Арзамасова Ольга Александровна УГЛЕВОД-БЕЛКОВЫЕ КОМПЛЕКСЫ ПЕЧЕНИ И СЫВОРОТКИ КРОВИ У ПРЕНАТАЛЬНО
реклама
На правах рукописи Арзамасова Ольга Александровна УГЛЕВОД-БЕЛКОВЫЕ КОМПЛЕКСЫ ПЕЧЕНИ И СЫВОРОТКИ КРОВИ У ПРЕНАТАЛЬНО АЛКОГОЛИЗИРОВАННЫХ КРЫС 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Челябинск – 2011 1 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Омская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Высокогорский Валерий Евгеньевич Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Цейликман Вадим Эдуардович доктор медицинских наук, профессор Львовская Елена Ивановна Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Защита состоится « » г. в часов на заседании диссертационного совета Д 208.117.02 при ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64). С диссертацией можно ознакомиться государственной медицинской академии в библиотеке Челябинской Автореферат разослан "____" ____________ 2011 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор 2 Н.В. Тишевская ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. В последнее десятилетие растет уровень потребления алкоголя, в том числе среди женщин репродуктивного возраста (А.Ю. Егоров, Л.К. Шайдукова, 2005), что ведет к увеличению числа случаев рождения детей, перенесших внутриутробную алкогольную интоксикацию. По данным Американского института здоровья признаки алкогольной эмбриофетопатии или алкогольного синдрома плода в США имеют 2 новорожденных из 1000, тогда как в России – 15 из 1000 новорожденных детей. По данным Добровольского Г. А.(1992) и Kimura K.A.(2000) этанол и ацетальдегид обладают выраженными тератогенными свойствами. В большинстве случаев исходом хронической пренатальной алкогольной интоксикации является антенатальная гибель плода (20 %) и гибель в первые периоды постнатального развития (Коннор П., 1999). Большое количество работ посвящено изучению морфофункциональных изменений, возникающие при хроническом употреблении алкоголя матерями во время беременности (Mattson S.N., 1999, Hoyme H.E., 2005). При этом патогенетические механизмы алкогольного тератогенеза до конца остаются не выясненными. По мнению ряда авторов, в основе тератогенного действия этанола лежит интенсификация свободнорадикального окисления под действием алкогольной интоксикации (Kimura K.A., 2000, Dong J., 2010, Gundogan F., 2010). У плода, при внутриутробном действии этанола, происходит истощение резервов антиокислительной системы, уменьшение пула восстановленного глутатиона, а также падение активности глутатион-зависимых ферментов в печени (Высокогорский В.Е., Самусева Н.Л., 2000), нарушение реакций окислительного фосфорилирования, синтеза мРНК, а также нарушение тканевой репарации и развитие дистрофических процессов в различных органах (Fofana B., 2010). Внутриутробное воздействие алкоголя может не иметь явных клинических признаков на ранних сроках жизни, а проявляться в отдаленные периоды постнатального развития в виде физической неполноценности и умственной отсталости (Guerri C., 2009). Основными критериями, для установления факта злоупотребления беременной алкоголем и выявления алкогольной эмбриофетопатии, являются пренатальное и (или) послеродовое замедление роста, черепно-лицевые дисморфизмы, задержка нервнопсихического развития (Dannaway D.C., 2009). Однако идентификация алкогольной эмбриофетопатии по черепно-лицевым дисморфизмам в различных этнических группах может оказаться затруднительной, а некоторые нейроповеденческие отклонения становятся очевидными лишь в процессе дальнейшего развития ребенка. При этом большинство младенцев, рожденных злоупотребляющими алкоголем матерями, не имеют полного синдромокомплекса и не всегда есть возможность идентифицировать 3 алкогольную эмбриофетопатию в течение периода новорожденности (Коннор П, 1999, Astley S.J. 2000, Hoyme H.E., 2005). В исследованиях (Gallot D. et al., 2007), посвященных выявлению лабораторных маркеров пренатальной алкогольной интоксикации у новорожденных, установлено, что обычные алкогольные биомаркеры (активность АсАТ, АлАТ, ГГТ, концентрация углевод – дефицитного трансферрина), определяемые в плацентарной крови плода для ранней диагностики алкогольного синдрома плода, являются малоинформативными. Учитывая изложенное, вопрос разработки и внедрения в клиническую практику новых высоко чувствительных и специфичных методов раннего выявления данного синдрома является актуальным. Известно, что у лиц, перенесших пренатальную алкогольную интоксикацию, наблюдается выраженные нарушения углеводного обмена, выражающиеся в стойкой гипогликемии, усугубляемой развитием резистентности клеток к инсулину (Chen L., 2003, Xing-Hai Yao, 2008). Кроме того, показано ингибирующее влияние пренатальной интоксикации на ключевые ферменты глюконеогенеза, это в свою очередь ведет к тому, что клетка лишается основного источника энергии и пластического материала необходимого для синтеза гликоконьюгатов (Chen L., 2003). Пренатальная алкоголизация вызывает нарушение синтеза сиалосодержащих белков, выражающееся в нарушении процессов Огликозилирования (Jimenez-Farfan et all. 2005, Fofana B., Yao X. H. et all., 2010). В связи с этим, изучение особенностей обмена углевод-белковых комплексов в условиях пренатальной алкогольной интоксикации имеет несомненную актуальность. Цель исследования. Выявить патохимические особенности обмена углевод-белковых комплексов печени пренатально алкоголизированных животных и определить эффективность метаболической коррекции при данных условиях. Задачи исследования. 1. Исследовать уровень гликопротеинов в печени и сыворотке крови животных, перенесших пренатальную алкогольную интоксикацию. 2. Установить влияние пренатальной алкогольной интоксикации на показатели обмена протеогликанов в печени и сыворотки крови животных. 3. Изучить показатели обмена коллагена в печени животных, подвергнутых пренатальной алкогольной интоксикации. 4. Оценить эффект комплекса витаминов – α-токоферола, ретинола и аскорбиновой кислоты на уровень углевод-белковых комплексов печени 4 и сыворотки крови животных, перенесших пренатальную алкогольную интоксикацию. Научная новизна. Комплексное изучение углевод-белковых конъюгатов позволило получить новые сведения о нарушениях их обмена в условиях пренатальной алкогольной интоксикации. В эксперименте на крысах показано существенное влияние пренатальной алкогольной интоксикации на уровень гликопротеинов, протеогликанов печени и сыворотки крови, что выражается в уменьшении содержания углеводного компонента в гликопротеинах, накоплении продуктов метаболизма протеогликанов и коллагена в ткани печени и снижении интенсивности процессов их катаболизма. Установлено, что выявленные изменения показателей обмена углевод-белковых комплексов, характеризующиеся существенным снижением уровня ГК, активности βглюкуронидазы, коллагенолитической активности и уровня ТИМП-1 в печени животных сохраняются в отдаленные сроки постнатального онтогенеза. Теоретическое и практическое значение работы. Результаты проведенного экспериментального исследования позволяют расширить представления о патохимических механизмах, лежащих в основе эмбрио- и фетотоксического действия этанола. Полученные данные об изменениях показателей метаболизма гликопротеинов, коллагена, протеогликанов в сыворотке крови после воздействия пренатальной алкогольной интоксикации могут служить обоснованием для разработки диагностических критериев. Выявленный выраженный протективный эффект комплекса витаминов А, Е, С может быть использован для коррекции метаболических нарушений, индуцированных пренатальной алкогольной интоксикацией. Положения, выносимые на защиту: В результате воздействия пренатальной алкогольной интоксикации значительно изменяются уровни белкового и углеводного компонентов гликопротеинов в печени животных, инициируется нарушение обмена протеогликанов. 2. Эффекты пренатальной алкогольной интоксикации сохраняются в отдаленные сроки постнатального онтогенеза, что характеризуется накоплением в ткани печени продуктов обмена коллагена и снижением процессов катаболизма коллагена в ткани печени. 1. 5 3. Применение комплекса витаминов способствует коррекции нарушений показателей обмена углевод-белковых комплексов, возникающие в результате воздействия этанола в пренатальный период. Апробация работы. Основные результаты проведенного исследования доложены на Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» (Челябинск, 2009); межрегиональной конференции «Инновационные технологии диагностики и лечения в здравоохранении» (Омск, 2009); региональной научно-практической конференции, посвященной 70-летию проф. П. Н. Шараева (Ижевск, 2010); II научной конференции молодых ученых ОмГМА "Итоговая сессия аспирантов выпускного года обучения" (Омск, 2010); юбилейной научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2010). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе – 3 в рецензируемых журналах из перечня, рекомендованного ВАК Минобрнауки РФ. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста, содержит 22 таблицы, 26 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной материалам и методам исследования, глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Библиографический указатель содержит 230 источников, в том числе 126 – на иностранном языке. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования. Экспериментальное исследование выполнено на 296 неполовозрелых потомках белых беспородных крыс в различные сроки постнатального онтогенеза. Эксперимент проводился в осенне-зимний период 2007-2009 гг. в соответствии с этическими нормами и рекомендациями по гуманизации работы с лабораторными животными (Кополадзе Р. А., 2000), отраженных в «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целях» (Страсбург, 1986). Выведение животных из эксперимента производилось в утренние часы путем цервикальной дислокации под эфирным наркозом в возрасте 15-и, 30-и и 60-суток с соблюдением правил эвтаназии. Пренатальную алкогольную интоксикацию моделировали путем интрагастрального введения половозрелым самкам крыс массой 180 – 200 г. 40 % этанола в дозе 4 г / кг с первого дня и в течение всего срока беременности (Henderson G.I. et al., 1995). Потомство данных самок составило группу 6 «Алкоголь». Контрольные самки получали равный объем физиологического раствора. Это потомство составило группу «Контроль». Этап I: формирование групп 1 группа 2 группа 3 группа Самки белых крыс получавших ежедневно интрагастрально физиологический раствор в течение всего срока беременности Самки белых крыс получавших ежедневно интрагастрально 40 % этанол в дозе 4 г / кг массы в течение всего срока беременности Самки белых крыс получавших ежедневно интрагастрально 40 % этанол в дозе 4 г / кг массы и комплекс витаминов (А, Е, С) в течение всего срока беременности Потомство Группа «КОНТРОЛЬ» Потомство Группа «АЛКОГОЛЬ» Потомство Группа «АЛКОГОЛЬ+ВИТ» Этап II: получение биологического материала (декапитация под эфирным наркозом в возрасте 15, 30 и 60 суток постнатального онтогенеза; получение гомогената печени, сыворотки крови) Этап III: проведение биохимических исследований (определение показателей обмена гликопротеинов, протеогликанов, коллагена в гомогенате печени и сыворотке крови животных). Этап IV: статистическая обработка полученных данных Этап V: Обсуждение результатов, формулирование выводов. Рис. 1. Дизайн исследования 7 Для оценки эффекта комплекса витаминов А, Е, С на фоне пренатальной алкогольной интоксикации, часть самок дополнительно к раствору этанола получали комплекс витаминов – α-токоферол в дозе 80 мг/кг, ретинол-1 мг/кг, аскорбиновую кислоту-200 мг/кг (Канапацкая И. А., 1997). Потомство данных самок составило группу «Алкоголь+Витамины». В сыворотке крови и ткани печени животных исследовали уровень белоксвязанного, пептидсвязанного и свободного оксипролина (Шараев П. Н., 2008), содержание серогликоидов с использованием коммерческого набора реактивов «Мукопротеины» («Hospitex diagnostics», Швейцария) и по содержанию связанных с ними гексоз (Камышников В. Ф.,2004). Содержание сиаловых кислот определяли с помощью набора реактивов «Сиалотест - 80» (ННП «Реахим», г. Ижевск), уровень свободной и связанной с белками фукозы, активность α-L-фукозидазы с использованием в качестве субстрата 4нитрофенил-α-L-фукозы, уровень гликозаминогликанов и глюкуроновой кислоты с помощью карбозольной реакции Дише, активность β-глюкуронидазы (Шараев П. Н. 2008), содержание тканевого ингибитора металлопротеиназы1(ТИМП-1) определяли набором реагентов «BioSours International Inc. Human TIMP-1 ELISA» (США). Анализ и статистическая обработка полученных результатов проводили с использованием пакетов прикладных программ «Statistica 6.0» («StatSoft Inc.», США). В связи с распределением данных, отличным от нормального, полученные результаты анализировали методами непараметрической статистики – с использованием критерия Манна-Уитни, корреляционный и регрессионный анализ с определением коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Результаты представлены как Ме (Q1…Q3), где Ме – медиана, Q1 – 25-й процентиль, Q3 – 75-й процентиль. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Уровень гликопротеинов в сыворотке крови и печени животных, перенесших пренатальную алкогольную интоксикацию В результате проведённых исследований установлено, что уровень гликопротеинов в сыворотке крови группы «Алкоголь» превышал значения контрольной группы на 15-е сутки жизни в 2,2 раза (р = 0,033), на 30-е сутки в 1,6 раза (р = 0,020) (рис. 2 а). Соответствия содержания гликопротеинов в сыворотке крови уровню контрольных животных не наблюдалось и при достижении животными 60-и суточного возраста, этот показатель превышал контрольные значения в 1,5 раза (р = 0,025). 8 2,2 2а . 18 2б. 2,0 1,8 14 1,6 12 мкг/л 1,4 мг/л 16 1,2 1,0 0,8 10 8 6 0,6 4 0,4 2 0,2 0,0 15 СУТОК 30 СУТОК 0 60 СУТОК ВОЗРАСТ ЖИВОТНЫХ Контроль 15 СУТОК 30 СУТОК 60 СУТОК ВОЗРАСТ ЖИВОТНЫХ Алкоголь Алкоголь + Витамины Рис. 2. Содержание гликопротеинов (2а) и мукопротеинов (2б) в сыворотке крови животных. Примечание. Статистически значимые различия с группой «Контроль» обозначены: - рU < 0,05; - рU < 0,01; - рU < 0,001 (U – тест Манна-Уитни) Исследование фракции гликопротеинов – мукопротеинов, определяемых по тирозину, позволило установить повышение их уровня в сыворотке крови животных с пренатальной алкоголизацией на 15-е и 30-е сутки постнатального развития в 1,9 раза (р = 0,041) и в 2,2 раза (р = 0,050) соответственно (рис. 2 б). При достижении животными возраста 60-суток в группе «Алкоголь» в сыворотке крови уровень мукопротеинов не имел значимых отличий от контрольных значений. Кроме того, в сыворотке крови отмечалось высокое содержание сиаловых кислот – основных углеводных составляющих компонентов гликопротеинов, занимающих преимущественно концевое положение в гликоконьюгатах. Так на 15-е сутки жизни данный показатель превышал значения контрольной группы в 1,5 раза (р = 0,032) и на 30-е сутки в 1,2 раза (р = 0,012). В возрасте 60-суток суммарный уровень сиаловых кислот группы «Алкоголь» не имел значимых отличий от значений контрольных животных (табл. 1). Высокий уровень суммарных сиаловых кислот в сыворотке крови на ранних этапах развития животных свидетельствует об интенсивных процессах катаболизма гликопротеинов, составляющих фракцию так называемых острофазовых белков, синтезируемых печенью в ответ на токсическое действие этанола и его метаболитов в пренатальный период. В печени пренатально алкоголизированных животных установлено существенное повышение гликопротеинов на 15-е сутки жизни – в 1,3 раза (р = 0,024) и на 30-е сутки – в 1,4 раза (р = 0,031) относительно соответствующих значений группы «Контроль» (рис. 3а). К 60-и суткам жизни уровень гликопротеинов в печени пренатально алкоголизированных животных не имел значимых отличий от контрольных значений. 9 Таблица 1 Уровень суммарных сиаловых кислот в сыворотке крови, ммоль / л (Ме (Q1…Q3)) Группа 15 суток 30 суток 60 суток n n n Контроль 1,57 2,94 4,33 15 (1,19…2,25) 13 (1,50…3,37) 15 (4,02…4,48) Алкоголь 4,43 2,29 3,65 12 (2,10…2,68) 13 (3,48…5,01) 15 (4,39…4,63) рU = 0,176 рU = 0,032 рU = 0,012 Алкоголь+ 1,91 2,93 4,36 Витамины 10 (1,42…2,47) 10 (1,47…3,81) 10 (4,00…4,61) рU = 0,116 рU = 0,141 рU = 0,253 Примечание. n – численность выборки; p - статистический уровень значимости различий в сравнении с показателями контрольной группы; р*- статистический уровень значимости различий в сравнении с показателями группы «Алкоголь» (U – тест Манна-Уитни). Уровень мукопротеинов, определяемых по тирозину, в печени животных группы «Алкоголь», был повышен на 15-е и 30-е сутки жизни в 1,4 раза (р = 0,001) и в 1,5 раза (р = 0,015) относительно соответствующих значений группы «Контроль» (рис. 3 б). На 60-е сутки жизни уровень мукопротеинов в печени пренатально алкоголизированных животных существенно не отличался от значений мукопротеинов группы контрольных животных. 9 3б. 8 6 мкг/г белка 20 18 7 мкмоль/г белка 3а. . 22 5 4 3 2 1 16 14 12 10 8 6 4 15 СУТОК 30 СУТОК 2 60 СУТОК ВОЗРАСТ ЖИВОТНЫХ Контроль 15 СУТОК 30 СУТОК 60 СУТОК ВОЗРАСТ ЖИВОТНЫХ Алкоголь Алкоголь + Витамины Рис. 3. Содержание гликопротеинов (3а) и мукопротеинов (3б) в печени животных. Примечание. см. рис. 2. 10 Об интенсивном метаболизме гликопротеинов в группе животных, перенесших пренатальную алкогольную интоксикацию, свидетельствует высокий уровень в печени свободной и белоксвязанной фукозы (рис. 4). Так, на 15-е сутки развития в печени пренатально алкоголизированных животных уровень свободной и белоксвязанной фукозы превышал значения группы контроль в 2,82 раза (р = 0,027) и в 1,5 раза (р = 0,029), соответственно. 5 0,9 4а. 4б. 0,8 0,7 0,6 мкг/г белка мкг/г белка 4 3 2 1 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 15 СУТОК 30 СУТОК 0,0 60 СУТОК 15 СУТОК ВОЗРАСТ ЖИВОТНЫХ Контроль 30 СУТОК 60 СУТОК ВОЗРАСТ ЖИВОТНЫХ Алкоголь Алкоголь + Витамины Рис. 4. Содержание свободной (4а) и белоксвязанной (4б) фукозы в печени животных. Примечание. см. рис. 2. К 30-суткам развития уровень свободной фукозы оставался повышенным в 3,6 раза (р = 0,027), тогда как уровень белоксвязанной фукозы снижался и не отличался от контрольных значений. По достижению животными возраста 60суток уровень свободной и белоксвязанной фукозы не имел значимых отличий от группы «Контроль». Изменение уровня в печени свободной и белоксвязанной фукозы сопровождалось изменением активности α-L-фукозидазы (рис. 5). Так, активность фермента превышала значения группы «Контроль» на 15-е сутки развития в 1,6 раза (р = 0,032) и на 30-е сутки в 1,1 раза (р = 0,012), что свидетельствует об усиленном катаболизме фукозосодержащих гликопротеинов. На 60-сутки развития активность α-L-фукозидазы в печени снижалась и не отличалась от контрольных цифр. 26 Рис. 5. Активность α-Lфукозидазы в печени животных. мкмоль/г белка•мин 24 22 20 Примечание. см. рис. 2. 18 16 14 Контроль 12 10 Алкоголь 8 6 4 Алкоголь+Витамины 15СУТОК 30 СУТОК 60 СУТОК ВОЗРАСТ ЖИВОТНЫХ 11 Полученные результаты свидетельствуют о том, что пренатальное воздействие алкогольной интоксикации сопровождается выраженными нарушениями со стороны обмена гликопротеинов. Несмотря на то, что воздействие алкогольной интоксикации прекращается с момента рождения животных, отмечается сохранение выявленных нами нарушений различного характера в печени и сыворотке крови в отдаленные сроки постнатального онтогенеза. В печени, как и в сыворотке крови, наблюдается высокое содержание гликопротеинов и мукопротеинов в ранние сроки постнатального онтогенеза, кроме того, в печени выявлен высокий уровень связанной с белками фукозы, что свидетельствует об интенсивном биосинтезе и накоплении этих гликоконьюгатов в печени. Увеличение содержания гликопротеинов сопровождается увеличением уровня их углеводных компонентов - сиаловых кислот в сыворотке крови и свободной фукозы в ткани печени, что, на фоне повышенной активности α-L-фукозидазы, свидетельствует об интенсивном катаболизме сиало- и фукозосодержащих гликопротеинов, которые в основном являются компонентами острофазных белков, иммунных комплексов и поверхностных мембранных структур, отвечающих за проведение трансмембранного сигнала в клетку (Varki A., 2009 ). Для более детального исследования особенностей обмена гликопротеинов печени в условиях пренатальной алкогольной интоксикации, было проведено сравнение уровня мукопротеинов, определяемых по содержанию тирозина и по уровню освобожденных в результате гидролиза связанных с ними гексоз. Важно отметить, что, несмотря на повышение в печени животных перенесших пренатальную алкоголизацию содержания мукопротеинов определяемых по тирозину на 15-е и 30-е сутки развития, при определении содержания углеводного компонента в мукопротеинах – гексоз, было установлено значимое снижение уровня данного показателя во все сроки постнатального онтогенеза относительно соответствующих значений группы «Контроль» (рис.6). 2,4 2,2 Рис. 6. Уровень гексоз в мукопротеинах печени. 2,0 1,8 мкг/г белка 1,6 Примечание. см. рис. 2. 1,4 Контроль Алкоголь Алкоголь+Витамины 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 15 СУТОК 30 СУТОК 60 СУТОК ВОЗРАСТ ЖИВОТНЫХ Так, на 15-е и 30-е сутки жизни животных содержание гексоз в мукопротеинах печени пренатально алкоголизированных животных было 12 соответственно снижено в 1,6 раза (р = 0,009) и в 1,5 раза (р = 0,017) относительно соответствующих значений группы «Контроль». На 60-е сутки постнатального онтогенеза происходило наиболее существенное снижение гексоз в мукопротеинах печени – в 1,8 раз (р = 0,009). Это еще раз подчеркивает, что последствия перенесенной пренатальной алкогольной интоксикации имеют отдаленный характер проявлений. Выявленное существенное снижение уровня гексозного компонента в мукопротеинах подтверждает имеющиеся данные о влиянии пренатального воздействия этанола на процессы гликозилирования белков (Jiménez-Farfán D., 2005). 20 7б. 9 Y = 0,530 + 0,330 * X; r = - 0,942; р = 0,004 8 7 6 5 4 3 14 МП (ТИР) СЫВОРОТКА КРОВИ, МКГ/Л 7а. МП (ТИР) СЫВОРОТКА КРОВИ, МКГ/Л 10 18 16 14 12 Y = 22,644 + 1,363 * X; r = - 0,900, р = 0,030 10 8 6 15 16 17 18 19 20 21 2 22 3 4 5 6 7 8 9 10 11 МП (ТИР) ПЕЧЕНЬ, МКГ/Г БЕЛКА МП (ТИР)ПЕЧЕНЬ, МКГ/Г БЕЛКА Рис. 7. Зависимость уровня мукопротеинов сыворотки крови от содержания мукопротеинов печени группы «Алкоголь» на 15-е (7а) и 60сутки (7б) жизни. Проведенный корреляционный анализ выявил отрицательную зависимость сильной степени между мукопротеинами сыворотки крови и мукопротеинами печени (r = - 0,942; р = 0,004) на 15-е сутки постнатального развития, но данная связь становилась положительной на 30-е сутки жизни животных (r = 0,610; r = 0,018). На 60-е сутки жизни выявленная взаимосвязь вновь усиливалась и имела отрицательный характер (r = - 0,900; р = 0,030). Нелинейный характер связей между показателями обмена гликопротеинов печени и сыворотки крови на различных этапах постнатального онтогенеза животных группы «Алкоголь» позволили рассчитать уравнение нелинейной регрессии для корреляций сильной степени (рис. 7). В группе животных с пренатальной алкогольной интоксикацией и дотацией витаминов с выраженными антиокислительными свойствами - А, Е, С, происходила нормализация практически всех определяемых показателей обмена гликопротеинов относительно соответствующих значений группы «Контроль». Исключение составило повышение уровня мукопротеинов печени на 13,35 % (р = 0,046) в 15-е сутки жизни. В остальных случаях статистически значимых отличий от группы «Контроль» не наблюдалось во все сроки эксперимента. 13 Показатели обмена протеогликанов в печени и сыворотке крови животных, перенесших пренатальную алкогольную интоксикацию У потомства алкоголизированных животных содержание ГК в сыворотке крови было повышено на 18,4 % (р = 0,019) по сравнению со значениями группы «Контроль» на 15-е сутки жизни (табл. 16). На 30-е и 60-е сутки постнатального развития уровень ГК снижается и не отличается от такового в группе контрольных животных. 2,2 8а. 4,5 8б. 2,0 1,8 4,0 3,5 1,6 3,0 мкг/л мкг/л 1,4 1,2 1,0 0,8 2,5 2,0 1,5 0,6 1,0 0,4 0,5 0,2 0,0 15 СУТОК 30 СУТОК 0,0 60 СУТОК ВОЗРАСТ ЖИВОТНЫХ Контроль 15 СУТОК 30 СУТОК 60 СУТОК ВОЗРАСТ ЖИВОТНЫХ Алкоголь Алкоголь + Витамины Рис. 8. Уровень глюкуроновой кислоты (8а), гликозаминогликанов (8б) в сыворотке крови. Примечание. см. рис. 2. Содержание ГАГ в сыворотке крови у животных группы «Алкоголь» превышало контрольные значения в возрасте 15-и суток в 3,8 раза (р = 0,001). В возрасте 30-и суток уровень данного показателя превышал значения контрольной группы на 20,6 % (р = 0,022). Нормализации содержания ГАГ в сыворотке крови не происходило даже при достижении животными 60-и суточного возраста и этот показатель превышал контрольные значения в 1,5 раза (р = 0,007). Изменение уровня ГАГ в сыворотке крови отражает, вероятно, нарушение метаболизма протеогликанов межклеточного матрикса в организме в целом. В отличие от показателей в сыворотке крови пренатально алкоголизированных животных в ткани печени уровень ГК в группе «Алкоголь» повышался более значительно и длительно. Так, на 15-е сутки развития уровень ГК выше контрольных значений в 1,8 раза (р = 0,001) и в 1,3 раза (р = 0,041) на 30-е сутки жизни (рис. 9 а). Это вероятно, связано с интенсивным синтезом гликозаминогликанов и накоплением их в межклеточном матриксе печени. К 60-и суткам происходит уменьшение значений ГК в 2,1 раза (р = 0,001) по отношению к группе «Контроль» в возрасте 60 суток. Уровень ГАГ в печени животных группы «Алкоголь» повышен на 95 % (р = 0,002) в 15 суток жизни и на 30-е сутки жизни в 2,4 раза (р = 0,003) 14 относительно значений группы «Контроль» (рис. 9 б). В возрасте 60-и суток содержание ГАГ в печени пренатально алкоголизированных животных остается повышенным на 66 % (р = 0,005). 9а. 9 7 9б. 8 6 мкг/ г белка мкг/г белка 7 6 5 4 3 2 5 4 3 2 1 1 0 15 СУТОК 30 СУТОК 0 60 СУТОК 15 СУТОК ВОЗРАСТ ЖИВОТНЫХ Контроль 30 СУТОК 60 СУТОК ВОЗРАСТ ЖИВОТНЫХ Алкоголь Алкоголь + Витамины Рис. 9. Содержание глюкуроновой кислоты (9а), гликозаминогликанов (9б) в печени животных. Примечание. см. рис. 2. Изменение уровня ГК и ГАГ в ткани печени на 60-е сутки развития сопровождается снижением активности β−глюкуронидазы печени на 78,5 % (р = 0,006) в сравнении с группой «Контроль», что может свидетельствовать о снижении интенсивности катаболизма протеогликанов (рис. 7). По достижении животными более зрелого возраста происходит значительное понижение уровня ГК в ткани печени, сопровождаемое снижением активности β−глюкуронидазы, что, вероятно, связано со снижением интенсивности процесса распада протеогликановых структур и накопление их в межклеточном матриксе. мкмоль/г белка•мин 16 Рис.10. Активность β-глюкуронидазы в печении животных. 14 12 Примечание. см. рис. 2. 10 8 Контроль 6 Алкоголь 4 2 Алкоголь+Витамины 15 СУТОК 30 СУТОК 60 СУТОК ВОЗРАСТ ЖИВОТНЫХ Исследование уровня ГК и ГАГ сыворотки крови и печени, а также активности фермента β-глюкуронидазы в ткани печени, в группе животных «Алкоголь + Витамины» не было выявлено никаких статистически значимых 15 различий со значениями группы «Контроль». Это еще раз подчеркивает выраженный протективный эффект комплекса витаминов А, Е, С с выраженными антиоксидантными свойствами. Показатели обмена коллагена в печени животных, перенесших пренатальную алкогольную интоксикацию При исследовании показателей обмена коллагена установлено, что в ткани печени пренатально алкоголизированных животных уровень свободного оксипролина (СОП) на 15-сутки развития выше контрольных значений в 2,9 раза (р = 0,002), на 30-сутки жизни на 22 % (р = 0,012) (табл. 2). В возрасте 60суток содержание СОП в печени пренатально алкоголизированных животных остается повышенным на 59 % (р = 0,005) по отношению к показателям контрольной группы. Высокий уровень СОП у животных, перенесших внутриутробную этаноловую интоксикацию, во все сроки наблюдения сопровождается повышением уровня пептидсвязанного оксипролина (ПСОП) в 2,5 раза (р = 0,003) на 15- сутки и 30-сутки (р = 0,015) постнатального онтогенеза, что свидетельствует об интенсивных процессах катаболизма коллагена в печени животных. При достижении животными 60-суточного возраста, в группе животных «Алкоголь» не выявлено статистически значимых различий в содержании ПСОП со значениями группы «Контроль». Уровень белоксвязанного оксипролина (БСОП) в печени животных группы «Алкоголь» повышен в 2,1 раза (р = 0,003) на 15-сутки жизни и на 30сутки жизни в 2,2 раза (р = 0,005) относительно значений группы «Контроль». На 60-сутки жизни содержание БСОП в печени пренатально алкоголизированных животных сохраняется высоким и превышает контрольные значения на 89 % (р = 0,015). Высокое содержание СОП, ПСО и БСО в ткани печени потомства алкоголизированных крыс сопровождалось увеличением общей коллагенолитической активности в ранние сроки постнатального онтогенеза (рис. 7 б). Так, общая колллагенолитическая активность превышала значения группы «Контроль» на 81 % (р = 0,002) на 15-е сутки жизни и на 30-е сутки на 31 % (р = 0,016), соответственно. На 60-е сутки жизни происходило снижение общей коллагенолитической активности в 1,3 раза (р = 0,025) относительно значений в группе «Контроль». При этом в печени животных группы «Алкоголь» отмечался высокий уровень ТИМП-1 на 15-е сутки развития на 26,12 % (р = 0,047) и на 30-е сутки на 30 % (р = 0,034). На 60-е сутки жизни содержание ТИМП-1 снижается на 16 % (р = 0,048) по отношению к группе «Контроль» (рис. 7 а). 16 Свободный оксипролин Показ атель Пептидсвязанный оксипролин Белоксвязанный оксипролин Таблица 2 Уровень свободного, пептид- и белковосвязанного оксипролина в печени, мкг/г белка (Me (Q1…Q3)) Возраст животных Группа 15 суток 30 суток 60 суток n = 15 n = 14 n = 15 2,90 3,35 4,00 Контроль (1,09…5,85) (1,46…6,4) (1,20…6,10) 8,30 (4,51…11,40) рU = 0,002 4,81 (3,90…6,13) рU = 0,050 рU* = 0,001 6,33 (4,78…10,00) рU = 0,012 3,50 (1,90…5,15) рU = 0,365 6,36 (3,28…9,20) рU = 0,005 4,20 (1,50…5,00) рU = 0,365 Контроль 0,20 (0,11…0,26) 0,18 (0,10…0,26) 0,23 (0,18…0,33) Алкоголь 0,50 (0,35…0,70) рU = 0,003 0,46 (0,23…0,66) рU = 0,015 0,30 (0,16…0,50) рU = 0,058 Алкоголь + Витамины 0,18 (0,15…0,35) рU = 0,122 0,21 (0,10…0,35) рU = 0,340 0,20 (0,15…0,40) рU = 0,650 Контроль 5,60 (4,13…9,11) 4,51 (3,20…9,44) 4,90 (3,45…9,00) 11,90 (7,30…16,27) рU = 0,003 6,14 (3,90…10,01) рU = 0,122 10,09 (6,92…14,6) рU = 0,005 5,50 (3,00…10,00) рU = 0,298 9,28 (6,78…15,21) рU = 0,015 4,32 (3,90…8,94) рU = 0,311 Алкоголь Алкоголь + Витамины Алкоголь Алкоголь + Витамины Примечание. см. табл. 1. При исследовании показателей обмена коллагена – СОП, ПСО и БСО в печени у животных в группе «Алкоголь+Витамины» наблюдалось по отношению к значению группы «Контроль» повышение уровня СОП, как и в группе «Алкоголь», но в значительно меньшей степени, только на 66 % (р = 0,001) на 15-е сутки жизни. При достижении животными возраста 30-и и 60-и 17 суток, статистически значимых изменений не наблюдалось. При исследовании коллагенолитической активности и уровня ТИМП-1 не выявлено статистически значимых различий во все наблюдаемые сроки эксперимента. 7а. 14 400 7б. 350 мкмоль/г белка·мин 12 мкг/г белка 10 8 6 4 2 0 15 СУТОК 30 СУТОК 250 200 150 100 50 60 СУТОК ВОЗРАСТ ЖИВОТНЫХ Контроль 300 15 СУТОК 30 СУТОК 60 СУТОК ВОЗРАСТ ЖИВОТНЫХ Алкоголь Алкоголь+Витамины Рис. 7. Содержание ТИМП-1 (7 а) и коллагенолитическая активность (7 б) в печени животных. Примечание. см. рис. 2. Повышенный уровень СОП и ПСО у пренатально алкоголизированных животных свидетельствует об усилении процессов катаболизма коллагена. В пользу этого свидетельствует и повышенная коллагенолитическая активность в печени, наблюдаемая на более ранних сроках жизни животных. При сопоставлении показателей коллагенолитической активности и содержания ТИМП-1 в печени у животных, алкоголизированных в пренатальном периоде, наблюдается неоднозначная картина. На фоне повышенной коллагенолитической активности уровень ТИМП-1 на ранних стадиях постнатального онтогенеза значимо превышает контрольные значения, однако в возрасте 60-суток уровень ТИМП-1 и общая коллагенолитическая активность резко снижается. Такие изменения, на фоне высокого содержания продуктов обмена коллагена, как правило, наблюдаются в органах при различных патологических процессах, вызванных, в том числе, факторами алкогольного генеза (Casini A., 1999). Это может свидетельствовать о снижении интенсивности распада коллагеновых волокон, при этом существенное повышение в печени уровня белоксвязанного оксипролина указывает на смещение динамического равновесия между процессами анаболизма и катаболизма коллагена в сторону его синтеза. Таким образом, пренатальная алкогольная интоксикация сопровождается выраженными нарушениями со стороны углевод-белковых комплексов, при этом некоторые изменения сохраняются длительное время, вплоть до достижения животными половозрелого возраста. В печени отмечается высокое содержание ГК и ГАГ в ранние сроки постнатального онтогенеза, что может свидетельствовать об интенсивном биосинтезе и накоплении протеогликанов в межклеточном матриксе. В свою очередь увеличение содержания ГАГ в 18 экстрацеллюлярном матриксе, по мнению Серова В.В. и соавт. (1981) предшествует усилению процессов фибриллообразования. По достижении животными более зрелого возраста происходит значительное понижение уровня ГК в ткани печени, сопровождаемое снижением активности β−глюкуронидазы, что, вероятно, связано со снижением интенсивности процесса распада протеогликановых структур. Вклад в нарушение процессов катаболизма ГАГ может вносить и пониженный уровень тиреоидных гормонов, наблюдаемый при пренатальной алкогольной интоксикации (Wilcoxon J.S., 2004). Кроме того, снижение уровня ГК в печени может быть обусловлено как увеличением синтеза ГАГ, так и истощением пула ГК при развитии эндотоксикоза в посталкоголизационном периоде (Еникеев Д.А., 2000, Зимницкий А.Н., 2004). В пользу этого предположения свидетельствует снижение уровня ГК сыворотки крови по мере взросления животных. Полученные результаты нарушения обмена углевод-белковых комплексов могут свидетельствовать о развитии дискоординации процессов метаболизма гликоконъюгатов экстрацеллюлярного матрикса, что является характерной особенностью хронических алкогольных поражений органов (Shimizu K., 2008, Жанкалова З.М., 2009). Выявленные изменения показателей обмена углевод-белковых комплексов могут служить обоснованием для использования их в клинической практике для более раннего выявления метаболических нарушений вызванных пренатальной алкогольной интоксикацией. Кроме того, позитивный эффект использования витаминов для существенной коррекции нарушений метаболизма углевод-белковых комплексов, является основой для разработки профилактических мероприятий и предупреждения развития негативных изменений метаболизма, вызванных внутриутробной алкогольной интоксикацией. 19 Выводы: 1. Пренатальная алкогольная интоксикация характеризуется существенными изменениями обмена гликопротеинов, что выражается в повышении в сыворотке крови их уровня в 2,2 раза, мукопротеинов – в 1,9 раза, сиаловых кислот – в 1,5 раза. В печени увеличивается содержание гликопротеинов – в 1,3 раза и мукопротеинов – в 1,4 раза на 15-сутки постнатального развития. 2. Пренатальная алкогольная интоксикация вызывает в печени потомства значительное уменьшение, более чем в 1,5 раза, углеводного компонента мукопротеинов во все наблюдаемые сроки жизни животных. 3. Эффекты алкогольной интоксикации в пренатальный период сохраняются в отдаленные сроки постнатального онтогенеза, что характеризуется значительным снижением уровня ГК в 2,1 раза и активности βглюкуронидазы в печени животных на 78,5 %, коллагенолитической активности в 1,3 раза и уровня ТИМП-1 - на 16 % на 60-сутки постнатального развития. 4. Пренатальная алкогольная интоксикация сопровождается повышением содержания в печени свободного, пептидсвязанного и белоксвязанного оксипролина во все наблюдаемые сроки постнатального онтогенеза. 5. Применение комплекса витаминов А, Е, С способствует коррекции у потомства нарушений обмена углевод-белковых комплексов, возникающих в результате пренатального воздействия этанола. 20 Список опубликованных работ: 1. Высокогорский В. Е. Особенности метаболизма протеогликанов в печени пренатально алкоголизированного потомства / В. Е. Высокогорский, О. А. Арзамасова // Материалы Российской конференции «Актуальные проблемы теоретической прикладной биохимии», посвященная 80-летию со дня рождения Р.И. Лифшица, приуроченная к 65-летию Челябинской медицинской академии. – Челябинск, 2009. – С. 19-21. 2. Арзамасова О. А. Особенности метаболизма протеогликанов в сыворотке крови и печени животных, подвергшихся пренатальной алкогольной интоксикации / О. А. Арзамасова // Омский научный вестник. Приложение. Материалы межрегиональной научно-практической конференции «Инновационные технологии диагностики и лечения в здравоохранении» приуроченной к 45-летию Центральной научноисследовательской лаборатории. 2009. № 1 (84). – С. 40-42. 3. Арзамасова О. А. Влияние антиоксидантных витаминов на метаболизм протеогликанов в печени пренатально алкоголизированного потомства крыс / О. А. Арзамасова, В. Е. Высокогорский // Материалы региональной научно-практической конференции «Клиническая биохимия: единство фундаментальной науки и лабораторной диагностики», посвященной 70летию П. Н. Шараева. Ижевск, 2010. – С. 7-10. 4. Арзамасова О. А. Влияние пренатальной алкогольной интоксикации на метаболизм углевод-белковых комплексов печени / О. А. Арзамасова // Сборник тезисов юбилейной научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины». Санкт-Петербург, 2010. – С. 58-60. 5. Высокогорский В. Е. Влияние пренатальной алкогольной интоксикации на метаболизм углевод-белковых комплексов печени и поджелудочной железы / В. Е. Высокогорский, О. А. Арзамасова, Н. М. Курч // Наркология. – 2010. № 8. – С. 40-43. 6. Курч Н. М. Метаболизм коллагена в печени и поджелудочной железе пренатально алкоголизированного потомства / Н. М. Курч, О. А. Арзамасова, В. Е. Высокогорский // Наркология. – 2010. № 10. – С. 3639. 7. Курч Н. М. Метаболизм гликоконьюгатов печени и поджелудочной железы у потомства алкоголизированных крыс / Н. М. Курч, О. А. Арзамасова, Н. Л. Самусева, В. Е. Высокогорский // Омский научный вестник. – 2010. № 10. С. 67-71. 21 СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ ГАГ – гликозаминогликаны; ГК – глюкуроновая кислота; ПГ – протеогликаны; БСО – белоксвязанный оксипролин; ПСО – пептидсвязанный оксипролин; СОП – свободный оксипролин; ГП – гликопротеины; МП (тир) – мукопротеины, определяемые по тирозину; СК – сиаловые кислоты; ТИМП – тканевые ингибиторы матриксных металлопротеиназ. 22 На правах рукописи Арзамасова Ольга Александровна УГЛЕВОД-БЕЛКОВЫЕ КОМПЛЕКСЫ ПЕЧЕНИ И СЫВОРОТКИ КРОВИ У ПРЕНАТАЛЬНО АЛКОГОЛИЗИРОВАННЫХ КРЫС 03.01.04 – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук 23
