Использование L-аргинина и ингибиторов образования оксида азота

Иммунопатология, аллергология, инфектология
Immunopathology, allergology, infectology
2004,№3: 14–17
ИММУНОМОДУЛЯЦИЯ
Использование L-аргинина и ингибиторов образования оксида азота
для коррекции воспалительного процесса в мозге крыс при его
ишемии-реперфузии
Н. Е. Максимович
Гродненский государственный медицинский университет, Гродно, Беларусь
Modulations of nitmc oxide formation and inflammation in brain with ischemiareperfusion
N. E. Maksimovich
Grodno State Medical University, Belarus
Аннотация
Summary
В экспериментах у 128 крыс с субтотальной ишемией-реперфузией головного мозга исследовали степень гидратации мозга и активность миелопероксидазы в условиях
модуляции «L-Аргинин-МО». При использовании L-Аргинина, а также ингибиторов NO-синтазы (NOS): неселективного ингибитора Nco-nitro-L-Arginine Methylester,
селективного ингибитора нейрональной NOS 7-nitroIndazole и селективного ингибитора индуцибельной NOS
S-Methylisothiourea установлен NO-зависимый характер
изменений степени отека мозга и активности миелопероксидазы в мозговой ткани у крыс с субтотальной ишемией-реперфузией головного мозга. В ранний период
ишемии-реперфузии головного мозга роль повышение
степени гидратации мозга и активности миелопероксидазы в мозговой ткани связано с образованием NО при участии нейрональной, а в поздний период — индуцибельной N0-синтазы. Nou-nitro-L-Arginine Methylester, как
ингибитор всех изоформ NOS, включая эндотелиальную
NOS, обладает провоспалительными свойствами. L-Аргинин в сочетании с 7-nitro-Indazole и S-Methylisothiourea
оказывает наиболее выраженный антивоспалительный
эффект. Полученные данные позволяют предположить,
что оксид азота, образуемый при участии эндотелиальной NO-синтазы при ишемии-реперфузии головного
мозга у крыс, обладает антивоспалительными свойствами.
Brain oedema and myeloperoxidase activity in rats with brain
ischaemia-reperfusion and modulation of pathway «LArginine-NO» were studied in experiments.
We used L-Arginine and inhibitors of the NO-synthasa:
nonselective inhibitor Nco-nitro-L-Arginine Methylester,
selective inhibitors of neuronal NO-synthasa — 7-nitroIndazole and selective inhibitor of inducible NO-synthasa —
S-Methylisothiourea. We found, that increase of brain
oedema and myeloperoxidase activity in rats brain observed
in both periods is mediated via NO: in the early period of
brain ischemia-reperfusion it depends on neuronal NOsynthasa and in late period — on inducible NO-synthasa.
Morever, nonselectove inhibitor of all isoforms of NOsynthasa (including endothelial NO-synthasa) Nco-nitro-LArginine Methylester possesses proinflammation properties.
On the other hand, L-Arginine in combination with 7nitro-Indazole and S-Methylisothiourea induces maximal
antiinflammation effect.
These data allow us to suppose that endothelium-derived
NO decrease oedema and myeloperoxidase activity in rats with
ischemia-reperfusion of brain.
Ключевые слова
Keywords
Головной мозг, ишемия-реперфузия, оксид азота, отек,
миелопероксидаза.
Brain, ischaemia-reperfusion, nitric oxide, oedema,
myeloperoxidase.
Одним из основных звеньев патогенеза ишемических и реперфузионных повреждений головного мозга
является воспаление [1, 2, 3]. Воспалительный процесс
при ишемии-реперфузии головного мозга (И/РГМ)
проявляется экссудативными явлениями с выраженной лейкоцитарной инфильтрацией, приводя к смер-
ти в ишемический или в постишемический (реперфузионный) периоды. Уменьшение экссудативных процессов и лейкоцитарной инфильтрации при воспалении является важным направлением разработки патогенетической терапии повреждений головного мозга
при реперфузионных повреждениях головного мозга.
14
Immunopathology, Allergology, Infectology 2004 N° 3
Иммуномодуляция: Использование L-аргинина и ингибиторов образования оксида азота…
Поиск решения данной проблемы в значительной
степени базируется на выяснении роли оксида азота
(N0) в реализации различных реакций воспалительного процесса [1, 4]. Активно дискутируется вопрос как
о про-, так и об антивоспалительных его эффектах.
Эффекты N0 при воспалении могут быть реализованы
через изменение проницаемости сосудов, снижение сосудистого тонуса, адгезии лейкоцитов, модуляцию цитотоксических эффектов лейкоцитов (преимущественно макрофагов), пролиферативных и регенерационных процессов [5, 6]. Многообразие эффектов NО
объясняется его образованием в различных структурах нитроксидергической системы головного мозга
(нейроцитах, глии, сосудистом эндотелии, лейкоцитах
и тромбоцитах) [7]. Образование NО происходит при
участии различных изоформ NO-синтаз (NOS): эндотелиальной NOS (eNOS), нейрональной NOS (nNOS)
и индуцибельной NOS (iNOS). Оксид азота, образованный каждой из изоформ NOS, участвует в регуляции NO-зависимых механизмов функционирования
мозга и в выполнении мозгом определенных функций
[7]. Известно, что NО эндотелиального происхождения
участвует в механизмах артериальной гиперемии, как
одной из сосудистых реакций при воспалении. Образованный в избыточном количестве NО может явиться
причиной повышения проницаемости сосудистой
стенки и усиления экссудативных реакций, а его недостаток — активирует адгезию лейкоцитов к сосудистому эндотелию и их эмиграцию в окружающую
ткань. Воспалительный процесс обычно связывают с
возрастанием активности iNOS, способной обеспечить образование высоких концентраций NО [3].
Однако вопрос о роли NО, образуемого при участии других (нейрональной и эндотелиальной) изоформ NOS, в механизмах воспаления при И/РГМ
изучен недостаточно. В связи с чем целью работы
явилось исследование образования отёка и инфильтрации ткани мозга лейкоцитами у крыс при его
ишемии-реперфузии в условиях модуляции пути «LАргинин- NO» и обоснование возможности использования модуляторов образования оксида азота для
коррекции воспалительного процесса в мозге крыс
при его ищемии-реперфузии.
Материалы и методы исследований
Исследования выполнены на 128 белых беспородных крысах-самцах (8 групп, n=16) массой 220–
250 г. И/РГМ моделировали путем 30-ти минутной
окклюзии общих сонных артерий с последующей
реперфузией (2–8 группы) в условиях внутривенного тиопенталового наркоза (60 мг/кг) [8]. Животные каждой группы были разделены на 2 подгруппы:
в первой подгруппе (п=8) забор головного мозга для
исследований производили в ранние (через 30 минут), а во второй подгруппе (n=8) — в поздние (через 24 часа) сроки И/РГМ.
Крысам первой группы (ложно оперированные,
контроль 1) вводили 0,5 мл изотонического раствора NaCl. Крысам второй группы (И/РГМ, контроль
2) вводили 0,5 мл изотонического раствора NaCl. У
Иммунопатология, Аллергология, Инфектология 2004 N° 3
животных остальных 3–8 групп с И/РГМ производили коррекцию «L-Apraнин-NO» пути. Крысам третьей группы внутривенно вводили субстрат N08 LАргинин (150 мг/кг), четвертой группы — неселективный ингибитор NOS Nro-nitro-L-Arginine Methyl
Ester (L-NAME, 5мг/кг), пятой группы — селективный ингибитор nNOS 7-nitro-Indazole (7-NI, 10 мг/
кг), шестой группы — селективный ингибитор iNOS
S-Methylisothiourea (S-MT, 1 мг/кг), седьмой группы — 7-NI и S-MT, восьмой группы — 7-NI и S-МТ
и L-Аргинин в аналогичных дозах. Препараты вводили непосредственно после окклюзии общих сонных артерий внутривенно.
Степень гидратации мозга (ГМ) определяли гравиметрически [9]. Степень инфильтрации мозга лейкоцитами оценивали по активности миелопероксидазы
(АМП) в супернатанте гомогената мозга классическим
методом на спектрофотометре (Beckman) и выражали как скорость абсорбции на 1 мг белка [10]. Полученные данные обрабатаны методами вариационной
статистики с использованием t-критерия Стьюдента.
Результаты и их обсуждение
У крыс 2-й группы после 30-ти минутной И/РГМ
степень ГМ увеличилась до 71,9±0,19 % в ранний реперфузионный период (в контроле 1–70,2±0,20 %,
р<0,001) и до 72,6±0,19 % — в поздний реперфузионный период (в контроле 1–70,1±0,22 %, р<0,001). АМП
также повысилась в ранний реперфузионный период
до 143±9,0/мгР1/мин. (62±1,9/мгР1/мин., р<0,001), а
после 24-х часовой реперфузии — до 207±8,7/мгР1/
мин., что значительно выше, чем в группе контроль 1
(67±6,9/мгРУмин., р<0,001).
В дальнейшем сравнительный анализ изучаемых показателей будет осуществляться между их значениями в
каждой из 3–8 групп и значениями во 2-й группе.
Введение L-Аргинина (группа 3) привело к снижению содержания воды в ткани мозга в ранний период реперфузии (до 70,8±0,31 %, р<0,05), в то время как
в поздний реперфузионный период изменений не наблюдали (71,1±0,37 %, р>0,05). АМП ткани мозга
уменьшилась в ранний период реперфузии — до
108±8,6/мгР1/мин. (р<0,05), а в поздний — до 181±7,7/
мгР1/мин. (р<0,05). Результаты, полученные при введении L-Аргинина, свидетельствуют о его антивоспалительных эффектах при И/РГМ.
При введении L-NAME (4-я группа) содержание
воды в мозге не изменилось, составив в ранний период И/РГМ 71,3±0,37 % (р>0,05), а в поздний период — 73,0±0,22 % (р>0,05). Однако в оба периода И/
РГМ произошло увеличение АМП: в ранний — до
174±6,8/мгР1/мин. (р<0,05), а в поздний период — до
245±9,2/мгР1/мин. (р<0,05). Выявленное при введении L-NAME увеличение инфильтрации ткани мозга лейкоцитами в оба периода И/РГМ свидетельствует о его провоспалительных эффектах.
Введение 7-NI крысам с И/РГМ (5-я группа) не
изменило ГМ в ранний (71,2±0,38 %, р>0,05) и в поздний (71,8±0,22 %, р>0,05) периоды И/РГМ. Однако АМП уменьшилась в ранний период (до 108±9,0/
15
Н. Е. Максимович
мгР1/мин., р<0,05) и не изменилась в поздний период И/РГМ (206±6,1/мгР1/мин., р>0,05). Данные результаты свидетельствуют о зависимости инфильтрации ткани мозга лейкоцитами в ранний период И/
РГМ от активности nNOS.
Введение крысам S-MT (6-я группа) только в поздний период И/РГМ привело к уменьшению ГМ (до
71,6±0,27 %, р<0,05) и АМП (до 168±6,7/мгР1/мин.,
р<0,001), в то время как в ранний период эти показатели не изменились (71,3±0,35 %, р>0,05, и АМП
138±2,4/мгР1/мин., р>0,05 соответственно). Данные результаты свидетельствуют об участии образуемого
iNOS оксида азота в реализации воспалительных реакций только в поздний период И/РГМ. Источниками
iNOS в мозговой ткани наряду с макрофагальными
клетками являются эндотелиальные клетки [11] и
тромбоциты [12], нейроциты [13]. Согласно данным
литературы активность iNOS в ранний реперфузионный период отсутствует [3].
Сочетанное введение 7-NI и S-MT (7-я группа) привело к снижению степени ГМ (до 70,6±0,38 %, р<0,05) и
АМП (110+5,3/мгРУмин., р<0,05) в ранний и в поздний
периоды И/РГМ (до 70,8±0,30 %, р<0,05 и до 146±12,8/
мгР1/мин., р<0,05 соответственно). На фоне сочетанной
селективной блокады nNOS и iNOS не выявлено различий изучаемых показателей по сравнению с их значениями в группе 5 (с введением 7-NI) в ранний и в группе с
введением S-MT в поздний реперфузионные периоды.
Сочетанное введение с 7-NI, S-MT и L-Аргинина (8я группа) привело к уменьшению степени ГМ в ранний
период (до 70,1 ±0,27 %, р<0,001) и в поздний период
(до 71,6±0,27 %, р<0,05). Кроме того в данной группе
наблюдали выраженное снижение АМП (до 91±9,3/
мгР1/мин., р<0,05) — в ранний и (до 134±5,4/мгРУмин., р<0,001) — в поздний реперфузионный периоды.
Важно отметить, что у животных данной группы содержание в мозге воды не отличалось от содержания
воды в данный период в других группах. Однако
уменьшение АМП у крыс этой группы только поздний
реперфузионный период было достоверно более значительным, чем в группе крыс, получавших L-Аргинин (р<0,001), а различия АМП ткани мозга, продолжали сохраняться по сравнению с ее значением АМП
в группе ложно оперированных крыс (р<0,001).
В результате проведенных исследований у крыс с И/
РГМ выявлены признаки отека головного мозга и увеличения инфильтрации ткани мозга лейкоцитами в
оба реперфузионные периода, причем в поздний период И/РГМ данные изменения были более выраженными. Эксперименты с введением модуляторов пути «LАргинин-NO» показали NO-зависимый характер воспалительного процесса в ткани мозга при его ишемии-реперфузии. Введение L-Аргинина привело к
уменьшению выраженности гидратации мозга в ранний, а инфильтрации мозга лейкоцитами — в поздний
реперфузионные периоды. Реализация антивоспалительных свойств L-Аргинина может быть связана с
эффектами образующегося из него оксида азота [4].
16
Эксперименты с введением крысам с ИГМ ингибитора nNOS 7-NI свидетельствует об участии N0
нейронального происхождения в реализации изучаемых реакций воспаления в раннюю стадию И/РГМ.
Выявленное снижение ГМ и АМП при введении ингибитора iNOS S-MT в поздний реперфузионный
период свидетельствует об определяющей роли N0,
образованного iNOS, в патогенезе изучаемых реакций воспаления в поздний период И/РГМ. Введение
L-NAME, необратимо ингибирующего нейрональную и эндотелиальную NOS, увеличило инфильтрацию мозга лейкоцитами в оба реперфузионные периода, но не изменило степень гидратации мозговой
ткани. Предполагается, что причиной возрастания
инфильтрации лейкоцитами ткани мозга в ранний
период И/РГМ является подавление образования
эндотелиального NО, обладающего, как известно,
антиадгезивными свойствами [1, 2]. В поздний реперфузионный период усиление выраженности инфильтрации мозга лейкоцитами можно рассматривать как результат обратимого ингибирующего эффекта L-NAME в отношении iNOS. Образование при
участии iNOS больших количеств NО может выступать причиной повреждения эндотелия сосудов, как
фактора, способствующего эмиграции лейкоцитов в
ишемизированную ткань головного мозга крыс [3].
Комплексный анализ изменения гидратации мозга
и его инфильтрации лейкоцитами при изолированном
и сочетанием способах введения модуляторов пути «LАргинин-МО» свидетельствует об NO-зависимых механизмах изучаемых реакций воспалительного процесса в ткани мозга крыс: образовании отека и инфильтрация тканей лейкоцитами. В ранний период в реализации воспалительных реакций принимает участие
NО, образованный при участии нейрональной изоформы NOS. NО, образуемый при участии индуцибельной NOS, активирует сосудистые и зависимые
от лейкоцитов механизмы воспаления только в поздний период И/РГМ. Кроме того результаты экспериментов дают основание сделать предположение
об антивоспалительной роли N0, образованного при
участии эндотелиальной NOS.
Заключение
Таким образом, проведенные эксперименты с
использованием различных модулятов образования
оксида азота в эксперименте у крыс с И/РГМ обосновывают возможность коррекции неблагоприятных последствий воспалительного процесса у них
путем целенаправленного воздействия на изоформы
NO-синтаз, роль которых в реализации изучаемых
воспалительных реакций в различные периоды реперфузионного синдрома неоднозначна. В соответствии с полученными результатами профилактика и
терапия воспалительного процесса при И/РГМ должна быть патогенетически обоснованной и включать препараты с селективными механизмами коррекции пути «L-Apraнин-NO».
Immunopathology, Allergology, Infectology 2004 N° 3
Иммуномодуляция: Использование L-аргинина и ингибиторов образования оксида азота…
Литература
1. Higuchi H., Granger D.N., Saito H., Kurose I. Assay of
antioxidant and antiinflammatory activity of nitric oxide in
vivo. Methods in Enzymology.-1999.- V.301: 424–436.
8. Hossman К. A. Experimental models for the investigation
of brain ischemia. Cardiovascular Resarch 1998; Vol.39: 106–
120.
2. Kubes P., Suzuki M., Granger D.N. Nitric oxide: an
endogenous modulator of leukocyte adhesion. Proc. Natl. Acad.
Sci USA.-1991.-V.88: 4б51–4б55.
9. Pearce M. L., Yamashita J., Beazell J. Measurement of
pulmonary edema. Circ. Res. 1965.- V. 16: 482–488.
3. ladecola С., Zhang F., Casey R., dark Н. В., Ross M. Е.
Inducible nitric oxide synthase gene expression in vascular cells
after transient focal cerebral ischemia. Stroke.- 1996.- 27(8):
1373–1380.
10. Bradley P.P., Priebat D.A., Christensen R.D., et al.
Measurement of cutaneus inflammation: estimation
ofneutrophil content with an enzyme marker. J. Invest.
Dermatol. 1982.- V. 78: 206–209.
4. Granger D. N., Kubes P. Nitric oxide as antiinflammatory
agent. Methods in Enzymology. 1996.-V.269: 434–442.
11. Lamas S., Michel Т., Brenner B. M., Marsden P. A.: Nitric
oxide synthesis in endothelial cell: evidens for pathway
inducible by TNF-a. Am. J. Physiol. 1991; 261: 634–641.
5. Langrehr J. M., Hoffman R. A., Lancaster J. R., Simmons R.
L. Nitric oxide — a new endogenous immunomodulator.
Transplantation.- 1993.- V. 55.- № 6: 1205–1212.
6. Laroux F.S., Pavlick K.P., Hines I.N. Role of nitric oxide in
inflammation. Acta Physiologica Scandinavica.-2001.-V. 173(1):
113–118.
7. Максимович Н. Е. Понятие о нитроксидергической
системе мозга. Роль нейрональных источников. Журн.
ГрГМУ 2003; №4: 7–11.
Иммунопатология, Аллергология, Инфектология 2004 N° 3
12. Mehta J.L., Chen L.Y., Kone B.C., Mehta P., Turner P.
Identification of constitutive and inducible forms of nitric
oxide synthase in human platelets. J. Lab. Clin. Med.-1995.125: 370–377.
13. Heneka M. Т., Galea Е., GavriluykV., et al. Noradrenergic
Depletion Potentiates P-Amyloid-Induced Cortical
Inflammation: Implications for Alzheimer’s Disease. The
Journal of Neuroscience. 22(7): 2434–2442. 2002.
17