+ЭУР_Иммунологические методы диагностики
реклама
КИСЛЕНКО В.Н. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ЭЛЕКТРОННЫЙ УЧЕБНЫЙ РЕСУРС НОВОСИБИРСК- 2010 Разнообразие форм иммунного ответа предопределяет широкий набор методов их регистрации. Однако каждой форме иммунологического реагирования соответствует только свой, определенный набор методов исследования, что важно знать для правильного подбора методов тестирования иммунного состояния организма. Условно все методы можно разделить на две большие группы: прямые методы выявления патогена, когда лаборатория стремится выделить фрагмент возбудителя (наследственный материал или антигены) или с помощью культурального посева обнаружить патогены на искусственных питательных средах, и непрямые. К прямым методам диагностики следует отнести бактериологический анализ, микроскопию и иммунофлуоресценцию и различные методы ДНК-диагностики (в первую очередь — амплификационные и гибридизационные технологии). К непрямым методам относятся гистология, инструментальный анализ и, конечно, серологический анализ, то есть анализ гуморального ответа организма на присутствие патогена. Оценка гемограммы (относительное и абсолютное количество лимфоцитов, лейкоцитов и эритроцитов). Оценку иммунного статуса следует начать с изучения параметров периферической крови: подсчета общего количества лейкоцитов и эритроцитов в 1 мл крови и подсчета мононуклеарных клеток в мазке. Эти данные позволят оценить относительное (%) и абсолютное количество лимфоцитов в 1 мл крови. Оценка гуморального звена иммунной системы. Исследование гуморального звена иммунной системы (антительный ответ, В-клеточный ответ иммунной системы) включает в себя оценку В-лимфоцитов (общее содержание в крови, анализ антигенных детерминант) и вырабатываемых ими антител (разных классов иммуноглобулинов IgM, IgG, IgA, IgE), а также определение количества антителообразующих клеток (АОК) и циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). При регистрации антителообразования учитывается наличие циркулирующих в крови и лимфе антител, секреторных, или местных, образующихся локально слизистыми покровами, и антител, содержащихся в клетках-продуцентах. Возможно также оценить способность В-клеток синтезировать антитела в культуре in vitro. Определение антител, иммуноглобулинов разных классов. Определение иммуноглобулинов — один из наиболее распространенных методов исследования гуморального иммунитета. Для количественной оценки иммуноглобулинов сыворотки крови чаще всего используют методы: 1) радиальной иммунодиффузии; 2) иммуноэлектрофореза; 3) метод иммунофлуоресценции. Практически все методы исследования гуморального иммунитета основаны на учете строго специфической реакции антиген-антитело, причем при постановке теста один из участников этой реакции известен, а наличие другого предполагается. В результате реакции между антигеном и антителом образуются иммунные комплексы антиген-антитело, которые так или иначе обеспечивают обезвреживание и нейтрализацию чужеродного антигена. Если образовавшиеся молекулярные агрегаты антиген-антитело имеют достаточно большие размеры, они выпадают в осадок — происходит их преципитация. В том случае, когда антиген представлен чужеродной клеткой (эритроцит, бактерия), в результате образования на ее поверхности комплекса антигенантитело изменяются физико-химические свойства клеточной мембраны и, при условии крупных размеров антитела (IgM), происходит «склеивание» (агглютинация) клеток. Если же антитело имеет относительно малые размеры (например IgG), то образовавшийся на поверхности клетки иммунный комплекс не способен вызвать их агглютинацию. В этом случае речь идет о так называемых неполных антителах, которые блокируют чужеродные антигены так, что они не могут взаимодействовать с полными антителами. Агглютинацию таких клеток можно вызвать, добавив к ним так называемые гетерологические антитела, т.е. антитела против иммуноглобулинов человека (например, реакция Кумбса — см. ниже). Для идентификации иммунных комплексов часто используют их свойства образовывать преципитаты (выпадать в осадок) или агглютинировать различные клетки или частицы (например, эритроциты, частицы латекса и т.д.). Наибольшей точностью обладают методы, основанные на обнаружении и клинической оценке меток (маркеров), располагающихся на участвующих в иммунной реакции антителах (радиоактивные вещества, изотопы, ферменты, флюорохром): радиоиммунный, иммуноферментный и метод иммунофлуоресценции. Сывороточные антитела представлены преимущественно IgG и IgM, которые взаимодействуют в основном с растворимыми и корпускулярными антигенами соответственно. Следовательно, антитела, ассоциированные с IgG, можно обнаружить при помощи реакций, основанных па феномене преципитации, а связанные с IgM — при помощи реакций, основанных на феномене агглютинации. Антитела, участвующие в формировании феномена преципитации (преципитины), выявляют в реакциях кольцевой преципитации (пробирочная) и преципитации в гелях (пластинчатая). В обоих вариантах ингредиенты реакции должны быть прозрачными, чтобы визуально зарегистрировать образовавшийся преципитат в виде кольца на границе двух сред при постановке пробирочной РП (реакция преципитации) или в виде линий между лунками с реагентами при постановке реакции диффузионной преципитации (РДП). Антитела, участвующие в формировании феномена агглютинации (агглютинины), выявляют в реакциях агглютинации — пробирочной, пластинчатой, кольцевой в различных вариантах. Агглютинат обычно хорошо виден глазом в форме беловато-сероватых трудно разбиваемых при встряхивании комочков. Для выявления агглютининов в молоке реакцию ставят с подкрашенным антигеном. Для повышения чувствительности серологических (лат. serum — сыворотка) реакций обычно растворимые антигены закрепляют на какойлибо крупной частице, получая искусственный корпускулярный антиген (например, в реакциях латекс-агглютинации или непрямой гемагглютинации), или вводят вторую, индикаторную систему (например, в реакции связывания комплемента). Во всех этих реакциях уровень антител определяют в титрах, принимая за последний наибольшее разведение сыворотки, обеспечивающее положительный результат реакции. Глава 1. Применение серологических реакций для диагностики инфекционных болезней и идентификации микроорганизмов Иммунологические реакции in vitro (в пробирке) используют в лабораторной диагностике инфекционных заболеваний и иммунологических исследованиях. Метод диагностики инфекционных заболеваний, основанный на определении специфических антител в сыворотке крови, называется серологическим. Серологические реакции применяют в двух направлениях: • Выявление с диагностической целью антител в сыворотке крови обследуемого при наличии набора известных антигенов. В качестве антигенов применяют взвеси микроорганизмов, инактивированные химическими или физическими методами, или используют диагностикумы, представляющие фракции микроорганизма. Как правило, результаты серологической диагностики получают при исследовании парных сывороток крови больных, взятых в первые дни болезни и через определенные промежутки времени от начала заболевания. • Определение родовой, видовой и типовой принадлежности микроорганизма или его антигенов с известными иммунными сыворотками. Иммунные сыворотки должны содержать антитела в высоком титре и быть строго специфичными. В лабораторной практике применяют серологические реакции, основанные на прямом взаимодействии антигена с антителом (агглютинация, преципитация) и опосредованные реакции (реакция непрямой гемагглютинации, реакция связывания комплемента), а также реакции с использованием меченых антител или антигенов (иммуноферментный, радиоиммунный анализ, метод флуоресцирующих антител). Процесс взаимодействия антигена с антителом протекает в две фазы. Специфическая фаза — это взаимодействие, при котором происходит комплементарное соединение активных центров антител и антигенов. Процесс длится от нескольких секунд до нескольких минут. Специфической фаза названа потому, что с антигеном, попавшим в организм, может соединиться только подходящее к нему (комплементарное) антитело. Неспецифическая фаза — это проявление внешних признаков образования иммунных комплексов (помутнение, выпадение осадка и так далее). Длится от нескольких минут до нескольких часов. Внешние проявления реакции антитело-антиген зависят от многих факторов: от физико-химических свойств антигена (размеры, физическое состояние), от класса и вида антител, от условий опыта (консистенция среды, концентрация солей, pH, температура). Поливалентность (способность образовывать больше двух связей) антител и антигенов обеспечивает возникновение видимых невооруженным глазом агрегатов. Это можно объяснить тем, что к образовавшемуся комплексу антиген-антитело могут присоединяться другие молекулы антител и антигенов на свободные активные центры. В результате формируются довольно крупные агрегаты, которые могут выпасть в осадок. Еще одной особенностью является то, что наиболее интенсивно реакции антиген-антитело проявляются, если компоненты находятся в эквивалентных соотношениях, то есть лишних антител и антигенов после реагирования не остается. Иммунологические реакции благодаря высокой специфичности и чувствительности применяют для выявления и количественного определения антигенов и антител. Для выявления неизвестного антигена используют диагностические иммунные антисыворотки. Их получают путем многократной иммунизации лабораторных животных известным антигеном. Обнаружение антител проводят с использованием известных антигенов, которые представляют собой взвесь убитых микроорганизмов, инактивированных высокой температурой, химическими веществами, ультразвуком, рентгеновскими лучами или ультрафиолетовым облучением. Реакция агглютинации Реакции агглютинации — это реакции склеивания корпускулярных антигенов (микробы, эритроциты и т.д.) специфическими антителами. Образовавшийся при этом комплекс выпадает в осадок. Эти реакции проводят для определения наличия определенных антигенов или антител. На стекле к капле сыворотки добавляется взвесь бактерий, выделенных из организма или трупа. Если капля мутнеет, значит, агглютинация произошла и в организме присутствует тот антиген, к которому были антитела (известные) в исходной сыворотке. Также эту реакцию проводят в пробирке: в несколько пробирок наливают исследуемую сыворотку крови с неизвестными антителами, потом к этим образцам добавляют известные диагностикумы (убитые бактерии) и наблюдают, в какой пробирке произойдет помутнение или выпадет осадок. Реакция агглютинации — взаимодействие антител с антигенами — является двухфазной: в первой фазе происходит специфическое связывание антигена и антитела, во второй — осаждение образовавшегося агрегата, являющегося гидрофобным, солями. Основываясь на этом представлении, принято разделять агглютинины на полные и неполные. Неполные антитела — агглютинины, которые в среде физиологического раствора NaCl не могут осаждать клетки или частицы, даже если они связываются с ними. Классификация агглютининов, основанная на методах их выявления: • полные агглютинины; • неполные агглютинины: – блокирующие антитела, определяемые в тесте блокирования, – агглютиноиды, определяемые в среде сыворотки, плазмы, альбумина, – неполные антитела, выявляемые с помощью антиглобулиновой реакции — Coombs, – криптагглютиноиды, выявляемые после предварительной обработки эритроцитов ферментами, – агглоиды, обнаруживаемые с помощью коллоидных посредников (поливинилпирролидон, желатина, декстран и др.). Полные и неполные агглютинины находятся в основном в γглобулиновой фракции сыворотки крови. В процессе иммунизации вначале появляются полные антитела, в случае продолжающейся сенсибилизации появляются антитела, способные вызвать агглютинацию лишь при определенных условиях. Полные и неполные антитела имеют отличительные признаки по физико-химическим свойствам и серологической характеристике. Так, неполные антитела более термостабильны по сравнению с полными, в то время полные менее устойчивы и снижают свою активность даже при хранении в замороженном состоянии. Полные антитела имеют большую авидность к соответствующим антигенам, чем неполные антитела. Реакция гемагглютинации (агглютинация эритроцитов) Реакция агглютинации широко используется для обнаружения антиэритроцитарных антител (определение групп крови), а также антигенов в исследуемых образцах эритроцитов или тканей с помощью специфических антисывороток. Агглютинация в солевой среде — наиболее простой метод выявления полных агглютининов, реакцию можно проводить как на планшетах (более быстрый метод), так и в пробирках (для более точного количественного учета антител в сыворотке). Для реакции необходимы исследуемая сыворотка или сыворотка известной специфичности и взвесь эритроцитов, приготовленная из свежевзятой крови, отмытой от примеси плазмы физиологическим раствором NaCl. С этой целью в пробирку с 8–10 мл физиологического раствора NaCl берут несколько капель крови, перемешивают и центрифугируют в течение 5– 7 мин при 3000 об/мин. Затем сливают надосадочную жидкость, к осадку эритроцитов добавляют физиологический раствор до нужного объема, перемешивают путем встряхивания и вновь центрифугируют. После троекратного отмывания из осадка эритроцитов готовят 2–5%-ную взвесь эритроцитов в физиологическом растворе хлористого натрия. Агглютинация в пробирках (планшете для агглютинации). В ряд агглютинационных пробирок (кроме первой) вносят по 0,1 мл (2 капли) физиологического раствора. Затем в первую и вторую пробирки добавляют по 0,1мл (2 капли) сыворотки и, начиная со второй пробирки, переносят после перемешивания пипеткой по 0,1 мл (2 капли) разведенной сыворотки в каждую последующую пробирку, получая, таким образом, ряд разведений сыворотки, кратных 2. Затем в каждую пробирку вносят по 0,05 мл (1 капля) 2% взвеси эритроцитов. В качестве контроля берут нормальную сыворотку и физиологический раствор с используемой взвесью эритроцитов. После встряхивания пробирки помещают в термостат при температуре 37 °C на 30 мин – 1 час или выдерживают при комнатной температуре (18 °C) либо при температуре 4 °C (в зависимости от задач исследователя). После инкубации проводится оценка реакции без предварительного центрифугирования по форме осадка или после центрифугирования (при 1500 об/мин в течение одной минуты) по характеру сгустка. Для более точного учета реакции используют агглютиноскоп или просматривают под малым увеличением микроскопа или лупой. Оценка интенсивности агглютинации проводится по следующей схеме. Резко выраженная агглютинация (++++). При встряхивании комочек эритроцитов не разбивается, жидкость совершенно прозрачна. Под микроскопом все поле зрения занято одним агглютинатом. Умеренная агглютинация (++). Осадок при встряхивании разбивается на несколько отдельных комочков, небольшая часть эритроцитов находится в свободном состоянии и хорошо выявляется под микроскопом. Слабая агглютинация (+). Агглютинаты мелкие, большая часть эритроцитов взвешена в жидкости. Под микроскопом на фоне отдельных эритроцитов видны небольшие агглютинаты. Отрицательная реакция (–). Гомогенная мутная взвесь эритроцитов в жидкости, под микроскопом склеенные эритроциты не выявляются. Наибольшее разведение сыворотки, при котором еще обнаруживается агглютинация эритроцитов, принимается за титр агглютининов. Реакция агглютинации при бактериальных инфекциях Реакция агглютинации в инфекционной иммунологии широко применяется для диагностики различных инфекционных заболеваний, для идентификации микроорганизмов, выделенных от больных и бактерионосителей. Реакция агглютинации применяется для решения вопросов диагностики в двух аспектах: 1) диагностика заболевания путем обнаружения в крови больного антител к соответствующему виду микроба; 2) идентификация микроба, выделенного из организма больного или из внешней среды с помощью известной агглютинирующей сыворотки. Для постановки реакции агглютинации необходимы три основных компонента: сыворотка, антиген (диагностикум) и физиологический раствор натрия хлорида. В качестве антигена чаще всего применяют готовые диагностикумы, которые представляют собой микробов, убитых тем или иным способом, в виде взвеси определенной концентрации или в высушенном состоянии. Антигеном может также служить взвесь, приготовленная из любой лабораторной культуры микробов, при условии сохранения ими типичных свойств и отсутствия спонтанной агглютинации в физиологическом растворе. Достоверными можно считать результаты реакции только при хороших четких контролях. За титр антител принимают последнее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация не менее чем на ++. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) РНГА применяют в двух вариантах: с известными антигеном для обнаружения антител или с известными антителами для выявления антигена. Эта реакция специфична, и применяют ее для диагностики заболеваний, вызванных бактериями и риккетсиями. Для постановки РНГА используют эритроцитарные диагностикумы, приготовленные путем адсорбции на эритроцитах антигенов или антител в зависимости от цели исследования (рис. 7). Рис. 7. Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации: 1 — эритроциты; 2 —антиген эритроцита; 3 — конъюгированный антиген; 4 — антитело В положительных случаях степень агглютинации эритроцитов отмечают плюсами. Четырьмя плюсами оценивают реакцию, имеющую вид тонкой пленки из склеивающихся эритроцитов (зонтик), покрывающей дно пробирки; наличие пленки с фестончатыми кружевными краями обозначают двумя плюсами. За титр принимают предельное разведение исследуемого материала, вызывавшее агглютинацию эритроцитов на два полюса. Реакция гемагглютинации и реакция торможения гемагглютинации В основе реакции гемагглютинации (РГА) лежит способность эритроцитов склеиваться при адсорбции на них определенных антигенов. В качестве исследуемого материала при гемагглютинации используют аллантоисную, амниотическую жидкость, суспензию хорионаллантоисных оболочек куриных эмбрионов, взвеси и экстракты из культур или органов животных, зараженных вирусами, нативный инфекционный материал. РГА не является серологической, поскольку происходит без участия иммунной сыворотки, и используется для выбора рабочего разведения антигена для постановки РТГА или наличия антигена (вируса) в исследуемом материале (например, при гриппе). В реакции используются эритроциты животных, птиц, человека I (0) группы крови. Для постановки ориентировочной РГА на предметное стекло наносят каплю 5%-ной взвеси эритроцитов и каплю испытуемого материала, тщательно смешивают. При положительном результате через 1–2 минуты макроскопически наблюдают появление хлопьевидной агглютинации эритроцитов. Для постановки РГА в развернутом ряду в лунках полистероловых планшетов готовят двукратно возрастающие разведения исследуемого материала на физиологическом растворе в объеме 0,5 мл. Во все пробирки вносят по 0,5 мл 0,25–1%-ной взвеси эритроцитов. Результаты учитывают после полного оседания эритроцитов в контроле (эритроциты + физиологический раствор). Реакцию учитывают по характеру осадка эритроцитов. В положительных случаях степень агглютинации отмечают плюсами. Четырьмя плюсами оценивают реакцию, имеющую вид тонкой пленки из склеившихся эритроцитов, покрывающей дно пробирки (зонтик), реакцию с просветами в пленке отмечают тремя плюсами, наличие пленки с фестончатыми кружевными краями из склеившихся эритроцитов обозначают двумя плюсами, хлопьевидный осадок эритроцитов, окруженный зоной комочков агглютинированных эритроцитов соответствует одному плюсу. Резко очерченный осадок эритроцитов, неотличимый от контроля, показывает отсутствие агглютинации. За титр принимают предельное разведение исследуемого материала, вызвавшее агглютинацию эритроцитов на два плюса. При положительном результате РГА исследование продолжают, определяя тип выделенного вируса с помощью реакции торможения гемагглютинации типоспецифическими сыворотками. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на свойстве антисыворотки подавлять вирусную гемагглютинацию, так как нейтрализованный специфичными антителами вирус утрачивает способность агглютинировать эритроциты. При ориентировочном типировании вирусов используют капельный метод на стекле. Для окончательного установления типовой принадлежности выделенного вируса и титрования антител в сыворотках ставят развернутую РТГА в пробирках или в лунках. С этой целью готовят двукратные разведения сывороток на физиологическом растворе и разливают по 0,25 мл. К разведениям сыворотки прибавляют по одной капле материала, содержащего вирус и по одной капле 1%-ной взвеси эритроцитов. При использовании РТГА для определения типа вируса используют типоспецифические сыворотки, которые добавляют к равному объему рабочего разведения антигена. Типовую принадлежность выделенного вируса устанавливают по специфической иммунной сыворотке, показавшей наивысший титр антител к этому вирусу. РГА и РТГА широко применяются для диагностики вирусных инфекций (клещевой энцефалит, грипп и др.) с целью обнаружения специфических антител и для идентификации многих вирусов по их антигенам. Реакция пассивной гемагглютинации Для определения антител к ДНК чаще используют реакцию пассивной гемагглютинации. С этой целью антиген (ДНК) вначале осаждают на эритроцитах барана, а затем добавляют к ним исследуемую сыворотку. Если в сыворотке содержатся антитела к ДНК, происходит агглютинация эритроцитов и их гемолиз. В зависимости от типа используемого антигена удается выделить несколько типов антител к ДНК: I тип — антитела к односпиральной ДНК, II тип — к термоденатурированной ДНК, III тип — к нативной двуспиральной ДНК. Определение типа антител позволяет проводить дифференциальную диагностику различных заболеваний (см. ниже). Неполные антитела к эритроцитам обнаруживаются при помощи прямого и непрямого тестов Кумбса. Непрямая проба Кумбса основана на выявлении агглютинации эритроцитов, нагруженных неполными антителами, которая появляется при добавлении антиглобулиновой сыворотки. Проба осуществляется в два этапа. Вначале проводится сенсибилизация стандартных резус-положительных эритроцитов донора 0 (I) группы. Каплю взвеси эритроцитов вносят в пробирку, наслаивают на них несколько капель исследуемой сыворотки, в которой предполагают наличие антител к эритроцитам, и инкубируют 40 мин при 37 °C. Эритроциты осторожно отмывают от сыворотки физиологическим раствором. Неполные антитела, если они присутствуют в исследуемой сыворотке, фиксируются на эритроцитах, но не могут вызвать их агглютинацию (рис. 8). Рис. 8. Схема проведения непрямой пробы Кумбса: а, б — соответственно первый и второй этапы исследования На втором этапе пробы на сухую тарелку наносят каплю стандартной антиглобулиновой сыворотки, содержащей антитела к человеческим иммуноглобулинам, и добавляют туда эритроциты, на которых предположительно фиксированы неполные антитела исследуемой сыворотки. Если на предыдущем этапе исследования на поверхности эритроцитов действительно фиксировались противоэритроцитарные антитела, последние взаимодействуют с антителами к иммуноглобулину стандартной антисыворотки (см. рис. 8). В результате происходит агглютинация (склеивание) эритроцитов. При прямой реакции Кумбса используют собственные эритроциты пациента, которые предположительно уже были сенсибилизированы аутоантителами. Эритроциты добавляют в антиглобулиновую сыворотку: при наличии на их поверхности фиксированных иммуноглобулинов (антител к эритроцитам) возникает агглютинация эритроцитов. Аутоантитела к эритроцитам обнаруживают при аутоиммунных гемолитических анемиях, гемолитической болезни новорожденных, системных заболеваниях соединительной ткани, хроническом активном гепатите и других заболеваниях. Реакция преципитации В основе механизма этой реакции лежит выпадение из раствора нерастворимого комплекса антиген-антитело. Реакция преципитации позволяет обнаруживать ничтожные количества белкового антигена (до разведения 1:1 000 000). Она в этом отношении чувствительнее многих химических реакций, хотя в свою очередь уступает по чувствительности реакции связывания комплемента и анафилаксии. Реакция преципитации нашла широкое применение для определения степени родства видов животных и растений. Реакция преципитации основана на взаимодействии антигенов и антител в эквивалентных количествах. Кольцепреципитация — появление непрозрачного кольца преципитата при постепенном наслаивании растворимого антигена на иммунную сыворотку. Например, для определения антигенов сибирской язвы используют сыворотку крови иммунизированных лошадей, при этом кольцо преципитата появляется в течение 2 мин. Также эту реакцию можно проводить на твердых средах (агаре). При этом в два углубления среды помещаются сыворотка и взвесь бактерий, зона преципитации образуется между ними. Эти реакции используются для определения антигенов бактерий, тканей человека и животных, диагностики некоторых инфекционных заболеваний, определения видовой принадлежности белка в судебной медицине. Феномен преципитации заключается во взаимодействии мелкодисперсных антигенов (преципитиногенов) с соответствующими антителами (преципитинами) и образованием преципитата (рис. 9). Постановку РП осуществляют двумя методами: в жидкой среде — по типу реакции флокуляции, кольцепреципитации или в плотной среде в агаре (геле). РП применяют в двух целях: выявление антигенов по известной иммунной преципитирующей сыворотке или антител с использованием известных антигенов. Существует много вариантов постановок реакции, но чаще всего используют следующие методики: реакция преципитации в геле по Оухтерлони, радиальная иммунодиффузия по Манчини, реакция иммуноэлектрофореза, реакция флокуляции, кольцепреципитации. Рис. 9. Реакция преципитации: 1 — антиген; 2 — антитело Реакция преципитации в геле по Оухтерлони Для постановки реакции используют 1%-ный агар Дифко, который разливают расплавленным на предметные стекла или чашки Петри слоем толщиной 0,5 см. В застывшем агаре вырезают лунки диаметром 5 мм специальным приспособлением. В одну лунку помещают взвесь, содержащую исследуемый антиген, в другую — иммунную сыворотку. Антиген и антитела диффундируют в питательную среду, вступают в иммунную реакцию и образуют полосы преципитации. Учет реакции проводят предварительно через 4 часа, окончательно — через 24–48 часов. Реакцию Оухтерлони можно использовать для определения токсичности бактерий, титра антител, активности стандартных диагностикумов или иммунных специфических сывороток (рис. 10, б). Рис. 10. Реакция преципитации: а — реакция кольцепреципитации; б — реакция преципитации по Оухтерлони Реакция кольцепреципитации Данную реакцию применяют для выявления антигенов с помощью иммунной преципитирующей сыворотки, содержащей специфические антитела. Это качественный метод исследования. Реакцию проводят путем наслаивания на иммунную сыворотку среды, содержащей определенный антиген. Реакцию ставят в узких пробирках объемом 0,1–0,5 мл. В случае соответствия антигена и антитела на границе между ними через 3–5 мин образуется кольцо преципитации (рис. 10, а). Необходимым условием образования нерастворимого иммунного комплекса является эквивалентное соотношение антигенов и антител. Метод радиальной иммунодиффузии Принцип наиболее простого и распространенного метода радиальной иммунодиффузии заключается в оценке диаметра колец преципитации, возникающих при взаимодействии в геле антигена (в данном случае иммуноглобулина исследуемой сыворотки) и антитела (антител к иммуноглобулинам человека, содержащимся в стандартных антисыворотках). Стандартные антисыворотки с антителами к IgG, IgM, IgA смешивают с расплавленным агаром. Эту смесь заливают на специальные пластины. После ее застывания на каждой пластине специальным пробойником делают 35 лунок диаметром 2 мм (рис. 11, а). В лунки микропипеткой вносят по 2 мкл последовательных разведений (1:1, 1:2, ... 1:8) стандартной сыворотки с известной концентрацией иммуноглобулинов, а также такое же количество разведений исследуемой сыворотки (с неизвестным содержанием иммуноглобулинов). Рис. 11. Схема определения концентрации иммуноглобулинов методом радиальной иммунодиффузии: а — внесение стандартной и исследуемой сыворотки в лунки пластины с залитым агаром, содержащим антитела к иммуноглобулинам; б — фрагмент пластины после инкубации (видны кольца преципитации, диаметр которых зависит от концентрации иммуноглобулинов); в — калибровочная кривая зависимости диаметра колец преципитации от концентрации иммуноглобулинов стандартной сыворотки Пластины инкубируют при 4 °C в течение 24 ч и затем оценивают результаты. Антиген (иммуноглобулин стандартной или исследуемой сыворотки) диффундирует в слое агара, содержащего антитела к человеческим иммуноглобулинам, в результате чего вокруг лунок образуются кольца преципитации (рис. 11, б). Чем выше концентрация иммуноглобулинов, тем больше диаметр кольца. Вначале оценивают размеры колец преципитации вокруг лунок, в которые были внесены стандартные сыворотки различного разведения с известной концентрацией иммуноглобулинов. По этим результатам строят кривую, отражающую зависимость между диаметром (площадью) кольца преципитации и концентрацией иммуноглобулина (рис. 11, в). Такую кривую строят для каждой пластины. Затем измеряют диаметр колец преципитации в испытуемом препарате и по стандартной калибровочной кривой определяют искомую концентрацию иммуноглобулинов. Для количественного определения IgE, присутствующего в сыворотке крови в низких концентрациях, применяют более точные методы радиоиммунного или иммуноферментного анализа. Реакция иммуноэлектрофореза Используется в основном для определения моноклональных иммуноглобулинов, например парапротеинов при миеломной болезни или макроглобулинемии Вальденстрема. Метод представляет собой сочетание электрофоретического разделения белков сыворотки крови (или других биологических сред) и последующей радиальной иммунодиффузии с образованием преципитатов. Для проведения реакции расплавленный агар наносят на предметное стекло и делают в нем лунку (рис. 12, a). В лунку вносят исследуемую сыворотку и пластину помещают в электрическое поле, под действием которого происходит разделение различных белков сыворотки крови (рис. 12, б). По окончании электрофореза в агаровой пластине вырезают траншею, в которую вносят стандартную антисыворотку, содержащую антитела к определенным антигенам, например парапротеину (рис. 12, в). Если в исследуемой сыворотке имеются искомые антигены (парапротеин), уже через несколько суток в агаровом слое образуются полосы преципитации (рис. 12, г). Рис. 12. Схема метода иммуноэлектрофореза: а — внесение в лунку исследуемой сыворотки с искомым антигеном; б — электрофоретическое разделение белков исследуемой сыворотки; в — внесение в траншею стандартной антисыворотки с антителами к искомому антигену; г — появление дуг преципитации при наличии в исследуемой сыворотке искомого антигена Метод иммуноэлектрофореза чаще используется для идентификации низких концентраций парапротеина при миеломной болезни, макроглобулинемии Вальденстрема и т.д. Метод радиальной иммунодиффузии (по Манчини) Количество и соотношение иммуноглобулинов отдельных классов в биологических жидкостях отражают состояние В-системы. Иммунную сыворотку против антител определенного класса (IgG, IgM, IgA) вносят в расплавленный агаровый гель. После застывания агара антитела в нем равномерно распределены. Внесенный в лунку исследуемый материал (антиген) радиально диффундирует в толщу геля. Поскольку концентрация антител везде одинакова, то в результате реакции антиген-антитело в зоне эквивалентности образуются не полосы преципитации, а кольцо преципитации вокруг лунки с антигеном. Диаметр кольца преципитации прямо пропорционален концентрации антигена в исследуемой жидкости. В предварительных опытах определяют оптимальное (рабочее разведение антисывороток к иммуноглобулинам каждого класса. В каждом опыте устанавливают количество иммуноглобулинов стандартной сыворотке и по отношению к ней определяют количество иммуноглобулинов в исследуемом материале. Используют 3%-ный агар Дифко на веронал-мединаловом буфере pH 7,3–7,4 (мединал — 35,4 г, веронал — 5,25 г, дистиллированная вода — до 1000 мл). В бактериологической пробирке смешивают по 5 мл расплавленного агара и антисыворотки. Берут два стекла размером 9×12 см, на одно из них помещаю П-образную рамку, сверху кладут второе стекло. Толщина рамки составляет 1 мм. В щель между стеклами заливают смесь агара и антисыворотки и оставляют в вертикальном положении для застывания агара на 15–20 мин. Затем удаляют одно из стекол и рамку. В агаре пробойником вырезают лунки диаметром 2 мм (5 рядов по 7 лунок в каждом). В лунки первого ряда вносят разведения стандартной сыворотки, в остальные — исследуемые пробы по 1 мкл. Пластинку выдерживают во влажной камере 24 ч (IgG, IgA) или 48 ч (IgM). Строят калибровочную кривую. На оси абсцисс откладывают значения диаметров колец преципитации разведенной стандартной сыворотки, на оси ординат — значения концентраций иммуноглобулинов (% или мг/мл). Измеряют диаметр колец преципитации в пробах и по калибровочной кривой устанавливают концентрацию соответствующего иммуноглобулина. Реакция связывания комплемента Реакция связывания комплемента (РСК) проводится с участием не только антигена и антитела, но и комплемента. Так как она не сопровождается видимыми изменениями, для обнаружения связывания комплемента используют индикаторную гемолитическую систему. Эта система состоит из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки кролика. В присутствии комплемента в гемолитической сыворотке происходит хорошо наблюдаемый лизис эритроцитов. Принцип метода состоит в том, что если в опыте образовался комплекс антиген-антитело и с ним связался комплемент (т.е. в растворе свободного комплемента не останется), то лизиса эритроцитов не произойдет и они осядут на дно пробирки. Если комплекс не формируется, то комплемент остается свободным и реагирует с гемолитической системой, вызывая лизис эритроцитов. Этот механизм лежит в основе реакции Вассермана (диагностика сифилиса). Общую активность системы комплемента определяют в так называемой гемолитической системе по реакции связывания комплемента. Гемолитическая система представляет собой смесь эритроцитов барана и стандартной специфической антисыворотки, содержащей антитела к этим эритроцитам, но искусственно лишенной собственного комплемента. В такой системе гемолиза эритроцитов не происходит в связи с отсутствием важного звена процесса связывания антител с антигеном — комплемента, разрушенного предварительным нагреванием. Если в такую систему добавить исследуемую сыворотку больного, содержащую комплемент, образуется иммунный комплекс, и происходит связывание и гемолиз эритроцитов. Чем больше концентрация комплемента в исследуемой сыворотке, тем более выражен гемолиз эритроцитов. В норме уровень комплемента сыворотки крови составляет 20–40 гемолитических единиц. При острых инфекционных и воспалительных заболеваниях наблюдается, как правило, увеличение активности комплемента, при хронических — ее снижение. Низкие значения гемолитической активности могут отражать врожденную или приобретенную недостаточность отдельных компонентов системы комплемента. Следует отметить, что дефекты данной системы рассматриваются как самые частые наследственные аномалии белков человека. Они могут играть патогенетическую роль при следующих заболеваниях и синдромах: 1. Рецидивирующие бактериальные пиогенные инфекции органов дыхания, кожи и других органов: пневмонии, бронхоэктазы, рецидивирующий синусит, пиодермия, генерализованные бактериальные инфекции, септицемия. 2. Рецидивирующие менингококковые и гонококковые инфекции (менингококковый менингит, диссеминированные гонококковые инфекции, гонококковые артриты и др.). 3. Аутоимунные, аллергические заболевания и болезни иммунных комплексов: системная красная волчанка, дерматомиозит, мембранопролиферативный гломерулонефрит, болезнь Шенлейн-Геноха, синдром Шегрена, тромбоцитопеническая пурпура, склеродермия, ювенильный ревматоидный артрит, рецидивирующий ангионевротический отек (особенно часто — ларингоспазм), дерматозы, фоточувствительность и др. Реакция связывания комплемента используется для лабораторной диагностики риккетсиозов, вирусных инфекций (грипп, корь, клещевой энцефалит и др.) и основывается на способности комплемента связываться с комплексом АГ + АТ. Комплемент адсорбируется на Fc-фрагменте иммуноглобулинов G и М. Реакция протекает в две фазы (рис. 13). Рис. 13. Реакция связывания комплемента: а — лизис сенсибилизированных эритроцитов в присутствии комплемента; б — отсутствие гемолиза вследствие фиксации комплемента комплексом АГ+АТ; в — лизис эритроцитов в результате отсутствия комплекса А Первая фаза — взаимодействие антигена и антитела. В качестве материала, содержащего антитела, используется исследуемая сыворотка, к которой добавляется известный антиген. К этой системе добавляют стандартный комплемент и инкубируют при 37 °C в течение 1 ч. Вторая фаза — выявление результатов реакции при помощи индикаторной гемолитической системы (эритроциты барана и гемолитическая сыворотка кролика, содержащая гемолизины к эритроцитам барана). К смеси антиген + антитело + комплемент (1-я фаза) добавляют индикаторную систему и вновь инкубируют при 37 °C в течение 30–60 мин, после чего оценивают результаты реакции. Разрушение эритроцитов происходит в случае присоединения к гемолитической системе комплемента. Если комплемент адсорбировался ранее на комплексе АГ + АТ, то гемолиз эритроцитов не наступает. Гемолиз происходит в том случае, когда в исследуемой сыворотке содержатся специфические антитела к диагностическому антигену. При отсутствии в исследуемой сыворотке специфических антител комплекс АГ + АТ не образуется и комплемент остается несвязанным. При добавлении гемолитической системы комплемент присоединяется к ней и происходит гемолиз эритроцитов. Интенсивность РСК оценивают по четырехкрестной системе в зависимости от степени задержки гемолиза и наличия осадка эритроцитов. Все компоненты РСК, за исключением исследуемой сыворотки, должны быть оттитрованы. Тесты с ингибированием гемагглютинации эритроцитов Данные методы не отличаются особой чувствительностью определений, но зато относительно просты в исполнении и нетрудозатратны. Для проведения такого исследования смешивают анализируемый объект с раствором антигена (подозреваемой патологии). Если в испытуемом образце имеются антитела к антигену возбудителя, происходит их комплексообразование, которое в дальнейшем предотвращает агглютинацию эритроцитов под влиянием молекул антигена. Реакция выполняется на планшетах с лунками с коническим дном, результат (наличие-отсутствие агглютинации) наблюдают непосредственно, т.е. невооруженным глазом. Натренированный человек способен различать даже степени протекания агглютинации. К сожалению, многие гликопротеины, являющиеся антигенами вообще, способны давать реакцию агглютинации эритроцитов, поэтому метод не отличается особой специфичностью. Метод флуоресцирующих антител для выявления патогенных бактерий и определения антител к ним. Реакция иммунофлуоресценции Реакция иммунофлуоресценции (РИФ) основана на соединении антигенов бактерий, риккетсий и вирусов со специфическими антителами, меченными флуоресцирующими красителями (флуоресцеинизотиоцианат, родамин, В-изотицианит, лиссатинродамин В-200, сульфохлорид и др.), имеющими реакционноспособные группы (сульфохлорид, изотиоцианит и др.). Эти группы соединяются со свободными аминогруппами молекул антител, которые не теряют при обработке флуорохромом специфического сродства к соответствующему антигену. Образовавшиеся комплексы антиген - антитело становятся хорошо видимыми, ярко светящимися структурами под люминесцентным микроскопом. С помощью РИФ можно обнаруживать небольшие количества бактериальных и вирусных антигенов. При некоторых заболеваниях внутренних органов, в развитии которых имеет значение процесс иммунного воспаления или иммунной агрессии, в сыворотке крови можно обнаружить аутоантитела к гладкой мускулатуре, эритроцитам, иммуноглобулинам, митохондриям, антиядерные (антинуклеарные) антитела, антитела к ДНК, противоопухолевые антитела и др. Самым распространенным тестом обнаружения аутоантител в исследуемой сыворотке является метод иммунофлуоресценции, имеющий несколько модификаций и протекающий в два этапа. Первый этап заключается в образовании иммунных комплексов определенного антигена со специфическими антителами. Второй этап — в выявлении этого комплекса путем обработки его меченым антигаммаглобулином. Преимущество РИФ — простота, высокая чувствительность, скорость получения результата. РИФ применяется как метод ранней экспрессдиагностики гриппа, дизентерии, малярии, чумы, туляремии, сифилиса и др. Для проведения такого исследования используется люминесцентный микроскоп. При прямой иммунофлуоресценции к исследуемому препарату (например срезам тканей), содержащему искомый антиген, добавляют антисыворотку с антителами к этому антигену. Предварительно антитела метят флуорохромом. В результате взаимодействия антигена и антитела образуется иммунный комплекс, который фиксируется только в тех участках ткани, где имеется данный антиген. Эти участки легко обнаруживаются при микроскопии в ультрафиолетовом свете по характерному свечению (флуоресценции). В клинической практике по понятным причинам чаще используют метод непрямой иммунофлуоресценции. На срезы тканей различных органов животных, содержащих известные антигены, наносится исследуемая сыворотка (рис. 18, а). Если в ней содержатся антитела (иммуноглобулины) к данному тканевому антигену, происходит реакция связывания этих антител антигеном (рис. 18, б). Не связавшиеся белки тщательно отмывают и на срезы тканей наносят противочеловеческую IgG-антисыворотку, меченную флуорохромом (рис. 18, в). В результате антитела с флуорохромной меткой против иммуноглобулинов (например, против IgG), содержащиеся в антисыворотке (антитела к антителам-иммуноглобулинам класса G), связываются только с иммуноглобулинами (антителами), которые присутствовали в исследуемой сыворотке больного и остались фиксированными на соответствующих (известных) антигенах ткани (рис. 18, г). Люминесценция этих фиксированных антител хорошо выявляется при микроскопии ткани в ультрафиолетовом свете. Таким образом, на первом этапе непрямой иммунофлуоресценции происходит как бы «закрепление» антител больного в тех местах ткани, где локализованы соответствующие антигены (см. рис. 18, а, б), а на втором этапе — их обнаружение с помощью антител сыворотки к этим иммуноглобулинам, меченных флуорохромом (см. рис. 18, в, г). Рис. 18. Схема метода непрямой иммунофлуоресценции: а — нанесение исследуемой сыворотки на срезы тканей с известным антигеном; б — реакция связывания антител антигеном; в — внесение стандартной антисыворотки, содержащей антитела к иммуноглобулинам человека, меченные флуорохромом; г — фиксация этих антител на антителах к искомому антигену Метод иммунофлуоресценции используется для выявления аутоантител к гладкой мускулатуре, митохондриям, антиядерных, антинуклеарных и других антител. Для их обнаружения в сыворотке крови больного обычно используют срезы желудка и почки крыс. Иммунофлуоресцентное исследование — одна из наиболее простых процедур клинической диагностики (рис. 19). На пленку наносят исследуемый объект (сыворотка крови и т.п.). Образец может содержать, а может и не содержать антигены возбудителя подозреваемой патологии. Для проверки на ту же пленку наносят раствор антител к искомому антигену, конъюгированных (т.е. связанных ковалентно) с молекулами флуоресцирующего соединения, которое в данном случае выступает в роли маркера, удобного для обнаружения. Пленка выдерживается в растворе антител некоторое время, достаточное для связывания антител с антигенами (если таковые имелись в исследуемом образце), после чего избыток несвязавшихся антител смывается буфером, а пленку рассматривают под флуоресцентным микроскопом. Если в образце присутствовал антиген патологии, с его молекулами будут прочно связаны молекулы меченных флуоресцеином антител и под микроскопом можно наблюдать зеленое окрашивание. Метод прямой иммунофлуоресценции (ПИФ) представляет собой прямое выявление как корпускулярных, так и растворимых антигенов при люминесцентной микроскопии. Метод является скрининговым и основными показаниями к его применению являются острая, хроническая формы заболевания, необходимость установления этиологии инфекционного процесса. Его чувствительность и специфичность при использовании моноклональных антител могут составлять 60 % и 80 % соответственно. Методика требует ее исполнения опытным лабораторным работником, высококвалифицированная экспертная оценка методом ПИФ редко бывает доступной, в частности, оценка эффективности лечения. ПИФ недостаточно чувствительна для определения малых количеств элементарных телец — возможны ложноотрицательные результаты. Рис. 19. Иммунофлуоресцентное исследование Диагностическое значение результатов, полученных методом прямой иммунофлуоресценции (ПИФ). Известно, что при использовании метода ПИФ относительно часто получают также ложноположительные результаты, поэтому его предлагается использовать только как ориентировочный (скрининговый) метод выявления патогена. Получение ложноположительных результатов может быть обусловлено, прежде всего, низким качеством диагностических наборов и субъективным характером трактовки получаемых данных. Несмотря на появившееся скептическое отношение к использованию метода иммунофлуоресценции, он остается весьма распространенным. Иммуноферментный анализ Иммуноферментный анализ (ИФА, англ. — enzyme-linked immunoSorbent assay, ELISA) — лабораторный иммунологический метод качественного определения и количественного измерения антигенов. Иммуноферментный метод также основан на учете реакции антигенантитело, причем в качестве метки, позволяющей обнаружить иммунный комплекс, используют ферменты, например пероксидазу. В основе метода иммуноферментного анализа (ИФА) лежит принцип взаимодействия иммуносорбента — антигена возбудителя инфекции — с выявляемыми антителами и в соединении этого комплекса антиген-антитело с иммуноглобулинами, содержащим ферментную метку. Иммуноглобулины, применяемые в таких тест-системах, так называемый конъюгат, может быть получен на основе антивидовых антител (например кроличьи антитела против иммуноглобулинов человека) или на основе антител, направленных против человеческих иммуноглобулинов определенного класса (M, G, А). В зависимости от того, какие антитела использованы, тест-система будет выявлять в исследуемом образце или специфические антитела независимо от их класса, или антитела лишь определенного класса (например, только иммуноглобулин G или только иммуноглобулин M). Существует несколько методов постановки реакции, однако в настоящее время используются в основном следующая схема (рис. 20). Рис. 20. Схема проведения иммуноферментного анализа: а — антитела против антигена сорбированы на стенках пробирки; б — добавление исследуемой сыворотки к искомым антигенам, которые взаимодействуют с антителами и фиксируются на стенках пробирки; в — введение антител к данному антигену, меченных ферментом (пероксидазой), которые также фиксируются на стенках пробирки; г — добавление перекиси водорода и хромогена, который под действием кислорода, выделяющегося при разложении Н2О2 пероксидазой, изменяет свой цвет на желтый Вначале на стенках полистироловых пробирок сорбируют антитела против определенного антигена. В эту же пробирку вносят исследуемую сыворотку (или другой биологический субстрат). Если там содержатся искомые антигены, они взаимодействуют с антителами и вместе с ними фиксируются на стенках пробирки. После этого в пробирку вводят антитела к данному антигену, меченные ферментом, которые также присоединяются к образовавшемуся иммунному комплексу и остаются на стенках пробирки. Для обнаружения и количественной оценки этих комплексов в пробирку добавляют перекись водорода (Н2О2) и хромогены. Фиксированный к стенке пробирки фермент (пероксидаза) разлагает Н2О2 с выделением кислорода. Последний окисляет хромоген, который приобретает желтый цвет. Интенсивность окрашивания и, соответственно, количество искомого антигена оценивают спектрофотометрически или визуально. Наиболее распространен твердофазный ИФА, при котором один из компонентов иммунной реакции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе (рис. 21). В качестве твердого носителя используются микропанели из полистирола. При определении антител в лунки с сорбированным антигеном последовательно добавляют сыворотку крови больных, антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом и смесь растворов субстрата для фермента и хромогена. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют не связавшиеся реагенты путем тщательного промывания. При положительном результате изменяется цвет раствора хромогена. Твердофазный носитель можно сенсибилизировать не только антигеном, но и антителом. Тогда в лунки с сорбированными антителами вносят искомый антиген, добавляют иммунную сыворотку против антигена, меченную ферментом, а за тем — смесь растворов субстрата для фермента и хромогена. ИФА применяют для диагностики заболеваний, вызванных вирусными и бактериальными возбудителями. Рис. 21. Иммуноферментный анализ, выявление антигена прямым и непрямым методами твердофазного ИФА По такому принципу построена основная масса тест-систем для иммуноферментной диагностики различных инфекций: ВИЧ-инфекция, вирусные гепатиты, цитомегаловирусная, герпесная, токсоплазменная и другие инфекции. Однако следует отметить, что иммуноферментный анализ может давать и ложные результаты. Ложноположительные могут возникнуть за счет ревматоидного фактора, представляющего собой иммуноглобулин M против собственных иммуноглобулинов G человека; за счет антител, образующихся при различных системных заболеваниях, нарушениях обмена или приеме лекарственных препаратов; у новорожденных ложноположительные реакции могут возникать за счет образования в организме ребенка M-антител к иммуноглобулину G матери. Ложноотрицательные результаты реакции обусловлены конкуренцией между иммуноглобулинами М и G, а также техническими ошибками при постановке реакции. В зависимости от того, какие антигены используются, все иммуноферментные тест-системы для выявления антител подразделяются на: • лизатные — в которых используется нативный антиген (лизированный или обработанный ультразвуком возбудитель инфекции, полученный в культуре); • рекомбинантные — в которых используются полученные генноинженерным способом белки-аналоги определенных белковых антигенов возбудителя; • пептидные — использующие химически синтезированные фрагменты белков. Общее направление развития ИФА-диагностикумов — это направление от лизатных тест-систем, которые принято называть тест-системами первого поколения, к рекомбинантным и пептидным. Технология получения рекомбинантных белков позволяет получить в достаточно чистом виде аналог любого отдельного антигена. Для создания высококачественной рекомбинантной тест-системы необходимо из всего антигенного многообразия возбудителя выбрать антигены, которые были бы высокоиммуногенными (т.е. в организме инфицированного человека должны вырабатываться антитела к этим антигенам в достаточно большом количестве) и высокоспецифичными (т.е. характерными лишь для данного возбудителя и не дающими перекрестных реакций с антителами другой природы). Кроме того, большое значение имеет качество очистки рекомбинантных белков. В идеальном случае возможно получение рекомбинантной тестсистемы практически со 100%-ной специфичностью при высокой чувствительности. На практике этого не всегда удается достичь, однако специфичность лучших рекомбинантных тест-систем приближается к 100 %. Таким образом, за счет несомненных преимуществ иммуноферментного анализа: удобства в работе, быстроты, объективности за счет автоматизации учета результатов, возможности исследования иммуноглобулинов различных классов (что важно для ранней диагностики заболеваний и их прогноза) — в настоящее время этот метод является одним из основных в лабораторной диагностике. Методика. Используются специальные 96-луночные (8 рядов по 12 лунок) планшеты из полистирола, с круглыми плоскодонными лунками вместимостью около 300 мкл. Перед анализом планшету сенсибилизируют, нанося раствор антигена. Обычно это не целая структура возбудителя, а часть (наиболее характерная) белков его оболочки. Очень часто антигены для ИФА получают генноинженерными технологиями, выращивая на трансгенных E. сoli. Растворимые антигены закрепляются на поверхности планшеты рядом специфических взаимодействий непосредственно из раствора. Для снижения помех участки незанятой антигеном поверхности «укрывают» нанесением раствора бычьего сывороточного альбумина. Несвязанный материал удаляют и планшету сушат. Сенсибилизированные планшеты можно хранить при – 18 °C не более 2 недель. При выполнении анализа лунки заполняют исследуемым материалом (сыворотка крови), нанося его в разные лунки с дробным разбавлением (1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 и т.д.), после чего выдерживают около 30 мин для связывания. Если в образцах имеются антитела, комплементарные нанесенному антигену, они образуют с ним прочные комплексы. Содержимое из лунок удаляют трехкратной промывкой буфером и несвязавшийся материал удаляется при промывке. Далее лунки заполняются раствором конъюгата, представляющего собой связанные глутаровым альдегидом молекулы белка-фермента (чаще всего — пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза) и молекулы антител против антител к возбудителю, полученные из сыворотки кролика (или другого организма) при введении в его кровь антител человека к искомому возбудителю. Дают время на прохождение реакции комплементарного связывания, после чего избыток раствора конъюгата удаляется и лунки промываются буфером. Молекулы конъюгата осаждаются на молекулах осадившихся на антигене антител из испытуемого образца. В довершение всего лунки заполняют раствором субстрата, превращение которого в окрашенный продукт осуществляется конъюгированным ферментом. Такое ферментативное превращение осуществляется примерно 60 мин, после чего реакция останавливается добавлением кислоты. Количество превращенного субстрата пропорционально концентрации конъюгата и, следовательно, концентрации антител против возбудителя в исследуемом образце. По плотности окраски в УФ-свете можно судить о концентрации антител в исследуемой сыворотке. В «холостых» контрольных лунках параллельно проводят реакцию для установления порога «шумов». Имеются также лунки, заполненные антителами из контрольного раствора для проверки специфичности реакции. В качестве субстратов для конъюгатов с пероксидазой хрена применяется о-фенилендиамин в смеси с перекисью водорода, дающие после остановки реакции оранжево-коричневые растворы, измеряемые при 492 нм. Субстратом для щелочной фосфатазы является п-нитрофенилфосфат, превращающийся в п-нитрофенол, индицируемый при 405 нм. ИФА повышает чувствительность анализа благодаря «усилению сигнала» на конъюгированном ферменте. На каждую молекулу исследуемого в сыворотке антитела «садится» по одной молекуле фермента, которая способна катализировать превращение десятков и сотен тысяч молекул субстрата. Однако и чувствительность ИФА имеет ограничения. В первые дни после заболевания число антител в крови может оказаться настолько малым, что ИФА часто дает так называемую «серонегативную реакцию». Современные методы иммунологии позволяют обнаруживать в биологических средах ничтожно малые количества некоторых органических и неорганических веществ (гормонов, ферментов, витаминов, биологически активных веществ, антител к определенным тканям и органам, лекарств и т.п.), которые не выявляются классическими биохимическими и иммунологическими методами. Наиболее чувствительными являются радиоиммунный и иммуноферментный методы исследования. Радиоиммунологический анализ (РИА) Радиоиммунный метод является наиболее информативным, основан на исследовании характера взаимодействия антитела с антигеном с образованием иммунного комплекса, в один из компонентов которого (антиген или антитело) введена радиоактивная метка. Наибольшее распространение получил метод конкуренции за специфические антитела меченого радиоактивным изотопом антигена и такого же антигена, но свободного от радиоактивной метки, количество которого необходимо определить в исследуемой биологической среде. С этой целью в исследуемую жидкость, в которой предполагается наличие антигена, добавляют известное количество такого же меченого антигена и стандартное количество антисыворотки с соответствующими антителами (рис. 22, а). Если в исследуемой жидкости отсутствует искомый специфический антиген, то около 70–80 % меченого антигена связывается с антителами, обусловливая высокую радиоактивность образующегося преципитата (рис. 22, б). Если же в биологической среде присутствует искомый антиген, он конкурирует с меченым антигеном и связывает часть антител. В результате радиоактивность преципитата падает по сравнению с контролем (рис. 22, в). На этом принципе основано количественное определение антигенов или антител. Рис. 22. Принцип радиоиммунного метода: а — добавление в исследуемую жидкость стандартной антисыворотки с антителами и антигена, меченного радиоактивным изотопом; б — образование радиоактивных преципитатов при отсутствии в исследуемой жидкости искомого антигена; в — при наличии искомого антигена РИА — один из самых чувствительных методов иммунодиагностики. Его применяют для выявления антигена вируса гепатита В у больных вирусным гепатитом. Для этого к исследуемой сыворотке добавляют референс-сыворотку (сыворотку, содержащую антитела к вирусу гепатита В). Смесь инкубируют 1–2 сут. при температуре 40 °C, затем добавляют референс-антиген (антиген, меченный изотопом 125J) и продолжают инкубацию еще 24 ч. К образовавшемуся комплексу антиген-антитело добавляют преципитирующие антииммуноглобулины против белков референс-сыворотки, что приводит к образованию преципитата (рис. 23). Результат учитывают по наличию и числу импульсов в преципитате, зарегистрированных счетчиком. При наличии в исследуемой сыворотке антигена, связавшегося со специфическими антителами, последние не вступают в связь с меченым антигеном и поэтому он не обнаруживается в преципитате. Таким образом, в основу РИА положен принцип конкурентного взаимодействия определяемого антигена и известного количества меченого антигена с активными центрами антител. Рис. 23. Радиоиммунологический анализ: 1 — антиген; 2 — антитело; 3 — радиоактивная метка Следует добавить, что в последние годы для количественного радиоиммунного и иммуноферментного определения различных антигенов и антител в биологических средах все чаще используют так называемые моноклональные антитела. Последние получают не путем иммунизации животных, а искусственно, путем синтеза так называемым моноклоном, т.е. культурой клеток, происходящих из одного сенсибилизированного лимфоцита. Моноклональные антитела отличаются от обычных антител, полученных с помощью классической иммунизации животных, очень высокой специфичностью и реагируют только на определенный антиген. Для диагностики какой – либо одной болезни часто приходится использовать целый набор серологических методов диагностики. Особенно показателен в этом отношении бруцеллез. Для диагностики бруцеллеза применяют две серологические реакции — РА и РСК. Первой выявляют свежие случаи болезни, второй — развитие инфекционного процесса. В качестве арбитражного метода используют и третий тест— реакцию Кумбса, поскольку синтез неполных антител завершает образование полных антител, улавливаемых в РА и РСК. Кроме того, экспериментально доказано совпадение результатов исследования животных на бруцеллез реакциями агглютинации, связывания комплемента, Кумбса (РК) с показаниями метода флуоресцирующих антител (МФА) в непрямом варианте. Таким образом, последняя реакция принципиально информативнее всех предыдущих диагностических тестов (рис. 14). Она может регистрировать антитела классов М, G как полные, так и неполные. Рис. 14. Принципы серологического тестирования бруцеллезного процесса у рогатого скота Диагностическими серологическими тестами не удаётся строго разграничить вакцинальный и эпизоотический процессы у бруцеллезного скота. Их можно разграничить при исследовании классов иммуноглобулинов в динамике. Если, скажем, через 1,5–2 месяца синтез IgM снизится или заместится синтезом IgG, то это будет характеризовать эпизоотический процесс, связанный с репликацией возбудителя в организме. Можно также использовать антиген, позволяющий разграничить вакцинальный и эпизоотический процессы. Глава 2. Генодиагностика. Полимеразная цепная реакция в идентификации патогенных бактерий К числу наиболее чувствительных и высокоспецифичных иммунологических методов обнаружения антигенов относится метод полимеразной цепной реакции, который позволяет обнаруживать в исследуемом материале присутствие нескольких молекул искомого антигена или единичных возбудителей. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) —метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определенных фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе). Помимо простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией) ПЦР позволяет осуществлять множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК) и широко используется в биологической и медицинской практике, например для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, выделения новых генов. История. В начале 1970-х гг. норвежскому ученому Къеллу Клеппе (Kjell Kleppe) из лаборатории нобелевского лауреата Хара Гобинды Хораны (Har Gobind Khorana) пришла в голову мысль, что можно амплифицировать ДНК с помощью пары коротких одноцепочечных молекул ДНК — синтетических праймеров. Однако в то время эта идея осталась невостребованной. Полимеразная цепная реакция была вновь открыта в 1983 г. Кери Маллисом (Kary Mullis). Его целью было создание метода, который бы позволил амплифицировать ДНК в ходе многократных последовательных удвоений исходной молекулы ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы. Через 7 лет после опубликования этой идеи, в 1993 г., Маллис получил за нее Нобелевскую премию. В начале использования метода после каждого цикла нагревания — охлаждения приходилось добавлять в реакционную смесь ДНК-полимеразу, так как она быстро инактивировалась при высокой температуре, необходимой для разделения цепей спирали ДНК. Процедура была очень неэффективной, требовала много времени и фермента. В 1986 г. она была существенно улучшена. Было предложено использовать ДНК-полимеразы из термофильных бактерий. Эти ферменты оказались термостабильными и были способны выдерживать множество циклов реакции. Их использование позволило упростить и автоматизировать проведение ПЦР. Одна из первых термостабильных ДНК-полимераз была выделена из бактерий Thermus aquaticus и названа Taq-полимеразой. Недостаток этой полимеразы заключается в том, что вероятность внесения ошибочного нуклеотида у нее достаточно высока, так как у этого фермента отсутствуют механизмы исправления ошибок (3'→5' экзонуклеазная активность). Полимеразы Pfu и Pwo, выделенные из архей, обладают таким механизмом, их использование значительно уменьшает число мутаций в ДНК, но скорость их работы (процессивность) ниже, чем у Taq. Сейчас применяют смеси Taq и Pfu, чтобы добиться одновременно высокой скорости полимеризации и высокой точности копирования. Проведение ПЦР Метод основан на многократном избирательном копировании определенного участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, (репликации) с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований. С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определенных условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20–40 тысяч пар нуклеотидов. Это все равно значительно меньше длины хромосомной ДНК эукариотической клетки. Например, геном человека состоит примерно из 3 млрд пар оснований. Компоненты реакции. Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты: • ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать; • два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента; • термостабильная ДНК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов: Thermus aquaticus (Taqполимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwoполимераза) и др. • буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — pH, ионную силу раствора; содержит соли, бычий сывороточный альбумин. Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Если используется амплификатор с подогревающейся крышкой, этого делать не требуется. Добавление пирофософатазы может увеличить выход ПЦР-реакции. Этот фермент катализирует гидролиз пирофосфата, побочного продукта присоединения нуклеотидтрифосфатов к растущей цепи ДНК, до ортофосфата. Пирофосфат может ингибировать ПЦР-реакцию. Праймеры. Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами — короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18–30 оснований. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двухцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка. После гибридизации матрицы с праймером (отжиг) последний служит затравкой для ДНКполимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы (см. ниже). Важнейшая характеристика праймеров — температура плавления (Tm) комплекса праймер-матрица. Она определяется как температура, при которой праймер присоединился к половине возможных сайтов связывания. Если праймер короткий и Tm мала, то праймер может оказаться частично комплементарен другим участкам матричной ДНК, что может привести к появлению неспецифических продуктов. Верхний предел температуры плавления ограничен оптимумом температуры действия полимеразы, активность которой падает при температурах выше 80 °C. При выборе праймеров желательно придерживаться следующих критериев: GC-состав ~ 40–60 %; близкие Tm праймеров (отличия не более чем на 5 °C); отсутствие неспецифических вторичных структур — шпилек и димеров; желательно, чтобы на 3'-конце был гуанин или цитозин, поскольку они образуют три водородные связи с молекулой матрицы, делая гибридизацию более стабильной. Амплификатор. ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1 °C. Современные амплификаторы позволяют задавать сложные программы, в том числе с возможностью горячего старта, Touchdown ПЦР (см. ниже) и последующего хранения амплифицированных молекул при 4 °C. Для ПЦР в реальном времени выпускают приборы, оборудованные флуоресцентным детектором. Существуют также приборы с автоматической крышкой и отделением для микропланшет, что позволяет встраивать их в автоматизированные системы. Ход реакции. Обычно при проведении ПЦР выполняется 20–35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий. Денатурация. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94–96 °C (или до 98 °C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5–2 мин, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией, так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Иногда перед первым циклом (до добавления полимеразы) проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2–5 мин для полной денатурации матрицы и праймеров. Такой прием называется горячим стартом, он позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции. Отжиг. Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается на 4–5 °C ниже их температуры плавления. Время стадии — 0,5–2 мин. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре). Элонгация. ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7–10 мин. Две получившиеся ДНК-цепи служат матрицей для следующего цикла, поэтому количество матричной ДНК в ходе каждого цикла удваивается. Количество специфического продукта реакции (ограниченного праймерами) теоретически возрастает пропорционально 2n, где n — число циклов реакции. На самом деле эффективность каждого цикла может быть меньше 100 %, поэтому в действительности P ~ (1 + E)n, где P — количество продукта, Е — средняя эффективность цикла. Число «длинных» копий ДНК тоже растет, но линейно, поэтому в продуктах реакции доминирует специфический фрагмент. Рост требуемого продукта в геометрической прогрессии ограничен количеством реагентов, присутствием ингибиторов, образованием побочных продуктов. На последних циклах реакции рост замедляется, это называют «эффектом плато». Разновидности ПЦР: • «Вложенная» ПЦР (Nested PCR) — применяется для уменьшения числа побочных продуктов реакции. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции. • «Инвертированная» ПЦР (Inverse PCR) — используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном. Для осуществления инвертированной ПЦР проводят ряд разрезаний ДНК рестриктазами с последующим соединением фрагментов (лигирование). В результате известные фрагменты оказываются на обоих концах неизвестного участка, после чего можно проводить ПЦР как обычно. • ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR, RT-PCR) — используется для амплификации, выделения или идентификации известной последовательности из библиотеки РНК. Перед обычной ПЦР проводят на матрице мРНК синтез одноцепочечной молекулы ДНК с помощью ревертазы и получают одноцепочечную кДНК, которая используется в качестве матрицы для ПЦР. Этим методом часто определяют, где и когда экспрессируются данные гены. • Асимметричная ПЦР (Asymmetric PCR) — проводится тогда, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа. ПЦР проводится как обычно, за исключением того, что один из праймеров берется в большом избытке. • Количественная ПЦР (Quantitative PCR, Q-PCR) — используется для быстрого измерения количества определенной ДНК, кДНК или РНК в пробе. Количественная ПЦР в реальном времени (Quantitative real-time PCR) — в этом методе используют флуоресцентно меченые реагенты для точного измерения количества продукта реакции по мере его накопления. • Touchdown (Stepdown) ПЦР (Touchdown PCR) — с помощью этого метода уменьшают влияние неспецифического связывания праймеров на образование продукта. Первые циклы проводят при температуре выше температуры отжига, затем каждые несколько циклов температуру снижают. При определенной температуре система пройдет через полосу оптимальной специфичности праймеров к ДНК. • Метод молекулярных колоний (ПЦР в геле; PCR + Colony, Polony) — акриламидный гель полимеризуют со всеми компонентами ПЦР на поверхности и проводят ПЦР. В точках, содержащих анализируемую ДНК, происходит амплификация с образованием молекулярных колоний. • ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК (Rapid amplification of cDNA ends, RACE-PCR), ПЦР длинных фрагментов (Long-range PCR) — модификация ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК (10 тысяч оснований и больше). Используют две полимеразы, одна из которых — Taqполимераза с высокой процессивностью (т.е. способная за один проход синтезировать длинную цепь ДНК), а вторая — ДНК полимераза с 3'-5' эндонуклеазной активностью. Вторая полимераза необходима для того, чтобы корректировать ошибки, внесенные первой. • ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК (Random Amplification of Polymorphic DNA PCR, RAPD-PCR) — используется тогда, когда нужно различить близкие по генетической последовательности организмы, например разные сорта культурных растений, породы собак или близкородственные микроорганизмы. В этом методе обычно используют один праймер небольшого размера (20–25 п.н.). Этот праймер будет частично комплементарен случайным участкам ДНК исследуемых организмов. Подбирая условия (длину праймера, его состав, температуру и пр.), удается добиться удовлетворительного отличия картины ПЦР для двух организмов. Если нуклеотидная последовательность матрицы известна частично или неизвестна вовсе, можно использовать вырожденные праймеры, последовательность которых содержит вырожденные позиции, в которых могут располагаться любые основания. Например, последовательность праймера может быть такой: …ATH…, где Н — А, Т или С. Применение ПЦР ПЦР используется во многих областях для проведения анализов и в научных экспериментах. Криминология. ПЦР используют для сравнения так называемых «генетических отпечатков пальцев». Необходим образец генетического материала с места преступления — кровь, слюна, сперма, волосы и т.п. Его сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Достаточно совсем малого количества ДНК, теоретически — одной копии. ДНК расщепляют на фрагменты, затем амплифицируют с помощью ПЦР. Фрагменты разделяют с помощью гель-электрофореза. Полученную картину расположения полос ДНК и называют генетическим отпечатком пальцев (genetic fingerprint). Установление отцовства. Хотя «генетические отпечатки пальцев» уникальны (за исключением случая однояйцевых близнецов), родственные связи все же можно установить, сделав несколько таких отпечатков. Тот же метод можно применить, слегка модифицировав его, для установления эволюционного родства среди организмов. Медицинская диагностика. ПЦР дает возможность существенно ускорить и облегчить диагностику наследственных, бактериальных и вирусных заболеваний. Нужный ген амплифицируют с помощью ПЦР с использованием соответствующих праймеров, а затем секвенируют для определения мутаций. Вирусные инфекции можно обнаруживать сразу после заражения, за недели или месяцы до того, как проявятся симптомы заболевания. Высокие показатели чувствительности и специфичности полимеразной цепной реакции (ПЦР) делают ее революционной в лабораторной диагностике. Показания к применению ПЦР такие же, как и у культурального метода. Следует учитывать, что при исследовании биопроб методом ПЦР сразу после курса антибактериального лечения в некоторых случаях можно получить «ложноположительные с клинической точки зрения» результаты, поскольку невозможно однозначно оценить жизнеспособность микробной клетки на основании выявления фрагмента ее генома, используя только молекулярно-биологические методы, поскольку амплифицируется ДНК как живого, так и погибшего микроорганизма. Метод ПЦР особенно эффективен при выявлении трудно культивируемых, некультивируемых, требующих сложной питательной среды и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Диагностические возможности ПЦР не ограничены способностью микроорганизма расти на искусственных средах или в культуре клеток. Поэтому основное преимущество ПЦР перед культуральными методами состоит не в высокой чувствительности ПЦР-метода (поскольку их чувствительность сопоставима), а в способности идентифицировать, определять свойства и работать с большим разнообразием микроорганизмов, которые не удается по тем или иным причинам размножать в лабораторных условиях. Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Преимущества ПЦР как метода диагностики Одним из важнейших критериев диагностической эффективности любого лабораторного анализа является показатель «чувствительности». При этом следует различать аналитическую и диагностическую чувствительность. Аналитическая чувствительность, применительно к ПЦР, представляет собой то минимальное количество копий (геномных эквивалентов, г/э) ДНК или РНК в одном миллилитре раствора образца, которое может быть определено данной тест-системой. Большинство коммерческих амплификационных тестсистем позволяет обнаружить в биологической пробе искомую нуклеиновую кислоту (НК), если ее концентрация составляет не менее нескольких сот г/э копий в 1 мл образца. Например, аналитическая чувствительность большинства тест-систем для ВИЧ-1 составляет 300–500 копий ДНК в 1 мл образца. Диагностическая чувствительность определяется количеством пациентов с данным заболеванием, дающих истинно положительные результаты при использовании конкретного набора, и оценивается в процентах. В этом аспекте имеется общее положение, определяющее клиническую пригодность любых лабораторных способов диагностики или тест-систем: диагностическая чувствительность метода не должна быть ниже 95–98 %. Второй универсальный критерий лабораторной эффективности — «специфичность», определяется процентом здоровых людей, имеющих истинно отрицательные результаты анализа. Метод ПЦР обладает высочайшей специфичностью, которая достигает 99–100 %. Диагностическая чувствительность и специфичность ПЦР сопоставимы, а зачастую и превосходят таковые, обеспечиваемые культуральным методом, которые являются «золотым стандартом» в диагностике инфекционных заболеваний. Если учесть продолжительность процедуры выращивания культуры клеток (от нескольких недель до нескольких месяцев), то преимущество метода ПЦР становится несомненным. Результаты ПЦР-анализа можно получить в течение одного рабочего дня, при этом отобранные для анализа пробы могут храниться (накапливаться) в течение даже нескольких недель при соблюдении соответствующих температурных норм. Проведенная в нескольких зарубежных исследовательских центрах суммированная оценка чувствительности различных методов диагностики показала, что «быстрые», или экспресс-тесты имеют чувствительность 40– 60 %, ИФА — 50–70 %, прямая иммунофлуоресценция (ПИФ) — 55-75%, культуральное исследование — 60-80%, а ПЦР от 90 до 100%. Поэтому ПЦР по сравнению с другими способами обладает двумя важными преимуществами: высокой чувствительностью и непродолжительностью по времени анализа, т.е. «актуальностью» получения результата исследования врачом и пациентом. Таким образом, приведенные выше факты позволили отметить следующие преимущества ПЦР перед другими методами клинической лабораторной диагностики: • Универсальность. Метод принципиально позволяет обнаруживать любые ДНК и РНК даже в тех случаях, когда другими способами это сделать невозможно. Вне зависимости от объекта и области применения ПЦР (клиническая медицина, криминалистика, ветеринария, генетика, молекулярная биология) используется стандартный комплект приборов. Это обусловливает универсальность процедуры постановки ПЦР при исследовании любых биологических объектов. • Специфичность. Высокая специфичность (100 %) метода обусловлена тем, что в исследуемом материале определяется уникальный фрагмент НК (нуклеотидная последовательность), характерный только для данного возбудителя или гена. Таким образом, ПЦР-диагностикумы дают возможность избежать проблем, связанных с перекрестно-реагирующими антигенами. • Чувствительность. Возможность проведения не только качественной (наличие), но и количественной (концентрация) оценки содержания НК. В настоящее время реальный порог чувствительности коммерческих амплификационных тест-систем позволяет определять единичные копии в исследуемом образце. • Актуальность ответа (быстрота получения результата). Высокая технологичность и автоматизация метода позволяет получить результаты исследования в руки врача и пациента в день проведения анализа. • Возможность доклинической и ретроспективной диагностики ПЦР позволяет осуществить определение патогена или дефектного гена в организме еще до развития заболевания. Например, при инфекциях в инкубационном периоде, т.е. в серонегативной фазе, или при латентном характере заболевания. Кроме того, возможно проведение ПЦР в архивном (фиксированном) материале или биологических остатках, что важно для идентификации личности или отцовства. • Проведение анализа возможно в минимальном объеме пробы (до нескольких микролитров), что крайне важно в неонатологии, судебной медицине, клинической генетике и т.п. • Возможность одновременной диагностики нескольких возбудителей заболеваний или аномальных генов в одной пробе без ущерба для чувствительности или специфичности результата. • Возможность экспертизы — полученные результаты ПЦР возможно вносить в компьютерные информационные носители или фотографии для оценки независимыми экспертами. Несмотря на вышеуказанные достоинства метод ПЦР все же не лишен некоторых недостатков, которые следует учитывать при оценке результатов исследований. Ошибки при использовании метода ПЦР С точки зрения получения ложноотрицательного или ложноположительного результата особенно опасны ошибки, контроль которых невозможно осуществить во время проведения ПЦР-анализа. Это, прежде всего, ошибки, связанные с нарушением правил забора, хранения и транспортировки проб. Поскольку эти процедуры могут осуществляться вне ПЦР-лаборатории, большое внимание следует уделять обучению медицинского персонала, выполняющего забор проб, так как именно от него во многом зависит качество ПЦР-анализов. Случаи тотальной контаминации выявляются без труда по появлению линии «положительной» ДНК во всех пробах, включая отрицательный контроль. Реагенты, загрязненные «положительной» ДНК, подлежат ликвидации. Повторная реакция ставится с новыми реагентами. Вторую группу составляют ошибки, связанные с неверной диагностической стратегией врача, использующего ПЦР-диагностику. Недостатки ПЦР лежат не в сути метода, а в неправильном методическом подходе (алгоритме лабораторной диагностики) при обследовании пациента и неверной клинической интерпретации полученных результатов. Следует обратить внимание на случаи несовпадения результатов ПЦРанализа с результатами других исследований, например с результатами определения антител к возбудителю методом иммуноферментного анализа (ИФА). Возможна и обратная ситуация, когда при положительном результате ПЦР-анализа не выявляются специфические антитела. При хронических инфекциях, которые зачастую сопровождаются иммунодепрессией, такая картина бывает нередко. Глава 3. Методы изучения иммунного статуса организма Определение антителопродуцирующих клеток Антителопродуцирующие клетки определяют при помощи меченых антител или антигенов. В первом случае наиболее популярным является сэндвич-тест (англ. sandwich — многослойный), смысл которого сводится к последовательному нанесению на мазок-отпечаток или срез лимфоидной ткани сначала взвеси или раствора соответствующего антигена, а затем гомологичной им меченой флуорохромом антисыворотки (МФА). Светящийся антиген локализуется на клетках, продуцирующих антитела, высвечивая их контуры. Если нужно обнаружить не антитело, а иммуноглобулинпродуцирующие клетки, используют прямой и непрямой варианты МФА с применением меченой антивидовой сыворотки ко всем глобулинам или к иммуноглобулинам определенного класса. В экспериментальных исследованиях на линейных мышах и крысах для оценки первичного (IgM и IgG) и вторичного (IgG) ответа на тимусзависимый или тимус-независмый антиген используется метод определения количества антителообразующих клеток in vivo в камере (или агаре) по Cunningham. Первичный (IgM) гуморальный иммунный ответ in vivo Количество антителообразующих клеток, синтезирующих антитела класса IgM (IgM-АОК) в селезенке мышей, оценивается на пике иммунного ответа на 4-5-е сутки после внутривенной иммунизации эритроцитами барана (ЭБ) в дозе 107 ЭБ/мышь по количеству локальных зон гемолиза в полужидкой среде модифицированным методом. У мышей после шейной дислокации извлекается селезенка и помещается в пенициллиновый флакон с 0,5 мл среды 199. Каждая селезенка помещается в отдельный флакон. Все процедуры с клетками проводятся на льду. Объем клеточной суспензии доводится до 5 мл; клетки разводятся средой до необходимой концентрации. Затем готовится инкубационная смесь: 300 мкл среды, 100 мкл суспензии ЭБ (4·109 ЭБ/мл), 100 мкл сыворотки морской свинки, предварительно разведенной в 1,5 раза и 500 мкл клеточной суспензии. Компоненты перемешиваются и смесь заливается в стеклянные камеры (по 2 камеры на каждое животное, учитывая среднее), сделанные из двух предметных стекол, склеенных смесью воска с парафином вдоль продольных сторон. Учитывается объем камеры. Камеры помещаются в термостат и инкубируются 90 мин. при +38 °C. После инкубации подсчитываются зоны гемолиза под бинокулярной лупой (×42): N АОК = n АОК в камере × Объем клет. суспензии × Разведение клеток. Объем камеры Вторичный IgG ответ in vivo Первичная иммунизация проводится внутривенно в дозе 2 % ЭБ в объеме 0,5 мл. Через 30 дней после первичной иммунизации проводится вторичная иммунизация ЭБ в дозе 10·106/мышь внутривенно. Количество IgG АОК определяется в селезенке на пике иммунного ответа (на 5-е сутки после вторичной иммунизации) методом локального гемолиза. Клетки селезенки инкубируются 2 часа при 39 °C в камерах с ЭБ, комплементом морской свинки и кроличьей антисывороткой против мышиного IgG (разведение в 2000 раз). Зоны гемолиза подсчитываются под увеличением ×42. Результаты выражаются в абсолютном количестве IgG АОК в селезенке. Продукция IgG В-клетками in vitro Продукцию IgG клетками селезенки и костного мозга, спонтанную и LPS-стимулированную, определяют в супернатантах клеточных культур после культивирования в течение 7 дней. Оптимальная доза LPS E. coli, установленная в предварительных опытах, составляет 30 мкг/мл. Результаты выражают в мкг/мл и индексах стимуляции (IS — отношение разницы между опытом и контролем к контролю). Концентрацию IgG в периферической крови и супернатантах культур определяют твердофазным вариантом метода иммуноферментного анализа в 96-луночных плоскодонных планшетах фирмы E.I.A. «Linbro» с помощью меченного пероксидазой хрена конъюгата и ОФД в качестве субстрата. В качестве основного буфера используется Tris-NaCl, блокирующего агента — желатин. Также предварительно должны быть определены оптимальные разведения конъюгатов и антисывороток. Интенсивность реакции оценивают на многоканальном спектрофотометре Multiskan при = 492 нм. Калибровочную кривую строят по препаратам IgG (Sigma) (10–100 нг/мл). Результаты выражают в абсолютных значениях (мг/мл, мкг/мл). Оценка клеточного звена иммунной системы Т-лимфоциты — самая многочисленная (60 %) популяция клеток иммунной системы (ИС), которая в свою очередь разделяется на субпопуляции. Хелперы и супрессоры являются иммунорегуляторными клетками, а киллеры и эффекторы ГЗТ — эффекторными (рис. 15). Рис. 15. Взаимодействие Т-лимфоцитов Т-киллеры разрушают инфицированные клетки и клетки опухолей. Существует еще субпопуляция так называемых естественных киллеров (ЕК), они имеют CD56/57+. Это большие гранулярные клетки, в гранулах содержится белок перфорин, который может проникать в мембрану клеткимишени и в результате полимеризации образовывать мембраноатакующий комплекс (своеобразная «дырка» в мембране), вызывая осмотический «взрыв» и лизис клетки. Клеточный иммунный ответ разделяют на стадии: • распознавание антигена макрофагом или другой антигенпрезентирующей клеткой; • обработка антигена макрофагом или другой антиген-презентирующей клеткой; • презентация обработанного антигена в комплексе с белками МНС I и МНС II (Т-киллеры непосредственно взаимодействуют с комплексом АГ* МНС I, а Т-эффекторы — посредством Т-хелперов); • передача информации на Т-хелперы; • передача информации на Т-эффекторы; • пролиферация и дифференцировка Т-эффекторной популяции под действием интерлейкина. Т-киллеры при встрече с чужеродной клеткой выделяют перфорин, разрушающий ее мембрану. Т-эффекторы оказывают опосредованное действие: выделяют факторы хемотаксиса, подавления миграции макрофагов и лейкоцитов, активации. Клетки в очаге пролиферации образуют инфильтрат, который окружается фибробластами, продуцируемым ими коллагеном, и становится гранулемой. Гранулема выполняет ограничивающую функцию — локализует процесс воспаления, препятствует его распространению; элиминирующая функция выражена слабо. Т-клеточные ответы заканчиваются формированием двух субпопуляций эффекторных Т-клеток: 1) цитотоксических Т-лимфоцитов (или Т-киллеров); 2) эффекторных Т-лимфоцитов воспаления. Оценка клеточного звена иммунной системы включает определение количества (по CD маркерам) различных субпопуляций Т-клеток (CD3,CD4 и др.) с помощью моноклональных антител и изучение их функциональных свойств (пролиферация в ответ на митогены, аллоантигены и др.). Оценка проводится как in vivo, так и in vitro. Определение количества субпопуляций Т-лимфоцитов Принцип метода: моноклональные антитела (мАТ) к поверхностным дифференцировочным антигенам лимфоцитов периферической крови используют для определения их фенотипа и количественного учета. Количество лимфоцитов определенного фенотипа существенно изменяется при вирусных заболеваниях и аутоиммунных патологиях, стрессе. Определение фенотипа лимфоцитов рекомендуется проводить при использования иммуномодуляторов, при наличии клинических признаков иммунологической недостаточности. Определение популяционного и субпопуляционного состава лимфоцитов осуществляется на проточных цитометрах после их специфического связывания с мАТ и окрашивания антиглобулиновыми антителами, меченными флуорохромом или на люминесцентном микроскопе. В настоящее время существует большое количество типов антител к дифференцировочным антигенам лимфоцитов животных. Классификация мАТ базируется на группах мАТ, реагирующих с одними и теми же дифференцировочными антигенами на лимфоцитах человека (CD — cluster of differentiation; CD-номенклатура). Циркулирующие иммунные комплексы В последние годы большое диагностическое значение придают определению в сыворотке крови циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). Они представляют собой растворимые комплексы антиген-антитело, которые в норме фагоцитируются макрофагами и разрушаются. Для определения ЦИК используют метод осаждения (преципитации) ЦИК раствором полиэтиленгликоля. После инкубации и центрифугирования выпавшие в осадок ЦИК растворяют раствором едкого натра и определяют их содержание в растворе на спектрофотометре, выражая количество иммунных комплексов в единицах оптической плотности. Определение ЦИК в сыворотке крови возможно также с помощью метода иммунофлуоресценции. Увеличение концентрации ЦИК может иметь два важных в практическом отношении следствия. Во-первых, ЦИК могут приводить к повреждению мембран и способствовать развитию иммунопатологического процесса в органах. Особенно часто это наблюдается при снижении функциональной активности тканевых макрофагов. Во-вторых, ЦИК обладают способностью активировать систему комплемента, хемотаксическим действием по отношению к лимфоцитам и нейтрофилам, активируют систему свертывания крови, кининовую систему, выделение гранулоцитами и макрофагами биологически активных веществ и т.д. Эти эффекты ЦИК сопровождаются развитием воспаления тканей. Повышение концентрации ЦИК обнаруживают при многих заболеваниях, в основе которых лежат нарушения клеточного иммунитета, в первую очередь при различных аутоиммунных заболеваниях. Определения фенотипа и количества лимфоцитов с помощью моноклональных антител на лазерном проточном цитометре методом непрямой иммунофлуоресценции Немеченые мышиные моноклональные антитела (мАТ) к соответствующим поверхностным рецепторам разных популяций лимфоцитов крови человека (животных) после их прикрепления визуализируются добавлением антимышиных иммуноглобулинов, меченных флуоресцентными красителями (например ФИТЦ или фикоэритрином). Необходимое оборудование: • мАТ нужной специфичности. • Лейкоцитарная клеточная взвесь или мононуклеарные клетки крови, выделенные из 3 мл крови. • Среда 199. • 1%-ный параформальдегид. • Фиколл-верографин. • 70%-ный глицерин. • Проточный цитофлуориметр. • Центрифуга на 3000 об/мин. • Термостат 37 °C. • Холодильник бытовой (+4 °C). • Полная рабочая среда (ПРС). • Лизирующий раствор. Постановка метода: 1. Производится забор крови из вены в объеме 3 мл с гепарином (из расчета 15–20 единиц на 1 мл крови). 2. Наслаивают на 0,5 мл раствора фиколл-верографина (плотностью 1,077 г/см3) и центрифугируют при 400g 25 мин. 3. Пастеровской пипеткой отбирают лейкоцитарное кольцо и дважды отмывают центрифугированием (200g, 10 мин) в среде 199. 4. Осадок ресуспендируют в среде 199 с 2%-ной эмбриональной телячьей сывороткой в объеме 1 мл. 5. С помощью камеры Горяева определяют число ядросодержащих клеток и доводят их концентрацию до 2·106 клеток/мл средой 199 с 2%-ной эмбриональной телячьей сывороткой. 6. К осадку клеток добавляют 0,5 мл ПРС, клеточную взвесь разливают по 50 мкл в лунки 96-луночных круглодонных планшетов. 7. В каждую лунку вносят по 50 мкл предварительно разведенных мАТ: первая лунка — контроль (добавляют ПРС), 2-я, 3-я, 4-я, 5-я лунки — мАТ CD3, CD4, CD8, CD21 соответственно. 8. Планшет ставят на 30 мин в холодильник (4 °C). 9. Клетки дважды отмывают от мАТ путем добавления в каждую лунку по 200 мкл ПРС и центрифугирования планшетов в течение 5 мин при 1000 об/мин. 10. В случае если мАТ не соединены с флуорохромом, проводят процедуру докрашивания, добавляя в каждую лунку по 50 мкл антимышиных иммуноглобулинов, меченых ФИТЦ в соответствующем инструкции разведении. 11. Планшеты ставят на 30 мин в холодильник (4 °C). 12. Добавляют в каждую лунку по 100 мкл ПРС и затем центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об/мин (300g). Надосадочную жидкость из планшета стряхивают резким движением. 13. Лизируют оставшиеся в пробе эритроциты: к осадку добавляют по 200 мкл лизирующего раствора. 14. Встряхивают на шейкере 1 мин, сразу центрифугируют 5 мин при 300g, надосадочную жидкость выливают резким движением. 15. Быстро добавляют ПРС до полного объема лунки, центрифугируют при тех же условиях и сливают надосадочную жидкость. 16. Для фиксации к осадку добавляют по 100 мкл 2%-ного параформальдегида и ставят на 30 мин в холодильник (4 °C). 17. Добавляют ПРС до полного объема лунки. Для длительного хранения препаратов слегка увлажняют прокладку из фильтровальной бумаги, закрывают планшет этой бумагой и сверху накрывают крышкой. Планшет помещают в холодильник и затем просчитывают образцы на цитометре. Определение фенотипа и количества лимфоцитов с помощью моноклональных антител на люминесцентном микроскопе Приготовление образцов крови для просмотра под люминесцентным микроскопом осуществляется так же, как и для анализа на проточном цитометре (см. выше). После фиксации взвесь клеток помещают на очищенное предметное стекло на 20 мин для их осаждения, затем стекло переносят под струю холодного воздуха (под вентилятор) для уменьшения объема жидкости. Добавляют каплю 50%-ного глицерина на фосфатном буфере, сверху аккуратно накрывают покровным стеклом. Избыток глицерина удаляют фильтровальной бумагой. Под микроскопом определяют процент светящихся клеток при объективе ×90. В качестве иммерсионного средства можно использовать 50%-ный или 70%-ный глицерин, приготовленный на фосфатном буфере. В одном образце просчитывается 200–500 клеток. Определение количества лимфоцитов в лимфотоксическом тесте с помощью моноклональных антител Принцип метода. Для определения субпопуляций Т-лимфоцитов можно использовать методы проточной цитометрии, непрямой иммунофлуоресценции и лимфотоксический тест (ЦТТ). Для выполнения этих методов необходимы мАТ к дифференцировочным антигенам (АГ) Тлимфоцитов. В случае отсутствия проточного цитометра применение ЦТТ имеет ряд преимуществ перед иммунофлуоресценцией: этот метод более прост. Он основан на способности мышиных мАТ класса IgM и IgG и комплемента оказывать цитотоксическое воздействие на соответствующую субпопуляцию лимфоцитов, что выявляется с помощью красителя. Для идентификации лимфоцитов различных популяций используют мАТфиксирующий комплемент. После инкубации лимфоцитов с мАТ необходима дополнительная инкубация клеток с антимышиными кроличьими сыворотками. Постановка метода: 1. Кровь в объеме 0,5 мл разводят в отношении 1:2 средой 199. 2. Наслаивают на 0,5 мл раствора фиколл-верографина (плотностью 1,077 г/см3) и центрифугируют при 400g 25 мин. 3. Пастеровской пипеткой отбирают лейкоцитарное кольцо и дважды отмывают центрифугированием (200g, 10 мин) в среде 199. 4. Осадок ресуспендируют в среде 199 с 2%-ной эмбриональной телячьей сывороткой в объеме 1 мл. 5. С помощью камеры Горяева определяют число ядросодержащих клеток и доводят их концентрацию до 2·106 клеток/мл средой 199 с 2%-ной эмбриональной телячьей сывороткой. 6. В лунку 96-луночного планшета вносят 20 мкл суспензии лимфоцитов (объем суспензии при указанной концентрации может колебаться от 10 до 40 мкл) и 5 мкл мАТ в рабочем разведении 7. Инкубируют 40 мин при комнатной температуре. 8. Центрифугируют 5 мин при 300g для удаления избытка мАТ и надосадок сливают. 9. В качестве источника комплемента (подбор комплемента см. ниже) к осадку добавляют 25 мкл свежей сыворотки кролика в разведении 1:2, осадок взбалтывают и инкубируют 90 мин при комнатной температуре. 10. В лунку вносят 10 мкл 2%-ного раствора эозина на изотоническом растворе хлорида натрия. 11. Через 5 мин в лунки добавляют 10 мкл 1–2%-ного формальдегида с pH 7,2–7,4, что дает возможность сохранять препарат в течение нескольких дней. ЦТТ можно остановить переносом планшетов с реакцией на лед, но в этом случае результаты реакции учитывают в течение 1–2 ч. Результаты ЦТТ учитывают в препарате «раздавленная капля» (объектив ×20). Целесообразно просматривать препараты в микроскопе с фазовоконтрастным устройством для более точной идентификации лимфоцитов и моноцитов и возможной примеси нейтрофилов. Считают число «убитых» лимфоцитов на 200 лимфоцитов. Убитые клетки окрашены, существенно увеличены, становятся как бы плоскими, распластанными. Средние арифметические значения содержания (± стандартные отклонения) Т-лимфоцитов, Т-хелперов и Т-супрессоров/киллеров у здоровых добровольцев составляют 74,9 ± 4,8; 42,9 ± 7,3 и 24,8 ± 6,2 соответственно, что совпадает с данными, полученными с помощью метода цитофлуориметрии. Подбор комплемента — важнейший этап в ЦТТ. В качестве последнего используют свежую сыворотку кроликов массой 1,5–2,0 кг. Комплемент получают смешиванием сывороток от нескольких (6 и более) животных, предварительно проверенных на отсутствие токсичности и достаточную активность в ЦТТ. Сыворотку кроликов получают на холоде с последующим замораживанием при –70 °C. Комплемент при этом может храниться в течение 1–1,5 мес. При замораживании в жидком азоте срок хранения неограничен. Размороженные образцы комплемента должны быть использованы в течение 4 ч. Повторное замораживание не допускается! Метод оценки функциональной активности лимфоцитов in vitro ─ реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) Принцип метода. Существуют вещества растительного и бактериального происхождения, которые оказывают на лимфоциты млекопитающих митогенное действие. Для оценки функционального состояния Т-лимфоцитов используют фитогемагглютинин (ФГА) и конканавалин А (Кон A) — лектины растительного происхождения, а для оценки функционального состояния В-клеток (в присутствии Т-лимфоцитов) — митоген лаконоса (МЛ). Мононуклеары периферической крови инкубируют в присутствии вышеуказанных митогенов в течение 72 ч. Результаты реакции оценивают по включению Н3-меченого тимидина. Постановка метода реакции бласттрансформации с клетками селезенки мышей не имеет принципиальных отличий при использовании клеток крови других животных. Селезенки мышей забирают в стерильных условиях и готовят клеточную суспензию: селезенки помещают во флакончики со средой, расстригают ножницами, многократно пропускают через шприц с иглами уменьшающегося диаметра, фильтруют через металлическую сеточку и 3 раза отмывают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин со сменой среды. Осадок клеток селезенки ресуспендируют в полной среде RPMI-164, содержащей 10 % эмбриональной сыворотки телят, 10 мМ Hepes, 4·10–5 М 2-меркаптоэтанола, 2 мМ L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина, и подсчитывают их общее количество. Полученную клеточную суспензию доводят до концентрации 0,7·106 клеток/мл полной среды и помещают в 96луночные круглодонные планшеты для культивирования по 100·103 клеток/лунку в объеме 150 мкл/лунку. Добавляют оптимальные дозы митогенов LPS E. сoli 055:B5, Con A, PWM, определенные в предварительных опытах: 30 мкг/мл, 2 мкг/мл и 1мкг/мл соответственно — в объеме 10 мкл. Для оценки спонтанной пролиферации в лунки добавляют 10 мкл среды RPMI-1640. Все пробы проводятся в триплетах. Инкубацию клеточной культуры проводят при +37 °С в атмосфере, содержащей 5 % СО2, в течение 72 ч. Пролиферативную активность клеток оценивают по включению Н3тимидина в ДНК делящихся клеток. Метку вносят за 16 ч до конца культивирования по 1 мкКи в каждую лунку планшета. Для этого основной раствор Н3-тимидина сначала растворяют в среде RPMI-1640 до концентрации 100 мкКи/мл, а затем по 10 мкл раствора добавляют в каждую лунку планшета. По окончании инкубации клетки собирают на стеклянноволокнистые фильтры (Flow Lab) с помощью аппарата Harvester (TITERTEK). Фильтры помещают во флаконы для сцинтилляционного счета, и радиоактивность подсчитывают в сцинтилляторе (4 г дифенилоксазола и 0,1 г дифенилоксазолилбензола на 1 л толуола) в жидкостном сцинтилляционном счетчике Delta. Результаты оценивают в имп/мин. на 100·103 клеток, подсчитывают средние значения по триплету. Оценка результатов проводится как в абсолютных значениях, так и в индексах стимуляции (ИС): ИС = имп/мин митогениндуцированной пролиферации . имп/мин спонтанной пролиферации Результаты экспериментов представляются в виде среднего счета (имп/мин) из трех идентичных культур. Показания к применению. Проведение РБТЛ целесообразно в случае: первичных иммунодефицитов, связанных с нарушениями клеточного иммунитета; вторичных иммунодефицитов, связанных с нарушениями клеточного иммунитета, которые развиваются вследствие воздействия на организм какого-либо повреждающего фактора (ВИЧ-инфекция, острые и хронические вирусные инфекции, злокачественные заболевания); физиологических иммунодефицитов, например, при старении, когда ослабление иммунитета затрагивает реакции, обусловленные Т-клетками, что служит одной из причин повышения частоты опухолей в старости; аутоиммунных заболеваний. Необходимое оборудование и реактивы: 1. Ламинарный бокс (рис. 17). 2. 96-луночные круглодонные планшеты. 3. Инкубатор на 37 °C с возможностью поддерживать 5%-ную атмосферу СО2 (Flow). 4. Автоматические пипетки с переменным объемом («Ленпипет»). 5. Фиколл-пак (Sigma). 6. Среда 199 (Sigma). 7. Среда для культивирования клеток: RPMI-1640 (Sigma). 8. Гентамицин (АО «Белмедпрепараты»). 9. Эмбриональная телячья сыворотка (Flow). 10. Глутамин (Sigma). 11. Жидкостный сцинциляционный счетчик. 12. Фитогемагглютинин (Sigma). Маточный раствор (1 мг/мл в RPMI1640). Рабочий раствор (5 мкг/мл в ПКС). Готовится в день постановки. 13. Митоген лаконоса (Sigma). Маточный раствор (1 мг/мл в RPMI1640). Рабочий раствор (0,5 мкг/мл в ПКС). Готовится в день постановки. 14. 3[Н]-тимидин («Изотоп», Санкт-Петербург). Рабочий раствор (1 мкКи/мл). Размораживается один раз перед применением. 15. Сцинциляционная жидкость. 16. Стекловолоконные фильтры Titertek. 17. Полная культуральная среда (ПКС). Рис. 17. Стерильный ламинарный шкаф Выполнение метода включает следующие процедуры: Выделение клеток. Используют мононуклеарные клетки из периферической крови человека или животного. Забор крови производят натощак в стерильную пробирку с гепарином (20 ME на 1 мл крови). От забора крови до начала выделения должно пройти не более 3 ч. Кровь в это время хранится при комнатной температуре в плотно закрытой пробирке. Перед разведением ее следует перемешать. Гепаринизированную кровь разводят в два раза средой 199, затем наслаивают на градиент плотности фиколл-пака (8 мл разведенной крови на 2 мл фиколла в центрифужной пробирке). Пробирки центрифугируют 30–40 мин при 400g. Затем отбирают образовавшееся в интерфазе «кольцо» мононуклеаров. После этого клетки дважды отмывают центрифугированием средой 199. Концентрацию клеток доводят до 2·106 клеток/мл полной культуральной средой. Их жизнеспособность после выделения должна составлять не менее 95 %, что определяют по включению 0,2%-ного трипанового синего. Постановка реакции. Мононуклеары культивируют в объеме 150 мкл ПКС (полной культуральной среды — питательная среда содержит все необходимые для культивирования компоненты: эмбриональную телячью сыворотку, 2-меркаптоэтанол, гентамицин) в 96-луночных круглодонных планшетах при 37 °C в атмосфере 5%-ного СО2 в течение 72 ч в присутствии выше указанных митогенов в рабочих концентрациях. В качестве контроля используют клетки, инкубированные только в присутствии среды. За 6 ч до окончания реакции в каждую лунку добавляют Н3-тимидин в концентрации 1 мкКи на лунку. По окончании реакции клеточную взвесь переносят на стекловолоконные фильтры. Высушенные в течение ночи фильтры переносят в сцинциляционные флаконы с 3 мл сцинциляционной жидкости и подсчитывают включения радиоактивной метки: в культуре со средой: спонтанная бластгрансформация, с фитогемагглютинином — ФГАиндуцированная бласттрансформация, с митогеном лаконоса — МЛиндуцированная бласттрансформация. Результаты выражают в импульсах в минуту (имп/мин) и в виде индекса стимуляции — отношение включения метки в присутствии митогена к включению метки в присутствии только среды. Чувствительность и специфичность. Следует отметить, что данная методика разработана только для определенных митогенов, которые обладают неспецифическим воздействием на клетки, проводится in vitro, и у исследователя могут возникать вопросы при экстраполяции полученных при помощи данного теста результатов на реальное состояние Т- и В-звеньев иммунитета и иммунитета в целом. Для выявления специфического ответа лимфоцитов на антигены требуется более длительное (до 7 сут.) культивирование клеток. Поэтому сам по себе показатель активности лимфоцитов не должен служить единственным изучаемым критерием при клеточных иммунопатологиях самого различного генеза. Известно, что обусловленная терапией «нормализация митогензависимой активности» не обязательно развивается параллельно с улучшением клинической картины. Снижение пролиферативного ответа на митогены в большинстве случаев является косвенным доказательством наличия клеточного иммунодефицита, но механизмы последнего могут быть различными. Только в комплексе с другими количественными и, особенно, качественными характеристиками иммунной системы метод может дать наиболее полную информацию о состоянии иммунитета, выявлении конкретного иммунологического дефекта и, следовательно, подобрать адекватное лечение и/или способ иммунокоррекции. Для высокой диагностической эффективности и достаточной иммунокоррекции следует соблюдать ниже приведенные условия и правила. • Необходимо использовать инактивированную эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС). • Для большей информативности этот анализ нужно проводить лишь в комплексе с другими показателями и оценкой клинической картины в целом, а для исследования функциональной активности лимфоцитов — с синтезом цитокинов, определением активности ЕКК и др. • Реальную информацию об изменении параметра несут лишь сильные сдвиги показателя (±20–40 % от нормы и более). • Для диагностической и прогностической оценки иммунитета важнейшее значение имеет индивидуальный показатель нормы у данного больного (особенно с учетом возраста и наличия хронических заболеваний). • При оценке функциональной активности лимфоцитов, как и при оценке других показателей иммунограммы, следует прежде всего исключить возможность их колебания в связи с приемом пищи, физическими нагрузками, стрессом, временем суток и др. Определение активности естественных киллерных клеток Принцип метода. Определяется способность естественных киллерных клеток периферической крови убивать клетки-мишени эритромиелоидной линии К-562. Необходимые реактивы: 1. Мононуклеары крови, выделенные на фиколл-верографине. 2. Культура К-562. 3. Среда RPMI-1640. 4. Эмбриональная телячья сыворотка (ЭТС). 5. Антибиотики. 6. 3Н-уридин. 7. Ламинарный шкаф (см. рис. 17). 8. Световой микроскоп. 9. Набор автоматических пипеток. 10. СО2-инкубатор. 11. Центрифуга на 3000 об/мин. 12. Стерильные микропланшеты. 13. Жидкостный сцинциляционный счетчик. Постановка метода: 1. Клетки-мишени [(1–4)·106 кл/мл] метят Н3-уридином (1 мкКи/мл) и инкубируют при 37 °С на водяной бане 1 ч. 2. Меченые клетки трижды отмывают большим объемом среды 199 с 10%-ной ЭТС. 3. Для предотвращения реутилизации клетками-эффекторами продуктов гидролиза ДНК, включившей радиоактивную метку, клеткимишени инкубируют 2 ч при 37 °С и вновь отмывают один раз в большом объеме среды 199 с 10%-ной ЭТС. 4. Цитотоксический тест выполняют в круглодонных 96-луночных планшетах. В шесть лунок помещают клетки-мишени в количестве 1·104 в 0,2 мл питательной среды (контрольные культуры). В другие шесть лунок помещают клетки-мишени в количестве 1·104 в объеме 0,1 мл и клеткиэффекторы в количестве 5·105 в 0,1мл. В каждую лунку добавляют панкреатическую РНКазу Serva в конечной концентрации 0,25–10,0 мкг/мл. 5. Культуры инкубируют 14 ч при 37 °C. 6. После инкубации клеточные культуры переносят на фильтры с помощью собирателя клеток — харвестра. 7. Фильтры высушивают и помещают в сцинтилляционную жидкость; проводят учет реакции с помощью P-счетчика. Показатель активности ЕКК выражают в виде индекса цитотоксичности, который определяется по формуле: ИЦ = среднее значение в опыте (имп/мин) . среднее значение в контроле (имп/мин) Реакция гиперчувствительности замедленного типа in vivo (ГЗТ) Клеточные реакции иммунной системы in vivo оцениваются по выраженности реакции гиперчувствительности замедленного типа, отражающей функциональную активность Th1 (хелперов 1-го типа) и макрофагального звена при ответе на Т-зависимый антиген. Реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) состоит из двух этапов — фазы сенсибилизации и разрешения. По результатам влияния на сенсибилизацию оценивается возможность образования антигенспецифических Т-лимфоцитов, результаты разрешающей фазы оценивают интенсивность воспалительной реакции, связанной с выделением провоспалительных цитокинов. Животных иммунизируют (сенсибилизируют) 2,5·107 ЭБ/мышь внутрибрюшинно для тестирования интенсивности клеточного ответа — реакции гиперчувствительности замедленного типа. На 4-е сутки после сенсибилизации вводят разрешающую дозу антигена под подошвенный апоневроз правой задней лапы (5·108 ЭБ/мышь в объеме 50 мкл). В контрлатеральную лапу вводят растворитель в том же объеме. Степень выраженности реакции ГЗТ оценивают по величине отека лапы после введения разрешающей дозы ЭБ сенсибилизированным животным (Crowle, 1975). Учет реакции проводят через 24 ч после введения разрешающей дозы ЭБ по величине местного отека; величину отека оценивают штангенциркулем. Результаты выражают в абсолютных (разности между отеком лапки, в которую были введены ЭБ, и отеком контралатеральной лапки) и относительных единицах (отношение разности между отеком лапки, в которую были введены ЭБ, и отеком контралатеральной лапки к отеку контралатеральной лапки, умноженное на 100 %). Определение цитокинов Термином «цитокины» объединяют так называемые ростовые факторы, которые регулируют пролиферацию, дифференцировку и функцию клеток крови, в том числе и клеток иммунной системы. Цитокины представляют собой новую самостоятельную систему регуляции функций организма, обеспечивающую в первую очередь развитие защитных реакций и поддержание гомеостаза при внедрении патогенов (микроорганизмов) и нарушении целостности тканей, а также при эндогенно возникающих состояниях (опухолевые клетки, клетки, измененные вирусами, старением и т.д.). Одним из важных показателей функционирования иммунной системы является оценка продукции цитокинов. Оценивается как спонтанная, так и стимулированная митогенами продукция цитокинов in vitro клетками селезенки мышей методом иммуноферментного анализа. Изучение уровней цитокинов позволяет получить информацию о функциональной активности различных типов иммунокомпетентных клеток; о тяжести воспалительного процесса, его переходе на системный уровень и прогнозе, о соотношении процессов активации Т-хелперов 1-го и 2-го типов, о стадии развития ряда аллергических и аутоиммунных заболеваний. Оценка уровней цитокинов, в частности с использованием иммуноферментных диагностических тест-систем, позволяет по-новому подойти к изучению состояния иммунной системы организма в клинической практике. Цитокины продуцируются и секретируются клетками иммунной системы, они выполняют функции ее медиаторов, обеспечивающих межклеточную кооперацию, позитивную и негативную иммунорегуляцию. Цитокины регулируют амплитуду и продолжительность воспалительного и иммунного ответов, поэтому они должны продуцироваться и секретироваться транзиторно (индуцибельно), и иметь короткий полупериод жизни. Классификация цитокинов в основном проводится по их биологическим свойствам. • Интерлейкины (ИЛ) — факторы взаимодействия между лейкоцитами (гуморальная связь между лейкоцитами); • Интерфероны (ИФН) — цитокины с противовирусной активностью (осуществляют естественную защиту организма от вирусов) — ИФН-α, -β, -γ. • Факторы некроза опухоли (ФНОα) — обладают провоспалительными, гемопоэтическими и иммуностимулирующими свойствами. • Колониестимулирующие факторы (КСФ) — гемопоэтические цитокины (способствуют продукции форменных элементов крови, лимфоцитов и макрофагов), вызывающие размножение и дифференцировку клеток-предшественников различных ростков гемопоэза на разных этапах их созревания, — Г-КСФ, М-КСФ, ГМ-КСФ. • Хемокины (ХК) — хемотаксические цитокины (ответственны за хемотаксис) — СС, CXC. • Ростовые факторы — обладают противовоспалительным действием, способствуют регенерации поврежденных тканей. Изучение уровня цитокинов (интерлейкинов) в сыворотке периферической крови и биологических жидкостях: • провоспалительные цитокины — ИЛ-1, ФНОα; • противовоспалительные цитокины ИЛ-4, ИЛ-10. Количественное определение цитокинов в культуральном супернатанте клеток селезенки проводится методом иммуноферментного анализа с использованием соответствующих тест-систем на иммуноферментном анализаторе «Мультискан». Расчеты количества цитокинов проводятся путем построения калибровочной кривой с помощью компьютерной программы. Количество цитокинов выражают в пкг/мл. Индекс стимуляции высчитывается как соотношение показателей индуцированной липополисахаридами и спонтанной продукции. Оценка интерферонового статуса При возникновении инфекции в организме человека развиваются иммунные реакции со сложными клеточными взаимодействиями. Регуляторами этих взаимодействий являются специальные белки — цитокины. Одним из ключевых цитокинов является интерферон. Спектр основных биологических эффектов ИФН: • подавление размножения внутриклеточных инфекционных агентов вирусной и невирусной природы (хламидии, риккетсии, бактерии, простейшие); • антипролиферативная активность; • антитуморогенный эффект; • антитоксическое действие; • антимутагенный эффект; • радиопротективный эффект; • подавление или усиление продукции антител; • стимуляция макрофагов, усиление фагоцитоза; • усиление цитотоксического действия сенсибилизированных лимфоцитов на клетки-мишени; • активация естественных киллерных клеток. Существует три типа природного интерферона: альфа (ИНФ-α), бета (ИНФ-β), гамма (ИНФ-γ). Это интерфероны 1-го поколения. Диагностическую ценность имеет выявление уровня интерферона в сыворотки крови и определение способности лейкоцитов периферической крови продуцировать различные типы интерферонов в ответ на активирующий сигнал (вирусные частицы или иммуномодуляторы). Такое исследование и получило название «Интерфероновый статус». Целью определения интерферонового статуса является: 1. Исследовать способность иммунной системы к развитию адекватных иммунологических реакций в ответ на этиологический фактор. 2. Выявить уровень продукции интерферона в настоящий момент (в норме или на фоне заболевания). 3. Подобрать иммуномодулирующий препарат, на который развивается максимальный ответ иммунокомпетентных клеток для применения в терапевтических целях. Исследование интерферонового статуса включает определение уровня сывороточного интерферона (ИФН), спонтанной продукции ИФН, способности лейкоцитов к стимулированной продукции ИФН-α (под воздействием вируса болезни Ньюкасла), а также способности продуцировать ИФН-γ под воздействием фитогемагглютинина. Показатель «Циркулирующий интерферон», варьирующий в норме от 2 до 8 ед/мл, характеризует суммарное «фоновое» количество всех типов интерферонов, циркулирующих в крови, смесь интерферонов различных типов. У здоровых взрослых и детей старшего возраста в кровотоке определяется незначительная часть интерферона в результате его разведения и быстрого выведения. Процессы продукции и элиминации интерферона находятся в равновесии, и уровень сывороточного интерферона в кровотоке не выходит за пределы нормы. Уровень (циркулирующего) сывороточного интерферона служит объективным суммарным показателем количества данного белка in situ, повышенный уровень — показатель остроты процесса. Анализ информативен, когда необходимо оценить общее количество интерферона: подозрение на генерализованный герпес, гепатит, рассеянный склероз (общее снижение), бронхиальная астма, крапивница (корреляция со степенью тяжести) и др. Определение уровня продукции α- и γ- интерферонов дает важную информацию о потенциальной активности системы интерферона. Взрослые доноры способны к значительной их продукции (до 640 ед/мл для γинтерферона). Все интерфероны обладают противовирусным, иммуномодулирующим, противоопухолевым и антипролиферативным эффектами. ИНФ-α: • обладает выраженным противовирусным и противоопухолевым действием, в этом есть сходство с ИНФ-β; • в меньшей степени проявляет иммуномодулирующие свойства. Основными клетками продуцентами для ИНФ-α являются Влимфоциты, макрофаги (для ИНФ-β — клетки эпителия, фибробласты). Титры ИФН-α в пробах цельной крови — показатель функциональной активности В-лимфоцитов и состояния противовирусной защиты организма; Уровень ИНФ-α в норме варьирует от 128 до 640 ед/мл. ИНФ-γ: • обладает выраженным иммуномодулирующим действием; • вместе с интерлейкином-2 (ИЛ-2) и фактором некроза опухолей (ФНО α) относится к основным провоспалительным цитокинам; • является индуктором клеточного звена иммунитета. Противовирусные и противоопухолевые свойства слабее, чем у ИНФ-α и ИНФ-β. Основными клетками-продуцентами являются Т-лимфоциты, натуральные или естественные киллеры (NK-клетки). Титры ИФН-γ — показатель функциональной активности Тлимфоцитов и способности к активации иммунной системы (в частности, при вирусных инфекциях). Уровень ИНФ-γ в норме варьирует от 32 до 256 ед/мл. Нормализация показателей уровня интерферонов является критерием эффективности терапии, и, как правило, коррелирует с положительной динамикой заболевания. Показатели ИФН-статуса в целом позволяют судить об иммунореактивности организма: 1. У здоровых лиц наблюдается определенное содержание сывороточного интерферона и значительный «запас» продукции α- и γинтерферонов. 2. Стрессы и острые вирусные инфекции, аллергические состояния характеризуются повышением уровня сывороточного интерферона и снижением уровня индуцируемой продукции α- и γ-интерферонов. 3. Хронические вирусные инфекции (герпес, гепатит, рассеянный склероз) сопровождаются глубоким подавлением всех показателей интерферонового статуса. 4. Аутоиммунные заболевания (системная красная волчанка, ревматоидный артрит) характеризуются подавлением индуцируемой продукции α-интерферона, наличием спонтанно вырабатываемого ИФН. 5. Острый лимфолейкоз, злокачественные образования, проказа сопровождаются подавлением индуцируемой продукции γ-интерферона. 6. При бронхиальной астме, крапивнице уровень сывороточного интерферона коррелирует с тяжестью заболевания. Изучение неспецифической резистентности организма Защиту макроорганизма от возбудителей инфекционных болезней обеспечивает не только иммунная система, но и механизмы неспецифического порядка: непроницаемость слизистых и кожных покровов, фагоцитоз, бактерицидное действие лизоцима, а также гуморальные факторы: комплемент, пропердин и др. Количественное определение лизоцима в сыворотке крови Лизоцим — гидролитический фермент, расщепляющий высокомолекулярные полисахариды бактерий (пептидогликан), находится в тканях, секретах, экскретах (за исключением пота и мочи), действует бактерицидно на многие бактерии. Присутствие и активность лизоцима определяют по его способности вызывать лизис бактерии Micrococcus lysodeicticus. Готовят 1%-ный агаровый гель (Дифко) на 0,15M фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБР). В расплавленный агар температурой 60–70 °C вносят ацетоновый порошок биомассы М. lysodeicticus из расчета 10 мг на 100 мл геля. Компоненты перемешивают и разливают в чашки Петри (толщина слоя 4 мм). В застывшем агаре делают лунки диаметром 5 мм. Параллельно определяют активность стандартного лизоцима, кристаллизованного из яичного белка. Для этого лизоцим разводят в 015M ФСБР, чтобы получить разведения с концентрацией 0,5; 1; 3; 5, 10; 20; 40 и 70 мг/мл. По 0,05 мл каждого разведения лизоцима вносят в лунки. Чашки Петри выдерживают 48 ч во влажной камере при 37 °C и измеряют диаметр зоны лизиса М. lysodeicticus вокруг лунок. По полученным данным строят калибровочную кривую, откладывая на осях координат значения концентрации лизоцима и диаметра зоны лизиса. Сыворотку крови разводят в ФСБР в соотношении 1:5, вносят по 0,03 мл в лунки и далее поступают как при определении активности стандартного лизоцима. Измерив диаметр зоны лизиса, по калибровочной кривой вычисляют содержание лизоцима в исследуемой пробе. Количественное определение комплемента в сыворотке крови Комплемент (С) представляет собой сложную систему главным образом неактивных белков крови. Процесс их активации (по классическому пути) запускается образованием комплекса антиген-антитело (АГ-AT) и происходит в виде цепной реакции: комплекс АГ-АТ + С1 + С4 + С2 + С3 + С5 + С6 + С7 + С8 + С9. В процессе активации образуется литический комплекс, который делает мембрану клетки проницаемой, внутрь клетки осмотически поступает вода, в результате клетка набухает и лопается. Такое разрушение клеток (антигенов) под влиянием антител и комплемента получило название иммунного лизиса. Наиболее эффективно комплемент действует на бактериальные клетки в сочетании с лизоцимом. Кроме того, бактериальные клетки (антигены) после взаимодействия с антителами и комплементом легче поглощаются фагоцитами. Количество комплемента в крови (сыворотке крови) определяют в реакции иммунного лизиса с использованием эритроцитов барана и гемолизина в качестве антител к эритроцитам барана. Эритроциты барана, обработанные гомологичными антителами и чувствительные в таком состоянии к литическому действию комплемента, называют гемолитической системой. Количество комплемента измеряют в гемолитических единицах (СН50). За единицу комплемента принимают такое его количество в объеме 0,5 мл, которое за 30 мин при 37 °C обусловливает лизис 50 % эритроцитов в 0,5 мл гемолитической системы (5%-ная суспензия эритроцитов барана в веронал-мединаловом буферном растворе с pH 7,3–7,4 + гемолизин в тройном титре). Исследуемую сыворотку в возрастающих дозах разливают по пробиркам (например, 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,08; 0,10 мл), добавляют ФСБР до 0,5 мл, вносят во все пробирки по 0,5 мл стандартизированной гемсистемы. Одновременно ставят контроль на резистентность эритроцитов (0,5 мл ФСБР + 0,5 мл гемсистемы). Пробирки встряхивают и выдерживают при 37 °C 30 мин, охлаждают при 2–4 °C 10 мин, центрифугируют при 3000 об/мин 15–20 мин, насадочную жидкость колориметрируют и по коэффициенту экстинкции определяют процент гемолиза при помощи заранее построенной калибровочной кривой. Калибровочную кривую строят следующим образом: к 1 мл 5%-ной суспензии эритроцитов добавляют 3 мл дистиллированной воды, эритроциты при этом полностью лизируются (100%-ный гемолиз). Из полученного лизата путем добавления буферного раствора готовят пробы с 10-, 20-, 30-, 40-, 50-, 60-, 70-, 80-, 90%-ным гемолизом. На фотоэлектроколориметре определяют оптическую плотность каждой пробы (кювета шириной 1 мм, синий светофильтр), затем на оси абсцисс откладывают процент гемолиза, а на оси ординат — коэффициент экстинкции. СН50 вычисляют по дозе сыворотки, дающей гемолиз, наиболее близкий к 50 %. Для этого используют специальную формулу (Крога) или, что проще, коэффициенты, рассчитанные по этой формуле. Например, если исследуемая сыворотка в разведении 1:25 дает 30%ный лизис, то СН50 в 1 мл составит 25 · 0,844 = 21,1 ед. Фагоцитоз бактерий К фагоцитирующим клеткам относят полиморфноядерные лейкоциты крови. Поглощение микробной клетки фагоцитом может не сопровождаться гибелью микроорганизма (незавершенный фагоцитоз) или приводить к внутриклеточному перевариванию захваченных бактерий (завершенный фагоцитоз). Белой мыши внутрибрюшинно сначала вводят 2 мл стерильного МПБ, через 2–3 ч — 0,5 мл культуры эшерихий. Спустя 20–40 мин шприцем из брюшной полости отбирают экссудат, делают мазки на предметном стекле, фиксируют спирт-эфиром, окрашивают метиленовым синим (экспозиция 2–3 мин). При микроскопировании можно наблюдать различные стадии фагоцитоза: поглощение, деструкцию (переваривание) клеток (рис. 6 цветной вкладки). Методы оценки активности фагоцитирующих клеток. Для оценки активности фагоцитов используют следующие показатели: 1) фагоцитарный показатель — процент фагоцитирующих клеток от общего числа учтенных нейтрофильных лейкоцитов; Фагоцитарное число — среднее число микробных клеток, поглощенных одним лейкоцитом (характеризует интенсивность фагоцитоза). Определение фагоцитарного показателя: в чистую стерильную центрифужную пробирку вносят 0,2 мл 2%-ного раствора цитрата натрия, 0,1мл крови, взятой у морской свинки или кролика, и 0,05 мл суспензии убитых нагреванием бактерий S. epidermidis, E. coli или др. (концентрация 0,5·109 клеток по оптическому стандарту мутности). Компоненты перемешивают и выдерживают при 37–38 °C 30 мин, затем центрифугируют при 2500–3000 об/мин 15–20 мин до образования прозрачного слоя плазмы, слоя эритроцитов и тонкого сероватого среднего слоя лейкоцитов. Осторожно отсасывают плазму, пипеткой берут средний слой, делают три—пять мазков и окрашивают по методу Романовского – Гимзы. Препарат микроскопируют, подсчитывают не менее 100 нейтрофильных лейкоцитов и определяют среди них число (%) фагоцитирующих. Определение фагоцитарного числа. В мазках, которые были приготовлены для определения фагоцитарного показателя, подсчитывают 100 нейтрофильных лейкоцитов и суммарное количество захваченных ими бактериальных клеток, затем определяют фагоцитарное число. Например, 100 лейкоцитов поглотили 500 бактериальных клеток, следовательно, фагоцитарное число равно 500 : 100 = 5,0. Определение опсоно-фагоцитарного индекса. Интенсивность фагоцитоза повышается благодаря антителам — опсонинам, взаимодействующим с микробными клетками. Чтобы определить опсонофагоцитарный индекс, сравнивают активность фагоцитов в нормальной и исследуемой (иммунной) сыворотках. Пастеровской пипеткой набирают на высоту капилляра около 2 см сначала суспензию бактериальных клеток (0,5·109/мл), затем лейкоцитов и, наконец, исследуемую сыворотку. На предметном стекле компоненты перемешивают при помощи пипетки, затем вновь набирают в капилляр, конец которого запаивают. Капилляр помещают в термостат при 37 °C на 30 мин. После инкубирования смесь выливают на предметное стекло, готовят мазок и окрашивают его метиленовым синим (1 мл насыщенного спиртового раствора на 30 мл дистиллированной воды). Аналогичным образом готовят препарат с нормальной (контрольной) сывороткой. Оба препарата микроскопируют, просматривают 100 нейтрофильных лейкоцитов, определяют количество фагоцитированных бактерий, рассчитывают фагоцитарное число в каждой сыворотке и затем опсоно-фагоцитарный индекс исследуемой сыворотки. Например, в 100 лейкоцитах нормальной сыворотки фагоцитировано 200 бактерий, следовательно, фагоцитарное число 200 : 100 = 2. В 100 лейкоцитах исследуемой иммунной сыворотки захвачено 500 бактерий, и фагоцитарное число 500 : 100 = 5. Опсоно-фагоцитарный индекс показывает, во сколько раз процесс фагоцитоза в иммунной сыворотке интенсивнее, чем в нормальной. Его вычисляют делением фагоцитарного числа иммунной сыворотки на фагоцитарное число нормальной сыворотки. В приведенном примере опсонофагоцитарный индекс составит 5,0 : 2,0 = 2,5. Проточная цитофлуориметрия Метод проточной цитофлуориметрии (ПЦ) основан на измерении определенных свойств клеток, вводимых в поток жидкости. Проточный цитометр состоит из трех основных блоков: оптического, где производится измерение, блока обработки сигналов, где сигналы усиливаются и преобразуются из оптических в электрические, блока сбора и обработки данных (компьютер). Оптический блок предназначен для измерения рассеивания света и флуоресценции. Клетки вводят в поток жидкости, ширина которого составляет 50–100 мкм. На струе сфокусирован лазер. В момент прохождения клеток через луч лазера они рассеивают свет во всех направлениях и испускают небольшое количество света за счет флуоресценции. Переднее рассеивание света в направлении лазерного пучка обусловлено многими параметрами исследуемого объекта, в том числе размером клетки. На основе данного параметра можно отличать жизнеспособные лимфоциты от мертвых и эритроцитов. Перпендикулярное или боковое рассеяние света под углом 90° по отношению к лазерному лучу позволяет различать популяции клеток, таких как лимфоциты, моноциты, нейтрофилы. Флуоресцентные сигналы измеряют с помощью разделяющих, дихроических и обычных зеркал. В большинстве проточных цитометров удается одновременно измерять несколько флуоресцентных сигналов, что дает возможность определять фенотип клетки, степень ее активации, стадию дифференцировки и другие дополнительные характеристики. В блоке обработки поступающие от детектора сигналы усиливаются и сравниваются на основе выбранных критериев с заданными параметрами. Эта операция позволяет определять, является ли регистрируемое событие тем, которое нас интересует. Выбор интересующих нас событий называется дискриминацией, а ограничения, накладываемые на регистрируемый параметр, — окнами. Выбор окон — одна из важнейших операций при работе специалиста на цитометре. Включение определенных субпопуляций в анализ и исключение их из него существенно влияют на результаты анализа образцов и зависят от профессионализма специалиста. Из блока обработки сигналы посылаются в блок хранения компьютера. Обычно данные представляют в виде распределений частот встречаемости одного или двух параметров. Эти распределения называют гистограммами, или профилями. Критическим моментом для адекватного использования цитометра является выбор флуорохрома. Идеальный флуорохром должен обладать следующими свойствами: 1) возбуждаться при нужной длине волны: для цитометра»FacScan» длина волны возбуждения аргонового лазера составляет 488 нм; 2) легко связываться с белками; 3) обладать низким уровнем неспецифического связывания окрашивания; 4) отдавать энергию возбуждения в виде флуоресценции, т.е. иметь высокий квантовый выход; 5) излучение флуорохрома должно лежать в зоне максимальной чувствительности фотодетектора; 6) длины волн излучаемого флуорохромом света не должны совпадать с длинами волн аутофлуоресценции (флуоресценции молекул, присутствующих в анализируемых клетках, но не имеющих отношения к флуорохрому); 7) допускать использование в одном опыте данного флуорохрома одновременно с другими. Стандартным флуорохромом, применяемым в проточной цитометрии, стал флуоресцеинизотиоционат (ФИТЦ), излучающий в зеленой части спектра. Другая удачная находка — флуорохром фико-эритрин, который возбуждается светом той же длины волны, что и ФИТЦ, но излучает в красной части спектра. Это дало возможность применять его в паре с ФИТЦ при «двойном окрашивании». Клиническое значение результатов исследования иммунного статуса Главными задачами при оценке иммунного статуса являются иммунодиагностика нарушений иммунной системы, прогнозирование тяжести патологического процесса, оценка эффективности проводимого лечения и профилактика. Идентификация нарушенного звена иммунной системы дает возможность подтвердить (или отклонить) клинический диагноз. Выделяют клинические признаки иммунологической недостаточности, которые включают 4 основных синдрома: 1) инфекционный синдром (рецидивирующие, хронические инфекции); 2) аллергический синдром; 3) аутоиммунный синдром; 4) иммунопролиферативный синдром. Иммунодиагностика при перечисленных синдромах имеет значение для изучения этиопатогенеза заболевания, прогнозирования обострения, для выбора метода лечения и оценки его эффективности. Методы иммунодиагностики можно разделить на скрининговые и уточняющие. Первые существуют для фиксирования нарушений в иммунной системе, вторые — для установления механизмов, задействованных в их реализации с целью дальнейшей иммунокоррекции. Стандартный скрининговый тест включает: • подсчет абсолютного количества лейкоцитов, нейтрофилов, лимфоцитов и тромбоцитов; • определение концентрации сывороточных иммуноглобулинов различных классов (IgG, IgA и IgM); • определение гемолитической активности системы комплемента CH50; • проведение кожных тестов гиперчувствительности замедленного типа. Гематологический анализатор-автомат (рис. 24) предназначен для: Рис. 24. Coulter MAXM — настольный автоматический гематологический анализатор на 26 параметров (существует вариант для ветеринарии) • измерения параметров классической гемограммы; • дифференциального анализа пяти популяций лейкоцитов; • гистограммы распределения эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов; • диаграммы лазерного лейкоцитарного анализа (индикация патологии); • определения количества ретикулоцитов, их объема и показателя зрелости. Более детальное изучение иммунного статуса включает изучение количества и функциональной активности клеточного и гуморального звеньев иммунной системы: • Исследование фагоцитарной функции. • Исследование системы комплемента. • Исследование Т-системы иммунитета. • Исследование В-системы иммунитета. Рациональным считается исследование иммунного статуса в несколько этапов. Вначале проводятся ориентировочные исследования для выявления значительных дефектов иммунной системы (1-й уровень), затем можно провести более подробное изучение (2-й уровень) основываясь на данных предыдущего исследования. Тесты 1-го уровня: • Исследование фагоцитарной функции: – подсчет абсолютного числа фагоцитов (нейтрофилов и моноцитов); – оценка интенсивности поглощения микробов фагоцитами; – способности фагоцитирующих клеток переваривать захваченные микробы. • Исследование система комплемента: – определение гемолитической активности комплемента CH50. • Исследование Т-системы иммунитета: – подсчет общего числа лимфоцитов; – подсчет процента и абсолютного числа зрелых T-лимфоцитов (CD3) и двух основных их субпопуляций: хелперов/индукторов (CD4) и киллеров/супрессоров (CD8); – определение пролиферативного ответа на основные T-митогены (фитогемагглютинин и конканавалин A). • Исследование В-системы иммунитета: – определение концентрации иммуноглобулинов различных классов (G, A, M, E) в сыворотке крови; – определение процента и абсолютного количества B-лимфоцитов (CD19, СD20) в периферической крови. Тесты 2-го уровня: • Исследование фагоцитарной функции: – оценка интенсивности хемотаксиса фагоцитов; – определение экспрессии молекул адгезии (CD11a, CD11b, CD11c, CD18) на поверхностной мембране нейтрофилов. • Исследование Т-системы иммунитета: – исследование продукции цитокинов (интерлейкина-2 (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6; гамма-интерферона (ИФН-γ); фактора некроза опухоли (ФНО α)); – определение активационных молекул на поверхностной мембране Tлимфоцитов (CD25, HLA-DR); – выявление молекул адгезии (CD11a, CD18); – исследование пролиферативного ответа на специфические антигены, чаще всего на дифтерийный и столбнячный анатоксины; – проведение аллергической реакции с помощью кожных тестов с рядом микробных антигенов. • Исследование В-системы иммунитета: – субклассов иммуноглобулинов, особенно IgG; – секреторного IgA; – исследование соотношения κ (каппа) и λ (лямбда) цепей иммуноглобулинов; – определение специфических антител к белковым и полисахаридным антигенам; – исследование способности лимфоцитов к пролиферативному ответу на митогены B(стафилококк, липополисахарид энтеробактерий) и T-B (митоген лаконоса). Определение чувствительности к иммуномодуляторам До клинического применения иммуномодуляторов предварительная оценка индивидуальной чувствительности организма к ним оказывается существенно эффективной. Действие иммуномодуляторов определяется особенностями иммунной системы, в частности взаимосвязанным и взаимозависимым функционированием клеточных элементов, участвующих в развитии иммунного ответа. Крайне важным подходом к назначению иммунокорректоров является предварительное вычленение основного пораженного звена иммунитета и адресная доставка иммуномодуляторов, ибо в противном случае применение иммуномодулирующих средств может быть неэффективным. Разработка новых подходов к оценке иммуномодулирующей эффективности новых препаратов положительным образом сказывается на развитии клинической иммунологии и создании новых методов определения состояния иммунной системы человека и показаний для назначения иммуномодулирующих средств и контроля за проводимой терапией. Глава 4. Гибридомная технология. Получение и использование моноклональных антител Термины АОК — антителообразующая клетка; плазматическая клетка; зрелый Влимфоцит. ГАТ — питательная среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин, тимидин. ГГФРТ — фермент гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансфераза. Катализирует синтез нуклеотидов. ДМЕМ — питательная среда Игла специальная. ДМСО — диметилсульфоксид. Стабилизатор. ПЭГ — полиэтиленгликоль. Фидер — вспомогательная культура клеток, выполняющая функции по детоксикации среды и подкормки основной культуры клеток. ФСТ — фетальная сыворотка теленка. Гибридомную технологию с полным правом можно назвать методом иммунобиотехнологии с очень широким диапазоном применения: от диагностики и лечения заболеваний разной этиологии до судебной экспертизы. В ветеринарной практике данный метод с успехом применяется для получения моноклональных антител, уникальная структура которых как раз позволяет проводить точную специфическую диагностику болезней, вызванных инфекционными агентами. В представленном методическом пособии изложен общий иммунобиотехнологический принцип получения гибридом, способных секретировать специфические антитела заданной направленности. При введении в организм животных и человека чужеродных макромолекулярных веществ — белков или полисахаридов (антигенов) — в крови появляются защитные белки — антитела, для которых характерна необыкновенная, уникальная специфичность. Каждое антитело узнает только свой антиген, точнее, одну его детерминантную группу. Детерминантная группа состоит из нескольких аминокислот (обычно из 6–8), образующих пространственную структуру, характерную для данного белка. В одном белке, состоящем из нескольких сот аминокислот, имеется несколько (от 5 до 15) разных детерминант, поэтому к одному белку образуется целое семейство различных по своей специфичности антител. Даже к одной детерминанте образуется целый спектр антител, отличающихся по структуре, степени специфичности и прочности связывания с ней. То же относится и к полисахаридным антигенам, детерминантные группы которых образуются 3–6 остатками моносахаридов. Таким образом, при введении антигена возникает большое семейство антител, направленных к разным его детерминантам. В крови иммунизированных животных появляется богатый и уникальный по составу спектр антител, который и обеспечивает их абсолютную специфичность в распознавании данного антигена. Однако иногда требуются не многокомпонентные смеси антител, а отдельные, элементарные составляющие этой смеси, направленные лишь к одной детерминанте антигена и имеющие одни и те же характеристики. Но получить такие антитела путем иммунизации невозможно по причине образования большого разнообразия антител, индуцируемых даже одним антигеном. Дело в том, что в организме в процессе созревания антителообразующих клеток (АОК) образуется большое количество генетически однородных семейств клеток-клонов, каждый из которых специализируется на синтезе только одного варианта антител. Таких клонов много больше, чем требуется антител для распознавания любого, случайно взятого антигена. Антиген, попадая в организм, стимулирует размножение тех клонов, которые продуцируют антитела к его детерминантам (в этом, кстати, суть клонально-селекционной теории Бернета). Казалось бы, выход прост: надо вырастить отдельные клоны АОК в пробирке — в культуре тканей — и они будут продуцировать моноклональные антитела, т.е. антитела одной строго определенной специфичности, продукт одного клона. Но нормальные клетки смертны, вскоре после высаживания в культуру они погибают. Дело не доходит до образования АОК. Добавление в культуру факторов роста несколько продлевает их жизнь, но тоже не решает проблемы. Гибридомы В 1975 г. иммунологи Георг Келер и Цезарь Мильштейн разработали оригинальный подход к этой проблеме: решили получить гибрид нормальной АОК и опухолевой клетки. В случае успеха такой гибрид унаследовал бы от нормальной клетки способность к синтезу антител, а от опухолевой — бессмертие и способность к неограниченному и бесконтрольному росту. Это им удалось осуществить. Методы гибридизации соматических (т.е. не половых) клеток к тому времени были хорошо известны и широко применялись для разных целей. Для этого использовали вирус, способствующий слиянию клеток. Разнородные клетки, у которых слились оболочки, образовывали двухъядерные гибриды, которые сохраняли способность к клеточным делениям. В процессе клеточного деления хромосомы обоих ядер перемешивались и образовывали общее ядро. Таким образом возникал истинный гибрид, потомок двух соматических клеток, или гибридома. Гибридому можно получить и между нормальной АОК и опухолевой, плазмоцитомной клеткой. Плазмоцитома была взята потому, что она больше всего соответствовала АОК по типу дифференцировки. Весь ее синтетический аппарат был настроен на синтез иммуноглобулинов. Проблема заключалась в том, как отделить образовавшуюся гибридому от присутствующих в системе отдельных неслившихся клеток и от гибридов иного состава или иной специфичности, чем требуемые. Для достижения этой цели авторы разработали специальную схему, использующую отбор клеток в селектирующей среде. Прежде всего, был получен особый мутант мышиной плазмоцитомы, рост которой можно было контролировать составом питательной среды. Для получения мутанта использовали особенности синтеза нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), имеющихся во всех клетках и необходимых для их существования. Известно, что имеется два пути синтеза предшественников нуклеиновых кислот: основной и резервный. Основной — это путь новообразования нуклеотидов, звеньев, входящих в состав нуклеиновых кислот. Этот путь включает несколько этапов и блокируется противоопухолевым препаратом аминоптерином (А). Однако клетки не гибнут от этого препарата, поскольку обладают резервным путем — способностью синтезировать нуклеотиды и нуклеиновые кислоты, реутилизируя продукты распада ранее синтезированных нуклеиновых кислот; гипоксантина (Г) и тимидина (Т). Добавление Г и Т в питательную среду, содержащую А, снимает токсический эффект последнего. Синтез нуклеотидов по второму пути может происходить лишь в том случае, когда в клетке присутствует фермент гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза (ГГФРТ). Для селекции гибридом надо было получить мутант плазмоцитомы, не способный пользоваться резервным путем и, следовательно, погибающий в среде, содержащей Г, Т и А (ГАТсреда). Такой мутант получили путем добавления в среду токсических аналогов Г и Т. Все клетки, способные усваивать Г и Т, включали их токсичные аналоги и погибали. Выживали лишь те редкие мутанты, которые были не способны усваивать Г и Т, т.е. были лишены резервного пути. Из потомства этих клеток дополнительно отбирали еще и такие мутанты, которые утратили способность к синтезу собственных иммуноглобулинов. Теперь все было готово для получения гибридом, т.е. гибридов нормальных АОК и плазмоцитомных клеток. Мышей интенсивно иммунизировали определенным материалом — белком, бактериальной клеткой или клеткой животного происхождения. Когда в их крови появлялись антитела, у мышей брали селезенку и лимфатические узлы (места скопления АОК) и готовили из них взвесь клеток. К ней добавляли в избытке клетки мутантной плазмоцитомы и полиэтиленгликоль (ПЭГ). После короткой инкубации, требующейся для слияния клеток, их отмывали от ПЭГа и помещали в ГАТ-среду. Теперь в системе находились гибриды АОК и АОК, АОК и плазмоцитомы, а также оставшиеся свободными АОК и клетки плазмоцитомы. Из них нужно было отобрать только гибриды АОК и плазмоцитомы. После недолгого (несколько дней) культивирования одиночные АОК, а также гибриды АОК и АОК погибали, так как нормальные клетки смертны и быстро погибают в культуре. Плазмоцитомные клетки и их гибриды тоже погибали, так как А блокировал основной путь синтеза предшественников нуклеиновых кислот, а Г и Т их не спасали. Выживали, следовательно, только гибриды АОК и плазматических клеток, так как бессмертие они унаследовали от плазмоцитомы, а резервный путь — от нормальной клетки. Такие гибриды — гибридомы — сохраняли способность синтезировать и секретировать антитела. Техника их получения была названа гибридомной технологией (рис. 16). Рис. 16. Схема получения моноклональных антител Культивирование и поддержание гибридом В настоящее время для получения гибридом используют только такие линии миеломных клеток, которые не секретируют свои собственные иммуноглобулины. Гибридомы, полученные в результате слияния с такими вариантами, продуцируют только антитела спленоцитов. Существует много различных типов маркированных (дефектных по ГГФРТ) миеломных клеточных линий лабораторных животных (мышь, крыса) и человека. Особенностью этих линий является устойчивость к антиметаболитам (ядам) — аналогам пуриновых оснований (8-азагуанин, 6-тиогуанин и др.), которая является наследственным признаком, обусловленным генной мутацией, и связана с утратой гена ГГФРТ (табл. 19). Таблица 1. Миеломные линии, использующиеся для получения гибридом № п/п Клеточная линия Общепринятое обозначение 1 P3-x63/Aq8 Х6З 2 Fox-NY Fox 3 NS-1/1Ag14.1 NS-1 4 Sр2/О-Ag Sp2/0 5. X63-Ag8.653 X653 * Линия устойчива к 8-азагуанину. Устойчивость 8-Ag* 8-Ag* 8-Ag* 8-Ag* 8-Ag* Лимфоциты получают от животных, обычно мышей, которых иммунизируют специфическим антигеном. Смесь лимфоцитов и миеломных клеток после слияния в среде, содержащей ПЭГ, культивируют в полистироловых планшетах для тканевых культур в присутствии фидеров (фибробластов или перитонеальных макрофагов) на среде ГАТ. Через 12–17 дней гибридные клетки образуют макроскопические колонии на подстилке кормящих клеток. Супернатант каждой культуры проверяют на присутствие специфических антител. Культуры гибридом, секретирующие специфические антитела, наращивают, клонируют, замораживают и используют для изучения характеристик содержащихся в ней мАТ. Клоны гибридом, продуцирующих мАТ необходимой специфичности, вводят в брюшную полость обработанных пристаном мышей для получения асцитов. 10 мл асцитической жидкости вполне достаточно для выполнения обширных исследовательских программ, поэтому клоны гибридом не поддерживают постоянно как растущую культуру, а замораживают и восстанавливают по мере надобности для наработки больших количеств мАТ. Необходимое оборудование: • Бокс для вирусологической работы. • Бокс для работы с культурой клеток. • Шкаф с вертикальным ламинарным потоком воздуха. • СО2-инкубатор, содержание СО2 соответствует 5–7 %. • Центрифуги высокоскоростные. • Люминесцентный и инвертированный микроскопы. • Суховоздушный и жидкостный термостат. • Низкотемпературный холодильник (температура –20...–70 °C). • Холодильник бытовой (+4 °C). • Сосуды для криоконсервации (СДС-20, СДС-30). • Центрифуга настольная лабораторная 1000–8000 об/мин. • Магнитная мешалка. • Многоканальные пипетки на 50–250 мкл. • Одноканальные пипетки на 2, 10, 50 и 100 мкл. • Планшеты для культивирования клеток 4-, 6-, 12-, 24- и 96-луночные. • Чашки Петры полистироловые. • Гомогенизаторы стеклянные. • Стерильная лабораторная посуда. Получение иммунных лимфоцитов Гибридомы образуются при слиянии устойчивых к 8-азагуанину миеломных клеток с синтезирующими антитела В-лимфоцитами, еще не полностью дифференцированными в зрелые плазматические клетки. Поэтому все процедуры гибридизации предусматривают взятие лимфоцитов у иммунизированного животного в первые 6 дней после введения последней дозы антигена, т.е. до полной дифференциации их в плазматические клетки. Лимфоциты многих видов животных обладают способностью образовывать жизнеспособные антителопродуцирующие гибридомы при слиянии с клетками мышиной миеломы. Однако использование в качестве источника лимфоцитов мышей линии BALB/c открывает гораздо большие перспективы. Гибридомы «мышь-мышь» более стабильны и секретируют большие количества антител, чем межвидовые гибриды. Мышиные линии РЗ, Х653, NS-1, SP2/0, которые обычно используются для слияния, несут антигены гистосовместимости BALB/c. Образующиеся в результате слияния гибридомы при этом будут нести только BALB/c антигены гистосовместимости, что позволяет выращивать их в брюшной полости мышей этой линии. При этом продукция антител гибридомой этой линии превышает продукцию in vitro более чем в 1000 раз. Для иммунизации мышей не обязательно использовать высокоочищенные антигены, так как каждая полученная гибридома будет продуцировать антитела лишь к одной антигенной детерминанте (эпитопу). Тем не менее повышение степени очистки антигена увеличивает процент гибридом, синтезирующих антитела необходимой специфичности. Культивирование клеток перевиваемой мышиной миеломы Sр2/0 Клетки мышиной миеломы Sp2/0 дефектны по ферменту ГГФРТ, что обусловливает их чувствительность к среде ГАТ и устойчивость к антиметаболиту 8-азагуанину. Иногда миеломные клетки теряют устойчивость к 8-азагуанину и приобретают способность расти и размножаться в среде ГАТ. При использовании таких реверантных клеток для гибридизации они будут расти в селективной среде, тормозить рост и маскировать наличие образовавшихся гибридом. И хотя у линии Sp2/0 очень низкий процент реверсий по сравнению с другими миеломами мышей, рекомендуется культивирование этих клеток в среде, содержащей 8азагуанин. Методика. Клетки миеломы культивируют при 37 °C в стеклянных матрасах на 100 или 200 мл, в среде ДМЕМ, содержащей 10 % фетальной сыворотки теленка (ФСТ) и 15 мкг/мл 8-азагуанина. Посевная концентрация клеток 1–1,5×105/мл. Обычно клетки растут довольно быстро и требуют субкультивирования раз в 2-3 дня. Удвоение клеточной популяции происходит за 15–20 часов. Субкультивирование выполняют энергичным встряхиванием матраса (для отделения прикрепившихся к стеклу клеток) и заменой 1/2 или 2/3 среды на свежую. Ежемесячно культуры необходимо переводить в чистые культуральные матрасы. Для стимуляции пролиферативной активности клетки миеломы в течение недели перед слиянием необходимо субкультивировать ежедневно или раз в два дня. За 24 часа до гибридизации активно растущую культуру миеломы субкультивируют замещением половины суспензии клеток свежей гибридомной средой (ГС) с 20 % ФСТ, но без 8-азагуанина. Кондиционированная среда Клетки гибридом плохо растут и часто погибают при культивировании в низких концентрациях, например при субкультивировании и клонировании. Для того чтобы обеспечить их выживание в таких условиях, применяют несколько технологических приемов. Одним из примеров может быть добавление к культуре гибридом клеток селезенки мыши. В качестве фидеров (подкармливающих клеток) могут использоваться тимоциты или культуры перитонеальных макрофагов. Альтернативным способом культивирования клеток гибридом при их низкой концентрации является культивирование в кондиционированной среде, обеспечивающее выживание и рост гибридом даже в концентрациях, близких к 1 клетке в миллиметре. Кондиционированная среда — это ДМЕМ с 20 % ФСТ, в которой росли клетки миеломы в течение 2-3 циклов деления (24–36 часов). Лучшей кондиционированной средой является среда красновато-оранжевого цвета (в начале закисления). Методика. Клетки мышиной миеломы культивируют в среде, содержащей 8-азагуанин. Для получения кондиционированной среды трехкратно с 2-дневным интервалом заменяют всю среду с 8-азагуанином на культуре миеломных клеток свежей ДМЕМ с 10% ФСТ, но без 8-азагуанина. Для получения больших объемов кондиционированной среды клетки миеломы выращивают в стеклянных матрасах емкостью 100–200 мл. Через два дня после третьей смены среда ДМЕМ с 10 % ФСТ меняется на ДМЕМ с 20 % ФСТ. Через 24–36 часов эту среду сливают; если в ней много клеток, то ее центрифугируют; для полного удаления клеток среду фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. К культуре миеломы снова добавляют ДМЕМ с 20 % ФСТ, которая снова кондиционируется через 24–36 часов. Так как при каждой смене среды часть клеток удаляется, оставшиеся клетки продолжают активно делиться. Поэтому кондиционирование можно продолжать неограниченно долго, следя за тем, чтобы миеломные клетки были здоровыми и активно делились. Если кондиционированная среда не требуется в течение какого-либо периода времени, клетки культивируют снова в среде с низким содержанием сыворотки (10 %). При необходимости их вновь переводят на ДМЕМ с 20 % ФСТ. Нельзя помещать культуры, используемые для получения кондиционированной среды, в среду с 8-азагуанином. Кондиционированную среду обычно используют свежей. Допустимо хранение короткий период при комнатной температуре или при –20 °C. Приготовление культур перитонеальных макрофагов мышей Культуры макрофагов готовят за 1-2 дня до слияния. Макрофаги служат в качестве фидеров, т.е. подкармливающих клеток, устраняют токсичность среды, очищают культуры от клеточного детрита и обеспечивают обогащение среды ростовыми факторами, что создает наиболее благоприятные условия для роста молодых культур гибридом, образующихся после процедуры гибридизации. Макрофаги используют также в пластиках для клонирования с теми же целями. Методика. Здоровых аутбредных (беспородных) мышей обескровливают декапитацией, поверхность тела мышей обрабатывают 70%ным этанолом. Внутрибрюшинно каждой мыши вводят 10 мл охлажденной до +4 °C ДМЕМ без сыворотки. Стенки брюшной полости тщательно массируют. Через 5–10 мин мышей фиксируют, вновь обрабатывают 70%ным этанолом. Брюшную стенку прокалывают стерильной инъекционной иглой и с помощью стерильного шприца аспирируют как можно больше жидкости из брюшной полости. Жидкость переносят в стерильные пенициллиновые флаконы по 10 мл, осторожно подслаивают около 1 мл ФСТ и центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин. Надосадок отбрасывают. Осадок клеток растворяют в гибридомной среде до концентрации 50 000 клеток на миллилитр и распределяют по 50 мкл в лунки 96-луночных культуральных пластин. Макрофагов, полученных от одной мыши, обычно достаточно на 5– 10 пластин. Культуры инкубируют при 37 °C в атмосфере влажного воздуха с 5–6 % СО2. Через 2–3 часа наблюдается прикрепление макрофагов к полистиролу и их трансформация. Перед выполнением гибридизации культуры макрофагов тщательно проверяют микроскопически на отсутствие контаминации. Пластины с проростом выбрасывают. Процедура гибридизации • За сутки перед слиянием активно растущую культуру миеломы субкультивируют (1/2 часть суспензии клеток.) в свежей гибридомной среде с 20 % ФСТ, но без 8-азагуанина. При этом через 24 часа культура будет находиться в логарифмической фазе роста. На каждую мышиную селезенку необходимо около 20 млн клеток миеломы (в пределах 50 мл культуры). • В день слияния проверяют культуры мышиных перитонеальных макрофагов на контаминацию. • Все необходимые среды и 0,83%-ный хлорид аммония помещают в водяной термостат (37 °C). 2 г ПЭГ-4000 растворяют в 3 мл ДМЕМ без сыворотки, нагретой до 37 °C, добавляют несколько капель 2,5%-ного раствора бикарбоната натрия для достижения уровня pH, близкого к 8, и 2-3 капли ДМСО. • Иммунную мышь с наивысшим титром антител обескровливают декапитацией. Кровь тщательно собирают в стерильный флакон для последующего серологического исследования. Мышь фиксируют в спинном положении. При помощи стерильных инструментов вскрывают брюшную полость, захватывают селезенку, отрезают ее от сальника и переносят в чашку Петри с 1,5–2,0 мл ДМЕМ без сыворотки. • Ополаскивают селезенку в. среде. Переносят в стерильный гомогенизатор и наливают в него 10–15 мл холодной ДМЕМ без сыворотки, затем осторожно выдавливают пульпу селезенки. Клеточную суспензию переносят в центрифужный стакан, дают суспензии отстояться в течение 5 мин. За это время крупные конгломераты клеток осядут. После этого стерильной пипеткой тщательно собирают надосадок, переносят его в другую пробирку, в которой будет проводиться слияние клеток. • Стерильной пастеровской пипеткой осторожно подслаивают ГАТ на дно пробирки под суспензию селезеночных клеток. Завинчивают крышку и центрифугируют пробирку в течение 10 мин при 1000 об/мин. Живые клетки пройдут через сыворотку и сформируют осадок. Клеточный детрит останется в интерфазе между средой и сывороткой. Надосадок отбрасывают, а осадок ресуспендируют в 5 мл 0,83%-ного раствора хлорида аммония, нагретого до 37 °C. Происходит лизис эритроцитов. Через 1–2 мин. добавляют 10–15 мл ДМЕМ с 10 % ФСТ, доливают 2 мл сыворотки и вновь центрифугируют. • Берут 3-4 матраса с активно растущими клетками миеломы. Энергичными движениями отделяют прикрепившиеся клетки и их суспензию переносят в стерильную центрифужную пробирку с закручивающейся крышкой. Клетки центрифугируют в течение 6–10 мин при 1000 об/мин. • После того как клетки отцентрифугируются, надосадок отбрасывают. Сравнивают объем осадков миеломных и селезеночных клеток. На 1 клетку миеломы должно приходиться не более 10 спленоцитов. • Ресуспендируют оба осадка в 5 мл бессывороточной ДМЕМ. Затем каждую суспензию сливают в соответствующих пропорциях в центрифужную пробирку. Смесь разбавляют бессывороточной ДМЕМ до 50 мл и центрифугируют в течение 6–10 мин при 1000 об/мин. • Осадок клеток осушают, удаляя при помощи пипетки всю надосадочную жидкость. Постучав по дну пробирки, разбивают осадок, добавляют в пробирку 1 мл стерильного 40%-ного раствора ПЭГ-4000, нагретого до 37 °C, и тщательно суспендируют в нем клетки. Через 60 с добавляют по каплям безсывороточной ДМЕМ, затем через 60 с еще 4 мл среды, перемешивая содержимое покачиванием пробирки. Выждав еще 60 с, впрыскивают в пробирку струей 8 мл теплой ДМЕМ. • Через 30 мин клетки центрифугируют, надосадок отбрасывают. Осадок клеток растворяют в теплой гибридомной среде с 20 % ФСТ (или ГС) до конечного объема 50–100 мл и концентрации селезеночных клеток 10 на мл. Конечную суспензию распределяют по 100 мкл в 96-луночные планшеты с 1–2-дневными культурами мышиных перитонеальных макрофагов. Планшеты инкубируют в СО2-инкубаторе при 37 °С и 5 % СО2. • На следующий день добавляют в каждую лунку по 100 мкл ГС с 2кратной концентрацией ГAT. Проверяют планшеты на контаминацию. В первые 2 недели культивирования используют ГАТ-среду, затем 1–2 недели используют среду ГТ и в последующем — ГС с 20–15 % ФСТ. Сменять необходимо только половину среды, так как 100%-ная свежая среда губительна для многих гибридом. Микроскопические колонии гибридом можно заменить на 4–8-й день после слияния. При просматривании колоний снизу белые колонии гибридом будут заметны через 10 дней после гибридизации. Так как антителопродуцирующие клетки могут быть смешаны с непродуцирующими, необходимо немедленное их клонирование сразу же после установления продукции специфических антител. Рост и субкультивирование гибридом Гибридные клетки, растущие в ГАТ, через 7–12 дней формируют в лунках микроскопически различимые колонии. Количество их в планшетах может быть различным, что зависит от посадочной концентрации клеток, эффективности гибридизации. Первые 5–7 дней среду в планшетах не меняют. В дальнейшем 2-3 раза в неделю производят замену 1/2–1/3 части культуральной среды на свежую ГАТ-среду с 20 % ФСТ. Большинство колоний гибридных клеток хорошо растут, активно истощают среду и требуют более частой ее смены, чем плохо растущие колонии. Культуры с плохим ростом требуют более осторожного обращения, беспокоить их необходимо как можно меньше и добавлять только 2-3 капли свежей среды в неделю. Скрининг. На 14–21-й день, когда большинство колоний начнут активно расти (о чем судят по быстрому закислению среды культивирования), необходимо проводить тестирование гибридомных супернатантов на присутствие антител. Общепринятым методом скринирования гибридомных культур на специфическую активность является непрямой вариант твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Метод лишен многих недостатков, характерных для тестов вирусной нейтрализации, иммунодиффузии, РСК, РЗГА, ИМФА и др., поскольку основан на обнаружении просто специфического взаимодействия антител с антигеном, а не на выявлении последующего взаимодействия. Так как некоторые гибридомы продуцируют низкие титры антител при культивировании в среде с пониженным содержанием сыворотки, необходимо первые две недели использовать среду, содержащую 20 % ФСТ. После тестирования отмечают те лунки пластин, культуральная среда в которых содержала антитела к антигенам вируса. Большинство положительно реагирующих лунок будут содержать гибридные клетки. Присутствие антител в культуральной жидкости небольшой части прореагировавших лунок, не содержащих гибридных клонов, объясняется наличием в них фрагментов селезенки, в которых антителопродуцирующие спленоциты некоторое время сохраняют свою жизнеспособность, поэтому через 5–6 дней проводят повторное тестирование. Обычно за это время спленоциты погибают и положительная реакция отмечается лишь в лунках с антителопродуцирующими гибридами. После тестирования проводят субкультивирование клонов из положительно прореагировавших лунок. Для субкультивирования используют 96-луночные культуральные планшеты с 1–2-дневными культурами перитонеальных макрофагов. В каждую лунку переносят по одному клону из положительных лунок исходных планшет. Через 3–5 дней культивирования пересаженных клонов их жизнеспособность проверяют в инвертированном микроскопе и вновь тестируют гибридомные супернатанты на присутствие антител. Так как неклонированные гибридомы часто теряют способность продуцировать антитела, их необходимо как можно раньше клонировать. После клонирования гибридомы наращивают для замораживания, а также для получения содержащей моноклональные антитела культуральной жидкости. Для этого клоны с наиболее интенсивной продукцией выращиваются в лунках 96-луночной планшетах до образования почти сплошного монослоя, после чего каждый клон переносится в отдельную лунку 24-луночной пластины с фидерными клетками. К этому времени среду ГАТ заменяют на ГТ, не содержащей аминоптерина. Через 2-3 дня, когда эти культуры подрастут и покроют около 70% поверхности роста, их делят в две другие группы и т.д., наращивая каждый клон до необходимого количества клеток. Культуры гибридом, находящиеся в стадии логарифмического роста, криоконсервируют. Часть клеток, оставшихся после криоконсервации клонов, вновь интенсивно выращивают в ГС, содержащей 20 % ФСТ, до образования сплошного монослоя. Для получения моноклональных антител с целью предварительного исследования их характеристик среду в лунках не меняют 4–5 дней. Когда среда пожелтеет, но клетки еще сохраняют жизнеспособность, ее отбирают, центрифугируют и хранят в стерильных флаконах при –4 °C. При необходимости культуральную жидкость замораживают и хранят при –70 °C. Для получения моноклональных антител в высоких концентрациях гибридомы вводят в брюшную полость обработанных пристаном мышам линии BALB/c с целью индукции асцитных опухолей. Если в контрольной ампуле криоконсервированных после восстановления 70–90 % клеток останутся жизнеспособными и не утратят способности секретировать антитела, дальнейшее культивирование гибридомной культуры прекращают. Клонирование гибридом Гибридомы, как правило, не являются стабильными клеточными линиями и имеют тенденцию к потере хромосом, что часто приводит к потере антителопродукции. Клетки, потерявшие способность секретировать антитела, приобретают способность к более активному росту и могут перерастать медленно растущие клетки, сохранившие продукцию антител. Обычно уровень антител в культуральной жидкости в это время еще достаточно высок и хорошо улавливается в ELISA. Это может привести к безвозвратной потере многих полезных клонов. Для предотвращения подобных потерь предпринимают как можно более раннее клонирование гибридом, выделяя из смеси продуцирующих и непродуцирующих клеток те, которые сохранили продукцию антител. Клонирование необходимо проводить сразу же после того, как установлена специфичность секретируемых гибридомой антител к вирусу. Для получения достаточно стабильной линии гибридных клеток требуется 2-3 (иногда больше) клонирования. Для поддержания стабильности линии на достаточно высоком уровне необходимо в дальнейшем проводить клонирование не реже одного раза в три месяца при длительном пассировании в культуре, после пассирования на мышах и при больших сроках хранения клонов в криоконсервированном состоянии. Наиболее распространенным методом клонирования является клонирование в полужидком агаре. Методика 1. За 2–3 дня до клонирования в одном или нескольких 12-луночных планшетах готовят культуры перитонеальных макрофагов мышей. В каждую лунку пластины вносят по 0,5 мл ГС с 20 % ФСТ, содержащей 104 клеток перитонеального экссудата в 1 мл. 2. За день до клонирования необходимо заменить половину среды в культуре свежей ГС с 20 % ФСТ. В день клонирования на водяной бане разогревают 3%-ный агар Дифко. Расплавленный агар охлаждают до 42 °C. Из лунок пластин с культурами макрофагов отбирают кондиционированную среду и смешивают с равным объемом свежей ГС, содержащей 20 % ФСТ и подогретой до 42 °C. По 10 мл этой смеси вносят во флаконы с расплавленным агаром. Приготовленный 0,5%-ный агар (половину) распределяют по лункам пластин. После застывания агара вносят по 9-10 капель ГС с 20 % ФСТ и в ней суспендируют 20–40 гибридных клеток того клона, который необходимо клонировать. Затем осторожными круговыми движениями пластины перемешивают среду над агаром и добавляют к ней равный объем жидкого 0,5%-ного агара из водяной бани. После повторного легкого взбалтывания ее помещают в холодильник (+4 °C) на 2-3 мин, а затем в СО2-инкубатор. 3. Активный рост клонов в агаре начинается на 3–4-й день. Когда клоны достигают нужных размеров, их пересаживают из агара в 96-луночные планшеты с 1–2-суточными культурами макрофагов. Желательно в каждую лунку добавить по 50 мкл кондиционированной среды. Пластины с пересаженными клонами инкубируют в СО2-инкубаторе в течение 2–3 дней. Затем проводят подкормку клеток, внося в каждую лунку с растущими клонами по 50 мкл свежей ГС с 20 % ФСТ. На 5–7-й день клоны тестируют на продукцию ими антител. Их наращивают и замораживают. Определение класса и подкласса гибридомных антител После клонирования гибридом проводят определение класса и подкласса секретируемых ими иммуноглобулинов. Это позволяет, во-первых, подтвердить моноклональную природу иммуноглобулинов, так как клетки одного клона должны секретировать антитела только одного класса и подкласса; во-вторых, сделать предварительное заключение о возможности дальнейшего использования антител каждого клона (так, для диагностики предпочтительны антитела класса G, не дающие, в отличие от IgM, неспецифических реакций); в-третьих, выбрать оптимальный метод очистки антител того или иного клона (солевая преципитация, аффинная хроматография и др.). Обычно класс и подкласс гибридомных антител определяют в реакции двойной иммунодиффузии по Оухтерлони с использованием коммерческих моноспецифических кроличьих или овечьих антимышиных сывороток. При этом часто образуются слабые линии преципитации, различимые лишь при сильном боковом освещении. Получение асцитов у мышей Гибридомы, культивируемые in vitro, секретируют от 0,1 до 10 мкг антител на 1 мл культуральной среды. Эти же гибридомы при выращивании в брюшной полости сингенных мышей могут вырабатывать от 1 до 10 мг на 1 мл асцитической жидкости. Оба метода получения моноклональных антител имеют свои преимущества и свои недостатки. Антитела, секретируемые in vitro хорошо отклонированной гибридомой, растущей в бессывороточной среде или в среде с ФСТ, лишенной иммуноглобулинов, являются в прямом смысле моноклональными и моноспецифичными. Недостатком является низкая концентрация их в культуральной жидкости. В том случае, когда требуются высокие концентрации антител, обычно выращивают гибридомы в виде асцитических опухолей, что практически всегда позволяет без сложностей получить необходимые их количества. Однако моноклональные антитела в асцитических жидкостях будут контаминированы иммуноглобулинами, присутствующими в нормальной сыворотке мышей. Поэтому для получения асцитической жидкости необходимо использовать мышей, не вступавших в контакт с антигенами, применявшимися для получения MA, a также с антигенами, которые могут перекрестно реагировать со специфическими. Методика: • Взрослым рожавшим самкам ВALB/C предварительно внутрибрюшинно вводят 0,5 мл пристана. • На 7–21-й день им вводятся внутрибрюшинно 1–2×106 быстрорастущих, малопассированных клонированных гибридомных клеток, предварительно отмытых бессывороточной ДМЕМ. • Асциты развиваются на 7–14-й день. Гибридомы имеют тенденцию расти в виде твердой опухоли и продуцировать низкие уровни антител. В этом случае мышь часто погибает до образования асцитов. Для того чтобы вызвать асцит, необходимо использовать более низкую дозу гибридомных клеток и новую партию мышей. • Асцитическую жидкость собирают в пенициллиновые флаконы, прокалывая брюшную стенку мыши стерильной иглой. • Асцитическую жидкость центрифугируют 6–10 мин при 1000 об/мин для удаления клеток. Все жидкости, полученные от одинаковых клонов, объединяют. Хранят их замороженными при –70 °C, или при +4 °C в преципитированном состоянии. • Осадок клеток асцитической жидкости обрабатывают 0,83%-ным раствором хлорида аммония, подогретым до 37 °C, подслаивают 1–2 мл сыворотки и центрифугируют. Надосадок отбрасывают, а осевшие клетки гибридом или криоконсервируют, или вводят внутрибрюшинно новой партии мышей (по 1–2 млн клеток на мышь) с целью получения асцитов. Применение моноклональных антител (МКА) 1. Получение большого количества, высокоаффинных антител, специфических по отношению к антигенам гистосовместимости. 2. Получение антител к «биологическим молекулам». 3. Связывание и выделение в чистом виде антигенов микроорганизмов. МКА позволяют получать высокоочищенные препараты, свободные от вредных побочных примесей, с помощью их удается получать антигены вирусов герпеса, цитомегаловируса, бактерий и др. 4. Местная лекарственная терапия болезней внутренних органов, т.е. применение МКА в качестве доставки лекарственных средств к пораженному участку организма. Этот метод позволит лечить не только инфекционные болезни, но и раковые опухоли, которые могут разрушаться под действием лекарственных препаратов. 5. Использование МКА для диагностики, а также в анализе эмбрионального развития.
