Документ 2694679
реклама
На правах рукописи ШИШКИНА ВАЛЕНТИНА СЕРГЕЕВНА РОЛЬ ПРО- И АНТИВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ М1 И М2 В РАЗВИТИИ АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКОГО ПОРАЖЕНИЯ 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва, 2014 Работа выполнена на кафедре клеточной биологии и гистологии Биологического факультета Федерального государственного бюджетное образовательного учреждения высшего образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» (ФГБОУ ВО МГУ им. М.В. Ломоносова) и в лаборатории молекулярной и клеточной кардиологии НИИ экспериментальной кардиологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский кардиологический научно-производственный комплекс” Минздрава РФ (ФГБУ «РКНПК» Минздрава РФ). Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Ильинская Ольга Петровна Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Тарарак Эдуард Михайлович Официальные оппоненты: Заведующий лабораторией клеточной иммунопатологии и биотехнологии ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН, доктор биологических наук, профессор Болтовская Марина Николаевна Заведующий лабораторией клеточных и молекулярных основ гистогенеза ФГБУН Института биологии развития имени Н.К. Кольцова РАН, доктор биологических наук Домарацкая Елена Ивановна Ведущая организация: ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздрава РФ Защита состоится 17 февраля 2015 года в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д.501.001.52. при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу 119234, Москва, Ленинские горы, д.1, стр.12, Биологический факультет МГУ, аудитория М-1. С диссертацией можно ознакомиться в отделе диссертаций Фундаментальной библиотеки МГУ имени М.В. Ломоносова по адресу: Ломоносовский просп., д. 27, сектор «А», 8 этаж, комн. 812 и на сайте биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова http://www.bio.msu.ru/dissertations/council.php?ID=4 Автореферат разослан « » января 2015 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Калистратова Е.Н. 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Сердечно-сосудистые заболевания привлекают большое внимание исследователей всего мира в связи с высоким риском развития таких тяжелых осложнений, как ишемии, инфаркты и инсульты. Морфологической основой большинства этих заболеваний является атеросклероз артерий. Атеросклероз – сложный, многоэтапный патологический процесс, развивающийся в основном в артериях эластического (аорта, ветви ее дуги) и мышечно-эластического (артерии сердца, головного мозга и др.) типа (Фустер В. и др., 2004). В современных исследованиях прогрессивного развития атеросклеротических бляшек (АСБ) большое значение отводится воспалению, поскольку в самом атеросклеротическом поражении обнаруживаются основные клетки-участники этого процесса – моноциты/макрофаги (Мц/Мф) и Т-лимфоциты (Т-Лц), продуцирующие факторы регуляции воспалительного ответа (Hansson G.K. and Hermansson A., 2011; Libby P. et. al., 2013). Проникновение в субэндотелиальное пространство Мц, их последующая дифференцировка в Мф и активация являются ключевыми моментами инициации атерогенеза и развития АСБ. В последние годы в современной научной литературе сформировалось представление о так называемой дивергентной поляризации Мф, суть которой заключается в том, что Мф, как in vitro, так и in vivo, в зависимости от получаемых ими сигналов могут проявлять не только про-, но и антивоспалительную активность. В связи с этим выделяют два полярных фенотипа активированных Мф, обозначаемых, соответственно, как М1 и М2. Такое полярное разделение популяции Мф соответствует классификации активированных Т-Лц на Тх1 и Тх2 подтипы, и подчеркивает связь Мф определенного фенотипа с реализацией соответствующего иммунного ответа. При классическом пути активации нативные Мф в ответ на действие провоспалительных факторов – интерферона (IFNγ), фактора некроза опухоли (TNFα) и липополисахарида (ЛПС) приобретают «провоспалительный» фенотип М1, для которого характерна повышенная секреции различных провоспалительных цитокинов, в основном интерлейкина IL-12 и MCP1 (моноцитхемотаксический фактор 1) и низкая – IL-10. Таким образом М1 Мф инициируют воспалительную реакцию, в ходе которой они проявляют высокую цитотоксическую и бактерицидную активность и поддерживают Tх1-зависимый иммунный ответ (Mantovani A. et al., 2004, 2009; Martinez F.O. et al., 2008). Сравнительно недавно открытая альтернативная активация Мф в «антивоспалительный» фенотип М2 происходит под действием иных факторов, в результате такой активации среди Мф М2 возникает несколько функциональных подтипов: M2a – в ответ на стимуляцию IL-4 и IL-13; M2b – в ответ на действие иммунных комплексов, ЛПС и/или IL-1; а M2c Мф – под действием IL-10, трансформирующего фактора роста бета (TGF-) и глюкокортикоидов (Butcher M.J. and Galkina E.V., 2012). Эти подтипы М2 Мф различаются набором поверхностных маркеров и секретируемых цитокинов. Так, для М2а Мф характерным поверхностным маркером является CD206 (маннозный рецептор), для М2b – CD86 (костимулирующая молекула к главному комплексу гистосовместимости (ГКГС) класса II) и молекулы белков ГКГС класса II, а для М2с – CD163 (гемоглобин-гаптоглобиновый рецептор). Все перечисленные подтипы М2 Мф продуцируют высокий уровень IL-10 и низкий IL-12; Мф М2а и М2с, помимо вышеперечисленных факторов, секретируют высокие уровни CCL18 и TGF-; подтип М2b – хемокина CCL1 (хемоаттрактант для Мц, В-Лц и дендритных клеток), а М2а еще и CCL24 (хемоаттрактант для эозинофилов и Т-Лц) (Mantovani A. et al., 2004). В настоящее время сложилось представление о том, что Мф с фенотипом М2а проявляют антивоспалительную, а М2b/с – регуляторную 3 функциональную активность (Луста К.А. и Орехов А.Н., 2014). В целом субпопуляция Мф М2 стимулирует ангиогенез, перестройку и репарацию ткани путем активации фибробластов и гладкомышечных клеток (ГМК) к пролиферации и синтезу межклеточного матрикса (Wynn T.A., 2004). Наряду с тем, что М2 Мф поддерживают Tх2-зависимый иммунный ответ (в основном при некоторых аллергических реакциях, паразитарных инфекциях), привлекают эозинофилы в очаг воспаления, их основная задача – способствовать подавлению воспалительной реакции и восстановлению ткани (Geissmann F. et al., 2010; Ley K. et al., 2011; Wolfs I.M. et al., 2011). Важно отметить, что полярные фенотипы М1 и М2 Мф, вероятнее всего представляют собой крайние состояния метаболической и функциональной поляризации Мф, наряду с которыми вероятнее всего существует некоторый ряд промежуточных состояний (фенотипический континуум) (Монастырская Е.А. и др., 2008; O’Nell L.A. et al., 2013; Artyomov M.N., 2014). В настоящее время ведутся исследования функциональной роли М1 и М2 субпопуляций Мф при опухолевом росте и различных патологиях, сопровождаемых острым и хроническим воспалением в том числе при атеросклерозе. Проведенные в последние годы исследования показали одновременное присутствие как про-, так и антивоспалительных Мф в различных эндартерэктомированных образцах артерий человека, а также в бляшках аорт у мышей с экспериментальным атеросклерозом (Bouhlel M.A. et al., 2007; Wilson H.M., 2010; Wolfs I.M. et al., 2011; Moore K.J. et al., 2013). Свое участие в атерогенезе Мф опосредуют путем секреции широкого спектра цитокинов, влияющих на пролиферативное поведение и функциональную активность клеток бляшек (Hansson G.K. and Hermansson A., 2011; Libby P. et. al., 2013), однако роль специализированных субпопуляций Мф М1 и М2 в процессе инициации, прогрессивного развития и дестабилизации АСБ до сих пор остается практически неизученной. Для понимания молекулярно-клеточных механизмов, сопровождающих прогрессивное развитие атеросклеротических поражений в интиме артерий, а также специфической роли в этих процессах фенотипически и функционально различных субпопуляций Мф, существенное значение приобретает изучение топографии распределения этих субпопуляций и спектра, синтезируемых ими цитокинов и других регуляторных молекул, на разных стадиях развития АСБ. Недостаток информации в этой области обусловливает актуальность настоящего исследования. Цель и задачи исследования Целью настоящей работы явилось изучение роли субпопуляций про- и антивоспалительных Мф в процессах начального и прогрессивного развития атеросклеротических поражений, а также их дестабилизации в сонных артериях человека. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи: I. Морфологически охарактеризовать и идентифицировать в соответствии с классификацией H. Stary (1995) типы атеросклеротических поражений сонных артерий человека, полученные в ходе операции каротидной эндартерэктомии, а также провести оценку стабильности/ нестабильности этих поражений. II. Исследовать роль Мф про- и антивоспалительного фенотипа в ходе начального развития, прогрессии и осложнении атеросклеротического поражения: 1. провести топографический анализ распределения субпопуляций Мф М1 и М2 в различных областях и типах атеросклеротических поражений путем иммуноцитохимического типирования клеток; 2. исследовать содержание про- и антивоспалительных цитокинов, секретируемых Мф М1 и М2, в разных типах атеросклеротических поражений методом иммуноферментного анализа; 4 исследовать содержание факторов, участвующих в реорганизации межклеточного матрикса, в атеросклеротических поражениях разных типов методом иммуноферментного анализа и сопоставить с возможной функциональной активностью субпопуляций Мф М1 и М2. Научная новизна работы Впервые проведено комплексное исследование распределения субпопуляций про- и антивоспалительных Мф (М1 и М2) и ряда биологически активных факторов и цитокинов, характеризующих функциональную активность этих субпопуляций, в шести основных типах атеросклеротических поражений (липидное пятно/полоса, атерома, фиброатерома, фиброзное, фиброкальцинозное и осложненное поражение) и исследована возможная роль этих субпопуляций в формировании и дестабилизации поражений в сонных артериях человека. Обнаружено, что во всех типах атеросклеротических поражений присутствуют как М1, так и М2 Мф, численное соотношение между которыми может существенно меняться в разных областях бляшек и на разных стадиях их прогрессивного развития. Показано одновременное присутствие обеих субпопуляций в областях поражений, склонных к разрыву – в фиброзных покрышках и плечах бляшек. Достоверно более интенсивная инфильтрация Мф обеих субпопуляций обнаружена в покрышках нестабильных поражений по сравнению со стабильными. Показано, что во всех типах атеросклеротических поражений выявляются цитокины, характерные для обеих субпопуляций Мф, однако в каждом из поражений та или иная группа (про- или антивоспалительных) факторов количественно преобладает, что предполагает доминирование функциональной активности одной из субпопуляций на соответствующей стадии развития АСБ. Обнаружено значительное увеличение содержания показателей антивоспалительной активности IL-10, CD163, CCL24 в осложненных, нестабильных поражениях одновременно с уменьшением содержания провоспалительных цитокинов – IL-12 и IL-1β. Это может указывать на возрастающую роль в таких поражениях функциональной активности М2 Мф, которая направлена на репарацию дезорганизованной интимы и стабилизацию АСБ. Кроме того, обнаружено, что для стабильных фиброзных и фиброкальцинозных поражений в целом характерны низкие уровни всех цитокинов. Во всех типах атеросклеротических поражений выявлена статистически значимая положительная корреляционная связь (от сильной до умеренной) между содержанием факторов реорганизации межклеточного матрикса (металлопротеаз 2 и 9 (MMP2, MMP 9) и их тканевых ингибиторов 1 и 2 (TIMP1, TIMP2)) и содержанием про- (IL-1β, IL-8, MCP1, CCL3) или антивоспалительных (IL-10, CCL24, TGFβ-1) цитокинов, секретируемых Мф М1 или М2, соответственно. Теоретическая и практическая значимость работы Результаты работы расширяют фундаментальные представления о фенотипической и функциональной гетерогенности популяции Мф. Они открывают перспективу дальнейшего более углубленного изучения проблемы фенотипической пластичности Мф и роли этого феномена в патогенезе атеросклероза. Полученные факты имеют значение для понимания молекулярноклеточных механизмов атерогенеза, сопровождающих прогрессивное развитие АСБ в сосудах человека, и специфической роли в этом процессе фенотипически полярных субпопуляций Мф М1 и М1, несбалансированная функциональная активность которых может лежать в основе прогрессивного развития атеросклеротических поражений. Данные о специфической функциональной активности субпопуляций Мф могут быть использованы при чтении спецкурсов «Ткани внутренней среды» и «Патологическая анатомия». 3. 5 На основе полученных данных может быть разработан метод сравнительной оценки содержания М1 и М2 Мф наряду с про- и антивоспалительными цитокинами – показателями их функциональной активности, в эндартерэктомированных образцах атеросклеротических поражений и в крови пациентов для прогнозирования характера развития у них атеросклероза и коррекции терапевтической стратегии. Новые данные о проявлении функциональной активности М1 и М2 субпопуляций Мф в различных типах атеросклеротических поражений могут заложить теоретическую основу для развития клеточных технологий, которые в перспективе могут быть использованы для разработки наиболее эффективных методов предупреждения развития и лечения атеросклероза. Апробация работы Основные результаты и положения диссертации были представлены и обсуждены на XVII, XVIII, XX международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2010, 2011, 2013); на международной конференции европейского атеросклеротического общества «EAS 2013» (France, Lion, 2013); на заседании объединенного семинара ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН (май, 2013) и на совместном заседании кафедры клеточной биологии и гистологии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова и лаборатории молекулярной и клеточной кардиологии НИИ экспериментальной кардиологии ФГБУ «РКНПК» Минздрава РФ (май 2013, сентябрь, 2014). Публикации По результатам диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них в журналах, соответствующих перечню ВАК РФ – 7, а также тезисов докладов и материалов конференций – 12. Структура и объем диссертации Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Текст диссертации изложен на 168 страницах, содержит 46 рисунков и 24 таблицы. Список литературы состоит из 223 цитируемых источников, из которых 13 – на русском и 210 – на английском языке. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Работа выполнена на экспериментальной базе кафедры клеточной биологии и гистологии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова и лаборатории молекулярной и клеточной кардиологии НИИ экспериментальной кардиологии ФГБУ «РКНПК» Минздрава РФ. Материал исследования – пораженные атеросклерозом участки сонных артерий человека, изъятые в ходе операций каротидной эндартерэктомии в отделении неотложной сосудистой хирургии института скорой помощи имени Н.В. Склифосовского. Исследовано 16 таких образцов от 10 мужчин (средний возраст 59 ± 6 года) и 6 женщин (средний возраст 73 ± 5 года) с верифицированным гемодинамически значимым каротидным стенозом (степень стеноза 69 ± 14%). Полученные образцы, состоявшие из интимы и медии, в сумме содержали 27 АСБ удлиненной формы с участками поражений разных типов от липидного пятна/полосы до осложненного поражения. Методы исследования При макроскопическом исследовании АСБ отмечали их морфологическую неоднородность, разрезали поперек на фрагменты шириной 5 – 7 мм (n = 163) и замораживали в парах жидкого азота. Из части фрагментов АСБ (n = 64) готовили криостатные срезы для морфологического и иммуногистохимического анализа, другую часть (n = 95) использовали для иммуноферментного анализа. 6 Гистологическая обработка материала. Для морфологического анализа, классификации и оценки стабильности/нестабильности атеросклеротических поражений из замороженных фрагментов АСБ (n = 64) готовили криосрезы толщиной 5 мкм. Часть из них после фиксации в смеси метанол : хлороформ : ледяная уксусная кислота (6:3:1) окрашивали гематоксилин-эозином для общей морфологической характеристики поражений. Для идентификации структурных компонентов соединительнотканного матрикса срезы окрашивали орсеином, альциановым синим и по Ван-Гизону. Для выявления нейтральных жиров использовали окраску масляным красным. Морфологическое исследование срезов атеросклеротического поражения. Исследовали такие области бляшек, как липидное «ядро» (скопление внеклеточных липидов в центре бляшки), «покрышка» (поверхностные фиброзные слои бляшки, расположенные над липидным ядром) и «плечо» (пограничная область между бляшкой и неизмененной интимой). Отмечали следующие показатели: толщину фиброзной покрышки, наличие в ней участков локального истончения и разрывов; количество, величину и структуру атеронекротических ядер; наличие тромбов и геморрагий, областей кальцификации и васкуляризации. Далее проводили идентификацию атеросклеротических поражений согласно классификации H. Stary (1995). Оценку стабильности/нестабильности поражений проводили в соответствии с общепринятыми морфологическими критериями (Falk E., et al., 1995; Casscells W., et al., 2003; Lovett J.K., et al., 2005). К нестабильным относили поражения, имевшие истончения и дефекты фиброзной покрышки (изъязвления, разрывы и геморрагии), низкое содержанием ГМК и компонентов матрикса (коллагена, эластина, протеогликанов), крупное атеронекротическое ядро с большим количеством липидов, кристаллов холестерина и клеточного детрита, неорганизованные интрамуральные тромбы и старые геморрагии, пристеночные тромбы на поверхности бляшек, а также выраженную инфильтрацию покрышек и плеч бляшки клетками воспаления (Мц/Мф и ТЛц). Иммуногистохимическое выявление антигенов на срезах. Часть криосрезов использовали для иммуногистохимического выявления различных антигенов с помощью непрямого пероксидазного метода с использованием авидин-биотинового комплекса. Для идентификации типов клеток использовали мышиные моноклональные антитела в разведении 1:100 (DAKO, Дания) против специфических клеточных маркеров: Мц – CD14, рецептор к ЛПС, Мф человека – HAM56, гликопротеид с неизвестной функцией, эндотелиальные клетки – vWF, фактор фон Виллебранта, Т-Лц – CD3, Т клеточный рецептор и ГМК – SM α-aktin, гладко-мышечный актин. Субпопуляции Мф выявляли согласно принятой схеме, используя мышиные моноклональные антитела в разведении 1:100 (BD, Франция): против маркера провоспалительных Мф – MCP-1 (моноцитхемотаксический фактор 1) и против двух маркеров антивоспалительных Мф – СD206 (маннозный рецептор – маркер антивоспалительного М2а подтипа Мф) и CD163 (гемоглобиновый – гаптоглобиновый рецептор – маркер регуляторных М2с подтипа Мф) (Bouhlel M.A. et al., 2007; Chinetti-Gbaguidi G., 2011). Для выявления клеток, секретирующих ферменты, участвующие в реорганизации матрикса, использовали мышиные моноклональные антитела против металлопротеазы 9 – MMP9 (Abcam, США) в разведении 1:500 и ингибитора металлопротеаз – TIMP1/2 (Novocastra, Германия) в разведении 1:300. Криосрезы атеросклеротических поражений после инкубации с первыми антителами фиксировали 10% забуференным формалином (Биовитрум, Россия), обрабатывали 3% перекисью водорода для ингибирования эндогенной пероксидазы и инкубировали с биотинилированными козьими поликлональными антителами к мышиным IgG в разведении 1:200 (Vector, США). Последующее выявление мест связывания 7 антител с антигенами проводили с помощью коньюгата авидина D с пероксидазой хрена (Vector, США), а визуализацию – с помощью стандартного набора на основе диаминобензидина (Vector, США). Морфометрическое исследование атеросклеротических поражений разных типов. Анализ изображений и подсчет различных морфометрических параметров проводили на цифровых микрофотоснимках, полученных на микроскопе Leica DM 5000 B (Германия), оснащенном цифровой фотокамерой Leica DFC 320 (Германия), в программе ImageJ при различных оптических увеличениях: х100, х200 и х400. Для каждого вида анализа использовали 3 поперечных гистологических среза АСБ. Интенсивность окрашивания областей атеросклеротических поражений, содержащих липиды, гликозаминогликаны, коллагеновые и эластические волокна, новообразованные сосуды и клетки, определяли на срезах после соответствующего окрашивания полуколичественным методом по 3-х балльной шкале: 1 – отсутствие / слабая интенсивность окраски / мало клеток / отсутствие микрососудов или 1-3 сосуда; 2 – средняя интенсивность окраски / умеренное количество клеток / умеренное количество микрососудов; 3 – интенсивная окраска / много клеток / большие скопления микрососудов, или несколько крупных сосудов. Анализ распределения субпопуляций М1 и М2 Мф в различных областях и типах атеросклеротических поражений. В первой части исследования анализировали топографию распределения Мф М1 и М2 на срезах в неизмененной интиме сосуда и при различной степени прогрессии атеросклеротического поражения. Во второй части работы была проведена количественная оценка распределения Мц, Мф М1 и М2 в участках АСБ, наиболее предрасположенных к разрыву и тромбозу – в покрышке и плечах. При этом проводили подсчет числа клеток каждого типа, приходящихся на общую площадь участка среза в 1мм2. Твердофазный иммуноферментный анализ АСБ. Для проведения иммуноферментного анализа замороженные в жидком азоте фрагменты (n = 95) образцов атеросклеротических поражений различного типа гомогенизировали в фосфатно-солевом буфере при pH = 7,4 (500 мкл буфера : 100 мкг ткани), содержавшем смесь ингибиторов протеаз. 1мл буфера содержал в конечной концентрации: 1mM диэтилтритола, 1mM фенилметилсульфонилфторида, 10µg леупептина (Sigma, США). Супернатант после гомогенизации и центрифугирования хранили при -700С. Иммуноферментный анализ проводили согласно протоколам производителей, используя готовые наборы для выявления в тканевых гомогенатах хемокинов CCL3, CCL18 и CCL24, маркерных белков Мц/Мф CD14 и CD163 (RandD, США), цитокинов MCP-1, IL-1b, IL-6 (BD, Франция), IL-8, фактора роста TGFβ-1 (BMS, Франция) и факторов, участвующих в реорганизации матрикса: MMP2 и TIMP2 (RandD, США) и MMP9 и TIMP1 (BMS, Франция). Концентрации всех факторов нормализовали на количество общего белка в супернатанте, которое определяли по методу Брэдфорда (Bradford M.M., 1976). Статистическая обработка результатов проведена с помощью программ: STATISTICA 7.0, Medcalс и Microsoft Excel. Для оценки статистической значимости отличий применяли двусторонний непараметрический критерий Манна-Уитни. Статистически значимыми считали различия при р<0,05. Корреляционный анализ проводили с использованием критерия Спирмана, при этом коэффициент корреляции считали достоверным при р<0,05. На таблицах и графиках данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартная ошибка среднего. Результаты исследования и их обсуждение Морфологическая характеристика и идентификация атеросклеротических поражений сонных артерий человека в соответствии с классификацией H. Stary (1995). Оценка 8 стабильности / нестабильности поражений. Морфологическое исследование 16 образцов наружных, внутренних и общих сонных артерий человека показало, что они состояли из интимы и медии, содержали 27 АСБ удлиненной формы с участками разных морфологических типов поражений. Микроскопическое исследование АСБ выявило 6 различных типов поражений (рис. 1, А – Ж): от начального (липидного пятна/полосы) до осложненного поражения (табл. 1). Всего было исследовано 163 отдельных фрагмента сосудов, в том числе 4 участка с неизмененной интимой. Таблица 1. Количественное распределение идентифицированных типов атеросклеротических поражений и участков артерий с неизмененной интимой, исследованные с помощью иммуногистохимического (ИГХА) и иммуноферментного анализа (ИФА). Исследованный материал Неизмененная интима Типы поражений Липидное пятно/полоса Атерома Фиброатерома Фиброзное поражение Фиброкальцинозное поражение Осложненное поражение Количество исследованных участков артерий (n=163) ИГХА ИФА 4 0 4 3 13 23 7 14 5 4 26 31 7 22 Рис. 1. Поперечные гистологические срезы участков АСБ с разными типами атеросклеротических поражений. А – норма, Б – липидное пятно, В – атерома, Г – фиброатерома, Д, Е и Ж – фиброзное, фиброкальцинозное и осложненное поражение, соответственно. ПС – просвет сосуда, И – интима, П – фиброзная покрышка, АЯ – атероматозное ядро, ФТ – фиброзная ткань, Гр – геморрагия, ООСК – область отложения солей кальция, М – медия. Окраска гематоксилин – эозином (А) и по Ван – Гизону (Б – Ж). Ядра окрашены гематоксилином Караччи (А – Ж). Морфометрическое исследование клеточного состава неизмененной интимы выявило в ней высокое содержание ГМК и наличие единичных Мц и Мф. На начальных стадиях развития атеросклеротического поражения – в липидном пятне/полосе – была выявлена выраженная инфильтрация Т-Лц, Мц и Мф, в меньшей степени присутствовали клетки, эскпрессировавшие матриксную металлопротеазу MMP9 и ее ингибитор TIMP1. Результаты морфологического анализа выраженных атеросклеротических поражений (атером, фиброатером, осложненных, фиброзных и фиброкальцинозных) выявили статистически значимые различия по содержанию клеток в разных типах поражений. Так, было показано, что по сравнению с фиброзными и фиброкальцинозными поражениями в адлюминальной области фиброатером и осложнённых бляшек содержалось достоверно больше Т-Лц, Мц и Мф, в области плеч – больше Мц, а в атероматозных ядрах было снижено содержание ГМК (табл. 2). Кроме того, в фиброзной покрышке и в области плеч фиброатером было выявлено самое высокое содержание MMP9+- клеток, особенно по сравнению с теми же структурами в фиброзных поражениях. Исследование степени васкуляризации выявило самую высокую плотность расположения новообразованных микрососудов в атероматозных ядрах осложненных поражений, а также в плечах и фиброзных покрышках фиброатером. Напротив, в тех же структурах фиброзных бляшек содержание микрососудов было минимальным. Известно, что 9 высокая инфильтрация лейкоцитами и MMP9+- клетками фиброатером и осложненных поражений в клинически значимых областях – плечах и фиброзных покрышках, может способствовать дестабилизации и разрыву таких поражений и потенциально обеспечивать развитие клинических проявлений (Newby A.C., 2005). Таблица 2. Сравнительный анализ частоты встречаемости клеток, несущих различные маркеры, в разных типах атеросклеротических поражений (M ± m) Типы поражений по H. Stary (1995) 1 2 3 4 Фиброат. Осложн. Фиброкал. Фиброз. (n=13) (n=14) (n=7) (n=23) Частота встречаемости клеток, несущих соответствующий маркер (усл. ед.) Обл. поражения Типы клеток Маркёр Атер. ядро ГМК SM α-actin 1,2 ± 0,2 1,2 ± 0,4 2,3 ± 0,3 Мф Мц/Мф Т-Лц ЭК Мф, ГМК Мц/Мф Мф, ГМК HAM56 CD14 CD3 vFW MMP9 CD14 MMP9 2,5 ± 0,1 2,3 ± 0,2 2,0 ± 0,2 1,0 ± 0,2 1,8 ± 0,2 2,3 ± 0,2 1,9 ± 0,2 2,2 ± 0,2 2,1 ± 0,2 1,6 ± 0,2 0,7 ± 0,3 1,6 ± 0,2 2,1 ± 0,3 1,5 ± 0,3 1,4 ± 0,3 1,1 ± 0,3 1,0 ± 0,4 0,9 ± 0,4 1,6 ± 0,3 1,2 ± 0,4 1,5 ± 0,3 Фиброз. покрышка Плечо Достоверность различий р1-3 р1-4 р2-3 р2-4 2,3 ± 0,1 0,006 <0,001 0,07 0,009 1,2 ± 0,1 1,2 ± 0,1 1,0 ± 0,1 0,1 ± 0,1 1,2 ± 0,1 1,4 ± 0,1 1,2 ± 0,1 0,008 0,014 <0,001 <0,001 0,001 0,002 0,01 0,007 0,01 0,06 <0,001 0,001 0,014 0,056 0,59 0,44 0,04 0,27 0,03 0,24 0,63 0,89 0,08 0,95 0,13 0,13 0,06 0,34 Примечания. Приведены данные только для случаев с достоверно значимыми различиями. Значения р, выделенные жирным шрифтом, достоверны, р<0,05. Все фрагменты АСБ были также оценены с точки зрения наличия в них гистоморфометрических признаков стабильности/нестабильности поражений в соответствии с общепринятыми гистологическими критериями нестабильности (Falk E. et al., 1995; Casscells W. et al., 2003; Lovett J.K. et al., 2005). Подавляющее большинство стабильных фрагментов АСБ (74%) были поражениями фиброзного и фиброкальцинозного типа, среди нестабильных участков 43% были атеромами или фиброатеромами, а 53% – осложненными поражениями. Сопоставление стабильных и нестабильных поражений по клеточному составу показало следующее: в нестабильных участках в области плеч повышено содержание Т-Лц, Мц и MMP9+- клеток, в области фиброзных покрышек – Мц, Мф, Т-Лц, MMP9+- клеток и сосудов, а в области атероматозных ядер повышено содержание Мф и Т-Лц и снижено количество ГМК. Топография распределения субпопуляций Мф М1 и М2 в разных типах атеросклеротических поражений. В этой части исследования после иммуногистохимического выявления М1 и М2 Мф был проведён сравнительный анализ топографии распределения этих субпопуляций в нормальной интиме и в указанных выше типах атеросклеротических поражений. В неизмененной интиме были обнаружены лишь единичные Мц/Мф, представленные CD14+, HAM56+ и CD206+- клетками (рис. 2А, В (а – г)). В липидных пятнах/полосах интима была значительно инфильтрирована Мц и Мф (рис. 2Б, Г (а - г)), имеющими как про- (MCP1+-клетки), так и антивоспалительный иммунофенотип (CD206+ и CD163+- клетки). Подтипы М2 Мф: М2а (CD206+) и М2с (CD163+) были представлены в равных долях. При этом статистически значимых различий между содержанием М1, М2а и М2с (табл. 3) не было выявлено. Однако суммарное количество Мф М2 в липидном пятне/полосе по сравнению с Мф М1 (MCP1 +- клетки) было в 2,3 раза больше (табл. 3).Т.е. в липидных пятнах преобладали Мф антивоспалительного фенотипа. Анализ результатов иммуногистохимического исследования серийных срезов выраженных атеросклеротических поражений (атером, фиброатером, осложненных фиброзных и фиброкальцинозных) и их сопоставление с данными, полученными при окраске на липиды, 10 показали, что про- и антивоспалительные Мф существенно отличаются по содержанию липидных включений и локализации внутри поражений. Подавляющее большинство пенистых клеток с липидными включениями несли маркер Мф НАМ56 (рис. 3А, Б). При этом Мф М1 содержали значительные включения липидов (рис. 3А, В) и были расположены в основном в типичных местах скопления пенистых клеток: в плечах бляшек, внутри липидных ядер, над ними или по их периферии, в то время как Мф М2 содержали незначительные липидные включения (рис. 3А, Г, Д) и находились в наиболее стабильных областях поражений: фиброзных покрышках и/или в участках с высоким содержанием межклеточного матрикса. Большинство Мф М1 солокализовалось с HAM56+-Мф (рис. 3Б, В), а обе функциональные подгруппы Мф М2 – как с HAM56+-Мф (рис. 3Б, Г, Д), так и с CD14+ Мц (данные не представлены). Различия в локализации М1 и М2 субпопуляций Мф можно объяснить специфическим характером их функциональной активности, связанной с особенностями фагоцитоза. Так, in vitro Мф М1 активно фагоцитируют окисленные липопротеиды; Мф М2, напротив, фагоцитируют их слабо, однако для них характерно участие в клиренсе апоптотирующих клеток (Ley K. et al., 2011; Moore K.J. and Tabas I., 2011; Murray P.J. and Wynn T.A., 2011). Таблица 3. Распределение субпопуляций Мф М1 и М2 в липидных пятнах/полосах (M ± m). Мф Маркер Липидное пятно/полоса М1 М2 (1) MCP1 (2) CD206 (3) CD163 Количество маркированных клеток/мм2 среза 117,8 ± 30,5 155,3 ± 39,4 115,6 ± 28,1 ПС HAM56 И 100 мкм А М В-а 100 мкм CD14 100 мкм В-б HAM56 ПС Достоверность различий p1-2 p1-3 р2-3 р> 0,05 р> 0,05 р> 0,05 MCP1 В-в CD14 100 мкм CD206 В-г MCP1 100 мкм CD206 И Б М 100 мкм Г-а 100 мкм 100 мкм Г-б Г-в 100 мкм Г-г 100 мкм Рис. 2. Поперечные серийные срезы внутренней сонной артерии. А – фрагмент неизменённой интимы; Б – фрагмент липидной полосы; рамки ограничивают области, представленные далее; В, Г – распределение Мц и Мф М1 и М2 на серийных срезах тех же фрагментов неизмененной интимы и начального атеросклеротического поражения – липидной полосы. Иммунопероксидазный (АВС-kit) метод окрашивания с помощью моноклональных антител против специфических клеточных маркеров: В-а, Г-а – CD14 (Мц); В-б, Г-б – HAM56 (Мф человека); В-в, Г-в – MCP1 (Мф М1); В-г, Г-г – CD206 (Мф М2а). Клетки, содержащие перечисленные антигены, имеют коричневое окрашивание. И – интима, М – медия, ПС – просвет сосуда. Окраска по Ван-Гизону (А) и на липиды масляным красным (Б). Ядра окрашены гематоксилином Караччи (А), гематоксилином Майера (Б, и Г) и метиловым зеленым (В). Кроме того, в выраженных поражениях были выявлены специфические зоны локализации субпопуляции Мф М2 (рис. 4). При этом значительные скопления Мф М2, как CD206+, так и CD163+, были обнаружены в местах расположения новообразованных микрососудов (рис. 4А, В). Подобная локализация М2 Мф объясняется участием этих клеток в процессах ангиогенеза вследствие их способности синтезировать VEGF и эндотелин (Mantovani A. et al., 2009). Кроме того, в участках расположения геморрагий мы обнаружили Мф М2 преимущественно подтипа М2с (CD163+ – клетки), а в покрышках над интрамуральными организующимися тромбами – М2а 11 (CD206+ – клетки) (рис. 4Б, Г). Известно, что появление геморрагий в АСБ ведет к разрушению внеклеточного матрикса и дестабилизации поражения, поэтому присутствие скоплений М2с Мф в этих областях можно объяснить, наряду с их участием в утилизации гемоглобина, также секрецией атеропротекторного IL-10, который является участником негативной регуляции воспалительного процесса (Mantovani A. et al., 2009). Факт преимущественного скопления М2а Мф в покрышках поражений над пристеночными тромбами, выявленный нами, может быть объяснен синтезом ими факторов (IL-4, 10 и 13, CCL24 и TGF-β), ингибирующих активацию эндотелия, стимулирующих миграцию ГМК и фибробластов и синтез соединительнотканного матрикса (Martinez F.O. et al., 2006; Ley K. et al., 2011). Рис. 3. Распределение субпопуляций Мф на HAM56 MCP1 серийных гистологических срезах атеромы внутренней сонной артерии. Сопоставление с локализацией липидов. А – окраска на липиды масляным красным, ядра окрашены 100 мкм 100 мкм Б В гематоксилином Караччи; рамка ограничивает М1 область, представленную далее: Б – Д – Пк CD206 CD163 распределение Мф М1 и М2 на М2 последовательных поперечных срезах того же фрагмента АСБ. Иммунопероксидазный (АВС- А 100 мкм kit) метод окрашивания с помощью 100 мкм 100 мкм Г Д моноклональных антител против специфических клеточных маркеров: Б – HAM56 (Мф человека), В – MCP1 (Мф М1), Г – CD206 (Мф М2а) и Д – CD163 (Мф М2с). Клетки, содержащие перечисленные антигены, имеют коричневое окрашивание. Ядра окрашены гематоксилином Майера. Пк – пенистые клетки. СЛ С 100 мкм А HAM56 SM-actin В-а 50 мкм В-б 50 мкм В-в CD163 CD206 MCP1 50 мкм В-г 50 мкм В-д 50 мкм ПС SM-actin HAM56 MCP1 CD206 CD163 П Б ТР 100 мкм Г-а 50 мкм Г-б 50 мкм Г-в 50 мкм Г-г 50 мкм Г-д 50 мкм Рис. 4. Поперечные гистологические срезы внутренней сонной артерии. А – фрагмент осложненного поражения в области скопления микрососудов; Б – фрагмент осложненного поражения в области покрышки над организующимся тромбом; рамки ограничивают области, представленные далее; В, Г – распределение ГМК, Мц и Мф М1 и М2 на серийных гистологических срезах тех же фрагментов АСБ. Иммунопероксидазный (АВС-kit) метод окрашивания с помощью моноклональных антител против специфических клеточных маркеров: В-а, Г-а – SM-aktin (ГМК); В-б – CD14 (Мц); Г-б – HAM56 (Мф); В-в, Г-в – MCP1 (Мф М1); В-г, Г-г – CD206 (Мф М2а); В-д, Г-д – CD163 (Мф М2с). Клетки, содержащие перечисленные антигены, имеют коричневое окрашивание. Окраска по Ван-Гизону (А, Б). Ядра окрашены гематоксилином Караччи (А, Б), гематоксилином Майера (В и Г-а, б, г) и метиловым зелёным (Г-в, д). С – сосуд, СЛ – скопление лейкоцитов, П – покрышка, ТР– организующийся тромб, ПС – просвет сосуда. Было обнаружено, что как в плечах, так и в покрышках – областях, наиболее предрасположенных к разрыву, тромбозу, возникновению геморрагий, на всех стадиях развития выраженных поражений присутствовали обе субпопуляции Мф, т.е. М1 (MCP1+) и М2 (CD206+ и CD163+). В участках плеч достоверной разницы по количеству М1 и М2 Мф между разными 12 2 клеток/мм среза Кол-во маркированных типами поражений выявлено не было (данные не представлены). Достоверно самое низкое содержание Мф М1 было обнаружено в адлюминальных фиброзных слоях фиброкальцинозных поражений. В аналогичных структурах фиброзных поражений содержание таких клеток также было низким, что их достоверно отличало от фиброзных покрышек фиброатером и осложненных поражений. Содержание Мф М1 в фиброзных покрышках атером было наиболее высоким, однако достоверных различий с остальными типами поражений кроме фиброкальцинозных, выявлено не было. 350 300 250 200 150 100 50 0 # * #* #* #* # * MCP1+ кл CD206+ кл CD163+ кл * #* # Атерома Фиброатерома Осложненное Фиброкаль- Фиброзное цинозное Рис. 5. Распределение субпопуляций Мф М1 (MCP1+- клеток) и М2 (CD206+- и CD163+- клеток) в фиброзных покрышках атеросклеротических поражений разных типов. # – различия достоверны по сравнению с фиброкальцинозным поражением; * – различия достоверны по сравнению с фиброзным поражением (p<0,05). Содержание М2а Мф в фиброзных покрышках фиброзных и фиброкальцинозных поражений было достоверно ниже по сравнению с покрышками фиброатером и осложненных поражений. Достоверно более низкое количество М2с Мф было также выявлено в покрышках фиброзных поражений по сравнению с атеромами, фиброатеромами и осложненными поражениями. Фиброзные и фиброкальцинозные поражения не отличались по содержанию в их поверхностных фиброзных слоях М2а Мф, но отличались по количеству Мф регуляторного фенотипа – М2с, а также провоспалительных М1 Мф. Так, в адлюминальных областях фиброзных поражений по сравнению с фиброкальцинозными наблюдалось более низкое содержание М2с Мф и более высокое – М1 Мф (рис. 5). Эти различия могут отражать более высокую степень провоспалительной активности в адлюминальных фиброзных слоях фиброзных бляшек по сравнению с фиброкальцинозными. Интенсивная инфильтрация как про-, так и антивоспалительными Мф фиброзных покрышек фиброатером и осложненных поражений по сравнению со стабильными, т.е. фиброзными и фиброкальцинозными, по-видимому, свидетельствует об идущих в них более активных воспалительных процессах. Это может способствовать их дестабилизации вследствие деградации внеклеточного матрикса и вести к истончению и разрыву фиброзных покрышек – наиболее опасному в клиническом отношении осложнению при атеросклерозе. Результаты данной части исследования позволяют заключить, что в атеросклеротических поражениях каждого типа присутствуют обе субпопуляции Мф – М1 и М2. При этом в нестабильных областях поражений (богатых липидными включениями) локализуются в основном Мф М1, участвующие в инициации и поддержании воспаления и оказывающие разрушающее воздействие на межклеточный матрикс АСБ. Напротив, в стабильных областях поражений, богатых соединительнотканным матриксом, а также в образующейся над интрамуральным организующимся тромбом фиброзной покрышке или местах расположения новообразованных микрососудов преимущественно локализуются Мф М2. Основная задача этой субпопуляции – способствовать подавлению воспаления и организации межклеточного матрикса. Стабильные поражения отличаются от нестабильных в первую очередь значительно меньшей общей 13 численностью Мф, представленных как М1, так и М2 субпопуляциями, практически в равных долях. Изучение содержания белков – маркеров Мц/Мф, про- и антивоспалительных цитокинов, секретируемых субпопуляциями Мф М1 и М2, в различных типах атеросклеротических поражений. Исследование возможной функциональной активности субпопуляций Мф М1 и М2 проводили, анализируя содержание секретируемых ими соответствующих про- (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, CCL3 и MCP-1) и антивоспалительных (IL-10, CCL18, CCL24 и TGFβ-1) факторов в гомогенатах атеросклеротических поражений с помощью иммуноферментного анализа. По мнению большинства авторов, эти цитокины наиболее ярко отражают присутствие и активность каждой из субпопуляций М1 и М2 Мф у человека (Mantovani A. et al., 2004, 2009; Martinez F.O. et al., 2008). Исследование содержания провоспалительных интерлейкинов IL-1β, IL-6 и IL-8, инициирующих и поддерживающих острый воспалительный процесс (Tedgui A. and Mallat Z., 2006; Apostolakis S., et al., 2009), в разных типах атеросклеротических поражений позволило обнаружить их наиболее высокие количества в фиброатеромах и осложненных поражениях по сравнению с фиброзными и фиброкальцинозными (табл. 4). Уровень содержания IL-6 и IL-8 был самым высоким в атеромах, фиброатеромах и осложненных поражениях, достоверно выше, чем в фиброкальцинозных и, в меньшей степени, фиброзных поражениях. При этом максимальное содержание IL-8 было выявлено в осложненных поражениях, а IL-6 – в атеромах и осложненных поражениях. Во всех типах поражений, кроме фиброкальцинозных, уровень IL-1β был высоким, с максимальным содержанием в фиброатеромах. Исследование содержания IL-12 в разных типах атеросклеротических поражений выявило его самый низкий уровень в осложненных поражениях, достоверно более низкий по сравнению с фиброзными и фиброкальцинозными АСБ. В фиброкальцинозных поражениях содержание IL-12 также было низким, а в липидных пятнах/полосах и атероме – высоким, однако достоверных различий с остальными типами поражений выявлено не было. Помимо провоспалительных интерлейкинов в атерогенезе важную роль играет противовоспалительный IL-10 (Mallat Z. et al., 1999; Tedgui A., Mallat Z., 2006). Максимальное содержание IL-10 было выявлено в осложненных поражениях, в остальных – его уровень был снижен, достигая минимального значения – в фиброзных АСБ (табл. 4). Помимо интерлейкинов существенное значение в развитии, прогрессии и нарушении стабильности атеросклеротического поражения имеют хемокины (Boisvert W. A, 2004; Braunersreuther V. et al., 2007). В качестве основных показателей функциональной активности провоспалительных Мф использовали провоспалительные хемокины: MCP1, являющийся основным Мц– и Т-Лц– специфическим хемоаттрактантом, и CCL3, участвующий в привлечении и активации полиморфноядерных лейкоцитов. О проявлении функциональной активности антивоспалительных Мф судили по наличию в гомогенатах АСБ антивоспалительных хемокинов: CCL18, привлекающего Т-Лц и участвующего в дифференцировке и активации Мц в Мф М2, и хемоаттрактанта CCL24 (хемоаттрактант для эозинофилов и Т-Лц) (Mantovani A., et al., 2004, 2009). Исследование содержания провоспалительного хемокина MCP1, основного специфического хемоаттрактанта Мц и Т-Лц, в разных типах атеросклеротических поражений показало его высокое, но достоверно не различающееся содержание, во всех типах поражений кроме фиброзных и фиброкальцинозных, в которых уровень МСР1 был минимальным. Содержание провоспалительного хемокина CCL3 оказалось наиболее высоким в липидных пятнах/полосах и фиброатеромах. В первом случае содержание этого хемокина достоверно превышало его уровень 14 во всех остальных поражениях, во втором – только в фиброзных и фиброкальцинозных. Исследование распределения антивоспалительного хемокина CCL18, секретируемого всеми подтипами Мф М2 (Mantovani A., et al., 2004, 2009), выявило его самый высокий уровень в липидных пятнах/полосах. Анализ содержания антивоспалительного хемокина CCL24, секретируемого Мф М2а (Mantovani A., et al., 2004), выявил его высокий уровень в атеромах и осложненных поражениях, а минимальный – в фиброзных и фиброкальцинозных поражениях (табл. 4). Следует отметить, что данные о присутствии CCL24 во всех типах атеросклеротических поражений отличаются от результатов полученных ранее другими исследователями, по мнению которых содержание этого цитокина в плазме крови пациентов не связано с атерогенезом, так как не коррелирует с его клиническими проявлениями (Aukrust P. et al., 2008). Исследование содержания фактора роста TGFβ-1, обладающего антивоспалительным, иммуносупрессорным и фиброгенным действием, высокая продукция которого в основном обеспечивается активностью М2 Мф (Mantovani A., et al., 2004, 2009; Tedgui A., Mallat Z., 2006), позволило выявить его максимальный уровень в липидных полосах и осложненных поражениях. Высокое содержанием TGFβ-1 было обнаружено в атеромах и фиброзных поражениях, а минимальное – в фиброатеромах и фиброкальцинозных бляшках (табл. 4). Уровень белка CD14, основного маркера Мц, был достоверно выше в атеромах, фиброатеромах и осложненных бляшках по сравнению со стабильными фиброзными и фиброкальцинозными (табл. 4). Данный факт может свидетельствовать о постоянном поступлении в нестабильные бляшки Мц из кровотока. Аналогичное распределение было показано и для белка CD163, маркера М2с Мф. Минимальное его количество было в фиброзных и фиброкальцинозных бляшках, а максимальное – в осложненных поражениях. Этот факт подтверждает важное участие Мф регуляторного фенотипа М2с в таких поражениях. Их присутствие может быть связано с удалением гемоглобин-гаптоглобиновых комплексов, негативной регуляцией воспаления, синтезом IL-10 и TGFβ-1 и запуском репаративных процессов (Schaer C.A. et al., 2006; Philippidis P. et al., 2004). Данные, полученные в этой части работы, указывают на присутствие Мф М1 и М2 во всех типах атеросклеротических поражений (липидное пятно/полоса, атерома, фиброатерома, фиброзное, фиброкальцинозное и осложненное поражение) и проявление ими специфической функциональной активности. Об этом свидетельствуют данные о содержании в этих поражениях про- и антивоспалительных цитокинов, характерных для каждой из субпопуляций. Однако преобладание тех или иных групп цитокинов в разных типах поражений различно и может свидетельствовать о повышении функциональной активности одной из субпопуляций Мф и ее важной роли в таком типе поражения. Так, на начальной стадии атерогенеза – в липидных пятнах/полосах были выявлены высокие уровни как про- (IL-1β, IL-12, MCP1 и CCL3), так и антивоспалительных (CCL18 и TGFβ-1) цитокинов. Данный факт свидетельствует об активной инфильтрации интимы Мц/Мф, развитии воспалительной реакции и одновременной активации процесса репарации межклеточного матрикса, опосредованного действием факторов привлечения в очаг атерогенеза матрикс-синтезирующих клеток – модифицированных ГМК секреторного фенотипа и фибробластов (Libby P. et al., 2002). В атеромах выявлены высокие уровни провоспалительных факторов IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, MCP1 при и одновременном повышении содержания по сравнению с липидным пятном хемокина CCL24, секретируемого М2а Мф. Эти данные могут говорить об активизации М2а Мф на фоне продолжающейся интенсивной активности провоспалительных М1 Мф – такое изменение баланса цитокинов может вести к 15 хронизации процесса воспаления и прогрессии поражения в фиброатерому. В зрелой, потенциально нестабильной фиброатероме выявлены высокие уровни провоспалительных факторов IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, MCP1, секретируемых М1 Мф, и низкие – антивоспалительных CCL18, CCL24 и TGFβ-1, секретируемых М2 Мф. Такое соотношение факторов свидетельствует о преобладании активности в фиброатероме М1 Мф, поддерживающих процесс острого воспаления, который способствует разрушению межклеточного матрикса и дестабилизации поражения, вследствие чего может происходить разрыв покрышки, выброс атероматозных масс и формирование осложненного поражения – наиболее опасного в клиническом отношении. В осложненном поражении наряду с высокими уровнями некоторых провоспалительных цитокинов IL-6, IL-8, и MCP1, содержание IL-1β и IL-12 было сниженным по сравнению с фиброатеромами, а антивоспалительных – IL-10, CCL24, TGFβ-1 и белка CD163, характерных для М2 Мф – значительно более высоким по сравнению с атеромами и фиброатеромами. Все это свидетельствует об усилении процессов репарации, способствующих стабилизации поражения. Низкие уровни большинства цитокинов в фиброзных и фиброкальцинозных бляшках, повидимому, отражают слабую функциональную активность обеих субпопуляций Мф, что способствует сохранению их стабильного состояния. Исследование содержания факторов, участвующих в реорганизации межклеточного матрикса, в разных типах атеросклеротических поражений. В атеросклеротических поражениях помимо малочисленных эндотелиальных, ГМК, фибробластов и некоторых других клеток, именно Мф являются одним из основных источников факторов, участвующих в процессах реорганизации и деградации межклеточного матрикса (Newby A.C., 2008). В связи с этим в данной части исследования методом иммуноферментного анализа изучали содержание и распределение в указанных выше типах поражений важнейших металлопротеаз: MMP2, участвующей в инициации гидролиза коллагена I типа и коллагена базальных мембран IV типа, и MMP9, гидролизующей коллаген базальных мембран IV и V типов (Carbone G.L. et al., 2003; Newby A.C., 2005), а также их тканевых ингибиторов TIMP1 и TIMP2. Присутствие этих металлопротеаз в определенной степени отражает активность субпопуляций Мф: MMP2 в основном синтезируется М2 Мф, а MMP9 – преимущественно субпопуляцией М1 (Butcher M.J., Galkina E.V., 2012). Исследование содержания TIMP1, ингибитора металлопротеаз MMP1, MMP3 и MMP9 (Katsuda S., Kaji T., 2003; Newby A.C., 2005) в разных типах поражений выявило его низкий уровень в фиброзных и фиброкальцинозных бляшках по сравнению с другими типами АСБ (рис. 6А). В атеромах в среднем также наблюдался высокий уровень TIMP1, однако достоверных различий с остальными типами поражений выявлено не было. Аналогичное распределение было показано и для MMP9, максимальное количество которой было обнаружено в фиброатеромах и осложненных поражениях, особенно по сравнению с фиброзными (рис. 6А). В липидных пятнах/полосах, атеромах и фиброкальцинозных поражениях в среднем уровень MMP9 был низким и практически соответствовал таковому в фиброзных бляшках, однако достоверных различий с другими типами поражений выявлено не было. Высокое содержание в фиброатеромах и осложненных бляшках как TIMP1, так и MMP9 свидетельствует о влиянии деятельности М1 Мф на активную перестройку матрикса в данных поражениях. 16 Таблица 4. Содержание белков CD14 (маркер Мц), CD163 (маркер Мф М2с) и цитокинов – провоспалительных IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, MCP1, CCL3 и антивоспалительных– IL-10, CCL18, CCL24 и TGFβ-1, синтезируемых М1 и М2 Мф, в разных типах атеросклеротических поражений (M ± m). Мц и Мф Фактор CD14 13,6 ± 4,5 IL-1β IL-6 65 ± 50 45 ± 42 58 ± 29 164 ± 57 84 ± 14 90 ± 15 62 ± 30 142 ± 42 15 ± 4,7 12,7 ± 4,2 75 ± 17 69 ± 22 р3-4=0,003; р5-2=0,01; р5-3=0,002; р5-4=0,004 IL-8 119 ± 59 256 ± 133 243 ± 48 426 ± 175 42 ± 25 103 ± 22 р5-3=0,02; р5-4< 0,001; р5-6=0,04 IL-12 80,4 ± 65,3 71,1 ± 62 36,5 ± 11,7 6,5 ± 1,6 11,5 ± 6,9 30,3 ± 6,8 MCP1 874 ± 140 787 ± 347 1533 ± 304 766 ± 108 179 ± 45 594 ± 102 CCL3 148 ± 22 39 ± 18 103 ± 24 64 ± 12 23 ± 10 47 ± 10 CD163 IL-10 CCL18 66 ± 18 0,66 ± 0,5 29,5 ± 7,7 66 ± 18 0,88 ± 0,8 5,9 ± 1,0 85 ± 10 0,72 ± 0,2 7,3 ± 1,4 120 ± 19 1,85 ± 0,5 8,5 ± 1,75 35 ± 10 0,65 ± 0,6 3,7 ± 0,4 37 ± 6 0,32 ± 0,1 7,9 ± 1,0 CCL24 19,7 ± 13,0 100,7 ± 50,2 32,3 ± 11,4 87,7 ± 36,7 10,8 ± 9,9 15,3 ± 7,4 TGFβ-1 1344 ± 88 824 ± 416 766 ± 165 1242 ± 459 244 ± 171 1045 ± 190 р4-3=0,004; р4-6< 0,001 р5-1=0,003; р5-2=0,04 р6-3=0,03 р5-3= 0,001; р5-4=0,001; р5-6=0,02 р1-2=0,03; р1-4=0,04 р3-5=0,03; р3-6=0,02 р1-5=0,02; р1-6=0,01 р5-3= 0,002; р5-4< 0,001 р6-3< 0,001; р6-4< 0,001 р6-4=0,01 р1-2=0,03; р1-3=0,01; р1-4=0,02; р1-5=0,01; р1-6=0,005 р2-1=0,04; р2-3=0,04 р5-4=0,04 р6-3=0,02; р6-4=0,002 р2-5=0,02; р2-6=0,005 р1-3=0,01; р1-5=0,03 Мц М1 М2 (2) Типы поражений по H. Stary (1995) (3) (4) (1) Липидное пятно/полоса (n = 5) (5) (6) Фиброкал. (n = 7) Фиброзн. (n = 31) Содержание фактора*, pg/mg белка 28,2 ± 9,4 33,9 ± 4,0 31,2 ± 3,4 9,9 ± 2,2 13,2± 2,4 р5-2=0,02; р5-3= 0,002; р5-4< 0,001 р6-2= 0,04; р6-3< 0,001; р6-4=0,001 р3-5=0,03 р6-2=0,04; р6-3=0,02; р6-4=0,02 Атерома (n = 4) Фиброатер. (n = 26) Осложнен. (n = 22) Достоверность различий, для параметров с р< 0,05 р6-3=0,02; р6-4< 0,001 Примечания. *Содержание белков CD14, CD163 и хемокнина CCL18 указано в ng/mg белка. 60,0 90,0 MMP9 MMP2 TIMP1, с/10 TIMP2 45,0 60,0 * #* 45,0 #* ng/mg белка ng/mg белка 75,0 * 30,0 15,0 0,0 А Липидное пятно/полоса Атерома Фиброатерома Осложненное Фиброкальцинозное Фиброзное $ # $ ∆ # 30,0 # ∆ # ∆ # ∆ 15,0 0,0 Б Липидное пятно/полоса Атерома Фиброатерома Осложненное Фиброкальцинозное Фиброзное Рис. 6. Содержание металлопротеаз 2 и 9 и их матриксных ингибиторов 1 и 2 в разных типах атеросклеротических поражений. А – MMP9 и TIMP1, Б – MMP2 и TIMP2; * – различия достоверны по сравнению с фиброкальцинозным поражением; # – различия достоверны по сравнению с фиброзным поражением; ∆ – различия достоверны по сравнению с липидным пятном/полосой; $ – различия достоверны по сравнению с осложненным поражением, (p<0,05) 17 Исследование содержания TIMP2, основного ингибитора MMP2 и MMP14 (Katsuda S., Kaji T., 2003; Newby A.C., 2005), выявило его высокий уровень на начальных стадиях формирования атеросклеротического поражения (в липидном пятне/полосе, атероме) и, в меньшей степени в фиброатероме. Минимальное содержание его было обнаружено в фиброкальцинозных поражениях, особенно по сравнению с начальными стадиями развития АСБ (рис. 6Б). Также достоверно более низкий по сравнению с липидными пятнами/полосами и атеромами уровень TIMP2 был обнаружен в осложненных поражениях. Распределение MMP2 в разных типах поражений было сходно с распределением ее ингибитора TIMP2 (рис. 6Б). Максимальное содержание MMP2 было выявлено в липидном пятне/полосе. По мере прогрессии и развития осложненного поражения содержание MMP2 постепенно снижалось до минимального уровня в фиброкальцинозных АСБ, достоверно отличающегося от его уровня в липидных пятнах/полосах, атеромах и фиброатеромах. Результаты этой части исследования свидетельствуют об активных процессах перестройки межклеточного матрикса в ходе атерогенеза, идущих при участии обеих субпопуляций Мф, причем, судя по полученным данным, на начальном этапе развития АСБ основной вклад в этот процесс, по-видимому, вносят М2 Мф, а в выраженных нестабильных поражениях – М1 Мф. Количественное содержание TIMP1 и TIMP2 меняется в соответствии с изменением уровня содержания ингибируемых ими металлопротеаз. Корреляционный анализ содержания в атеросклеротических поражениях белковмаркеров Мц/Мф, цитокинов и факторов протеазно-антипротеазного баланса. Возможная роль субпопуляций М1 и М2 Мф в реорганизации межклеточного матрикса. Для получения дополнительной информации о возможной роли Мф М1 и М2 в формировании поражений, развитии осложнений или стабилизационных процессов был проведен корреляционный анализ по Спирману (см. «материалы и методы») содержания в бляшках исследованных выше факторов: протеазно-антипротеазного баланса – MMP2 и MMP9, TIMP1 и TIMP2, провоспалительных цитокинов IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, MCP1 и CCL3 (секретируемых М1 Мф), антивоспалительных факторов – CCL18, CCL24 и TGFβ-1 (характерных для М2 Мф) и маркерных белков Мц/Мф – CD14 и CD163. Анализ проводили для выраженных поражений: потенциально нестабильных фиброатером, в которых было выявлено повышенное содержание провоспалительных цитокинов; фиброзных бляшек, в которых было снижено содержание практически всех цитокинов и осложненных поражений. В последнем типе наряду с высоким содержанием большинства провоспалительных цитокинов были выявлены и высокие уровни антивоспалительных. Результаты корреляционного анализа представлены в табл. 5 и 6. Далее приведены только статистически достоверные корреляции (р<0,05). Во всех исследованных поражениях была выявлена умеренная и сильная положительная корреляционная связь между уровнем содержания белка CD14 – маркера Мц/Мф и факторов реорганизации межклеточного матрикса – металлопротеаз 2 и 9 и их ингибиторов TIMP1 и TIMP2 (табл. 5 и 6). Такая связь логично объясняет тот факт, что постоянный приток Мц из крови в область атеросклеротического очага требует активации факторов протеазно-антипротеазного баланса. Во всех исследованных поражениях для провоспалительных факторов IL-1β, IL-8, MCP1, CCL3 – показателей функциональной активности субпопуляции Мф М1, также была выявлена сильная и умеренная корреляционная связь с ММР2 и ММР9, TIMP1 и TIMP2 (табл. 5, 6). При этом не было выявлено корреляционной зависимости этих факторов с TGFβ, основным фиброгенным фактором. Полученные данные косвенно подтверждают участие субпопуляции Мф 18 М1, секретирующей эти провоспалительные факторы (Mantovani A. et al., 2009), в реорганизации тканевого матрикса, особенно в его деградации в атеросклеротических поражениях. Для показателей функциональной активности антивоспалительных Мф М2 (IL-10 и TGFβ-1, секретируемых всеми М2, а также CD163 – маркера М2с, и CCL24, секретируемого М2а) была выявлена более сложная картина корреляционных связей (табл. 5, 6). Так, в фиброатеромах показана умеренная отрицательная корреляционная связь TGFβ-1 с TIMP1 и сильная положительная связь CD163 с ММР9. В фиброзном поражении были выявлены сильные и умеренные корреляционные связи CD163 с TIMP1, IL-10 с TGFβ-1, а хемокина CCL24 с TGFβ-1, TIMP1 и TIMP2. В осложненных поражениях была выявлена умеренная положительная связь CD163 с TIMP2. Эти данные косвенно свидетельствуют о том, что деятельность субпопуляции Мф М2 также связана с реорганизацией тканевого матрикса, однако в отличие от Мф М1 ей в большей степени свойственна стимуляция его синтеза. Таблица 5. Корреляционный анализ содержания белков протеазно-антипротеазного баланса и показателей, характеризующих М1 и М2 Мф и Мц в фиброатероме и фиброзном поражении (R – коэффициент корреляции; для параметров, выделенных жирным шрифтом, он достоверен, р<0,05). Тип поражения Фиброатерома Фиброзное поражение Мц/Мф Мц Фактор CD14 IL-1β MCP1 CCL3 CD163 TGFβ-1 CD14 IL-8 MCP1 CCL3 CD163 IL-10 CCL24 TGFβ-1 MMP9 TIMP1 MMP2 0,0 0,7 0,4 0,5 0,3 0,4 0,5 0,3 0,5 0,6 0,1 0,1 0,4 0,5 0,7 0,0 0,4 0,6 0,1 0,4 0,3 0,7 0,4 0,2 0,1 1,0 0,1 -0,5 -0,2 0,0 0,1 0,5 0,8 0,1 0,4 -0,2 0,5 0,6 0,1 0,2 -0,2 0,6 0,5 0,2 0,2 -0,3 0,3 0,4 -0,3 0,1 0,3 0,4 0,8 0,1 0,3 0,5 0,2 0,1 -0,2 0,3 0,6 0,3 0,4 0,3 0,5 TIMP2 М1 М2 Мц М1 М2 Таблица 6. Корреляционный анализ содержания белков протеазно-антипротеазного баланса и показателей, характеризующих М1 и М2 Мф и Мц в осложнённом поражении (R – коэффициент корреляции, для параметров, выделенных жирным шрифтом, достоверен, р<0,05). Тип поражения Мц/Мф Фактор TGFβ-1 MMP9 TIMP1 MMP2 TIMP2 Осложнённое поражение Мц CD14 0,0 0,6 0,1 0,4 0,5 IL-1β -0,1 0,8 0,5 0,3 0,0 IL-8 -0,3 0,6 0,4 0,1 -0,1 М1 MCP1 -0,3 0,2 0,6 0,2 -0,2 CCL3 -0,3 0,6 0,4 0,1 0,1 М2 CD163 0,0 0,4 -0,2 0,1 0,6 Анализируя полученные результаты и сопоставляя их с данными литературы (Vega M.A., Corbí A.L., 2006; Mantovani A. et al., 2009; Butcher M.J., Galkina E.V., 2012), можно предположить, что обе субпопуляции Мф М1 и М2 проявляют свою активность в процессах ремоделирования межклеточного матрикса на различных стадиях формирования и реорганизации атеросклеротических поражений, однако деятельность М1 Мф преимущественно направлена на деградацию матрикса, а М2 – на регуляцию процессов его синтеза. Заключение Результаты настоящего исследования, полученные при изучении шести основных типов атеросклеротических поражений сонных артерий человека, свидетельствуют об участии и важной роли как про-, так и антивоспалительной субпопуляции Мф в процессах инициации и прогрессивного развития, а также перестройки и дестабилизации атеросклеротических поражений. 19 В начальном атеросклеротическом поражении (липидное пятно/полоса) деятельность Мф М1 и М2 обеспечивает процессы, необходимые для элиминации липопротеидов в стенке сосуда. Факторы, выделяемые М1 Мф, направлены на усиление хемотаксиса клеток воспаления, в первую очередь Мц, их дифференцировку и активацию в про- и антивоспалительные Мф. Таким образом, Мф с фенотипом М1 необходимы для поддержания воспалительного процесса, в то время как Мф М2, напротив – для его подавления и стимуляции процессов синтеза и реорганизации соединительнотканного матрикса. В совокупности эти процессы могут обеспечить прогрессию поражения. Усиление функциональной активности М2 Мф в атеромах обеспечивает, с одной стороны, хронизацию процесса, а с другой – относительную стабильность таких поражений и прогрессивное развитие до фиброатеромы. Напротив, доминирование функциональной активности М1 Мф в фиброзных покрышках фиброатером свидетельствует об обострении воспалительного процесса в них, обусловленного активными перестройками фиброзного матрикса с преобладанием процессов его деградации над синтезом. Это может служить препятствием для фиброзирования атеросклеротического поражения и вести к его дестабилизации, и как следствие – к разрыву покрышки, тромбозу и образованию нестабильного осложненного поражения. Однако в осложненном поражении наряду с усиленной функциональной активностью М1 Мф может происходить усиление активности и М2 Мф, в частности подтипа М2с, которые, с одной стороны, обеспечивают удаление из межклеточного матрикса гемоглобин-гаптоглобиновых комплексов, образовавшихся в результате кровоизлияния внутрь бляшки, а с другой – инициируют запуск антивоспалительного ответа, способствующего репарации поврежденной артериальной стенки и сохранению ее целостности. Деятельность таких клеток в осложненном поражении направлена на уравновешивание деятельности М1 Мф и способствует стабилизации такого типа поражения. Снижение объема лейкоцитарного инфильтрата, представленного Т-Лц, Мц, М1 и М2 Мф, с одной стороны, и снижение функциональной активности обеих субпопуляций Мф, с другой, характеризует фиброзные и фиброкальцинозные поражения, обеспечивая их стабильное состояние. Таким образом, неустойчивый баланс между проявлением функциональной активности двух фенотипически полярных субпопуляций Мф существенно влияет на процессы формирования атеросклеротического поражения, поддержание его устойчивого состояния и развитие осложнений, имеющих клиническое значение. ВЫВОДЫ 1. Во всех типах атеросклеротических поражений сонных артерий человека обнаружены в разных количественных соотношениях Мф М1 (MCP1+-клетки) и М2 (CD206+- и CD163+-клетки), а также секретируемые ими про- (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, MCP1, CCL3) и антивоспалительные факторы (IL-10, CCL18, CCL24, TGFβ-1). 2. На ранней стадии развития поражения (липидное пятно/полоса) суммарное число Мф М2 превышает число М1 более, чем в два раза, а подтипы Мф М2а (CD206 +) и М2с (CD163+) представлены в равных долях. 3. В выраженных атеросклеротических поражениях (атеромы, фиброатеромы, осложненные, фиброзные и фиброкальцинозные) в областях богатых внеклеточными липидами, пенистыми клетками и лейкоцитарным инфильтратом, локализуются в основном Мф М1, а в фиброзных областях преобладают М2. Мф М1 и М2 значительно интенсивнее инфильтрируют фиброзные покрышки атером, фиброатером и осложненных поражений. Не обнаружено достоверных отличий в содержании Мф М1 и М2 в плечах атеросклеротических поражений различных типов. 20 4. На ранней стадии развития поражения (липидное пятно/полоса) выявлены высокие уровни содержания как про- (IL-1β, IL-12, MCP1, CCL3), так и антивоспалительных (CCL18 и TGFβ-1) цитокинов. 5. В выраженных атеросклеротических поражениях обнаружены: в атеромах – высокие уровни цитокинов, секретируемых Мф М1 (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, MCP1) и М2 (CCL24), в зрелой фиброатероме – М1 (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, MCP1, CCL3), в осложненных поражениях – М1 (IL1β, IL-6, IL-8, и MCP1) и М2 (IL-10, CCL24, TGFβ-1). В фиброзных и фиброкальцинозных поражениях выявлены низкие уровни как про- (IL-6, IL-8, IL-12, CCL3), так и антивоспалительных (IL-10, CCL18, CCL24) цитокинов. 6. Во всех типах атеросклеротических поражений выявлена положительная корреляционная связь (от сильной до умеренной) между содержанием факторов реорганизации межклеточного матрикса (MMP2, MMP 9, TIMP1, TIMP2) и содержанием про- (IL-1β, IL-8, MCP1, CCL3) или антивоспалительных (IL-10, CCL24, TGFβ-1) цитокинов, секретируемых Мф М1 или М2, соответственно. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах, соответствующих перечню ВАК РФ В.С. Шишкина, С.В. Каширина, В.Н. Сироткин, О.П. Ильинская, Э.М. Тарарак. Морфометрический анализ атеросклеротических бляшек сонных артерий человека // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2011. № 1. С. 577-580. Л.Р. Токлуева, Т.В. Балахонова, В.С. Шишкина, Т.В. Ваховская, Е.Ю. Страздень, М.А. Шария, М.М. Лукьянов, М.С. Рудас, Н.В. Радюхина, Э.М. Тарарак, С.А. Бойцов. Сравнительная характеристика результатов инструментальных методов исследования и гистохимического анализа каротидной атеросклеротической бляшки у асимптомных больных с выраженным атеросклерозом // Ультразвуковая и функциональная диагностика. 2012. №. 6. С. 70-76. Токлуева Л.Р., Балахонова Т.В., Страздень Е.Ю., Шария М.А., Лукьянов М.М., Радюхина Н.В., Шишкина В.С., Тарарак Э.М., Бойцов С.А. Возможности инструментальных методов диагностики нестабильных атеросклеротических бляшек каротидных артерий // Ангиология и сосудистая хирургия. 2013. Т. 19. №. 3. С. 37-44. В.С. Шишкина, Л.Р. Токлуева, С.В. Каширина, Н.В. Радюхина, О.П. Ильинская, В.В. Ахметов, И.П. Михайлов, А.В. Троицкий, Т.В. Балахонова, Е.Ю. Страздень, М.А. Шария, М.М. Лукьянов, С.А. Бойцов, Э.М. Тарарак. Сопоставление морфологических особенностей атеросклеротических бляшек сонных артерий и клинико-инструментальных данных у симптомных и асимптомных пациентов с выраженным каротидным атеросклерозом // Кардиология. 2013. №. 4. С. 36-42. В.С. Шишкина, О.П. Ильинская, М.А. Челомбитько, Т.В. Васильева, А.В. Федоров, Э.М Тарарак. Топографическое распределение и возможная роль про- и антивоспалительных субпопуляций макрофагов в разных типах атеросклеротических поражений // Морфологические ведомости. 2014. №. 3. С. 74-85. М.А. Челомбитько, В.С. Шишкина, О.П. Ильинская, А.И. Каминный, Т.О. Павлунина, Н.Н. Самовилова, Е.В. Грачева, Э.М. Тарарак, Н.В. Проказова. Цитофлуориметрическое изучение мембранных рафтов на субпопуляциях моноцитов человека при атеросклерозе // Acta Naturae. 2014. Т. 6. №. 4 (23). С. 6-14. В.С. Шишкина, М.А. Челомбитько, Ю.Е. Ефремова, А.В. Федоров, О.П. Ильинская, Э.М. Тарарак. Цитокины про- и антивоспалительной субпопуляций макрофагов и их значение в формировании и стабилизации атеросклеротических бляшек в сонных артериях человека // Кардиологический вестник. 2014. Т. IX. №. 4. С. 62-72. 21 Тезисы докладов и материалов конференций 1. В.С. Шишкина, С.В. Каширина. Морфометричекий анализ нестабильности атеросклеротических бляшек. Тезисы докладов XVI международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов – 2009». Секция «биология». Москва: Макс Пресс. 2009. С. 259. 2. В.С. Шишкина, С.В. Каширина. Анализ нестабильности атеросклеротических поражений сонных артерий человека методом гистоморфометрии. Сборник научных работ студентов и молодых ученых Всероссийской конференции с международным участием «Актуальные вопросы медицинской науки», посвященный 65-летию ЯГМА.- Ярославль, 2009. С. 107. 3. В.С. Шишкина, С.В. Каширина. Исследование морфологических особенностей стабильных и нестабильных атеросклеротических поражений сонных артерий в сопоставлении с УЗДГ обследованием, неврологическим статусом пациента в анамнезе и цитокиновым профилем плазмы. Тезисы докладов XVII международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов – 2010». Секция «биология». Москва: Макс Пресс. 2010. С. 308-309. 4. В.С. Шишкина, С.В. Каширина. Исследование морфологических особенностей стабильных и нестабильных атерослеротических поражений сонных артерий в сопоставлении с УЗДГ обследованием и неврологическим статусом пациента в анамнезе. Сборник тезисов XVI межгородской конференции молодых учёных. Актуальные проблемы патофизиологии. Санкт-Петербург: СПбГМУ. 2010. С. 188-189. 5. С.В. Каширина, В.С. Шишкина. Сравнительный морфологический анализ атеросклеротических поражений сонных артерий больных с различным неврологическим статусом в сопоставлении с клиническими данными. Сборник тезисов XVI межгородской конференции молодых учёных. Актуальные проблемы патофизиологии. Санкт-Петербург: СПбГМУ. 2010. С.73-74. 6. Shishkina V.S., Kashirina S.V., Sirotkin V.N., Andreeva E.R., Ilyinskaya O.P., Tararak E.M. Correlation study of morphological features of silent and vulnerable plaques vs clinical parameters of patience after carotid endarterectomy. 78th European Atherosclerosis Society Congress (Hamburg, Germany, 2010 Atherosclerosis Society Congress, Hamburg, Germany, June 20-23 2010. Atherosclerosis Supplements. Abstracts of 78th EAS Congress 2010. V. 11. №. 2. P. 195, Abstract # MS421. 7. Kashirina S.V., Shishkina V.S., Andreeva E.R., Ilyinskaya O.P., Radukhina N.B., Ahmetov V.V., Tararak E.M. Comparative study of carotid plaques of patients after endarterectomy procedure. 78th European Atherosclerosis Society Congress, Hamburg, Germany, June 20-23 2010. Atherosclerosis Supplements. Abstracts of 78th EAS Congress 2010. V. 11. №. 2. P. 186, Abstract # MS377. 8. Шишкина В.С. Иммуноферментный анализ распределения про- и антивоспалительных факторов в атеросклеротических бляшках сонных артерий человека. Тезисы докладов XVIII международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов – 2011». Секция «биология». Москва: Макс Пресс. 2011. С. 285. 9. V. Shishkina, S. Kashirina, E. Kosenkov, V. Masenko, V. Sirotkin, V. Ahmetov, I. Mikhailov, O. Ilyinskaya, E. Tararak. Investigation of distributional pecularities of cytokines and MMP2, MMP9 and TIMP1/2 in endarterectomy plaques. XVI International Symposium on Atherosclerosis – ISA2012, Sydney, Australiya, March 25-29 2012). Abstract # 228. 10. Шишкина В.С., Челомбитько М.А. Особенности продукции про- и антивоспалительных цитокинов макрофагами субпопуляций М1 и М2 при атерогенезе. Тезисы докладов XX международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов – 2013». Секция «биология». Москва: Макс Пресс. 2013. С. 161-162. 11. Shishkina V.S., Chelombitko M.A., Ilyinskaya O.P., Tararak E.M. Distribution of M1 and M2 macrophages subpopulations in different types of carotid atherosclerotic plaques. 81st European 22 Atherosclerosis Society Congress, Lyon, France, June 2-5 2013. Abstract # 1391. http://w3.kenesgroup.com/apps/eas2013/abstracts/pdf/1391.pdf 12. Shishkina V., Pavlunina T., Chelombitko M., Gracheva E., Kaminnyi A., Romanov Y., Samovilova N., Prokazova N.. Differential expression GM1, marker of lipid rafts, in human monocyte subpopulations may be involved the pathogenesis of atherosclerosis. 81st European Atherosclerosis Society Congress, Lyon, France, June 2-5 2013. Abstract #565. http://w3.kenesgroup.com/apps/eas2013/abstracts/pdf/565.pdf СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АСБ – атеросклеротическая бляшка ГМК – гладкомышечная клетка Лц – лимфоцит Мц – моноцит Мф – макрофаг М1 – провоспалительные макрофаги М2 – антивоспалительные макрофаги CCL – хемокины CD – кластер дифференцировки IL – интерлейкин MCP – (monocyte chemotactic protein) хемотаксический белок моноцитов MMP – (matrix metalloproteinase) матриксная металлопротеаза TIMP – (tissue inhibitor of metalloproteinases) тканевой ингибитор металлопротеаз пр 23
