Диссертация Рыщанова Раушан Миранбаевна

Костанайский государственный университет
имени Ахмета Байтурсынова
УДК 619:343.148.27:577.175.2/.7
На правах рукописи
Рыщанова Раушан Миранбаевна
Гормональные стимуляторы роста в мясе:
мониторинг остаточных количеств и
усовершенствование метода их определения
6D120200 «Ветеринарная санитария»
Диссертация на соискание ученой степени
доктор философии PhD ветеринарных наук
Научные консультанты
Ибрагимов Примкул Шолпанкулович,
доктор ветеринарных наук, профессор
Марио Джиорджи
доктор химической фармакологии,
профессор ветеринарной школы
Пизанского университета
Республика Казахстан
Костанай, 2014
1
Содержание
Нормативные ссылки……………………………………………………
Определения……………………………………………………………..
Обозначения и сокращения…………………………………………….
Введение …………………………………………………………………
1 Обзор литературы …………………………………………………….
1.1Половые стероидные гормоны и их влияние на продуктивность
животных……………………………………………………………..
1.1.1 Половые стероидные гормоны ………………………......
1.1.2 Отрицательное
влияние
гормонов
на
организм
человека……………………………………………………….
1.1.3 Гормональные препараты - стимуляторы роста
животных………………………………………………………………
1.2 Ветеринарно-санитарная оценка остаточного содержания
гормональных стимуляторов роста в мясе …………………….....
1.3 Методы определения остаточных количеств гормонов в мясе ....
1.4 Иммуноферментный анализ ………………………………………
1.5 Получение иммуногенов и иммунореагентов ИФА ………
2 Собственные исследования …………………………………………
2.1 Материал и методы исследований ………………………………
2.1.1 Материалы исследований ………………………………….
2.1.2 Методы исследований ……………………………………..
2.1.2.1 Методика ИФА по определению эстрадиола,
прогестерона, тестостерона тест-системой ООО «Медицина.
Аналитика. Ветеринария» ……………………………………………….
2.1.2.2 Высокоэффективная жидкостная хроматография с массспектрометрией …………………………………………………………
2.1.2.3 Хроматографическая гельфильтрация ..........................
2.1.2.4 Способ получения конъюгата эстрадиола 17β с HRP
2.1.2.5 Способы получения конъюгатов эстрадиола 17β с
гетерологичными носителями ..................................................................
2.1.2.6 Непрямой вариант твердофазного ИФА для
тестирования…………………………………………………………….
2.1.2.7 Реакция иммунодиффузии по методу O. Ouchterlony….
2.1.2.8 Приготовление буферных растворов …………………..
2.1.2.9 Метод Кастеллани …………………………………………
2.1.2.10 Метод высаливания сульфатом аммония ……………..
2.1.2.11 Электрофоретический метод ……………………………
2.1.2.12 Гибридомная технология получения моноклональных
антител ……………………………………………………………………
2.1.2.13 Метод Брэдфорд по определению белка ………………
2.1.2.14 Иммуноблотинг ………………………………………….
2.2 Результаты исследований…………………………………
2.2.1 Определение остаточных количеств тестостерона,
2
4
5
7
9
15
15
15
19
23
26
32
33
38
43
43
43
46
46
51
52
52
53
53
54
55
56
56
56
57
63
63
64
прогестерона, эстрадиола в мясе отечественного и импортного
происхождения …………………………………………………………
2.2.2 Получение специфических иммуногенов для определения
эстрадиола 17β иммуноферментным методом…………………………
2.2.2.1 Получение препаратов конъюгата эстрадиол-носитель
2.2.2.2 Получение конъюгатов эстрадиола с ферментом
пероксидазой хрена ……………………………………………………
2.2.3 Получение специфических иммунных сывороток ……..
2.2.3.1 Иммунизация кроликов ……………………………
2.2.3.2 Тестирование и очистка иммунных сывороток …………
2.2.4 Получение моноклональных антител к эстрадиолу 17β ...
2.2.5 Изучение иммунохимических свойств моноклональных
антител …………………………………………………………………..
2.2.6 Определение оптимальных условий применения
специфических антител и конъюгата эстрадиола с ферментом в
конкурентном варианте ИФА …………………………………………
2.2.7 Определение оптимальных условий применения
специфических антител и антивидового пероксидазного конъюгата в
конкурентном варианте ИФА …………………………………………
2.2.8 Отработка параметров подготовки проб материала ……
2.2.9 Лабораторные испытания разработанных реагентов ИФА
2.2.10 Разработка лабораторного регламента изготовления и
применения компонентов тест-систем ИФА для детекции
остаточных количеств гормона эстрадиола ……………………………
2.3 Обобщение и оценка результатов исследований…………
3 Заключение ……………………………………………………….
Список использованных источников………………………………
Приложение А Заключительный отчёт о НИР………….…………….
Приложение Б Отчёт о патентных исследованиях …..………………
Приложение В Лабораторный регламент ……………………………
Приложение В Акт лабораторных испытаний ………………………
Приложение Г Акты внедрения в производство………………………
Приложение Г1 Акты внедрения в учебный процесс ……………….
Приложение Д Инновационный патент ………………………………
Приложение Е Список публикаций ……………………………………
3
64
73
73
76
77
77
80
81
86
88
90
93
96
99
101
113
117
134
135
141
142
143
145
147
149
Нормативные ссылки
В настоящей диссертации использованы ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры,
мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 20292 –74 Колбы мерные вместимостью 100, 200, 500, 1000 мл
ГОСТ 20730 –75 Питательные среды
ГОСТ 22967 Шприцы инъекционные вместимостью 2, 5, 10 см3
ГОСТ 28085 – 89 Препараты биологические. Метод бактериологического
контроля стерильности.
ГОСТ 11078-78 Едкий натрий
ГОСТ 4233-77 Соли
ГОСТ 5962-67 Спирт этиловый ректификованный. Технические условия.
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия.
ГОСТ 20227-91 Посуда лабораторная стеклянная.Пипетки градуированные
Международный ветеринарный кодекс, Париж, Франция, 2000.
Закон Республики Казахстан о Ветеринарии от 10 июля 2002 года № 339-II
Закон РК «О безопасности пищевой продукции» 21.07.2007г. № 301-III
ЗРК
Технический регламент ТС «О безопасности мяса и мясной продукции»
(ТР ТС 034/2013). Утв.Решением Совета Евразийской экономической комиссии
от 9 октября 2013 года № 68.
Единые
ветеринарные
(ветеринарно-санитарные)
требования,
предъявляемые к товарам, подлежащим ветеринарному контролю (надзору).
Утв. Решением Комиссии ТС от 18 июня 2010 года № 137
СанПиН РК от 17.01. 2012 № 87
СанПиН 2.3.2.1078-01, - М: ФГУП «ИнтерСЭН». - 2002. - 155 с.
Инструкция утвержденная ДВ МСХ РФ №13-5-02/0141от 31.07.01.
«Наставление по применению набора для количественного определения
прогестерона
в
продуктах
животного
происхождения
методом
иммуноферментного анализа (ИФА-АГ-ПРОГ.)».
Инструкция утвержденная ДВ МСХ РФ №13-5-02/0138 от 31.07.01
«Наставление по применению набора для количественного определения
тестостерона
в
продуктах
животного
происхождения
методом
иммуноферментного анализа (ИФА-АГ-ТЕСТ.)».
Инструкция утвержденная ДВ МСХ РФ, №13-5-02/0146 от 31.07.01.
«Наставление по применению набора для количественного определения
эстрадиола-17В
в
продуктах
животного
происхождения
методом
иммуноферментного анализа (ИФА-АГ-ЭСТР.)».
4
Определения
В настоящей диссертации применяют следующие термины с
соответствующими определениями:
МЯСО – скелетная поперечнополосатая мускулатура животного с
прилегающими к ней жировой и соединительной тканями, а также
прилегающей костной тканью (мясо на костях) или без неё (бескостное мясо).
Мясо является продуктом убоя домашнего скота и птицы.
МОНИТОРИНГ - система сбора, регистрации, хранения и анализа
небольшого количества ключевых признаков, параметров описания данного
объекта для вынесения суждения о состоянии данного объекта в целом. То есть
для вынесения суждения об объекте в целом на основании анализа небольшого
количества характеризующих его признаков.
ГОРМОНАЛЬНЫЕ ПРЕПАРАТЫ - это лекарственные средства, которые
содержат гормоны или гормоноиды, которые проявляют фармакологические
эффекты подобно гормонам.
ГОРМОНАЛЬНЫЕ СТИМУЛЯТОРЫ РОСТА – это вещества, действие
которых направлено на усиление анаболических процессов в организме, то есть
вещества ускоряющие образование и обновление структурных частей клеток,
тканей и мышечных структур.
ПРОГЕСТЕРОН – стероидный половой гормон желтого тела яичника
самок, вырабатываемый в основном яичниками, надпочечниками и
семенниками.
ТЕСТОСТЕРОН – основной мужской половой гормон, андроген.
Секретируется клетками Лейдвига, семенников у самцов и в небольших
количествах яичниками у самок. Тестостерон стимулируют сперматогенез и
оказывают влияние на развитие половых органов и вторичных половых
признаков.
ЭСТРАДИОЛ 17β – основной женский половой гормон, эстроген,
вырабатываемый фолликулярным аппаратом яичников, незначительно корой
надпочечников и семенниками у самцов. Обеспечивает развитие женских
половых органов и вторичных половых признаков. По химическому строению –
стероид.
ГАПТЕНЫ – низкомолекулярные вещества, которые могут реагировать с
антителами, но самостоятельно неспособны индуцировать их синтеза. Однако
при соединении их с другими, более крупными молекулами, становятся
антигенными.
АНТИГЕНЫ – генетически чужеродные, как правило, макромолекулярные
вещества (белки, полисахариды и др.), взаимодействующие своими эпитопами
со специфическими рецепторами Т- и В-клеток, способные индуцировать
сенсибилизацию, аллергию, толерантность и синтез антител, и способные
реагировать с образовавшимися антителами как in vivo, так и in vitro.
АНТИГЕННАЯ ДЕТЕРМИНАНТА – пространственное расположение
аминокислотных остатков белка антигена, образующих на его поверхности
5
участок способный вступать во взаимодействие с комплементарным участком,
активным центром специфических антител или служить в качестве связующей
группы.
АНТИТЕЛА – белки глобулиновой природы, образующиеся в организме в
ответ на введение веществ, несущих на себе признаки генетически чужеродной
информации.
ПОЛИКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА – антитела, образующиеся в
сыворотке крови в разных клонах B-лимфоцитов и связываются с различными
антигенными детерминантами молекулы-мишени.
МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА – строго специфические антитела,
способные выявлять минимальные различия в химическом составе и
пространственной конфигурации молекул.
ГИБРИДОМА – гибридная клеточная линия, полученная in vitro в
результате слияния антителообразующей (плазматическая) клетки заданной
специфичности и клеток миеломы, продуцирующая моноклональные антитела.
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ – метод разделения белков в поле постоянного
электрического тока, основанный на различной скорости движения заряженных
частиц в жидкой среде (буфере) по твердому носителю.
ХРОМАТОГРАФИЯ – метод очистки
сложных смесей веществ,
основанный на их последовательной адсорбции и десорбции.
БИОТЕХНОЛОГИЯ – комплекс естественных или искусственно
созданных технологических приемов для создания биологических систем или
использования в промышленных и научных целях.
МЕЖДУНАРОДНОЕ АГЕНТСТВО ПО ИЗУЧЕНИЮ РАКА (МАИР) специализированное учреждение рак Всемирной организации здравоохранения,
издаёт Европейский кодекс против рака с участием Европейской комиссии.
ИММУНОБЛОТИНГ – метод идентификации антигенов или антител с
использованием метода электрофореза в полиакриловом геле и
иммуноферментного анализа.
6
Обозначения и сокращения
В настоящей диссертации применяют следующие обозначения и
сокращения:
ПГ – прогестерон
ТС - тестостерон
ЭСТ – эстрадиол 17 β
ВТО – всемирная торговая организация
МЭБ – международное эпизоотическое бюро
ВОЗ – всемирная организация здравоохранения
IARC - Международное агентство по изучению рака (МАИР)
ИФА – иммуноферментный анализ
РИД – реакция иммунной диффузии
ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография
п.н. – пары нуклеотид
мкг – микрограмм
нг – нанограмм
пг – пикограмм
мл – миллилитр
ФСБ – фосфатно-солевой буфер
ФСБ-ТВ – фосфатно-солевой буфер с 0,05% твином-20
БСА – бычий сывороточный альбумин
ДСН – додецилсульфат натрия
кД – килодальтон
рН – концентрация водородных ионов
ПАФ – неполный адъювант Фрейнда
НАФ – полный адъювант Фрейнда
КЖ – культуральная жидкость
АОК – антителообразующая (плазматическая) клетка.
Ig – иммуноглобулины
ОФД – ортофенилендиамин
МКА – моноклональные антитела
ГГФРТ – гипоксантин гуанин фосфорибозил трансфераза
ГАТ – селективная среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и
тимидин
ГТ – селективная среда, содержащая гипоксантин-тимидин
ELISA – enzymlinkedimmunosorbent-assay (иммуноферментный анализ)
АО – акционерное общество
КАТУ имени С.Сейфуллина – АО «Казахский агротехнический
университет им. С.Сейфуллина»
РК – Республика Казахстан
МСХ РК – министерство сельского хозяйства Республики Казахстан
КГУ имени А. Байтурсынова – РГП «Костанайский государственный
университет имени Ахмета Байтурсынова»
7
ИНОЦ – Инновационный научно-образовательный центр КГУ имени А.
Байтурсынова
СНГ – содружество независимых государств
США – соединенные штаты Америки
ДЭАС – дегидроэпиандростерона сульфат
МКА – моноклональные антитела
ПКА – поликлональные антитела
МДУ – максимально допустимый уровень
8
Введение
В последние годы одной из мировых проблем является загрязнение
пищевых продуктов животного происхождения содержащимися в них
остаточных количеств синтетических стероидных гормонов. Стероидные
гормоны могут попадать в продукты питания в результате использования их в
качестве анаболических стимуляторов роста при выращивании животных и
птиц [1, 2, 3, 4, 5, 6]. С развитием науки были синтезированы гормональные
препараты, которые по анаболическому действию эффективнее природных
гормонов в 10 и более раз. Так при их использовании у сельскохозяйственных
животных производство говядины и молока увеличивается до 15%,
производство мяса птицы до 40% [1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9]. Применение
анаболических стимуляторов в животноводстве обусловлено экономическими
факторами, так как позволяют добиться значительного повышения
продуктивности в животноводстве и снизить себестоимость продукции, что
вызвало всплеск их использования в последние годы. Этот факт, а также
дешевизна их синтеза определили интенсивное внедрение этого препарата в
практику животноводства и птицеводства [2, 3, 4].
Но главная опасность заключается в риске воздействия на здоровье
человека остаточных количеств этих веществ в животноводческой продукции
[9]. Многочисленными исследованиями доказана высокая токсичность и
опасность стероидных гормонов при поступлении их в организм человека.
Действие экзогенных гормонов может вызывать нарушение эндокринного
равновесия в организме, что выражается непредсказуемыми отдаленными
последствиями воздействия стероидов в препубертатном возрасте на
репродуктивную функцию посредством механизма, названного «гормональный
импринтинг» [9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18]. За последние 30 лет описано
более 10 000 случаев аномального полового развития у детей, вызванного
присутствием в продуктах остаточных количеств синтетических веществ [13,
14, 15, 16, 17, 18].
Экспрессия ферментов, метаболизирующих лекарственные препараты,
регулируется гормонами, поэтому анаболические стероиды могут продлевать
сроки выведения из организма различных лекарственных средств и повышать
их остаточное содержание в животноводческой продукции [7, 8, 19, 20].
Научный ветеринарный комитет в составе Еврокомиссии отмечает, что
«существует взаимосвязь между применением стероидных гормонов и
некоторыми видами рака», что «потребление мяса может повышать риск
заболевания раком груди и простаты», и приводит в качестве примера
Северную Америку, где объём потребления мяса, произведённого с
использованием гормонов, самый большой, и где заболеваемость раком груди и
простаты также самая высокая [9, 10, 19].
В настоящее время гормональные стимуляторы включены в состав
загрязнителей окружающей среды [9, 12, 13, 14, 15, 18]. Убедительные
доказательства канцерогенности природных и синтетических стероидных
9
эстрогенов (рак груди у женщин), и производных стильбена позволили
Международному агентству по изучению рака (IARC) отнести их к группе
признанных канцерогенов для людей [9, 13, 14, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 31].
Андрогенные анаболические стероиды классифицированы в качестве
вероятных канцерогенов для человека (рак простаты у мужчин). Данному
вопросу уделяется должное внимание во многих странах, он неоднократно
рассматривался на конференциях, в правительственных программах многих
стран, а также экспертами ФАО/ВОЗ [13, 14].
Риск, связанный с присутствием остаточных количеств анаболических
агентов в животноводческой продукции привел к запрещению использования
препаратов этой группы в качестве стимуляторов роста животных в
Европейском Союзе с 1989 года (директива 2003/74/EC). [9, 11, 20, 21]. В ряде
стран: США, Канаде, Австралии, Новой Зеландии, Аргентине и др., некоторые
природные
и
синтетические
гормональные
стимуляторы
роста
сельскохозяйственных животных официально разрешены: тестостерон,
эстрадиол, прогестерон, тренболон, зеранол, меленгестрол ацетат [9, 18, 21, 22,
25].
В Российской Федерации анаболические стимуляторы роста не разрешены
к использованию для продуктивных животных [19, 23, 32, 33]. В марте 2014
года Россельхознадзор запретил поставки говядины из Австралии, в который
был обнаружен стимулятор роста тренболон, запрещенный в России.
Что касается Казахстана, то здесь можно наблюдать двойственную
ситуацию. С одной стороны, в соответствии с законодательством государствчленов Таможенного союза и законом о безопасности Республики Казахстан,
при изготовлении продовольственного сырья животного происхождения не
допускается использование гормональных стимуляторов роста животных, с
«оговоркой» если не регламентируется национальными нормативными актами
[33, 34]. С другой стороны, отсутствуют механизмы мониторинга по контролю
содержания остаточных количеств гормональных стимуляторов роста в
продуктах животного происхождения отечественного и импортного
производства,
отсутствуют
утвержденные
методики
обнаружения
синтетических гормонов в продуктах питания.
Контроль поступающей продукции из стран дальнего зарубежья и
Таможенного Союза основывается на информации, предоставляемой
изготовителем (поставщиком) продукции, об использованных при ее
изготовлении и хранении стимуляторах роста животных и лекарственных
препаратов, т.е. основывается на полном доверии в отсутствии запрещенных
законодательством Казахстана остатков гормональных препаратов.
Мониторинг импортного мяса за последние 5 лет показал, что мясное
сырье в Казахстан импортируют США, Канада, Аргентина, Бразилия,
Австралия, Парагвай, Уругвай – стран, где применение гормональных
стимуляторов узаконено и почти всё животноводство и птицеводство
индустриализировано и нацелено на ускоренное «созревание» мяса,
уменьшение содержание в нём жира с требуемой нежной текстурой. В США
10
развито животноводство фабричного типа – factory farming [4, 9, 35, 36, 37, 38,
39, 40, 41].
Следует отметить, что в страны Европейского Союза ввоз мясной
продукции из указанных стран запрещен с 1989 года. [20, 21]. И соответственно
огромным рынком сбыта мясной продукции являются страны Средней Азии,
Россия, и Казахстан, куда беспрепятственно, официально и неофициально
ввозится огромное количество продукции мясной индустрии.
Использование в странах-экспортерах гормональных стимуляторов роста
при выращивании животных и птиц обуславливает потенциальную
возможность присутствия остаточных количеств этих препаратов в
животноводческой продукции и необходимость контроля над их содержанием.
Актуальность проблемы безопасности продуктов питания с каждым годом
возрастает, поскольку именно обеспечение безопасности продовольственного
сырья и продуктов питания является одним из основных факторов,
определяющих здоровье людей и сохранение генофонда.
Анализ имеющихся данных об отрицательном влиянии анаболических
гормонов на здоровье человека, а также экспорт в Казахстан пищевых
продуктов из стран, где законодательно разрешено применение этих опасных
ксенобиотиков, делают актуальными разработку методологической базы для
национальной системы контроля безопасности продукции животноводства.
В настоящее время в Казахстане недопустимо большая часть
диагностических и лекарственных препаратов, имеет иностранное
происхождение. Существующие разработки в основном направлены на
диагностику инфекционных заболеваний. Отечественные исследования и
разработки, направленные на создание тест-систем, позволяющих осуществлять
детекцию остаточных количеств опасных соединений в продуктах
животноводства, имеют большее значение для безопасности пищевой
продукции Казахстана и соответственно позволят не быть импортозависимой в
данной области.
В этой связи, целью наших исследований являлось исследование мяса
импортного и отечественного происхождения на содержание остаточных
количеств гормональных стимуляторов роста и усовершенствование метода
иммуноферментного анализа.
Для реализации целей исследований поставлены следующие задачи:
- изучить степень загрязнения мяса отечественного и импортного
происхождения остаточными количествами гормональных стимуляторов роста:
прогестерона, тестостерона, эстрадиола 17β;
- получить специфические иммунологические препараты пригодные для
детекции остаточных количеств эстрадиола 17β в иммунологических реакциях;
разработать
на
основе
полученных
препаратов
вариант
иммуноферментного анализа выявления эстрадиола 17β в продуктах
животноводства;
- определить оптимальный способ экстрагирования эстрадиола из проб
мяса и мясных продуктов;
11
- разработать лабораторный регламент производства и применения набора
реагентов ИФА для определения остаточных количеств эстрадиола 17 в
продуктах животного происхождения.
В работе использованы данные, полученные автором совместно с
сотрудниками Инновационного научно-образовательного центра (ИНОЦ) КГУ
имени Ахмета Байтурсынова, г. Костанай и исследователями Института
сельскохозяйственной биотехнологии КАТУ имени С. Сейфуллина, г. Астана.
Диссертационные исследования проведены в рамках научно-технического
проекта «Разработка отечественной тест-системы иммуноферментного анализа
для определения эстрадиола 17 в продуктах животного происхождения»,
грантового финансирования МОН РК на 2012 – 2014 годы по бюджетной
программе 055 «Научная и (или) научно-техническая деятельность»,
подпрограмма 101 «Грантовое финансирование научных исследований»,
регистрационный номер № 0112РК01067. Информационные карты,
свидетельствующие о сдаче годовых отчётов - 2012 г. - № 0212РК02292; - 2013
г. - № 0212РК02900 и заключительного отчёта 2014 - № 0214РК02369
(Приложение А).
Проведен патентный поиск глубиной в 15 лет. Было обнаружено 15
патентов по созданию высокоспецифичных и гомологичных иммунологических
препаратов и использование их в разработке эффективных наборов реагентов
для обнаружения гормонов и их остаточных количеств, превышающих
ветеринарно-санитарные нормы в сырье и продуктах животного
происхождения. Был составлен отчет о патентных исследованиях за 2012-2014
годы (Приложение Б).
Метрологическое
обеспечение
научно-исследовательской
работы
проводилось в Костанайском и Акмолинском филиале АО «Национальный
центр экспертизы и сертификации» путем государственной поверки
лабораторных приборов и средств измерения лабораторий Инновационного
научно-образовательного центра КГУ имени А. Байтурсынова» и лабораторий
НИИ биотехнологии, АО «КАТУ им. С. Сейфуллина.
Научная новизна работы
Впервые изучено содержание гормональных стимуляторов роста:
прогестерона, тестостерона и эстрадиола 17β в мясе отечественного и
импортного происхождения. Показано, что в отечественной продукции
содержание гормонов не превышало максимально допустимых уровней, в то
время как в ряде образцов импортного мяса выявлены превышения МДУ, в
некоторых случаях значительные.
В Казахстане впервые разработана тест-система реагентов ИФА по
определению эстрадиола 17β в продуктах животного происхождения:
разработаны способы конъюгирования эстрадиола 17β с гетерогенными
носителями, созданы специфические иммуногены, позволяющие получать от
иммунизированных животных-продуцентов высокоспецифичные антитела,
получены штаммы моноклональных антител к эстрадиолу, предложена
12
эффективная методика экстракции эстрадиола из продуктов животного
происхождения.
Практическая значимость работы
Создана тест-система для определения остаточных количеств
эстрадиола17β в продукции животноводства, предназначенная для проведения
государственного мониторинга незаконного использования их в качестве
анаболического стимулятора роста.
Разработан лабораторный регламент производства и применения набора
реагентов ИФА для определения остаточных количеств эстрадиола-17 в
животноводческой продукции (утв. 04.06.2014г. Научно-техническим Советом
КГУ имени А. Байтурсынова) (Приложение В).
Внедрены в производство Инновационного научно-образовательного
центра КГУ имени А. Байтурсынова: разработанные схемы иммунизации
кроликов и мышей для получения гипериммунных сывороток к различным
антигенам и антигенам гаптенного происхождения, разработанные способы
конъюгирования гаптенов с гетерологичными носителями для получения
иммуногенов, способ экстрагирования стероидных гормонов из продуктов
животного происхождения (Приложение Г).
Результаты диссертационных исследований внедрены в учебный процесс и
используются при чтении курса лекций и проведении лабораторных занятий по
ветеринарно-санитарной
экспертизе,
токсикологии,
медицинской
и
ветеринарной биотехнологии, иммунологии, студентам специальностей
ветеринарии и биотехнологии КГУ имени А.Байтурсынова, а также слушателям
«Центра повышения квалификации и профессиональной переподготовки
работников животноводства и ветеринарии» (Приложение Г1).
Апробация работы
Основные положения диссертации, разработки и отдельные материалы
доложены и обсуждены на международных, зарубежных и республиканских
конференциях:
- в программе Международной зарубежной научно-практической
конференции «Бъдещето въпроси от света на науката-2012» (София, Болгария);
на
Международной
научно-практической
конференции
«Байтурсыновские чтения-2013» (Костанай, 2013);
- на Международной зарубежной научно-практической конференции
«Современные подходы к проблеме развития образования, науки и техники»
(Донецк, Украина, 2013);
- на Международной научно-практической конференции «Молодых
ученых» Уральской государственной академии ветеринарной медицины
(Троицк, Россия, 2013);
на
Международной
научно-практической
конференции
«Байтурсыновские чтения-2014» посвященной 75-летию университета
(Костанай, 2014).
13
Публикации
Основные положения и результаты диссертационных исследований
изложены в 11 печатных работах, в том числе один инновационный патент на
изобретение Республики Казахстан (Приложение Д), 4 статьи в изданиях
рекомендованных Комитетом науки РК, одна статья в журнале входящей в
международную базу Thomson Reuters/Scopus и 5 в трудах научных
конференций (Приложение Е).
Основные положения, выносимые на защиту
- Результаты мониторинга по изучению степени загрязнения мяса
импортного и отечественного происхождения остаточными количествами
гормональных стимуляторов роста: тестостерона, прогестерона и эстрадиола;
- Разработка набора реагентов ИФА для определения эстрадиола 17β в
продуктах животноводства;
- Разработка варианта конкурентного ИФА по детекции эстрадиола 17β в
продуктах животноводства;
- Разработка эффективного способа экстракции эстрадиола 17β из мяса и
оптимизация условий его определения методом ИФА.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста, состоит
из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения
результатов, выводов, практических предложений, списка основной
литературы и приложений.
Диссертационная работа содержит 22 таблицы и 31 рисунков. Список
литературы включает 254 источников, в том числе 139 источников на
иностранном языке.
14
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Половые стероидные гормоны и их влияние на продуктивность
животных
1.1.1 Половые стероидные гормоны
Гормоны - биологически активные вещества, продукты секреции
эндокринных желез или желез внутренней секреции, выделяющиеся в кровь и
лимфу и обладающие высокой физиологической активностью. [42, 43, 44, 45,
46].
Основная функция гормонов, это гормональная регуляция деятельности
отдельных органов и систем и в целом всего организма. Гормоны с кровью
разносятся по всему организму и влияют на деятельность органов, изменяя
физиологические и биохимические реакции путём активации или торможения
ферментативных процессов [47, 48, 49].
Физиологическое действие гормонов направлено на:
- обеспечение гуморальной, т.е. осуществляемой через кровь, регуляции
биологических процессов;
- поддержание целостности и постоянства внутренней среды,
гармоничного взаимодействия между клеточными компонентами тела;
- регуляцию процессов роста, созревания и репродукции. Гормоны
регулируют активность всех клеток организма [50, 51, 52, 53].
В зависимости от химической структуры гормоны делятся на пептиные и
стероидные гормоны.
Cтероидные гормоны - это липидные гормоны, являющиеся по структуре
стероидами, но способные проникать через клеточную мембрану и
избирательно взаимодействуя со специфическими ядерными рецепторами
вызывать изменения в генетическом аппарате клетки, то есть осуществляющие
гормональную регуляцию в организме человека и животных [52, 53, 54, 55].
В зависимости от характера биологической активности производные
стероидных гормонов разделяют на три группы: кортикоидные, анаболические
андрогенные и эстрогенные стероидные гормоны. Однако в организме, многие
производные стероидных гормонов подвержены ферментативным реакциям в
стероид-продуцирующих тканях, и могут превращаться в другие стероидные
гормоны, являясь в этом случае одновременно и прогормонами, то есть,
прекурсорами [47, 53, 54, 55].
Из четырех общих групп стероидных гормонов выделяют:
минералкортикоиды, глюкокортикоиды, андрогены, эстрогены и прогестагены.
Стероидные гормоны дополнительно разделяют на две условные группы:
половые гормоны (прогестагены, андрогены и эстрогены) и кортикостероиды
(минералкортикоиды и глюкортикоиды) [51, 55, 56].
Половые гормоны синтезируются, соответственно в коре надпочечников и
в половых железах. (Рис.1) Регуляция синтеза стероидных гормонов
осуществляется с помощью пептидных гормонов вырабатываемых
15
гипоталамусом и гипофизом. Наиболее важными представителями половых
стероидных гормонов являются тестостерон, эстрадиол, прогестерон и др [57,
58].
Рисунок 1 Основные пути синтеза гормонов
Фармакодинамические эффекты половых стероидных гормонов
разнообразны. Специфическое действие данных гормонов отражается в
физиологическом ответе органов-мишеней: матки, влагалища, яичников,
молочных желез, гипофиза, плаценты, и в поддержании соответствующих
функциональных состояний, таких как развитие и появление вторичных
половых признаков, созревании яйцеклетки и овуляции, оплодотворении и
развитии беременности, наступлении родов, становлении функции лактации и
др. [59, 60].
Женские половые стероидные гормоны вызывают и другие
фармакодинамические эффекты, которые относят к разряду неспецифических,
но имеющих определенное клиническое значение для лечения некоторых
заболеваний и прогнозирования побочного действия. Так, стало возможным
использование гестагенов для лечения гиперпластических процессов в
эндометрии, а наличие рецепторов для эстрогенов в стенке артерий
обсуждается в контексте развития атеросклероза [54, 59].
К мужским половым гормонам относятся андрогены: андростерон,
тестостерон, метилтестостерон и дегидроандротестостерон.
Андрогены - обязательные предшественники всех половых стероидных
гормонов, исключая прогестины. Поэтому андрогены образуются в каждой
ткани, синтезирующей стероиды, включая яички, яичники и надпочечники.
Наибольшее количество циркулирующих андрогенов образуется в яичках.
Андрогены - вещества, обладающие биологическим действием мужского
полового гормона. В организме животных и человека они образуются у
16
мужских особей в семенниках и в корковом слое надпочечников, у женских
особей в корковом слое надпочечников, а при некоторых условиях и в
яичниках. В семенниках вырабатывается первичный гормон - тестостерон. При
метаболизме
тестостерона
образуются
андростерон,
этилхоланолон,
дегидроандростерон и изоандростерон. Под воздействием белковых гормонов
гипофиза
стимулируют
функцию
мужских
половых органов
и
развитие, вторичных половых признаков, влияют на многие биохимические
процессы, не связанные с особенностями пола. Андрогены- промежуточные
продукты в биосинтезе
эстрогенов синтетические
аналоги андрогенов
применяются в медицине. [59, 61, 62, 63].
Тестостерон, один из наиболее активных андрогенов. Его гормональные
эффекты реализуются путем связывания с андрогеновым рецептором, прямо
или опосредованно - путем конверсии в ДГТ, что происходит в самих тканяхмишенях. [28, 29]. Химическая структура тестостерона в соответствии с
рисунком 2.
Рисунок 2 - Структурная формула гормона тестостерона
К женским половым гормонам относятся эстрогены: эстрон, эстрадиол,
эстриол, этинилэстрадиол. Эстрогены - группа стероидных гормонов,
натуральные или синтетические вещества. В организме самок эстрогены
вырабатываются фолликулами яичников, плацентой во время беременности и
частично корой надпочечников. Эстрогены обеспечивают и стимулируют
развитие и репродуктивную функцию женских половых органов, нормальную
функцию, молочных желез, развитие вторичных половых признаков, влияют
на рост костей и нацентральную нервную систему. Играют важную роль в
регулированиимосновных биохимических процессов (углеводный обмен,
распределение липоидов, синтез аминокислот, нуклеиновых кислот, белков и
др.). Кроме участия в развитии вторичных половых признаков, эстрогены
оказывают системные эффекты [64, 65, 66].
Существуют три физиологически важных эстрогена: эстрон (Е1),
имеющий кетогруппу в положении С-17; эстрадиол (Е2), обладающий
гидроксильными группами в положениях С-3 и С-17, и эстриол (ЕЗ) с
гидроксильными группами в положениях С-3, С-16 и С-17 (обозначения Е1, Е2
и ЕЗ даны в соответствии с номерами гидроксильных групп, связанных со
стероидным кольцом). [68, 69, 70, 71].
17
Эстрадиол - главный эстроген, синтезируемый в яичниках. Структурная
формула гормона эстрадиола в соответствии с рисунком 3. Время полужизни
данного гормона составляет около трех часов.
Рисунок 3 - Структурная формула гормона эстрадиола
Помимо этого, эстрогены участвуют в регуляции метаболизма костной
ткани, а именно поддержание прочности и предотвращение резорбции костей, в
выделительной системе - регуляция водно-солевого обмена, а также в
функционировании
сердечно-сосудистой,
это
понижение
уровня
циркулирующих в крови липидов и защита от атеросклероза и
нейроэндокринной систем [72, 73, 74, 75].
Гестогены являются женскими половыми гормонами, к ним относится
прогестерон. Гестогены отвечают занормальное течение беременности у самок.
Образуются в желтом телеяичников и в плаценте из холестерина.
По химическому строению прогестины относятся к стероидным гормонам,
включающие
прогестерон
и
его
производные.
Синтетические
аналоги прогестинов используют в фармакологии. [75, 77, 78] Химическая
структура прогестерона в соответствии рисунком 4.
Рисунок 4 - Структурная формула гормона прогестерона
В нормальном состоянии существует гармоничный баланс между
активностью эндокринных желез, состоянием нервной системы и ответом
тканей-мишеней (тканей, на которые направлено воздействие). Любое
нарушение в каждом из этих звеньев быстро приводит к отклонениям от нормы.
18
Избыточная или недостаточная продукция гормонов служит причиной
различных заболеваний, сопровождающихся глубокими химическими
изменениями в организме [75, 76, 77, 78, 79, 80].
1.1.2 Отрицательное влияние гормонов на организм человека
Остатки лекарственных и гормональных препаратов, попадающие в
человеческий организм вместе с пищей, могут нанести серьезный ущерб
здоровью человека. Многочисленными исследованиями доказана высокая
токсичность и опасность синтетических половых гормонов при поступлении их
в организм. В настоящее время они включены в состав загрязнителей
окружающей среды. Соединения с эстрогенной активностью, не являющиеся
натуральными женскими половыми гормонами, получили название
ксеноэстрогенов. Под их действием наблюдается глобальное ухудшение
репродуктивной функции мужчин и самцов животных - от рыб до
млекопитающих, происходит прогрессирующая феминизация животного мира.
[11, 78, 79]
Особенно важно не нарушать гормональный баланс в детском возрасте,
так как у детей, не достигших полового созревания, концентрация половых
гормонов в организме очень низка, и малейшее повышение уровня гормонов
существенно. Следует также опасаться влияния гормонов на развивающийся
плод, так как в период внутриутробного развития рост тканей и клеток
регулируется точно отмеренным количеством гормонов. Экспериментально
показано, что все гормоны, применяемые в животноводстве, хорошо проходят
через плацентарный барьер и попадают в кровь плода. Небольшое отклонение
от нормальной концентрации гормонов может сказаться на физиологии
организма.
Побочные эффекты анаболических стероидов достаточно хорошо
известны. В настоящее время доказано, что эстрогены обладают
генотоксичным потенциалом [81, 82]. С увеличением концентрации половых
гормонов в крови возможно поражение органов размножения и полное
бесплодие, развитие гипертонии, поражения почек и печени, жирная кожа и
угревая сыпь, а также высокая вероятность злокачественных образований. У
мужчин, принимающих анаболические стероиды, возможно, помимо всего,
развитие груди по типу женской, прекращение выработки мужских половых
гормонов и спермы, вытекающая из этого импотенция, а также потеря волос и
рак предстательной железы [83, 84, 85].
Среди метаболитов эстрогенов преобладают прооксиданты- 2-окси и 4оксиметаболиты, которые могут подвергаться дальнейшей биотрансформации с
образованием полухинонов и хинонов. В результате окислительновосстановительных реакций с участием этих метаболитов могут
образовываться супероксиды и хиноны, вступающие в реакцию с ДНК и
обладающие мутагенными свойствами [55]. Мутагенность и генотоксичность
19
эстрогенов (их катехоловых и 16а- оксиметаболитов) доказана в нескольких
исследованиях, результаты которых суммированы ниже. [86, 87, 88].
Исследования повреждения ДНК катехолэстрогенами получили
дополнительный импульс в последние годы после открытия канцерогенного
действия 4-оксиэстрадиола [89, 90, 92]. Было установлено, что 4-оксиэстрогены
обладают в 9 раз более высокой канцерогенностью, по сравнению с
родительскими предшественниками при индукции опухолей матки у мышей
[93, 94]. Сообщается, что концентрация 4-оксиэстрадиола в экстракте клеток
раковой опухоли молочной железы человека была в 4 раза выше, чем 2оксиэстрадиола [95]. У людей преобладающее образование 4-оксиэстрадиола в
результате метаболизма Е2 обнаружено в микросомах миометрия матки и
клетках фиброзных опухолей, доброкачественных, злокачественных опухолях и
нормальных тканях молочных желез [96, 97, 98].
В результате этих исследований можно предположить, что у человека и
некоторых грызунов в органах и тканях, склонных к возникновению эстрогениндуцированных опухолей, может иметь место образование повышенных
концентраций канцерогенных 4-оксиметаболитов эстрогенов.
В
настоящее
время
получены
убедительные
доказательства
канцерогенности эстрадиола Е2, достаточные для того, чтобы Международное
агентство по изучению рака (IARC) классифицировало его как канцероген [99,
100]. Так Е2 вызывал увеличение частоты опухолей молочной железы,
гипофиза, матки, шейки матки, влагалища, яичек, лимфоидной и костной ткани
[101, 102, 103, 104, 105]. У хомяков он индуцировал опухоли почек у самцов и у
овариэктомированных самок [106].
У трансгенных мышей с избыточной экспрессией гена Wnt-1 обнаружена
высокая частота возникновения опухолей молочной железы в первые месяцы
после рождения. У овариэктомированных кроссбредных мышей уровень
синтеза Е2 и частота возникновения опухолей молочной железы значительно
ниже [68, 107]. Индукцию этих опухолей связывают с генотоксичным
эффектом эстрогенов.
Появляется все больше данных в пользу того, что эстрогены являются
фактором риска развития рака молочной железы у человека.
Эпидемиологические
исследования
убедительно
продемонстрировали
взаимосвязь между концентрацией эндогенных эстрогенов и риском
возникновения рака молочной железы [76, 108, 109, 110, 111, 112, 113].
Эпидемиологические данные указывают на то, что эстрадиол 17β и другие
натуральные эндогенные эстрогены являются слабыми канцерогенными
веществами, по сравнению с другими канцерогенами такими, например, как
бензопирены или 7,12-диметилбензоантрацен. Это легко объяснимо, так как
выраженные канцерогенные свойства у эндогенных гормонов обеспечили бы
эволюционные проблемы для людей и других млекопитающих. Отрицательные
результаты более ранних исследований мутагенной и канцерогенной
активности
эстрогенов
объясняются
недостаточно чувствительными
экспериментальными моделями. [69, 108, 109, 114, 115, 116, 117].
20
Отрицательное влияние эстрогенов выражается в стимуляции
канцерогенеза в гормонозависимых органах и тканях. Являясь ключевыми
индукторами и проводниками внутриклеточных пролиферативных сигналов,
эстрогены главным образом эстрадиол при определенных условиях способны
стимулировать рост доброкачественных и злокачественных опухолей в
эпителии молочной железы, эндометрии и шейке матки, эпителии и эндотелии
слизистых (гортань, пищевод, прямая кишка). [70, 118, 119, 120, 121, 122, 123].
Попадание в организм экзогенных стероидных гормонов со скоростью,
превышающей скорость синтеза соответствующих эндогенных стероидных
гормонов, практически полностью подавляет выработку стимулирующих
пептидных гормонов, что приводит к подавлению механизмов синтеза
соответствующих эндогенных гормонов, и в результате нарушается общий
гормональный баланс в организме [68, 124, 125, 126, 127].
Концепция, предполагающая, что нарушение гормонального равновесия в
организме, а именно дисбаланс соотношения 2-и 16а-гидроксипроизводных
эстрогена, является основной причиной возникновения злокачественных
гормонозависимых опухолей, начала формироваться достаточно давно, в
начале 80-х годов прошлого века. Тогда было впервые установлено значимое
50%-ное увеличение скорости процесса 16а-гидроксилирования у больных. На
сегодняшний день справедливость представлений о связи метаболитов
эстрогена с процессами опухолеобразования подкреплена результатами
огромного числа лабораторных и клинических исследований [69, 70, 76, 128,
129, 130, 131]. Таблица 1.
Таблица 1 - Метаболиты эстрогена и канцерогенез
Год
Результаты исследований
1982
Установлена
взаимосвязь
между
метаболитами эстрогенов и РМЖ
16а-гидроксилированными
1984
Пациентки с РМЖ и раком эндометрия имеют повышенный уровень
16а-гидроксилазной активности
1988
16а-ОНЕ1способен ковалентно и необратимо взаимодействовать с
эстрогеновыми рецепторами
1992
Установлены пролиферативные и генотоксические механизмы 16аОНЕ1-индуцированного канцерогенеза (клеточные культуры РМЖ)
1994 Агенты, повышающие уровень 2-ОНЕ1, подавляют канцерогенез
1995
Соотношение 16а-ОНЕ1/2-ОНЕ1 повышено на поздних стадиях РМЖ
(эксперименты in vivo на животных и клинические исследования)
1995
Пестициды
(органохлорин)
активизируют
ответственный за синтез 16а-ОНЕ1
21
цитохром
Р-450,
Полиморфизм CYP1A1 является причиной пониженного соотношения
1996 2-ОНЕ1/16а-ОНЕ1 в Африкано-Американской популяции женщин по
сравнению с кавказской популяцией
16а-ОНЕ1 индуцирует канцерогенез в эпителиальных клетках
молочной железы по пролиферативному и генотоксическому
1997
механизму (повреждение ДНК), подобно канцерогену 7,12-диметил-(а)
6ензатрацен (DMBA)
1997
Бифункциональность (усиление пролиферации и генотоксического
эффекта) канцерогенного действия 16а-ОНЕ1
1997
Установлена четкая обратная корреляция между соотношением 2/16 и
РМЖ (клинические исследования)
Постменопаузальные женщины с РМЖ имели 15%-ное статистически
1997 значимое снижение величины 2-ОНЕ1/ 16а-ОНЕ1 по сравнению с
контрольной группой (клинические исследования)
Эстрадиол и 16а-ОНЕ1 усиливают аномальную пролиферацию и
1998 малигнизацию кератиноцитов. Данный эффект блокируется индол-3карбинолом
Увеличение
соотношения 2-ОНЕ1/16а-ОНЕ1
1998 улучшением
статуса
больных
возвратным
папилломатозом
коррелирует
с
респираторным
У пременопаузальных женщин высокий уровень 2-ОНЕ1/ 16а-ОНЕ1
2000 коррелировал с пониженным риском возникновения РМЖ
(клинические исследования)
2001
Соотношение 2/16а- предполагаемый биологический маркер риска
опухолей головы и шеи
Ранее было сказано, о возможном канцерогенном действии гормонов, о
стимуляции роста многих разновидностей опухолевых клеток, например, рака
груди и матки у женщин, и рака простаты у мужчин [69, 76].
Однако данные эпидемиологических исследований, в ходе которых
сравнивали уровень заболеваемости раком у вегетарианцев и любителей мяса,
достаточно противоречивы. Одни исследования показывают четкую
зависимость, а другие - нет. Бостонскими учеными замечено, что риск
развития гормонально-зависимых опухолей у женщин напрямую зависит от
уровня потребления мяса в детском и подростковом возрасте. В США с 1970-х
годов и до недавнего времени наблюдался заметный рост заболеваемости
раком груди. В последние годы ситуация несколько стабилизировалась, но все
22
равно ежегодно от рака груди умирают 40 тысяч человек, и диагностируется
порядка 180 тысяч новых случаев [76, 133, 134, 135, 136].
1.1.3 Гормональные препараты, стимуляторы роста животных
Стимуляторы роста - это разнообразные по химической структуре
вещества и по функциям, выполняемым в организме, общим свойством
которых является стимуляция синтеза белка в организме животных и человека.
[137, 138]. Ряд гормональных препаратов обладает выраженной анаболической
активностью, применяется в этой связи для откорма скота и птицы:
полипептидные и белковые гормоны (инсулин, соматотропин и др.);
производные аминокислот - тиреоидные, стероидные гормоны, их производные
и аналоги [139, 140]. Анаболические стероиды сильно повышают процессы
обмена веществ и энергетические процессы в организме. Увеличивается
транспортная функция крови (доставка кислорода к мышцам), за счет
увеличения в крови эритроцитов, что существенно влияет на повышение
мышечной массы [141, 142].
Гормональные препараты уже в незначительных дозах существенно
изменяют многие физиологические процессы, причем одни в сторону
активизации, а другие в сторону снижения. Это необходимо хорошо знать, и
поэтому в наставлениях по применению тех или иных гормональных
препаратов подробно указывают их фармакологию, показания и
противопоказания, а также условия смягчения или предупреждение
неблагоприятного влияния [143, 144].
В настоящее
время ряд
препаратов,
ранее
производимых путем
экстракции соответствующих органов и тканей, получают синтетическим
путем. К ним относятся синтетические аналоги гормонов коры надпочечников,
женских и мужских половых гормонов, гормонов желтого тела (гестагены и
прогестины) и др. [145, 146].
Анаболические стимуляторы включают несколько подгрупп, в которые
входят эндогенные и синтетические стероидные гормоны, тиреостатики,
производные стильбена и Р-адреностимуляторы [147, 148]. Наиболее
выраженным анаболическим действием обладают половые стероидные
гормоны.
Для стимулирования мясной и молочной продуктивности, яйценоскости
используются гормональные препараты и их аналоги. [Балджи].
Положительный эффект гормональных препаратов связан с лучшим
использованием корма, снижением его расхода на единицу прироста.
В животноводстве широкое распространение получили анаболические
стероиды - производные андрогенов, в результате видоизменений структуры
молекул у них изменено соотношение между анаболической и андрогенной
активностью. [149]. Анаболические стероиды активно стимулируют синтез
белков. Под их влиянием повышается ретенция азота, синтез нуклеиновых
кислот, активность ферментов белкового обмена. [150, 151]. В мышцах и
23
печени увеличивается содержание гликогена, креатинфосфата и АТФ. Кроме
того, анаболическое действие андрогенов проявляется в результате связывания
глюкокортикоидов мышечным цитозолом, что уменьшает катаболизм
мышечного протеина. Препараты имеют повышенный анаболический индекс и
активируют синтез белка в мышечных тканях. К их числу относятся тренболона
ацетат (ТБА), метиландростендиол, дианабол, и фенаболин. Под влиянием этих
препаратов среднесуточный прирост повышается на 9-64 %, то есть, результаты
вариабельны. [152, 153, 154, 155].
Наиболее широкое применение получили половые гормоны, их
синтетические аналоги и анаболические стероиды: эстрадиол, тестостерон,
прогестерон, треноболона ацетат, ацетат мегестрола, ралгро (зеранол),
антитериоидные. [11, 156. 157].
Эффективность анаболических половых стероидов зависит от многих
факторов: вида, пола, возраста животного, определяющего зрелость
гормональной системы, условий кормления и содержания. Максимальная
скорость прироста живой массы наблюдается у животных с концентраций
половых гормонов, характерной для молодых половозрелых особей. Следует
отметить, что андрогены наиболее эффективны для самок, а эстрогены для
самцов. На практике, наиболее широкое применение получили так называемые
гормональные коктейли, состоящие из комбинации андрогенов, эстрогенов и
прогестагенов. Особенно эффективны они для кастрированных животных [158,
159].
Для достижения анаболического эффекта в животноводстве наиболее
широко используемым природным эстрогеном является эстрадиол-17В (Е2) в
свободной форме или его соли, которые применяют посредством имплантации
под кожу уха. Подкожная имплантация гормонов используются в клинической
практике более пятидесяти лет как наиболее эффективное средство
равномерного поступления гормона в плазму крови. После однократного
подкожного имплантирования удается получить стабильные физиологические
концентрации в течение 6 месяцев. Вещества анаболического действия
применяют в основном на заключительной стадии откорма с целью сохранения
или усиления энергии роста, торможения депонирования жира [160, 161, 162].
Считается, что ускоренная прибавка в весе и повышение эффективности
использования корма, наблюдаемые после назначения Е2, объясняются тем, что
в стимулированном гипофизе образуется больше гормона роста [163, 164].
В опыте на тёлках среднесуточный прирост при применении эстрадиола
составил 1120 г. [165, 166, 167].
Положительный эффект препарата связан с лучшим использованием
корма, снижением его расхода на единицу прироста. В крови животных под
влиянием ТБА уменьшается содержание мочевины и тироксина, но повышается
уровень тестостерона.
У свиней возрастает концентрация соматомедина и эстрадиола-17β. [168,
169, 170].
24
Эстрадиол бензоат, после назначения мелкому и крупному рогатому скоту,
с желчью и калом метаболизируется в форме 17а-метаболита Е2 на 60 -90%.
Эстрадиол в свободном виде обнаруживаются в моче и в значительно меньшем
количестве в форме конъюгатов с глюкороновой и серной кислотами.
Метаболиты стероидных гормонов плохо растворяются в воде и перед
экскрецией в печени превращаются в конъюгаты с серной, глюкороновой и
некоторыми другими кислотами. [171, 172].
В более поздних исследованиях уточнялись дозы препаратов, методы и
условия их применения [173, 174].
У опытных животных масса туши и мякотной части повышалась на 5-16
кг, снижалась масса внутреннего жира в мясе, увеличивался выход общего
белка. Затраты корма на 1 кг прироста веса снижались на 7-16 % [175, 176].
Поскольку многократные инъекции дианабола трудоемки, изучали
возможность их замены имплантацией.
На сегодняшний день, практика животноводства располагает
значительным количеством естественных и синтетических гормональных
препаратов. Их можно разделить на четыре группы.
- I группа - экстрактные препараты, полученные извлечением
гормональных веществ из эндокринных желез животных. Ряд препаратов
(инсулин, адреналин, эстрон) содержит гормональные вещества в высшей
степени очистки и даже в кристаллическом виде. Большинство же препаратов
этого типа имеет некоторое количество органических примесей. Например, в
препарате питуитрина допускается до 5% изменения активности за счет
гистамина, а в гонадотропине содержится до 20% веществ, далеких от
основных веществ.
- II группа - синтезированные препараты гормонов, полностью
соответствующие строению естественных веществ. Как правило, препараты
имеют высокую степень очистки, и их можно точно дозировать, но таких
препаратов малое количество, поскольку производство их сложно.
- III группа - растительные препараты, обладающие гормональным
действием. Кумэстрол из травы клевера и ряд других веществ обладают
высокой фармакологической активностью и специфичностью действия.
- IV группа препаратов - синтетические соединения, неидентичные
естественным гормонам, но обладающие ярко выраженным гормональным
действием [177, 178, 179, 180].
Значительное количество разных анаболических препаратов порождают
производители, выпускающие одну и ту же субстанцию под разными
торговыми брендами. К примеру, препарат «Метан» с действующим
химическим веществом метандростенолон/метандиенон, в странах Европы
известен как «D BOL» - дианабол, в Германии как «Неробол», так же известны
названия как «Анабол», «Напосим» и т.д., все это одно и то же.
25
1.2 Ветеринарно-санитарная оценка мяса на остаточное содержание
гормональных стимуляторов роста
Все гормональные препараты, используемые в ветеринарии и
животноводстве, являются фармакологическими веществами, которые
оказывают на организм животного многостороннее воздействие. Эти
препараты, наряду с желаемым целенаправленным действием на различные
стороны функциональной деятельности и продуктивности животных, в
определённых условиях могут проявлять отрицательное влияние. Таким
образом, применение гормональных препаратов в ветеринарии и
животноводстве, их приготовление, дозирование, кратность и способы
введения, их хранение, а также состояние обработанных животных и качество
получаемой от них продукции должны систематически и постоянно
контролироваться
ветеринарными
специалистами.
Все
данные
о
рекомендуемых к применению препаратах и их возможном побочном действии
включаются в соответствующие инструкции [77, 181, 182, 183, 184].
Особенно необходимо обращать внимание на наличие или отсутствие
остаточных количеств препаратов и компонентов их распада во внутренних
органах, мясе, молоке и других пищевых продуктах. Все продукты животного
происхождения после обработки биологическими стимуляторами, в том числе
гормональными препаратами, не должны содержать остаточных количеств
препаратов выше допустимого предела [185, 186].
Систематическое употребление продуктов питания, загрязненных
ксенобиотиками химического и биологического происхождения затрудняет
проведение ветеринарно-санитарной экспертизы этих продуктов, ухудшает их
качество, приводит к возникновению резистентных форм микроорганизмов,
является причиной различных форм аллергических реакций и дисбактериозов
[77, 187, 188].
Натуральные и синтетические гормоны, которые имплантируют
сельскохозяйственным
животным,
имеют
структуру,
аналогичную
человеческим гормонам, и обладают той же активностью. Однако, в отличие от
природных аналогов многие синтетические гормональные препараты
оказались более устойчивыми в организме животных, недостаточно
метаболизируются и накапливаются в больших количествах, и далее
мигрируют по пищевой цепочке в продукты питания. Кроме того,
синтетические гормональные препараты стабильны при приготовлении пищи,
способны вызывать нежелательный дисбаланс в обмене веществ и
физиологических функциях организма человека.
Естественным следствием применения гормональных препаратов в
животноводстве и птицеводстве явилась проблема загрязнения ими
продовольственного сырья и пищевых продуктов [189, 190, 191].
Как правило, за счет пролонгированной формы или имплантации
препараты длительное время находятся в организме животных на
определенном уровне. При нарушении сроков применения препаратов, а
26
также выдержки животных для выведения из организма стимулятора
препараты остаются в мясных продуктах. Кроме этого, соли хлорной кислоты
после выделения из организма животных с калом мигрируют из почвы в
растения, длительно сохраняются в них и снова попадают в организм
животных или человека с растительными продуктами или мясом [192, 193,
194].
С развитием науки были созданы многие гормональные препараты,
которые по анаболическому действию эффективнее природных гормонов в 100
раз и более. С целью ускорить "созревание" мяса, уменьшить содержание в нем
жира и обеспечить требуемую нежную текстуру, а также дешевизна их синтеза
определили интенсивное внедрение этих препаратов в практику
животноводства. Так, например, гексэстрол, диэтилстрильбэстрол, диенэстрол,
синэстрол, и др.
Медико-биологическими требованиями определены допустимые уровни
содержания гормональных препаратов в продуктах питания, мг/кг, не более:
мясо сельскохозяйственных животных, птицы и продукты их переработки эстрадиол 17β и тестостерон соответственно 0,0005 и 0,015; молоко и
молочные продукты, казеин - эстрадиол 17β на уровне 0,0002, масло коровье 0,0005 указанного гормонального препарата [195, 196, 197, 198].
В силу чрезвычайной важности и глобального характера проблемы
контроля остатков стимуляторов и лекарственных средств в пище,
затрагивающей вопросы здоровья огромного числа людей и, возможно,
будущих поколений, в законодательстве многих развитых стран мира
наблюдаются тенденции к расширению перечня обязательно контролируемых
препаратов, снижению предельно допустимых остаточных уровней этих
препаратов и даже к запрету на использование и торговлю некоторыми
препаратами, оказавшимися опасными для здоровья потребителей [199, 200,
201, 202].
Хотя в ряде стран (США, Канада, Австралия и др.) допускается
ограниченное применение гормональных стимуляторов роста под
государственным контролем, тем не менее часто встречаются злоупотребления,
в частности, использования запрещенных препаратов, увеличение их
дозировки, нарушение регламента использования и сроков выдержки животных
перед убоем (Белоусов А. В., 2002). В США гормоны получают около 90 %
крупного рогатого скота. В штате Айова, к примеру, диэтилстильбэстрол
использовался при откорме более чем 70 % скота и 90 % цыплят-бройлеров.
Официально разрешенные в США гормональные препараты (табл.1) включают
три естественных гормона (прогестерон, тестостерон, эстрадиол-17β) и три
синтетических (зеранол, меленгестролацетат и тринболонацетат) [9, 38, 203,
204, 205, 206].
В ряде Европейских стран разработаны и действуют национальные
программы контроля остаточного содержания гормонов в продукции
животноводства. Эффективность таких программ очевидна.
27
Разнообразие биологически активных веществ, а также необходимость
изучения их метаболизма в животном организме потребовало их
систематизации. Такая попытка в Российской Федерации была предпринята
исследователями
Санкт-Петербургской
государственной
академии
ветеринарной медицины (СПГАВМ) [207].
Согласно предложенной классификации, все вещества, влияющие на
продуктивность животных, подразделяются на три основные группы:
- чужеродные, потенциально опасные соединения антропогенного или
природного происхождения – ксенобиотики, это антибиотики, гормональные
препараты, тяжелые металлы, пестициды;
- средства, не являющиеся жизненно необходимыми для жизни животных эрготропики;
- средства, являющиеся жизненно необходимыми и обладающие
питательной ценностью, - кормовые добавки.
В развитых странах использование данных препаратов строго
контролируется уполномоченными органами государственного надзора. Так в
США существует несколько федеральных регулирующих организаций,
отвечающих за безвредность пищевых продуктов - Управление по контролю за
продуктами и лекарствами (FDA), служба контроля и безопасности пищевых
продуктов при Министерстве сельского хозяйства (FSIS) и Управление по
охране окружающей среды США (ЕРА).
Несколько заседаний в рамках Комитета экспертов объединенной
комиссии ФАО/ВОЗ было обращено к этой теме. Выпущен целый ряд
технических докладов по контаминации продуктов питания лекарственными
веществами, в том числе гормонов (WHOTechnical Report Series № 763 1988, №
788 1989, № 799 1990, № 815 1991, № 832 1993, № 851 1995, № 855 1995, № 864
1996, № 876 1998, №879 1998). Были приняты или вынесены на обсуждение
соответствующие законодательные положения правительствами ряда стран.
В настоящее время в развитых странах Запада действует Кодекс
Алиментариус, представляющий собой комплекс законодательных актов о
составе, свойствах и качестве пищевых продуктов.
С 1950 года, когда были получены первые данные о том, что добавка
гормональных препаратов в корм сельскохозяйственным животным ускоряет
их рост, повышает привесы и придает мясу нежный вкус и аромат, страны
Европы прошли путь от активного применения гормонов в скотоводстве до
полного запрета их использования в 1950 году. Причиной этому послужили
данные о возможном неблагоприятном воздействии гормональных препаратов
на здоровье человека, в частности, их канцерогенности [208, 209, 210].
Вследствие этого был запрещен импорт из США и Канады говядины,
выращенной с использованием гормональных стимуляторов роста (Directive
96/22/EC, Directive 96/23/EC,1996), что вызвало протест со стороны
американцев, которые уверяют в полной безопасности «гормонального» мяса.
Тем не менее, тот факт, что американская нация является самой «полной» в
28
мире, заставляет думать, что не последнюю роль в этом играет гормональный
фактор [211].
В связи с потенциальной опасностью, которую могут представлять остатки
гормональных стимуляторов в мясе и мясопродуктах, законодательство многих
стран ограничивает их использование и предусматривает соответствующий
контроль за содержанием гормональных препаратов на всех стадиях
производственного цикла – от периодического исследования мочи и крови
животных на фермах до контроля мяса и мясопродуктов, поступающих к
потребителю.
Тем не менее, в связи с предстоящим вступлением Российской Федерации
во Всемирную торговую организацию (ВТО) с целью гармонизации
ветеринарных требований к качеству продукции животного происхождения и
для обеспечения продовольственной безопасности населения, а также с учетом
положений Директивы ЕЭС №96/23 от 29 апреля 1996 года, Департаментом
ветеринарии МСХ РФ издано соответствующее Указание по организации
Государственного ветеринарного надзора за содержанием гормональных
стимуляторов роста и тиреостатиков в продуктах животного происхождения
(№10-7-1/900 от 04.10.99 г.), в котором отражены требования по
предупреждению попадания гормонов в продовольственное сырье; требования,
критерии и мероприятия, касающиеся их применения в ветеринарной практике,
а также лабораторный контроль за содержанием этих веществ в продуктах и
кормах. Был утвержден также план мероприятий по усилению контроля
качества и безопасности продукции животного происхождения, ведению
контроля и учета за ее движением и использованием, в котором определены
организации и лаборатории, осуществляющие мониторинг импортного
продовольственного сырья на наличие ксенобиотиков, в том числе и
гормональных стимуляторов роста (Московская горветлаборатория, ЦНМВЛ
МСХ РФ, ВНИИВСГЭ). В то же время в этом Указании, кроме проведения
соответствующего мониторинга, не предусмотрено никаких ограничений в
отношение продукции животного происхождения, содержащей повышенный
уровень гормонов, и не определен порядок ее реализации или переработки,
хотя актуальность решения этого вопроса очевидна [212, 213, 214].
В США фермеры начали давать коровам гормональные стимуляторы роста
ещё в 1950-х годах двадцатого столетия. Далее эта практика распространилась в
Канаду, Европу и другие страны. Первым таким стимулятором был
диэтилстильбэстрол (ДЭС) - синтетический заменитель женских половых
гормонов, применяемый тогда в медицине для предотвращения выкидышей и
некоторых других осложнений беременности. ДЭС прекрасно справлялся со
своей ролью стимулятора роста животных, однако к в 1970 году появились
сведения о сильной канцерогенности препарата и оспособствовании
возникновений аномалий у развивающегося плода. В связи с этим, ДЭС
считавшийся ранее безопасным был запрещен в медицине, а затем и в сельском
хозяйстве [215, 216, 217, 218].
29
В соответствии с этим, в 1989 году на всей территории Европейского
Союза было запрещено применение любых гормональных препаратов при
выращивании животных и птиц для производства мяса, молока и яиц.
Запрещен был также и импорт говядины, если при выращивании скота
использовались эти гормоны.
И если в Европе применение гормональных стимуляторов роста
запрещено, то в странах американского континента активно экспортирующих
мясо США, Канада, Бразилия, Аргентина и некоторых других, -это является
официально узаконенной практикой. Поскольку на каждый доллар,
потраченный на гормональные добавки, американский мясопромышленник
получает в среднем 20-долларовое увеличение прибыли. США и Канада
оспорили этот запрет в ВТО. В 1998 г. Апелляционный орган постановил, что
запрет не основывается на научно обоснованной оценке риска, как того требует
Соглашение по санитарным и фитосанитарным мерам. После этого США и
Канада ввели ответные меры на ряд европейских товаров. Объем санкций
составил 116,8 миллионов американских долларов и 11,3 миллионов канадских
долларов, соответственно [219, 220, 221, 222].
В настоящее время в США при выращивании крупного рогатого скота
мясного направления официально используются шесть гормонов: - три
натуральных гормона - эстрадиол, тестостерони прогестерон, а также три
синтетических гормона - зеранол (действует как женский половой гормон или
эстроген), меленгестрол ацетат (гормон беременности, или гестаген) и
тренболон ацетат (мужской половой гормон или андроген). Все гормоны в
виде капсул, за исключением меленгестрола, который добавляют в корм,
имплантируют в ухо животным, где они и остаются вплоть до убоя животных
[223].
В 2003 году Европейский Союз уведомил Секретариат ВТО о своей новой
Директиве 2003/74/EC по применению гормонов роста в животноводстве и
птицеводстве. Европейский Союз утверждал, что Директива 2003/74/EC
полностью отвечает требованиям ВТО, поскольку основывается на новых
научных данных, показывающих, что наличие риска для здоровья человека
убедительно требует запрета одного из этих гормонов, а также продолжения
запрета пяти других стимуляторов роста - на основе принципа
предосторожности. Тем не менее, США и Канада сохранили свои санкции в
действии и инициировали рассмотрение еще одного спора [224]. В октябре 2008
года Апелляционный орган подтвердил, что санкции были законными, но
настоятельно
рекомендовал
сторонам
приступить
к
процедуре,
предусмотренной статьей 21.5 Договоренности о правилах и процедурах,
регулирующих разрешение споров, с тем, чтобы окончательно прояснить
научное обоснование Директивы 2003/74/EC и урегулировать разногласие о
выполнении ЕС ранее вынесенного решения. В декабре 2008г. ЕС потребовал
проведения консультаций по разрешению спора с двумя сторонами, которые
предъявляют претензии по этому вопросу [225, 226, 227, 228].
30
В настоящее время в странах Европейского Союза использование
гормонов для улучшения скорости роста животных и птиц запрещено
директивой [229, 230]. В Российской Федерации также введен запрет на
использование гормональных стимуляторов роста и тиреостатиков [19, 32, 33].
В Республике Казахстан проблемы, связанные с качеством и
безопасностью продуктов - это результат отсутствия нормативной базы в своём
выступлении говорит вице-президент Казахской академии питания, глава
лаборатории иммунологии Игорь Цой [231].
Требования в казахстанских стандартах существенно отличаются от
международных документов, в частности, от рекомендаций ВОЗ и Всемирной
Продовольственной
Организации.
Техническая
оснащенность,
регламентирующие документы не всегда могут контролировать импортную
животноводческую продукцию. Зарубежные производители и поставщики
продуктов животного происхождения знают, что Казахстан не имеет
технической возможности контролировать их на содержание тех или иных
потенциально опасных компонентов. И соответственно, этот факт используют
в своих целях.
Применение лекарственных препаратов и кормовых добавок в
ветеринарии, животноводстве и птицеводстве требует соблюдения
определенных гигиенических правил, направленных на снижение загрязнения
продовольственного сырья и пищевых продуктов. Необходим контроль
остаточных количеств загрязнителей в животноводческом сырье и продуктах
питания, а также разработка быстрых и надежных методов их анализа.
Актуальность рассматриваемой проблемы обусловлена, кроме того,
расширением поставок зарубежной продукции с весьма разнообразным
спектром разрешенных там препаратов. Немаловажное значение имеют
накопление банка используемых препаратов, их идентификация и разработка
достоверных методов их определения в животноводческом сырье и пищевых
продуктах.
31
1.3 Методы определения остаточных количеств гормонов в мясе
Стратегия контроля содержания анаболических агентов в продукции
животного происхождения и кормах включает использование скрининговых
(отборочных) и подтверждающих (арбитражных) методов. [90, 232].
Скрининг-тестом можно назвать метод, позволяющий очень точно и быстро определить наличие остатков веществ в большом количестве образцов
[233].
Существует несколько типов скрининг-тестов, это микробиологические и
иммунологические скрининг-тесты, а также тонкослойная хроматография,
высокоэффективная жидкостная хроматография и рецепторный анализ [234].
К основным характеристикам скрининг-методов относятся: стабильность,
низкая стоимость, быстрота проведения анализа, легкость приготовления
образцов, небольшое количество ложноположительных результатов,
отсутствие ложноотрицательных результатов и безопасность в использовании.
Радиоиммунный анализ (РИА), рецепторный анализ (РА), иммуноферментный
анализ (ИФА), биосенсорный иммуноанализ (БИА) и флуороиммуннный
анализ - это скрининг-методы, основанные на связывании белков [80].
В мировой практике для определения остатков гормональных препаратов
используются инструментальные физико-химические методы анализа, такие
как высокоэффективная жидкостная хроматография высокого давления
(ВЭЖХ), для которой разработано много вариантов ее проведения.
Предпочтение отдается, как правило, обращенной фазной хроматографии.
Применяется газовая хроматография-масс-спектрометрия (ГХ-МС) [71, 235,
236, 237]. Методы предусматривают использование дорогостоящего
оборудования, нуждающегося в высококвалифицированном обслуживании. В
Казахстане далеко не каждая лаборатория имеет в своем оснащении указанное
оборудование.
Создание современных спектрометров позволило совместить в одном
методе скрининг и подтверждающие возможности. Хромато-массспектрометрия, сочетающая хроматографию с масс-спектрометрическим
детектированием аналитов. Эти методы являются арбитражными методами [72,
74, 238, 239, 240].
Для обнаружения веществ после разделения часто применяют УФдетекторы с максимумами поглощения в области 220-254 нм, однако, учитывая,
что гормоны слабо поглощают свет в ультрафиолетовой области, предел
обнаружения находится на уровне микрограммовых количеств. При
необходимости повышение чувствительности может быть достигнуто путем
получения легко детектируемых производных [235, 236, 237].
Один из способов решения проблемы определения остаточных количеств
ветеринарных препаратов - использование метода иммуноферментного анализа
(ИФА), который уже более 10 лет используется в странах ЕС, США и Японии
и является основным скрининговым методом в этих странах. Согласно
директиве ЕС2002/657, ИФА является рекомендованным скрининговым
32
методом для определения остаточных количеств ветеринарных препаратов в
продуктах животного происхождения в странах Европейского Союза [17, 81,
84, 167, 168, 169, 170, 199, 200]. В связи со вступлением нашей Республики в
ВТО, данная рекомендация будет обязательна для выполнения органами
ветеринарно-санитарной службы РК.
Важным преимуществом ИФА является высокая чувствительность,
специфичность, правильность и воспроизводимость результатов исследования,
применение стандартных препаратов, не требуется сложная измерительная
аппаратура, метод безопасен, пригоден при проведении массовых исследований
пищевых продуктов [127, 199, 201, 229].
1.4 Иммуноферментный анализ
Иммуноферментный анализ является одним из наиболее активно
развивающихся направлений химической энзимологии как в нашей стране, так
и за рубежом. Это обусловлено тем, что в ИФА уникальная специфичность
иммунохимического анализа сочетается с высокой чувствительностью
детекции ферментативной метки. Высокая стабильность реагентов, простота
методов регистрации и многие другие достоинства метода ИФА
способствовали его широкому внедрению в различные области медицины,
сельское хозяйство, биологическую промышленность, охрану окружающей
среды, а также в научные исследования [199, 201, 202, 203].
Иммунологический подход основан на выявлении специфичных антител к
инфекционному агенту. Подход удобен и в настоящее время является едва ли
не самым используемым в диагностике инфекционных заболеваний в
медицине.
Иммунохимические методы анализа, основанные на специфическом
связывании определяемого соединения соответствующими антителами, широко
вошли в аналитическую практику и используются в различных областях
медицины,
сельского
хозяйства,
микробиологической
и
пищевой
промышленности, для целей охраны окружающей среды. Индикация
образующегося комплекса антиген-антитело может быть осуществлена, если в
один из исходных компонентов реакционной системы ввести метку, которая
легко детектируется соответствующим высокочувствительным физикохимическим методом. Весьма удобными для этой цели оказались изотопные,
ферментные, флуоресцентные, парамагнитные и др. метки, использование
которых дало возможность увеличить чувствительность классических
иммунохимических методов анализа в миллионы раз, а время анлиза
уменьшить до нескольких минут [201, 241].
Исторически первым среди них был радиоиммунологический анализ
(РИА), предложенный в конце 50-х годов прошлого века. Благодаря
возможности определять метку, которой являлся изотоп 125I, в очень малых
концентрациях, удалось достигнуть высокой чувствительности анализа (на
уровне пкг/мл). В середине 60-х годов для идентификации и локализации
33
антигенов в гистохимических препаратах и выявления полос преципитации в
иммунодиффузных и иммуноэлектрофоретических методах в качестве
высокочувствительной метки было предложено использовать молекулы
ферментов. Являясь по своей природе мощными химическими катализаторами,
ферменты способны эффективно осуществлять наработку легко детектируемого
продукта, что делает возможным определение ферментной метки в весьма
малых концентрациях (до 10-12 М и ниже) [241, 242].
Первичным процессом в иммуноферментном анализе является стадия
«узнавания» анализируемого вещества специфическим к нему антителом. Так
как процесс образования иммунохимических комплексов происходит в строго
количественном соотношении, обусловленном аффинностью, концентрациями
компонентов и условиями реакции, то достаточным для определения исходной
концентрации анализируемого вещества является количественная оценка
образовавшихся иммунных комплексов. Для оценки возможно прямое
определение концентрации образующихся иммунных комплексов, и
количественная оценка оставшихся свободными мест специфического
связывания. Вторым процессом, онобщий для любого метода ИФА, является
формирование связи меченного ферментом вещества со специфическим
комплексом или свободными центрами связывания. Заключительным
обязательным процессом в ИФА является трансформация ферментной метки в
соответствующий сигнал, измеряемый каким-либо физико-химическим
методом: флюорометрическим, люминесцентным, спектрофотометрическим, и
т.д., что достигается путем измерения скорости превращения субстрата или
количества продукта, образующегося за фиксированный промежуток времени
[243].
На протяжении последних трех десятилетий иммуноферментные методы
анализа интенсивно развивались как в теоретическом, так и практическом
плане и к настоящему времени они сформировались в самостоятельное научное
направление, имеющее важное прикладное значение. Наибольшее
распространение получили гетерогенные методы иммуноферментного анализа,
основанные на использовании полистирольных планшетов для иммобилизации
антител или антигенов, специфическом связывании определяемого вещества на
стенках лунок планшета и последующем выявлении образовавшихся иммунных
комплексов с помощью меченных ферментами компонентов [241, 244].
Гетерогенные методы ИФА
Гетерогенный иммуноферментный анализ объединяет методы, в которых
анализ проводится в двухфазной системе, при этом разделение на фазы может
происходить на любой стадии определения. В целях удобства классификации
целесообразно проводить разделение гетерогенных методов по характеру
проведения первой стадии «узнавания», которая является определяющей для
всего анализа. Если на первой стадии антиген или антитело используют в
иммобилизованном состоянии и формирование специфического иммунного
комплекса проходит на твердой фазе, то метод называетсятвердофазным. Если
же на первой стадии анализа образование специфических иммунных
34
комплексов происходит в растворе, а лишь затем для целей разделения
используют твердую фазу с иммобилизованным реагентом, то такие методы
классифицируются как гомогенно-гетерогенные [201, 241, 244].
Использование твердых носителей для сорбционной или ковалентной
иммобилизации антител с последующим специфическим связыванием анализируемого соединения на иммунном сорбенте и выявлением образовавшихся
иммунных комплексов с помощью меченых ферментами компонентов
положило начало методам твердофазного (гетерогенного) ИФА [3] или ELISA от англ. Enzyme Linked Immunosorbent Assay [167, 168, 169].
Чаще всего в качестве ферментной метки используются пероксидаза хрена,
щелочная фосфатаза и глюкозоксидаза. Пероксидаза хрена выделяется из корня
хрена, она расщепляет перекись водорода. Метод выявления активности
пероксидазы основан на окрашивании хромогена, который выступает в роли
донора электронов, в присутствии перекиси водорода. В качестве хромогена
могут быть использованы: 3-диаминобензидин тетрахлорид (DAB), 3-амино-9этилкарбазол (AEK), 4-хлоро-1-нафтол, п-фенилендиамин дигидрохлорид [170,
244].
Методы выявления щелочной фосфатазы основаны на использовании
искусственных субстратов (фосфаты нафтолов) с добавлением в
инкубационную среду солей диазония. Локализация фермента после гидролиза
субстрата становится видимой в результате образования из солей диазония
нерастворимых азокрасителей. В качестве субстрата могут быть использованы
нафтол AS-MX фосфат, нафтол AS-BI фосфат, нафтол AS-TR фосфат или 5бромо-4-хлоро-3-индоксил фосфат. В качестве хромогена применяются
прочный красный TR, прочный синий ВВ, «новый фуксин», нитро синий
тетразолий [245, 246].
Многообразие методов гетерогенного иммуноферментного анализа,
относящихся к первым и вторым типам, обусловлено возможностью введения
ферментной метки как в молекулу антигена, так и молекулу антитела. Кроме
того, для конкретной схемы анализа определяющим является, какой из
реагентов – антитело или антиген, использован в иммобилизованном виде для
разделения иммунохимических комплексов от не связавшихся компонентов.
Можно выделить несколько видов твёрдофазного ИФА: прямой и непрямой, а также конкурентный и неконкурентный.
Прямой метод был разработан в 1940 годах. Исследователь Coons А.Н.
[240] с соавторами метил антитела флуоресцентной меткой для выявления
тканевых антигенов. В этом методе меченые первичные антитела
взаимодействовали напрямую с антигенами. Прямой метод чаще используется
для иммуногистохимических окрашиваний клеток и тканей.
В непрямом методе как минимум две стадии, для определения используют
меченые вторичные антитела. Впервые метод описан исследователями Weller и
Coonsв 1954 году [242]. Вначале первичные антитела инкубируют с антигеном,
затем следует этап инкубации с вторичными мечеными антителами, которые
35
распознают первичные антитела. Для этого метода очень важно, чтобы
конъюгат фермента с антителом обладал высокой специфической активностью.
Твердофазный неконкурентный метод проведения ИФА, основанный на
использовании пары антител различной антигенной специфичности, одно из
которых иммобилизовано на поверхности твердого носителя-планшета (рис.7),
а второе конъюгировано с ферментной меткой - пероксидазой хрена. В лунки
полистирольного планшета с сорбированными антителами вносят
анализируемый образец, инкубируют в течение одного часа, при этом
анализируемый антиген вступает в реакцию с антителами и образует на
поверхности лунок иммунный комплекс. Планшет отмывают от несвязавшихся
компонентов и добавляют меченные ферментом пероксидазой хрена антитела.
После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата антител с
ферментом определяют ферментативную активность носителя, которая
пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена. На стадии
выявления специфического иммунного комплекса антиген оказывается, как бы
зажатым между молекулами иммобилизованных и меченых антител, что
послужило поводом для широкого распространения названия «сэндвич»-метод.
Схема, может быть использована для анализа только тех антигенов, на
поверхности которых существуют, по крайней мере, две расположенные
далеко друг от друга антигенные детерминанты, а для определения большого
числа моновалентных антигенов (низкомолекулярные гормоны, лекарственные
соединения, пестициды), метод неприемлем [247, 248].
Рисунок 7 - Планшет 96-луночный для проведения гетерогенногоИФА
Твердофазныйконкурентный анализ низкомолекулярных антигенов
может быть осуществлён по следующей схеме. К иммобилизованным на
носителе антителам добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген и
фиксированную концентрацию конъюгата антигена с ферментом. После
проведения инкубации носитель отмывают от несвязавшихся свободного и
меченого антигена и регистрируют ферментативную активность на носителе,
которая обратно пропорциональна концентрации определяемого антигена.
36
Конкурентные
твердофазные
методы
обладают
меньшей
чувствительностью по сравнению с неконкурентными. Предел обнаружения
различных соединений для них ограничен как чувствительностью регистрации
ферментной метки, так и аффинностью антител, в то время, как для
неконкурентных методов, при отсутствии неспецифических взаимодействий, только чувствительностью определения фермента. Поэтому для достижения
высокой чувствительности анализа конкурентным методом необходимо
использовать высокоаффинные антитела [249, 250].
Гомогенные методы ИФА.
К гомогенным относятся методы, осуществляемые в однофазной системе,
и не требующие стадии механического разделения образовавшихся комплексов.
Впроцессе гомогенного ИФА регистрируется концентрация не образующегося
специфического комплекса антитело-антиген, а оставшихся свободными
центров специфического связывания. Однако, в противоположность
гетерогенным
схемам,
наблюдаемая
ферментативная
активность,
соответствующая концентрации незанятых мест специфического связывания,
может как уменьшаться, так и увеличиваться, что обусловлено различной
природой воздействия связывания лигандов на ферментнативную активность.
Введение метки в молекулу антигена является одним из наиболее
распространенных подходов в гомогенных методах иммуноферментного
анализа. Всегомогенные методы относятся к конкурентным и основаны на
одновременном взаимодействии с антителами анализируемого антигена и
меченого антигена. После образования в растворе соответствующего
иммунохимического комплекса проводят измерение ферментативной
активности, которая пропорциональна концентрации свободного или
связанного меченого лиганда [203, 250, 251].
Одним из распространенных гомогенных методов является EMITанализ (enzyme multiplied immunoassay technique), основанный на изменении
активности ферментной метки в конъюгате фермент-антиген при образовании
комплекса с антителами, происходящем в результате конформационных
перестроек в молекуле фермента или стерическом исключении доступности
молекулы субстрата к активному центру фермента при комплексообразовании
конъюгата с антителами. Достоинствами гомогенных методов является
значительное сокращение времени проведения анализа (несколько минут),
недостатками – меньшая чувствительность и возможность влияния состава
анализируемого образца на результаты анализа [90, 252].
37
1.5 Получение иммуногенов и иммунореагентов ИФА
При разработке иммунохимического метода наиболее ответственным этапом исследований является получение специфических иммунологических
реагентов, определяющих чувствительность и специфичность анализа, это
получение высокотитражных, высокоаффинных антисывороток таким
способом, который сохранит жизнеспособность иммунизируемых животных
[81, 82]. Исходя из этого, необходимо знать некоторые основы иммунологии,
свойства антигенов и адъювантов, а также возможные пути и схемы введения
антигенов животному. Для получения поликлональной сыворотки с высоким
титром
необходимо
использовать
для
иммунизации
животных
филогенетически далекого вида, это связано с тем, что, чем больше различий и,
следовательно, эпитопов, тем больше продукция антител [81, 84].
Поликлональные антисыворотки, получаемые при иммунизации
животных, обычно кроликов, коз или овец, содержат антитела к различным
эпитопам иммуногена. Наиболее важным преимуществом поликлональной
антисыворотки является то, что она образует крупные нерастворимые
интенсивно окрашиваемые при иммуногистохимическом исследовании
комплексы с антигеном благодаря одновременному связыванию антител с
многими эпитопами антигена, вследствие этого они менее чувствительны к
конформационным изменениям антигена. [167, 169, 253].
Кролик, единственный вид чаще всего используемый для иммунизации изза подходящего размера, легкости взятия крови, относительно длительного
срока жизни (5-8 лет) и возможности отбирать адекватный объем сыворотки с
высоким титром антител и их высокой аффинностью [84, 90, 254].
Для получения иммунной сыворотки необходимо подобрать оптимальную
схему иммунизации животных, которая зависит от множества факторов. Это,
прежде всего физико-химическое состояние вводимого антигена, его
активность, доза, способы, интервалы и кратность введения антигена, общая
продолжительность цикла иммунизации, применение адъювантов и
иммуномодуляторов.
Антитела, которые используются в иммунологических методиках,
получают путем повторной иммунизации животных. Затем в период
максимальной выработки антител у животных забирается кровь, из которой
затем выделяют фракцию иммуноглобулинов.
Специфическую
активность
полученных
иммунных
сывороток
определяют титрованием. Таблица 2.
Способы получения конъюгатов, т.е. комплекса фермента со
специфическим реагентом, могут быть разделены на три группы. К первой
группе относятся методы химического связывания.
Вторая группа методов основана на образовании иммунохимического
комплекса между ферментом и специфическим антителом к ферменту.
Принцип методов третьей группы заключается в последовательном проведении
двух этапов.
38
Таблица 2 - Методы оценки активности антител в ИФА
Относительная Методы с одним разведением сыворотки
активность
1/1000
антител
ВС (А405)
П/О
МНА
СК
Слабо
отрицательная
0,09
0,6
0,4
35
Стандартная
отрицательная
0,15
1.0
1,0
90
Слабо
положительная
0,55
3,7
12
1100
Средне
положительная
1,75
11,7
107
7000
Сильно
положительная
3,8
25,3
463
80000
Титрование
ЭД
Т
0,37
30
0
70
1,19
1100
1.9
5600
3,89
550000
На первом этапе, с одной стороны, фермент, а с другой стороны,
специфический реагент химически модифицируется реагентами, имеющими
между собой высокое значение константы связывания, например, авидинбиотин или гаптен-антитело. На втором этапе проводят реакцию между
модифицированными, ферментом и специфическим реагентом, приводящую к
образованию конъюгата по типу реакции антиген-антитело [254].
Методы химического связывания можно, в свою очередь, разделить на
следующие группы:
- методы периодатного окисления, основанные на образовании новых
реакционных групп на ферменте и их последующем взаимодействии с
реакционными группами специфического реагента;
- методы соединения фермента и специфического реагента за счет
гомобифункционального реагента;
- методы соединения фермента и специфического реагента
гнтеробифункционального реагента.
Методы иммунохимического связывания. Эта группа методов основана на
образовании
фермент-антиферментного
комплекса,
который
после
присоединяется к иммунохимическому комплексу на твердой фазе за счет антиимуноглобулинов. Для фермент-антиферментного комплекса характерно
максимальное сохранение ферментативной активности. Образование ферментантиферментного комплекса может быть осуществлено двумя способами, в
процессе последовательного добавления к иммобилизованной твердой фазе
вначале антиферментных антител, а затем фермента или путем
предварительного получения такого комплекса [168, 170, 199, 203].
Последним компонентом специфического комплекса на твердой фазе
является конъюгат. Точнее, его ферментативная активность, а следовательно и
концентрация, будет пропорциональна концентрации остальных компонентов
комплекса, один из которых подлежит определению.
39
В середине семидесятых годов двадцатого века был разработан
принципиально новая технология получения антител, основанный на слиянии
то есть, гибридизации лимфоцитов иммунизированного животного с
миеломными клетками с образованием новых клеток – гибридом.
Особенностью гибридомных клеток является их способность размножаться и
продуцировать антитела в искусственных условиях invitro - вне организма. С
помощью специальных методов клонирования можно выделить одну
гибридную клетку, которая, размножаясь, будет секретировать в
неограниченных количествах антитела только одного вида – моноклональные
антитела, которые являются гомогенными как по специфичности, так и по
физико-химическим свойствам [169, 200, 201].
Моноклональные антитела (МА), в отличие от поликлональных, являются
продуктом секреции одной антителопродуцирующей клетки, либо ее потомков
- клона, образовавшихся в процессе деления этой клетки. Все моноклональные
антитела, являющиеся продуктом одного клона, представлены идентичными
молекулами. Основными свойствами моноклональных антител являются:
- все молекулы моноклональных антител, являющиеся продуктом одного
клона, имеют одинаковую специфичность, таким образом, направлены против
одинаковых мест связывания - антигенных детерминант на каком-либо
конкретном антигене, тогда как поликлональная сыворотка имеет в своем
составе антитела к разным участкам связывания с антигенам и даже к разным
антигенам.
- все молекулы моноклональных антител, являющиеся продуктом одного
клона, имеют одинаковое сродство к связываемому антигену (аффинность), то
есть моноклональные антитела бывают высокоаффинными («прочно»
связывающие антиген) и низкоаффинные (образующие легко диссоциирующий
комплекс с антигеном). Поликлональная сыворотка всегда представлена
антителами разной аффинности.
- все молекулы моноклональных антител, являющиеся продуктом одного
клона, имеют один изотип и субизотип иммуноглобулинов, в поликлональной
сыворотке несколько изотипов.
Технология
получения
гибридом
–
клеток,
продуцирующих
моноклональные антитела, впервые была описана в 1975 году Келером и
Мильштейном. Гибридные клетки получали путем слияния мутантных клеток
плазмоцитом и спленоцитов мышей, иммунизированных эритроцитами барана.
В качестве индуктора слияния клеток использовали вирус Сендай. Гибридные
клетки культивировали в полужидком агаре, содержащим метаболические
ингибиторы опухолевых клеток [82, 85].
С
развитием
гибридомной
технологии
методика
получения
моноклональных антител претерпела существенных изменений. В качестве
индуктора слияния клеток в современных технологиях используется
полиэтиленгликоль. И на смену полужидкому агару пришла техника
лимитирующих разведений. Рисунок 8.
40
Таким образом, работы по получению новых моноклональных антител в
целях создания на их основе лекарственных и диагностических средств очень
перспективны. Гибридомная технология стала прорывом в разработке
препаратов для лечения злокачественных новообразований, вирусных,
аутоиммунных и многих других заболеваний. Терапия с помощью
моноклональных антител эффективна, очень специфична, т.е. нацелена только
на определенный патологический механизм, являющийся причиной
заболевания, и, следовательно, сравнительно безопасна. Уже сегодня более 20%
разрабатываемых биофармацевтических препаратов являются продуктами
гибридомной технологии. Всего в мире на различных стадиях разработки
находится свыше 350 лекарственных средств, содержащих МА, семьдесят из
них проходят клинические испытания [249, 250].
Рисунок 8 - Основные этапы получения гибридом
Разработанные варианты ИФА различаются типом твердой фазы и
способами присоединения к ней первого специфического реагента, числом и
последовательностью добавления остальных специфических реагентов,
способом промывки твердой фазы, способом получения конъюгата, природой
41
фермента в конъюгате, типом используемого субстрата, способом выражения
результатов анализа и т.д.
В каждом из вариантов ИФА можно выделить следующие общие этапы:
- получение иммуносорбента;
- формирование многослойного комплекса на твердой фазе за счет
последовательного проведения специфических реакций;
- удаление неспецифически связавшихся компонентов, а также их избытка;
- получение ферментного конъюгата;
- измерение ферментативной активности специфического комплекса на
твердой фазе;
- интерпретация результатов анализа.
Подготовку иммуносорбентов проводят путем ковалентной «пришивки»
антигена или антитела к поверхности матрицы либо путем их физической
адсорбции. Связывание белков с носителем происходит за счет гидрофобных и
электростатических взаимодействий.
Подготовку иммуносорбентов проводят путем ковалентной «пришивки»
антигена или антитела к поверхности матрицы либо путем их физической
адсорбции. Связывание белков с носителем происходит за счет гидрофобных и
электростатических взаимодействий.
При адсорбции антигена или антител на твердой фазе необходимо
соблюдать некоторые требования:
- наилучшая адсорбция антигенов обеспечивается при нейтральной pH;
- оптическая концентрация сорбируемого белка составляет 1-10 мкг/см3;
- достаточная чистота исследуемого материала;
- сорбцию обычно проводят при температуре 4оС в течение ночи.
Сенсибилизированную таким образом твердую фазу можно хранить в
сухом месте в течение года [90, 170, 252].
Таким образом, как показывает зарубежный опыт, организация контроля
пищевых продуктов иммуноферментным методом возможна минимальными
средствами и в самые короткие сроки. Простота эксплуатации и незначительная
стоимость необходимого оборудования выгодно отличают иммуноферментный
метод от классических методов анализа и делают его особенно
привлекательным для лабораторий с ограниченными финансовыми
возможностями.
Следует отметить, что областные региональные, а также районные
ветеринарные лаборатории Казахстана имеют в своем оснащении почти 100%
приборы для проведения иммуноферментного анализа. Метод, успешно освоен
и специалисты на протяжении десяти лет диагностируют многие болезни.
Это ещё раз раз подчеркивает актуальность предполагаемых нами
исследований, практическую ценность экспресс-тестов (ИФА) и их
превостепенное значение при проведении массовых исследований пищевых
продуктов.
42
2 Собственные исследования
2.1 Материал и методы исследований
Работа выполнена в иммунобиологической лаборатории Инновационного
научного
образовательного
центра
Костанайского
государственного
университета имени Ахмета Байтурсынова (ИНОЦ КГУ им. А. Байтурсынова) в
Научно-исследовательском институте биотехнологии АО «Казахский
агротехнический
университет
имени
Сакена
Сейфуллина»
(НИИ
биотехнологии КАТУ им. С.Сейфуллина), и в отделе пищевой безопасности
Республиканской ветеринарной лаборатории Акмолинского регионального
филиала республиканского государственного предприятия (РГП).
При проведении исследований применялись физико-химические,
серологические, иммунохимические, биотехнологические и аналитические
методы.
Мониторинговые исследования по обнаружению остаточных количеств
гормональных стимуляторов роста в сырье и продуктах животного
происхождения проводили методом отбора образцов на предприятиях, в
лабораториях, в торговой сети г. Костанай.
Пробы мышечной ткани животных и птиц импортного и отечественного
происхождения предоставлены отделом безопасности пищевой продукции и
перемещения объектовКостанайской областной территориальной инспекции
Комитета ветеринарного контроля и надзора МСХ РК и отделом пищевой
безопасности РГП Республиканской ветеринарной лаборатории.
2.1.1 Материалы исследований
Исследованию подвергали фарш куриный, мышечную ткань птицы
производства стран Бразилия, Соединённые Штаты Америки, Канада,
Российская Федерация, Республика Казахстан, мышечную ткань крупного
рогатого скота из стран Бразилия, Польша, США, Казахстан, мясо конины
происхождения Российской Федерации и Республики Казахстана, мышечную
ткань свиней производства Россия, Беларусь, Казахстан - всего 315 образцов
мяса.
В работе были использованы:
Лабораторные животные:
- беспородные кролики весом 2-3 кг, самцы, возраст 6-12 месяцев;
- мыши линии BALB/c;
- беспородные мыши.
Химические и биологические препараты: лиофилизат эстрадиола SigmaAidrich (Китай), бычий сывороточный альбумин (БСA), производства Россия,
овальбумин (OВA), (IgG-Free, Protease-Free), производства Jackson Immuno
Research (США), коллоидное золото (~0.01% HAuCl4~1A520 ед/мл,
монодисперсный, размер частиц 20 нм, фирма Sigma, США), фермент
43
пероксидаза хрена «Sigma (ТипVI, лиофилизированный, 250-330ед/мг, RZ-3.0),
цианамид (CyanamideM.W.= 42,04) производства MPBiomedicals Франция),
глутаровый альдегид (Fluka, Швейцария), хлористоводородный 1–этил 3-(3диметиламинопропил) карбодиимид (EDC), фирма Sigma-Aidrich, США,
сыворотка плода коровы фирм HyClon (США), миеломная линия клеток
Х63.Ag.8.6.5.3, среда RРМI-1640 (Sigma, США), Hepesфирма Sigma, США, Lглютамин (фирма Sigma, США), 2-меркаптоэтанол, фолиевая кислота, Кумасси
G-250, полиэтиленгликоль (ПЭГ), (фирма Sigma, США), пристан,
диметилсульфоксид (ДМСО) (ПанЭко, Россия), коммерческие конъюгаты 17β–
estradiolс BSA, 17β–estradiol с ОVA (фирма Sigma, Китай), полный и неполный
адъюванты Фрейнда (Sigma, США), Трис, гипоксантин, аминоптерин, тимидин
(ГАТ), агароза.
Химические реактивы: ацетонитрил, этилацетат, тетрагидрофуран, ацетон,
метанол, гексан, дихлорометан, соляная кислота концентрированная,
слабоконцентрированная серная кислота, 7,5% бикарбонат натрия, пируват
натрия, натрия хлорид, калия хлорид, метанол, 70% фосфорная кислота,
лимонная кислота, щавелевая кислота, диэтиловый эфир, этиловый спирт 96º,
хлороформ, натрий фосфорнокислый однозамещенный химически чистый,
калий фосфорнокислый однозамещенный химически чистый, бисакриламид,
сульфат
аммония,
дисульфат
аммония,
деионизированная
вода,
дисстиллированная вода, твин-20, твин-80.
Иммуноферментные тест-системы для обнаружения гормонов эстрадиола,
прогестерона и тестостерона в продуктах животного происхождения
производства ООО «Медицина. Аналитика. Ветеринария», Российская
Федерация.
Препараты для проведения реакции иммунной диффузии (РИД),
иммуноферментного анализа (ИФА), иммуноблотинга, гельфильтрации и
электрофореза.
Лабораторная посуда и инструменты:
- одноразовая пластиковая лабораторная посуда (пробирки);
- мерная стеклянная лабораторная посуда (колбы, стаканы, цилиндры);
- чашки Петри пластиковые и стеклянные различных диаметров;
- 96-луночные планшеты с плоским дном;
- 24-луночные планшеты-мультичашки пластиковые;
- пластиковые флаконы с площадью роста 25, 75 см2.
- шприцы одноразовые, объем 1мл, 2 мл, 5мл, 10 мл;
- микрошприцы 10 мкл, МШ-10;
- пипетки 0,1—10 мл;
- пипетки объёмом 0,1 мкл – 1000 мкл.;
- воронки;
- предметные и покровные стёкла;
- камера Горяева.
Для работы по получению гибридом использовали специальную
стерильную пластиковую посуду для культуры клеток.
44
Приборы, оборудование, инструменты:
- гомогенизатор лабораторный;
- центрифуга низкоскоростная (Россия);
- водяная баня, (Россия);
- вошер для планшет ИФА (Проплан, Россия);
- шейкер термостатирующий для планшетИФА (Проплан, Россия);
- шейкер-качалка – встряхиватель (Латвия);
- спектрофотометр вертикального сканирования для ИФА «Униплан»
(фирмы ЗАО «ПИКОН», Россия);
- прибор для встряхивания пробирок «Vortex»;
- спектрофотометр с вертикальным потоком света (ASYSExpert 96,
Австрия);
- принтер для ИФА «Униплан» (фирмы ЗАО «ПИКОН», Россия);
- обращеннофазовый выcoкoэффeктивный жидкocтный хрoмaтoгрaф
«Аджелен 1100» на основе спектрометрической детекции с 4-х градиентным
насосом;
- концентрирующие патроны «диапак С16»;
- автосамплер до 50 мкл. ;
- кoлoнки aнaлитичecкиe хрoмaтoгрaфичecкиec внутрeнним диaмeтрoм 4,6
мм, С – 18 - 150 мм для oбрaщeнoфaзoвoй ВЭЖХ;
- детектор DAD (диодно-матричный);
- детектор FLD– флюоресцентный детектор;
- инкубатор СО2 фирма Ламинар, Россия;
- инвертированный микроскоп, Германия;
- весы лабораторные;
- магнитная мешалка MS-01 фирмы ELMI, Латвия;
- лабораторная центрифуга СМ-6МТ фирмы ELMI, Латвия;
- устройство для дегазации растворителей;
- мембранные фильтры 0,22 мкм (''Millipore'', США);
- скальпели; пинцеты, ножницы, ножи.
45
2.1.2 Методы исследований
2.1.2.1 Методика ИФА по определению эстрадиола, прогестерона,
тестостерона тест-системой ООО «Медицина. Аналитика. Ветеринария»
Подготовка проб для исследований в ИФА
По одной методике пробоподготовки выполнялись анализы на три
различных гормона: эстрадиол, прогестерон, тестостерон.
Цель подготовки пробы для исследований состояла в превращении пробы
мяса в подходящую для последующего анализа форму - раствор, а также для
концентрирования и разбавления аналита и избавления от мешающих анализу
компонентов. Подготовка проб мяса для исследований состояла из
совокупности действий: измельчение, гомогенизация, экстракция, гидролиз
и осаждение пробы.
Для определения истинной концентрации гормонов в каждом исследуемом
образце мяса необходимо оценить процент выхода дополнительно вносимого
стероида. Для этого каждый образец пробы исследовали как в чистом виде, так
и с добавлением гормона. Во всех случаях для анализа одного образца
одновременно исследовали 2 пробы того же образца с добавлением
калиброванных растворов гормона, вносимых в образец до гомогенизации и
после экстракции. С этой целью брали усредненную навеску из разных мест
исследуемого образца массой 40 г., которую делили на две части по 20 г.,
каждая. В одну из частей вносили 20 мкл калиброванного раствора
исследуемого гормона с соответствующим содержанием гормона для оценки
эффективности экстракционной процедуры. Исследуемые пробы тщательно
гомогенизировали до мелкодисперсного состояния в 40 мл дистиллированной
воды каждая. Затем обозначали три чистых пропиленовых флакона №1, №2 и
№3. Во флаконы №1 и №2 отбирали по 3 грамм гомогената, полученного без
внесения калиброванного раствора гормона, а во флакон №3 – 3 грамма
гомогената с добавлением калиброванного раствора исследуемого гормона. Во
все флаконы приливали тройной по отношению к гомогенату объем
диэтилового эфира - 9 мл, плотно закрывали крышками, тщательно встряхивали
в шейкере в течение 5-10 минут, центрифугировали при 3000g в течение 10
минут и в течение 60 минут выдерживали при температуре минус 18°С с целью
замораживания водной нижней фазы. По истечении времени замораживания
прозрачную эфирную фазу каждого образца аккуратно сливали в чистые
пропиленовые флаконы и выпаривали досуха на водяной бане с температурой
воды 370 С или 600 С в вытяжном шкафу. Из флакона №2 переносили 380 мкл
элюата в чистый флакон, добавляли по 20 мкл калиброванного раствора для
прогестерона - 500 нг/мл, для тестостерона - 300 нг/мл, для эстрадиола-17В 50нг/мл, перемешивали и обозначали флакон Z. Флакон №1 обозначают X, а
флакон №3–Y. Из флаконов X, Y, Z отбирали в чистые, соответственно
маркированные пробирки по 60 мкл исследуемых проб добавляли в каждую по
46
390 мкл промывочного буфера, перемешивали и использовали в ИФА [227, 228,
229].
Для исследования мяса на остаточное количество гормональных
стимуляторов роста использовали метод непрямого конкурентного
твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Принцип метода основан
на конкуренции гормона, адсорбированного на поверхности лунок планшета, и
свободного гормона (в калибровочной пробе или анализируемом образце) за
активные центры связывания аффинных антител, меченых ферментом
пероксидазой. В результате иммуноспецифической реакции образуются
комплексы антитела-гормон. Комплекс антиген-антитело, который не связан с
поверхностью планшета, удаляют путем промывки. В ходе ферментативной
реакции пероксидазы с перекисью водорода субстратного раствора происходит
окрашивание - тетраметилбензидина (ТМБ) в синий цвет. Интенсивность
окраски обратно пропорциональна содержанию гормона в анализируемом
образце.
Анализ осуществляли коммерческими тест-системами, согласно
инструкциям «Наставление по применению набора для количественного
определения прогестерона в продуктах животного происхождения методом
иммуноферментного анализа (ИФА-АГ-ПРОГ.)», Утв. ДВ МСХ РФ №13-502/0141от 31.07.01.«Наставление по применению набора для количественного
определения тестостерона в продуктах животного происхождения методом
иммуноферментного анализа (ИФА-АГ-ТЕСТ.)», утвержденного ДВ МСХ РФ
№13-5-02/0138 от 31.07.01, «Наставление по применению набора для
количественного определения эстрадиола-17β в продуктах животного
происхождения методом иммуноферментного анализа (ИФА-АГ-ЭСТР.)» Утв.
ДВ МСХ РФ, №13-5-02/0146 от 31.07.01. Тест-наборы произведены ООО
«Медицина. Аналитика. Ветеринария.», Россия [227, 228, 229]. Рисунок 9.
Рисунок 9 - Набор для количественного определения гормонов в продуктах
животного происхождения методом ИФА
47
Диапазон измеряемого содержания гормонов составляет 1-125 нг/мл для
прогестерона. Минимальное содержание прогестерона, определяемое с
помощью набора, составляет 0,5 нг/мл, тестостерона -0,25 нг/мл, эстрадиола17В – 0,05 нг/мл, коэффициент вариации результатов измерения в образцах не
превышает 12% [31,32].
Подготовка рабочих растворов для анализа.
Приготовление промывочного буфера. Перед использованием стандартный
раствор фосфатно-солевого буферного раствора (ФСБР) прогревали на водяной
бане при температуре от 40 до 60°С для полного растворения солей. Затем
буферный раствор ФСБР смешивали с дистиллированной водой в следующей
пропорции: - 1 часть ФСБР и 19 частей дистиллированной воды.
Приготовление калиброванных стандартов. Перед использованием
флаконы со стандартами и калиброванным раствором прогревали в водяной
бане 30 минут при температуре 37°С. Затем чистыми наконечниками
переносили по 60 мкл каждого стандарта и анализируемого образца в
предварительно маркированные пробирки и добавляли по 390 мкл
промывочного буфера, перемешивали и использовали в иммуноферментном
анализе. Для приготовления калиброванного раствора использовали
стандартные растворы прогестерона с концентрацией 500 нг/мл, тестостерона 300 нг/мл и эстрадиола-17В - 50 нг/мл. Для этого к 960 мкл промывочного
буфера добавляли 40 мкл калиброванного раствора, содержащего
дляпрогестерона - 25 мкг/мл, тестостерона - 15 мкг/мл и эстрадиола 17β - 2,5
мкг/мл и перемешивали.
Приготовление рабочего раствора коньюгата. Для приготовления рабочего
раствора конъюгата смешивали буфер №1, буфер №2 и стандартный раствор
конъюгата по 2 мл каждого в соотношении 1:1:1. Смешанные растворы
тщательно перемешивали.
Приготовление раствора хромогена. Раствор готовили непосредственно
перед использованием. Для этого смешивали содержимое флаконов ТМБ
(тетраметилбензидин) и субстратного раствора в соотношении 1 часть раствора
ТМБ и 4 части субстратного раствора. Для работы с растворами хромогена
использовали химически чистую посуду и неиспользованные наконечники.
Рабочий
раствор
антител
готовили
непосредственно
перед
использованием, согласно инструкции по применению набора тест-системы.
Для этого к 2,75 мл буфера для анализа добавляли 2,75 мл антител в
соотношении 1:1, перемешивали [32].
Постановка иммуноферментного анализа
Порядок маркировки планшета и внесения образцов приведен на схеме.
Время внесения образцов в лунки одного планшета не превышало 15 минут,
согласно инструкции по постановке иммуноферментного анализа [30].
Упаковку со стрипами планшета вскрывали, в рамку вставляли
необходимое для работы количество стрипов, во все используемые лунки
вносили по 300 мкл промывочного буфера и оставляли на 1 минуту по
следующей схеме:
48
A
B
C
D
E
F
G
H
1
0
1
2
3
4
X1
Y1
Z1
3
4
X2
Y2
Z2
X3
Y3
Z3
X4
Y4
Z4
X5
Y5
Z5
X6
Y6
Z6
---
Содержимое планшета удаляли переворачиванием и встряхиванием так,
чтобы в лунке не оставалось жидкости.
В лунки 1 и 2 ряда вносили по 150 мкл калиброванного стандарта №1
исследуемого гормона.
В лунки 1 и 2 ряда В вносили по 150 мкл калиброванного стандарата №2
исследуемого гормона.
В лунки 1 и 2 ряда С вносили по 150 мкл калиброванного стандарата №3
исследуемого гормона.
В лунки 1 и 2 ряда D вносили по 150 мкл калиброванного стандарата №4
исследуемого гормона.
В лунки 1 и 2 ряда E вносили по 150 мкл калиброванного стандарата №5
исследуемого гормона.
В лунки 1 и 2 ряда F вносили по 150 мкл образца из флакона X1.
В лунки 1 и 2 ряда G вносили по 150 мкл образца из флакона Y1.
В лунки 1 и 2 ряда H вносили по 150 мкл образца из флакона Z1.
В оставшиеся лунки вносилипо 150 мкл исследуемых образцов,
руководствуясь схемой. В случае определения эстрадиола-17β во все
используемые лунки планшета вносили по 50 мкл раствора антител и
инкубировали планшет в течение 30 минут при 37°С в вибротермостате. После
чего, жидкость из лунок удаляли переворачиванием и встряхиванием планшета
так, чтобы в лунках не оставалось жидкости. Затем во все используемые лунки
планшета вносили по 300 мкл промывочного буфера и повторяли процедуру
отмывания в вошере 4 раза, для удаления несвязанных продуктов реакции.
Далее во все используемые лунки планшета вносили по 50 мкл раствора
коньюгата и инкубировали в течение 30 минут при 37°С в вибротермостате и
снова повторяли процедуру отмывки лунок планшета промывочным буферным
раствором. И на заключительном этапе для учета ферментативной реакции во
все используемые лунки планшета вносили по 100 мкл раствора хромогена и
инкубировали в темном месте в течение 7-15 минут при температуре от 18 до
24°С. Содержимое всех лунок окрашивалось в голубой цвет, а интенсивность
окрашивания зависила от количества выявленных специфических антител. Для
остановки реакции в лунки планшета с хромогеном добавляли по 100 мкл стоп49
реагента после чего содержимое всех лунок планшета меняет окраску на
желтый цвет. Рисунок 9.
Рисунок 9 - Постановка ИФА. Внесение стоп-реагента
Оптическую плотность растворов в лунках с калиброванными растворами
и анализируемыми образцами после остановки ферментативной реакции
измеряли на спектрофотометре вертикального сканирования «Униплан» фирмы
ЗАО «ПИКОН» при длине волны 450 нм. Программное обеспечение прибора
позволяет получать результаты измерений в виде конечных концентраций
исследуемого гормона в анализируемых образцах.
Расчет коэффициента выхода гормона (Кв) проводили после определения
конечных концентраций исследуемого гормона в анализируемых образцах X,
Y, Z(в нг/мл) по формуле:
Kв = Y-X / Z-X
Расчет
коэффициента
неспецифического
влияния
компонентов
анализируемых проб на специфическую реакцию связывания гормона
антителами проводили по формуле:
Кнесп = Z/ 25 прогестерон
Кнесп = Z/15 тестостерон
+Х
Кнесп = Z/2,5 эстрадиол-17В
Расчет истинной концентрации гормона в анализируемом образце (в нг/мл)
проводили по формуле:Кист = Х / Кв х Кнесп
Расчет истинной концентрации гормона в 1 килограмме анализируемого
образца (мг/кг) рассчитывали путем деления полученной величины Кист на
1000.
Для мяса допускается уровень прогестерона и тестостерона не более 0,015
мг/кг, для эстрадиола-17β не более 0,0005 мг/кг [227, 228, 229].
50
2.1.2.2 Высокоэффективная жидкостная хромотография с массспектрометрией
Содержание остаточных количеств гормонов прогестерона, тестостерона и
эстрадиола в продуктах животного происхождения определяли также
арбитражным методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с
последующим количественным определением на жидкостном хроматографе с
масс-спектрометрическим детектором, обеспечивающим измерение при длине
волны 278 нм для прогестерона и тестостерона и 355 нм для эстрадиола.
Исследования проводили в отделе безопасности пищевой безопасности
Республиканской ветеринарной лаборатории Акмолинский региональный
филиал РГП.
Метод ВЭЖХ основан на применении жидкостной экстракции гормона из
биологических проб, осаждении, очистке и концентрировании экстрактов на
концентрирующих патронах.
Пробоподготовка. Нaвеску мяca 10 г., тщaтeльнo измeльчaли, дoбaвляли 15
мл фocфaтнoгo буфeрa (3,6 г нaтрия фосфoрнoкиcлoгo oднoзaмeщeннoгo и 3,4 г
кaлия фocфoрнoкиcлoгo oднoзaмeщeннoгo, рacтвoрeнных в 1000 мл вoды, рН
6,88) и экcтрaгирoвaли трижды пo 30 мл этилaцeтaтa. Cмecь в кoлбoчкe
вcтряхивaли нa мaгнитнoй мeшaлкe 10 минут и цeнтрифугирoвaли в течение 15
минут. Нaдocaдoчную жидкocть cливaли и прoмывaли трижды пo 5 мл
нacыщeнным рacтвoрoм пoвaрeннoй coли (400 г coли нa 1 л вoды).
Oргaничecкий cлoй oтбирaли, и упaривaли нa иcпaритeлe дo минимaльнoгo
oбъeмa. Зaтeм трижды экcтрaгирoвaли пeтрoлeйным эфирoм (5 мл) и экcтрaкт
иcпoльзoвaли для иccлeдoвaния.
ВЭЖХ-МС-МС анализ выполнялся на высокоэффективной жидкостной
хромотографии с масс-спектрометрическим детектором с четырехградиентным
квадрупольным анализатором. В систему ВЭЖХ «Agilent 1100» были
установлены колонка и предколонка Pursuit С18, 150 мм><2 мм, 3 мкм (Varian,
США), температура термостата колонки 40°С. Рисунок 10
Рисунок 10 – Прибор ВЭЖХ Agilent 1100
В качестве подвижной фазы использовались следующие растворители:
- фаза А - деионизированная вода с 0,05 % формиата аммония;
51
- фаза В -метанол с 0,05 % формиата аммония.
Условия ВЭЖХ анализа были следующие: с 0,0 по 5,0 минут - градиентное
элюирование к 100 % фазы В, с 5,0 по 7,0 минут - элюирование в 100% фазы В,
с 7,0 по 7,1 минуте - переход к элюированию в фазе А/В (50/50 об.), с 7,1 по
13,0 минут - уравновешивание колонки в фазе А/В (50/50 об.), скорость потока
подвижной фазы - 0,2 мл/мин, объём вводимых проб - 20 мкл. Массспектрометрические измерения проводились в диапазоне 300 - 500 m/z.
Условия тандемной масс-спектрометрии оптимизировались с использованием
программного обеспечения МаэБЬупх 4.1. Детектирование аналитов
выполнялось в режиме мониторинга нескольких реакций (МНР).
2.1.2.3 Хроматографическая гельфильтрация
Подготовка колонки с сефадексом G-25: 4-5 г сефадекса G-25
суспендировали в 0,05М трис-НСl с средой рН-7,5 из расчета на 1 грамм
сефадекса на 50 мл раствора, оставляли для набухания на 2-3 дня при
комнатной температуре. Путем декантирования, периодически удаляли мелкие
частицы геля суспензированные в надосадочной жидкости. В вертикально
установленную колонку размером 1,5 х 30 см заполняли гель. После
образования в колонке плотного столбика геля высотой 20 см., пропускали
несколько объемов буфера для уравновешивания. Посредством открытия
выходного отверстия колонки выпускали буферный раствор до тех пор, пока
его уровень в верхней части колонки не достигал уровня геля. Затем осторожно
на гель наслаивали 1,2 см3 пробы. После вхождения нанесенного препарата в
гель, остатки его смывали тремя порциями буферного раствора в количестве 45 мл. Для элюирования через колонку пропускали в общей сложности 150-200
мл буферного раствора со скоростью 40-60 мл/час и собирали фракции по 5 мл.
Определение рабочего титра проводили методом прямого варианта ИФА с
использованием препаратов антител специфичных к эстрадиолу.
2.1.2.4 Способы получения конъюгата эстрадиола 17β с HRP
Способ 1. Фермент пероксидазы хрена (HRP) в количестве 26 мг,
предварительно растворяли в 1 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ), с рН-7,2,
затем по капле добавляли к 3 мг эстрадиола. К полученной смеси с помощью
дозиметрическойпипетки добавляли хлористоводородный 1–этил -3(3диметиламинопропил) карбодиимид (EDC) (300 мг в 1 мл воды) и
инкубировали в течение 1часа при комнатной температуре. Для очистки от не
связавшихся реагентов препарат помещали в диализный мешок с размером пор
14-16 кД и диализовали против ФСБ с рН-7,2 в течение 4-х суток.
Способ 2. К раствору эстрадиола в количестве 9 мг в деионизированной
воде в количестве 1 мл, добавляли 8 мг пероксидазы хрена, 5 мг. хлористоводородного 1–этила 3 (3-диметиламинопропила) карбодиимида
(EDC), перемешивали до полного растворения и инкубировали в течение 24-х
52
часов
при
комнатной
температуре.
Приготовление
препаратов
конъюгатаэстрадиола с ферментом пероксидазой хрена проводили в стерильной
стеклянной посуде.
Очистку полученных соединений проводили путем гельфильтрации на
сефадексе G-25.
2.1.2.5 Способы получения
гетерологичными носителями
конъюгатов
эстрадиола
17β
с
Способ 1. К раствору носителя БСA или OВA в фосфатном буфере
добавляли 350 мг эстрадиола 17β в 5 мл того же буфера. В течение 5 минут при
перемешивании по каплям к реакционной смеси добавляли 320 мг цианамида в
10 мл ФСБ. Выдерживали смесь 2 часа при комнатной температуре и ночь при
+4˚С, при постоянном перемешивании. Затем устанавливали смесь на диализ
против дистиллированной воды на 5 суток.
Способ 2. Растворяли 70 мг эстрадиола в 0,5 мл дистиллированной
водысмешивали с 10 мг каждого из белков носителей в фосфатно-солевом
буфере (ФСБ) с рН-7,2 и к этой смеси добавляли 14 мг EDC. Инкубировали при
комнатной температуре в течение ночи и диализовали против ФСБ с рН равной
7,2 [88].
Способ 3. К раствору носителя БСA или OВA в 1M ацетата натрия
добавляли глутаровый альдегид и инкубировали при комнатной температуре в
течение 30 секунд при покачивании. Раствор эстрадиола 17β добавляли к этой
смеси инкубировали в течение 30 минут и для остановки реакции добавляли
моноэтаноламин. Смесь инкубировали в течение 30 минут и диализовали
против Триса-HCl буфера, pH-7.2, в течение 6-ти часов при температуре 4°C
[89].
Способ 4. Растворяли носитель в 0,1М morpholinoethane sulfonic acid
(МES), 0.15M NaCl, pH 4,7 до концентрации 10 мг/мл. Растворяли 4 мг
эстрадиола в минимальном объеме демитилсульфоксида (ДМСО), а затем в 1
мл буфера МES. Добавляли 500 мкл раствора эстрадиола к 200 мкл белканосителя и 10 мг EDC при мягком перемешивании. Инкубировали при
комнатной температуре в течение 2 часов. Очистку конъюгата проводили
диализом против ФСБ (рН 7,2) [89].
Способ 5. К 500 мкл коллоидного золота добавляли 50 мкл эстрадиола и 50
мкл деионизированной воды. Инкубировали при комнатной температуре в
течение 2 часов. Очистку конъюгата проводили диализом против ФСБ (рН 7,2)
2.1.2.6 Непрямой вариант твердофазного ИФА для тестирования
конъюгатов
Ячейки 96-луночного планшета для иммунологических реакций
сенсибилизировали конъюгатом эстрадиола с гетерологичным носителем в
разных концентрациях (0,0005 - 0,020 мг/мл), при температуре 4ºС в течение
53
16-18 часов (ночи). С целью удаления не связавшегося антигена планшет
отмывали 3 раза ФСБ и 3 раза ФСБ с ФСБ-ТВ. После этого вносили
антителосодержащую жидкость в количестве 0,1 мл и инкубировали при 37ºС в
течение 60 минут. После инкубирования планшет отмывали описанным
способом для удаления неспецифически связавшихся антител. Затем в лунки
планшет вносили кроличьи антитела, меченные пероксидазой хрена
(антивидовой коньюгат) в объеме 0,1 мл и инкубировали при 37ºС в течение 1
часа. Повторяли процедуру отмывки для удаления несвязанных продуктов
реакции и в лунки вносили по 0,1 мл раствора субстрата фермента. Субстрат
готовили непосредственно перед использованием путем растворения 0,01г.
ортофенилендиамина (ОФД) (Sigma, США) в 10 мл 1 % раствора лимонной
кислоты с рН 4,5 и добавлением 0,005 мл 30 % перекиси водорода. Планшет
инкубировали 10-15 минут при комнатной температуре. Положительная
реакция характеризуется окрашиванием раствора субстрата в желтокоричневый цвет. Реакцию останавливали добавлением в лунки планшет
раствора 2М серной кислоты. Результаты ИФА учитывали с помощью
спектрофотометра с вертикальным потоком света при длине волны 492 нм.
(Униплан, Россия).
2.1.2.7 Реакция иммунодиффузии по методу O. Ouchterlony
Приготовление гелей. В качестве гелеобразующего агента применяли
агарозу фирмы «Difco» (Difco Bacto Agar, Difco Special Agar). Готовили
стерильный 1%-й агар в водяной бане. В смесь добавляли 0,1-0,12%-й
метриолят для предотвращения роста микроорганизмов.
Заливка агара. На поверхность обезжиренных предметных стекол,
расположенных
на
строго
горизонтальной
поверхности,
заливали
расплавленную 1%-ую агарозу до образования слоя толщиной 1,5 мм.
Высушивали агар при комнатной температуре.
Приготовление лунок. Для высечения лунок в агаре применяли
стандартные штампы, состоящие из 7 трубок – пробойников. В слое агара
пробойником вырезают лунки диаметром 2 мм на расстоянии 15 мм одна из
другой. На стекле делают несколько рядов лунок [88].
Ход работы. После застывания агара с помощью специального трафарета и
пробойника вырезали лунки диаметром 2-3 мм. В центральную лунку вносили
0,005 мл исследуемых антигенов (конъюгатов), а в остальные – по 0,005 мл
специфических антисывороток (рис. 11). Чашки Петри [ГОСТ 25336-82-Е] с
предметными стеклами [ГОСТ 92-84-75] инкубировали во влажной камере не
менее суток при комнатной температуре. Результаты реакции учитывали по
наличию полос преципитации между лунками с испытуемыми антигенами и
специфическими антисыворотками.
Для контрастирования полос преципитации препарат окрашивали
раствором Кумасси G–250 в течение 10-15 минут. Раствор красителя готовили
следующим образом: 5г Кумасси растворяли в 1000 мл растворителя.
54
Растворитель состоял из 450 мл дистиллированной воды, 450 мл этанола и 100
мл ледяной уксусной кислоты.
После окрашивания геля проводили обесцвечивание фона раствором для
обесцвечивания, состоящего из метилового спирта, уксусной кислоты и
дистиллированной воды в соотношении 50:10:40, соответственно[88].
Рисунок 11 – Постановка реакции иммунодиффузии по методу
O. Ouchterlony
2.1.2.8 Приготовление буферных растворов
Буферные растворы готовили по следующим прописям:
1) Фосфатно-солевой буфер (ФСБ), рН-7,4:
- NaCl – 8 г;
- Na2HPO4 12H2O – 2,9 г;
- NaH2HPO4 2H2O – 0,2 г;
- Растворяют в 1 литре дистиллированной воды.
2) Фосфатно-солевой буфер с твином (ФСБ-ТВ), рН-7,4:
- в 1 л ФСБ растворяли 0,5 мл детергента твин-20 (0,05% по объему).
3) Карбонат-бикарбонатный буферный раствор (КББ) 0,05М, рН-9,6:
- Na2CO3 – 1,59 г (0,015 M);
- NaHCO3 – 2,94 г (0,035 М);
- растворяли в 1 л дистиллированной воды и доводили рН раствором
карбоната или бикарбоната натрия.
4) Цитратный (субстратный) буфер, рН-5,0:
- раствор А (Na2HPO4·12H2O – 0,2 моль/л) – растворяли14,3 г соли в
200 мл H2O.
- раствор Б (лимонная кислота – 0,1 моль/л) – растворяли2,1 г соли в 100
мл H2O. Смешивали 5,5 мл раствора А с 5 мл раствора Б и 10 мл H2O,
проверяли рН.
5) Буфер Макллвейна:
- лимонная кислота моногидрат – 12,9 г.;
55
- Na HPO – 10,9 г.;
- ЭДТА натриевой соли – 37,2 г.;
- растворить в 1000 мл дистиллированной воды;
- установить рН 3,8 – раствор 20 мМ щавелевой кислоты в этаноле – 1,8
г/л.
2.1.2.9 Метод Кастеллани
Метод основан на адсорбции, то есть в истощении иммунной сыворотки
избытком соответствующего белка. Иммунную сыворотку крови разводили от
1:2 до 1:256 в фосфатно-солевом буфере в количестве 2 мл. В каждую пробирку
вносили по 0,5 мл носителя бычьего сывороточного альбумина в концентрации
1 мг/мл. Пробирку с разведением при котором образуется преципитат
центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут. Отбирали супернатант
и тестировали на уровень антител к носителю.
2.1.2.10 Метод высаливания сульфатом аммония
К исследуемой сыворотке крови добавляли 4М сульфата аммония равного
количества, и инкубировали в холодильнике при температуре +40С в течение 3х часов. Центрифугировали в течение 30 минут при 25000 об/мин при +40С.
Удаляли супернатант, осадок растворяли в дистиллированной воде,
диализировали для удаления сульфата аммония. Переосаждение белковой
фракции проводили два раза.
2.1.2.11 Электрофоретический метод
Электрофорез проводили в 10 %-ном полиакриламидном геле в
присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) по методу J. Laemmlietal на
аппарате для вертикального электрофореза (Сompact dual mini code (Англия)
[17]. Тщательно промытые и обезжиренные стеклянные пластины (12×15)
монтировали с помощью прокладок и зажимов. Для предотвращения утечки
растворов прокладки смазывали вазелином. Заливали пространство между
пластинками раствором для разделяющего геля, состоящего из 5 мл 30 %
бисакриламида; 3,750 мл 1,5 М трис-HCl (рН 8,8); 6 мл дистиллированной
воды; 0,150 мл 10% ДСН; 0,015 мл ТЕМЕД и 0.075 мл 10% персульфата
аммония. После полимеризации нижнего геля вставляли гребенку и заливали
оставшееся пространство раствором для концентрирующего геля по прописи:
0,67 мл 30% бисакриламида; 1,25 мл 0,5 М трис-HCl (рН-6,8); 3 мл
дистиллированной воды; 0,05 мл 10% ДСН; 0,004 мл ТЕМЕД и 0,05 мл 10 %
персульфата аммония.
Буфер для разведения образцов готовили следующим образом: к 0,315 мл
1М трис-HCl (рН 6,8) добавляли 0,25 мл 2-меркаптоэтанола, 0,5 мл глицерина,
0,115мл 10% ДСН; 0,05 мл 0,1% бромфенолового синего и доводили объем до 5
56
мл дистиллированной водой. Образцы разводили в соотношении 1:1, кипятили
на водяной бане в течение 3-5 минут и охлаждали. Электрофорез проводили
при силе тока 20 мА и напряжении 220 в. По завершении процесса гель
вынимали из пластин, окрашивали в течение 1 часа и отмывали в нескольких
сменах обесцвечивающего раствора до полного исчезновения фоновой
окраски.[254].
2.1.2.12 Гибридомная технология получения моноклональных антител
Для культивирования клеточных культур использовали среду RPMI-1640.
Для приготовления 1,0 литра культуральной среды к 863мл дистиллированной
воды [ГОСТ 6709-72], добавляли следующие компоненты: 100 мл 10-кратного
концентрата RPMI-1640; 10 мл 100 мм пирувата натрия; 26,7 мл 7,5 %
бикарбоната натрия; 2,283 г Hepesа; 0,3 г L-глютамина; 0,003 мл 2меркаптоэтанола. РН культуральной среды доводили до 7,2–7,4 с помощью
NaOH и стерилизовали фильтрованием через мембранные фильтры 0,22 мкм
(''Millipore'', США). Рисунок 12.
Полную ростовую среду для культивирования гибридных клеток готовили
добавлением в неполную ростовую среду 10% к объему среды стерильной
сыворотки плода коровы, инактивированной нагреванием при 56 ºС в течение
30 мин.
Рисунок 12 - Компоненты культуральной среды
Подготовка миеломных клеток
Для гибридизации использовали миеломные линии клеток Х63-Ag 8.653 и
SP2/O-Аg14, замороженные в специальных пластиковых ампулах с
завинчивающимися крышками. Перед слиянием ампулы с клетками из жидкого
азота переносили в водяную баню на 37ºС, а затем в центрифужную пробирку с
10 мл холодной неполной ростовой среды и перемешивали.Центрифугировали
в течение 5-7 минут при 1000 об/мин. Супернатант сливали и к осадку клеток
добавляли необходимый объем полной ростовой среды, суспензировали и
переносили в ячейки 24-х луночного планшета на слой «питающих клеток» в
количестве 200-300 клеток в каждую ячейку. Инкубировали клетки при 37С в
атмосфере с 5 % СО2. Для гибридизации использовали клетки, находящиеся в
57
логарифмической фазе роста. Клетки переносили из культуральных сосудов в
центрифужные пробирки, прикрепившиеся к подложке клетки снимали мягким
пипетированием и центрифугировали 5-7 минут при 1000 об/мин.
Надосадочную жидкость сливали, а осадок суспензировали в 5 мл неполной
ростовой среды и подсчитывали количество клеток в камере Горяева.
Подготовка иммунных спленоцитов
Спустя четыре дня после последней инъекции по схеме иммунизации
убивали
животных
с
наиболее
высокими
титрами
антител в
иммуноферментном анализе (не менее 1:800) методом цервикальной
дислокации. Покровы кожи обрабатывали 70º этиловым спиртом. Затем убитую
мышь укладывали спинкой вниз на препаровальный столик. Пинцетом
растягивали конечности и фиксировали их булавками. Делали продольный
разрез по белой линии живота от симфиза до грудинно-ключичного
сочленения. На уровне передних и задних лапок делали боковые надрезы.
Образовавшиеся кожные лоскуты отводили в сторону. В стерильных условиях
извлекали селезенку и помещали ее в чашку Петри.
В шприц [ГОСТ 22967] набирали неполную ростовую среду в объеме не
менее 10 мл, и вымывали из селезенки спленоциты путем перфузии. Суспензию
клеток переносили в стерильную пробирку с коническим дном и
центрифугировали 10 минут при 1000 об/мин. Осадок суспензировали в 5 мл
неполной ростовой среды и подсчитывали количество клеток в камере Горяева
[24]. Рисунок 13.
Рисунок 13 - Выделение перитонеальных макрофагов
Приготовление раствора полиэтиленгликоля
(ПЭГ).
Раствор
полиэтиленгликоля с молекулярной массой 4000 расплавляли на водяной бане
до жидкого состояния. Затем к 1,5 мл неполной культуральной среды RPMI1640 добавляли 1,5 мл расплавленного ПЭГ и 0,3 мл диметилсульфоксида
(ДМСО), рН среды раствора 8,0–8,5. Приготовленный раствор ПЭГ
стерилизовали через фильтры с размером пор - 0,45 мкм. Непосредственно
перед гибридизацией раствор ПЭГ нагревали до 37 º С.
58
Приготовление «питающего слоя» перитонеальных макрофагов
За 3-4 дня до слияния клеток, в стерильных условиях выделяли
перитонеальные макрофаги беспородных мышей и высевали их в ячейки 96луночных планшет.Беспородную мышь забивали путем цервикальной
дислокации, кожные покровы обрабатывали 700 этиловым спиртом и
закрепляли спинкой вниз на препаровальном столике. Пинцетом растягивали
конечности и фиксировали их булавками.Производили продольный разрез
кожи по белой линии живота, а также верхние и нижние разрезы. Шприцом
вводили в брюшную полость 10 мл неполной культуральной среды и в течение
5 минут раздражали брюшину путем легкого постукивания пинцетом. Затем
отсасывали суспензию перитонеальных макрофагов из брюшной полости и
осаждали их центрифугированием при 1000 об/ мин в течение 10 минут.
Рисунок 14.
Осадок клеток ресуспензировали в полной ростовой среде из расчета
6
2х10 клеток в 1 мл и высевали в ячейки 96-луночного планшета. Клетки
выращивали в СО2-инкубаторе при температуре 37С в атмосфере с 5% СО2.
Рисунок 14 - Выделение перитонеальных макрофагов
Гибридизация клеток
Гибридизацию клеток проводили в стерильных условиях в ламинарных
шкафах.
Клетки
миеломных
линий
X63-Ag8.653
и
спленоциты
иммунизированных мышей смешивали и центрифугировали 7-10 минут при
1000об/мин. Надосадочную жидкость сливали, осадок осторожно встряхивали и
добавляли к нему в течение 1 минуты 1 мл теплого (37С) раствора ПЭГ,
осторожно перемешивали осадок кончиком пипетки. Медленно приливали 9 мл
неполной ростовой среды и перемешивали. Смесь выдерживали 10 минут при
температуре 37С и центрифугировали 7-10 минут при 1000 об/мин.
Надосадочную жидкость сливали, осадок суспендировали в 40 мл полной
ростовой среды и высевали в ячейки 96–луночного планшета с «питающим
слоем» перитонеальных клеток, приготовленных за 2 дня до гибридизации.
Суспензию клеток в полной ростовой среде разливали по 100 мкл в каждую
59
ячейку планшета с помощью многоканальной микропипетки. Планшеты с
клетками инкубировали при 37ºС в атмосфере с 5% СО2. Через 24 часа после
посева гибридизированных клеток в каждую ячейку планшета добавляли
равное количество среды, содержащей гипоксантин, аминоптерин, тимидин
(ГАТ) в двукратной концентрации. При этом объем селективной ростовой
среды в каждой ячейке увеличивался до 0,2 мл, а концентрация ГАТ
уменьшалась в 2 раза и становилась однократной.
Клонирование гибридных культивируемых клеток
Клонирование гибридных культивируемых клеток проводили методом
лимитирующих разведений. Для клонирования выбирали ячейки с
жизнеспособными клетками, находящимися в логарифмической фазе роста.
Собирали суспензию клеток в пробирку и центрифугировали 7 минут при 1000
об/ мин. Надосадочную жидкость сливали, к осадку клеток приливали 1 мл
неполной ростовой среды и подсчитывали количество клеток в камере Горяева
на инвертированном микроскопе. Готовили шесть стерильных пробирок, в три
первые наливали по 4,5 мл неполной, а в остальные по 4,5 мл полной ростовой
среды. Рисунок 15. Затем в первую пробирку вносили по 0,5 мл взвеси клеток,
суспензировали и путем последовательных переносов в последующие пробирки
по 0,5 мл суспензии доводили разведение клеток до нужной концентрации:
1кл/мл и 10 кл/мл. После этого суспензию клеток с концентрацией 1 и 10 кл/мл
вносили по 5 рядов в лунки 96-луночного планшета. Лунку двух оставшихся
рядов заполняли суспензией клеток с концентрацией 100 кл/мл. (рис.15)
Рисунок 15 - Клонирование гибридных клеток.
Перенос суспензии клеток в ячейки планшета осуществляли
многоканальной пипеткой. Планшеты помещали в СО2-инкубатор,
отрегулированный на температуру 37С и поддерживающий содержание СО2 в
камере в пределах 5 %. Колонии растущих клеток становились видимыми
микроскопически через 5-7 суток. Антительную активность клеток-субклонов
определяли с помощью твердофазного ИФА на 10–14 сутки после
клонирования. Для определения активности гибридом выбирали ячейки,
60
содержащие одиночные колонии клеток, различимые микроскопически.
Позитивные клоны подвергали реклонированию по описанному методу. На
всех этапах клонирования гибридные клетки параллельно размножали в
небольших количествах (4-5 лунок) на 24–х луночных планшетах и
криоконсервировали.
Получение препаративных количеств моноклональных антител
Замороженные клетки в специальных пластиковых ампулах с
завинчивающимися крышками из жидкого азота переносили в водяную баню на
37 º С, а затем - в центрифужную пробирку с 10 мл холодной неполной
ростовой среды и перемешивали. Центрифугировали в течение 5-7 минут при
1000 об/мин. Супернатант сливали, к осадку клеток добавляли необходимый
объем полной ростовой среды, суспендировали и переносили в ячейки 24-х
луночного планшета на слой «питающих клеток» в количестве 200-300 клеток в
каждую ячейку. Инкубировали клетки при 37С в атмосфере с 5 % СО2. Далее
гибридные клетки наращивали в пластиковых матрацах объемом 25 или 50 мл в
полной ростовой среде. Клетки культивировали 3-4 дня в СО2 инкубаторе.
Клетки снимали с поверхности пластика пипетированием и центрифугировали
при 1000 об/мин в течение 7 минут. Осадок клеток ресуспензировали в
неполной ростовой среде и вводили 2х106 клеток внутрибрюшинно мышам
линии BALB/c. После образования асцитной опухоли через 12-14 дней мышь
убивали методом цервикальной дислокации. Затем тушку фиксировали на
препаравальной доске и препарировали кожу вдоль белой линии живота.
Асцитную жидкость собирали из брюшной полости с помощью шприца с
иглой. Затем асцитную жидкость отделяли от гибридных клеток
центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 минут. Гибридные клетки
ресуспензировали в неполной ростовой среде и вводили в брюшную полость
мышам линии BALB/c для дальнейшего накопления антител. Асцитную
жидкость использовали для выделения из нее иммуноглобулинов.
Определение изотипов МКА
На поверхность обезжиренных предметных стекол, расположенных на
строго горизонтальной поверхности, заливали расплавленную 1% агарозу до
образования слоя толщиной 1,5 мм. После застывания агарозы с помощью
специального трафарета и пробойника вырезали лунки диаметром 2-3 мм. В
центральную лунку вносили 0,005 мл асцитной жидкости, а в остальные лунки
по 0,005 мл специфических антисывороток к различным классам мышиных
иммуноглобулинов (Goat Anti-Mouse Ig GFc Subclass 1, Goat Anti-Mouse IgG Fc
Subclass 2 a, Goat Anti-Mouse Ig GFc Subclass 2 b, Goat Anti-Mouse Ig GFc
Subclass 2 c, Goat Anti-Mouse Ig GFc Subclass 3, Goat Anti-Mouse IgM). Чашки
Петри с предметными стеклами инкубировали во влажной камере не менее
суток при комнатной температуре. Результаты реакции учитывали по наличию
полос преципитации между лунками с испытуемыми антигенами и
специфическими антисыворотками.
61
Определение константы связывания моноклональных антител.
Три ряда 96-луночного планшета для микротитрования сенсибилизировали
антигеном в оптимальной концентрации 10 мкг/мл и три ряда тем же
антигеном, но в концентрации вдвое ниже оптимальной – 5 мкг/мл, в ЗФР (рН
7,2-7,4), при 4С в течение ночи. Планшет отмывали по три раза ЗФР и ЗФР-Тв
и раститровывали на три ряда МКА из очищенной асцитной жидкости, начиная
с концентрации 5мкг/мл. После 1,5 часа инкубации при 370 С и отмывки, в
лунки планшета вносили антивидовые антитела, меченные пероксидазой хрена,
в рабочем разведении. Реакцию проводили в объеме 0,05 мл.
После получения результатов ИФА строили кривые зависимости
связывания различных разведений моноклональных антител с оптимальной
концентрации антигена. Константу связывания определяли по формуле:
1
Ксв = -------------------------------4(МКА) – 2(МКА)
Где, (МКА) – концентрация антител, соответствующая 50% связыванию от
максимального при оптимальной концентрации антигена, соответствующая 50
% связыванию от максимального при вдвое меньшей концентрации антигена.
Непрямой вариант твердофазного иммуноферментного анализа
Ячейки 96-луночного планшета для иммунологических реакций
сенсибилизировали конъюгатом эстрадиола с гетерологичным носителем в
разных концентрациях (0,0005 - 0,020 мг/мл), при температуре 4ºС в течение
ночи. С целью удаления не связавшегося антигена планшет отмывали 3 раза
ФСБ и 3 раза ФСБ с ФСБ-ТВ. После этого вносили антителосодержащую
жидкость в количестве 0,1 мл и инкубировали при 37ºС в течение 60 минут.
После инкубирования планшет отмывали описанным способом для удаления
неспецифически связавшихся антител. Затем в лунки планшет вносили
кроличьи антитела, меченные пероксидазой хрена (антивидовой коньюгат) в
объеме 0,1 мл и инкубировали при 37ºС в течение 1 часа. Повторяли процедуру
отмывки для удаления несвязанных продуктов реакции и в лунки вносили по
0,1 мл раствора субстрата фермента. Субстрат готовили непосредственно перед
использованием путем растворения 0,01 г ортофенилендиамина (ОФД) (Sigma,
США) в 10 мл 1 % раствора лимонной кислоты с рН 4,5 и добавлением 0,005 мл
30 % перекиси водорода. Планшет инкубировали 10-15 минут при комнатной
температуре. Положительная реакция характеризуется окрашиванием раствора
субстрата в желто-коричневый цвет. Реакцию останавливали добавлением в
лунки планшет раствора 2 М серной кислоты. Результаты ИФА учитывали с
помощью спектрофотометра с вертикальным потоком света при длине волны
492 нм. (Униплан, Россия) и (ASYSExpert 96, Австрия) при длине волны 492 нм
[16, 17, 18].
62
2.1.2.13 Метод Брэдфорд по определению белка
Раствор готовили следующим образом: 100 мг Кумасси растворяли в 50 мл
этанола, добавляли 100 мл 85% Н3РО4, остужали, доводили до 1000 мл
дистиллированной водой. В лунку первого ряда вносили по 100 мкл пробы
белка неизвестной концентрации и бычий сывороточный альбумин в
концентрации 1 мг/мл в качестве контроля. В лунки следующих рядов вносили
по 50 мкл забуферного раствора с рН 7,2 - 7,4. Опытные и контрольные пробы
белка раститровывали в объеме 50 мкл. В каждую лунку вносили по 50 мкл
реактива Бредфорда и учитывали результат на спектрофотометре при длине
волны 492 нм.
2.1.2.14 Иммуноблотинг
Электрофоретический перенос антигенов из геля на нитроцеллюлозную
мембрану осуществляли с помощью прибора для иммуноблотинга по H.
Towbinetal. [95]. Для этого готовили следующие растворы:
- катодный буфер -0,3 г Триса и 0,5 г аминогенной кислоты растворяли в
20 мл метанола и доводили объем до 100 мл дистиллированной водой;
- анодный буфер № 1 – 3,6 г Трис растворяли в 20 мл метанола и доводили
объем до 100 мл дистиллированной водой;
- анодный буфер № 2 – 0,3 г Триса растворяли в 20 мл метанола и
доводили объем до 100 мл дистиллированной водой.
Прибор готовили к работе следующим образом: на графитовую пластину
помещали фильтровальную бумагу смоченную в анодном буфере № 1, затем –
смоченную в анодном буфере № 2, накрывали нитроцеллюлозной мембраной и
укладывали на мембрану полиакриламидный гель, накрывали его
фильтровальной бумагой, смоченной, в катодном буфере и закрывали, прибор.
Перенос проводили при постоянной силе тока 0,8 мА/см геля в течение одного
часа.
Для
иммунохимического
проявления
специфических
антигенов
нитроцеллюлозную мембрану сначала инкубировали в 1%-ом растворе БСА в
течение ночи при 40С. Затем отмывали по три раза ЗФР и ЗФР-ТВ и
выдерживали 1,5 ч при 370С в растворе моноклональных антител из
очищенного асцитной жидкости, разведенной 1:100 в ЗФР-ТВ. После чего
носитель вновь отмывали и инкубировали в рабочем разведении антивидовых
антител, меченых пероксидазой хрена в течение 1 часа при температуре 370С.
Повторяли процедуру отмывки и проявляли реакцию по расщеплению
субстрата. Раствор субстрата готовили непосредственно перед использованием
следующим образом: 0,01 гр. 4-хлор-нафтола, растворяли в 2 мл метанола,
смешивали с 18 мл забуферного раствора.
63
2.2 Результаты исследований
2.2.1 Определение остаточных количеств тестостерона, прогестерона,
эстрадиола в мясе отечественного и импортного происхождения
На первом этапе исследований провели анализ поступления в Республику
Казахстан импортного мяса различных видов. В десятку лидеров странэкспортеров мяса и мясных субпродуктов в Казахстан входят – Бразилия,
Аргентина, США, Канада, Польша, Парагвай, Уругвай, Австралия, Монголия,
Индия и другие. Общий объем импорта только за 2013 год составил более 94,5
тысячи тонн. За 2010-2013 годы в Казахстан из разных стран поставлено более
45,3 тысячи тонн говядины на 126,6 миллиона долларов. По данным Комитета
таможенного контроля Министерства финансов РК, США являются
крупнейшим поставщиком мяса в Казахстан. Производители птичьего
мясаамериканских штатов за период 2010-2013 годы поставили в Казахстан
более половины всего импортного мяса. [83]. Традиционным продуктом,
поставляемым из США в РК, являются куриные окорочка, или так называемые
«ножки Буша».
Из стран Таможенного Союза одним из крупных поставщиков мяса
крупного рогатого скота является Республика Беларусь. По статистическим
данным, в 2010 году Беларусь экспортировала в Казахстан 75,2 тонны мяса
говядины на сумму свыше 248,3 тысячи долларов, а уже через два года в весе
почти в 17 раз больше – 1 255,7 тонн на 5,9 миллиона долларов. В 2013 году
импорт из этой страны вырос в 3 раза - до 4,1 тысячи тонн на сумму 18,6
миллиона долларов.
Мониторинг поступления импортного мяса различных видов в
Костанайскую область за период с 2008 по 2013 годы, показал, что ежегодно на
регулярной основе осуществляются оптовые поставки мяса из стран дальнего
зарубежья в основном из Соединённых Штатов Америки (США), Аргентины,
Бразилии, Канады, Австралии. Таблица 3.
Кроме того, мясная продукция поступает из стран Европы, Польши и
Литвы, из стран Таможенного Союза Беларуси и Российской Федерации.
Ассортимент импортного мяса следующий: конина, говядина, свинина, мясо
птицы (индейка, куринные окорочка), мясные субпродукты, шпики, фарш.
Мясо поступает как в замороженном блочном виде, так и охлажденным в
вакуумной упаковке и в копчённом виде. [18].
На костанайском рынке крупнейшими поставщиками говядины являются
США, Канада и Бразилия. (рис. 16). Причём, отмечалась тенденция ежегодного
возрастания поступления говядины. С 2013 года Министерство сельского
хозяйства Республики Казахстан ввело ограничения (квоты) на ввоз
импортного мяса.
Поставщиками конины в Казахстан являются Канада, Польша и Россия в
соответствии с рисунками 17/1 и 17/2. Объём поступления конины в страну не
столь значительный по сравнению с говядиной и птицей.
64
Свинина в основном ввозится из стран США, России и из Беларуси. (рис.
18).
Самые значительные объёмы поставки в течение 2008 – 2013 годов
приходится на мясо кур. Крупными поставщиками куринных окорочков
являются – США и Бразилия. Начинают составлять конкуренцию страны
Таможенного Союза – Россия и Беларусь. (рис. 19/1, Рисунок 19/2, Рисунок
19/3). В 2013 году не было поступлений мяса из Украины.
Таблица 3 - Динамика импортного мяса различных видов в Костанайскую
область за период 2008 – 2013 гг. (тыс.тонн)
СтранаГоды
производи Вид мяса 2008
2009
2010
2011
2012
2013
тель
Аргентина говядина 106,47 28,1
27,01
26,08
25,8
23,0
Бразилия говядина 100,04 98,9 198,601 162,48 99,7 250,16
мясо
594,72 1259,5 183,119 87,8
76,80 75,02
птицы
США
говядина 290,81 288,9
289,5
329,1 329,1 289,5
свинина
- 49,914 16,76
16,76 56,037 67,35
мясо
5141,3 4009,2 3873,66 3411,2 2923,8 2163,7
птицы
Канада
говядина 95,6
95,6
111,4 111,71 334,2 330,8
конина
- 98,99
85,8
75,08 75,08 75,08
Австралия говядина 50,00 55,978
23,0
23,0
21,2
21,2
Литва
говядина
10,4
11,2
10,4
132,9
говядина
78,55
19,65
21,7
78,55
Польша
конина
1,005
1,06
2,95
говядина 35,7
33,8
35,6
31,5
31,5
67,0
Россия
конина 0,0045
0,100
0,10
0,100
1,95
мясо
8,0
75,08
19,0
25,0
птицы
свинина
19,2
19,0
20,2
21,2
22,0
25,2
говядина
25,0
87,6
58,7
55,59
Беларусь
свинина
9,0
25,2
45,2
25,5
мясо
19,2
56,7
57,21
78,9
птицы
Украина
говядина
2,0
2,6
2,7
3,7
мясо
4,2
4,5
4,5
3,5
птицы
65
400
350
Аргентина
300
Бразилия
США
250
Канада
Австралия
200
Литва
150
Польша
Россия
100
Беларусия
50
Украина
0
2008
2009
2010
2011
2012
2013
Рисунок 16 - Динамика импорта говядины в Костанайскую область
за 2008 – 2013 гг.
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Польша
Россия
2008 2009 2010 2011 2012 2013
Рисунок 17/1 - Динамика импорта конины в Костанайскую область
за 2008 – 2013 гг.
66
120
100
80
60
Канада
40
20
0
2008 2009 2010 2011 2012 2013
Рисунок 17/2 - Динамика импорта конины в Костанайскую область
за 2008 – 2013 гг.
80
70
60
50
США
40
Россия
30
Беларусь
20
10
0
2008 2009 2010 2011 2012 2013
Рисунок 18 - Динамика импорта свинины в Костанайскую область
за 2008 – 2013 гг.
67
6000
5000
4000
3000
США
2000
1000
0
2008
2009
2010
2011
2012
2013
Рисунок 19/1 - Динамика импорта птицы из США в Костанайскую область
за 2008 – 2013 гг.
1400
1200
1000
800
Бразилия
600
400
200
0
2008
2009
2010
2011
2012
2013
Рисунок 19/2 - Динамика импорта птицы из Бразилии
в Костанайскую область за 2008 – 2013 гг.
68
90
80
70
60
Россия
50
Беларусь
40
Украина
30
20
10
0
2008
2009
2010
2011
2012
2013
Рисунок 19/3 - Динамика импорта птицы из стран ТС и Украины
в Костанайскую область за 2008 – 2013 гг.
С целью определения остаточных количеств гормональных стимуляторов
роста: прогестерона (ПГТ), тестостерона (ТСТ) и эстрадиола (ЭСТ), за период с
2012 по 2013 годы нами было исследовано 315 образцов мяса, из них 132 пробы
мяса костанайских производителей и 183 пробы импортного происхождения.
Для исследований использовали мясо свежее, охлажденное, замороженное.
В том числе исследовано мясо отечественного происхождения: 27
образцов говядины, птицы - 50, конины - 25 и 30 проб свинины, мясо
импортного производства: говядины – 87 проб, птицы – 56, конины и свинины
по 20 проб.
Изучение степени загрязнения мяса отечественного и импортного
происхождения
остаточными количествами гормональных стимуляторов
проводили методом твёрдофазного непрямого иммуноферментного анализа
(ИФА). Пробы с содержанием гормонов исследовали арбитражным методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией
(ВЭЖХ-МС).
Показатели полученных результатов сравнивали с максимально
допустимыми уровнями (МДУ) гормонов принятыми в директивах ЕС и
российскими нормативными актами.
Методом ИФА было исследовано мясо говядины и свинины костанайских
производителей ТОО «Карасу-Ет», ТОО «Берёзка», ТОО «Агро», мясо кур
производства Костанайской птицефабрики АО «Север-птица», Рудненской
птицефабрики ТОО «Жас канат 2006», АО «Усть-Каменогорская
птицефабрика» Алматинской птицефабрики «Казахстан кустары» и ТОО
Петропавловской бройлерной птицефабрики, а также закуплено на
костанайском торговом рынке.
Результаты анализов отечественного мяса представлены в таблице 4.
69
Таблица – 4 Результаты ИФА остаточных количеств гормонов в мясе
отечественного происхождения
Мясо
Количество
Гормоны
проб
ТСТ
ПГТ
ЭСТ
говядина
27
0
0
0
конина
25
0
0
0
свинина
30
0
0
0
птица
50
0
0
0
Итого
132
0
0
0
Результаты проведенных исследований показали, что в исследуемых 132-х
образцах мяса отечественных производителей, содержание трёх стероидных
гормональных стимуляторов роста не обнаружено.
Результаты мониторинговых исследований по обнаружению остаточных
количеств гормональных стимуляторов в мясе импортного происхождения
представлены в таблицах 5 и 6.
Исследования показали, что из 183-х анализируемых проб импортного
мяса повышенное содержание хотя бы одного из определяемых анаболических
гормонов выявлено в 59 образцах, что составляет 32,2%.
Из показателей таблицы 5 видно, что превышение максимально
допустимого уровня тестостерона обнаружено в 32 пробах мяса, что составляет
54,2%, из числа проб с тестостероном, из них в 22-х пробах говядины
производства Бразилии (12 проб), и Канады (10 проб), в 3-х пробах свинины из
США (9,4%), а также в 7 пробах мяса птицы производства США (21,8%).
Уровень тестостерона превышал максимально допустимый уровень в
исследуемых образцах говядины от 1,1 до 2,7 раза, свинины от 1,0 до 1,8 раза,
птицы от 1,0 до 1,9 раза.
При исследовании мяса на содержание эстрадиола-17β было обнаружено
его превышение в 27-ми пробах, что составило 45,7% от общего числа
обнаруженных гормонов. Превышение МДУ обнаружено в 16-ти пробах
говядины и 11-ти пробах куриного мяса производства США. Таблица 5.
Уровень превышения эстрадиола-17β в пробах мяса составляет от 1,6
до39,8 раза. При этом превышение допустимого уровня в мясе птицы
составляет от 1,6 до 19,8 раза, говядины от 1,8 до 39,8 раза.
В пробах мяса конины и свинины превышение гормона эстрадиола-17β не
наблюдается.
Содержание остаточных количеств гормона прогестерона превышающих
МДУ в мясе различных видов животных импортного происхождения не
обнаружено.
70
Таблица 5 - Содержание остаточного количества тестостерона в импортном
мясе, превышающих МДУ
п/п
Номер
Количество
Странаисследуемой
тестостерона
Вид мяса
производитель
пробы, №
МДУ-0,015 мг/кг
1
№3
0,018
куриное
США
2
№5
0,016
куриное
США
3
№17
0,021
куриное
США
4
№19
0,021
говядина
Канада
5
№22
0,021
говядина
Канада
6
№32
0,017
говядина
Бразилия
7
№33
0,019
говядина
Бразилия
8
№61
0,017
говядина
Канада
9
№66
0,029
говядина
Канада
10
№67
0,026
говядина
Канада
11
№68
0,026
говядина
Канада
12
№89
0,022
говядина
Канада
13
№91
0,020
говядина
Бразилия
14
№95
0,04
говядина
Бразилия
14
№96
0,017
говядина
Канада
16
№97
0,032
говядина
Канада
17
№101
0,016
свинина
США
18
№104
0,028
свинина
США
19
№105
0,027
свинина
США
20
№106
0,022
говядина
Бразилия
21
№107
0,020
говядина
Бразилия
22
№111
0,028
говядина
Бразилия
23
№120
0,019
говядина
Бразилия
24
№121
0,021
говядина
Бразилия
25
№133
0,039
говядина
Бразилия
26
№135
0,040
говядина
Бразилия
27
№137
0,036
говядина
Канада
28
№151
0,029
говядина
Бразилия
29
№157
0,029
куриное
США
30
№158
0,029
куриное
США
31
№159
0,027
куриное
США
32
№175
0,022
куриное
США
71
Таблица 6 - Содержание остаточных количеств эстрадиола-17β в импортном
мясе, превышающих МДУ
п/п
Номер
Содержание
Странаисследуемой
эстрадиола-17β
Вид мяса
производитель
пробы, №
МДУ-0,0005мг/кг
1
№6
0,0047
куриное мясо
США
2
№7
0,0008
куриное мясо
США
3
№9
0,0099
куриное мясо
США
4
№11
0,022
куриное мясо
США
5
№12
0,0044
куриное мясо
США
6
№15
0,0022
куриное мясо
США
7
№19
0,0011
куриное мясо
США
8
№21
0,001
куриное мясо
США
9
№25
0,0016
куриное мясо
США
10
№27
0,004
куриное мясо
США
11
№52
0,0010
куриное мясо
США
12
№59
0,0016
говядина
США
13
№74
0,005
говядина
США
14
№75
0,0046
говядина
США
15
№76
0,0016
говядина
США
16
№79
0,0199
говядина
США
17
№80
0,021
говядина
США
18
№81
0,0044
говядина
США
19
№115
0,001
говядина
США
20
№116
0,0111
говядина
США
21
№119
0, 0027
говядина
США
22
№123
0,0016
говядина
США
23
№127
0,005
говядина
США
24
№129
0,001
говядина
США
25
№143
0,0009
говядина
США
26
№145
0,0047
говядина
США
27
№148
0,0009
говядина
США
72
2.2.2 Получение специфических иммуногенов
эстрадиола 17β иммуноферментным методом
для
определения
2.2.2.1 Получение препаратов конъюгата эстрадиол-носитель
При разработке иммуноферментного анализа (ИФА) наиболее
ответственным этапом исследований явилось получение специфических
иммунореагентов, определяющих чувствительность и специфичность анализа,
т.е. получение высокотитражных и высокоаффинных антисывороток [81]. В
ходе серии экспериментов были получены специфические иммунореагенты:
антиген и высокоаффинные поликлональные сыворотки.
По своей химической природе стероидный гормон эстрадиол является
низкомолекулярным органическим соединением с молекулярной массой
272,382г/моль, не обладающимсобственной иммуногенностью, т.е. гаптеном.
Рисунок 20.
Рисунок 20 - Структурная формула эстрадиола-17β
Как правило, соединения с размерами молекул менее 1000 дальтон
недостаточно иммуногенны и для придания им свойств активных иммуногенов
их нужно соединять с молекулой-носителем.
В связи с этим для придания эстрадиолу иммуногенных свойств создавали
высокомолекулярные конъюгаты эстрадиола 17β с гетерогенными носителями.
Для отработки способов получения конъюгатных препаратов обладающих
антигенными свойствами применили пять вариантов, основанные на
карбодиимидном методе иметоде активированных эфиров. В качестве
высокомолекулярных носителей, имеющих достаточнуюмолекулярную массу
для образования иммунного ответа организма животных, для конъюгации с
молекулами гаптенов-эстрадиола были использованы:
- бычий сывороточный альбумин (БСА) с молекулярной массой 66000 Да
(IgG-Free, Protease-Free Bovine Serum Albumin) производства Россия;
- овальбумин (ОВА) с молекулярной массой 45000 Да, производства
Россия;
- коллоидное золото ~0.01% HAuCl4, ~1A520 ед/мл, монодисперсный,
размер наночастиц 20нм, Sigma, США.
73
Было апробировано 5 способов конъюгации препаратов эстрадиола с БСА,
ОВА и коллоидным золотом с использованием в качестве сшивающих агентов
цианамида (cyanamide) производства MPBiomedicals (США), глутарового
альдегида (Fluka, Швейцария) и хлористоводородный 1–этил 3 (3диметиламинопропил), карбодиимид (EDC), (Sigma-Aidrich, США). Эти
вещества активируют химические связи и происходит соединение
(коньюгирование), не имеющее место в естественных условиях. Рисунок 21.
Первый способ предполагает добавление к раствору носителя
(БСА)эстрадиола и цианамида. Инкубацию проводили при комнатной
температуре при постоянном перемешивании в течение 12 часов на магнитной
мешалке и диализации против дистиллированной воды.
При втором способе к раствору эстрадиола в дистиллированной воде
медленно добавляют сухой носитель, растворяют хлористоводородный 1–этил
3 (3-диметиламинопропил) карбодиимид (EDC) и инкубируют в течение 2-х
часов при комнатной температуре и постоянном перемешивании. Смесь
диализировали в течении 2-х суток при температуре 4˚С против фосфатносолевого буфера с рН - 7,2-7,4 с двукратной сменой буферного раствора.
Рисунок 21 - Схематическое изображение сшивания гаптена-эстрадиола с
белком носителем бычьим сывороточным альбумином
Третий способ предполагал внесение к раствору носителяв 1M ацетата
натрия глутарового альдегидаи инкубирование при комнатной температуре в
течение 30 секунд с покачиванием. Раствор эстрадиола добавляли к полученной
смеси, инкубировали в течение 30 минут, диализировали против Триса-HCl
буфера с pH-7.2, в течение 6 часов при 4°C. Для остановки реакции добавляли
моноэтанолаамин.
При четвёртом способе носитель растворяли в morpholinoethane sulfonic
acid (МES), 0.15M NaCl, pH 4,7 до концентрации 10 мг/мл. Растворяли 4 мг
эстрадиола в минимальном объеме демитилсульфоксида (ДМСО), а затем в 1
мл буфера МES. Инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов.
Очистку конъюгата проводили диализом против ФСБ (рН 7,2) [18].
Конъюгаты с овальбумином и коллоидным золотом были синтезированы
аналогичным способом.
74
Пятый способ использовали только для конъюгирования коллоидного
золота с эстрадиолом в деионизированной воде.
Очистку полученных соединений проводили путем диализа и
гельфильтрации на сефадексе G-25. На рисунке 22 представлены методы
очистки полученных препаратов.
Рисунок 22 - Очистка конъюгатов методом диализа и хроматографии
После очистки гетероличные конъюгаты ЭСТ-БСА, ЭСТ-ОВА, ЭСТ-КЗ
исследовали в ИФА.
Из препаратов, использованных в качестве антигена для иммунизации
животных наилучшие показатели были в случае использования конъюгата
ЭСТ-БСА, полученного по методу №2, с использованием в качестве
сшивающего агента хлористоводородного 1–этил 3 (3-диметиламинопропил)
карбодиимида (EDC). Максимальный титр специфических антител при этом
составил от 1:3200 – 1:12800.
В результате проведения исследований отработана методика получения
коньюгированных
препаратов
препаратов
эстрадиола-17β
с
высокомолекулярными гетерологичными носителями BSA, OVA и коллоидным
золотом.
В результате проведенной работы было получено по 5 мл конъюгата
эстрадиола в каждом из способов. Часть препаратов конъюгата были разделены
на аликвоты по 200 мкл, законсервированы 50% глицерином и помещены на
хранение при -70С. Остальная часть препаратов былаиспользованадля
иммунизации животных с целью установления их способности вызывать
индукцию антител, специфических к антигенам.
75
2.2.2.2 Получение конъюгатов эстрадиола с ферментом пероксидазой
хрена
При проведении исследований с использованием варианта конкурентного
иммуноферментного анализа основным компонентом, от которого зависит
качество результата является конъюгат. Он представляет собой препарат
искомого гаптена, в нашем случае - гормон эстрадиол, который метили
ферментом. В качестве фермента для метки использовали фермент пероксидаза хрена фирмы «Sigma (лиофилизированный порошок, 250-330
ед/мг, RZ-3.0, ТипVI). В качестве сшивающего агента использовали 1-ethyl-3(3-dimethylaminopropyl) - carbodiimidehydrochloride (EDC) (Sigma).
В процессе работы проводили подбор оптимальных режимов конъюгации
эстрадиола с ферментом пероксидазой хрена. Было использованодваспособа
конъюгации, отличающиеся поколичеству вносимого фермента, гормона и
сшивающего агента, по применению разных растворителей: фосфатно-солевого
буфера или деионизированной воды, по времени инкубации и использования
процесса диализации.
После завершения процесса мечения препаратов коньюгатаэстрадиола
ферментом пероксидазой хрена проводили изучение его свойств: активности,
специфичности, устойчивости к воздействию факторов внешней среды.
Контроль активности коньюгата осуществляли путем определения его
рабочего титра. Рабочий титр приготовленных конъюгатов был определен в
прямом варианте ИФА методом «шахматного титрования». Для этого ячейки
96-луночного планшета для иммунологических реакций сенсибилизировали
ранее полученными специфическими поликлональными антителами в
концентрации от 0,02 до 0,005 мг/мл иинкубировали при 4ºС в течение ночи.
Для удаления несвязавшихсяантител, планшет отмывали 3 раза фосфатносолевым буфером с содержанием 0,05% твина-20 (ФСБ-ТВ-20). Далее в лунки
планшета вносили по 0,1мл растворов конъюгатов в ФСБ-ТВ-20 в разведениях.
Планшет с растворами выдерживали в термостатепри температуре 37ºС в
течение 60 минут. Процедуру отмывки планшет повторяли с целью удаления
несвязанных продуктов реакции. В лунки планшета вносили по 0,1 мл раствора
субстрата фермента. Субстрат ТМБ вносили по 100 мкл и инкубировали
планшет 10-15 минут при комнатной температуре. Реакцию останавливали
добавлением в лунки планшет раствора 0,5М серной кислоты. Результаты ИФА
учитывали с помощью спектрофотометра с вертикальным потоком света при
длине волны 450 нм.
За рабочий титр конъюгата принимали наибольшее его разведение,
которое выявляет сенсибилизированные специфические антитела с оптической
плотностью не ниже 0,5 нм. Конъюгат считается пригодным для
использования, если имеет рабочий титр не менее 1:500.
Результаты опыта по определению активности, полученных конъюгатов
приведены в таблице 7.
76
Как следует из таблицы 7, оптимальным для конъюгации эстрадиола был
способ №2, при котором оптическая плотность коньюгата составила 0,920 нм
при разведении 1:1000.
В результате тестирования было определено, что с использованием
способа коньюгации №2, предполагающего инкубирование в течение 24 часов
при комнатной температуре и очистку на хроматографической колонке с
сефадексом G-25, можно получить активные препараты конъюгатов
эстрадиолас пероксидазой хрена с рабочим титром 1:1000.
Таблица 7 - Результаты определения рабочего титра специфических
конъюгатов
Конъюгат
Способ
Оптическая плотность при разведении, нм
№
1:200
1:500
1:1000
1:2000
ЭСТ-ПХ
1
0,699
0,400
0,215
0,167
ЭСТ-ПХ
2
1,264
1,002
0,920
0,432
Примечание - ЭСТ-ПХ – конъюгат эстрадиола с ферментом пероксидазы
хрена
Еще одним важнейшим показателем пригодности коньюгатов при
использовании в иммуноферментном анализе является его специфичность.
Специфичность полученных конъюгатов определяли также в прямом варианте
ИФА с использованием препаратов антител специфичных к эстрадиолу.
2.2.3 Получение специфических иммунных сывороток
2.2.3.1 Иммунизация кроликов
Для определения иммуногенных свойств полученных конъюгатных
препаратов была проведена иммунизация лабораторных животных. Для
получения иммунных сывороток необходимо подобрать рациональную схему
иммунизации животных. При выборе оптимальной схемы иммунизации
животных важно было создать такие условия (доза антигена, кратность
инъекций, продолжельность), которые привели бы к значительному уровню
специфических антител.
С этой целью иммунизировали четыре группы животных. По методу
аналогов были подобраны 4 группы кроликов-самцов (2-2,5 кг по 7 особей в
группе), которым инъецировали изготовленные по различной методике
иммунологические препараты.
Препараты иммуногена вводили стерильным шприцем в дозе 1 мл на
голову, подкожно в область спины в несколько точек с различной кратностью,
интервалом и продолжительностью иммунизации.
77
Для усиления иммунного ответа введенного антигена, вместе с
конъюгатом вводили полный и неполный адъювант Фрейнда.При каждой
иммунизации, конъюгат 17β – Esradiol вводили подкожно в пять точек
парапозвоночной области в соотношении антигена и адъюванта Фрейнда 1:1.
Схема иммунизации кроликов №1 состояла из 5-ти-кратного введения
эстрадиола с концентрацией 0,2 мг/мл с интервалом между первой и второй
иммунизацией 20 дней и последующих введений через 10 дней. На 15-ый день
после последнего введения взятие крови с целью тестирования сывороток
методом иммуноферментного анализа и РИД. Таблица 8.
Таблица 8 - Схема иммунизации кроликов №1
Продолжи- Кратно- КонцентДоза
Количество
тельность
сть
рация
АГ-ЭСТ адъюванта
в днях
введения АГ-ЭСТ
ПАФ/ НАФ
1
1
0,2мг/мл
0,5 мл
0,5 мл ПАФ
20
2
0,2мг/мл
0,5 мл
0,5 мл НАФ
30
3
0,2мг/мл
0,5 мл
0,5 мл НАФ
40
4
0,2мг/мл
0,5 мл
0,5 млНАФ
60
5
0,2мг/мл
0,5 мл
0,5 мл НАФ
Путь и
область
введения
подкожно
6-7 точек
подкожно
6-7 точек
подкожно
6-7 точек
подкожно
6-7 точек
подкожно
6-7 точек
Отбор крови
75
Схема иммунизации кроликов №2 отличалась от схемы №1, 4-х -кратным
введением антигена с концентрацией 0,1мг/мл и интервалом 7 дней.
На 15-ый день после последнего введения взятие крови для тестирования
сывороток в РИД и ИФА. Таблица 9.
Таблица 9 - Схема иммунизации кроликов №2
Продолжи- Кратно- КонцентДоза
тельность
сть
рация
АГ-ЭСТ
в днях
введения АГ-ЭСТ
1
1
0,1мг/мл
0,5 мл
Количество
адъюванта
ПАФ/ НАФ
0,5 мл ПАФ
8
2
0,1мг/мл
0,5 мл
0,5 мл НАФ
15
3
0,1мг/мл
0,5 мл
0,5 мл НАФ
23
4
0,1мг/мл
0,5 мл
0,5 млНАФ
37
Отбор крови
78
Путь и
область
введения
подкожно
6-7 точек
подкожно
6-7 точек
подкожно
6-7 точек
подкожно
6-7 точек
Схема №3 отличалась от схемы иммунизации №2 и №3 интервалами
введения конъюгата, которые составили: между первой, второй и третьей 7
дней, а между третьей и четвертой 14 дней. А также в сравнении со схемой №3
концентрацией антигена 0,1 мг/мл. Через 14 дней после последней
иммунизации, осуществлялось взятие крови, с целью тестирования сыворотки
на наличие специфических антител при помощи методов ИФА и РИД. Таблица
10.
Таблица 10 - Схема иммунизации кроликов №3
Продолжи- Кратно- КонцентДоза
Количество
Путь и
тельность
сть
рация
АГ-ЭСТ адъюванта
область
в днях
введения АГ-ЭСТ
ПАФ/ НАФ
введения
1
1
0,1мг/мл
0,5 мл
0,5 мл ПАФ
подкожно
6-7 точек
8
2
0,1мг/мл
0,5 мл
0,5 мл НАФ
подкожно
6-7 точек
15
3
0,1мг/мл
0,5 мл
0,5 мл НАФ
подкожно
6-7 точек
28
4
0,1мг/мл
0,5 мл
0,5 млНАФ
подкожно
6-7 точек
45
Отбор крови
Схема №4 отличается от всех схем иммунизации использованием грундиммунитета с концентрацией эстрадиола 0,1 мг/мл, а последующие четыре
иъекцции по 0,2 мг/мл. Через 7 дней после последней иммунизации у кроликов
отбирали кровь для анализов. Таблица 11.
Наиболее оптимальные варианты схем иммунизации кроликов, дающих
высокоспецифичные иммунные сыворотки проводили в 2-х повторах с
последующей реиммунизацией животных с высоким титром антител.
Таблица 11 - Схема иммунизации кроликов №4
Продолжи- Кратно- КонцентДоза
тельность
сть
рация
АГ-ЭСТ
в днях
введения АГ-ЭСТ
1
1
0,1мг/мл
0,5 мл
Количество
адъюванта
ПАФ/ НАФ
0,5 мл ПАФ
7
2
0,2мг/мл
0,5 мл
0,5 мл НАФ
14
3
0,2мг/мл
0,5 мл
0,5 мл НАФ
21
4
0,2мг/мл
0,5 мл
0,5 млНАФ
28
5
0,2мг/мл
0,5 мл
0,5 млНАФ
35
Отбор крови
79
Путь и
область
введения
подкожно
6-7 точек
подкожно
6-7 точек
подкожно
6-7 точек
подкожно
6-7 точек
подкожно
6-7 точек
2.2.3.2 Тестирование и очистка иммунных сывороток
Полученные иммунные сывороткитестировали на наличие специфических
антител к гормону 17β-estradiol методами ИФА и РИД. Проводили
исследования нативной сыворотки и сыворотки после истощения Таблица 12.
При исследовании сыворотки полученной послеиммунизации кроликов по
схеме №1, титр антител не
очищенной сыворотки, обнаруживался при конечном разведении 1:12800,
в РИД при разведении 1:4. Титр антител сыворотки после очистки составил в
ИФА 1:6400, в РИД 1:2.
При исследовании сыворотки полученной по схеме №2, в ИФА
образовавшиеся комплексы обнаруживались при разведении 1:6400, и в РИД
1:4. Титр антител сыворотки после очистки составил: ИФА 1:3200, РИД 1:2.
Анализ сыворотки полученной по схеме №3, показал следующие
результаты: связавшиеся комплексы антиген-антитело в ИФА обнаруживались
до конечного разведения 1:3200, исследование в РИД не дало положительных
результатов. После процедуры очистки – в ИФА титр показал 1:6400,
исследование в РИД не дало положительного результата.
Результаты тестированияиммунной сыворотки полученной по схеме №4
показали титр в ИФА –до конечного разведения 1:12800, в РИД при разведении
1:4. После процедуры очистки – титр в ИФА составляет 1:6400, а в РИД 1:2.
Таблица 12 - Результаты исследования сывороток в ИФА и РИД
Схема
Титры
Титры
Титры
Титры
иммунизации антител ИФА антител ИФА антител РИД антител РИД
животны
(нативная
(сыворот
(нативна
(сыворо
х
сыворотка)
ка после
я
тка после
адсорбции)
сыворотк адсорбции)
а)
№1
1:12800±0,15
1:6400±0,17
1:4±0,15
1:2±0,15
№2
1:6400±0,15
1:3200±0,15
1:2±0,09
1:1±0,09
№3
1:3200±0,09
1:1600±0,1
№4
1:12800±0,17
1:6400±0,17
1:4±0,17
1:2±0,1
№5
1:12800±0,13
1:6400±0,17
1:4±0,17
1:2±0,1
Как видно из таблицы 12 в результате тестирования полученных
сывороток крови было определено, что гормон 17β-estradiol конъюгированный
с высокомолекулярным белком носителем БСА обладает свойством вызывать
иммунный ответ. При этом наиболее высокий титр разведения антител по
отношению к 17β-estradiol, при небольшой реакции с препаратами носителя,
показали пробы сывороток крови взятых от кроликов иммунизированных
конъюгатом по схеме №1 и №4. Титры антител, специфичных непосредственно
80
к антигенным детерминантам гаптена-гормона находились в пределах: ИФА
1:3200 - 1:6400.
Титры очищенных иммуноглобулинов в реакции иммунной диффузии
составили 1:2-1:4. Рисунок 23.
Рисунок 23 – Результаты РИД очищенных иммуноглобулинов
От животных с наиболее высоким титром специфичных антител были
получены пробы сыворотки крови, в среднем по 10 мл.
Для выделения фракций иммуноглобулинов было проведено их
высаливание сульфатом аммония до 50% концентрации.
Очистку полученных фракций поликлональных антител от белковых
носителей проводили путём гельфильтрации с помощью хроматографической
колонки (длина 30-60 см, диаметр - 1,5 см) с различными носителями (G-75, G200). В качестве буферных систем использовали фосфатно-солевой буфер с рН
7,2-7,4.
Полученные в результате фракции иммуноглобулины концентрировали до
1мг/мл по общему белку методом диализа против полиэтиленгликоля с
молекулярной массой 6000 кД (ПЭГ-6000). Препараты разделяли на аликвоты и
хранили до использования при - 20°С.
На введение конъюгата ЭСТ-БСА было получено 48 специфических
поликлональных сывороток путём иммунизации кроликов по схемам №1 и №4,
описанной в п.2.2.3.1.
2.2.4 Получение моноклональных антител к эстрадиолу 17β
К основным методам, широко применяемым в мировой практике для
обнаружения остаточных количеств гормональных препаратов в продуктах
животноводства относится иммуноферментный анализ (ИФА). Важным
преимуществом ИФА является высокая чувствительность, специфичность,
применение стандартных препаратов. Однако, ИФА как диагностический тест
будет иметь ценность лишь в том случае, когда в нем будут использованы
специфические иммуноглобулины, направленные против уникальных эпитопов
гормонов, характеризующиеся постоянными свойствами, т. е. имеющие
моноклональное происхождение, и доступные в неограниченном количестве. В
этом случае, чувствительность и специфичность ИФА несопоставимо выше, так
как позволяет выявлять остаточные количества гормонов в диапазоне не всегда
81
достаточном для воздействия их на тест-культуры. Предел обнаружения в ИФА
для стероидных гормонов от 0,0015 мг/кг до 0,15 мг/кг в зависимости от вида
продукта.
Для получения моноклональных антител к эстрадиолу-17β использовали
гибридомную технологию.
Для получения иммунных спленоцитов была проведена иммунизация
лабораторных мышей линии Balb/c 8-недельного возраста препаратами
конъюгатов эстрадиола: конъюгат эстрадиола с бычьим сывороточным
альбумином (ЭСТ-БСА), конъюгат эстрадиола с овальбумином (ЭСТ-ОВА),
конъюгат эстрадиола с коллоидным золотом (ЭСТ-КЗ). Для иммунизации по
принципу аналогов были сформированы три группы мышей по три головы в
каждой.
До начала иммунизации проводили отбор проб крови с последующим
анализом преиммунной сыворотки для кроссреакции на используемые
антигены. В первый день иммунизации вводили внутрибрюшинно по 100 мкл
каждого конъюгата с неполным адъювантом Фрейнда (1:1). Затем на 7, 11, 12,
13 дни животным инъецировали по 100 мкл антигена в забуференном
физиологическом растворе с рН 7,2-7,4. Рисунок 24.
Рисунок 24 – Иммунизация мыши линии BALB/c
По окончании сроков иммунизации проводили отбор проб сывороток
крови и тестировали в непрямом варианте иммуноферментного анализа. С этой
целью ячейки 96-луночного планшета для иммунологических реакций
сенсибилизировали гетерологичными конъюгатами эстрадиола на фосфатносолевом буфере с pH 7,2-7,4 в разных концентрациях (5-10 мкг/мл.), при 4С в
течение 16-18 часов. Постановку реакции осуществляли в стандартном
варианте. Результаты ИФА учитывали с помощью спектрофотометра при 450
нм. Таблица 13.
В результате тестирования полученных сывороток крови было определено,
что все препараты конъюгатов обладают свойством вызывать иммунный ответ.
В результате тестирования было выяснено, что использованные конъюгаты
обладают достаточной степенью антигенности, так как титр специфических
82
антител составлял в пределах 1:400-1:6400. При этом наиболее высокий
средний титр антител по отношению к эстрадиолу, при небольшой реакции с
препаратами носителя, показали пробы сывороток крови, взятых от мышей
иммунизированных конъюгатом эстрадиол-БСА. Титры антител, специфичных
непосредственно к антигенным детерминантам гаптена-гормона достигали
1:3200-1:6400, что указывает на активную индукцию клонов В-лимфоцитов,
продуцирующих антитела заданной специфичности.
Таблица 13 - Титры специфических антител иммунных мышей в ИФА
№
Антиген использованный для иммунизации
мыши
ЭСТ-БСА
ЭСТ-ОВА
ЭСТ-КЗ
1
1:3200
1:3200
1:400
2
1:6400
1:1600
1:400
3
1:6400
1:3200
1:800
Отбирали мышей с наиболее высокими титрами антител, селезенки
которых были использованы в качестве источника иммунных лимфоцитов.
Слияние клеток селезенки мышей осуществляли с миеломными клетками
линии Х63/Ag 8.653. В качестве сливающего агента использовали 50% раствор
полиэтиленгликоля с молекулярной массой 4000.
Для культивирования клеточных культур использовали среду RPMI-1640 с
добавлением 10% фетальной сыворотки теленка, 0,05 мг/мл пирувата натрия,
0,003 мл/л 2-меркаптоэтанола. Рисунок 25.
Рисунок 25 - Клетки миеломных клеток линии X63-Ag 8.6.5.3
Количество миеломных клеток – 3×106, иммунных спленоцитов – 20×106,
соотношение 1:9.
83
После гибридизации клетки культивировались на селективных средах:
вначале на среде ГАТ (гипоксантин - аминоптерин - тимидин), а затем на среде
ГТ (гипоксантин-тимидин). Формирование асцитной опухоли штаммами
гибридом - продуцентов моноклональных антител происходило в течение двух
недель. По истечению двух недель после гибридизации проводили контроль
роста слившихся клеток путем просмотра культур под инвертированным
микроскопом. Было выявлено, что из 384 лунок, использованных для рассева
(четыре 96-ти луночных планшета для проведения культуральных работ), рост
гибридных клеток наблюдался в 15 лунках, процент слившихся клеток составил
– 3,9%. Тестирование культуральной жидкости клонов методом ИФА на
наличие специфических антител начинали проводить с момента, когда
наблюдалось незначительное пожелтение ростовой среды и гибридные клетки
занимали более 30 % поверхности лунок. В качестве антигена использовали
конъюгат эстрадиола с овальбумином (ОВА).
Результаты первичного тестирования гибридных клонов в непрямом
варианте иммуноферментного анализа показали присутствие специфических
антител в культуральной жидкости 2-х штаммов гибридом 3В4 и 4F4. Таблица
14.
Таблица 14 - Результаты скрининга гибридных культивируемых клеток
Наименование
Оптическая плотность
гибридного
15-й день
20-й день
25-й день
клона
3В4
0,652
0,514
0,111
4F4
0,803
0,993
1,015
Как следует из результатов таблицы 14, только один штамм 4F4 сохранил
активность с течением времени. Далее, для получения гомогенных по структуре
и свойствам МКА было проведено клонирование гибридомы 4F4 методом
лимитирующих разведений. В результате клонирования было получено 3
гомогенных штамма, сохранивших свои свойства и продуцирующих
моноклональные антитела,
специфичные к антигенным детерминантам
эстрадиола. Антительную активность клеток - субклонов определяли с
помощью ИФА через 10–14 суток после клонирования. Для определения
активности гибридом выбирали ячейки, содержащие одиночные колонии
клеток, различимые микроскопически. Позитивные клоны подвергали
реклонированию по описанному методу. Результаты клонирования показали
однородность отобранных субклонов, так как до 84 % из них сохранили синтез
специфических иммуноглобулинов. Для дальнейшей работы были отобраны
субклоны с наибольшей оптической плотностью в ИФА. Титр антител
культуральной жидкости субклонов, при которых достоверно фиксировалось
связывание иммуноглобулинов в ИФА, был в диапазоне от 1:1600 до 1:3200.
84
Для получения препаративного количества моноклональных антител in vitro
проведено культивирование штаммов на 24-луночных планшетах и затем в
вентилируемую ёмкость (матрацы) объемом 25-50 мл. (Рис. 26)
Рисунок 26 - Культивирование штаммов в вентилируемой ёмкости
По мере накопления клетки снимали мягким пепетированием, часть
гибридом была подвергнута криоконсервации в жидком азоте при -196С для
длительного
хранения.
Культуральную
жидкость
гибридом
4F4
концентрировали на пальчиковом концентраторе СХ-10 (Millipore).
Для наработки моноклональных антител in vivo, 6-ти мышам линии Balb/c
за 7-10 суток до инъекции вводили препарат пристан в дозе 0,5 мл на голову.
Через 6-7 суток штаммы-продуценты моноклональных антител вводили
линейным мышам внутрибрюшинно в количестве 0,5 млн. клеток в 1 мл и
наблюдали до образования у подопытных животных асцитных опухолей. После
этого мышей убивали методом цервикальной дислокации и в стерильных
условиях собирали асцитную жидкость содержащую моноклональные антитела.
Полученные серии моноклональных антител из асцитной жидкости
очищали методом сульфатаммонийного высаливания до 50% насыщения, с этой
целью в асцитную жидкость добавляли равный объем ЗФР с рН 7,2 и равный
объем насыщенного раствора сульфата аммония и оставляли при
перемешивании на 12 часов при 4°С.
Для более полной очистки моноклональных антител использовали метод
диализа против 1000-кратного объема забуференного физиологического
раствора, и диализовали против ЗФР в течение суток. Очищенные
моноклональные антитела в виде асцитной жидкости консервировали с
добавлением 0,1% азида натрия и замораживали при -70С. Объем полученной
асцитной жидкости от каждого штамма в среднем составил 4-5 мл.
Концентрацию антител определяли по методу Бредфорда, она составила 4
мг/мл.
85
2.2.5 Изучение иммунохимических свойств моноклональных антител
Проведены исследования по изучению иммунохимических свойств
полученных моноклональных антител (МКА). Результаты исследований
показали, что характер роста гибридом - стационарная суспензия. При посеве в
вентилируемые
ёмкости
гибридомы
представляли
собой
слабо
прикрепляющиеся к подложке округлые клетки размером с исходной
миеломной клетки, цитоплазма гибридом имела вид тонкого ободка вокруг
ядра. Полученные гибридомы хорошо растут в ростовой среде,
представляющей собой RPMI 1640 c 10% сывороткой плода коровы, 2х10-3 МLглутамина, 1х10-3 М пирувата натрия при температуре 37С в атмосфере с 5%
СО2. При посевной дозе 1-2 млн.кл./мл клетки образовывали монослой в
среднем за 5 дней, при этом продуктивность МКА составляла от 30 до 125
мкг/мл.
Методом вертикального электрофореза в 10% ПААГ в присутствии
додецилсульфата натрия на аппарате для вертикального электрофореза
Сompactdualminicode (Англия) определена молекулярная масса исследуемых
моноклональных антител, которая составила 66 и 25 кД, что соответствует
общепринятым значениям показателей тяжелых и легких цепей
иммуноглобулинов. (Рис. 27).
Рисунок 27 - Определение молекулярной массы МКА
В процессе изучения иммунохимических свойств полученных
моноклональных антител осуществляли постановку иммуноблотинга по методу
H. Towbinetal., что позволило доказать гомогенность (однородность)
полученных моноклональных антител по своей структуре, поскольку в
иммуноблотинге реагировали с исходным антигеном с образованием одной
линии.
Следующим важнейшим показателем моноклональных антител является
константа связывания то есть, аффинность по отношению к конъюгату
эстрадиол-ОВА, которую определяли по методу J. Beattyetal, ее значения были
в пределах 2,3х10-8М. Как видно из графика (Рис. 27), показатели константы
86
связывания моноклональных антител составляют по отношению к исходному
антигену 2,3х10-8М.
--- 5 мкг/мл; --- 10 мкг/мл
Рисунок 27 - Определение константы связывания гибридомы
Определение изотипа антител методом радиальной иммунодиффузии в
агарозном геле показало, что моноклональные антитела всех штаммов
относятся к иммуноглобулинам класса G подкласса G3. Концентрация
моноклональных антител в культуральной и асцитной жидкости составила 60,
30, 125 и 4000 мкг/мл соответственно. Полная характеристика полученных
моноклональных антител приведена в таблице 15.
Таблица 15 – Характеристика штаммов гибридом
Наимен Константа Изотип
ПродуктивПродуктив- Специфичование связывания МКА ность in vitro, ность in vivo,
ность
штамма
мкг/мл
мкг/мл
-9
4F4А7
1,9х10 М
IgG3
60
4000
эстрадиол
4F4G8
2,6х10-9М
IgG3
30
4000
эстрадиол
4F4D9
2,2х10-9М
IgG3
125
4000
эстрадиол
Таким образом, в результате выполнения данного этапа исследований
методом гибридомной технологии было получено 3 штамма гибридом
продуцирующих моноклональные антитела специфичные антигенным
детерминантам эстрадиола. Проведена наработка препаративного количества
моноклональных антител и изучены их основные иммунохимические свойства.
87
2.2.6 Определение оптимальных условий применения специфических
антител и конъюгата эстрадиола с ферментом в конкурентном варианте
ИФА
При разработке способов иммуноферментного определения эстрадиола,
следует принимать во внимание тот факт, что гормон по своей химической
структуре является гаптеном. В этой связи, очевидным становится
невозможность
использования
обычных
«сэндвич»
вариантов
иммуноферментного анализа. В таких случаях, для количественного
определения гаптена, адекватный анализ может быть проведен в различных
формах конкурентного взаимодействия.
Для отработки параметров постановки конкурентного ИФА нами
изучалось влияние физико-химических факторов: температура, ионная сила,
значения рН среды, концентрационные соотношения, блокирующий буфер,
продолжительность взаимодействия, применения поликлональных антител
(ПКА) и моноклональных антител (МКА) полученного конъюгата эстрадиола с
пероксидазой хрена (ЭСТ-ПХ) в конкурентном варианте ИФА для определения
стандартного раствора эстрадиола (контроль реакции).
Сущность метода и принципиальная схема определения эстрадиола в
данном варианте конкурентного иммуноферментного анализа состоит в
использовании первичных антител захвата, адсорбированных на поверхности
планшета, неконъюгированных вторичных антивидовых антител и эстрадиола,
конъюгированного с пероксидазой.
Постановка реакции состоит из следующих этапов:
1) иммобилизация лунок полистирольного планшета специфическими
антителами;
2) одноэтапное внесение и инкубирование стандартных растворов
эстрадиола, раствора конъюгата эстрадиола с носителем и раствора
антивидовых антител;
3) внесение хромогена и контроль реакции.
Для проведения реакции использовали 96-луночные полистирольные
планшеты (Китай), антивидовые коммерческие антитела Anti-Mouse IgG
(Jackson Lab, США), стандартный раствор эстрадиола.
На первом этапе определяли оптимальные параметры подготовки
иммунного сорбента. Для этого лунки полистирольного планшета промывали
дистиллированной водой и в каждую лунку вносили 0,2 мл этилового спирта.
Через 1 минуту спирт сливали и лунки планшета трижды промывали в
отмывочном буфере - фосфатно-солевом буфере с твином (ФСБ-ТВ), с рН
среды -7,4. Влияние продолжительности и температуры инкубации антигена на
степень его адсорбции изучали, используя конъюгат ЭСТ-БСА в концентрации
0,05 мкг/мл. Далее во все лунки вносили по 0,15 мл раствора антигена в
карбонат-бикарбонатном буферном растворе с рН среды - 9,5 и фосфатносолевом буфере с рН-7,2. Сенсибилизацию лунок конъюгатом ЭСТ-БСА
проводили при различных условиях в течение 1 и 2-х часов при температуре
88
37°С, и в течение 16 часов при температуре 4°С. Для удаления не связавшиеся с
поверхностью полистирольной лунки ли, промывая лунки трижды в
отмывочном буфере. Для определения рабочего разведения исследуемых
сывороток каждую из них титровали методом двукратных разведений в
растворе фосфатного буфера с 0,05% твина-20 и рН среды -7,4 на твёрдофазном
антигене (ТФА). После сенсибилизации и отмывки в лунки планшета вносили
по 0,15 мл исследуемых АТ в рабочем разведении 1/800 и калибровочные растворы эстрадиола, инкубировали в течение 1 часа при температуре 37 °С, затем
трижды отмывали в промывочном буфере.
Результаты ИФА учитывали с помощью спектрофотометра с
вертикальным потоком света (ASYS Expert 96, Австрия) при длине волны 450
нм. Таблица 16.
Таблица 16 - Результаты тестирования стандартных растворов эстрадиола
Схема 1
Концентрация,
0
0,5
1,5
4,5
13,5
40,5
нг/мл
ОП, нм
ОП, %
2,621
1,542
1,349
1,315
0,977
0,588
58
51
50
37
25
В результате проведенной работы были определены оптимальные
параметры проведения реакции:
- концентрация ПКА/МКА – 0,005 мг/мл;
- буфер для разведения ПКА/МКА - карбонат-бикарбонатный буфер с рН
среды -9,5;
- инкубация моноклональных антител на твердой фазе - 12 ч при 4ºС;
- буфер для разведения раствора эстрадиола - фосфатно-солевой буфер с
рН среды -7,2;
- время и условия экспозиции стандартного раствора эстрадиола, раствора
конъюгата эстрадиола и раствора антивидовых антител – 2 часа при комнатной
температуре в пределах 20-25°С.
Реакцию повторяли 3 раза. Средние показатели из 2-х полученных в опыте
значений оптической плотности, измеренной в лунках со стандартными
растворами, делили на среднее значение оптической плотности, измеренной в
лунках с первым (нулевым) стандартом, полученный результат умножали на
100.
Результат измерения оптической плотности измеряемой пробы выражается
в процентах от оптической плотности лунки с нулевым стандартом (%
поглощения) по формуле:
ОПn х 100 = % поглощения
ОПО
89
где, ОПn – среднее значение оптической плотности в лунках со
стандартной пробой;
- ОПО – среднее значение оптической плотности лунки с нулевым
стандартом.
По величине относительного поглощения, вычисленного для стандартного
раствора, и соответствующим известным значениям концентрации эстрадиола
мкг/кг (мкг/л) строили калибровочные кривые.
оптическая плотность, %
70
60
50
40
30
20
10
0
концентрация, нг/мл
0,5
1,5
4,5
13,5
40,5
Рисунок 28 - Калибровочная кривая для стандартных растворов
эстрадиола (схема 1)
Анализируя полученные результаты, следует отметить, что использование
данной схемы постановки конкурентного ИФА не позволяет в полной мере
оценить степень регистрации раствора эстрадиола с известными
концентрациями, а построенная калибровочная кривая не обладает
необходимой линейностью в основном диапазоне данных.
2.2.7 Определение оптимальных условий применения специфических
антител и антивидового пероксидазного конъюгата в конкурентном
варианте ИФА
Для отработки оптимальных параметров постановки конкурентного ИФА
на основе применения моноклональных антител и антивидового
пероксидазного конъюгата (anti-mouse IgG) для определения стандартных
(контроль реакции) раствора эстрадиола нами изучалось влияние основных
физико-химических факторов: температура, ионная сила и значения рН,
концентрационные соотношения, буфер, продолжительность взаимодействия,
которые определяют протекание реакции.
90
Сущность метода и принципиальная схема определения эстрадиола в
данном варианте конкурентного иммуноферментного анализа основана на
конкуренции свободного эстрадиола из исследуемой пробы и эстрадиола,
предварительно иммобилизованного на твердой фазе в составе белкового
конъюгата БСА, за центры связывания специфичных к эстрадиолу антител.
После
отделения
несвязавшихся
реагентов
количество
антител,
прореагировавших с иммобилизованным антигеном, определяют с помощью
антивидовых антител меченных пероксидазой хрена. Таким образом,
количество выявленных антивидовым конъюгатом специфических антител
будет обратно пропорционально концентрации эстрадиола в растворе.
Постановка реакции состоит из следующих основных этапов:
1) фиксация образца на твердой подложке т.е. иммобилизация в лунках
планшета конъюгата эстрадиола с гетерологичным белок-носителем;
2) одноэтапное внесение и инкубирование раствора эстрадиола и раствора
специфических антител
3) внесение антивидового пероксидазного конъюгата
4) внесение хромогена и контроль реакции на спектрофотметре ИФА.
Последовательность постановки ИФА показана на рисунке 29.
1
2
1) Сенсибилизация конъюгатом
эстрадиола с гетерологичным
белок-носителем
2) Одноэтапное внесение и
инкубирование раствора
эстрадиола и раствора
специфических антител
4
3
3) Внесение антивидового
пероксидазного конъюгата
4) Внесение хромогена и
контроль реакции
Рисунок 29 – Схема постановки конкурентного ИФА
91
Для проведения реакции использовали 96-луночные полистироловые
планшеты (Китай), полученные специфические моноклональные и
поликлональные антитела, коммерческие антивидовые конъюгаты Anti-Mouse
IgG (Peroxidaseantibody) (Jackson Lab, США) и кроличьи IgG с пероксидазой
(Sigma, Германия), стандартный раствор эстрадиола (ЭСТ).
Первый этап работы включал определение оптимальных параметров
подготовки иммунного сорбента. С этой целью лунки полистирольного
планшета сенсибилизировали конъюгатом эстрадиола с овальбумином (ОВА) в
диапазоне концентраций 0,005-0,02 мг/мл на карбонат-бикарбонатном буфере с
рН среды -9,5 и фосфатно-солевом буфере с рН-7,2.
Инкубацию проводили в течение 10, 16 и 24 часов при температуре 4ºС
или 2 часа при 37ºС. Далее в лунки планшета вносили по 0,05 мл стандартного
раствора эстрадиола в различных концентрациях: 0; 0,5; 1,5; 4,5; 13,5; 40,5
нг/мл. Добавляли по 0,05 мл раствора МКА или ПКА, перемешивали вручную,
вращая планшет легкими круговыми движениями по поверхности стола и
оставляли на инкубацию в течение 1-2-х часов при комнатной температуре в
пределах 20-25°С. Затем добавляли по 0,05 мл раствора антивидового
конъюгата.
Результаты ИФА учитывали с помощью спектрофотометра с
вертикальным потоком света при длине волны 450 нм. Реакцию повторяли два
раза. Таблица 17.
В результате проведенной работы были определены оптимальные
параметры проведения реакции:
- концентрация антигена - конъюгат эстрадиола с овальбумином – 0,01
мг/мл;
- буфер для разведения антигена - фосфатно-солевой буфер с рН-7,2;
- инкубация антигена – 12 часовпри температуре 4ºС;
- буфер для разведения раствора эстрадиола - фосфатно-солевой буфер рН
среды 7,2;
- экспозиция стандартного раствораэстрадиола и раствора специфических
антител – 2 часа при комнатной температуре в пределах 20 - 25°С.
Расчет значений оптической плотности и процента поглощения проводили
аналогично ранее проведенным исследованиям.
Таблица 17 – Результаты тестирования стандартных растворов эстрадиола
(схема 2)
Концентрация,
0
0,5
1,5
4,5
13,5
40,5
нг/мл
ОП, нм
ОП, %
2,205
1,166
0,964
0,681
0,360
0,200
52
43
30
16
9
92
По величинам относительного поглощения, вычисленным для стандартных
растворов, и соответствующим известным значениям концентрации эстрадиола
мкг/кг (мкг/л) строили калибровочные кривые.
В результате проведенных исследований, при использовании этой схемы
конкурентного варианта ИФА получены данные, позволяющие построить
калибровочные кривые, обладающие требуемой линейностью в основном
диапазоне данных и потенциально позволяющие проводить детекцию
эстрадиола в продуктах животноводства.
Таким образом, в результате проведенных исследований оптимальной
схемой постановки конкурентного варианта ИФА признана схема №2. Где
определение эстрадиола основано на конкуренции свободного эстрадиола
изисследуемой пробы и эстрадиола, предварительно иммобилизованного на
твердой фазе в составе белкового конъюгата, за центры связывания
специфичных к эстрадиолу антител, с последующим их выявлениемс помощью
антивидовых антител меченных пероксидазой хрена. Рисунок 30.
оптичекая плотность, %
60
50
40
52
43
30
30
20
16
10
9
0
концентрация, нг/мл
0,5
1,5
4,5
13,5
40,5
Рисунок 30 – Калибровочная кривая для стандартных растворов
эстрадиола (схема 2)
2.2.8 Отработка параметров подготовки проб материала
Известно, что эффективность любого метода определения опасных
веществ, в том числе остаточных количеств гормонов в продуктах
животноводства, в значительной мере зависит от правильно подобранного
способа подготовкипроб материала для исследования. Мы ставили задачу
разработать оптимальный способ извлечения гормона из проб мяса,
позволяющий проводить детекцию вещества в минимальном количестве. В
пробы мяса искусственно вводили растворы, содержащие гормон эстрадиол из
расчета 50 мкг/л активного вещества. Далее было изучено влияние различных
93
химических веществ на мышечную ткань. В процессе опыта одну и ту же пробу
мяса экспериментально загрязненную гормоном подвергали воздействию
различных физико-химических факторов и проводили сравнение их действия.
Химические соединения в качестве экстрактов подбирали с учётом их
полярности. Использовали соединение этилацетата с дихлорометаном в
соотношении 7:3, готовили буфер Макллвейна из смеси лимонной кислоты,
фосфорнокислого натрия, ЭДТА-натриевой соли и щавелевой кислоты в
этаноле.
Процесс подготовки проб состоял из гомогенизации и экстракции (рис.31).
В работе были использованы 5 способов экстракции гормона:
- способ №1 - экстрагирование этилацетатом с дихлорометаном;
- способ №2 - экстрагирование ацетоном;
- способ №3 - экстрагирование буфером Макллвейна;
- способ №4 - экстрагирование дистиллированной водой при 70-80°С;
- способ №5 - экстрагирование диэтиловым эфиром.
Исходя из полученных результатов, для тестирования в ИФА определен
оптимальный способ пробоподготовки образцов мышечной ткани:
- пробы мяса гомогенизировали до мелкодисперсного состояния,
добавляли дистиллированной воды в соотношении 12, полученные гомогенаты
смешивали с помощью вортекса и в течение 10 минут встряхивали на шейкере.
Рисунок 31 – Отработка способов подготовки проб мяса для исследования
94
В чистые пробирки брали по 3 грамма гомогената добавляли 9 мл в
соотношении 1:3 экстрагирующий раствор смешивали при помощи вортекса и в
течение 10 минут встряхивали на шейкере. Затем пробу центрифугировали в
течение 10 минут при 5000 об/мин.
Собирали полученный супернатант (водная фаза) в отдельные пробирки и
выпаривали в водяной бане при температуре 600 С с использованием азота до
сухого состояния. Затем в выпаренную пробу вносили 0,15 М фосфатносолевой буфер с рН 7,2-7,4 и ставили на 1минуту в вортекс.
Степень извлечения эстрадиола из исследуемой пробы определяли по
показаниям российской тест-системы ИФА, учет результатов проводили по
интенсивности окрашивания реакционной среды т.е. оптической плотности на
спектрофотометре. Также в качестве контроля тестировали пробы свободные
от гормона. Реакцию ставили в трех повторах и рассчитывали среднее значение
оптической плотности. Таблица 18.
Таблица 18 – Результаты оценки различных способов экстрагирования
эстрадиола из мышечной ткани
Эстрадиол
Оптическая плотность в ИФА, нм
способ №1 способ №2 способ №3 способ №4
способ №5
50 мкг/л
0,007
0,067
0,099
0,991
0,600
0 мкг/л
1,134
1,073
1,060
1,203
1,004
Из таблицы видно, что характер предварительной обработки образцов
мышечной ткани существенным образом оказывает влияние на степень
извлечения гормона. Наибольшее влияние наблюдается при использовании
ацетонитрила с дихлорометаном (способ №1), затем ацетона (способ №2),
диэтилового эфира (способ №5), наименьшее - буфера Макллвейна (способ
№3), самое незначительное влияние при экстрагировании дистиллированной
водой с подогревом.
В связи со сложностью приобретения диэтилового эфира, он является
прекурсором, со сложным 5-ти компонентным составом буфера Маклвейна и
наименьшим выходом гормона, для дальнейшей работы выбран способ
экстрагирования ацетонитрила с дихлорометаном.
Исходя из полученных результатов, для тестирования в ИФА определен
оптимальный способ пробоподготовки образцов мышечной ткани, который
заключается в следующем:
 гомогенизация пробы, добавление дистиллированной воды в
соотношении 12, смешивание при помощи вортекса;
 встряхивание в течение 10 минут на шейкере;
95
 добавление в пробу ацетонитрила с дихлорометаном в соотношении 13
(3 г гомогената и 9 мл экстракта) и встряхивание в течение 10 минут на
шейкере;
 центрифугирование пробы при 5000 об/мин. в течение 10 минут;
 сливание прозрачной экстрагированной фазы в чистые пробирки;
 выпаривание на водяной бане с температурой воды 60°С досуха;
 растворение высушенной пробы ФСБ 0,15М с рН среды 7,2-7,4;
 полученную пробу используют для исследования - 0,05 мл раствора на
1 лунку планшета ИФА.
2.2.9 Лабораторные испытания разработанных реагентов ИФА
Для определения диагностической ценности и возможности применения
на практике были проведены лабораторные испытания разработанного
иммуноферментного набора реагентов для определения гормона эстрадиола в
280 пробах мяса импортного производства и 50 пробах колбасных изделий
отечественного происхождения. Подготовку проб и проведение анализов
осуществляли в соответствии с оптимальными условиями и схемой
постановки, определенных в результате предыдущих исследований. Таблица
19.
Таблица 19 – Результаты определения эстрадиола в животноводческой
продукции в конкурентном ИФА
Вид
Происхождение
Количество
Позитивные
продукта
продукта
анализируемых
к эстрадиолу
проб
Количество
%
говядина
импорт
200
27
13,5
куриное мясо
колбаса
импорт
80
5
6,3
РК
50
5
10,0
Как видно из таблицы 19, в исследуемых образцах говядины был
обнаружен эстрадиол в 27-ми пробах, что составляет 13,5% от общего
количества исследованных проб мяса. В курином мясе из 80-ти исследуемых
проб остаточное содержание эстрадиола было обнаружено в пяти пробах, что
составило 6,3%. В 50-ти образцах колбасных изделиях отечественных
производителей обнаружено превышение эстрадиола в пяти пробах, что
составляет 10% от общего числа исследованных проб.
С целью определения эффективности разработанного варианта ИФА, все
позитивные пробы и некоторая часть негативных проб были исследованы
российской иммуноферментной тест-системой фирмы ООО «Медицина.
Аналитика. Ветеринария.». Постановку реакции проводили согласно
утверждённой инструкции по использованию тестов.
96
Разработанный конкурентный вариант иммуноферментного анализа
ставили по ранее отработанным параметрам. Учет результатов проводили по
показателям оптической плотности реакционной жидкости в лунках планшета с
помощью спектрофотометра при длинне волны 450 нм.
В результате проведенных исследований были получены следующие
данные. (Таблица 20, 21, 22).
Таблица 20 – Результаты ИФА по детекции эстрадиола в говядине
№
Разработанный вариант
Тест -системы фирмыООО
пробы
ИФА
«Медицина.Аналитика.Ветеринария.»
ОП, нм
результат
ОП, нм
результат
1
0,071
+
0,071
+
2
0,040
+
0,038
+
3
0,047
+
0,046
+
4
0,094
+
0,076
+
5
0,033
+
0,069
+
6
0,091
+
0,011
+
7
0,082
+
0,070
+
8
0,063
+
0,064
+
9
0,056
+
0,056
+
10
0,037
+
0,067
+
11
0,290
0,103
+
12
0,096
+
0,032
+
13
0,070
+
0,069
+
14
0,011
+
0,011
+
15
0,986
1,099
16
0,099
+
0,039
+
17
0,055
+
0,021
+
18
0,376
0,033
+
19
0,053
+
0,051
+
20
0,070
+
0,069
+
21
0,064
+
0,063
+
22
0,076
+
0,076
+
23
0,033
+
0,067
+
24
0,047
+
0,046
+
25
0,092
+
0,039
+
26
0,036
+
0,033
+
27
0,021
+
0,021
+
97
Как видно из таблицы 20, российский тест позволил обнаружить
остаточное количество гормона на две положительные пробы больше в
сравнении с разработанной нами тест-системы. Однако, в целом, результаты,
полученные при исследовании проб материала с помощью разработанной тестсистемы и российским тестом, были вполне сопоставимы и показали высокую
степень корреляции.
По аналогичной схеме были проведены исследования разаработанного
ИФА для обнаружения эстрадиола в пробах куринного мяса и колбасных
изделиях. Полученные результаты приведены в таблицах 21 и 22.
Таблица 21 – Результаты ИФА по детекции эстрадиола в мясе кур
№
Разработанный
Тест -система фирмы ООО
пробы
вариант ИФА
«Медицина.Аналитика.Ветеринария.»
ОП, нм
результат
ОП, нм
результат
1
0,077
+
0,019
+
2
0,063
+
0,063
+
3
0,029
+
0,028
+
4
0,082
+
0,070
+
5
0,063
+
0,064
+
Таблица 22 – Результаты ИФА по детекции эстрадиола в колбасных изделиях
№
Разработанный
Тест -система фирмы ООО
пробы
вариант ИФА
«Медицина.Аналитика.Ветеринария.»
ОП, нм
результат
ОП, нм
результат
1
0,020
+
0,0302
+
2
0,100
+
0,019
+
3
0,061
+
0,066
+
4
0,0335
+
0,035
+
5
0,014
+
0,040
+
Результаты исследования, направленные на обнаружение эстрадиола в
пробах куринного мяса и колбасных изделий в нашем варианте конкурентного
ИФА и российском аналоге, показали полное совпадение. Обнаруженные 5
позитивных проб в мясе кур и в колбасных изделиях, были подтверждены
результатами анализа российского иммуноферментного аналога.
98
Как следует из результатов исследований, разработанный вариант
конкурентного иммуноферментного анализа на основе использования
моноклональных и поликлональных антител к детерминантам гормона
эстрадиола, по своим основным характеристикам, чувствительности и
специфичности, не уступает коммерческому аналогу. Большая часть
результатов, полученных при использовании разработанного конкурентного
варианта ИФА, коррелировала с сопоставимыми показателями оптической
плотности данных коммерческих тестов.
Таким образом, на основе полученных данных по испытанию
разработанной тест-системы в сравнении с зарубежными аналогами можно
сделать предположение о возможности ее использования для детекции
остаточного количества эстрадиола в продуктах животноводства.
2.2.10 Разработка лабораторного регламента производства и
применения компонентов тест-систем ИФА для детекции остаточных
количеств гормона эстрадиола
С учетом опыта отработки оптимальных условий проведения анализа,
разработан лабораторный регламент производства и применения «Тестсистемы ИФА для определения остаточных количеств эстрадиола 17В в
животноводческой продукции» (Приложение В).
Лабораторный регламент состоит из 8 разделов.
I. Технологическая схема производства включает следующие этапы:
1) Приготовление конъюгатов эстрадиола;
2) Приготовление калибровочных растворов - растворы гормона с
известной концентрацией;
3) Наработка и очистка препаративного количества специфических
антител;
4) Подготовка иммуносорбента (сенсибилизация лунок планшета
конъюгатом эстрадиола);
5) Приготовление буферных растворов: 0,05 М бикарбонатный
буфер, рН 9,6; фосфатно-солевой буферный раствор, содержащий 0,05%
детергента твин-20 (ФСР-Т); фосфатно-солевой буферный раствор,
содержащий 1% бычьего сывороточного альбумина (блокирующий буферный
раствор); 0,05М цитратно-фосфатный буферный раствор (ЦФР, рН 5,0);
6) Приготовление стоп - реагента.
II. Сборка тест-системы
III. Наименование и спецификации оборудования
IV. Перечень и характеристика материалов
V. Изложение технологического процесса
Проведена сенсибилизация иммунного сорбента. Для этого в лунки
планшета вносили по 0,1см³ раствора конъюгата эстрадиола с овальбумином
(ОВА) в карбонат-бикарбонатном буфере рН-9,5 в концентрации 5-10 мкг/мл.
Затем планшет накрывали крышкой и оставляли в холодильнике при
99
температуре +4С на 18-24 часа. После инкубации содержимое лунок удаляли,
планшет отмывали четырехкратно раствором ФСБ, содержащим 0,05% твина20 (ФСБ-Т), подсушивали на воздухе при комнатной температуре и закрывали
защитной пленкой.
Растворы антивидовых пероксидазных конъюгатов в специальной
защитной среде разделены на аликвоты по 50 мкл и разлиты во флаконы. Кроме
того, подготовлены растворы и компоненты субстратной смеси и стопреагентов.
Подготовлены этикетки для маркирования реагентов, фасовка, маркировка
и упаковка компонентов «Тест-системы ИФА для определения остаточных
количеств эстрадиола 17В в животноводческой продукции». Для этого,
согласно разработанного регламента приготовлены 10-ти кратные концентраты
буферных растворов (фосфатно-солевой буферный раствор, содержащий 0,05%
детергента твин-20 (ФСБ-ТВ);) для промывания носителя и разведения проб в
объеме 20 мл (при разведении дистиллированной водой получится 200 мл) на
каждый набор.
VI. Контроль производства и управление технологическим процессом
Разработана стандартная лабораторная процедура проведения контроля
активности реагентов иммуноферментного теста. Процедура предусматривает
отбор компонентов набора случайным методом после хранения в течение
определённого времени (1 месяц, 2 месяца и т.д. до 12 месяцев, включительно)
и постановку иммуноферментного анализа с заведомо известными
положительными и отрицательными контролями.
Проведен контроль активности и специфичности реагентов изготовленной
тест-системы ИФА для определения остаточных количеств эстрадиола 17В в
животноводческой продукции, хранящихся в течение одного месяца, в
результате которого установлено, что на момент проверки все реагенты
соответствовали критериям установленным для каждого компонента в
отдельности.
VII. Переработка и обезвреживание отходов
VIII. Техника безопасности, охрана окружающей среды, пожарная
безопасность и производственная санитария.
100
2.3 Обобщение и оценка результатов исследований
Успехи в области изучения биохимии гормонов, их получения, в частности
методом генной инженерии, создали теоретические и технологические
предпосылки широкого использования гормонов в практике животноводства.
Развитие биотехнологической науки позволило создать синтетические
гормональные препараты с анаболической активностью в 10 и более раз
сильнее природных. Гормональные стимуляторы роста широко используются
при выращивании сельскохозяйственных животных и птицы. Использование
гормональных препаратов на здоровых животных на фоне полноценного
кормления и соответствующих условий содержания позволяет повысить
среднесуточный прирост молодняка на 5-25 % и эффективность использования
корма на 5-10% [7, 18, 27, 253]. Например, в США с использованием гормонов
получают более 50% говядины [9, 38]. В странах американского континента
Бразилии, Канаде, Мексике, Аргентине и Австралии разрешено использование
шести гормонов - эстрадиола прогестерона, тестостерона, зеранола,
меленгестрол ацетата и тренболон ацетата [9, 38]. Со стороны государственных
органов за предприятиями использующими стимуляторы роста ведётся
постоянный строгий контроль. Гормональные препараты применяют при
откорме животных в Великобритании, Франции, Канаде, Новой Зеландии и
других странах [2, 7, 27].
Естественным следствием применения гормональных препаратов в
животноводстве явилась проблема загрязнения ими продовольственного сырья
и пищевых продуктов. Синтетические стероидные гормоны сохраняются при
термической обработке, не обладают видовой специфичностью [7,9], и при
попадании в человеческий организм воспринимаются им как свои, активно
вмешиваясь в межгормональные взаимоотношения, что представляет
серьезную опасность для здоровья человека, (особенно опасны для здоровья
детей и подростков), поскольку данные соединения нарушают обменные
процессы и гормональный статус организма [2, 7, 22, 23, 24]. Конечно,
количество гормонов, попадающих в организм с мясом, не так велико. Однако,
как показали исследования последних лет, даже небольшое отклонение от
нормальной концентрации гормонов может сказаться на физиологии
организма. Вместе с тем длительное и систематическое использование
продуктов питания, загрязненных гормональными препаратами является
причиной различного рода аллергических реакций, дисбактериозов и других
нарушений [7, 22, 23, 24].
Убедительные
доказательства
канцерогенности
природных
и
синтетических стероидных эстрогенов (рак груди у женщин), и производных
стильбена позволили Международному агентству по изучению рака (IARC)
отнести их к группе признанных канцерогенов для людей [2, 28, 76]. Данному
вопросу уделяется должное внимание во многих странах, он неоднократно
рассматривался на конференциях, в правительственных программах многих
стран, а также экспертами ФАО/ВОЗ.
101
В странах Европейского Союза (ЕС) гормональные стимуляторы роста
отнесены к группе В - загрязнителям пищевой продукции и использование
препаратов в животноводстве запрещено с 1 января 1989 года в соответствии с
Директивой 88/146 / EEC, которые заменены позже распоряжением Директив
96/22 EC, ЕС/96/23, ЕС/2002/657, ЕС/2003/74 [12, 14, 15, 20, 21]. Запрет
распространяется и на импортное мясо от животных, получавших
гормональные ускорители роста.
В странах Таможенного Союза Российской Федерации, Беларуси и
Казахстана законодательно запрещено применение в животноводстве и
птицеводстве гормональных стимуляторов роста.
Что касается Казахстана, то здесь можно наблюдать двойственную
ситуацию. С одной стороны, в соответствии с требованиями Таможенного
союза запрет на использование гормональных стимуляторов роста животных. С
другой
стороны,
отсутствуют
механизмы
мониторинга
и
контрользасодержанием их в отечественной и импортнойживотноводческой
продукции. Соответственно отсутствуют утвержденные нормативные
документы (методики) по их определению и допустимые уровни. Контроль
основывается на информации, предоставляемой изготовителем (поставщиком)
продукции, об использованных при ее изготовлении и хранении стимуляторах
роста животных и лекарственных препаратов.
Экспорт в Казахстан мяса и мясных продуктов из стран, где
законодательно разрешено применение опасных анаболических стероидов
представляет серьезную угрозу для здоровья людей.
Один из способов решения проблемы определения остаточных количеств
ветеринарных препаратов - использование метода иммуноферментного анализа
(ИФА), который уже 10 лет используется в странах ЕС, США и Японии
и является основным скрининговым методом в этих странах. Согласно
директиве ЕС2002/657, иммуноферментный анализ является рекомендованным
скрининговым методом для определения остаточных количеств ветеринарных
препаратов в продуктах животного происхождения в странах Европейского
Союза [20]. В связи со вступлением нашей Республики в ВТО, данная
рекомендация будет обязательна для выполнения органами ветеринарносанитарной службы РК.
Как показывает зарубежный опыт, организация контроля пищевых
продуктов иммуноферментным методом возможна минимальными средствами
и в самые короткие сроки. Простота эксплуатации и незначительная стоимость
необходимого оборудования выгодно отличают иммуноферментный метод от
классических методов анализа и делают его особенно привлекательным для
лабораторий с ограниченными финансовыми возможностями.
В связи с особой важностью данной проблемы, основным направлением
наших исследований является проведение мониторинговых исследований
импортного и отечественного мяса на остаточное содержание гормонов и
разработка вариантов иммуноферментного анализа для обнаружения остатков
гормонального стимулятора эстрадиола 17 в сырье и продуктах животного
102
происхождения. Решение вопроса позволит повысить точность определения и
соответственно повысить качество и безопасность продуктов питания в
Казахстане. [9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18].
В настоящее время в Казахстане нет отечественных тест-систем,
соответствующих требованиям ВТО и позволяющих осуществлять детекцию
остаточных количеств гормонов, антибиотиков в продуктах животноводства.
Приобретение ИФА тест-систем у зарубежных производителей позволит в
лучшем случае лишь временно отодвинуть проблему, в худшем – поставит в
полную зависимость от импорта данный сектор народного хозяйства. В связи с
развитием науки, в частности молекулярной биологии, иммунохимии,
биотехнологии разработаны и приобретают все большее значение
высокочувствительные иммунологические тесты, позволяющие за короткий
период проводить детекцию материала в минимальных количествах. Метод
ИФА является одним из наиболее активно развивающихся направлений
биотехнологии, что обусловлено уникальной специфичностью в сочетании с
высокой чувствительностью ферментной метки.
Мониторинговые исследования импортного мяса проводились по
отчётным сведениям отдела безопасности пищевой продукции и перемещения
объектов Костанайской областной территориальной инспекции Комитета
ветеринарного контроля и надзора МСХ РК.
Результаты мониторинга показали, что в Костанайскую область ежегодно
на регулярной основе осуществляются оптовые поставки мясопродуктов из
Бразилии, Аргентины, США, Канады, Австралии, стран Европы (Польша,
Литва), Беларуси, Украины и России вследующем ассортименте: конина,
говядина, свинина, мясо птицы (индейка, куриные окорочка), мясные
субпродукты, шпики. В среднем по области с 2008 по 2013 годы удельный вес
импорта мяса в общем объеме потребления составил в среднем 47,9%.
Основная часть потребления импортного мяса приходится на мясо птицы –
куриные окорочка.Крупнейшим поставщикоммяса птицы на костанайский
рынок являются США (штаты Сан-Пауло, Миссисипи, Джорджия, Алабама,
Луизиана, Арканзас, Северная Каролина, Мериленд) [84, 143].
Результаты исследований по импортной продукции свидетельствуют о
том, что проблема поступления в нашу страну мяса с повышенным
содержанием гормональных стимуляторов роста существует. Всего за период с
2012 по 2013 год было исследовано 183 пробы импортного мяса, в том числе 87
проб мяса говядины, 56- мясо птицы, 20 проб свинины и 20 проб конины.
Остатки гормональных препаратов тестостерона и эстрадиола обнаружены в
59-ти пробах мяса, из них 38 проб говядины, 3 пробы свинины и 18 куриного
мяса. Происхождение загрязненного мяса говядины из Бразилии, Канады и
США, куриные окорочка и свинина из США. Значительная доля загрязненного
мяса 62,7% приходится на производителей США. Превышение максимально
допустимого уровня в исследуемых образцах мясасоставило: тестостерона от
1,0 до 2,7 раза, эстрадиолаот 1,6 до 39,8 раза. Полученные результаты
103
свидетельствуют о широком применении данных гормональных препаратов в
животноводстве и птицеводстве США, Канады, Бразилии.
Исследования мяса отечественного происхождения 132-х проб показали,
что остаточное количество гормональных стимуляторов не превышало
максимально допустимых уровней. Это свидетельствует о том, что
Костанайские производители данные стимуляторы при откорме птицы и скота
не применяют. Однако полностью исключить применение гормональных
стимуляторов роста в настоящее время нельзя, поскольку достаточно широкое
распространение получают различные кормовые добавки, в том числе
импортного происхождения, в составе которых могут быть и гормональные
стимуляторы.
Исследования по разработке реагентов для детекции эстрадиола-17β в
животноводческой продукции проводились в лабораториях Иннованного
научно-образовательного центра КГУ имени А. Байтурсынова и Научноисследовательского института биотехнологии КАТУ имени С. Сейфуллина.
На первом этапе разработки тест-системы иммуноферментного анализа
отрабатывали способы синтеза конъюгатных препаратов обладающих
иммуногенными свойствами. Было проведено 5 серий опытов по
конъюгированию различных носителей с молекулярной массой, позволяющей
получать иммунный ответ при введении лабораторным животным. Способы
конъюгирования были основаны на методе активированных эфиров. Для
конъюгации использовали лиофилизат эстрадиола Sigma-Aidrich (Китай) с
97,8% очистки. В качестве высокомолекулярных белков-носителей для
конъюгации с молекулами гаптена-эстрадиола были использованы бычий
сывороточный альбумин (БСА) с молекулярной массой 66 кД (IgG-Free,
Protease-Free Bovine Serum Albumin) производства «Jackson Immuno Research»,
овальбумин (ОВА) с молекулярной массой 45кД, коллоидное золото(~0.01%
HAuCl4~1A520 ед/мл, монодисперсный, размер частиц 20 нм, фирма Sigma,
США). В качестве сшивающих агентов использовали следующие химические
соединения: хлористоводородный 1–этил 3 (3-диметиламинопропил),
карбодиимид (EDC) и глутаровый альдегид (Sigma-Aidrich, США). Эти
вещества активируют химические связи препаратов и происходит их
соединение.
Исходя
из
принципа
конструирования
высококачественных
диагностических препаратов, нами была изучена эффективность применения
для иммунизации кроликов полученных антигенов-конъюгатных препаратов.
Для выяснения их иммуногенных свойств была проведена иммунизация
кроликов по четырём схемам. Опытным животным инъецировали,
изготовленные по различной методике иммунологические конъюгаты
эстрадиола 17β с различными носителями.
Иммунизация - самый творческий этап в процессе получения
поликлональных антител, именно эффективностью иммунизации определяется
в наибольшей степени конечный результат. Выбор схемы иммунизации и
использование
различных
приемов,
повышающих
эффективность
104
иммунизации, целиком зависят от свойств конкретного антигена. Под этим
подразумеваюттакие факторы, как физико-химическое состояние антигена,
дозы, способы, интервалы и кратность введения антигена, общую
продолжительность цикла иммунизации, применение адъювантов и
иммуномодуляторов [83, 86, 87, 167, 199]. Конечная же цель, может быть
достигнута различными путями, но в любом случае, схема иммунизации,
предлагаемая для производства, должна соответствовать определенным
требованиям, главное из которых – возможность получения сывороток с
достаточно высоким титром специфических антител за сравнительно короткий
промежуток времени приминимальном расходовании антигенного и другого
материала [16, 82, 170].
Для проверки специфичности иммунной сыворотки проводили
иммуноферментный анализ, а для определения стабильности специфичности
проводили реакцию иммунодиффузии против использованного антигена по
классической схеме.
В результате тестирования полученных сывороток крови в ИФА и РИД
было определено, что все препараты конъюгатов обладают свойством вызывать
иммунный ответ. Из препаратов, использованных в качестве антигена для
иммунизации, наилучшие показатели были в случае использования конъюгата
ЭСТ-БСА, полученного по методу №2, с использованием в качестве
сшивающего агента хлористоводородного 1-этил 3(3-диметиламинопропил)
карбодиимида (EDC). Титры антител, специфичных непосредственно к
антигенным детерминантам эстрадиола-17βс БСА были довольно высокими и
находились в пределах 1:3200 - 1:12800 в ИФА и в РИД 1:2 - :4. После
процедуры очистки от носителей и балластных антител – титр специфических
антител оставался достаточно высоким и составлял в ИФА 1:6400, а в РИД 1:2.
Анализ результатов тестирования сывороток дал возможность определить
эффективность использованных схем иммунизации. В результате тестирования
было определено, что все использованные схемы иммунизации обеспечивают
достаточный уровень выработки специфических антител против испытуемых
антигенов. Однако, наиболее высокие уровни специфических антител в ИФА
1:12800, в РИД 1:4 выявлены в сыворотках крови кроликов,
иммунизированных по схемам №1 и №4 (таблица 6), где была использована
концентрация конъюгированного антигена ЭСТ-БСА – 0,2 мг/мл. Выбор
оптимальной концентрации АГ для иммунизации - очень сложная задача. Это
связано с тем, что индивидуальные свойства антигенов сильно различаются и
доза АГ зависит не только от вида животного, которому вводят АГ, но и от
адъюванта, вместе с которым вводят АГ, способ введения и от частоты
инъекций [87]. Для получения сыворотки с высоким титром у лабораторных
животных необходимо использовать концентрации белкового АГ при введении
с адъювантом от микограмм (мкг) до миллиграмм (мг) [86]. Для кроликов
обычная доза растворимого белка, вводимого вместе с адъювантом Фрейнда,
находится в пределах от 50-1000 мкг [83]. Для каждого АГ существует
довольно широкий разброс доз, называемый «окном иммуногенности», однако
105
очень малое количество или очень большое количество антигена может вызывать подавление, толерантность или иммунные смещения в сторону клеточного
иммунитета, более чем активного гуморального ответа на введенный антиген
[82, 83, 86, 87].
Результаты сравнения двух схем с высоким титром антител показали, что
наиболее эффективной схемой иммунизацииявляется схема №4, где
использовали грунд-иммунитет с концентрацией антигена 0,1мг/мл с
последующими 4-мя инъекциями в дозе 0,2 мг/мл., и продолжительностью 35
дней. Длительность во времени (75 дней) и продолжительное использование
адьювантов в схеме №1, способствовало развитию у кроликов адьювантной
болезни. Повторный цикл иммунизации проводили через месяц по схеме №4.
Результаты данного эксперимента доказали возможность получения
иммунного ответа к эстрадиолу-17β при использовании синтезированных
конъюгатов. Далее от животных с наиболее высоким титром специфичных
антител были получены 56 проб специфических поликлональных сывороток в
среднем по 10 мл. Очистку полученных фракций поликлональных антител от
белковых носителей и балластных антител проводили путём гельфильтрации с
помощью хроматографической колонки с различными носителями. Фракцию
иммуноглобулинов G концентрировали до 1мг/мл по общему белку методом
диализа против полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000 кД (ПЭГ6000). Полученные препараты разделяли на аликвоты и хранили до
использования при - 20°С.
Иммуноферментный анализ как диагностический тест будет иметь
ценность лишь в том случае, когда в нем будут использованы специфические
иммуноглобулины, направленные против уникальных эпитопов гормонов,
характеризующиеся постоянными свойствами, т. е. имеющие моноклональное
происхождение, и доступные в неограниченном количестве.
В этой связи, хорошей возможностью решения этой проблемы явилось
использование одного из направлений биотехнологии – гибридомной техники
получения моноклональных антител (МКА). Опыт использования этих
чувствительных и высокоспецифичных тестов в диагностике вирусных и
бактериальных инфекций показал, что их внедрение в практику значительно
повышает эффективность работы.
Для получения моноклональных антител специфичных к эстрадиолу,
проводили иммунизацию линейных мышей полученными конъюгатами.
Результаты исследований показали, что все использованные антигены для
иммунизации вполне пригодны для стимулирования иммунной системы
организма подопытных животных. Титры специфических антител в сыворотке
крови мышей, иммунизированных конъюгатом ЭСТ-БСА в ИФА достигали
значений 1:6400, который и использовали в дальнейших исследованиях. Для
получения штаммов гибридом продуцирующих моноклональные антитела к
эстрадиолу проведена гибридизация иммунных спленоцитов от линейной
мыши с клетками миеломной линии X63-Ag 8.6.5.3. Гибридизацию проводили
по стандартной схеме. После гибридизации клетки культивировались на
106
селективных средах: вначале на ГТ (гипоксантин-тимидин), а затем на ГАТ
(гипоксантин - аминоптерин - тимидин). По истечению 14 суток
культивирования микроскопированием было выявлено образование 15 клонов.
Тестирование гибридом на продукцию антител начинали проводить с
того момента, когда наблюдалось незначительное пожелтение ростовой среды,
и клетки занимали более 30 % поверхности лунок. При тестировании в качестве
антигена для сенсибилизации использовали конъюгат ЭСТ-ОВА. Результаты
первичного тестирования (на 15 день) гибридных клонов в непрямом варианте
иммуноферментного анализа показали присутствие специфических антител в
культуральной жидкости 2-х штаммов гибридом 3В4 и 4F4. Антительную
активность клонов определяли с помощью ИФА на 25 день после
клонирования. Результаты показали, что только один штамм 4F4 сохранил
активность с течением времени.
Для получения гомогенных по структуре и свойствам МКА проведено
клонирование гибридомы 4F4 методом лимитирующих разведений. В результате
клонирования получено три гомогенных штамма сохранивших свои свойства и
продуцирующих МКА специфичные к антигенным детерминантам эстрадиола.
Антительную активность клеток-субклонов определяли с помощью
твердофазного ИФА на 10–14 сутки после клонирования. Титр антител
культуральной жидкости субклонов, при которых достоверно фиксировалось
связывание иммуноглобулинов в ИФА, был в диапазоне от 1:1600 до 1:3200.
Изучены
иммунохимические
и
иммунобиологические
свойства
полученных МКА. Результаты исследований показали, что характер роста
гибридом - стационарная суспензия. При посеве в матрасы гибридомы
представляют собой слабо прикрепляющиеся к подложке округлые клетки
размером с исходной миеломной клетки, цитоплазма гибридом имеет вид
тонкого ободка вокруг ядра. Полученные гибридомы хорошо растут в ростовой
среде, представляющей собой RPMI 1640 c 10% сывороткой плода коровы,
2х10-3 МL-глутамина, 1х10-3 М пирувата натрия при температуре 37С в
атмосфере с 5% СО2. При посевной дозе 1-2 млн. кл./мл клетки образовывали
монослой в среднем за 5 дней, продуктивность МКА составляла от 30 до 125
мкг/мл.
Методом вертикального электрофореза определена молекулярная масса
исследуемых МКА, которая составила 66 и 25 кД, что соответствует
общепринятым значениям показателей тяжелых и легких цепей
иммуноглобулинов.
Для наработки препаративного количества моноклональных антител в in
vitro проведено их культивирование. Для наработки МКА in vivo
иммунизировали мышей линии Balb/c, после образования у животных
асцитных опухолей брали асцитную жидкость. Полученные серии асцитной
жидкости очищали методом сульфатаммонийного высаливанияи диализа.
Концентрацию белка определяли по методу Бредфорд, она составила 4 мг/мл.
Препараты консервировали и замораживали при -70С.
107
В процессе постановки иммуноблотинга, доказана гомогенность
полученных МКА, поскольку с исходным антигеном они реагировали с
образованием одной линии.Показатели константы связывания моноклональных
антител по отношению к конъюгату эстрадиол-ОВА, составили 2,3х10-8М.
Многообразие методов гетерогенного анализа обусловлено возможностью введения ферментативной метки как в молекулу антигена, так и в молекулу антител. Кроме того, для конкретной схемы анализа определяющим
является то, какой из реагентов - антитело или антиген, находится в
иммобилизованном виде для разделения иммунохимических комплексов от
несвязавшихся компонентов [3].
При проведении исследований с использованием варианта конкурентного
иммуноферментного анализа основным компонентом, от которого зависит
качество результата является конъюгат. Он представляет собой препарат
искомого гаптена, в нашем случае - гормон эстрадиол, который метили
ферментом. В качестве фермента для метки использовали фермент пероксидаза хрена фирмы «Sigma (лиофилизированный порошок, 250-330ед/мг,
RZ-3.0, ТипVI). В качестве сшивающего агента использовали 1-ethyl-3-(3dimethylaminopropyl) - carbodiimidehydrochloride (EDC)(Sigma).
В процессе работы проводили подбор оптимальных режимов конъюгации
эстрадиола с ферментом пероксидазой хрена. Было использовано два способа
конъюгации, отличающиеся по количеству вносимого фермента, гормона и
сшивающего агента, по применению разных растворителей: фосфатно-солевого
буфера или деионизированной воды, по времени инкубации и использования
процесса диализации. В результате проведенной работы было получено по 2 мл
конъюгатов. Тестирование в прямом варианте ИФА показало, что с
использованием варианта №2, предполагающего инкубирование в течение 24
часов при комнатной температуре, можно получить препараты конъюгатов с
рабочим разведением 1:1000 (ЭСТ-ПХ), что соответствует минимальным
требованиям предъявляемым к пероксидазным конъюгатам.
Далее была проведена работа по определению оптимальных условий
постановки конкурентного варианта ИФА с использованием стандартных
растворов эстрадиола. Были использованы 2 схемы тестирования.
Первая схема предполагала постановку конкурентного варианта ИФА с
применением поли – и моноклональных антител (МКА) и конъюгатов
эстрадиола с ферментом пероксидазой хрена. Особенностью данной схемы
состояла в использовании первичных антител захвата, адсорбированных на
поверхности планшета (МКА специфичные гормону), неконъюгированных
вторичных антивидовых антител и эстрадиола, конъюгированных с
пероксидазой. Одноэтапное внесение и инкубирование основных реагентов
создает конкурентные условия, позволяющие определить концентрацию
свободного эстрадиола в исследуемой пробе. По величинам относительного
поглощения, вычисленным для стандартных растворов, и соответствующим
известным значениям концентрации эстрадиола мкг/кг (мкг/л) строили
калибровочные кривые. Однако, анализируя полученные результаты,
108
установили, что использование данной схемы постановки ИФА не позволяет в
полной мере оценить степень регистрации растворов эстрадиола с известными
концентрациями, а построенные калибровочные кривые не обладают
необходимой линейностью в основном диапазоне данных.
Вторая схема предполагала постановку конкурентного варианта ИФА с
применением моноклональных антител и антивидовых пероксидазных
конъюгатов. Сущность данной схемы основана на конкуренции свободного
эстрадиола из
измеряемой пробы и эстрадиола,
предварительно
иммобилизованного на твердой фазе в составе белкового конъюгата,
за
центры связывания специфичных антител (МКА кэстрадиолу). То есть, если
МКА связываются со свободным эстрадиолом, их реакция с
иммобилизированным эстрадиолом минимизируется. После отделения не
связавшихся реагентов
количество
антител,
прореагировавших
с
иммобилизованным антигеном, определяли с помощью антивидовых
антител, меченных ферментом. Количество выявленных специфических
антител, будет обратно пропорционально концентрации эстрадиола в растворе.
В результате проведенных исследований были определены оптимальные
параметры проведения реакции:
- концентрация антигена - конъюгат эстрадиола с овальбумином – 0,01
мг/мл;
- буфер для разведения антигена - фосфатно-солевой буфер рН-7,2;
- инкубация антигена – 12 часов при температуре 4ºС;
- буфер для разведения раствора эстрадиола - фосфатно-солевой буфер рН
7,2;
- экспозиция стандартного раствора эстрадиола и раствора специфических
антител – 2 часа при комнатной температуре в пределах 20-25°С.
После регистрации средних значений оптической плотности, по величинам
относительного поглощения, вычисленным для стандартных растворов, и
соответствующим известным значениям концентрации эстрадиола мкг/кг
(мкг/л) строили калибровочные кривые. По общепринятым требованиям
калибровочные кривые при аналогичных исследованиях должны быть почти
линейны в основном диапазоне данных. Анализируя полученные данные,
следует отметить, что необходимая линейность наблюдается на кривых,
построенных по результатам тестирования по второй схеме, предполагающей
использование неконъюгированных специфических поли – и моноклональных
антител и антивидовых коньюгатов.
Таким образом, использованная схема полностью соответствует
требованиям, предъявляемым к аналогичным иммуноферментным тестсистемам.
Эффективность метода определения остаточных количеств гормонов в
значительной мере зависит от эффективности подготовки проб для
исследования. Пробоподготовка помогает повысить точность получаемых
результатов, расширить исследуемый диапазон значений, повысить
безопасность исследования, ускорить тест, улучшить воспроизводимость и
109
погрешность результатов. Мы ставили задачу максимально упростить способ
подготовки проб для проведения анализа в произвоизводственной лаборатории.
Для выбора оптимального способа извлечения гормона эстрадиола из проб мяса
было изучено влияние различных химических веществ на мышечную ткань.
Для этого пробу мяса загрязненную эстрадиолом подвергали воздействию
различных физико-химических факторов и проводили сравнение их действия.
Учитывая, что стероиды являются неполярными соединениями и, в
большинстве случаев, вместе с ними экстрагируются липиды нестероидной
природы, поэтому для экстракции использовали смеси полярных
растворителей, например, этанол, диэтиловый эфир, ацетон, ацетонитрил и
дихлорометан. Зная, что стероиды имеют свойство сорбироваться на стекле, мы
использовали полипропиленовую посуду.
При использовании этилацетата и диэтилового эфира для экстракции
эстрадиола часто образовывалась эмульсия. Эту проблему устраняли путем
добавления гидрооксида натрия и осторожного вращения пробы, вместо его
энергичного встряхивания.
В пробы мяса искусственно вносили растворы, содержащие 50 мкг/л
активного эстрадиола. Степень извлечения эстрадиола определяли по
оптической плотности в ИФА с использованием российской тест-системы, учет
результатов проводили по интенсивности окрашивания реакционной среды т.е.
по оптической плотности с помощью спектрофотометра. В качестве контроля
тестировали пробы свободные от гормона. Реакцию ставили в трех повторах.
В результате установлено, что характер предварительной обработки
образцов мяса существенным образом оказывает влияние на степень
извлечения эстрадиола. В работе были использованы 5 способов экстракции
гормона. Наибольшее влияние наблюдается при использовании ацетонитрила с
дихлорометаном (способ №1), затем диэтилового эфира (способ №5), и ацетона
(способ №2), наименьшее - буфера Макллвейна (способ №3), самое
незначительное при экстрагировании дистиллированной водой с подогревом.
В связи со сложностью приобретения диэтилового эфира, он является
прекурсором, со сложным 5-ти компонентным составом буфера Маклвейна и
наименьшим выходом гормона, для дальнейшей работы выбран способ
экстрагирования ацетонитрила с дихлорометаном.
Исходя из полученных результатов, для тестирования в ИФА определен
оптимальный способ пробоподготовки образцов мышечной ткани:
 пробу гомогенизируют и добавляют дистиллированной воды в
соотношении 12, содержимое смешивают при помощи вортекса и
встряхивают в течение 10 минут с помощью шейкера;
 берут 3 грамма гомогената добавляют в соотношении 1:3 экстрагирующий
раствор этилацетат/дихлорометан (9мл), содержимое смешивают с
помощью вортекса и повторно перемешивают на шейкере в течение 10
мин;
 пробу центрифугируют при 5000 об/мин в течение 10 минут;
110


собирают полученный супернатант (водная фаза) и выпаривают до сухого
состояния в водяной бане при температуре 600 С;
после в выпаренную пробу вносят фосфатно-солевой буфер с рН 7,2-7,4 и
ставят на на 1минуту в вортекс;
для исследования используют 0,05 мл раствора на 1 лунку планшета.
Таким образом, определены оптимальные способы подготовки проб
мышечной ткани мяса для тестирования в ИФА с целью определения
остаточных количеств гормона.
Для определения диагностической ценности и возможности применения в
практике, проведены лабораторные испытания разработанной тест-системы для
определения эстрадиола на 330 пробах продуктов животного происхождения
(мясо, колбаса) отечественного и импортного производства. В исследуемых
пробах мяса эстрадиол был обнаружен в 37-ми пробах, что составляет не более
11,2% от общего количества исследованных проб.
Далее все позитивные пробы и некоторая часть негативных проб также
были исследованы с использованием коммерческих иммуноферментных тестсистем для определения остаточного количества эстрадиола. В качестве
сравнения были использованы тест-системы ИФА производства Российской
Федерации фирмы ООО «Медицина.Аналитика.Ветеринария.».
Постановку реакции ИФА проводили согласно инструкции по
использованию тестов. Разработанный конкурентный вариант ИФА ставили по
отработанным ранее параметрам.
Как следует из результатов исследований, разработанный вариант
конкурентного иммуноферментного анализа на основе использования
моноклональных антител к детерминантам эстрадиола, по своим основным
характеристикам: чувствительности и специфичности не уступает российскому
аналогу. Большая часть результатов, полученных при использовании
разработанного конкурентного варианта ИФА, коррелировала с сопоставимыми
показателями оптической плотности данных российских тестов.
Таким образом, на основе полученных данных по испытанию
разработанной тест-системы в сравнении с российским аналогом можно
сделать предположение о возможности ее использования для детекции
остаточных количеств эстрадиола 17β в продуктах животноводства.
С учетом опытных данных разработан лабораторный регламент
производства и применения «Тест-системы ИФА для определения остаточных
количеств эстрадиола 17β в животноводческой продукции» (Приложение Б).
В результате проведенных исследований поставленные задачи полностью
выполнены, полученные результаты достоверны, поскольку установлена
высокая степень чувствительности и специфичности разработанного теста в
сравнении с российскими аналогами.
Технико-экономическая
эффективность
внедрения
результатов
исследований складывается из возможности использования отечественной тест111
системы ИФА для достоверного обнаружения эстрадиола 17В в продуктах
животноводства.
Сравнение полученных результатов с аналогичными результатами
зарубежных работ Белоусова А.В. [126], Gwendolyn, позволяет сделать
заключение о достаточно высоком уровне разработанного теста и
сопоставимости данных.
112
3 Заключение
В результате проведенных исследований поставленные задачи полностью
выполнены, изучена степень загрязнения продукции животноводства - мяса
гормональными препаратами, отработаны способы получения конъюгатных
препаратов гормона эстрадиола 17β, обладающих антигенными свойствами.
Проведена иммунизация лабораторных животных синтезированными
конъюгатами, получены препараты специфических поликлональных антител с
высокими титрами. Результаты данного эксперимента доказали возможность
получения
иммунного
ответа
к
эстрадиолу
при
использовании
синтезированных конъюгатов. Проведено выделение из полученных сывороток
иммуноглобулинов методом сульфатаммонийного высаливания и очистка
методом хроматографии. Титры очищенных иммуноглобулинов в реакции
иммунодиффузии составили 1:2-1:4.
Для получения штаммов гибридом, продуцирующих моноклональные
антитела к эстрадиола 17β проведена гибридизация иммунных спленоцитов от
линейных мышейс клетками миеломной линии X63-Ag 8.6.5.3. Гибридизацию
проводили по стандартной схеме. В результате выполнения данного этапа было
получено 3 штамма гибридом продуцирующих МКА специфичных к
антигенным
детерминантам
эстрадиола
17β.
Изучены
основные
иммунохимические
параметры,
характеризующие
полученные
иммуноглобулины (изотип, константа связывания, специфичность, титр и др.) и
проведена наработка препаративного количества моноклональных антител.
Проведен подбор оптимальных режимов конъюгации эстрадиола с
ферментом пероксидазой хрена. В работе было апробировано два варианта
конъюгации, основанных на использовании в качестве сшивающего агента 1ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) – carbodiimide hydrochloride (EDC), но
принципиально отличающихся по времени инкубации и способу очистки. В
результате проведенной работы было получено по 2 мл конъюгатов эстрадиола17β (ЭСТ-ПХ). Тестирование в прямом варианте иммуноферментного анализа
показало, что оптимальным для конъюгации эстрадиола был вариант №2. В
результате тестирования было определено, что с использованием этого
варианта, предполагающего инкубирование в течение 24-х часов при
комнатной температуре, можно получить препараты конъюгатов с рабочим
разведением 1:1000 (ЭСТ-ПХ), что в общем соответствует минимальным
требованиям, предъявляемым к пероксидазным конъюгатам.
В результате проведенных исследований определена схема и оптимальные
условия постановки конкурентного варианта ИФА для определения эстрадиола17β. Схема основана на конкуренции свободного эстрадиола из опытной пробы
и эстрадиола, сенсибилизированного на твердой фазе в составе белкового
конъюгата, за центры связывания специфичных к эстрадиолу антител, с
последующим их выявлением с помощью антивидовых антител, меченых
ферментом.
113
Определены оптимальные способы подготовки образцов мышечной ткани
мяса для тестирования в ИФА с целью определения остаточных количеств
эстрадиола. Для дальнейшей работы выбран способ экстрагирования
ацетонитрила с дихлорометаном.
Для определения диагностической ценности и возможности применения в
практике, проведены лабораторные испытания разработанной тест-системы на
330 пробах продуктов животного происхождения (колбаса, мясо) в сравнении с
российскими аналогами. Как следует из результатов исследований,
разработанный вариант конкурентного иммуноферментного анализа на основе
использования моноклональных антител к детерминантам эстрадиола, по своим
основным характеристикам (чувствительность и специфичность) не уступает
российскому аналогу. Большая часть результатов, полученных при
использовании предлагаемого теста, коррелировала с показаниями российских
тестов, что позволяет сделать предположение о возможности ее использования
для детекции эстрадиола в продуктах животноводства.
С учетом опытных данных разработан лабораторный регламент
производства и применения «Тест-системы ИФА для определения остаточных
количеств эстрадиола в животноводческой продукции».
По результатам исследований на 1 изобретение в РГП НИИС
зарегистрирована заявка на получение инновационных патентов «Способ
получения поликлональных антител к эстрадиолу» (Приложение Д):
Решение поставленных задач позволило определить схему и оптимальные
условия постановки конкурентного варианта ИФА для обнаружения эстрадиола
17β и разработать лабораторный регламент производства и применения «Тестсистемы ИФА для определения остаточных количеств эстрадиола 17β в
животноводческой продукции».
Для использования результатов НИР в практике ветеринарии, после
проведения требуемой процедуры лабораторных и производственных
испытаний, необходимо внедрение разработанных технологий и тест-систем в
систему ветеринарно-санитарного контроля.
Технико-экономическая эффективность внедрения складывается из
разработки
доступной
и
эффективной
технологии
создания
импортозамещающих препаратов с высокой диагностической ценностью, что
позволит существенно повысить эффективность существующих исследований и
обеспечить население страны экологически чистыми продуктами питания.
Таким образом, результаты исследований позволили сделать следующие
выводы:
1 Установлено, что из 183-х анализируемых проб мяса (говядины, кур,
свинины) импортного происхождения повышенное содержание
гормонов выявлено в 59 образцах - 32,2%. Превышение МДУ
тестостерона обнаружено в 32-х пробах мяса, что составляет 17,5%,
эстрадиола-17β в 27-ми пробах, что составило 14,8%. Величина
превышения тестостерона составляла 1,0-2,7 раза, эстрадиола-17β в 10,2
114
- 44,0 раза. В мясе отечественного происхождения остаточное
количество гормональных стимуляторов не превышало максимально
допустимых уровней.
2 Усовершенствована методика получения специфических реагентов,
пригодных для детекции остаточных количеств эстрадиола 17β в
иммунологических реакциях:
- созданы конъюгаты гормона Estradiol-17β с бычьим сывороточным
альбумином (ЭСТ-БСА), и Estradiol-17β с ферментом пероксидазой
хрена (ЭСТ-ПХ).
- получены специфичные антитела к эстрадиолу в количестве 150 мл. с
рабочим титром антител в ИФА 1:6400 – 1:12800 с титрами очищенных
иммуноглобулинов в реакции иммунной диффузии 1:2-1:4.
- получены три гомогенных штамма продуцентов моноклональных антител
4F4А7, 4F4G8, 4F4D9, специфичных к антигенным детерминантам
эстрадиола 17β. Полученные иммуноглобулины относятся к классу G,
подклассу G3. Константа связывания (степень аффинитета) к антигенам
гормона эстрадиола, равна 1,9х10-9М, 2,6х10-9М, и 2,2х10-9М,
соответственно.
3 Определены оптимальные параметры проведения ИФА для детекции
эстрадиола:
- концентрация конъюгата эстрадиола с овальбумином – 0,01 мг/мл;
- буфер для разведения антигена - фосфатно - солевой буфер рН-7,2;
- инкубация антигена – 12 часов при температуре 4ºС;
- буфер для разведения раствора эстрадиола - ФСБ с рН 7,2;
- экспозиция стандартного раствора эстрадиола и раствора
специфических антител – 2 часа при комнатной температуре в пределах
20-25°С.
4 Подобраны системы растворителей для эффективного извлечения
эстрадиола 17β из биологических образцов с учетом физикохимических свойств молекулы гормона, который заключается в
следующем:
- гомогенизация пробы, добавление дистиллированной воды в
соотношении 12, смешивание при помощи вортекса;
- встряхивание в течение 10 минут на шейкере;
- добавление в пробу ацетонитрила с дихлорометаном в соотношении 13
(3 г гомогената и 9 мл экстракта) и встряхивание в течение 10 минут на
шейкере;
- центрифугирование пробы при 5000 об/мин. в течение 10 минут;
- сливание прозрачной экстрагированной фазы в чистые пробирки;
- выпаривание на водяной бане с температурой воды 60°С досуха;
- растворение высушенной пробы ФСБ 0,15М с рН среды 7,2-7,4;
115
- полученную пробу используют для исследования - 0,05 мл раствора на 1
лунку планшета ИФА.
5 Разработан лабораторный регламент производства и применения «Тестсистемы ИФА для определения остаточных количеств эстрадиола-17β в
животноводческой продукции».
Практические предложения
Результаты исследований: синтезированные конъюгаты эстрадиола с БСА,
разработанные схемы иммунизации кроликов, мышей линии Balbc,
разработанные «Тест-система ИФА для определения остаточных количеств
эстрадиола 17β в животноводческой продукции», конкурентный вариант ИФА
могут быть рекомендованы для использования в практике производства и
применения тест-систем.
116
Список использованных источников
1 Мозгов, И.Е. Фармакологические основы применения лекарственных
веществ для повышения продуктивности животных // Фармакологические
основы использования лекарственных веществ в животноводстве: Сб. науч. тр. /
Моск. Вет. акад. М., 1974. - Т. 74. - С. 3-29.
2 Комаров А.А., Вылегжанина Е.С., Нестеренко И.С., Беловодский Л.В.,
Жуков А.В. Определение остаточного содержания лекарственных препаратов в
продукции животноводства. Журнал Ветеринария №11, 2009.
3 Гаврилов В.Б., Еремин С.А., Егоров А.М. Антибиотики и химиотерапия
1992; 9: 36-39.
4 Lin, Y.C., Kulp, S.K., Sugimoto, Y. and Brueggemeier, R.W. 2000.
Potential risk of growth promoter in beef for breast cancer growth. Era of Hope,
Department of Defence Breast Cancer Research Program Meeting Proceedings 2000
II: 480.
5 Henricks, D.M., Gray, S.L., Owenby, J.J. and Lackey, B.R. 2001. Residues
from anabolic preparations after good veterinary practice. APMIS 109 (103): S345-5.
6 Островская А.В., Содержание гормональных стимуляторов роста в
мясе и усовершенствование метода их определения// Дисс.; 2004г. Москва.97с.
7 Мысик, А.Т. Животноводство стран мира / А.Т. Мысик // Зоотехния. 2005. -№1.- С. 2-7.
8 S. N. Al-Dobaib and H. M. Mousa. / Department of Animal Production and
Breeding, / Benefits and risks of growth promoters in animal production / Journal of
Food, Agriculture & Environment Vol.7 (2) : 202-208. 2009
9 Рожков, О. А. Ветеринарно-санитарная безопасность пищевых
продуктов на предприятиях торговли и общественного питания / О.А. Рожков,
Ю.В. Русаков // Методические рекомендации. — 2006. — 251 с.
10 Балджи Ю.А., Майканов Б.С., Жанабаева Д.К., Ветеринарносанитарная экспертиза продуктов животноводства при контаминации
посторонними веществами., 2009
11 Европейская комиссия XXIV/B3/SC4. Генеральный директорат
12 Потребительской политики и защиты прав потребителей Управление
здоровья B. Б3 - Управление научных комитетов II – Мнение научного
комитета «Оценка потенциальных рисков для здоровья человека остатков
гормонов в мясе и мясопродуктах» 30 апреля 1999. – с. 217.
13 Доклад Научного комитета Европейской комиссии по защите прав и
здоровья потребителей от 30.04.1999. – с. 135.
14 BRC Global Standard for Food Safety – международный стандарт для
пищевой промышленности 01января 2008 года.- c.163.
15 Житенко, П.В. Ветеринарно-санитарная экспертиза продуктов
животноводства : Справочник / П.В. Житенко, М.Ф. Боровков ; М. : Колос,
2000.-335с.
117
16 Баркатина Е. Н., Мурох В. И., Коломиец Н. Д., Шуляковская О.В.,
Методы анализа остаточных количеств гормонов в продуктах животноводства.
Хранение и переработка сельхозсырья. 2001, с.7.
17 Ибрагимов П.Ш., Рыщанова Р.М., Чужебаева Г.Д., Коканов С.К.,
Ветеринарно-санитарный контроль остаточных количеств гормональных
стимуляторов роста в продуктах животного происхождения. // журнал «3i
Интеллект, идея, инновация», КГУ им.А.Байтурсынова, №4 - 2011г.
18 Федеральное государственное бюджетное учреждение всероссийский
государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для
животных и кормов ФГБУ «ВГНКИ». Центр всемирной организации
здравоохранения животных по пищевой безопасности, диагностике и борьбе с
болезнями животных для стран восточной Европы, Центральной Азии и
Закавказья. «Организация работы ветеринарных лабораторий и активного
мониторинга» Совещание Россельхознадзора 27 июня 2013 г.
19 Директива EU 2002/657COMMISSION DECISIONof 12 August 2002.
Стандарты для тестирования остаточных количеств определенных веществ в
продуктах животного происхождения ввозимых из третьих стран.
20 Директива 2003/74/EC Европейского Парламента и Совета от 22
сентября 2003 «О запрете на использование в животноводстве определенных
веществ, имеющих гормональное или тиреостатическое действие и бетаагонистов».
21 Fara G.M. Epidemic of breast enlargement in an Italian school / Fara G.M.,
Del Corvo G., Bernuzzi S., Bigatello A., Di Pietro C, Scaglioni S., Chiumello G. //
Lancet. 1979. V. 11. P.295-297
22 Joffe M. Accidental gynecomastia in children- Discussion / Joffe M.,
Chiumello G., Thonneau P. et al.// APMIS. - 2001. - V.I09. - P. S207-S209
23 Loizzo A. Italian baby food containing diethylstilboestrol three years later/
Loizzo A., Gatti G.L., Macri A., Moretti G., Ortolani E., Palazzesi S. // Lancet. 1984.-V.5.-P.1014-1015
24 Pasquino A.M. Transient pseudo-precocious puberty by probable oestrogen
in take in 3 girls/ Pasquino A.M., Balducci R., Manca Bitti M.L., Spadoni G.L.,
Boscherini B. // Archiv Dis. Child. 1982. V.57. P.954-956
25 Perez-Comas A. Premature sexual development in Puerto Rico/ PerezComas A. // Boletin Asociacion Medica de Puerto Rico. - 1988. - V.80. - P.85-90.
26 Комаров А.А., д.б.н. - Система обеспечения безопасности продукции
животноводства при использовании анаболических стероидов, производных
стильбена и β-адреностимуляторов// Дисс.; 2006г. Москва.- 452с.
27 Berstein, L.M., Imyanitov, E.N., Gamajunova, V.B., Kovalevskij, A.J.,
Kuligina, E.Sh., Buslov, K.G., Karpova, M.B., Togo, A.V., Volkov, O.N. and
Kovalenko, I.G. 2002. CYP17 genetic polymorphism in endometrial cancer: are only
steroids involved. Cancer Lett 180(1): 47-53.
28 Berrino, F., Pasanisi, P., Bellati, C., Venturelli, E., Krogh, V., Mastroianni,
A., Berselli, E., Muti, P. and Secreto, G. 2005. Serum testosterone levels and breast
cancer recurrence. Int J Cancer 113(3): 499-502.
118
29 Cauley, J.A., Lucas, F.L., Kuller, L.H., Stone, K., Browner, W. and
Cummings, S.R. 1999. Elevated serum oestradiol and testosterone concentrations are
associated with a high risk for breast cancer. Study of Osteoporotic Fractures
Research Group. Ann Intern Med 130(4 Pt 1):270-7.
30 Cho, E., Chen, W.Y., Hunter, D.J., Stampfer, M.J., Colditz, G.A.,
Hankinson, S.E. and Willett, W.C. 2006. Red meat intake and risk of breast cancer
among premenopausal women. Arch Intern Med 166: 2253-9.
31 Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых
продуктов. СанПиН 2.3.2.1078–01 (Санитарно-эпидемиологические правила и
нормативы). – М.: ИНФРА – М, 2002. – 216 с.
32 Решение Совета Евразийской экономической комиссии от 9 октября
2013 года № 68. Технический регламент Таможенного союза «О безопасности
мяса и мясной продукции» (ТР ТС 034/2013).
33 Закон РК «О безопасности пищевой продукции» 21.07.2007г. № 301-III
ЗРК.
34 Galbraith, H. 2002. Hormones in international meat production: biological,
sociological and consumer issues. Nutrition Research Reviews 15: 243-314. Johnson,
A.C., Williams, R.J. and Matthiessen, P. 2005. The potential steroid hormone
contribution of farm animals to freshwaters, the United Kingdom as a case study. Sci
Total Environ 362(1-3): 166-78.
35 Le Bizec, B., Marchand, P., Maume, D., Monteau, F., Bichon, E. and André,
F. 2004. Monitoring anabolic steroids in meat-producing animals. Review of current
hyphenated mass spectrometric techniques. Chromatographia 59: S3-S11.
36 Leffers, H., Naesby, M., Vendelbo, B., Skakkebaek, N.E. and Jorgensen, M.
2001.Oestrogenic potencies of zeranol, oestradiol, diethylstilboestrol, bisphenol-A
and genistein: implications for exposure assessment of potential endocrine disrupters.
37 Hum Reprod 16: 1037-45. Le Guevel, R. and Pakdel, F. 2001. Assessment
of oestrogenic potency of chemicals used as growth promoter by in-vitro methods.
Human Reprod 16: 1030-6.
38 Марголина А., Прощание с пасторалью, или высокая цена дешевого
мяса //Наука и жизнь №3 2009. Журнал с. 76-80
39 Донченко Л.В., Надыкта В.Д. Безопасность пищевой продукции. – М.:
Пищепромиздат, 2001. – 525 с.
40 Комиссаренко В. П., Минченко А. Г., Тронько Н. Д., Молекулярные
механизмы действия стероидных гормонов, К., 1986.
41 Ковганко Н.В., Ахрем А. А., Стероиды (экологические функции),
Минск, 1990;
42 Камерницкий А. В., Левина И. С., "Химико-фармацевтический
журнал", 1991, № 10, с. 4-16;
43 Steroid Hormones: a practical approach, ed. by В. Green, R. E. Leake, Oxf.,
1987;
44 Субботин В.М., Александров И.Д. - Ветеринарная фармакология.
Москва «КолосС» 2004. – 720с.
45 Жуленко В.Н., Рабионович М.И., Таланов Г.А. – Ветеринарная
119
токсикология // М.: Колос, 2002. - 384с.
46 Рабинович М.И., Ноздрин Г.А., Самородова И.М., Ноздрин А.Г. Общая фармакология. Санкт-петербург. Москва. Краснодар.2006г.
47 Племенков В.В. Введение в химию природных соединений. 2001 г.
Москва. 376 стр.,
48 Алексашин Ю.В., Куцемако Р.Т., Куляш Ю.В. Лекции по
биоорганической химии.134 стр., 2001 г.
49 Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия.3-е изд., 479 стр.,
2000г.
50 Поллов
К.
Введение
в
репродуктивную
эндокринологию.
Биохимические и физиологические аспекты, основы диагностики. М., 2000. - 72
с.
51 Кольман Я. Наглядная биохимия / Кольман Я., Рём К.-Г. - М.: Мир.,
2000. -366 с.
52 Розен В.Б. Основы эндокринологии / Розен В.Б.; Под ред. Смирновой
О.В. Издательство Московского Унверститета, 1994. - 115 с.
53 Hormones and the Fetus, ed. by J. R. Pasqualini, F.A. Kind, v. 1-2, N. Y,
1986-1988;
54 Kamernitzky A. V., в кн.: Frontier of bioorganic chemistry and molecular
biology, N.Y.-[a.o.], 1980, p. 261-63; Zeelen F. I., Medicinal chemistry of steroids,
Elsevier, 1990.
55 Комов, В.П.. Биохимия / В.П.Комов, В.Н. Шведова. В.П. Комов, В.Н.
Шведова. М.: Дрофа, 2006. – 639 с.
56 Филлипович, Ю.Б. Основы биохимии Ю.Б.Филипович. – М.: Мир,
2000. – 640 с.
57 Yamamoto I. Enzyme immunoassay for clenbuterol, a p2-adrenergic
stimulant/ Yamamoto I. and Iwata K.// Journal of Immunoassay. 1982. - V.3. - P.
155-171;
58 Sporano V., Grasso L., Esposito M., Oliviero G., Brambilla G., and Loizzo
A.Clenbuterol residues in non-liver containing meat as a cause of collective food
poisoning / Veterinary and Human Toxicology. 1998. - V.40. -P.141-143;
59 Рогов И.А., Антипова, Н.И. Дунченко Химия пищи : учебник и учеб.
пособия для студентов высш. учеб. заведений / под ред. И.С. Беленькая. М.:
Колос С, 2007. - 853 с.
60 Берштейн Л.М. Гормональный канцерогенез. - СПб.: Наука, 2000.
61 Глушков А.Н. "Общебиологические закономерности и механизмы
канцерогенеза". Медицина в Кузбассе. 2004, ? 1, стр. 3-9.
62 Bradlow H I. Nutrient modulation of female hormone metabolism:
Modifying breast cancer risk. In: Functional Medicine Approaches to Endocrine
Disturbances of Aging. Vancouver, British Columbia: Institute of Functional
Medicine Proceedings; 2001.
63 Klug I., Dressendorfer R., Strasburger С et al. Cortisol and 17hydroxyprogesterone levels in saliva of healthy neonates: normative data and relation
120
to body mass index, arterial cord blood pH and time of sampling after birth. Biol.
Neonate, 2000, 78, 22-26.
64 Lord R.S., Bongiovanni В., Bralley J.A. Estrogen metabolism and the dietcancer connection: rationale for assessing the ratio of urinary hydroxylated estrogen
metabolites. Altern Med Rev., 2002, 7,12-29.
65 Meng Q., Yuan F., Goldberg I.D. et al. lndole-3-carbinol is a negative
regulator of estrogen receptor-alpha signaling in human tumor cells. J. Nutr., 2000,
130,2927-2931.
66 Muti P., Bradlow H I . , Micheli A. et al. Estrogen metabolism and risk of
breast cancer: a prospective study of the 2:16alpha-hydroxyestrone ratio in
premenopausal and postmenopausal women. Epidemiology, 2000, 11, 635-640.
67 Terry P., Wolk A., Persson I., Magnusson C. Brassica vegetables and breast
cancer risk. JAMA, 2001, 285, 2975-2977.
68 Злокачественные новообразования в России в 2002 году
(заболеваемость и смертность), Под ред. В.И.Чиссова, В.В.Старинского, Ш.В
Петровой.
69 Creasman W.T., Endometrial carcinoma, Medicine Journal, 2001, vol. 27.
70 Fuller A., Seiden M., Young R., Uterine cancer, 2004, London
71 Benoit E. Gas chromatographic/mass spectrometric analysis of 19nortestosterone urinary metabolites in cattle/ Benoit E., Guyot J.L., Courtot D. and
Delatour P. Ann. Rech. Vet. 1989. V.20. P.485-491.
72 J Agric Food Chem. 2007 Oct 17;55(21):8325-30. Epub 2007 Sep 24.
Determination of anabolic steroids in muscle tissue by liquid chromatography-tandem
mass spectrometry. Veterinary Laboratory of Serres, Terma Omonoias, 62110Serres,
Greece.
73 Mitchell G.A. Illegal use of |3-adrenergic agonists in the United States/
Mitchell G.A. and DunnavanG.ll Journal of Animal Science. 1998. V.76. P.208211.
74 Miyazaki T., Hashimoto Т., Sasamoto T. and Kokubo Y. Simultaneous
determination of anabolic agents in beef by highperformance liquid chromatography
with photodiode array detection/ In: Proceedings of the EuroResidue III Conference
on Residues of Veterinary Drugs in Food (by ed. N. Haagsma and A. Ruiter).
Veldhoven, The Netherlands. 1996. P.705-709.
75 Bergink E.W. Metabolism and receptor binding of nandrolone and
testosterone under in itro and in vivo conditions/ Bergink E.W., Geelen J.A.A. and
Tuфijn E.W. Acta Endocrinologica.
76 Ашрафян Л.А., В.И. Киселев. Опухоли репродуктивных органов
(этиология и патогенез) монография 2010 г. Метаболиты эстрадиола и
патологические процессы в репродуктивной системе.
77 Григорьева Р.З. Безопасность продовольственного сырья и продуктов
питания: Учебное пособие. – Кемеровский технологический институт пищевой
промышленности. – Кемерово, 2004. – 86 с.
78 Watson R.A.A., London J., Shaw E.G., Smith D.S. Clin Chim Acta 1976;
73: 51-55.
79 Jolley M.E., Stroupe S.D., Schwenger R.S. Clin Chem 1981; 27: 1190-1197.
121
80 Brown S.A., Newkirk D.R., Hunter R.P. et al. J Assoc Off Anal Chem
1990; 73: 3: 479-483.
81 Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М.
Теория и
практика иммуноферментного анализа / - М.: Высшая школа, 1991. 251 с.
82 Бутенко Р.Г. и др. Клеточная инженерия.серия Биотехнология №3/ М.:
«Высшая школа», 2001.
83 Ковалев И.Е., Полевая О.Ю. Биохимические основы иммунитета к
низкомолекулярным соединениям. М 1985.
84 Ибрагимов П.Ш., Рыщанова Р.М., Чужебаева Г.Д., Коканов С.К.,
Мониторинг остаточных количеств гормональных стимуляторов роста в мясе
отечественного и импортного происхождения. КазНАУ, г.Алматы, журнал
«Ізденістер, нәтижелер, Исследования, результаты», № 2-2013 г.
85 Д.Кэтти Антитела. Методы. М., Мир, 1991.
86 А. Ройт, Дж. Брюсстофф, Д. Мейл. Иммунология- М.: Мир, 2000 —
ISBN 5-03-003362-9 Иммунология в 3 томах / Под. ред. У. Пола.- М.:Мир, 1988
87 Goding J. Antibody production by hybridoma //J. Immunol. Meth. – 2009.
- Vol. 39, № 1. - P. 285-308.
88 Ouchterlony O. Diffusion – in gel methods for immunological analysis//
Prog. Allergy. – 1958. – V. 5. – P. 1-78.
89 Панин А.Н., Комаров А.А. Проблемы аналитического контроля
безопасности кормов и продукции животноводства. Химия в ветеринарии.
Рос.хим.ж., №3 2005.
90 Вербов В. Н. Принципы твердофазного анализа. // Твердофазный
иммуноферментный анализ. Труды института имени Пастера, том 64, 1998. С 327. г. Санкт-Петербург, НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера
91 Покровский В.И., Романенко Г.А., Княжев В.А. и др. / Политика
здорового питания. Федеральный и региональный уровни / Новосибирск: Сиб.
унив. изд–во, 2002. – 344 с.
92 Позняковский В.М. Гигиенические основы питания, безопасность и
экспертиза продовольственных товаров. – 2-е изд. перераб. – Новосибирск:
Изд-во Новосиб. ун–та, 1999. – 448 с.
93 Позняковский В.М. Гигиенические основы питания, безопасность и
экспертиза продовольственных товаров. – 3-е изд. испр. и доп. – Новосибирск:
Изд-во Новосиб. ун–та, 2002. – 556 с.
94 Нечаев А.П., Траубенберг С.Е., Кочеткова А.А. и др. /Пищевая химия
/ СПб.: ГИОРД, 2001. – 592 с.
95 Нечаев А.П, Кочеткова А.А., Зайцев А.Н. Пищевые добавки. – М.:
Колос, 2001. – 256 с.
96 Робертс Г.Р., Март Э.Х., Сталтс В.Дж. и др./Безвредность пищевых
продуктов / – М.: Агропромиздат, 1986. – 287 с.
97 Росивал Л., Энгст Р., Соколай А. Посторонние вещества и пищевые
добавки в продуктах. – М.: Легкая и пищевая промышленность, 1982.- 264 с.
122
98 Донченко Л.В., Надыкта В.Д. Безопасность пищевой продукции. – М.:
Пищепромиздат, 2001. – 525 с.
99 Федеральный и региональный аспекты государственной политики в
области здорового питания: Тезисы международного симпозиума. – Кемерово:
КемТИПП, 2002. – 490 с.
100 Николаева М.А., Лычников Д.С, Неверов А.Н. Идентификация и
фальсификация пищевых продуктов. – М.: Экономика, 1996.–108 с.
101 Технологические и экономические аспекты обеспечения качества
продукции и услуг в торговле и общественном питании. Материалы
всероссийского конгресса по торговле и общественному питанию. – Кемерово:
КемТИПП, 2003 – 272 с.
102 Получение рекомбинантного конъюгата пероксидазы хрена с fabфрагментом антител с использованием экспрессионной системы pichia pastoris
Колясников О.В., Григоренко В.Г., Егоров А.М. Журнал Аcta naturae Выпуск№
3 / том 3 / 2011.
103 Кельнер Р. Аналитическая химия. Проблемы и подходы: в 2-х томах /
Пер. с англ. Под ред. Р. Кельнера, Ж.-М. Мерме, М. Otto, М. Видмера. -М.:
Мир, 2004. Т.1 - 608; Т.2. - 728 с.
104 Золотов Ю.А. Аналитическая химия: фрагменты картины М.: ГЕОХИ,
1999.-С. 41.
105 Отто М. Современные методы аналитической химии. М.: Изд-во:
Техносфера, 2003 в двух томах; Т1 412 е., Т2 - 281 с.
106 Гольберт К.А., Вигдергауз М.С. Введение в газовую хроматографию.
М.: Химия. 1990. 344с.
107 Нолтинг Б. Новейшие методы исследования биосистем. — М.:
Техносфера, 2005.-256 с.
108 Другов Ю. С. Экологическая аналитическая химия. СПб: Анатолия,
2000.-432 с.
109 Рудаков О.Б. Спутник хроматографиста. Методы жидкостиой
хроматографии / О.Б. Рудаков, И:А. Востров, С.В; Федоров и др. Издательство:
«Водолей», Воронеж, 528 с.
110 Басова E.M. Мицсллярная жидкостная хроматография / E.M. Басова,
B.M. Иванов, О.А. Шнигун // Успехи химии. 1999. - Т.6.-С., 1083.
111 Di Corcia A., Fritz D., Brunér F. Use of graphitized carbon black for linear
gasliquid-solid chromatography of polar low-boiling compounds. // Anal. Chem.
1970. V.42. №13. P.1500-1504.
112 Kiselev A.V., Markosyan D.L. Chromatographic determination and
molecular-statistical calculation of retention volumes of oxygen-containing organic
substances on graphitized thermal carbon black. // Chromatographia. 1983. V.17.
№10. P.526-532.
113 Качество жизни в Казахстане: безопасность питания. Клуб Института
политических решений (КИПР) заседание. Информация пресс-службы
Института политических решений. 2013
123
114 Курмангалиева Д.Б. ЖГУ им.И.Жансугурова, Безопасность как
основной принцип формирования качества пищевых продуктов.
г.Талдыкорган, 2013.
115 Николаева М.А. Товароведение потребительских товаров: М.: Инфра,
2003.- С. 224.
116 Николаева
М.А.
Товароведение
потребительских
товаров.
Теоретические основы. М.: НОРМА, 2000.- 278 с.
117 Безвредность пищевых продуктов / под ред. Г.Р.Робертса, - пер. с
англ.- М.: Агропромиздат, 1986. - С. 287.
118 Поздняковский В.М. Гигиенические основы питания, качество и
безопасность пищевых продуктов. Учебник. Новосибирск, 2005. - С 520.
119 Спиркин А.Г. Философия: Учебник. 2-е изд. М.: Гардарика, 2002. С.300.
120 Мазур И.И., Шапиро Д.В. Управление качеством: Учеб. пособие. М.:
Высшая школа, 2003. - С. 18-29.
121 Николаева М.А. Товароведение потребительских товаров: М.: Инфра,
2003.- С. 224.
122 Николаева
М.А.
Товароведение
потребительских
товаров.
Теоретические основы. М.: НОРМА, 2000.- 278 с.
123 Соклаков В.В. Стандарт ISO 22000:2005 «Системы менеджмента
безопасности пищевых продуктов. Требования к любым организациям в
продуктовой цепи» // От качества управления к качеству жизни – Сочи, 2006. –
С. 84 - 90.
124 The new ISO 22000 Food Safety Standard. – The Global Standard,
Nov/Dec, 2005. – 34 р.
125 Международный ветеринарный кодекс, Париж, Франция, 2000.
126 Мустафина Ш.А. Анализ методов обнаружения остаточного
количества антибиотиков в пищевых продуктах. /Журнал «Ветеринария», №3/
2008 г. С.73-75.
127 Ковалев И.Е., Полевая О.Ю. Биохимические основы иммунитета к
низкомолекулярным соединениям. М 1985.
128 Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и
практика иммуноферментного анализа. М 1991.
129 Long G.L., Winefordner J.D. Anal Chem 1983; 7: 712A-724A.
130 Ke LI, Liqiang LIU, ChuanLai XU, XiaoGang CHU. Rapid Determination
of Chloramphenicol Residues in Aquaculture Tissues by Immunochromatographic
Assay. Analytical sciences november 2007, VOL. 23 1281
131 Laemmli V.K. Cleavage of structural protection during the assembly of the
head of bacteriophage T4 [Текст]. // Nature ( London). – 1970. - Vol. 27. - P. 680685.
132 Ouchterlony O. Diffusion – in gel methods for immunological analysis. //
Prog. Allergy. – 1958. - V. 5. - P. 1-78.
133 Бутенко Р.Г. и др. Клеточная инженерия. Серия Биотехнология №3 //
Москва «Высшая школа», 1987.
124
134 Oi V., Herzenberg L. Immunoglobulin – producing hybrid cell lines
//Selected methods in cellular immunology.//Ed. By. Mishell B and Shiigi. – San
Francisco, 1980. - P. 351-352.
135 Beatty J., Beatty P., Vlahos W. Measurement of monoclonal antibodi
affinity by non – copetitive immunoassay.//J. Immunol. Meth. – 1987. - Vol. 100,
№3. - P. 173-179.
136 Bradford M. A rapid and sensitive method fer the qvantitation of
microgram qvantitaties of protein utilizing the principle of protein – due binding //
Anal. Biochem. - 1976. - Vol. 72. № 4. – P. 248-254.
137 Фримель Х. В кн.: Иммунологические методы. Ред. Фримель Г.
//Москва: Медицина, 1987. - с. 89-97.
138 Goding J. Antibody production by hybridoma. //J. Immunol. Meth. – 1980.
- Vol. 39, № 1. - P. 285-308.
139 Бачинская В.М., Ветеринарно-санитарная экспертиза продуктов убоя
бройлеров при применении лития карбонататема. дисс. к. б.н., Москва, 2010
140 Указание по организации Государственного ветеринарного надзора за
содержанием гормональных стимуляторов роста и тиреостатиков в продукции
животного происхождения № 12-7-1/900 от 04.10.1999г.
141 Белоусов А.В., Разработка и изготовление набора реагентов
количественного определения эстрадиола 17В в продуктах животного
происхождения методом иммунноферментного анализа. дисс., Москва – 2002.
142 Рекомендации по постановке ИФА-анализа на тест-системах
производства ЗАО “Медико-Биологический союз”.
143 Отчеты Костанайской областной территориальной инспекции
Комитета вет. контроля и надзора МСХ РК об импортной продукции животного
происхождения 2008-2012 гг.
144 Leyssens L. Determination of p2-receptor agonists in bovine urine and liver
by gas chromatography-tandem mass spectrometry/ Leyssens L., Driessen C., Jacobs
A. et al.// Journal of Chromatography B. 1991. - V.564. - P.515-527;
145 Jiang W. Formaldehdye-mediated aggregation of proteins antigens:
comparison of untreated and formalinized model antigens/ Jiang W., Schwendeman
S.P.// Biotechnol. Biotechnol. 2000. - V.70. - P.5;
146 Parkin D.M. Cancer incidence in five continents/ Parkin D.M., Whelan
S.L., Ferlay J., Raymond L., Young J. Volume VII. IARC Scientific Publications №
143. International Agency for Research on Cancer, Lyon. – 1997;
147 Schilt R. Screening of cattle urine samples for the presence of beta-agonists
with a functional test: some preliminary results/ Schilt R., Hooijerink H., Huf F.A.,
Zuiderveld O.P., Bast A. // Analyst. 1994. - V.l 19. - P.2667-2670;
148 Workshop Beta-Agonists in Retina. 15-16 May 2000, Berlin // Organizing
laboratory: EU Reference Laboratory for Residues of Veterinary Drugs (Berlin). 2000,136p;
149 Ибрагимов П.Ш., Рыщанова Р.М., Чужебаева Г.Д., Коканов С.К.,
Опыт получения иммунных сывороток для тест-системы иммуноферментного
анализа по определению эстрадиола 17β в продуктах животного
125
происхождения. // журнал «3i Интеллект, идея, инновация», КГУ
им.А.Байтурсынова, №4 - 2011г.
150 Bouffault J.C. Anabolic activity of trenbolone acetate alone or in
association with estrogens/ Bouffault J.C., Willemart J.P. In: Anabolics in Animal
Production (by ed. Meissonnier E.). Office International des Epizootics, Paris. -1983.
- P.155-192;
151 Noble R.L. The development of prostatic adenocarcinoma in Nb rats
following prolonged sex hormone administration/ Noble R.L. // Cancer Res. 1977. V.37. - P.1929-1933.
152 Nutter L.M. An o-quinone form of estrogen produces free radicals in
human breast cancer cells: Correlation with DNA damage/ Nutter L.M., Wu Y-Y.,
Ngo E.O., Sierra E.E., Gutierrez P.L., Abul-Hajj Y.J. // Chem. Res. Toxicol. 1994. V.7. - P.23-28.
153 Шамберев Ю.Н., Иванов И.С., Кузякова Н.И. Пути применения
гормонов в животноводстве. Доклады ТСХА. 1995, №226. С.160.
154 Самуилов В.Д. Иммуноферментный анализ / Самуилов В.Д. // П.
Соросовский, М., 2000
155 Courtheyn D. Misuse of growth promoters in livestock production /
Courtheyn D., Vercammen J., Logghe M., Seghers H., De Wasch K., De Brander H.
// Analytica Chimica Acta. - 2002. - Vol. 473. - P. 71-82.
156 EEC Council Regulation 508/99/CCE // Off. J. Eur. Commission, L60 of
9-3.1999.
157 Stolker A. A.M. Analysis of corticosteroids / Stolker A. A.M., Schwillens
P.L., Ginkel L.A., Brinkman U.A.T. // J. Chromotogr. A. - 2000. - Vol. 893 №1. - P.
55-67.
158 Димитриев Д. А., Сапёрова Е. В. Половые гормоны в регуляции
деятельности сердечно-сосудистой системы : учеб. пособие / Д. А. Димитриев,–
Чебоксары : Чуваш. гос. пед. ун-т, 2009. – 128 с.
159 Official Jornal of the European Communites L221, 8-36, Commission
Decision (2002/657/EC) of 12 August 2002. Brussels, Belgium, 2002.
160 Абрамова Е.Г. Разработка биотехнологической схемы получения
флуоресцирующих иммуноглобулинов для идентификации холерных
вибрионов О139 серогруппы. дисс. канд. биол. наук : 03.00.07 Саратов, 2005
151 с.
161 Кальницкая О.И., Ветеринарно-санитарный контроль остаточных
количеств антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения. дисс.
д.вет. наук : 03.00.07 Москва, 2008, 319 с.
162 Кальницкая О.И., Петрова Е.И. Законодательное обеспечение работ в
РФ по недопущению в пищу продовольственного сырья, содержащего
ксенобиотики / Качество, стандартизация, контроль: теория и практика:
Материалы 6-ой международной научно-практической конференции. – Ялта. 2006. - С. 57-60.
163 Кальницкая О.И., Иванова Г.В. Контроль безопасности пищевых
продуктов с помощью современных методов исследования / Технология и
126
продукты здорового питания: Материалы международной научно-практической
конференции. - М., МГУПП. – 2006. -С. 28-31.
164 Кальницкая О.И., Ильина А.Г. Влияние канцерогенных веществ на
качество сельскохозяйственной продукции и здоровье человека /
Агроэкологическая безопасность в условиях техногенеза: Материалы
международного симпозиума. – Казань - 2006.- С. 41-47.
165 Кальницкая О.И. Гигиенические аспекты проблемы использования
лекарственных препаратов в животноводстве // Актуальные проблемы
инфекционной патологии и иммунологии: Материалы международной научнопрактической конференции. - М., ВИЭВ. – 2006. - С. 608-609.
166 Кальницкая О.И. Лекарственные средства как возможные
контаминанты продукции животноводства // Научные основы обеспечения
защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных
инфекционных заболеваний: Материалы международного симпозиума. Казань, ФГУ ФЦТРБ-ВНИВИ. – 2005. - С. 165-169
167 Байерман К. Определение следовых количеств органических веществ /
- М.: Мир, 1987. - 462 с.
168 Будников Г.К. Определение следовых количеств веществ как
проблема современной аналитической химии / Будников Г.К. // Химия. - 2000. 28с.
169 Егоров A.M. Теория и практика иммуноферментного анализа / Егоров
A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. - М.: Высшая школа, 1991.251 с.
170 Нго Т.Т., Ленхофф Г., Иммуноферментный анализ //. М.: Мир, 1988.173-243 с.
171 Машковский М.Д. Лекарственные средства: В 2 т. / Машковский М.Д.
- 14-е изд. - М.: ООО «Издательство Новая Волна»: Издатель С.Б. Дивов, 2001. Т.
2.-31 с.
172 Abraham G. Possible role of dexamethasone in sensitizing the betaadrenergic receptor system in vivo in calves during concomitant treatment with
clenbuterol / Abraham G., Gottschalk J., Ungemach F. // Pharmacology. - 2004. Vol. 72 №3. - P. 196-200.
173 Abraham G. Solid-phase radioimmunoassay of estradiol-17 / Abraham G. //
J Clin Endocrinol Metab. - 1969. - Vol. 29. - P. 866-870.
174 Allison A.C. Immunological adjuvants: Desirable properties and sideeffects / Allison A.C., Byars N.E. // Molec. Immunol. - 1991. - Vol. 28. - P. 297-384.
175 Altman A. Immunomodifiers in vaccines / Altman A., Dixon F.J. //
Advances in Veterinary Science and Comparative Medicine. - 1989. - Vol. 33. - P.
301343.
176 Analitical strategies for residue analysis of veterinary drugs growthpromoting agents in food-producing animals - a review / Stolker A.A.M., Brinkman
U.A.Th. // J. Chromotogr. A. - 2005. - Vol. 1067. - P. 15-53.
177 Antignac J.P. Analytical strategies for the direct mass spectrometric
analysis of steroid and corticosteroid phase II metabolites / Antignac J.P., Brosseaud
127
A., Gaudin-Hirret I., Andre F., Bizec B.L. // Steroids. - 2005. - Vol. 70 №3. - P. 205216.
178 Antignac J.P. Comparision of different liquid chromatography-mass spectrometry and gas chromatography-mass spectrometry methods for determination of
corticosteroids in biological matrices - a review / Antignac J.P., Mon- teau F.,
Negriolli J., Andre F., Bizec B.L. // Chromatographia. - 2004. - Vol. 59.-P. 13.
179 Antignac J.P. Differentiation of betamethasone and dexamethasone using
liquid chromatography/positive electrospray tandem mass spectrometry and multivariate statistical analysis / Antignac J.P., Bizec B.L., Monteau F. // J. Mass
Spectrom. - 2002. - Vol. 37. - P. 69-75.
180 Antignac
J.P. Multi-residue extraction-purification procedure for
corticosteroids in biological samples for efficient control of thier misuse in livestock
production / Antignac J.P., Bizec B.L., Monteau F., Poulain F. Andre F. //
J.Chromatogr. B. - 2001. - Vol. 757. - P. 11-19.
181 Antignac J.P. Study of natural and artificial corticosteroid phase II
metabolites in bovine urine using HPLC-MS/MS / Antignac J.P., Bizec B.L.,
Monteau F., Andre F. // Steroids. - 2002. - Vol. 67. №10. - P. 873-82.
182 Asensio C. Role of glucocorticoids in the physiopathology of excessive fat
deposition and insulin resistance / Asensio C., Muzzin P., Rohner-Jeanrenaud F. //
Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. - 2004. - Vol. 28 - P. 45-52.
183 Australian Government, Dep. Of Agric., Fisheries and Forestry
http://www.affa.gov.au/corporate_docs/publications/pdCanimalplanthealth/nrs/
international/ _pig_mrls_aug06.pdf
184 Bennett B. A comparison of commercially available adjuvants for use in research / J. Immunol. Methods // Bennett B., Check I.J., Olsen M.R., Hunter R.L.1992.-Vol. 153.-P. 31-40.
185 Bevalot F. Analitical strategies for the screening of veterinary drugs and
their residues / Bevalot F., Gaillard Y., Lhermitte M.A., Pepin G. J. // Chromatogr.
B.-2000.-Vol. 740.-P. 227.
186 Blanchflower W.J. Confirmatory assay for the determination of
tetracycline, oxytetracycline, chlortetracycline and its isomers in muscle and kidney
using liquid chromatography - mass sepectrometry / Blanchflower W.J., McCracen
R.J., Haggan A.S., Kennedy D.G. // J.Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. - 1997-Vol.
692.-P. 351-360.
187 Кононенко Т.П. Применение твердофазного конкурентного
иммуноферментного анализа для определения фумонизинов группы В /
Кононенко Г.П., Буркин A.A., Зотова Е.В., Соболева H.A. // Прикладная
биохимия и микробиология. - 1999. - Т. 35. №2. - С. 206-211.
188 Кольман Я. Наглядная биохимия / Кольман Я., Рём К.-Г. - М.: Мир., 366 с.
189 Коренман Я.И. Экстракция органических соединений / Коренман Я.И.
// Химия. - 1997. -http://www.pereplet.ru/obrazovanie/stsoros/239.html
128
190 Report for 2004 on the results of residue monitoring in food of animal
origin in the Member States // European Commission Health And Consumer
Protection
191 Derictorate-General, Annex I (SANCO/3400/2005).
http://ec.europa.eu/food/food/chemicalsafety/residues/workdoc_2004_en.pdf. 2004.
192 Report for 2005 on the results of residue monitoring in food of animal
origin in the Member States // European Commission Health And Consumer
Protection Derictorate-General, Annex I (SANCO/3635/2006. http://ec.europa.eu/)
193 Dighe K.K. A solid phase radioimmnoassay for plasma progesterone /
Dighe K.K., Hunter W.M. // Biochem. J. - 1974. - P.143,219-231.
194 Dowling P. CgFARAD - the Canadian Food Animal Residue Avoidance
Database / Dowling P., Doucet M., Fortier S., Clark C. //
www.canadianveterinarians.net /larounds.
195 Dray S. Allotype suppression / Dray S. // Ontogeny of Acquired Immunity,
A Ciba Foundation Symposium. Amsterdam: ASP, Elsevier, North Holland. - 1971.P. 87-103.
196 Edwards R.W.H. The extraction and oxidation of urinary steroids conjugate
/ Edwards R.W.H., Kellie A.E., Wade A.P. // Memoirs of the Society for Endocrinology. - 1953. - Vol. 2. - P. 53-63.
197 EEC Council Regulation 508/99/CCE // Off. J. Eur. Commission, L60 of 93.1999.
198 Eisen H.N. Variations in affinities of antibodies during the immune
response / Eisen H.N., Siskind G.W. // Biochemistry. - 1964. - Vol. 3. - P. 996-1008.
199 ELISA and ELISPOT Products Handbook and Technical Guide //
http://www.piercenet.com/files/ELISAHB 1601158ptl.pdf
200 ELISA Technical Bulletin No. 1 // http://www.corning.com/lifesciences/
technical_information/techdocs/elisal.pdf
201 ELISA Technical Bulletin No. 2 // http://www.corning.com/lifesciences/
technical_information/techdocs/elisa2.pdf
202 ELISA Technical Bulletin No. 5 // http://www.corning.com/lifesciences/
technical_information/techdocs/elisa5.pdf
203 Elliott C. Screening Methods / Elliott C. // School of Advanced Residue
Analysis in Food. http://www. saraf-educ. org. - 2003.
204 English J. The metabolism of dexamethasone in the rat - effect of
phenytoin / English J., Chakraborty J., Marks V. // J. Steroid Biochem. - 1975. - Vol.
6. - P. 65-68.
205 Engvall E. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): Quantitative
assay of immuno-globulin G / Engvall E., Perlmann P.O. // Immunochemistry. 1971.-Vol. 8.-P. 871-875.
206 Cerni L. Dexamethasone and clenbuterol detection by enzyme
immunoassay in bovine liver tissue: a new multiresidue extraction procedure / Cerni
L., Bian- cotto G., Tondolo A., Bogoni P. // Food Agr. Immun. - 1998. - Vol. 10 - P.
307-315.
129
207 Chen C.L. Use of enzyme-linked immunosorbent assay and
radioimmunoassay to determine serum and urine dexamethasone concentrations in
thoroughbreds after intravenous administration of the steroid / Chen C.L., Zhu D.,
Gillis K.D., Meleka-Boules M. // Am. J. Vet. Res. - 1996. - Vol. 57. №2 - P. 182-186.
208 Сводные данные по импорту мяса. Комитет таможенного контроля
Министерства финансов РК. 2013
209 Patent Title: Steroid hormone analysis by mass spectrometry Date:
01/06/2009 Soldin Steven J., Georgetown University, c. Washington, US
210 Ветеринарный Институт. Пулавы 46, 331-335, 2002
Управление
остаточными количествами гормонов убойных животных в Польше в 2000 – 2001
Барбара Возняк Отдел гигиены пищевых продуктов животного происхождения,
Национальный исследовательский ветеринарный институт 24-100 Пулавы,
Польша bwozniak@piwet.pulawy.pl
211 Директивы ЕЭС 89/662/ЕЕС, 90/425/ЕЕС, 93/25 7/ЕЕС 96/23/ЕС,
2002/657/ЕС, 2003/74/ЕС.
212 Ванеева Л., Цветкова Н. Иммуноферментный метод, его настоящее и
будущее.// Иммунология.,1980, №2, с. 13-19.
213 Галкин A.B., Комарова В.И, Иванова Е.А. Иммуноферментный метод
экспресс-контроля продовольственного сырья и пищевых продуктов на
содержание потенциально опасных химических соединений. Хранение и
переработка сельхозсырья. 1998, №5, с.21.
214 Качество
и
безопасность
сельскохозяйственной
пищевой
продукции/под редакцией д.б.н. А.К.Смагулова – Алматы, 2002 – 544с.
215 Материалы заседания «круглого стола» на тему «Совершенствование
законодательства о пищевой безопасности в преддверии вступления Казахстана
в ВТО», сенате парламента РК, Астана, 2011
216 Нечаев А.П. Пищевые добавки: Учеб. / А.П. Нечаев, А.А. Кочеткова,
217 А.Н. Зайцев. – М.: Колос; Колос-Пресс, 2002. – С. 15.
218 Новые методы иммуноанализа. Под редакцией У.П. Коллинза. М.
«Мир.» 1991.
219 Codex Alimentarius. V.3.Resdues of Veterinary Drugs in Foods and
Agriculture Organization the United Nations, Rome, 200
220 Goudreault G. Studies on anabolic steroids- // Analytica Chimica Acta.
2006. - Vol. 372. - P. 232-238.
221 Vranic M.L. Estimation the withdrawl period for veterinary drugs used in
food producing animals / Vranic M.L., Marangunich L., Fernandez Courel H.,
Fernandez Saurez A. // Analytica Chimica Acta. 2003. - Vol. 483. - P. 251-257.
222 Акимбаева А.К., Кухар Е.В., Сураншиев Ж.А., Акибеков О.С.
Иммунохимическая характеристика моноклональных антител, полученных к
возбудителю рубромикоза. Казахский агротехнический университет им.
С.Сейфуллина, Астана, Казахстан.
223 9-й Московский международный Конгресс по ветеринарии докл.
А.Н.Панина, ФГБУ «Всероссийский Государственный Центр качества и
стандартизации лекарственных средств для животных и кормов», 18 апр. 2011.
130
224 Инструкция утвержденная ДВ МСХ РФ №13-5-02/0141от 31.07.01.
«Наставление по применению набора для количественного определения
прогестерона
в
продуктах
животного
происхождения
методом
иммуноферментного анализа (ИФА-АГ-ПРОГ.)».
225 Инструкция утвержденная ДВ МСХ РФ №13-5-02/0138 от 31.07.01
«Наставление по применению набора для количественного определения
тестостерона
в
продуктах
животного
происхождения
методом
иммуноферментного анализа (ИФА-АГ-ТЕСТ.)».
226 Инструкция утвержденная ДВ МСХ РФ, №13-5-02/0146 от 31.07.01.
«Наставление по применению набора для количественного определения
эстрадиола-17В
в
продуктах
животного
происхождения
методом
иммуноферментного анализа (ИФА-АГ-ЭСТР.)».
227 Sang-Hee Jeong, Daejin Kang, Myung-Woon Lim, Chang Soo Kang, Ha
Jung Sung / Risk Assessment of Growth Hormones and Antimicrobial Residues in
Meat / Journal List Toxicol Research. Korean Society of Toxicology; v.26(4); 2010
Dec PMC3834504
228 J.W. Lauderdale / Beef Cattle Growth Promoting Products are Safe When /
Used as Approved — Carcinogenic Aspect October 2007
229 Оpinion of the scientific panel on contaminants in the food chain on a
Request from the european commission related to Hormone residues in bovine meat
and meat products opinion of the scientific panel on contaminants in the food chain
on a Request from the european commission related to Hormone residues in bovine
meat and meat products / The EFSA Journal (2007) 510, 1-62.
230 The Japan Food Chemical Research Foundation. Maximum Residue Limit
(MRLs) List of Agricultural Chemicals in Foods. Webpage consulted April 2007.
The EFSA Journal (2007) 510, 1 – 62
231 Akhmedkhanov, A., Zeleniuch-Jacquotte, A. and Toniolo, P. 2001. Role of
exogenous and endogenous hormones in endometrial cancer: review of the evidence
and research perspectives. Ann NY Acad Sci 943: 296-315. Aksglaede, L., Juul, A.,
Leffers, H., Skakkebaek, N.E. and Andersson, A.M. 2006. The sensitivity of the child
to sex steroids: possible impact of exogenous estrogens. Hum Reprod Update 12(4):
341-9.
232 Ankley, G.T., Jensen, K.M., Makynen, E.A., Kahl, M.D., Korte, J.J.,
Hornung, M.W., Henry, T.R., Denny, J.S., Leino, R.L., Wilson, V.S., Cardon, M.C.,
Hartig, P.C. and Gray, L.E. 2003. Effects of the androgenic growth promoter 17-betatrenbolone on fecundity and reproductive endocrinology of the fathead minnow.
Environ Toxicol Chem 22(6): 1350-60.
233 Balizs, G. and Hewitt, A. 2003. Determination of veterinary drugs residues
by liquid chromatography and tandem mass spectrometry. Analytica Chimica Acta
492: 105-31.
234 Bauer, E.R., Daxenberger, A., Petri, T., Sauerwein, H. and Meyer, H.H.
2000. Characterization of the affinity of different anabolic and synthetic hormones to
the human androgen receptor, human sex hormone binding globulin and to the bovine
progestin receptor. APMIS 108: 838-846.
131
235 Durhan, E.J., Lambright, C., Makynen, E., Lazorchak, J., Hartig, P.,
Wilson, V., Earl Gray, L. and Ankley, G.T. 2006. Identification of Metabolites of
Trenbolone Acetate in Androgenic Runoff from a Beef Feedlot. Environ Health
Perspect 114(1): 65-68.
236 EC (European Commission), 1999. Scientific Committee on Veterinary
Measures relating to Public Health (SCVPH). Assessment of potential risks to human
health from hormone residues in bovine meat and meat products.
237 EC (European Commission), 2000. Scientific Committee on Veterinary
Measures relating to Public Health (SCVPH). Review of specific documents relating
to the SCVPH opinion of 30 April 1999 on the potential risks to human health from
hormone residues in bovine meat and meat products. 3 May 2000.
238 EC (European Commission), 2002. Scientific Committee on Veterinary
Measures relating to Public Health (SCVPH). Review of previous SCVPH opinions
of 30 April 1999 and 3 May 2000 on the potential risks to human health from
hormone residues in bovine meat and meat products.
239 EFSA, 2004. Opinion of the Scientific Panel on Contaminants in the Food
Chain on a request from the Commission related to zearalenone as undesirable
substance in animal feed. Adopted on 28 July 2004. The EFSA Journal (2004) 89: 135.
240 Ferchaud V., Le Bizec B., Monteau F., Montrade M. and André F. 1998.
Determination of testosterone exogenous character in bovine urine by gas
chromatography/combustion /isotope ratio mass spectrometry. The Analyst 12: 261720.
241 Ferchaud V., Le Bizec B., Monteau F. and André F. 2000. Characterization
of exogenous tesosterone in livestock by gas chromatography/combustion/isotope
ratio mass spectrometry: influence of feeding and age. Rapid Communic Mass
Spectrometry 14: 652-656.
242 Furusawa, N. and Kishida, K. 2006. Determining zeranol in bovine tissues
under nontoxic conditions. LC GC North America Supplement S: 82-85.
243 Gray, L.E. Jr., Wilson, V.S., Stoker, T., Lambright, C., Furr, J., Noriega,
N., Howdeshell, K., Ankley, G.T. and Guillette, L. 2006. Adverse effects of
environmental antiandrogens and androgens on reproductive development in
mammals. Int J Androl 29(1): 96-104;
244 discussion 105-8. Gulbahar, M.Y., Yuksel, H., Guvenc, T. and Okut, H.
2005. Assessment of proliferative activity by AgNOR and PCNA in prostatic tissue
of ram lambs implanted with zeranol. Reprod Domest Anim 40: 468-474.
245 Hageleit, M., Daxenberger, A. and Meyer, H.H.D. 2001. A sensitive
enzyme immunoassay (EIA) for the determination of melengestrol acetate (MGA) in
adipose and muscle tissues. Food Addit Contam 18: 285-291.
246 Hebestreit, M., Flenker, U., Buisson, C., André, F., Le Bizec, B., Fry, H.,
Lang, M., Weigert, A., Heinrich, K., Hird, S. and Schanzer, W. 2006 Application of
stable isotope carbon isotope analysis to the detection of testosterone administration
to cattle. J Agricult Food Chem54: 2850-8.
132
247 Horie, M. and Nakazawa, H. 2000. Determination of trenbolone and
zeranol in bovine muscle and liver by liquid chromatography-electrospray mass
spectrometry. J Chromatography A 882: 53-62.
248 Impens, S., De Wasch, K., Cornelis, M. and De Brabander, H. 2002.
Analysis on residues of oestrogens, gestagens and androgens in kidney fat and meat
with gas chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatography A 970: 23547.
249 Impens, S., Courtheyn, D., Wasch, K.D. and De Brabander, H. 2003. Faster
analysis of anabolic steroids in kidney fat by downscaling sample size and using gas
chromatography - tandem mass spectrometry. Analyt Chim Acta 483: 269-80.
250 Liu, S. and Lin, Y.C. 2004. Transformation of MCF-10A human breast
epithelial cells by zeranol and estradiol-17beta. Breast J 10(6): 514-21. MacNeil,
J.D., Reid, J., Neiser, C.D. and Fesser, A.C.E. 2003. Single-laboratory validation of a
modified liquid chromatographic method with UV detection for determination of
trenbolone residues in bovine liver and muscle. J AOAC Intern 86: 916-24.
251 Maume, D., Deceuninck, Y., Pouponneau, K., Paris, A., Le Bizec, B. and
André, F. 2001. Assessment of oestradiol and its metabolites in meat. APMIS
149: 32-8. Оценка эстрадиола и его метаболитов в мясе.
252 Бессонова Е.А. Хроматографическое и электрофоретическое
определение стероидов и биогенных аминов в биологических объектах /
автореферат по ВАК 02.00.02, 2004.
253 Maume, D., Le Bizec, B., Pouponneau, K., Deceuninck, Y., Solere, V.,
Paris, A., Antignac, J. and Andre, F. 2003. Modification of 17b-estradiol
metabolite profile in steer edible tissues after oestradiol implant administration.
Analyt Chim Acta 483: 289-97.
254 Годовые отчеты по проекту «Разработка отечественной тестсистемы иммуноферментного анализа для определения эстрадиола 17В в
продуктах животного происхождения».
133
ПРИЛОЖЕНИЕ А
Заключительный отчет о НИР
134
Приложение Б
Отчет о патентных исследованиях
Таблица В.6.4 – Количество опубликованных охранных документов по годам (изобретательская активность)
Объект техники и его
Количество патентов, опубликованных заявок по годам подачи заявки (исключая патенты-аналоги)
составные части
1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2012
7
8
9
10
11
12
13
14
15
1
2
4
5
6
16
17
18
18
1
Способ получения конъюгата RU
гаптен-белок
1
Конъюгаты полимиксина
US
Determination of estradiol by
US
1
1
competitive immunoassay
1
Estradiol derivative and
JP
immunoassy using the same
1
Method and apparatus for
BG
detecting estradiol and
metabolites thereof using an
acoustic device
1
Specific binding members for
DE
estradiol; materials and methods
1
1
Methods for detecting estradiol
US
by mass spectrometry
1
Способ получения
RU
поликлональной т-клеточной
вакцины для лечения
иммунологических
расстройств
1
Способ иммуноферментного
RU
анализа антител к химическим
канцерогенам группы
полициклических
ароматических углеводородов
1
Специфическое связывание
RU
членов эстрадиола, материалы
135
и методы
Определение эстрадиола
путем конкурентного
иммуноанализа
Штамм гибридных
культивируемых клеток мыши
MUS MUSCULUS L.,
используемый для получения
моноклональных антител к
тироксину
ELISA detection method for
penicillins antibiotic residue
ELISA detection method for
carbostyril antibiotic relict
ELISA detection method for
quantitative determination of
cephalosporin antibiotic content
in animal-derived food
Inhibition Assay Method and
Device for Detection of
Antibiotics
1
RU
1
RU
CN
1
CN
1
CN
1
1
US
Таблица В.6.5 – Взаимное патентование
Национальная принадлежность
заявителя
1
Страна патентования
2.1.
2.2.
2.3.
2.4.
2.5.
2.6.
2.7
2.8
НЕ ОБНАРУЖЕНО
136
Количество патентов
Национальных
Запатентовано в
патентов
других странах
3
4
Всего
5
Таблица В.6.6 – География патентования объектов промышленной собственности исследуемыми фирмами (по патентам-аналогам)
Наименование фирмы
Наименование технического
Номер
Дата
Дата
Номера выданных патентов
патентовладельца
решения (изобретения)
первичной
приоритета
публикации
(поданных заявок) по странам
заявки
первич.
выдачи
заявки
1
2
3
4
5
6
Костянко М.В., Глушков
Способ получения конъюгата
98102742/13
16.02.1998
10.11.1999
А.Н.
гаптен-белок
НОВАРТИС АГ (CH)
Конъюгаты полимиксина
97120930/14
24.05.1996
20.03.2001
НОВАРТИС АГ (CH)
Моноклональное
антитело, 95119595/13
30.03.1994
10.11.2001
способное
специфически
распознавать
рапамицин
(варианты),
набор
для
иммунотестирования
Леви Моисей Иосифович; Способ экспрессного определения
2000112381/1 19.05.2000
27.08.2002
Сучков Юрий
антибиотиков биологическим
4
Григорьевич и другие
методом
Piasio, Roger (South
Detection of antibiotics
08/132469
10/06/1993
07/18/1995
Portland, ME)
Justus-Liebig-Universität
Entwicklung
und
Anwendung 978-3-835911.12.2007
17.03.2008
Giessen
enzymimmunologischer
Verfahren 5256-0
zum Nachweis von Cefalexin,
Ceftiofur und Desfuroylceftiofur in
Milch
Федеральное
Конъюгат
окситетрациклина
с 2003116913/0 2003.06.06
2004.12.27
государственное
бычьим сывороточным альбумином 4
учреждение
для иммунохимического способа
"Всероссийский
определения окситетрациклина
государственный центр
качества и стандартизации
лекарственных средств
для животных и кормов"
(ФГУ"ВГНКИ")
Продолжение
таблицы
137
В.6.6
Иркутский
государственный
медицинский университет
Способ определения антибиотиков
группы
хлорамфеникола
с
использованием
стандартного
образца свойств
Иркутский
Способ определения антибиотиков
государственный
группы
хлорамфеникола
с
медицинский университет использованием
стандартного
образца свойств
Томский политехнический Способ
количественного
университет
определения
левомицетина
в
пищевых
продуктах
и
фармпрепаратах
Косяков Константин
Синтетический иммуноген для
Сергеевич ; Пленкин
терапии
и
профилактики
Владимир Юрьевич ;
злоупотреблений наркотическими и
Ветошкин Владимир
психоактивными веществами
Геннадьевич
Глушков Андрей
Способ иммуноферментного
Николаевич; Климов
анализа антител к химическим
Игорь Александрович;
канцерогенам группы
Аносова Татьяна
полициклических ароматических
Петровна; Костянко
углеводородов
Михаил Владимирович
Казанский
Способ получения конъюгата
государственный
аймалина с бычьим сывороточным
университет
альбумином
им.В.И.Ульянова-Ленина
Акционерное общество
Штамм гибридных культивируемых
"Биотехнология"
клеток мыши MUS MUSCULUS L.,
используемый для получения
моноклональных антител к
тиреотропному гормону человека
Акционерное общество
Штамм гибридных культивируемых
2000120114/1
4
2000.07.27
2003.08.10
2000120114/1
4
2000.07.27
2002.08.20
2000131453/2
8
2000.12.14
2002.03.20
2003127705/1
5
2003.09.15
2004.09.20
94020467/14
01.06.1994
10.01.1999
93039016/14
27.07.1993
27.08.1997
93030646/13
11.06.1993
10.05.1996
93018323/13
05.04.1993
10.12.1995
138
"Биотехнология"
Акционерное общество
"Биотехнология"
UNIV ZHEJIANG
UNIV ZHEJIANG
UNIV ZHEJIANG
клеток мыши MUS MUSCULUS L.,
используемый для получения
моноклональных антител к
тироксину
Штамм гибридных культивируемых
клеток мыши MUS MUSCULUS L.,
используемый для получения
моноклональных антител к
фенобарбиталу
Tetracycline and carrier protein
couplet product, method for producing
tetracycline antibiotic antibody uses
thereof
Penicillin and carrier protein couplet
product, method for producing betalactam penicillin antibody, and uses
thereof
ELISA detection method for
penicillins antibiotic residue
Продолжение
таблицы
В.6.6
UNIV ZHEJIANG
ELISA detection method for
carbostyril antibiotic relict
UNIV ZHEJIANG
ELISA detection method for
quantitative determination of
cephalosporin antibiotic content in
animal-derived food
Robert S. Salter, Reading,
Inhibition Assay Method and Device
MA
for Detection of Antibiotics
Хайджиа Сайенсиз, Инк.
Способ определения веществ,
(US)
имеющих по меньшей мере одну
область антигенной детерминанты
Rodney J. Brown et al
Detection of antibiotics in milk
93018329/13
05.04.1993
10.12.1995
CN101429244
(A)
12.04.2008
13.05.2009
CN101429241
(A)
12.04.2008
13.05.2009
CN101403750
(A)
12.04.2008
13.05.2009
CN101315376
(A)
CN101315372
(A)
12.04.2008
13.05.2009
12.04.2008
13.05.2009
20100285572
26.07. 2010
11.11. 2010
4613461/14
07.02.1989
10.04.1997
4347312
20.03.1997
31.08.1998
139
ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ ОТЧЕТА О ПАТЕНТНЫХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
Д.1 Технический уровень и тенденции развития объекта хозяйственной деятельности
Форма Д.1.1 Показатели технического уровня объекта техники
Значение показателей
Объек
Отечественные и зарубежные объекты аналогичного назначения (с указанием
т
моделей, фирм, стран, года известности)
разра- Способ получения конъюгата
Наименование
ботки гаптен-белок,
патентообладаконъю тель Костянко Михаил
показателей
гат
Владимирович;
Глушков
Андрей Николаевич
1
2
3.1
3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9
3.10
гаптен
антрацен (АЦ)
носитель
бычий сывороточный альбумин
(БСА)
восстановитель
Боргидрид натрия
молярное
соотношении белка
и блокирующего
соединения
блокирующие
соединения
1:100 - 1:1000
производные
иодуксусной
кислоты,
производные
акриловой
кислоты,
непредельные
производные
гетероциклических соединений,
циклические имины, оксираны
Руководитель темы,
доктор ветеринарных наук, профессор
Ибрагимов П.Ш.
Патентовед
Гаврилов В.Н.
140
Объект
по государственному
стандарту
4
Междун Прогноз
ародны на
е
и 2010 г.
национа
льные
стандар
ты
5
6
отсутствуют
Нет
ПРИЛОЖЕНИЕ В
Лабораторный регламент
141
ПРИЛОЖЕНИЕ Г
Акт лабораторных испытаний
142
ПРИЛОЖЕНИЕ Д
Акты внедрения в производство
143
ПРИЛОЖЕНИЕ Д1
Акты внедрения в производство
144
ПРИЛОЖЕНИЕ Ж
Акты внедрения учебный процесс
145
ПРИЛОЖЕНИЕ Ж1
Акты внедрения учебный процесс
146
ПРИЛОЖЕНИЕ Е
Инновационный патент
147
148
ПРИЛОЖЕНИЕ К
Список публикаций, полученных в результате выполнения темы
1 Ибрагимов П.Ш., Рыщанова Р.М., Чужебаева Г.Д., Коканов С.К., Ветеринарносанитарный контроль остаточных количеств гормональных стимуляторов роста в
продуктах животного происхождения. // журнал «3i Интеллект, идея, инновация», КГУ
им.А.Байтурсынова, №4 - 2011г.
2 Ибрагимов П.Ш., Рыщанова Р.М., Чужебаева Г.Д., Коканов С.К., Опыт
получения иммунных сывороток для тест-системы иммуноферментного анализа по
определению эстрадиола 17β в продуктах животного происхождения. // журнал «3i
Интеллект, идея, инновация», КГУ им.А.Байтурсынова, №4 - 2011г.
3 Рыщанова Р.М., Ибрагимов П.Ш., Чужебаева Г.Д., Коканов С.К., Получение
иммунной сыворотки к эстрадиолу 17β. Материалы международной зарубежной
конференции «Бъдещето въпроси от света на науката-2012», г.София, Болгария
4 Ибрагимов П.Ш., Рыщанова Р.М., Чужебаева Г.Д., Коканов С.К., Мониторинг
остаточных количеств гормональных стимуляторов роста в мясе отечественного и
импортного происхождения. КазНАУ, г.Алматы, журнал «Ізденістер, нәтижелер,
Исследования, результаты», № 2-2013 г.
5 Рыщанова Р.М., Ибрагимов П.Ш., Определение остаточного содержания
гормональных стимуляторов роста в мясе методом ИФА. Материалы международной
научно-практической конференции «Байтурсыновские чтения», КГУ имени А.
Байтурсынова, г.Костанай, апрель 2013.
6 Рыщанова Р.М., Получение моноклональных антител к эстрадиолу 17β. Материалы
международной зарубежной конференции «Современные подходы к проблеме развития
образования, науки и техники». г. Донецк, Украина, 2013г.
7 Рыщанова Р.М., Ибрагимов П.Ш., Чужебаева Г.Д., Коканов С.К., Наметов
А.М., Production of Specific Immune Serum Against the Steroid Estradiol Hormone. MiddleEast Journal of Scientific Research 16 (12): 1700-1703, 2013 ISSN 1990-9233 / © IDOSI
Publications, 2013 DOI: 10.5829/idosi.mejsr.2013.16.12.12099 база Thomson Reuters/Scopus
8 Рыщанова Р.М., Ирбатырова А.А., Бермухамедов Ж., Получение
Моноклональных антител к стероидным гормонам. Материалы международной научнопрактической конференции «Молодые учёные в решении проблем науки». г. Троицк,
Российская Федерация, ноябрь 2013г.
9 Рыщанова Р.М., Чужебаева Г.Д., Ирбатырова А.А., Получение специфических
антител для гибридомной технологии. КГУ имени А.Байтурсынова многопрофильный
журнал «3i Интеллект, идея, инновация», №1 - 2014г.
10 Рыщанова Р.М., Чужебаева Г.Д., Коканов С.К., Поликлональные и
моноклональные антитела в создании набора реагентов для определения эстрадиола 17В.
Материалы международной научно-практической конференции «Байтурсыновские
чтения», КГУ имени А.Байтурсынова, г.Костанай, апрель 2014г.
149