Цель занятия: ознакомиться с основными типами желтух
реклама
Тема занятия 9: Лабораторная диагностика желтух. Цель занятия: ознакомиться с основными типами желтух, механизмом образования билирубина и его фракций, изучить дифференциальную диагностику заболеваний печени. Перечень знаний и практических навыков: знать основные типы желтух; уметь осуществлять дифференциальную диагностику заболеваний печени; охарактеризовать основные фракции билирубина; усвоить механизм образования основных фракций билирубина; уметь определять тип желтухи, основываясь на лабораторных данных; уметь определять характер заболевания печени на основании лабораторных данных; освоить основные методики определения билирубина в сыворотке крови. Желтуха представляет собой желтое неестественное окрашивание кожи или склер. Это связано с присутствием в плазме билирубина в концентрациях, превышающих 40 мкмоль/л. В норме концентрация билирубина в плазме менее 22 мкмоль/л. Имеются 3 основные причины повышения уровня билирубина в крови: Скорость синтеза билирубина повышена и превышает выделительную способность печени (гемолитическая, надпеченочная желтуха). Угнетение конъюгационных и/или выделительных механизмов в печени – снижается способность печени метаболизировать синтезируемый в нормальных количествах билирубин (печеночная, гепатоцеллюлярная желтуха). Обструкция билиарной системы, препятствующая оттоку желчи (холестатическая, подпеченочная, механическая, обструкционная желтуха). Типы желтух Надпеченочная (гемолитическая) желтуха. Чаще всего надпеченочная желтуха вызывается повышенным разрушением эритроцитов – как зрелых клеток, так и их предшественников. Разрушение зрелых клеток может быть результатом гемолиза или следствием утилизации крови после внутренних кровотечений, например, в поврежденных мягких тканях. Неэффективный эритропоэз имеет место при пернициозной анемии (нарушение созревания эритроцитов) или талассемии (аномальная структура гемоглобина). Гипербилирубинемия при надпеченочной желтухе является следствием накопления неконъюгированного билирубина, который не выводится почками. При этом возрастает поступление билирубина из печени в кишечник. Продуцируется большое количество уробилиногена, уровень которого в моче повышается. Типы желтух Тип Надпеченочная Механизм Неэффективный эритропоэз Усиленный распад эритроцитов Гепатоцеллюлярная Незрелость ферментов коньюгации Наследственные нарушения транспорта билирубина Холестатическая Причина Пернициозная анемия Талассемия Гемолиз Внутренние кровотечения Желтуха новорожденных Заболевания Гильберта Синдром Клиглера-Найяра Синдром Ротора Синдром Дубина-Джонсона Генерализованная дисфункция Гепатит гепатоцитов Портальный церроз Индуцированная лекарственными Парацитамол препаратами Изониазид Внутрипеченочная Гепатит Цирроз желчных путей Фенотиазины Злокачественные заболевания печени Внепеченочная Желчные камни Опухоли желчевыводящего протока Сдавление желчевыводящего протока Карцинома головки поджелудочной железы Гепатоцеллюлярная желтуха. Врожденные нарушения транспорта билирубина приводят к желтухе из-за несовершенного поглощения, сниженой конъюгации или ослабленного выведения билирубина. Генерализованная гепатоцеллюлярная дисфункция может иметь место при гепатитах и декомпенсированных печеночных циррозах. Патогенез желтухи в этих случаях сложен, свой вклад вносят нарушения захвата, внутриклеточного транспорта, сниженная конъюгация билирубина. Лекарственные вещества могут вызывать гепатоцеллюлярные повреждения в связи со своей дозозависимой гепатотоксичностью (например, парацетамол) или идиосинкратической чувствительностью (например, изониазид). Если гипербилирубинемия вызвана нарушением конъюгации, билирубин не конъюгируется и отсутствует усиление потока билирубина через печень. Следствеием этого является то, что отсутсвует билурубинурия и уровень уробилиногена в моче не повышен. При наличии генерализованной дисфункции захват билирубина печенью снижается и, следовательно, большее его количесто экскретируется почками. Билирубин в сыворотке может быть конъюгированным и неконъюгированным, так как могут быть дефектными УДФ-глюкоронилтрансфераза и внутриклеточный транспорт билирубина. Если скорость конъюгации превышает экскреторную способность, в крови повышается уровень конъюгированного билирубина и он может экскретироваться с мочой. Такое иногда случается при выздоровлении после вирусного гепатита. Холестатическая желтуха. Холестатическая желтуха может быть результатом препятствия оттоку желчи из гепатоцитов в двенадцетиперстную кишку. Она может вызываться поражениями в самой печени (внутрипеченочныйхолестаз) или в желчных каналах и головке поджелудочной железы (внепеченочный холестаз). Внутри- и внепеченочный холестаз могут быть отдифференцированы ультразвуковым исследованием или биопсией печени, но не оценочными пробами функции печени. Внутрипеченочныйхолестаз часто является результатом генерализованной гепатоцеллюлярной дисфункции, развивающейся, например, при гепатите или декомнесированном циррозе печени. Это состояние также является симптомом первичного билиарного цирроза. Блокировать ветви желчного дерева могут злокачественные опухоли. Некоторые лекарственные препараты, такие как анаболические стрероиды, фенотиазины и сульфанилмочевина, могут пприводить к внутрипеченочномухолестазу. Внепеченочная обструкция часто является результатом опухолей главных желчевыводящих путей, опухоли головки поджелудочной железы и увеличения лимфоузлов в воротах печени. К обструкции желчных протоков также могут приводить желчные камни или склерозирующий холангит. Желтуха вызывается нарушением выведения и накоплением конъюгированного билирубина, фильтрующегося в клубочках и появляющегося в моче. Вместе с тем, билирубин в моче может и не определяться, возможно потому, что изменения процессов конъюгации приводят к образованию менее водорастворимого билирубина, связанного с альбумином. При полной обструкции билирубин не поступает в кишечник, уробилиноген не образуется и не определяется в моче, а каловые массы могут иметь окраску. Дифференциальная диагностика желтух Признаки Тип билирубина Уровень билирубина Билирубин в моче Уробилиноген в моче Активность ферменты Гематологическая желтуха Неконьюгированный Обычно < 75 мкмоль/л нет увеличен ЛДГ↑ Гепатоцеллюлярная желтуха Смешанный Билирубин ↑ Позднее Есть Увеличен Холестатическая желтуха Коньюгированный Билирубин может быть ↑↑↑ есть снижен АсАТ+АлАТ↑↑ ЩФ↑ позднее ЩФ обычно в 3 раза больше нормы, АсАТ, АлАТ+ЛДГ обычно умеренно↑ Образование билирубина и его фракций в крови, печени, кишечнике, почках. Токсичность билирубина. Билирубин образуется при распаде гемоглобина в клетках ретикулоэндотелиальной системы (РЭС), особенно активно в селезенке и в купфферовских клетках печени. Метаболизм билирубина У взрослого человека образуется 250–350 мг билирубина в сутки. Билирубин слаборастворим в воде, в плазме билирубин первично появляется в неконъюгированной форме, связанный с альбумином (непрямой, свободный билирубин). Неконъюгированный билирубин не может проникнуть через почечный барьер. В печени происходит переход билирубина от альбумина на синусоидальную поверхность гепатоцитов. В клетках печени непрямой билирубин подвергается энзиматической конъюгации с глюкуроновой кислотой и превращается в билирубинмоно- и билирубиндиглюкоронид (конъюгированный, прямой, связанный билирубин). Конъюгированный билирубин водорастворим, он поступает с желчью в желчный пузырь или непосредственно в кишечник. Здесь билирубин теряет глюкуроновую кислоту и восстанавливается до группы бесцветных тетрапольных соединений, называемых уробилиногенами. Часть уробилиногенов всасывается в тонкой кишке и по системе воротной вены вновь попадает в печень, где окисляется до дипирролов. В толстой кишке билирубин желчи под влиянием нормальной кишечной флоры превращается в стеркобилиноген. В нижнем участке толстой кишки основное количество бесцветногостеркобилиногена окисляется в коричневый стеркобилин, который выделяется с калом. Незначительная часть стеркобилиногена всасывается в кровь и через геморроидальные вены и нижнюю полую вену попадает в почки и затем в мочу. Нормальная моча содержит минимальное количество конъюгированного билирубина (7–20 мкг/л), не выявляемое качественными методами. Жёлчные пигменты – продукты распада гемоглобина и других производных порфирина, экскретируемые с желчью, мочой, калом. Основная их масса образуется в процессе катаболизма гемоглобина при распаде эритроцитов в клетках системы мононуклеарных фагоцитов. Желчные пигменты представляют собой соединения, содержащие 4 пиррольные группы, соединенные одноуглеродными мостиками в открытую, незамкнутую цепь (в отличие от замкнутой структуры гема). В результате разрыва a-метинового мостика в геме гемоглобина образуется вердоглобин (холеглобин) – железосодержащее порфириновое соединение с открытой пиррольной структурой, окрашенное в зеленый цвет. После отщепления от молекулы вердоглобина белка глобина и железа образуется зеленый желчный пигмент биливердин. Альтернативный путь образования биливердина заключается в отщеплении белковой части от молекулы гемоглобина, образовании железопорфиринового пигмента гематина и окисления гематина с разрывом метинового мостика и утратой железа. В клетках системы мононуклеарных фагоцитов биливердин восстанавливается до билирубина, который с кровью поступает в печень. Небольшое количество билирубина образуется в клетках системы мононуклеарных фагоцитов из гема, не использованного для синтеза гемоглобина, из гема, образующегося в печени при катаболизме других гемсодержащих белков (миоглобина, цитохромов и др.), или из гемоглобина, обновляющегося в процессе созревания эритроцитов. Билирубин – основной и наиболее диагностически ценный желчный пигмент, обнаруживаемый в желчи человека. Биливердин присутствует в желчи в следовых количествах (общее содержание Ж. п. в желчи составляет 15–20% ее сухой массы). В печени билирубин формирует парные соединения, или конъюгаты, главным образом с глюкуроновой кислотой (альдегидкарбоновойуроновой кислотой – производным глюкозы) и в меньшей степени – с серной кислотой. Связанный билирубин, секретируемый печенью, на 75% состоит из билирубинглюкуронида и на 15% – из билирубинсульфата. Желтуха новорождённых. Гемолитическая болезнь новорожденного Причины. Несовместимость крови матери и плода по группе или по резус-фактору. Накопление гидрофобной формы билирубина в подкожном жире обуславливает желтушность кожи. Однако реальную опасность представляет накопление билирубина в сером веществе нервной ткани и ядрах ствола с развитием "ядерной желтухи" (билирубиновая энцефалопатия). Клиническая диагностика. Проявляется сонливостью, плохим сосанием, умственной отсталостью, ригидностью затылочных мышц, тоническими судорогами, тремором конечностей, изменением рефлексов с возможным развитием глухоты и параличей. Лабораторная диагностика. В крови выявляются выраженная анемия, ретикулоцитоз, эритро- и нормобластоз. Гипербилирубинемия за счет непрямой фракции от 100 до 342 мкмоль/л, в дальнейшем присоединяется и прямая фракция. Уровень билирубина в крови быстро нарастает и к 3–5 дню жизни достигает максимума. Физиологическая (транзиторная) желтуха новорожденных Причины: относительное снижение активности УДФ-глюкуронилтрансферазы в первые дни жизни, связанное с повышенным распадом фетального гемоглобина, абсолютное снижение активности УДФ-глюкуронилтрансферазы в первые дни жизни, дефицит лигандина, слабая активность желчевыводящих путей. Клиническая диагностика. окрашивание кожи на 3–4 день после рождения, гемолиза и анемии нет. Симптомы исчезают спустя 1–2 недели после рождения. Лабораторная диагностика. Увеличение концентрации свободного билирубина в сыворотке до 140–240 мкмоль/л. Желтуха недоношенных Причины: относительное снижение активности УДФ-глюкуронилтрансферазы в первые дни жизни, связанное с повышенным распадом фетального гемоглобина, абсолютное снижение активности УДФ-глюкуронилтрансферазы в первые дни жизни, дефицит лигандина, слабая активность желчевыводящих путей. Клиническая диагностика. окрашивание кожи, гемолиза и анемии нет. Исчезает спустя 3–4 недели после рождения. Лабораторная диагностика. Увеличение концентрации свободного билирубина в сыворотке до максимума на 5–6 дни после рождения, более выражено по сравнению с физиологической желтухой. Негемолитическаягипербилирубинемия новорожденных, вызываемая молоком матери. Встречается у 1% вскармливаемых грудью новорожденных. Причины. Подавление активности УДФ-глюкуронилтрансферазы, предположительно, эстрогенами материнского молока. Клиническая диагностика. Проявляется желтухой, иногда с явлениями поражения ЦНС. Лабораторная диагностика. Увеличение концентрации свободного билирубина в сыворотке. Лабораторная дифференциальная диагностика заболеваний печени Заболевания печени. У 5% практически здоровых людей может наблюдаться незначительное повышение показателей печеночных ферментов, без каких либо признаков поражения печени. Практическим подходом к обследованию пациентов с изолированным повышением аминотрасфераз является повторение теста и дальнейшее обследование только при 2х кратном превышении нормы или выявлении факторов риска заболевания печени. Данные ферменты присутствуют не только в печени, но и AсАT в сердечной мышце, скелетных мышцах, почках, головном мозге, поджелудочной железе, легких лейкоцитах и эритроцитах; AлАT в скелетных и сердечной мышце (хотя в гораздо меньших чем AсАT количествах); ЛДГ практически во всех клетках и биологических жидкостях, для печени более характерны изоферменты ЛДГ5 иЛДГ4. Уровень аминотрасфераз не коррелирует с исходом поражения печени, так острый гепатит В с повышение уровня ферментов в более чем 20 раз часто заканчивается полных выздоровлением, тогда как алкогольный гепатит с гораздо более низким их подъемом может закончится печеночной недостаточностью. Снижение AлАT, AсАT чаще всего является признаком выздоровления, однако быстрое их падение в ряде случаев может быть признаком произошедшей массивной гибели печеночных клеток. Незначительное (менее чем в 3 раза) повышение уровня аминотрасфераз наблюдается в случае жирового гепатоза, неалкогольного стеатогепатита и хронического вирусного гепатита, их подъем в 3–20 раз характерен для острого вирусного гепатита, аутоиммунного и алкогольного гепатитов (иногда для хронического вирусного гепатита) и, наконец, увеличение более в чем в 20 раз наиболее вероятно для острого вирусного гепатита, лекарственного (или токсического) поражения печени и ишемического гепатита. Для алкогольной болезни печени характерно повышение AсАT при практически нормальной (или слегка повышенной) концентрации AлАT. Соотношение AсАT/AлАT у 70% таких пациентов больше 2. Изолированное повышение аминотрасфераз характерно для неалкогольной жировой болезни печени (при условии отрицательного уровня печеночных маркеров и отсутствия анамнеза злоупотребления алкоголем). Повышение этого показателя может наблюдаться и при целиакии, туберкулезе, саркоидозе и амилоидозе с поражением печени и при метастазах в печень. Холестаз Холестаз оценивается по следующим показателям: ГГТП, щелочная фосфатаза, билирубин и уровень желчных кислот сыворотки. ГГТП может повышаться не только при заболеваниях печени, но и инфаркте миокарда, заболеваниях почек и диабете. Однако этот фермент более специфичен для оценки поражения печени, чем ЩФ, которая в больших количествах содержится в костной ткани, что делает оценку природы ее повышения затруднительным, особенно у детей. Разумно использовать совместное определение двух этих показателей для подтверждения печеночной причины их повышения. Срок полураспада щелочной фосфотазы около недели, следовательно не следует ждать ее падения сразу после ликвидации билиарной обструкции. Уровень билирубина отражает баланс между его выработкой, в результате разрушения гемоглобина и элиминацией его печенью. В норме 70% билирубина сыворотки представлено неконьюгированной его формой. Незначительная неконьюгированная билирубинемия может наблюдаться при синдроме Жильбера (врожденном нарушении конъюгации билирубина). Голодание приводит к повышению неконьюгированного билирубина при этом синдроме. Другими причинами повышения неконьюгированнойго билирубина (патологическим читается его повышение > 85% общего билирубина) являются: гемолиз, желтуха новорожденных, желтуха у недоношенных, синдром Криглера-Найяра, лекарственное воздействие. Неконьюгированная билирубинемия может наблюдаться при молниеносной форме болезни Вильсона, в сочетании низкими цифрами щелочной фосфотазы (как следствие гемолиза из-за массивного выброса меди в кровь). Коньюгированная форма повышается при гепатоцелюлярных заболеваниях (цирроз, гепатит, токсическое воздействие лекарств), внутрипеченочном холестазе, сепсисе, синдромах Дабина-Джонсона и Ротора и обструктивной желтухе. Желтушная окраска склер становится заменой при концентрации билирубина в 30 µmol/l. Т.к. коньюгированный билирубин выводится почками, то его концентрация редко превышает 510 µmol/l (при отсутствии почечной недостаточности). Желчные кислоты (ЖК). Первичные ЖК образуются исключительно в печени с ежедневным уровнем синтеза 250–500 мг (примерно столько же теряется с калом), вторичные ЖК возникают в результате действия бактерий кишечника на первичные ЖК. Повышение уровня ЖК характерно для гепатобилиарного заболевания и отражает как поражение печени так и нарушение ее экскреторной функции. Их уровень имеет определенное дифференциально-диагностическое значение, так при синдроме Жильбера уровень ЖК нормальный. Оценка синтетической функции печени Альбумин. Альбумин полостью синтезируется в печени в количестве примерно 150 мг/кг/день. Время полураспада альбумина 20 дней. Следовательно, при острой печеночной недостаточности это не очень удобный показатель. Кроме того, причиной снижения альбумина также может быть переход его в 3е пространство (например при сепсисе), недостаток питания, потери через почки (нефрит) и кишечник (энтеропатия с потерей белка). Если мы видим снижение альбумина при заболеваниях печени мы может утверждать о достаточно длительном течении печеночной недостаточности у данного пациента. Протробиновое время (РТ). Этот показатель наиболее точно и главное быстро отражает синтетическую функцию печени т.к. все факторы свертывания (кроме VIII) синтезируются в печени, а время полураспада фактора VII составляет всего 3–5 часов. Ряд факторов свертывания (II, VII, IX, X) нуждаются в витамине К как кофакторе. Учитывая возможную недостаточность этого витамина (например при холестазе) необходимо назначить его в дозе 10 мг/день на 3 дня для оценки связанно ли снижение РТ с его недостатком или с нарушением синтетической функции печени. Ели через сутки после введения РТ улучшается, по крайней мере, на 30% говорят о сохраненной синетической функции печени. РТ является ценным прогностическим фактором при оценке печеночной недостаточности и помогает определить время когда пациент должен быть направлен для пересадки печени. Мочевина и аммиак. Эти показатели не играют основной роли в лабораторной диагностики патологии печени, однако их правильная интерпретация может помочь в установлении диагноза и предсказать возможность появления таких осложнений как печеночная недостаточность. Позволим себе напомнить, что мочевина синтезируется печенью из NH3, который, в свою очередь, в основном является продуктом жизнедеятельности толстокишечных бактерий. Концентрация аммиака плазмы может повышаться в следующих случаях: 1. Увеличение его продукции (гастроинтестинальное кровотечение, большое количество белка в диете). 2. Порто-системноешунирование. 3. Печеночная недостаточность. 4. Врожденные (генетические) дефекты. Изменение лабораторных показателей при различных видах заболевания печени Тест Аминотрасферазы Щелочная фосфотаза Билирубин общий Протромбиновое время Альбумин Желчные кислоты Заболевания печени Заболевания печени Холестатическое связанные с некрозом заболевание гепатоцитов (вирусные (первичный гепатиты, билиарный цирроз) лекарственные гепатиты, аутоиммунный гепатит, болезнь Вильсона, гемохроматоз, дефицит a1 -антитрипсина) Умеренное или Норма или слабое значительное повышение повышение Умеренное или Норма или слабое значительное повышение повышение От нормы до От нормы до значительного значительного повышения повышения Увеличено, не зависит от Увеличено, зависит витамина К от витамина К Снижен при хроническом Норма заболевании От незначительного до От незначительного значительного до значительного повышения повышения Инфильтративный процесс (рак печени) Норма или слабое повышение Умеренное или значительное повышение От нормы до слабого повышения Норма Норма Норма Референтные значения печеночных проб Тест Норма Белковые фракции Общий белок Альбумины Глобулины 65—85 г/л 40—50 г/л 20—30 г/л Показатели пигментного обмена Общий билирубин Прямой билирубин Непрямой билирубин 11,12 (8,6-20,5) мкмоль/л 2,57 мкмоль/л 8,6 мкмоль/л Ферменты АлАТ АсАТ Щелочная фосфатаза 0,1—0,68 ммоль/(ч·л) 0,1—0,45 ммоль/(ч·л) 1,0—3,0 ммоль/(ч·л) Липиды и липопротеины Общие липиды Триглицериды Общий холестерин 4,6—10,4 ммоль/л 0,565—1,695 % ммоль/л 3,11—6,48 ммоль/л Показатели азотистого обмена Мочевина 3,3—6,6 ммоль/л Муж - 0,088—0,177 ммоль/л Жен - 0,044—0,141 ммоль/л 0,12—0,38 ммоль/л Креатинин Мочевая кислота Дополнительные тесты: Тест Общая лактатдегидрогеназа (ЛДГ) Гамма-глютамилтранпептидаза (ГГТП) Сорбитолдегидрогеназа (СДГ) Глутаматдегидрогеназа (ГлДГ) Холинэстераза (ХЭ) Альфа-фетопротеин (АФП) Норма 0,8—4,0 ммоль/(ч·л) 0,6—3,96 ммоль/(ч·л) 0—0,02 мкмоль/(мл·ч) Муж – 0-7 Ед/л Жен – 0-5 Ед/л 5300 — 12900 Ед/л 0-10 Ед/мл Фракции билирубина в крови Общий билирубин Прямой (связанный) билирубин Непрямой (несвязанный) Фракции билирубина в моче В норме в сыворотке крови содержится в среднем 17 мкмоль/л общего билирубина, из которого только 10–15% входит в состав прямой фракции. Непрямой билирубин не может проходить через почечные тельца, и поэтому моча здорового человека не содержит этого пигмента. Появление в моче билирубина указывает на повышение в крови прямой его фракции и, как правило, является признаком нарушения экскреции желчных пигментов в кишки. Фракции билирубина в кале При кишечных инфекциях уробилиноген (уробилин) образуется в верхних отделах кишечника (в тонкой и в начале толстой кишки) из билирубина-глюкуронида (поступившего из печени). Часть образовавшегося уробилиногенарезорбируется через кишечную стенкуи с кровью портальной системы переносится в печень, где расщепляется полностью, в связи с чем в общий кровоток не поступает и не выделяется с мочой. При поражении печени уробилиноген поступает в общий кровоток и выделяется с мочой. Стеркобилиноген образуется также из билирубин-глюкуронида, поступающего из печени в двенадцатиперстную кишку и попавшего в толстую кишку. Этот билирубинглюкуронид при участии анаэробной кишечной микрофлоры восстанавливается до стеркобилиногена. Окраска кала у здорового человека определяется присутствием стеркобилиногена и продукта его окисления – стеркобилина. Определение стеркобилина в кале имеет значение в дифференциальной диагностике желтух. При гемолитической желтухе содержание в кале стеркобилина значительно повышается, а при механической желтухе и холестатической форме вирусного гепатита он не обнаруживается. Методы определения прямого билирубина основаны на его водорастворимости. Так как реакция происходит в водной среде, для определения прямого билирубина требуется только реагент, образующий с ним окрашенный комплекс. Если необходимо определить общий билирубин, к реакционной смеси прибавляют детергент, который переводит свободный билирубин в растворимое состояние. Нормы билирубина в сыворотке составляют до 22 мкмоль/л для общего билирубина и до 4,0 мкмоль/л для прямого. Рассмотрим методы определения билирубина в сыворотке. Метод Йендрашека-Гроффа Принцип метода Билирубины, прямой (коньюгирован с глюкоронатом) и непрямой (неконьюгированый, связанный с альбумином), в присутствии кофеина и детергента, соединяются с диазотированной сульфаниловой кислотой. Кофеин высвобождает билирубин, связанный с альбумином. Образуется азосоединение, окрашенное в красный цвет, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации билирубина в пробе и измеряется фотометрически при длине волны 500-560 нм. Метод линеен до концентрации общего билирубина в сыворотке и плазме 425 мкмоль/л Минимально выявляемая концентрация общего билирубина в пробе, определяемая с приемлемым уровнем воспроизводимости составляет 1,5 мкмоль/л. Материалом для исследования служит сыворотка пациента без признаков гемолиза или липемии. Процедура анализа Для определения общего и прямого билирубина готовят четыре пробирки: 1) Общий билирубин (сюда мы добавим детергент) 2) Прямой билирубин (без детергента, в водной среде будет реагировать только водорастворимый прямой билирубин) 3) Калибровочная проба 4) Контрольная проба Перед процедурой анализа необходимо приготовить диазореактив. Для этого смешивают сульфаниловую кислоту и нитрит натрия в соотношении 40:1. Данный реагент стабилен в течение 7 суток. Добавить реагенты в пробирки по схеме: Общий Прямой Калибровочная Контрольная билирубин билирубин проба проба Кофеиновый 1,4 – 1,4 – реагент Сыворотка 0,2 0,2 0,2 – Диазореактив 0,2 0,2 0,2 – Физ. раствор 0,2 1,6 0,2 1,8 Калибратор – – 0,2 – Количество добавляемых реагентов может меняться в зависимости от используемого диагностического набора. Цифры приведены для примера. Для определения прямого билирубина ровно через 5 минут инкубации при комнатной температуре измеряют оптическую плотность пробы против контроля при длине волны 546 нм. Для определения общего билирубина пробы инкубируют в течение 20 минут, затем измеряют оптическую плотность опытной пробы против контрольной, а также оптическую плотность калибровочной пробы против дистиллированной воды. Расчет концентрации билирубина производим по формуле: Аоп. С = ------------× С кал., Акал. где: С — концентрация билирубина в анализируемой пробе, мкмоль/л; Аоп. — оптическая плотность анализируемой пробы; Акал. — оптическая плотность калибратора; Скал. — содержание билирубина в калибраторе, мкмоль/л. Метод Уолтерс-Джерарда Принцип метода Прямой (связанный, конъюгированный с глюкуроновой кислотой) билирубин непосредственно реагирует с диазотированной сульфаниловой кислотой, а общий билирубин определяется в присутствии диметилсульфоксида (ДМСО) с образованием окрашенного азосоединения. Интенсивность окраски реакционной среды пропорциональна концентрации билирубина и измеряется фотометрически при длине волны 550 (540-560) нм. Для исследования используется сыворотка, гепаринизированная или ЭДТА-плазма крови без следов гемолиза и липемии. Процедура анализа не отличается от таковой в методе Йендрашека-Гроффа. Имеется реагент для определения общего билирубина (в своем составе содержит ДМСО), а также реагент для определения прямого билирубина (без ДМСО). Сыворотка и реагенты смешиваются в соотношении 1:10. Метод определения общего билирубина с 3,5 – дихлорфенилдиазониевой солью (DPD) Принцип метода Общий билирубин в присутствии детергента и акселератора реакции взаимодействует с диазокомплексом 3,5-дихлорфенил-диазоний-тетрафлюороборатом (DPD) в кислой среде с образованием азобилирубина. Интенсивность окраски реакционной среды пропорциональна концентрации билирубина и измеряется фотометрически при длине волны 510 (500-530) нм. Материалом для исследования служит сыворотка пациента без признаков гемолиза и липемии. Линейность метода – до 513 мкмоль/л. Процедура анализа Исследование проводят непосредственно в термостатируемой кювете при t +37°C с длиной оптического пути 1 см при длине волны 510 нм. Готовят и маркируют три пробирки: 1) Опытная проба 2) Калибровочная проба 3) Дистиллированная вода В опытную и калибровочную пробирки вносят по 1 мл раствора детергента, а также по 20 мкл сыворотки пациента и калибровочного раствора соответственно. В третью пробирку вносят 1 мл дистиллированной воды. Пробирки инкубируют 5 минут при 37°С и измеряют оптическую плотность А 1 против дистиллированной воды. Далее в пробирки 1 и 2 вносят по 200 мкл DPD-реагента, инкубируют еще 5 минут при 37°С и измеряют оптическую плотность А2 против дистиллированной воды. Расчет: ΔАоп. С = ------------× С кал., ΔАкал. где: С — концентрация билирубина в анализируемой пробе, мкмоль/л; Аоп. — разность оптических плотностей опытной пробы; Акал. — разность оптических плотностей калибровочной пробы; Скал. — содержание билирубина в калибраторе, мкмоль/л. Если концентрация билирубина в пробе превышает 513 мкмоль/л, пробу разбавить физиологическим раствором в 2 раза, анализ повторить и полученный результат умножить на 2. Метод с дихлоранилином Принцип метода. Альбумин-билирубиновый комплекс разрушается детергентом. Затем освободившийся билирубин (прямой и неконьюгированный) в присутствии диазотированного дихлоранилина вступает в реакцию азосочетания и образует окрашенный в красный цвет комплекс азокрасителя в кислом растворе, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна содержанию билирубина в пробе и измеряется фотометрически при длине волны 546(500-560) нм. Линейность определения концентрации билирубина находится в диапазоне от 4,0 до 510 мкмоль/л, отклонение от “линейности” не превышает 7%. Чувствительность определения — не более 3,0 мкмоль/л. Материалом для исследования служит негемолизированная сыворотка крови. Сыворотку крови следует отделить от форменных элементов крови не позднее, чем через 1 час после забора крови. Процедура анализа Компоненты реакционной смеси отбирать в количествах, указанных в таблице. Для приготовления рабочего реагента необходимо смешать дихлоранилиновый реагент с нитритом натрия в соотношении 1:1. Отмерить (мл) Опытная проба Контрольная Калиброво Калибровочная (холостая) чная проба (холостая) проба проба Рабочий реагент Дихлоранилиновый реагент Сыворотка крови 1,0 - 1,0 1,0 - 1,0 0,1 0,1 - - Калибратор 0,1 0,1 Пробы перемешать и инкубировать при комнатной температуре (+18-25°С) в течение 10 мин. Измерить оптическую плотность опытной пробы против контрольной (холостой) пробы и оптическую плотность калибровочной пробы против калибровочной (холостой) пробы в кювете 10 мм при длине волны 546 нм. Окраска стабильна в течение 30 мин. Расчет Аоп. С = ------------× С кал., Акал. где: С — концентрация билирубина в анализируемой пробе, мкмоль/л; Аоп. — оптическая плотность анализируемой пробы; Акал. — оптическая плотность калибратора; Скал. — содержание билирубина в калибраторе, мкмоль/л. ВОПРОСЫ ДЛЯ ОБСУЖДЕНИЯ 1. Типы желтух: надпеченочные, печеночные, подпеченочные. 2. Гипербилирубинемия и билирубинурия. 3. Образование билирубина и его фракций в крови, печени, кишечнике, почках. 4. Свободный (непрямой) и коньюгированный (прямой) билирубин, уробилиноген и стеркобилиноген, желчные пигменты. 5. Токсичность билирубина. 6. Желтуха новорождённых. 7. Референтные значения, дифференциальная диагностика заболеваний печени. 8. Фракции билирубина в крови, моче, кале. 9. Метод Йендрашека-Гроффа. Принцип реакции, аналитические характеристики. 10. Метод Уолтерса-Джерарда. Принцип реакции, аналитические характеристики. 11. Метод DPD. Принцип реакции, аналитические характеристики. 12. Метод с дихлоранилином. Принцип реакции, аналитические характеристики. ЗАДАЧА В сыворотке пациента методом Йендрашека-Гроффа при определении концентрации билирубина были получены следующие цифры: Аоп=1030, Акал=1800, Скал=85,5 мкмоль/л. Рассчитайте концентрацию общего билирубина сыворотки пациента. О какой патологии может идти речь? Какие исследования следует назначить пациенту для уточнения диагноза?
