общая характеристика работы - Институт цитологии и генетики

реклама
На правах рукописи
Дементьева Елена Вячеславовна
СТАТУС ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И МОДИФИКАЦИИ ХРОМАТИНА НА
АКТИВНОЙ И НЕАКТИВНОЙ Х-ХРОМОСОМЕ У ОБЫКНОВЕННЫХ
ПОЛЕВОК
Генетика – 03.02.07
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Новосибирск
2010
Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте
цитологии и генетики СО РАН, в лаборатории эпигенетики развития,
г. Новосибирск.
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор
Закиян С.М.
Институт цитологии и генетики СО РАН,
г. Новосибирск
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор
Кикнадзе И.И.
Институт цитологии и генетики СО РАН,
г. Новосибирск
доктор биологических наук
Лебедев И.Н.
НИИ медицинской генетики СО РАМН,
г. Томск
Ведущее учреждение:
Институт биологии гена, г. Москва
Защита состоится «_28_»__апреля_____2010 г. на утреннем заседании
диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени
доктора наук (Д 003.011.01) при Институте цитологии и генетики СО РАН по
адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10. Факс:
(383) 333-12-78; e-mail: dissov@bionet.nsc.ru.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и
генетики СО РАН.
Автореферат разослан «___»____________2010 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
доктор биологических наук
Т.М. Хлебодарова
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Дозовая компенсация генов половых хромосом
является одной из наиболее интересных и интенсивно разрабатываемых проблем
современной биологии. Необходимость дозовой компенсации возникает у
организмов, половые хромосомы которых значительно отличаются по
морфологии и генетическому содержанию. Специализация половых хромосом у
самцов млекопитающих приводит к нарушению соотношения уровней
экспрессии генов Х-хромосомы между полами, которое устраняется с помощью
подавления транскрипции, инактивации, генов на одной из двух Х-хромосом у
самок. Процесс инактивации Х-хромосомы изучается уже на протяжении
нескольких десятилетий. И хотя в понимании его механизмов достигнут
значительный прогресс, остается еще целый ряд невыясненных вопросов.
Гены Х-хромосомы самок млекопитающих в различной степени
вовлечены в систему дозовой компенсации. Так, ряд генов избегает инактивации
и сохраняет экспрессию на неактивной Х-хромосоме. Имеющиеся данные о
статусе экспрессии генов Х-хромосомы у человека, мыши и некоторых других
видов (Jegalian, Page, 1998; Disteche et al., 2002; Carrel, Willard, 2005; Yen et al.,
2007) указывают на то, что избегающие инактивации гены характерны для Ххромосомы многих таксонов плацентарных млекопитающих. Было выдвинуто
несколько гипотез, объясняющих различия в статусе экспрессии генов Ххромосомы, однако причины, по которым те или иные гены избегают
инактивации, на сегодняшний день не известны.
Существует две формы процесса инактивации Х-хромосомы:
импринтированная и случайная. Импринтированная инактивация Х-хромосомы,
унаследованной от отца, наблюдается у некоторых видов плацентарных
млекопитающих (например, грызунов) на предымплантационных стадиях
развития эмбриона и сохраняется в клетках экстраэмбриональных тканей. В
клетках, из которых формируются ткани собственно эмбриона, во время
имплантации происходит реактивация отцовской Х-хромосомы и последующий
процесс случайной инактивации либо отцовской, либо материнской Ххромосомы. Оба типа инактивации зависят от экспрессии гена Xist.
Установление неактивного состояния сопровождается распространением Xist
РНК вдоль инактивируемой Х-хромосомы, утратой модификаций, характерных
для транскрипционно активного хроматина, и приобретением модификаций
транскрипционно неактивного хроматина (Heard, Disteche, 2006; Шевченко и
др., 2006). Было показано, что при случайной инактивации в соматических
тканях человека и коровы модификации хроматина на неактивной Х-хромосоме
формируют два типа гетерохроматина, которые ассоциированы с различными
типами G-бэндов и отличаются по времени репликации в поздней S-фазе
(Chadwick, Willard, 2004; Coppola et al., 2008). Тем не менее, остается неясным,
свойственна ли такая организация хроматина неактивной Х-хромосоме других
видов плацентарных млекопитающих, а также принимают ли эти два типа
гетерохроматина участие в поддержании неактивного состояния Х-хромосомы
при импринтированной инактивации.
Случайная инактивация Х-хромосомы в отличие от импринтированной
стабильно поддерживается в ряду клеточных поколений. Принято считать, что
3
за стабильность случайной инактивации у человека и мыши отвечает
метилирование ДНК промоторных областей генов неактивной Х-хромосомы.
Роль метилирования ДНК в процессе импринтированной инактивации еще
только предстоит выяснить, поскольку в настоящее время существует очень
мало данных как о статусе метилирования, так и о статусе экспрессии генов Ххромосомы в экстраэмбриональных тканях самок млекопитающих.
Решению вопросов о том, с чем связаны различия в статусе экспрессии
генов на неактивной Х-хромосоме, и о роли модификаций хроматина в
процессах случайной и импринтированной инактивации, будет способствовать
детальное изучение процесса инактивации Х-хромосомы у других видов
млекопитающих. В лаборатории эпигенетики развития Института цитологии и
генетики СО РАН проводится исследование процесса инактивации Ххромосомы у обыкновенных полевок рода Microtus. В данной работе на примере
обыкновенных полевок впервые проведено сравнение статусов экспрессии и
метилирования генов, а также распределения модификаций хроматина на
активной и неактивной Х-хромосоме при случайной и импринтированной
инактивации.
Цель и задачи работы. Цель работы – установление статуса экспрессии генов и
модификаций хроматина на активной и неактивной Х-хромосоме в соматических
и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Определение статуса экспрессии генов Х-хромосомы в соматических и
экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок;
2. Сравнение статуса метилирования промоторных областей и/или первых
экзонов генов Х-хромосомы в соматических и экстраэмбриональных
тканях обыкновенных полевок;
3. Выяснение характера распределения модификаций хроматина на активной
и неактивной Х-хромосоме в фибробластах, трофобластных стволовых
клетках и клетках экстраэмбриональной эндодермы обыкновенных
полевок.
Научная новизна работы. На основе клеточных линий самок межвидовых
гибридов M. rossiaemeridionalis × M. arvalis создана модельная система для
изучения статуса экспрессии генов Х-хромосомы, и определен статус экспрессии
15 генов в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок.
Проведено сравнение профиля экспрессии генов Х-хромосомы обыкновенных
полевок с данными, имеющимися по человеку и мыши. Впервые установлен
статус метилирования промоторных областей и/или первых экзонов 4 генов Ххромосомы в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных
полевок. На примере трофобластных стволовых клеток и клеток
экстраэмбриональной эндодермы обыкновенных полевок впервые исследован
характер распределения модификаций хроматина на метафазных хромосомах
при импринтированной инактивации Х-хромосомы.
4
Положения, выносимые на защиту.
1. В экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок инактивация Ххромосомы является менее полной и/или стабильной по сравнению с
соматическими тканями;
2. В соматических тканях обыкновенных полевок в отличие от
экстраэмбриональных тканей наблюдается четкое соответствие между
статусом метилирования промоторной области и/или 1 экзона генов Ххромосомы и их транскрипционной активностью;
3. При случайной и импринтированной инактивации у обыкновенных
полевок
поддержание
неактивного
состояния
Х-хромосомы
осуществляется с помощью двух типов гетерохроматина, различающихся
по составу и локализации.
Научно-практическая значимость работы. Результаты данной работы вносят
вклад
в
понимание
эпигенетических
механизмов
случайной
и
импринтированной инактивации Х-хромосомы, а также механизмов регуляции
экспрессии генов Х-хромосомы у самок млекопитающих.
Апробация работы. Результаты работы представлены на второй
международной конференции по инактивации Х-хромосомы (Париж, 17 – 22
сентября 2006 г.), на Международной молодежной научно-методической
конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 9 – 12
мая 2007 г.), на Международной конференции «Хромосома 2009» (Новосибирск,
31 августа – 6 сентября 2009 г.), семинарах и отчетных сессиях Института
цитологии и генетики СО РАН.
По теме диссертации опубликованы три работы. Одна – в рецензируемом
отечественном журнале, две – в рецензируемых зарубежных журналах.
Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно.
Саузерн блот-гибридизация геномной ДНК выполнялась совместно с к.б.н. А.И.
Шевченко. Анализ результатов иммунофлуоресцентного окрашивания
метафазных хромосом клеточных линий обыкновенных полевок проводился
совместно с к.б.н. С.В. Павловой и к.б.н. А.И. Шевченко.
Структура и объем диссертации. Диссертация включает разделы: введение,
обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение,
выводы и список литературы (182 наименования). Работа изложена на 124
страницах, содержит 12 рисунков и 8 таблиц.
МАТЕРИЛЫ И МЕТОДЫ
1. Получение и цитогенетическая характеристика линий фибробластов
самок гибридов M. rossiaemeridionalis × M. arvalis.
Первичные культуры фибробластов легкого гибридной самки M.
rossiaemeridionalis × M. arvalis получали методом трипсинизации (Nesterova et
al., 1994). Препараты метафазных хромосом субклонов готовили согласно
5
(Nesterova et al., 1998). Для выявления позднореплицирующегося хроматина за 6
часов до начала приготовления цитогенетических препаратов метафазных
хромосом к клеткам добавляли 5-бромдезоксиуридин. Дальнейшую обработку
препаратов и иммунофлуоресцентное окрашивание антителами к 5бромдезоксиуридину проводили как описано в работе Shevchenko et al. (2009).
РНК-ДНК FISH с зондами на Xist РНК и повтор MS4 из блока гетерохроматина
Х-хромосомы M. rossiaemeridionalis был выполнен по стандартным методикам
(Lawrence et al. 1989; Fantes et al., 1995). Анализ препаратов проводили на
флуоресцентном микроскопе NIKON X100 с помощью программного
обеспечения фирмы Imstar.
2. Определение статуса экспрессии генов Х-хромосомы у обыкновенных
полевок.
РНК была выделена из 12,5-дневных эмбрионов самцов и самок M. arvalis
и M. rossiaemeridionalis, а также из фибробластов легкого, плацент и субклона
линии клеток экстраэмбриональной эндодермы (XEN) гибридных самок M.
rossiaemeridionalis × M. arvalis с помощью TRI REAGENT (Sigma) или RNAzol B
(Biogenesis) согласно инструкциям фирм производителей. Для очистки образцов
РНК от контаминаций ДНК использовали набор реагентов TURBO DNA-free
(Ambion). Реакции обратной транскрипции проводили при помощи обратной
транскриптазы M-MLV (Promega) и random decamer праймеров (Invitrogene)
согласно прилагаемым рекомендациям. При анализе экспрессии гена Xist в
экстраэмбриональных тканях для синтеза кДНК использовался цепьспецифичный праймер SDX3 (5’-cccagtgctggtgagctattcc-3’). Полученная кДНК
амплифицировалась с помощью ПЦР. Нуклеотидную последовательность ПЦРпродуктов определяли согласно протоколу ABI PRISM BigDye™ Terminator
Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems, Perkin-Elmer
Corporation) на автоматическом секвенаторе в Межинститутском центре
секвенирования ДНК (Институт химической биологии и фундаментальной
медицины СО РАН). Поиск межвидовых отличий нуклеотидных
последовательностей кДНК осуществлялся программой SeqMan (DNASTAR).
Статус экспрессии генов Х-хромосомы в фибробластах, плацентах и клетках
XEN самок гибридов M. rossiaemeridionalis × M. arvalis определяли методом
удлинения праймера на 1 нуклеотид (single nucleotide primer extension, SNuPE)
(Singer-Sam et al., 1992). В случае генов Chm, Nap1l3, Rbbp7, Sybl1, Utx в реакции
добавлялись [α32P]dATP или [α32P]dGTP; для генов Atrx, Ddx3x, Hprt, Mid1, Pgk1,
Rab9, Sb1.8, Slc7a3, Ube1x, Xist использовались [α32P]dCTP или [α32P]dTTP.
3. Определение статуса метилирования генов Х-хромосомы у
обыкновенных полевок.
Геномная ДНК из печени, трофобластных стволовых (ТС) и XEN клеток
была выделена как описано в работе Слободянюка с соавт. (1994). Геномная ДНК
гидролизировалась EcoRI, а затем чувствительными к метилированию
эндонуклеазами рестрикции (New England BioLabs). Саузерн блот-гибридизацию
с зондами на промоторную область и/или первый экзон генов проводили согласно
руководству Маниатис и др. (1984). Подбор чувствительных к метилированию
6
эндонуклеаз рестрикции осуществляли с помощью программы MapDraw
(DNASTAR).
4. Иммунофлуоресцентное окрашивание ядер и метафазных хромосом.
Цитоцентрифугирование фибробластов, ТС и XEN клеток и последующее
иммунофлуоресцентное окрашивание ядер и метафазных хромосом антителами
к различным модификациям хроматина проводилось как описано в работе
Shevchenko et al. (2009). Анализ препаратов осуществлялся как при ДНК-РНК
FISH. Для каждой модификации хроматина было проанализировано не менее
100 метафазных пластинок.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Статус экспрессии генов Х-хромосомы в соматических и
экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок.
Для изучения статуса экспрессии генов Х-хромосомы в соматических
тканях обыкновенных полевок из легкого гибридной самки M.
rossiaemeridionalis × M. arvalis была получена первичная культура
фибробластов. У гибридных самок M. rossiaemeridionalis × M. arvalis
инактивация Х-хромосомы происходит неслучайным образом. В 85% клеток
неактивной становится Х-хромосома M. rossiaemeridionalis, остальные клетки
содержат неактивную Х-хромосому M. arvalis (Zakian et al., 1987). Чтобы иметь
линии фибробластов, где точно известно, Х-хромосома какого вида неактивна,
было проведено субклонирование первичной культуры. В результате были
получены четыре субклона фибробластов (линии SA004, SA005, SA006, SA007).
В работе также использовался ранее полученный в лаборатории эпигенетики
развития ИЦиГ СО РАН субклон фибробластов гибридной самки M.
rossiaemeridionalis × M. arvalis (линия SAD4). Транскрипционный статус Ххромосом обоих видов в субклонах оценивался на основании двух свойств
неактивной Х-хромосомы: более поздней репликации по сравнению с активным
гомологом и экспрессии гена Xist. Было показано, что в субклонах SA004-7
неактивной является Х-хромосома M. rossiaemeridionalis, а в субклоне SAD4 –
Х-хромосома M. arvalis. В качестве экстраэмбриональных тканей
использовались плаценты и субклон клеток XEN гибридных самок M.
rossiaemeridionalis × M. arvalis, в которых импринтированной инактивации
подвергается отцовская Х-хромосома M. arvalis (Шевченко и др., 2008).
Для того чтобы различить аллели генов на активной и неактивной Ххромосоме в клетках гибридных самок, был осуществлен поиск межвидовых
различий нуклеотидных последовательностей их кДНК у M. arvalis и M.
rossiaemeridionalis. Пары праймеров были подобраны по известным
нуклеотидным последовательностям генов обыкновенных полевок или
нуклеотидным последовательностям ортологичных генов мыши, крысы и
человека. ПЦР-продукты ожидаемых размеров с кДНК M. arvalis и M.
rossiaemeridionalis были получены для 26 генов. Секвенирование подтвердило
их гомологию исследуемым генам. Межвидовые различия нуклеотидных
последовательностей кДНК были найдены только для 15 генов. В случае
7
остальных 11 генов межвидовые различия нуклеотидных последовательностей
кДНК не были обнаружены, что в дальнейшем не позволило определить их
статус экспрессии.
При исследовании статуса экспрессии 15 генов в фибробластах
обыкновенных полевок были обнаружены практически все типы экспрессии
генов Х-хромосомы (рис. 1). Так, гены Atrx, Chm, Hprt, Mid1, Nap1l3, Pgk1, Rab9,
Rbbp7, Slc7a3, Sybl1, Ube1x экспрессируются на активной Х-хромосоме и
подвергаются инактивации на неактивной Х-хромосоме. Ген Xist
экспрессируется на неактивной Х-хромосоме, а на активной Х-хромосоме его
транскрипция репрессирована. Ген Utx экспрессируется как на активной, так и
на неактивной Х-хромосоме, т.е. избегает инактивации. Статус экспрессии этих
13 генов одинаков во всех 5 исследуемых субклонах фибробластов в отличие от
генов Sb1.8 и Ddx3x. В линиях SA004-7 ген Sb1.8 экспрессируется на активной
Х-хромосоме, а в линии SAD4 – на активной и неактивной Х-хромосоме.
Напротив, ген Ddx3x экспрессируется на обеих Х-хромосомах в линиях SA004-7
и лишь на активной Х-хромосоме в линии SAD4. По-видимому, гены Sb1.8 и
Ddx3x имеют гетерогенную экспрессию у обыкновенных полевок. Поскольку
субклоны SA004-7 и SAD4 были получены из первичных культур фибробластов
легкого разных гибридных самок, то уровень экспрессии генов Sb1.8 и Ddx3x
может варьировать между особями и, если эта разница в уровне экспрессии
имеет какое-либо значение, то она может вносить вклад в индивидуальные
различия.
По профилю экспрессии генов Х-хромосома обыкновенных полевок более
сходна с Х-хромосомой мыши, чем с Х-хромосомой человека. Так, на Ххромосоме обыкновенных полевок была выявлена группа инактивирующихся
генов Chm, Nap1l3, Rab9, Rbbp7, Ube1x. У человека ортологи большинства из
них избегают инактивации (Carrel, Willard, 1999, 2005). У мыши установлен
статус экспрессии лишь для гена Ube1x, который также подвергается
инактивации (Carrel et al., 1996; Yen et al., 2007). Кроме того, известно, что ряд
генов, избегающих инактивации у человека, подвергается инактивации у мыши
(Disteche, 1995, 1999; Brown, Greally, 2003). Возможно, что у представителей
отряда грызунов (мышь, обыкновенные полевки и др.) число избегающих
инактивации генов может быть меньше, чем в других отрядах плацентарных,
либо инактивации избегают совсем другие гены Х-хромосомы. Это
предполагает, что эволюция процесса инактивации Х-хромосомы в различных
группах плацентарных млекопитающих происходила независимым образом.
Ранее было показано, что некоторые гены и трансгены, подвергающиеся
инактивации в соматических тканях, способны экспрессироваться на неактивной
Х-хромосоме в экстраэмбриональных тканях (Kratzer et al., 1983; Krumlauf et al.,
1986; Hadjantonakis et al., 2001; Garrick et al., 2006). В связи с этим принято
считать, что импринтированная инактивация Х-хромосомы является менее
полной и/или стабильной, чем случайная. Тем не менее, систематического
исследования статуса экспрессии генов Х-хромосомы при импринтированной
инактивации до сих пор не проводилось.
8
Рис. 1. Статус экспрессии генов Х-хромосомы в фибробластах и
экстраэмбриональных тканях гибридных самок M. rossiaemeridionalis × M. arvalis. Xa и
Xi – активная и неактивная Х-хромосомы, arv – M. arvalis, ros – M. rossiaemeridionalis,
XEN – клетки экстраэмбриональной эндодермы. Контрольные реакции проводились
без добавления матрицы.
В плацентах и субклоне клеток XEN обыкновенных полевок большинство
исследуемых генов имеет тот же статус экспрессии, что и в фибробластах (рис.
1). Гены Hprt, Nap1l3, Pgk1, Rab9, Rbbp7, Slc7a3, Sybl1 экспрессируются только
на активной Х-хромосоме. Экспрессия гена Xist осуществляется лишь с
неактивной Х-хромосомы, ген Utx избегает инактивации. Однако между
профилями
экспрессии
генов
Х-хромосомы
в
фибробластах
и
экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок был обнаружен ряд
отличий. Гены Sb1.8 и Ddx3x, которые имеют гетерогенную экспрессию в
фибробластах, экспрессируются на активной и неактивной Х-хромосоме в обоих
типах экстраэмбриональных тканей. Инактивирующийся в фибробластах ген
Ube1x экспрессируется на обеих Х-хромосомах в субклоне клеток XEN и в
плаценте. Интересно, что гены Atrx, Chm, Mid1 демонстрируют
линиеспецифическую инактивацию. В плаценте гены Atrx и Mid1
экспрессируются на обеих Х-хромосомах, а в субклоне клеток XEN
инактивируются также как и в фибробластах. Напротив, ген Chm подвергается
инактивации в плаценте и фибробластах, но экспрессируется на обеих Ххромосомах в субклоне клеток XEN. Линиеспецифичность инактивации генов
Atrx, Chm и Mid1 может быть следствием относительной нестабильности
импринтированной инактивации. Кроме того, линиеспецифичность инактивации
9
(доза) некоторых генов Х-хромосомы может влиять на развитие и
функционирование экстраэмбриональных тканей. Это предположение
подкрепляется тем, что ген Atrx избегает инактивации в производных
трофобласта и подвергается инактивации в экстраэмбриональной эндодерме не
только у обыкновенных полевок, но и у мыши (Garrick et al., 2006; Patrat et al.,
2009).
Таким образом, часть генов, подвергающихся инактивации в
соматических тканях, может экспрессироваться на неактивной Х-хромосоме в
экстраэмбриональных тканях. Это свидетельствует в пользу предположений о
меньшей полноте и/или стабильности импринтированной инактивации.
Вероятно, соматические и экстраэмбриональные ткани имеют различные
потребности в дозовой компенсации генов Х-хромосомы. Поскольку
экстраэмбриональные ткани необходимы в онтогенезе млекопитающих
ограниченный период времени, дозовая компенсация при импринтированной
инактивации Х-хромосомы может быть менее строгой (Heard, 2005), и значение
имеет только уровень экспрессии ограниченного набора генов Х-хромосомы.
2. Статус метилирования генов Х-хромосомы в соматических и
экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок.
Статус метилирования определялся для 4 генов Х-хромосомы с
известными нуклеотидными последовательностями промоторной области и/или
1 экзона (рис. 2). Были использованы печени самцов и самок M. arvalis и M.
rossiaemeridionalis, а также недифференцированные и дифференцированные ТС
и XEN клетки M. rossiaemeridionalis. В ТС клетках обыкновенных полевок, как и
в XEN клетках, инактивация Х-хромосомы импринтирована (Grigor’eva et al.,
2009).
Рис. 2. Статус метилирования генов Х-хромосомы в соматических и
экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок. ТС – трофобластные стволовые
10
клетки самок M. rossiaemeridionalis:
дифференцированные. XEN – клетки
rossiaemeridionalis.
н – недифференцированные, д –
экстраэмбриональной эндодермы M.
Рис. 3. Модификации хроматина в фибробластах самок M. rossiaemeridionalis. А.
Триметилированный Н3К27 (3meH3K27) и убиквитинированный гистон Н2А (uH2A).
Б. Триметилированный Н3К9 (3meH3K9) и триметилированный Н3К27 (3meH3K27). В.
Гетерохроматиновый белок НР1 и триметилированный Н3К27 (3meH3K27). Xa и Xi –
активная и неактивная Х-хромосомы. Для общего окрашивания хромосом
использовался 4’,6’–диамидино-2-фенилиндол (DAPI).
Рис. 4. Модификации хроматина в клетках экстраэмбриональной эндодермы самок M.
rossiaemeridionalis. Иммунофлуоресцентное окрашивание метафазных хромосом
антителами к гетерохроматиновому белку НР1 и убиквитинированному гистону Н2А
(uH2A). Xa и Xi – активная и неактивная Х-хромосомы. Для общего окрашивания
хромосом использовался DAPI.
11
Рис. 5. Модификации хроматина в недифференцированных трофобластных стволовых
клетках самок M. rossiaemeridionalis. А. Убиквитинированный гистон Н2А (uH2A) и
триметилированный Н3К9 (3meH3K9). Б. Гетерохроматиновый белок НР1 и
триметилированный Н3К9 (3meH3K9). В. Убиквитинированный гистон Н2А (uH2A) и
триметилированный Н3К27 (3meH3K27). Xa и Xi – активная и неактивная Ххромосомы. Для общего окрашивания хромосом использовался DAPI.
Рис. 6. Модификации хроматина в трофобластных стволовых клетках самок M.
rossiaemeridionalis на различных стадиях дифференцировки. Иммунофлуоресцентное
окрашивание
ядер
антителами
к
гетерохроматиновому белку НР1
и
триметилированному Н3К27 (3meH3K27). Верхний ряд соответствует 4 дню
дифференцировки, нижний ряд – 6 дню дифференцировки.
12
В соматических тканях самцов обыкновенных полевок были выявлены
только неметилированные аллели генов Nap1l3 и Sb1.8. У самок наблюдаются
неметилированные и метилированные аллели, которые, по всей видимости,
соответствуют активной и неактивной Х-хромосоме. Это результат согласуется с
инактивацией гена Nap1l3 и гетерогенной экспрессией гена Sb1.8 в
фибробластах полевок. Ген Xist полностью метилирован у самцов и частично
метилирован у самок, что соответствует его репрессии у самцов и экспрессии
лишь на неактивной Х-хромосоме у самок. Ген Utx не подвергается
метилированию ни у самцов, ни у самок обыкновенных полевок, что согласуется
с его экспрессией на единственной Х-хромосоме у самцов и обеих Ххромосомах у самок.
Метилирование ДНК промоторных областей генов неактивной Ххромосомы является самым поздним событием при установлении случайной
инактивации и считается ответственным за стабильное поддержание
неактивного состояния (Brockdorff, 2002). У человека и мыши между статусом
метилирования CpG-островков 5’ областей и транскрипционной активностью
генов Х-хромосомы прослеживается четкая корреляция: активные аллели не
метилированы, тогда как неактивные аллели метилированы (Carrel et al., 1996;
Gilbert, Sharp, 1999; Matarazzo et al., 2002). Данная закономерность наблюдается
и в соматических тканях обыкновенных полевок и означает, что метилирование
ДНК в промоторных районах и/или 1 экзонах генов Х-хромосомы играет
важную роль в поддержании их неактивного состояния при случайной
инактивации.
В экстраэмбриональных тканях статус метилирования генов неактивной
Х-хромосомы до сих пор остается неясным. Считается, что уровень
метилирования генов неактивной Х-хромосомы в экстраэмбриональных тканях
ниже, чем в соматических тканях. Об этом свидетельствуют экспрессия
некоторых генов и трансгенов на неактивной Х-хромосоме (Kratzer et al., 1983;
Krumlauf et al., 1986; Hadjantonakis et al., 2001; Garrick et al., 2006), а также
устойчивость экстраэмбриональных тканей к экстенсивному деметилированию
in vivo (Sado et al., 2000). Однако CpG-динуклеотиды в 5’ областях некоторых
генов Х-хромосомы подвергаются метилированию в экстраэмбриональных
тканях мыши и человека (Grant et al., 1992; Norris et al., 1994; Goto et al., 1997).
У обыкновенных полевок в клетках XEN, как и в фибробластах, ген
Nap1l3 не подвергается метилированию у самца и частично метилируется у
самки, что согласуется с его инактивацией в данной линии клеток (рис. 2).
Несмотря на то, что в плаценте ген Nap1l3 также инактивируется, он не
метилируется в ТС клетках самки ни до дифференцировки, ни в процессе
дифференцировки. Это означает, что метилирование данного гена на неактивной
Х-хромосоме
может
осуществляться
на
более
поздних
стадиях
дифференцировки либо он остается гипометилированным в производных
трофобласта. Ген Sb1.8 избегает инактивации и в плаценте, и в клетках XEN.
Однако в ТС и XEN клетках самок обыкновенных полевок выявляется
метилированный аллель гена Sb1.8. Известно, что уровень экспрессии генов на
неактивной Х-хромосоме, как правило, ниже, чем на активной Х-хромосоме
(Disteche et al., 2002; Carrel, Willard, 2005; Johnston et al., 2008). В таком случае
13
метилирование гена Sb1.8 в ТС и XEN клетках самок обыкновенных полевок
могло бы отражать более низкий уровень экспрессии его аллеля на неактивной
Х-хромосоме. Возможно также, что в ТС и XEN клетках метилирование ДНК не
принимает участия в регуляции экспрессии генов Nap1l3 и Sb1.8 или
метилирование совсем других CpG-сайтов участвует в регуляции их экспрессии.
Об этом может свидетельствовать метилирование единственного аллеля гена
Sb1.8 в XEN клетках самца. Статусы экспрессии и метилирования генов Xist и
Utx сходны в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных
полевок. В экстраэмбриональных тканях ген Xist также репрессирован у самцов
и транскрибируется лишь на неактивной Х-хромосоме у самок. В клетках XEN
самцов ген Xist полностью метилирован. В ТС и XEN клетках самок наряду с
метилированным
аллелем
выявляется
неметилированный
аллель,
соответствующий экспрессии данного гена на неактивной Х-хромосоме. Ген Utx
не метилируется ни в ТС клетках, ни в клетках XEN у обыкновенных полевок,
что согласуется с избеганием инактивации в плаценте и клетках XEN.
В экстраэмбриональных тканях метилирование ДНК, вероятно, участвует
в регуляции экспрессии только части генов Х-хромосомы. Значит, при
импринтированной инактивации Х-хромосомы метилирование ДНК может
оказаться менее важным для поддержания неактивного состояния, чем при
случайной, и другие эпигенетические механизмы, например, Polycomb белки
(Wang et al., 2001; Plath et al., 2004), могут вносить основной вклад в
инактивацию генов в экстраэмбриональных тканях. Меньшей роли
метилирования ДНК в поддержании неактивного состояния генов при
импринтированной инактивации может способствовать ограниченная по
времени необходимость в экстраэмбриональных тканях, и в результате
корректно метилированными оказываются только те гены Х-хромосомы,
уровень экспрессии которых является критичным.
3. Модификации хроматина Х-хромосомы обыкновенных полевок при
случайной и импринтированной инактивации.
Модификации хроматина исследовались у самок M. rossiaemeridionalis на
примере фибробластов, где инактивация Х-хромосомы происходит случайным
образом, а также XEN и ТС клеток, где инактивация импринтирована (Шевченко
и др., 2008; Grigor’eva et al., 2009). Клетки XEN получают из гипобласта
бластоцисты, поэтому они могут моделировать события, происходящие в
экстраэмбриональной эндодерме. ТС клетки, по-видимому, отражают события,
происходящие в трофобластной линии экстраэмбриональных тканей.
Методом иммунофлуоресцентного окрашивания метафазных хромосом
антителами к различным модификациям хроматина на неактивной Х-хромосоме
фибробластов и большинства клеток XEN были обнаружены два
неперекрывающихся типа гетерохроматина. Первый тип гетерохроматина
представлен триметилированным по лизину в 27 положении гистоном Н3
(3meН3К27) и моноубиквитинированным по лизину в 119 положении гистоном
Н2А (uH2A) (рис. 3А, 4). Их локализация совпадает с G-негативными бэндами
Х-хромосомы, а также с ранее установленной локализацией Xist РНК (Duthie et
al., 1999). Второй тип гетерохроматина образован триметилированным по
14
лизину в 9 положении гистоном Н3 (3meН3К9) и гетерохроматиновым белком
HP1 и соответствует G-позитивным бэндам Х-хромосомы (рис. 3Б-В, 4). Кроме
того, 3meН3К9 и НР1 выявляются в центромерных и теломерных районах
аутосом и половых хромосом, а также в блоках конститутивного
гетерохроматина на обеих, активной и неактивной, Х-хромосомах.
На примере хромосом человека и мыши было показано, что 3meH3K27
локализуется в участках хроматина, содержащих неактивные гены,
фланкирующие межгенные районы и SINE элементы. Напротив, 3meH3K9
маркирует протяженные участки неактивного хроматина, обогащенные LINE
элементами и LTR и имеющие низкую плотность генов (Valley et al., 2006;
Chadwick, 2007; Pauler et al., 2009). Таким образом, на неактивной Х-хромосоме,
по всей видимости, действуют две системы сайленсинга, направленные на
инактивацию
различных
типов
нуклеотидных
последовательностей.
Гетерохроматин первого типа (3meН3К27, uH2A и Xist РНК) необходим для
инактивации генов, в то время как гетерохроматин второго типа (3meН3К9 и
НР1) участвует в инактивации районов Х-хромосомы, содержащих
преимущественно повторенные последовательности.
До настоящего времени существование на неактивной Х-хромосоме двух
различных по набору модификаций и локализации типов гетерохроматина было
установлено лишь для человека (приматы) и коровы (парнокопытные)
(Chadwick, Willard, 2004; Coppola et al., 2008). В данной работе они выявлены на
неактивной Х-хромосоме в фибробластах и клетках XEN самок обыкновенных
полевок – представителей еще одного отряда плацентарных млекопитающих,
грызунов. Этот факт свидетельствует, во-первых, о едином принципе
поддержания неактивного состояния при случайной и импринтированной
инактивации Х-хромосомы, а, во-вторых, о сходстве структуры хроматина
неактивной Х-хромосомы у различных видов плацентарных.
В недифференцированных ТС клетках самок M. rossiaemeridionalis,
которые, вероятно, представляют ранние этапы импринтированной инактивации,
характер распределения 3meН3К9, НР1 и uH2A существенно отличается от
фибробластов и клеток XEN. 3meН3К9, НР1 и, что удивительно uH2A, были
равномерно распределены вдоль всей неактивной Х-хромосомы и
детектировались в центромерных и теломерных районах на аутосомах и обеих
Х-хромосомах (рис. 5А, Б). Интересно, что примерно в половине случаев uH2A
не обнаруживался в блоке конститутивного гетерохроматина неактивной Ххромосомы (рис. 5В), а 3meН3К9 и НР1 не выявлялись в блоке конститутивного
гетерохроматина на активной Х-хромосоме (рис. 5А, Б). Это свидетельствует о
том, что на данных стадиях развития блок конститутивного гетерохроматина на
Х-хромосоме еще окончательно не сформирован.
На неактивной Х-хромосоме в недифференцированных ТС клетках не был
выявлен 3meН3К27 (рис. 5В). Интересно, что в ТС клетках мыши 3meН3К27
является типичной для неактивной Х-хромосомы модификацией хроматина
(Mak et al., 2002; Silva et al., 2003). Данное различие может объясняться иной
динамикой процесса инактивации в предымплантационном развитии по
сравнению с мышью. Считается, что 3meН3К27 отвечает за появление на
неактивной Х-хромосоме uH2A (de Napoles et al., 2004; Plath et al., 2004). Однако
15
в недифференцированных ТС клетках полевок uH2A появляется на неактивной
Х-хромосоме раньше, чем 3meН3К27, что подтверждает существование
независимого от 3meН3К27 механизма убиквитинирования гистона Н2А
(Schoeftner et al., 2006).
Структура хроматина неактивной Х-хромосомы в недифференцированных
ТС клетках обыкновенных полевок очень сходна со структурой Х-хромосомы в
сперматогенезе млекопитающих. Те же самые модификации хроматина
(3meН3К9, НР1, uH2A) устанавливаются на Х-хромосоме в пахитене первого
деления мейоза, когда инициируется мейотическая инактивация половых
хромосом, и сохраняются после мейоза вплоть до замены гистонов на
протамины. Этот факт указывает на возможность существования связи между
мейотической и импринтированной инактивацией Х-хромосомы и предполагает,
что модификации хроматина, установленные в процессе мейотической
инактивации, могут быть тем самым импринтом, который обеспечивает
инактивацию отцовской Х-хромосомы в раннем развитии.
Для того чтобы выяснить, когда 3meН3К27 появляется на неактивной Ххромосоме, были исследованы ТС клетки на различных стадиях
дифференцировки (рис. 6). На 4 день дифференцировки 3meН3К27
обнаруживается на неактивной Х-хромосоме лишь в отдельных клетках. На 6
день дифференцировки 3meН3К27 наблюдается практически во всех ТС клетках.
Установление 3meН3К27 сопровождается снижением уровня 3meН3К9 и НР1 на
неактивной Х-хромосоме. Вероятно, в процессе дифференцировки ТС клеток
происходит постепенное замещение системы сайленсинга 3meН3К9/НР1 на
3meН3К27/uH2A, а дальнейшее поддержание неактивного состояния Ххромосомы в трофобластной линии осуществляется, как в экстраэмбриональной
эндодерме и при случайной инактивации.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Представленная работа направлена на изучение механизмов инактивации
Х-хромосомы у самок млекопитающих. Впервые установлены статусы
экспрессии и метилирования генов, а также распределение модификаций
хроматина на активной и неактивной Х-хромосоме в соматических и
экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок.
В соматических тканях, фибробластах гибридных самок M.
rossiaemeridionalis × M. arvalis, были обнаружены практически все известные на
сегодняшний день типы экспрессии генов Х-хромосомы: инактивирующиеся,
избегающие инактивации, гены с гетерогенной экспрессией. Сравнение
полученных результатов с данными, имеющимися по человеку и мыши,
показало, что по профилю экспрессии генов Х-хромосома обыкновенных
полевок сходна с мышиной Х-хромосомой и, скорее всего, заметно отличается
по набору избегающих инактивации генов от Х-хромосомы человека.
Исследование статуса экспрессии генов Х-хромосомы в плацентах и
субклоне клеток XEN гибридных самок дало возможность сравнить профили
экспрессии генов Х-хромосомы в соматических и экстраэмбриональных тканях.
В экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок большинство
16
исследуемых генов Х-хромосомы имеет тот же статус экспрессии, что и в
фибробластах. Однако несколько генов Х-хромосомы, которые подвергались
инактивации в фибробластах, экспрессировались на обеих Х-хромосомах, по
крайней мере, в одном из типов экстраэмбриональных тканей. Этот факт
подтвердил высказанные ранее предположения о меньшей полноте и/или
стабильности импринтированной инактивации Х-хромосомы по сравнению со
случайной.
Определение статуса метилирования промоторных областей и/или 1
экзонов генов Х-хромосомы в соматических и экстраэмбриональных тканях
обыкновенных полевок позволило выяснить роль метилирования ДНК в
процессах случайной и импринтированной инактивации. В соматических тканях
наблюдалось четкое соответствие между статусами экспрессии и метилирования
гена: транскрипционно активные аллели не подвергались метилированию, тогда
как транскрипционно неактивные аллели были метилированы. Этот результат
согласуется с данными, имеющимися по мыши и человеку, и свидетельствует о
важности метилирования ДНК для поддержания неактивного состояния генов
при случайной инактивации Х-хромосомы. В экстраэмбриональных тканях
данная закономерность соблюдалась лишь для части генов, т.е. при
импринтированной инактивации ведущая роль в поддержании неактивного
состояния генов, вероятно, принадлежит другим модификациям хроматина.
Изучение распределения модификаций хроматина на метафазных
хромосомах фибробластов, а также XEN и ТС клеток самок M.
rossiaemeridionalis, дало возможность сравнить структуру хроматина неактивной
Х-хромосомы при случайной и импринтированной инактивации. Было показано,
что при случайной и импринтированной инактивации на неактивной Ххромосоме устанавливаются два неперекрывающихся типа гетерохроматина:
один образован 3meН3К27 и uH2A, другой – 3meН3К9 и HP1. Поскольку те же
самые типы гетерохроматина были ранее обнаружены у человека и коровы, то
они, по-видимому, являются универсальными для неактивной Х-хромосомы
плацентарных млекопитающих.
В недифференцированных ТС клетках, соответствующих ранним стадиям
импринтированной инактивации, 3meН3К27 не выявляется, а 3meН3К9, HP1 и
uH2A равномерно распределены вдоль неактивной Х-хромосомы. Аналогичную
структуру хроматина имеет Х-хромосома в сперматогенезе млекопитающих, что
предполагает существование связи между мейотической и импринтированной
инактивацией. 3meН3К27 устанавливается на неактивной Х-хромосоме в
процессе дифференцировки ТС клеток, что сопровождается снижением уровня
3meН3К9 и HP1.
Полученные данные способствуют пониманию эпигенетических
механизмов случайной и импринтированной инактивации Х-хромосомы, а также
механизмов регуляции экспрессии генов Х-хромосомы у самок млекопитающих.
17
ВЫВОДЫ
1. В фибробластах гибридных самок M. rossiaemeridionalis × M. arvalis
выявлены все основные типы экспрессии генов Х-хромосомы. 11 генов
(Atrx, Chm, Hprt, Mid1, Nap1l3, Pgk1, Rab9, Rbbp7, Slc7a3, Sybl1, Ube1x)
подвергаются инактивации, ген Xist транскрибируется только с
неактивной Х-хромосомы, ген Utx избегает инактивации, гены Sb1.8 и
Ddx3x демонстрируют гетерогенную экспрессию;
2. В экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок инактивация Ххромосомы является менее полной и/или стабильной по сравнению с
фибробластами. Гены Atrx, Chm, Mid1, Ube1x, подвергающиеся
инактивации в фибробластах, в плацентах и клетках экстраэмбриональной
эндодермы гибридных самок M. rossiaemeridionalis × M. arvalis
экспрессируются не только на активной, но и на неактивной Х-хромосоме;
3. В соматических тканях обыкновенных полевок в отличие от
трофобластных стволовых клеток и клеток экстраэмбриональной
эндодермы наблюдается четкое соответствие между статусом
метилирования промоторной области и/или 1 экзона генов Х-хромосомы и
их транскрипционной активностью. Данный факт предполагает, что при
случайной инактивации метилирование ДНК имеет большее значение для
поддержания неактивного состояния генов Х-хромосомы, чем при
импринтированной инактивации;
4. При случайной и импринтированной инактивации у обыкновенных
полевок
поддержание
неактивного
состояния
Х-хромосомы
осуществляется с помощью двух неперекрывающихся типов
гетерохроматина: первый образован триметилированным H3K27 и
убиквитинированным H2A, второй – триметилированным H3K9 и
гетерохроматиновым белком HP1;
5. В
недифференцированных
трофобластных
стволовых
клетках
обыкновенных
полевок,
соответствующих
ранним
стадиям
импринтированной инактивации, триметилированный Н3К9, НР1 и
убиквитинированный Н2А равномерно распределены на неактивной Ххромосоме, а триметилированный Н3К27 отсутствует. Триметилирование
Н3К27 на неактивной Х-хромосоме происходит в процессе
дифференцировки трофобластных стволовых клеток и сопровождается
снижением уровня триметилированного H3K9 и HP1.
18
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:
1. Шевченко А.И., Павлова С.В., Дементьева Е.В., Голубева Д.В., Закиян
С.М. Модификации хроматина в процессе инактивации X-хромосомы у
самок млекопитающих // Генетика. 2006. Т. 42. № 9. С. 1225-1234.
2. Dementyeva E.V., Shevchenko A.I., Zakian S.M. X-chromosome upregulation
and inactivation two sides of the dosage compensation mechanism in mammals
// BioEssays. 2009. V. 31. № 1. P. 21-28.
3. Shevchenko A.I., Pavlova S.V., Dementyeva E.V., Zakian S.M. Mosaic
heterochromatin of the inactive X chromosome in vole Microtus
rossiaemeridionalis // Mammalian Genome. 2009. V. 20. № 9-10. P. 644-653.
4. Dementyeva E.V., Shevchenko A.I., Anopriyenko O.V., Mazurok N.A.,
Nesterova T.B., Zakian S.M. X-linked genes mapping and expression status
analysis in common voles // Book of abstracts of the 2nd Conference on Xinactivation. Paris, 2006. P. 68.
5. Дементьева Е.В., Шевченко А.И., Аноприенко О.В., Мазурок Н.А.,
Закиян С.М. Картирование и статус экспрессии генов Х-хромосомы у
обыкновенных полевок // Сборник материалов Международной
молодежной
научно-методической
конференции
«Проблемы
молекулярной и клеточной биологии». Томск, 2007. С. 65-66.
6. Шевченко А.И., Павлова С.В., Дементьева Е.В. Модификации хроматина
неактивной Х-хромосомы у обыкновенных полевок рода Microtus //
Сборник материалов Международной молодежной научно-методической
конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии». Томск,
2007. С. 186.
7. Васькова Е.А., Дементьева Е.В. Сравнение модификаций хроматина
неактивной Х-хромосомы фибробластов и трофобластных стволовых
клеток обыкновенных полевок // Материалы XLVI Международной
научной студенческой конференции «Студент и научно-технический
прогресс», секция биология. Новосибирск, 2008. С. 100-101.
8. Вагнер Т.В., Дементьева Е.В. Изучение статуса экспрессии генов Ххромосомы у обыкновенных полевок рода Microtus // Тез. докл.
Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых
«Ломоносов-2009», секция биология. Москва, 2009. С. 88.
9. Дементьева Е.В., Шевченко А.И., Вагнер Т.В., Закиян С.М. Статусы
экспрессии и метилирования генов Х-хромосомы в соматических и
экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок // Материалы
Международной конференции «Хромосома 2009». Новосибирск, 2009. С.
94-95.
10. Васькова Е.А., Шевченко А.И., Павлова С.В., Дементьева Е.В.,
Григорьева Е.В., Закиян С.М. Модификации хроматина неактивной Ххромосомы у обыкновенных полевок // Материалы Международной
конференции «Хромосома 2009». Новосибирск, 2009. С. 94.
19
Скачать