На правах рукописи Албегова Диана Заурбековна 14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология

На правах рукописи
Албегова Диана Заурбековна
ИССЛЕДОВАНИЕ НА ДОКЛИНИЧЕСКОМ УРОВНЕ ИММУНОСУПРЕССИВНЫХ ЭФФЕКТОВ
ФЛАВОНОИДОВ КОРНЯ СОЛОДКИ
14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология
14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва – 2011
1
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Научные руководители:
доктор медицинских наук,
профессор
Иван Генрихович Козлов
кандидат медицинских наук,
с.н.с.
Светлана Ивановна Павлова
Официальные оппоненты:
член-корреспондент РАМН,
профессор
Николай Львович Шимановский
доктор медицинских наук,
профессор
Александр Александрович Ярилин
Ведущая организация:
ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава»
Защита состоится «23» мая 2011 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.01 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу:
117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1.
Автореферат разослан «5» апреля 2011 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук, профессор
1
Потешкина Н.Г.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования
Переход исследований в медицине на молекулярный уровень
привел к накоплению в последние десятилетия многочисленных данных, позволивших детально описать патогенез целого ряда заболеваний. Важнейшим достижением данного этапа исследований стало выявление и характеристика молекул, появление которых либо сопутствует патологическому процессу, либо играет ведущую роль в его
возникновении (молекулярные маркеры заболевания и/или «патологические молекулы»). Принципиальное изменение ситуации произошло в
связи с завершением интенсивных исследований в иммунологии, биотехнологии и молекулярной биологии. В результате развития этих областей сформировалась унифицированная идеология, так называемой, прицельной или мишень-направленной терапии. В связи с этим
поиск новых таргетных лекарственных средств, способных селективно
корригировать ключевые звенья патогенеза того или иного заболевания приобретает все большую актуальность.
Одним из перспективных направлений в этой области является
разработка менее токсичных и более специфичных иммуносупрессивных лекарственных средств. В настоящее время в качестве иммуносупрессантов широко используются цитостатики, глюкокортикостероиды и ингибиторы кальциневрина. Цитотоксические противоопухолевые препараты (иммуносупрессанты первого поколения) неизбирательно воздействуют на любые клетки, находящиеся в процессе деления. Этим объясняется наличие у этого класса лекарственных препаратов большого числа побочных эффектов. Внедрение ингибиторов
кальциневрина (циклоспорин А, такролимус) явилось важным шагом в
направлении создания более избирательных препаратов, однако побочные эффекты этого класса лекарственных средств все еще значительны. В тоже время идеальный иммуносупрессант должен обладать избирательным действием на отдельные субпопуляции лимфоцитов, не вызывая повреждения как других клеток организма, так и
клонов лимфоцитов, осуществляющих реакции противоинфекционного и противоопухолевого иммунитета. Иначе говоря, действие препарата должно быть направлено преимущественно на антигенспецифические клетки, принимающие участие в патологических реакциях приобретенного иммунитета. В настоящее время на роль идеального иммуносупрессанта претендуют моноклональные антитела
(МАТ), ингибиторы внутриклеточных сигнальных молекул и так называемые «переключатели иммунного ответа».
1
Вещества растительного происхождения всегда являлись интересным источником для создания новых лекарственных средств. Пристальное внимание исследователей в последнее время уделяется
изучению флавоноидов – большой группы полифенольных соединений, присутствующих практически во всех высших растениях. Результаты многочисленных исследований демонстрируют, что эти вещества
обладают широким диапазоном фармакологических активностей, проявляя противовоспалительные, иммунотропные, антиканцерогенные и
другие эффекты [Евстропов А.Н., 2004, Cavani A., 2010, Chang C.L.,
2010, Jin S., 2010, Lamoke F., 2011, Singh R.P., 2006]. Изучение механизмов действия флавоноидов на молекулярном уровне показывает,
что некоторые их классы (изофлавоны, халконы) способны эффективно ингибировать фосфорилирование, а как следствие и активацию,
ключевых молекул сигнальных путей в животных клетках. Ряд работ
свидетельствуют об иммуностимулирующем действии некоторых флавоноидов в моделях in vivo [Nworu C.S., 2010, Sakai T., 2010]. Несмотря
на многочисленные исследования иммунотропных эффектов флавоноидов, на сегодняшний день отсутствует единая концепция, объясняющая их механизмы действия.
В связи с этим актуальным является изучение механизмов иммунотропной активности флавоноидов и экспериментальное обоснование их фармакологической эффективности в моделях на животных.
Цель исследования: изучение на доклиническом уровне иммуносупрессивных эффектов флавоноидов корня солодки (ФКС).
Задачи исследования:
1. Изучить влияние ФКС на индуцированную пролиферацию и оценить
проапоптогенный эффект данного препарата по отношению к митоген-активированным человеческим и мышиным мононуклеарным
клеткам.
2. Оценить влияние ФКС на продукцию цитокинов активированными
мононуклеарными клетками мышей.
3. Изучить эффективность ФКС в реакции контактной чувствительности, индуцированной 2,4-динитрофторбензолом у мышей.
4. Исследовать влияние ФКС на пролиферативный ответ и функциональную активность иммунокомпетентных клеток на ранних сроках
после сенсибилизации 2,4-динитрофторбензолом.
5. Изучить влияние ФКС на функциональную активность лимфоцитовэффекторов в реакции контактной чувствительности.
2
Научная новизна исследования
Впервые было проведено исследование фармакодинамических
эффектов флавоноидной фракции экстракта корня солодки в моделях,
рекомендованных для доклинического изучения новых фармакологических веществ с иммунотропной активностью.
Впервые был продемонстрирован антипролиферативный эффект
ФКС in vitro в отношении митоген-активированных человеческих и мышиных Т-лимфоцитов. Было доказано, что антипролиферативный эффект ФКС не связан с индукцией апоптоза, но обусловлен модулирующим действием на продукцию цитокинов: наблюдается подавление
секреции ИЛ-2 и ИФНγ, и повышение уровня ИЛ-6 и ИЛ-17.
Впервые было показано, что ФКС ингибирует развитие реакции
контактной чувствительности, индуцированной 2,4-динитрофторбензолом у мышей.
Впервые было показано, что внутривенное введение ФКС на
ранних сроках после сенсибилизации 2,4-динитрофторбензолом приводит к снижению, как абсолютного числа клеток регионарных лимфоузлов, так и к подавлению их пролиферативного ответа в системе in
vitro. Это коррелирует с изменением цитокинового баланса: наблюдается уменьшение секреции ИЛ-2, ИФНγ и ИЛ-4 и увеличение продукции ИЛ-10 и ИЛ-17 клетками регионарных лимфоузлов, что может свидетельствовать о способности флавоноидов солодки переключать
Th1/Th2 иммунные ответы в процессе развития контактной чувствительности на формирование Th17-лимфоцитов.
Впервые показано, что на поздних сроках после ДНФБ-сенсибилизации, обработка ФКС суммарной фракции спленоцитов, а также выделенных из нее с помощью иммуномагнитной сепарации T-клеток, приводит к блокаде адоптивного переноса реакции контактной чувствительности несенсибилизированным сингенным мышам-реципиентам.
Впервые было показано, что блокирующий эффект ФКС не
наблюдается в случае обработки CD8+ лимфоцитов-эффекторов, выделенных из спленоцитов сенсибилизированных животных. Воспроизведение блокирующего эффекта ФКС, происходит только после обработки
CD4+-популяции и последующего ее адоптивного переноса совместно с
CD8-эффекторами несенсибилизированным мышам-реципиентам.
Практическая значимость работы
Совокупность полученных в работе данных углубляет фундаментальные представления о механизмах развития иммунного ответа.
Растительное происхождение, большое количество ранее установленных биологических эффектов, а также выявленные принципи3
ально новые механизмы действия флавоноидов корня солодки открывают перспективу их дальнейшего изучения в качестве иммуносупрессивных лекарственных препаратов.
В работе подобран комплекс методов, позволяющих оценивать
иммунотропную активность и эффективность новых фармакологических агентов.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на Всероссийской
научной конференции «Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и патологии» (Новосибирск, 2010),
Национальной конференции: «Аллергология и клиническая иммунология – практическому здравоохранению» (Москва, 2010), 2nd European
Congress of Immunology: “Immunity for Life, Immunology for Health” (Berlin, Germany, 2009), V World Congress of Immunopathology and Respiratory Allergy (Tel Aviv, Israel, 2009), VI Georgian Congress of Allergology
and Immunology, VI International Congress “Health and Drug” (Tbilisi Tskhaltubo, Georgia, 2010), III World Asthma & COPD Forum, World Forum of Pediatrics (Dubai, UAE, 2010).
Работа апробирована на совместном заседании кафедры фармакологии педиатрического факультета, кафедры иммунологии МБФ и отдела иммунологии ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский
университет Росздрава». По материалам диссертации опубликовано 15
печатных работ, в том числе в изданиях рекомендованных ВАК РФ – 8.
Внедрение результатов исследования
Результаты диссертации внедрены в учебный процесс на кафедре фармакологии ГОУ ВПО «Севоро-Осетинская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития».
Разработанные в диссертации модели и методы используются в
экспериментальной работе кафедры и отдела иммунологии ГОУ ВПО
«Российский государственный медицинский университет Росздрава» и
отдела молекулярной и экспериментальной гематологии, онкологии и
иммунологии ФГУ ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии Росздрава.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 109 страницах машинописного текста и
состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, раздела собственных исследований, обсуждения резуль4
татов, выводов и списка литературы, включающего работы отечественных и зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 25 рисунками и содержит 9 таблиц.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
В экспериментах были использованы мыши линий СВА, BDF,
BALB/c (самцы весом 18-20 г., возраст 8-10 недель), полученные из питомника РАМН (Крюково, Московская область). Всего в исследованиях
было задействовано 560 мышей. Животные содержались на стандартном пищевом рационе вивария при свободном доступе к воде и пище.
Тестируемый агент и его стандартизация. В опытах использован экспериментальный образец ФКС, выделенный из экстракта корня
солодки методом колоночной хроматографии на полиамидном сорбенте (Fluka, Германия) с использованием высокоочищенного этанола в
качестве экстрагента. Полученный экспериментальный образец раствора ФКС в этаноле стандартизировали фотометрическим методом FolinCiocalteu с использованием в качестве стандарта галловой кислоты
(Acros Organics, Германия) и хранили при температуре –20°С.
Биологическая стандартизация исследуемого агента (ФКС)
проводилась по угнетению пролиферации клеток человеческой
гистиоцитарной лимфомы линии U937 (CRL-1593.2TM, ATCC). В работе
использовали партии препарата ФКС, при внесении которых в культуру
опухолевых клеток в концентрации 10 мкг/мл в пересчете на галловую
кислоту пролиферация соответствовала 40±2% от контрольного уровня.
В экспериментах in vivo ФКС вводили внутривенно или внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг в изотоническом растворе хлорида натрия с
5% содержанием этанола. Мышам контрольной группы вводили соответствующие объемы растворителя. В опытах in vitro в культуру клеток
вносили ФКС в диапазоне концентраций 0,1-20 мкг/мл, так, чтобы финальная концентрация этанола не превышала 1%. В контрольные лунки
добавляли соответствующие объемы высокоочищенного этанола.
Выделение лимфоцитов из периферической крови человека.
Клетки выделяли в стерильных условиях градиентным методом. Для
получения фракции мононуклеаров (МНК) использовали раствор фиколл-урографина плотностью 1,077 гсм3 [Boyum A., 1968]. Количество
выделенных МНК подсчитывали в камере Горяева по стандартной
методике. Для проведения опытов in vitro клетки культивировали в среде RPMI-1640 с 10% эмбриональной телячьей сывороткой, 10 мМ
Хепес-буфера (pH 7,2) и антибиотиками: 100 ед/мл пенициллина, 100
мкг/мл стрептомицина (далее – полная среда RPMI-1640).
Приготовление суспензии клеток лимфоидных органов.
Суспензии спленоцитов и клеток лимфоузлов готовили методом
5
щадящей гомогенизации. При выделении спленоцитов эритроциты
лизировали охлажденным раствором Бройля (0,84% хлорида аммония
в 10 мМ Хепес-буфере). Посчет и культивирование клеток проводили
аналогично МНК человека.
Иммуномагнитная сепарация. Для получения отдельных популяций спленоцитов использовали метод негативной селекции и набор
реактивов Dynal Mouse Negative Isolation Kit (Invitrogen Dynal AS, Норвегия). Сепарацию проводили в магнитном поле штатива DynalMag-2 (Invitrogen Dynal AS, Норвегия). Контроль чистоты популяции осуществляли
методом проточной цитометрии на цитофлуориметре Cytomics FC500
(Beckman-Coulter, США) с использованием флюорохром-меченых моноклональных антител к CD3, CD4, CD8 мышей (Invitrogen, США).
Оценка пролиферации лимфоцитов, индуцированной различными митогенами. Исследование пролиферации клеток производили радиоизотопным методом, оценивая включение 3Н-тимидина в ДНК
делящихся клеток. Клеточную суспензию разводили до конечной
концентрации 0,2×106 (МНК человека) или 106 (МНК мыши) кл/лунку в
полной среде RPMI-1640. Через 24 ч преинкубации МНК с агентами,
индуцирующими пролиферацию Т-лимфоцитов (митогены: конканавалин А (КонА) – для МНК мышей, фитогемаглютинин (ФГА) или моноклональные анти-CD3 антитела – для МНК человека) в опытные лунки
вносили ФКС и продолжали инкубацию еще 48 ч. При оценке действия
препарата сравнивали значения включений 3Н-тимидина в образцах с
добавлением ФКС и в контроле. Результаты выражали в процентах.
Оценка «раннего» апоптоза и некроза. Количественные исследования жизнеспособности выделенных клеток проводили методом
проточной цитофлуориметрии, используя Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (Beckman Coulter, США). Для анализа использовали аликвоты, содержащие 106 клеток.
Оценка «позднего» апоптоза. Исследование апоптоза МНК
проводилось методом цитофлуориметрического определения количества ДНК с использованием дифференциального красителя пропидиум йодида.
Модель контактной чувствительности. Инициацию реакции
контактной чувствительности (КЧ) к ДНФБ у мышей линии CBA проводили согласно общепринятому экспериментальному подходу с незначительными модификациями [Kim T.Y., 1990]. Животных сенсибилизировали путем аппликации на кожу брюшка 50 мкл 0,3% раствора ДНФБ в
ацетоне на 0 день. Для экспериментов с клетками на 4-е сутки часть
мышей забивали, выделяли паховые лимфоузлы. Клетки инкубировали
6-8 ч при 37ºС, 5% CO2 с добавлением ФКС в концентрации 20 мкг/мл in
vitro. Оставшимся мышам через 6 суток после сенсибилизации на внут6
реннюю поверхность правого уха наносили разрешающую дозу ДНФБ
(5 мкл 0,2% раствора). На левое ухо наносили аналогичный объем растворителя (ацетона). Отрицательным контролем (К¯) служила группа
интактных (несенсибилизированных) мышей, получивших только аппликацию разрешающей дозы ДНФБ. Через 24 ч после повторного нанесения ДНФБ оценивали интенсивность реакции КЧ по разнице отека правого и левого ушей (специфическое локальное воспаление). Толщину
ушей измеряли в миллиметрах специальным микрометром,
снабженным световым индикатором (Россия). Интенсивность супрессии
реакции КЧ в процентах рассчитывали по формуле:

Е  К 
 *100%
%супрессии  1  
 
 К К 
где Е, К+, К- – отек уха у мышей в опытной группе (ФКС), группе
положительного и отрицательного контроля, соответственно.
Адоптивный перенос контактной чувствительности. У мышейдоноров через 6 суток после сенсибилизации ДНФБ выделяли клетки
селезенки. Суспензию спленоцитов (3×107-108 кл/мышь, 0,5 мл) или их
отдельные популяции (CD3+, CD4+, CD8+), очищенные из того же
количества спленоцитов, вводили в хвостовую вену интактным мышамреципиентам. В опытной группе клетки инкубировали с ФКС в течение
30 мин. при 37ºC и 5% CO2, в контрольной – с соответствующим
объемом растворителя. Через 1 ч после переноса клеточной суспензии
мышам-реципиентам, включая интактных мышей (К¯ – отрицательный
контроль), наносили разрешающую дозу ДНФБ на внутреннюю
поверхность уха. На внутреннюю поверхность другого уха в качестве
контроля наносили такой же объем ацетона. Еще через 24 ч
регистрировали интенсивность реакции КЧ мышей-реципиентов выше
описанным методом.
Оценка уровня секреторных цитокинов. Паховые лимфатические узлы выделяли на 4 день после двукратной (с интервалом 24 ч)
сенсибилизации мышей ДНФБ. Выделенные лимфоциты культивировали 24 и 48 ч в полной среде RPMI-1640 при 37°C и 5% CO2 в присутствии 15 мкг/мл КонА. Концентрации цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ5, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-17, ИФНγ, ГМ-КСФ, ФНОα) определяли цитофлуориметрическим методом, используя набор реактивов Mouse Th1/Th2
FlowCytomix Multiplex и программное обеспечение FlowCytomix Pro
(Bender MedSystems, Австрия).
Статистическая обработка результатов. Для статистического
анализа результатов использовалась программа Excel для Windows
XP. Все результаты выражались как значения среднего ± стандартное
7
отклонение. Полученные в ходе экспериментов данные распределялись по нормальному закону, поэтому для оценки достоверности
различий применяли критерий Стьюдента, вычисляя коэффицент достоверности. Различие средних показателей считалось достоверным,
если величина коэффицента достоверности соответствовала уровню
значимости P<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Оценка влияния ФКС на пролиферацию митогенактивированных МНК
Для решения первой задачи работы оценивали влияние ФКС на
пролиферативный ответ активированных Т-клеточными митогенами
мышиных и человеческих МНК in vitro.
Уже в концентрации 1 мкг/мл исследуемый агент достоверно
(p<0,05) подавлял индуцированную митогеном КонА пролиферацию
мышиных МНК более чем на 40% (до 57,5±6,0%), а в дозе 20 мкг/мл
практически полностью блокировал пролиферативный ответ этих клеток (до 7,8±1,5% от контрольных значений). Аналогичные результаты
были получены при инкубации ФКС с ФГА- и анти-CD3-стимулированными МНК человека (рис. 1).
Пролиферация, % к
контролю
ФГА
Анти-CD3
КонА
120
80
40
0
0
5
10
15
20
25
Концентрация ФКС, мкг/мл
Рисунок 1. Влияние ФКС на пролиферацию ФГА и анти-CD3-активированных
МНК человека и КонА-активированных МНК мышей. Уровень пролиферации
клеток, не «обработанных» ФКС (контроль), соответствует 100%.
Следующим шагом в изучении антипролиферативных эффектов
стало использование экспериментальной модели, в которой ФКС вводили животным внутрибрюшинно, с последующей эксплантацией
спленоцитов и активацией их КонА в условиях клеточной культуры in
vitro. Данные, представленные на рис. 2, показывают достоверное
8
Пролиферация, % к
контролю
снижение пролиферации МНК мышей в зависимости от вводимой дозы
ФКС. Так, при однократном внутрибрюшинном введении ФКС уровень
пролиферативного ответа, индуцированного митогеном in vitro составил 86,2±6,1%, при двух- и трехкратном – 77,4±3,2% и 49,5±3,1% соответственно.
100
80
60
40
20
0
10
20
30
Доза ФКС, мг/кг
Рисунок 2. Влияние внутрибрюшинного введения ФКС на пролиферацию
эксплантированных митоген-активированных спленоцитов in vitro. Уровень
пролиферации клеток, не «обработанных» ФКС (контроль), соответствует 100%.
Таким образом, ФКС обладают выраженным дозозависимым
антипролиферативным эффектом в отношении митоген-активированных
МНК, который не зависит от линейной (мыши линий СВА, BDF, BALB/c) и
видовой (мышь – человек) принадлежности этих клеток, а также от
способа их обработки (in vitro или in vivo) исследуемым агентом.
2. Влияние ФКС на «поздний» апоптоз митоген-активированных
МНК и секрецию этими клетками цитокинов
Исследование механизмов антипролиферативного действия ФКС
показало, что даже в максимально эффективной дозе они не проявляют проапоптогенных свойств как в отношении мышиных спленоцитов,
активированных КонА, так и человеческих МНК, активированных антиCD3-антителами. Это позволяет заключить, что индукция апоптоза не
является механизмом выявленного ранее антипролиферативного эффекта ФКС.
Следующим шагом в изучении механизмов антипролиферативного действия ФКС стала оценка их влияния на спектр синтезируемых
МНК цитокинов, регулирующие начальные этапы адаптивного иммунного ответа и через которые опосредуется пролиферативный эффект
Т-клеточных митогенов.
Культивирование КонА-активированных МНК мыши в присутствии
20 мкг/мл ФКС приводило к достоверному (р<0,05) увеличению продук9
ции ИЛ-6 (на 33%) при параллельном резком снижении ИЛ-2 до уровня
неопределяемых значений. В более низких концентрациях (10 мкг/мл)
эффект ФКС на секрецию ИЛ-2 и ИЛ-6 был недостоверным. При этом
ФКС дозозависимо достоверно снижали секрецию ИФНγ (контроль –
6687,0±235,1 пг/мл; ФКС 10 мкг/мл – 2933,2±211,5 пг/мл; ФКС 20 мкг/мл –
2006,4±190,4 пг/мл; p<0,05) и повышали уровень ИЛ-17 (контроль –
6727,5±526,3 пг/мл; ФКС 10 мкг/мл – 8845,5±430,7 пг/мл; ФКС 20 мкг/мл –
9006,6±356,7 пг/мл; p<0,05) (рис. 3). Ни в контрольных, ни в опытных
пробах секреция ИЛ-1, -4, -5, -10, ГМ-КСФ, ФНОα не обнаруживалась.
Полученные в этом разделе данные свидетельствуют, что антипролиферативный эффект ФКС не связан с индукцией программируемой гибели митоген-активированных МНК, а опосредуется через изменение баланса основных Т-хелперных цитокинов. Характер изменения уровня цитокинов под влиянием ФКС (ингибирование ИЛ-2 и
ИФНγ при возрастании ИЛ-6 и ИЛ-17) позволяет предположить, что
данный агент инициирует переключение стимулированного КонА иммунного ответа с Th1 на Th17.
Концентрация цитокинов,
пг/мл
ИФНγ
ИЛ-17
10000
8000
6000
4000
2000
0
0
5
10
15
20
25
Концентрация ФКС, мкг/мл
Рисунок 3. Влияние ФКС на секрецию ИЛ-17 и ИФНγ КонА-активированными
клетками лимфоузлов интактных мышей.
3. Влияние ФКС на развитие реакции контактной
чувствительности (КЧ) к 2,4-динитрофторбензолу (ДНФБ)
у мышей
Основываясь на результатах предыдущих разделов работы, касающихся антипролиферативного эффекта ФКС, и для проверки возможности использования данного агента в качестве иммуносупрессивного лекарственного препарата на следующем этапе были проведены
исследования по оценке эффективности ФКС in vivo в реакции КЧ к
10
ДНФБ у экспериментальных животных. Как известно, КЧ является моделью T-клеточного иммунного ответа, воспроизводящей у человека
заболевание – контактный дерматит. В иммунопатогенезе КЧ выделяют две фазы: сенсибилизации (первичный контакт с сенсибилизирующим веществом) и реализации иммунного воспаления (при повторном
контакте с тем же веществом). У мышей реакцию КЧ индуцируют аппликацией ДНФБ на кожу и регистрируют по отеку уха при повторном
нанесении этого вещества после завершения фазы сенсибилизации.
Внутривенное введение мышам ФКС в дозе 10 мг/кг через 24-3648 ч после сенсибилизации дозозависимо подавляло развитие отека
уха мыши (рис. 4). При этом однократное введение ФКС через любой
из исследуемых промежутков времени от начала сенсибилизации не
давало достоверного угнетения реакции (24 ч – на 21,0±17,0; 36 ч – на
24,0±15,0; 48 ч – на 41,0±31,0%; р>0,05). Напротив, двух- или трехкратное введение ФКС вызывало почти полное подавление реакции
КЧ (24-36 ч – на 91,0±13,0%; 24-36-48 ч – 99,0±6,0%; p<0,05).
Таким образом, результаты этой серии экспериментов продемонстрировали способность ФКС угнетать in vivo связанные с индукцией
иммунного ответа иммунопатологические процессы и, в частности
реакцию КЧ, индуцированную ДНФБ.
Отек уха, мм
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
мм
К¯
К+
0,022
0,196
ФКС 24ч ФКС 36ч ФКС 48ч
0,16
0,155
0,125
ФКС 24, ФКС 24,
36ч
36, 48ч
0,037
0,023
Рисунок 4. Влияние ФКС на выраженность отека уха мышей в реакции КЧ,
индуцированной ДНФБ. К¯ – отрицательный контроль (провокация без сенсибилизации). К+ – положительный контроль (сенсибилизация + провокация).
4. Влияние ФКС на пролиферацию клеток регионарных
лимфоузлов и продукцию ими цитокинов в модели КЧ
Для проверки является ли антипролиферативная активность ФКС
ключевым фактором в подавлении реакции КЧ к ДНФБ у мышей, была
проведена дополнительная серия экспериментов по оценке пролифера11
ции и абсолютного количества клеток (клеточность) ближайших к нанесению ДНФБ регионарных лимфатических узлов во временной период,
соответствующий максимальному развитию фазы сенсибилизации.
Как показали результаты этой серии, внутривенное введение
ФКС (10-20 мг/кг) эффективно дозозависимо ингибировало оба исследуемых показателя. При введении 10 мг/кг ФКС снижали пролиферацию до 42,0±4,0%, а клеточность – до 60,0±4,0% (p<0,05) по отношению к группе положительного контроля); 20 мг/кг ФКС приводило к ингибированию пролиферации и клеточности более чем на 70% (рис. 5).
Пролиферация
Клеточность
% к контрольному
значению
100
80
60
40
20
0
10 мг/кг
20 мг/кг
Рисунок 5. Изменение пролиферации МНК и клеточности паховых лимфоузлов
при внутривенном введении мышам ФКС через 24 и 48 ч после сенсибилизации
ДНФБ. Уровень 100% соответствует контрольным значениям.
Параллельный с оценкой пролиферации анализ секреции цитокинов клетками паховых лимфоузлов показал, что внутривенное введение ФКС в дозе 10 мг/кг приводило к статистически значимому
(p<0,05) уменьшению концентрации ИЛ-2, ИЛ-4 и ИФНγ соответственно на 51%, 48% и 58% по сравнению с клетками сенсибилизированного
контроля. Напротив, уровни ИЛ-17 и ИЛ-10 повышались на 54% и 17%
соответственно (p<0,05). Секреция ФНОα достоверно не отличалась в
контрольных и опытных пробах. Под влиянием ФКС концентрации ИЛ6 и ГМ-КСФ были подвержены значительным колебаниям в различных
сериях экспериментов от значений, сравнимых с контролем, до уровней, превышающих их значения (рис. 6; табл. 1).
Таким образом, как и в ранее проведенных экспериментах in vitro
(см. разд. 1 и 2), ФКС при введении in vivo в фазу сенсибилизации КЧ
ингибировали пролиферацию ДНФБ-активированных МНК, что сопровождалось изменением спектра секретируемых Т-клеточных цитокинов. Характер изменения продукции цитокинов (снижение ИЛ-2, ИФНγ,
ИЛ-4 при повышении ИЛ-10 и ИЛ-17) позволяет предположить, что
12
угнетение КЧ при введении ФКС направлено на угнетение активности
Th1- и Th2-субпопуляций лимфоцитов за счет активации Th17- и, возможно, Treg-клеток.
Цитокины, % от контроля
200
100
0
ИЛ-2
ИЛ-10
ИЛ-4
ИФНγ
ИЛ-17
Рисунок 6. Статистически значимые изменения уровня секреторных цитокинов
в супернатантах клеток регионарных лимфоузлов на фоне внутривенного введения ФКС через 24 и 48 ч после сенсибилизации ДНФБ.
Таблица 1. Влияние внутривенного введения ФКС (10 мг/кг) через 24-48 ч после
сенсибилизации ДНФБ на секрецию цитокинов (пкг/мл) клетками регионарных
лимфоузлов.
Контроль
ФКС
ИЛ-2
ИЛ-10
ИЛ-4
ИФНγ
ИЛ-17
ФНОα
ИЛ-6
1926,5
±55,6
919,0
±26,5
807,5
±0,3
947,5
±0,3
302,0
±0,1
157,5
±0,1
42000,0
±2364,0
16828,0
±947,0
5378,5
±101,8
7972,0
±67,2
160,0
±7,5
182,0
±15,0
2100,5
±212,0
2910,5
±964,0
ГМКСФ
826,5
±174,6
1153,0
±164,5
5. Влияния ФКС на способность ДНФБ-сенсибилизированных
спленоцитов и их Т-популяции адоптивно переносить КЧ у мышей
Целью данного этапа работы явилось исследование возможного
влияния ФКС на функциональную активность зрелых (после завершения пролиферативных процессов, необходимых для реализации
данной реакции) клеток-эффекторов и их субпопуляций, участвующих
в КЧ. Для достижения поставленной цели был использован традиционный метод адоптивного переноса, в основе которого лежит
индукция КЧ при введении несенсибилизированному животному (рис.
7, столбец K–) спленоцитов от сенсибилизированного сингенного
донора (рис. 7, столбец K–/+).
Как демонстрируют результаты, представленные на рис. 7,
предварительная (до введения мышам-реципиентам) инкубация спленоцитов ДНФБ-сенсибилизированных доноров в течение 30 мин. с ФКС
13
(20 мкг/мл) приводила к снижению отека уха у реципиентов при повторном нанесении ДНФБ до 0,016±0,006 мм, что достоверно не различалось с таковыми значениями в группе отрицательного контроля
(0,010±0,004 мм, p<0,05), и было на 84% ниже в сравнении с группой
K–/+ (0,099±0,008 мм; p<0,05).
0,16
Отек уха, мм
0,12
0,08
0,04
0
К¯
К+
K¯/+
ФКС
Рисунок 7. Интенсивность реакции при адоптивном переносе КЧ спленоцитами
сенсибилизированных мышей-доноров интактным мышам-реципиентам. (K¯) –
отрицательный контроль, (K+) – положительный контроль без адоптивного переноса, (K¯/+) – адоптивный перенос КЧ спленоцитами, (ФКС) – адоптивный перенос спленоцитов, инкубированных с ФКС.
Учитывая литературные данные о принадлежности эффекторов
КЧ к Т-клеточной популяции, на следующем этапе исследований были
проведены эксперименты по иммуномагнитной сепарации Тлимфоцитов из суммарной фракции спленоцитов сенсибилизированных ДНФБ мышей и обработке их ФКС перед адоптивным переносом
животным-реципиентам. Результаты этой серии представлены на рис.
8. Как и предполагалось, Т-лимфоциты сенсибилизированных мышей
эффективно переносили КЧ несенсибилизированным реципиентам.
Выраженность реакции (0,107±0,006 мм) статистически не отличалась
от группы с адоптивным переносом суммарной фракции спленоцитов
(0,099±0,008 мм). Инкубация in vitro сепарированных Т-лимфоцитов с
ФКС (20 мкг/мл) блокировала способность этих клеток адоптивно переносить КЧ интактным мышам: отек уха составил 0,017±0,007 мм, что
практически совпадало с аналогичным показателем в группе отрицательного контроля.
В результате этого этапа исследований можно сделать вывод, что
ФКС обладают не только антипролиферативным эффектом на стадии
формирования ДНФБ-специфичных лимфоцитов, но и способны блокировать функциональную активность зрелых клеток-эффекторов, ответ14
ственных за адоптивный перенос реакции КЧ. При этом дополнительные эксперименты свидетельствуют, что блокирующий эффект ФКС в
отношении клеток-эффекторов КЧ не был связан с их гибелью вследствие индукции апоптоза или прямой цитотоксичности.
Отек уха, мм
0,12
0,08
0,04
0
К¯
K¯/+
CD3
CD3+ФКС
Рисунок 8. Интенсивность реакции КЧ при адоптивном переносе спленоцитов и
Т-лимфоцитов сенсибилизированных мышей-доноров интактным мышамреципиентам. (K¯) – отрицательный контроль, (K¯/+) – адоптивный перенос КЧ
спленоцитами, (СD3) – адоптивный перенос КЧ Т-лимфоцитами, (СD3 + ФКС) –
адоптивный перенос Т-лимфоцитов, культивированных в присутствии ФКС.
6. Влияние ФКС на способность субпопуляций Т-лимфоцитов
адоптивно переносить КЧ
Следующим шагом стала оценка субпопуляционной селективности действия ФКС. CD4+ и CD8+ лимфоциты выделяли иммуномагнитной сепарацией из спленоцитов мышей, сенсибилизированных ДНФБ;
чистота выделенных субпопуляций составляла 90,0±1,0%.
Как видно на гистограмме (рис. 9) перенос чистой популяции
CD8+ вызывал адоптивный перенос КЧ интактным мышам-реципиентам. Среднее значение отека уха составило 0,086±0,014 мм, что статистически не различалось с интенсивностью отека при переносе суммарной фракции спленоцитов или Т-лимфоцитов. У мышей, которым
перенесли сепарированные CD4+, выраженность отека была значительно меньше (0,034±0,008 мм; p<0,05).
Выяснив то, что в условиях нашего эксперимента реакция КЧ переносилась CD8+ лимфоцитами, в следующие серии экспериментов
было решено ввести еще одну опытную группу: (CD8+ФКС) – адоптивный перенос КЧ интактным мышам CD8+ лимфоцитами, преинкубированными с ФКС в концентрации 20 мкг/мл в течение 30 мин. (рис. 9).
Однако, преинкубация выделенных CD8+ лимфоцитов с ФКС не
вызвала подавления развития отека ушей (0,080±0,020 мм), т.е. реакция КЧ была «успешно» адоптивно перенесена. Это может свидетель15
ствовать об отсутствии прямого подавляющего эффекта флавоноидов
на CD8+ клетки-эффекторы КЧ.
Отек уха, мм
0,12
0,08
0,04
0
К¯
CD8
CD4
CD8+ФКС
Рисунок 9. Интенсивность реакции при адоптивном переносе КЧ популяциями
спленоцитов сенсибилизированных мышей-доноров интактным мышам-реципиентам. (K¯) – отрицательный контроль, (CD8) – адоптивный перенос КЧ CD8+
лимфоцитами, (CD4) – адоптивный перенос КЧ CD4+ лимфоцитами, (CD8+ФКС) –
адоптивный перенос КЧ CD8+ лимфоцитами, «обработанными» ФКС.
Таким образом, в результате данного этапа исследования можно
сделать следующие выводы: в условиях проводимого эксперимента
CD8+ субпопуляция T-лимфоцитов проявляет свойства клеток-эффекторов КЧ; антиген-специфические CD4+ лимфоциты не способны в достаточной степени переносить КЧ в условиях приводимой модели КЧ;
обработка in vitro ФКС в концентрации 20 мкг/мл CD8+ лимфоцитовэффекторов с последующим адоптивным переносом их интактным
мышам не вызывает ингибирования реакции КЧ.
7. Влияние ФКС на адоптивный перенос КЧ комбинацией
CD4+ и CD8+ лимфоцитов
После обсуждения полученных результатов было решено провести модифицированный эксперимент с выделением тех же популяций
спленоцитов от сенсибилизированных ДНФБ мышей. Культивированию в присутствии ФКС теперь подвергали CD4+ лимфоциты, которые
вводили мышам-реципиентам совместно с неинкубированными CD8+
лимфоцитами. На рис. 10 видно, что инкубация CD4+ с ФКС, с последующим добавлением CD8+ привела к супрессии реакции КЧ на 83%
по сравнению с соответствующим контролем (p<0,05). Отек уха в этой
группе мышей составил 0,020±0,010 мм, что достоверно не отличалось
от значений отека ушей в группе отрицательного контроля (интактные
мыши).
16
Отек уха, мм
0,12
0,08
0,04
0
К¯
K¯/+
CD8+CD4
CD4 (ФКС)+CD8
Рисунок 10. Интенсивность реакции при адоптивном переносе КЧ различными
популяциями спленоцитов сенсибилизированных мышей-доноров интактным
мышам-реципиентам. (K¯) – отрицательный контроль, (K¯/+) – адоптивный перенос КЧ спленоцитами, (CD8+CD4) – адоптивный перенос КЧ смесью CD8+ и
CD4+ лимфоцитов, (CD4 (ФКС) + CD8) – адоптивный перенос CD4+ лимфоцитов, инкубированных с ФКС, с последующим добавлением CD8+ лимфоцитов.
В результате проведенного эксперимента можно сделать следующий вывод: преинкубация CD4+ субпопуляции спленоцитов сенсибилизированных мышей с ФКС в концентрации 20 мкг/мл и смешивание ее с CD8+ лимфоцитами эффекторами приводила при адоптивном
переносе к угнетению КЧ. Данный факт позволил сделать предположение, что именно CD4+ лимфоциты приобретают в процессе обработки флавоноидами регуляторную функцию: возможно ФКС индуцируют
их супрессорный потенциал и опосредованно инактивируют CD8+ клетки-эффекторы КЧ.
Ввиду того, что исследуемый препарат ФКС содержит сумму полифенольных соединений, выявленные механизмы его иммуносупрессорного действия могут быть обусловлены разными компонентами.
Возможно, что среди флавоноидов корня солодки одни соединения
обладают выраженным антипролиферативным эффектом по отношению к активированным лимфоцитам, а другие способны супрессировать активность зрелых адаптивно сформированных лимфоцитовэффекторов КЧ посредством отрицательной регуляции их эффекторной функции.
17
ВЫВОДЫ
1. Флавоноиды корня солодки in vitro дозозависимо угнетают пролиферацию мононуклеарных клеток человека и мышей, индуцированную T-клеточными митогенами.
2. Исследование механизмов антипролиферативного действия флавоноидов солодки на модели КонА-стимулированных лимфоцитов
мышей, показывает, что они не связаны с индукцией апоптоза, но
сопровождаются изменением баланса T-хелперных цитокинов:
флавоноиды корня солодки подавляют секрецию ИЛ-2 и ИФНγ, и
увеличивают уровень ИЛ-6 и ИЛ-17, что может свидетельствовать о
переключении Th1 иммунного ответа в направлении Th17.
3. Парентеральное введение флавоноидов корня солодки на ранних
сроках после сенсибилизации 2,4-динитрофторбензолом, подавляет
реакцию контактной чувствительности у мышей, что сопровождается дозозависимым уменьшением абсолютного числа клеток регионарных лимфоузлов за счет снижения их пролиферативного ответа.
4. Снижение пролиферативного ответа клеток регионарных лимфоузлов, как и в случае митоген-стимулированной пролиферации in
vitro, сопровождается изменением цитокинового баланса: наблюдается уменьшение секреции ИЛ-2, ИФНγ и ИЛ-4 и увеличение продукции ИЛ-10 и ИЛ-17 клетками регионарных лимфоузлов, что может свидетельствовать о переключении Th1 и Th2 иммунных ответов в процессе развития контактной чувствительности на формирование Th17-лимфоцитов.
5. На поздних сроках от начала сенсибилизации 2,4-динитрофторбензолом, после завершения фазы пролиферации и миграции зрелых
эффекторов из регионарных лимфоузлов, обработка флавоноидами корня солодки суммарной фракции спленоцитов, а также выделенных из нее с помощью иммуномагнитной сепарации T-клеток,
приводит к блокаде адоптивного переноса реакции контактной чувствительности несенсибилизированным мышам-реципиентам.
6. Блокирующий эффект флавоноидов солодки не наблюдается в случае обработки основной эффекторной популяции, отвечающей за
адоптивный перенос контактной чувствительности – CD8+ клеток.
Воспроизведение блокирующего эффекта флавоноидов корня солодки, происходит только после обработки CD4+ популяции и последующего ее адоптивного переноса совместно с CD8+ эффекторами несенсибилизированным мышам-реципиентам.
18
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ
ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Павлова С.И., Албегова Д.З., Кягова А.А., Козлов И.Г. Механизмы иммуносупрессивной активности флавоноидов корня солодки при контактной
чувствительности у мышей. // Российский иммунологический журнал. –
2010. – т. 4(13). – № 3. – С. 248-254.
Павлова С.И., Албегова Д.З., Кягова А.А., Козлов И.Г. Механизмы иммуносупрессивного действия флавоноидов корня солодки при контактной
чувствительности у мышей: угнетение функции T-лимфоцитовэффекторов опосредуется неэффекторными клетками. // Медицинская
иммунология – 2010. – т. 12. – № 6. – С. 503-510.
Албегова Д.З., Малышев П.Ю., Цицуашвили М.Д., Дибирова Г.О. Флавоноиды корня солодки увеличивают выживаемость мышей при септическом шоке. // Вестник уральской медицинской академической науки. –
2010. – № 2/1(29). – С. 239.
Албегова Д.З., Павлова С.И., Малышев П.Ю., Цицуашвили М.Д., Дибирова
Г.О., Демина М.В., Козлов И.Г. Флавоноиды – ингибиторы сигнальных путей. // Российский аллергологический журнал. – 2010. – № 1. – вып. 1.
– С. 7-8.
Павлова С.И., Шкопоров А.Н., Албегова Д.З., Дмитриева Н.Б., Жукова
И.Б., Козлов И.Г. Оценка фагоцитоза с использованием GFPэкспрессирующих E. сoli. // Российский аллергологический журнал. –
2010. – № 1. – вып. 1. – С. 142-143.
Малышев П.Ю., Павлова С.И., Албегова Д.З., Дмитриева Н.Б., Жукова
И.Б., Дибирова Г.О., Козлов И.Г. Флавоноиды – потенциальные источники
для создания противоопухолевых препаратов. // Российский аллергологический журнал. – 2010. – № 1. – вып. 1. – С. 115-116.
Цицуашвили М.Д., Павлова С.И., Степанов Г.О., Албегова Д.З., Демина
М.В., Козлов И.Г. Возможность оптимизации фармакокинетики и повышение эффективности препаратов флавоноидов. // Российский аллергологический журнал. – 2010. – № 1. – вып. 1. – С. 199-200.
Цицуашвили М.Д., Павлова С.И., Албегова Д.З., Маркина Е.В., Жукова
И.Б. Сравнение антипролиферативного эффекта различных экспериментальных лекарственных форм флавоноидов корня солодки. // Вестник
уральской медицинской академической науки. – 2010. – № 2/1(29). –
С. 276-277.
Павлова С.И., Албегова Д.З., Кягова А.А., Демина М.В., Козлов И.Г. Влияние флавоноидов корня солодки на цитокиновый профиль лимфоцитов в
модели контактной чувствительности. // Цитокины и воспаление. – 2010. –
т. 9. – № 3. – С. 50.
Цицуашвили М.Д., Павлова С.И., Албегова Д.З., Козлов И.Г. Перспектива
создания наносомальных форм препаратов флавоноидов. // Международный журнал по иммунореабилитации. – 2010. – т. 12. – № 2. – С. 105.
Албегова Д.З., Павлова С.И., Цицуашвили М.Д., Малышев П.Ю., Козлов
И.Г. Флавоноиды снижают клеточность и пролиферацию лимфоцитов в
реакции контактной чувствительности. // Международный журнал по иммунореабилитации. – 2010. – т. 12. – № 2. – С. 105.
Tsitsuashvili M.D., Pavlova S.I., Albegova D.Z., Kozlov I.G. The prospect of a
nanosomal forms of drugs flavonoids. // International Journal on Immunoreahabilitation. – 2010. – Vol. 12. – № 1. – P. 86.
Albegova D.Z., Pavlova S.I., Tsitsuashvili M.D., Malyshev P.Yu., Kozlov I.G.
19
14.
15.
Flavonoids decrease cellularity and lymphocyte proliferation in mice contact
sensitivity. // International Journal on Immunoreahabilitation. – 2010. – Vol. 12.
– № 1. – P. 86.
Albegova D.Z., Pavlova S.I., Kyagova A.A., Tsitsuashvili M.D., Malyshev P.Yu.,
Kozlov I.G. Licorice root flavonoids and contact sensitivity in mice. // Proceedings of the III World Asthma & COPD Forum and World Forum of Pediatrics. –
2010. – P. 147-152.
Tsitsuashvili M.D., Pavlova S.I., Stepanov G.O., Albegova D.Z., Kozlov I.G.
The prospect of a nanosomal forms of flavonoids drugs. // Proceedings of the
III World Asthma & COPD Forum and World Forum of Pediatrics. – 2010. – P.
153-156.
СПИСОК СОРАЩЕНИЙ
АГ – антиген
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота
ДНФБ – 2,4-динитрофторбензол
ИК – ингибирующая концентрация
ИЛ – интерлейкин
ИФН – интерферон
КонА – конканавалин А
КЧ – контактная чувствительность
МНК – мононуклеарные клетки
ФГА – фитогемагглютинин
ФКС – флавоноиды корня солодки
ФНО – фактор некроза опухоли
20