симптомной стадии также было обнаружено компенсаторное увеличение (на
15%) экспрессии гена Д2-рецепторов (рис. 10). Данный результат может
отражать увеличение количества рецепторов на мембране нейронов-мишеней
стриатума, что приводит к повышению чувствительности этих нейронов к
пониженному уровню ДА. Однако, поскольку увеличение экспрессии Д2рецепторов было не значительно, то, по-видимому, 80%-го снижения ДА в
17
для
более
Содержание мРНК ТГ
в ЧС, у.е.
0,9% NaCl
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
выраженной
5х12 7х12 10х12
данного
МФТП
Б
А
активации
*
В
5х12 7х12 10х12
МФТП, мг/кг
*
2х12 4х12
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Содержание мРНК ТГ
в стриатуме, у.е.
стриатуме не достаточно
компенсаторного процесса.
Рис. 9. Содержание мРНК тирозингидроксилазы (ТГ) в черной субстанции (ЧС) через 5, 7 и
10 недель введений МФТП (А), а также в стриатуме при хроническом (Б) и остром
моделировании БП (В). Контроль принят за 1. *P<0,05 по сравнению с контролем.
Содержание мРНК Д2
рецепторов в стриатуме, у.е.
0,9% NaCl
МФТП
1,4
1,2
*
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
5х12
10х12
7х12
МФТП, мг/кг
Рис. 10. Содержание мРНК Д2-рецепторов в стриатуме через 5, 7 и 10 недель введений
МФТП. Контроль принят за 1. *P<0,05 по сравнению с контролем.
Поскольку после 10 недель введений МФТП нами не было обнаружено
дегенерации нейронов в компактной части ЧС, то мы предприняли попытку
«сорвать» адаптационные процессы и вызвать дегенерацию нейронов ЧС путем
дополнительного двукратного введения МФТП в дозе 12 мг/кг с 2-х часовым
интервалом (2х12), поскольку подобная схема введения МФТП, вводимая
интактным животным (т.е. животным без предварительных введений МФТП)
вызывает уменьшение числа ДА-ергических нейронов компактной части ЧС на
18
25% (Хаиндрава и др. 2010). Для этого животным после десяти недель введений
МФТП на 11-й неделе (через 7 дней после последней инъекции) МФТП был
введен двукратно в дозе 12 мг/кг с 2-х часовым интервалом (обозначается как
10х12+2х12). Проведение иммуногистохимического окрашивания на ТГ и
последующего подсчета ТГ-иммунореактивных нейронов на серийных срезах
ЧС показало, что в компактной части ЧС даже при такой схеме введения
нейротоксина по-прежнему отсутствуют изменения числа ДА-ергических
нейронов (Рис. 3А). Более того, после дополнительных двукратных инъекций
МФТП наблюдалось меньшее снижение числа терминалей ДА-ергических
аксонов в стриатуме, чем после только десяти недель введений МФТП (Рис.
3Б). Таким образом, подтвердилось наше предположение о том, что в
нигростриатной ДА-ергической системе развивается ранее неизвестный
процесс адаптации к нейротоксическому действию МФТП.
Отсутствие дегенерации нейронов компактной части ЧС может быть
обусловлено включением целого ряда механизмов, развивающихся на уровне:
(а) поступления МФТП в мозг (прохождении через гематоэнцефалический
барьер); (б) его метаболизма в мозге (ферментативного превращения МФТП в
МФП+ с помощью фермента МАО Б); (в) захвата МФП+ внутрь нейрона с
помощью транспортера ДА, расположенного на мембране ДА-ергического
нейрона. Изменения на каждом из этих этапов вместе или по отдельности могут
привести к тому, что в мозг или в нейрон попадает меньшее количество
нейротоксина, а это, соответственно, приводит к уменьшению вероятности
гибели клетки. Изменения на этапе поступления МФТП, который является
предшественником нейротоксина, в мозг и его дальнейшего ферментативного
превращения в нейротоксин - МФП+, суммарно могут привести к снижению
общего содержания МФП+ в тканях мозга. Для проверки данного
предположения контрольным животным (тем, которым вводили в течение 10
недель 0.9% NaCl) и опытным животным (тем, которым вводили в течение 10
недель МФТП) однократно был введен МФТП в дозе 12 мг/кг и через 20 минут
собран материал для анализа содержания МФП+ в ЧС и в стриатуме. Оказалось,
что содержание нейротоксина МФП+ в тканях ЧС и стриатума опытных
животных аналогично его содержанию в тканях контрольных животных (Рис.
11А). Таким образом, изменение поступления МФТП в мозг и его дальнейшего
метаболизма в МФП+ были исключены как причины развития адаптации к
МФТП. Поскольку МФП+ поступает из межклеточной щели в нейрон при
помощи транспортера ДА, то на следующем этапе были проведены
эксперименты по оценке активности транспортера ДА.
19
200
А
150
150
100
50
0
МФТП
Уровень обратного
захвата 3Н-ДА, %
Концентрация МФП+, %
0,9% NaCl
ЧС
Стриатум
Б
100
*
50
0
ЧС
*
Стриатум
Рис. 11. Содержание МФП+ в черной субстанции (ЧС) и в стриатуме через 20 минут после
введения МФТП животным из контрольной и опытной групп (А), а также активность
транспортера дофамина в срезах ЧС и стриатума через 10 недель введений МФТП (Б).
Контроль принят за 100%. *P < 0,05 по сравнению с контролем.
В ходе данных экспериментов было показано, что через 10 недель
введений МФТП уровень обратного захвата 3Н-ДА через транспортер ДА в ЧС
и в стриатуме снижается по отношению к контрольным животным на 50% и
57% соответственно (Рис. 11Б). В случае стриатума снижение уровня обратного
захвата 3Н-ДА, вероятно, отчасти отражает дегенерацию терминалей ДАергических аксонов. Однако в случае ЧС, где дегенерация тел ДА-ергических
нейронов отсутствовала вовсе, снижение активности транспортера дофамина,
вероятнее всего, является адаптационным механизмом, направленным на
меньшее поступление МФП+ в нейроны. Нельзя исключить, что на ранних
стадиях развития БП у человека, при наличии эндогенного нейротоксина или
экзогенно поступающего нейротоксина, может происходить аналогичная
компенсаторная перестройка ДА-ергической нигростриатной системы для
сохранения целостности нейрональной популяции.
ВЫВОДЫ
1. С помощью нейротоксина МФТП на мышах разработана модель
пролонгированного развития БП.
2. На модели симптомной стадии БП по сравнению с досимптомной стадией
наблюдается:
а) замедление скорости снижения содержания дофамина в стриатуме
за счет увеличения активности тирозингидроксилазы в выживших
терминалях дофаминергических аксонов;
20
б) увеличение содержания белка тирозингидроксилазы в нейронах
черной субстанции и его уменьшение в аксональных терминалях
стриатума,
вероятнее
всего,
за
счет
нарушения
аксоплазматического транспорта;
в) отсутствие изменений в экспрессии гена тирозингидроксилазы в
черной субстанции и усиление его экспрессии в стриатуме.
3. При моделировании БП увеличивается число тирозингидроксилазасодержащих волокон в дорзальном стриатуме, однако усиления
иннервации стриатума из других областей мозга не обнаруживается.
4. На модели ранней симптомной стадии БП происходит уменьшение
чувствительности нейронов черной субстанции к нейротоксину МФП+ за
счет снижения активности транспортера дофамина, захватывающего
МФП+ из межклеточной щели в нейрон.
1.
2.
3.
4.
5.
Статьи в журналах, соответствующих Перечню ВАК
и рецензируемых иностранных изданиях:
Козина Е.А., Хаиндрава В.Г., Кудрин В.С., Кучеряну В.Г., Клодт П.Д.,
Бочаров Е.В., Раевский К.С., Крыжановский Г.Н., Угрюмов М.В.
Экспериментальное моделирование функциональной недостаточности
нигростриатной дофаминергической системы у мышей // Российский
физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2010. Т. 96 (3). С. 270-282.
Хаиндрава В.Г., Козина Е.А., Кучеряну В.Г., Крыжановский Г.Н., Кудрин
В.С., Клодт П.Д., Бочаров Е.В., Раевский К.С., Угрюмов М.В.
Моделирование преклинической и ранней клинической стадий болезни
Паркинсона // Журнал неврологии и психиатрии. 2010. Т. 7. С. 40-47.
Хаиндрава В.Г., Кудрин В.С., Кучеряну В.Г., Клодт П.Д., Бочаров Е.В.,
Нанаев А.К., Козина Е.А., Крыжановский Г.Н., Раевский К.С., Угрюмов
М.В. Экспериментальное моделирование клинической и преклинической
стадий болезни Паркинсона // Бюллетень экспериментальной биологии и
медицины. 2010. Т.150 (11). С. 494-497.
Gurevich I.B., Kozina E.A., Myagkov A.A., Ugryumov M.V., and Yashina V.V.
Automating extraction and analysis of dopaminergic axon terminals in images of
frontal slices of the striatum // Pattern Recognition and Image Analysis. Advances
in Mathematical Theory and Applications. 2010. V. 20 (3). P. 349-359.
Ugrumov M.V., Khaindrava V.G., Kozina E.A., Kucheryanu V.G., Bocharov
E.V., Kryzhanovsky G.N., Kudrin V.S., Narkevich V.B., Klodt P.M., Rayevsky
21
K.S. and Pronina T.S. Modeling of preclinical and clinical stages of Parkinson’s
disease in mice // Neuroscience. 2011. V. 181. P. 175-188.
6. Угрюмов М.В., Козина Е.А., Хаиндрава В.Г., Кудрин В.С., Кучеряну В.Г.,
Клодт П.Д., Наркевич В.Б., Бочаров Е.В., Крыжановский Г.Н., Раевский К.С.
Моделирование паркинсонизма у мышей при помощи МФТП: от ранней
досимптомной до поздней симптомной стадии // Технологии живых систем.
2011. №8. С. 3-13.
Глава в коллективной монографии
Угрюмов М.В., Козина Е.А. Модель досимптомной стадии паркинсонизма.
В кн.: «Нейродегенеративные заболевания: фундаментальные и прикладные
аспекты. 2010. С. 223-229.
Труды конференций
1. Gurevich I., Koryabkina I., Kozina E., Myagkov A., Niemann H., Ugrumov M.,
and Yashina V. Method for automatic extraction of dopaminergic neuron
terminals on striatum frontal section images // Image Mining Theory and
Applications - IMTA 2009 (in conjunction with VISIGRAPP 2009). 2009. P. 3039.
2. Gurevich I., Koryabkina I., Kozina E., Myagkov A., Niemann H., Ugrumov M.,
and Yashina V. Automated extraction of data for construction of Parkinson’s
disease experimental model // Pattern Recognition and Information Processing
(PRIP). 2009. P. 308-313.
Список сокращений
5-ГИУК, 5-гидроксииндолуксусная кислота;
5-ГТ, 5-гидрокситриптамин, серотонин;
L-ДОФА, L-3,4-дигидроксифенилаланин;
БП, болезнь Паркинсона;
ГВК, гомованилиновая кислота;
ДА, дофамин;
ДАА, декарбоксилаза ароматических L-аминокислот;
ДОФУК, 3,4-дигидроксифенилуксусная кислота;
МАО, моноаминоксидаза;
МФТП, 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин;
МФП+ , 1-метил-4-фенил-пиридин ион;
НА, норадреналин;
ТГ, тирозингидроксилаза;
ЧС, черная субстанция.
22