Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð ÌÈÍÈÑÒÅÐÑÒÂÎ ÇÄÐÀÂÎÎÕÐÀÍÅÍÈß ÐÅÑÏÓÁËÈÊÈ ÁÅËÀÐÓÑÜ Ðàçðåøåíî Ìèíçäðàâîì Ðåñïóáëèêè Áåëàðóñü äëÿ ïðàêòè÷åñêîãî èñïîëüçîâàíèÿ Ïåðâûé çàìåñòèòåëü ìèíèñòðà çäðàâîîõðàíåíèÿ, ïðåäñåäàòåëü êîìèññèè ïî ñïîñîáàì ïðîôèëàêòèêè, äèàãíîñòèêè, ëå÷åíèÿ è îðãàíèçàöèîííûì ôîðìàì ðàáîòû ÌÇ ÐÁ __________________ Â.Ì. Îðåõîâñêèé 28 ôåâðàëÿ 2001 ã. Ðåãèñòðàöèîííûé ¹ 160-0011 ÈÑÑËÅÄÎÂÀÍÈÅ ÖÈÒÎÒÎÊÑÈ×ÍÎÑÒÈ ÃÅÏÀÒÎÒÐÎÏÍÛÕ ÏÐÅÏÀÐÀÒÎÂ Ñ ÈÑÏÎËÜÇÎÂÀÍÈÅÌ ÊËÅÒÎ×ÍÛÕ ÊÓËÜÒÓÐ (èíñòðóêöèÿ ïî ïðèìåíåíèþ) Ó÷ðåæäåíèå-ðàçðàáîò÷èê: Âèòåáñêèé ãîñóäàðñòâåííûé ìåäèöèíñêèé óíèâåðñèòåò Àâòîðû: À.À. ×èðêèí, Å.Î. Äàí÷åíêî 1 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð Îãëàâëåíèå ÏÎÊÀÇÀÍÈß Ê ÏÐÈÌÅÍÅÍÈÞ .................................................................................................................. 4 ÏÅÐÅ×ÅÍÜ ÍÅÎÁÕÎÄÈÌÎÃÎ ÎÁÎÐÓÄÎÂÀÍÈß................................................................................... 4 ÎÏÈÑÀÍÈÅ ÒÅÕÍÎËÎÃÈÈ ÈÑÏÎËÜÇÎÂÀÍÈß ÌÅÒÎÄÀ ............................................................... 12 ÂÎÇÌÎÆÍÛÅ ÎÑËÎÆÍÅÍÈß È ÎØÈÁÊÈ.......................................................................................... 22 ÏÐÎÒÈÂÎÏÎÊÀÇÀÍÈß Ê ÏÐÈÌÅÍÅÍÈÞ ........................................................................................... 22 2 Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð Ãåïàòîïðîòåêòîðû ïðåïàðàòû, íîðìàëèçóþùèå ñòðîåíèå, ìåòàáîëèçì è ôóíêöèþ ïàðåíõèìû ïå÷åíè, ÿâëÿþòñÿ ñðåäñòâàìè ïàòîãåíåòè÷åñêîé òåðàïèè îñòðûõ è õðîíè÷åñêèõ çàáîëåâàíèé ãåïàòîáèëèàðíîé ñèñòåìû. Îäíàêî, êàê è ëþáûå ÷óæåðîäíûå âåùåñòâà, ãåïàòîòðîïíûå ïðåïàðàòû ìîãóò ïðîÿâëÿòü öèòîòîêñè÷åñêèå ñâîéñòâà, â çàâèñèìîñòè îò äîçû èëè îñîáåííîñòåé ïðèìåíåíèÿ (Àëüáåðò À., 1989). Íàïðèìåð,óñòàíîâëåíî, ÷òî íåêîòîðûå æåë÷íûå êèñëîòû ñïîñîáíû âêëþ÷àòü ïðîãðàììó àïîïòîçà (Kwo P.Y. et al., 1995), âåäóùóþ ê ãèáåëè ãåïàòîöèòîâ. Ïî ìíåíèþ R.Epstein (1990) öèòîòîêñè÷åñêèå àãåíòû îêàçûâàþò ïåðâè÷íîå ïîâðåæäàþùåå äåéñòâèå íà ñòðóêòóðíóþ îðãàíèçàöèþ è ôóíêöèè ÄÍÊ.  òî æå âðåìÿ öèòîòîêñè÷íîñòü ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ìîæåò ëåæàòü â îñíîâå ìîëåêóëÿðíûõ ìåõàíèçìîâ âîññòàíîâèòåëüíûõ ïðîöåññîâ â ïå÷åíè ïîñëå ïîâðåæäåíèÿ (×èðêèí À.À., Äàí÷åíêî Å.Î., 2000). Èññëåäîâàíèÿ öèòîòîêñè÷íîñòè ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì ñèñòåì in vivo îñëîæíÿþòñÿ íàëè÷èåì ñòðóêòóðíîé è ôóíêöèîíàëüíîé ãåòåðîãåííîñòè êëåòîê è íå ìîãóò áûòü èñïîëüçîâàíû äëÿ ðàñêðûòèÿ òî÷íûõ ìîëåêóëÿðíûõ ìåõàíèçìîâ äåéñòâèÿ ïðåïàðàòîâ (Davila J.C., 1998). Ïîýòîìó êðàéíå âàæíà ðàçðàáîòêà ìîäåëåé in vitro äëÿ îöåíêè òîêñè÷íîñòè êñåíîáèîòèêîâ è ëåêàðñòâåííûõ ïðåïàðàòîâ, ÷òî ïîçâîëèò òàêæå óìåíüøèòü êîëè÷åñòâî æèâîòíûõ, èñïîëüçóåìûõ äëÿ áèîëîãè÷åñêîãî òåñòèðîâàíèÿ.  íàñòîÿùåå âðåìÿ ñóùåñòâóåò òûñÿ÷è ðàçëè÷íûõ òåñò-ñèñòåì äëÿ èññëåäîâàíèé in vitro: 1) èçîëèðîâàííûå ïåðôóçèðóåìûå îðãàíû; 2) òêàíåâûå ñðåçû; 3) êëåòî÷íûå êóëüòóðû/ñóñïåíçèè; 4) èçîëèðîâàííûå îðãàíåëëû/ìåìáðàíû/ôåðìåíòû; 5) ñèñòåìû áåçïîçâîíî÷íûõ; 6) non-living-ñèñòåìû; 7) êîìïüþòåðíûå ìîäåëè (Silber P.M., Ruegg C.E., 1994). Íàèáîëåå ïðîñòûìè è äîñòóïíûìè ñèñòåìàìè ÿâëÿþòñÿ ìîíîñëîéíûå êëåòî÷íûå êóëüòóðû (Guillouzo A.; 1986, Blaauboer B.J., Boobis A.R., 1994). 3 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð Ïðåäëîæåíà òðåõýòàïíàÿ ìåòîäèêà îöåíêè öèòîòîêñè÷åñêîãî ýôôåêòà ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ: 1. Èçó÷åíèå ïðÿìîãî öèòîòîêñè÷åñêîãî ýôôåêòà ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòîê ñ ðåäóöèðîâàííûì ýíäîïëàçìàòè÷åñêèì ðåòèêóëóìîì L929 è L41 (ñíèæåíà áèîòðàíñôîðìàöèÿ ïðåïàðàòîâ) ïî ñëåäóþùèì ïàðàìåòðàì: ðîñò êëåòîê â ìîíîñëîå, ïðîëèôåðàöèÿ ïî âêëþ÷åíèþ 3Í-òèìèäèíà â ÄÍÊ, áèîñèíòåç áåëêà ïî âêëþ÷åíèþ ìå÷åíûõ àìèíîêèñëîò. 2. Èçó÷åíèå íåïðÿìîãî (îïîñðåäîâàííîãî) öèòîòîêñè÷åñêîãî äåéñòâèÿ ïðåïàðàòîâ íà ñåêðåöèþ öèòîêèíîâ (ñåêðåöèÿ ôàêòîðà íåêðîçà îïóõîëè ñ èñïîëüçîâàíèåì ïåðèòîíåàëüíûõ ìàêðîôàãîâ). 3. Èçó÷åíèå öèòîòîêñè÷åñêîãî âëèÿíèÿ ïðåïàðàòîâ â ïðîöåññå èõ áèîòðàíñôîðìàöèè íà ãåïàòîöèòû ïåðâè÷íîé êóëüòóðû (áèîñèíòåç ÄÍÊ, áåëêà, àïîïòîç, íåêðîç). ÏÎÊÀÇÀÍÈß Ê ÏÐÈÌÅÍÅÍÈÞ Ðåêîìåíäóåòñÿ äëÿ âñåõ ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ êàê ïåðâûé ýòàï ýêñïåðèìåíòàëüíîé àïðîáàöèè è äîêëèíè÷åñêèõ èñïûòàíèé. ÏÅÐÅ×ÅÍÜ ÍÅÎÁÕÎÄÈÌÎÃÎ ÎÁÎÐÓÄÎÂÀÍÈß I ýòàï. Îöåíêà ïðÿìîãî öèòîòîêñè÷åñêîãî ýôôåêòà 1. Îïðåäåëåíèå ÷èñëà êëåòîê â ìîíîñëîå: êëåòêè L929 èëè L41; ñðåäà 199; ñûâîðîòêà êðóïíîãî ðîãàòîãî ñêîòà; àíòèáèîòèêè; êóëüòóðàëüíûå ïëàøêè; 4 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð ÑÎ2-èíêóáàòîð; ëàìèíàð; èíâåðòèðîâàííûé ìèêðîñêîï; 10% ðàñòâîð êðèñòàëëâèîëåòà; 2% ýòèëîâûé ñïèðò; ðàñòâîð Ýðëà; 10% óêñóñíàÿ êèñëîòà; ïèïåòêè; âàêóóìíûé àñïèðàòîð; ñïåêòðîôîòîìåòð. 2. Îïðåäåëåíèå áèîñèíòåçà ÄÍÊ: êëåòêè L929 èëè L41; ñðåäà 199; ñûâîðîòêà êðóïíîãî ðîãàòîãî ñêîòà; àíòèáèîòèêè; êóëüòóðàëüíûå ïëàøêè; ÑÎ2-èíêóáàòîð; ðàñòâîð Ýðëà; 3Í-òèìèäèí; 10% óêñóñíàÿ êèñëîòà; ýòèëîâûé ñïèðò; 0,3 N ÊÎÍ; 1 N õëîðíàÿ êèñëîòà; äèîêñàíîâûé ñöèíòèëëÿòîð; 5 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð ïèïåòêè; òåðìîñòàò; b-ñ÷åò÷èê. 3. Îïðåäåëåíèå áèîñèíòåçà áåëêà: êëåòêè L929 èëè L41; ñðåäà 199; ñûâîðîòêà êðóïíîãî ðîãàòîãî ñêîòà; àíòèáèîòèêè; êóëüòóðàëüíûå ïëàøêè; ÑÎ2-èíêóáàòîð; ðàñòâîð Ýðëà; 14Ñ-àìèíîêèñëîòû; 10% óêñóñíàÿ êèñëîòà; ýòèëîâûé ñïèðò; 0,3 N ÊÎÍ; 1 N õëîðíàÿ êèñëîòà; ïèïåòêè; äèîêñàíîâûé ñöèíòèëëÿòîð; òåðìîñòàò; b-ñ÷åò÷èê. II ýòàï. Îöåíêà íåïðÿìîãî öèòîòîêñè÷åñêîãî ýôôåêòà 3% ðàñòâîð ïåïòîíà; ñðåäà Õåíêñà; ãåïàðèí; 6 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð àêòèíîìèöèí Ä; öåíòðèôóãà; êëåòêè L929 èëè L41; ñðåäà 199; ñûâîðîòêà êðóïíîãî ðîãàòîãî ñêîòà; àíòèáèîòèêè; êóëüòóðàëüíûå ïëàøêè; ÑÎ2-èíêóáàòîð; 10% ðàñòâîð êðèñòàëëâèîëåòà â 2% ñïèðòå; ðàñòâîð Ýðëà; 10% óêñóñíàÿ êèñëîòà; ïèïåòêè; âàêóóìíûé àñïèðàòîð; ñïåêòðîôîòîìåòð. III ýòàï. Îöåíêà öèòîòîêñè÷åñêîãî ýôôåêòà íà ãåïàòîöèòû 1. Ïîëó÷åíèå ãåïàòîöèòîâ: êåòàìèí (êîíöåíòðàöèÿ 100 ìêã/ìë); ðîìïóí (êîíöåíòðàöèÿ 50 ìêã/ìêë); ñòåðèëüíûé ìàðëåâûé ôèëüòð; ñòåðèëüíûå íîæíèöû, ïèíöåò, ÷àøêà Ïåòðè; ñòåðèëüíàÿ ïîñóäà äëÿ ïîëó÷åíèÿ è ðàçâåäåíèÿ ãåïàòîöèòîâ (öèëèíäðû, ñòàêàíû); ôèëüòðû äëÿ ñòåðèëèçàöèè ðàñòâîðîâ; ëàìèíàð; ÑÎ2-èíêóáàòîð; 7 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð ðÍ-ìåòð; èãëà äëÿ ïåðôóçèè; ïëàñòèêîâûé êàòåòåð; ëèãàòóðû; ñâåòîâîé ìèêðîñêîï; èíâåðòèðîâàííûé ìèêðîñêîï; öåíòðèôóãà òðèïàí ãîëóáîé 0,4% êàìåðà Áþðêåðà; ñðåäà William E; ãåíòàìèöèí; ãëþêîçà 5,5 ììîëü; HEPES 10 ììîëü è 50 ììîëü; NaHCO3 4,17 ììîëü è 125 ììîëü; Na2HPO4 0,27 ììîëü è 16,85 ììîëü; ÊÍ2ÐÎ4 0,44 ììîëü è 22,04 ììîëü; KCl 5,36 ììîëü è 268,2 ììîëü; NaCl 136,9 ììîëü; êîëëàãåíàçà (òèï I, SeromedR, Biochrom KG, Berlin, Germany) ÑàÑl2 476 ììîëü; MgSO4´7 H2O 4,06 ììîëü; àëüáóìèí; ÄÍÊ-àçà (1 ìêã). 8 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð 2. Èçó÷åíèå âëèÿíèÿ ïðåïàðàòîâ íà áèîñèíòåç ÄÍÊ: 12-ëóíî÷íûå êóëüòóðàëüíûå ïëàøêè; ÑÎ2-èíêóáàòîð; âàêóóìíûé àñïèðàòîð; ïðîáèðêè «Ýïïåíäîðô»; öåíòðèôóãà ñ îõëàæäåíèåì; òåðìîáëîê; b-ñ÷åò÷èê; 63Í-òèìèäèí; ñìåñü òðèõëîðóêñóñíàÿ êèñëîòà (5%)/ìåòàíîë (95%); 0,3 ìîëü ÊÎÍ; 5%, 10% è 40% òðèõëîðóêñóñíàÿ êèñëîòà; ñöèíòèëëÿöèîííàÿ æèäêîñòü; ôîñôàòíûé áóôåð (ðÍ 7,4); êðàñèòåëü Hoechst 33342 (1 ìã/ìë); êîëëàãåíàçà (0,5 ìã/ìë); Òðèñ-ÍÑl 100 ììîëü; ÝÄÒÀ 1 ììîëü; äîäåöèëñóëüôàò íàòðèÿ 0,1%; ñòàíäàðò: ÄÍÊ òèìóñà òåëåíêà ôëóîðåñöåíòíûé ñïåêòðîôîòîìåòð. 3. Èçó÷åíèå âëèÿíèÿ ïðåïàðàòîâ íà áèîñèíòåç áåëêà: 12-ëóíî÷íûå êóëüòóðàëüíûå ïëàøêè; ÑÎ2-èíêóáàòîð; 9 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð âàêóóìíûé àñïèðàòîð; ïðîáèðêè «Ýïïåíäîðô»; öåíòðèôóãà ñ îõëàæäåíèåì; óëüòðàçâóêîâîé äåçèíòåãðàòîð; ñïåêòðîôîòîìåòð; áóìàæíûå ôèëüòðû; b-ñ÷åò÷èê; 35S-ìåòèîíèí; Òðèñ-ÍÑl 25 ììîëü; ÝÄÒÀ 5 ììîëü; NaCl 250 ììîëü; 1% Òðèòîí Õ-100; 10% òðèõëîðóêñóñíàÿ êèñëîòà; êîëëàãåíàçà (0,1 ìã/ìë); ôîñôàòíûé áóôåð (ðÍ 7,4); ðåàêòèâû äëÿ îïðåäåëåíèÿ êîëè÷åñòâà áåëêà: «Àíàëèç-Õ», «Êîðìåé ÄèÀíà», BCA protein assay (Rockford, IL, USA); ñòàíäàðò: áû÷èé ñûâîðîòî÷íûé àëüáóìèí. 4. Èçó÷åíèå âëèÿíèÿ ïðåïàðàòîâ íà íåêðîç ãåïàòîöèòîâ: 12-ëóíî÷íûå êóëüòóðàëüíûå ïëàøêè; ÑÎ2-èíêóáàòîð; âàêóóìíûé àñïèðàòîð; 0,1% Òðèòîí Õ-100; ñòàíäàðòíûå íàáîðû äëÿ îïðåäåëåíèÿ àêòèâíîñòè ëàêòàòäåãèäðîãåíàçû. 10 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð 5. Èçó÷åíèå âëèÿíèÿ ïðåïàðàòîâ íà àïîïòîç ãåïàòîöèòîâ: 35 ìì êóëüòóðàëüíûå ÷àøêè; ÑÎ2-èíêóáàòîð; âàêóóìíûé àñïèðàòîð; ïðîáèðêè «Ýïïåíäîðô»; öåíòðèôóãà ñ îõëàæäåíèåì; ôîñôàòíûé áóôåð (ðÍ 7,4); Òðèñ-ÍÑl 10 ììîëü è 100 ììîëü; NaCl 200 ììîëü; ÝÄÒÀ 5 ììîëü; äîäåöèëñóëüôàò íàòðèÿ 2%; ïðîòåèíêèíàçà Ê (20 ìã/ìë) ôåíîë; õëîðîôîðì; èçîàìèëîâûé ñïèðò; 70% ýòàíîë; ðèáîíóêëåàçà À (10 ìã/ìë); àãàðîçà; ýòèäèóì áðîìèä; ñïåêòðîôîòîìåòð; ïðèáîð äëÿ ýëåêòðîôîðåçà; óñòðîéñòâî ñ èñòî÷íèêîì ÓÔ äëÿ îöåíêè ôðàãìåíòàöèè ÄÍÊ; êàìåðà äëÿ âûïîëíåíèÿ ôîòîñíèìêîâ. 11 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð ÎÏÈÑÀÍÈÅ ÒÅÕÍÎËÎÃÈÈ ÈÑÏÎËÜÇÎÂÀÍÈß ÌÅÒÎÄÀ I ýòàï. Îöåíêà ïðÿìîãî öèòîòîêñè÷åñêîãî ýôôåêòà 1. Îïðåäåëåíèå ÷èñëà êëåòîê â ìîíîñëîå Èñïîëüçóþòñÿ òðàíñôîðìèðîâàííûå îïóõîëåâûå êëåòêè L929 èëè L41. Äëÿ êóëüòèâèðîâàíèÿ êëåòîê èñïîëüçóåòñÿ ñðåäà 199, ñîäåðæàùàÿ 10% ñûâîðîòêè êðóïíîãî ðîãàòîãî ñêîòà, àíòèáèîòèêè. Ïàññèðîâàíèå êëåòîê ïðîèçâîäèòñÿ â 24 è 48-ëóíî÷íûå êóëüòóðàëüíûå ïëàøêè ñ èñïîëüçîâàíèåì ñðåäû 199, ñîäåðæàùåé 5% áû÷üåé ñûâîðîòêè. Êëåòêè âûñåâàþòñÿ â ïëàøêè (1´105 êëåòîê íà ëóíêó), ÷åðåç 2 ÷ ìåíÿåòñÿ ñðåäà, è äîáàâëÿþòñÿ èññëåäóåìûå ïðåïàðàòû â êîíöåíòðàöèè 501000 ìêã/ìë.  êà÷åñòâå êîíòðîëÿ èñïîëüçóåòñÿ êóëüòóðàëüíàÿ ñðåäà. Èíêóáàöèÿ êëåòîê ñ ïðåïàðàòàìè ïðîèçâîäèòñÿ â òå÷åíèå 14 ñóò. ïðè 37° Ñ â àòìîñôåðå ñ 5% ÑÎ2. Ïîñëå èíêóáàöèè ñðåäà óäàëÿåòñÿ, êëåòêè ïðîìûâàþòñÿ òðèæäû õîëîäíûì ðàñòâîðîì Ýðëà è îêðàøèâàþòñÿ 0,2% ðàñòâîðîì êðèñòàëëâèîëåòà â 2% ñïèðòå â òå÷åíèå 10 ìèí. Êðàñèòåëü ýêñòðàãèðóåòñÿ 10% ðàñòâîðîì óêñóñíîé êèñëîòû â òå÷åíèå 1 ÷. Îïòè÷åñêàÿ ïëîòíîñòü èçìåðÿåòñÿ ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêè ïðè l 590 íì. Ðåçóëüòàòû âûðàæàþòñÿ â ïðîöåíòàõ ïî îòíîøåíèþ ê êîíòðîëþ. 12 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð 2. Îïðåäåëåíèå áèîñèíòåçà ÄÍÊ Êëåòêè êóëüòèâèðóþòñÿ àíàëîãè÷íî îïèñàííîìó âûøå. ×åðåç 2 ÷ èíêóáàöèè ïðåïàðàòà ñ êëåòêàìè äîáàâëÿåòñÿ 3Í-òèìèäèí â äîçå 2,5 ìêÊè/ìë. ×åðåç 18 ÷ èíêóáàöèè (37° Ñ, 5% ÑÎ 2) êóëüòóðàëüíàÿ ñðåäà àñïèðèðóåòñÿ, êëåòêè ïðîìûâàþòñÿ òðèæäû õîëîäíûì ðàñòâîðîì Ýðëà, 3Í-òèìèäèí ýêñòðàãèðóåòñÿ ñìåñüþ 10% óêñóñíîé êèñëîòû ñ ýòèëîâûì ñïèðòîì (1:9) â òå÷åíèå 10 ìèí. Êëåòêè ãèäðîëèçóþòñÿ 0,3 N ÊÎÍ â òå÷åíèå íî÷è â òåðìîñòàòå ïðè 37° Ñ. Ïðîáû íåéòðàëèçóþòñÿ 1 N õëîðíîé êèñëîòîé äî ðÍ 7,0. Äëÿ îïðåäåëåíèÿ ðàäèîàêòèâíîñòè èñïîëüçóåòñÿ 0,1 ìë ãèäðîëèçàòà â äèîêñàíîâîì ñöèíòèëëÿòîðå. Ïðîèçâîäèòñÿ ïîäñ÷åò êëåòîê ïî îêðàñêå êðèñòàëëâèîëåòîì è ðàññ÷èòûâàåòñÿ ÷èñëî èìïóëüñîâ â ìèíóòó íà 1000 êëåòîê. Ðåçóëüòàòû âûðàæàþòñÿ â ïðîöåíòàõ ïî îòíîøåíèþ ê êîíòðîëþ. 3. Îïðåäåëåíèå áèîñèíòåçà áåëêà Êëåòêè êóëüòèâèðóþòñÿ àíàëîãè÷íî îïèñàííîé âûøå ìåòîäèêå. ×åðåç 2 ÷ èíêóáàöèè ïðåïàðàòà ñ êëåòêàìè äîáàâëÿåòñÿ 14Ñ-àìèíîêèñëîòû â äîçå 40 ìêÊè/ìë. ×åðåç 6 ÷ èíêóáàöèè (37° Ñ, 5% ÑÎ2) êóëüòóðàëüíàÿ ñðåäà àñïèðèðóåòñÿ, êëåòêè ïðîìûâàþòñÿ òðèæäû õîëîäíûì ðàñòâîðîì Ýðëà, 14Ñ-àìèíîêèñëîòû ýêñòðàãèðóþòñÿ ñìåñüþ 10% óêñóñíîé êèñëîòû ñ ýòèëîâûì ñïèðòîì (1:9) â òå÷åíèå 10 ìèí. Êëåòêè ãèäðîëèçóþòñÿ 0,3 N ÊÎÍ â òå÷åíèå íî÷è â òåðìîñòàòå ïðè 37° Ñ. Ïðîáû íåéòðàëèçóþòñÿ 1 N õëîðíîé êèñëîòîé äî ðÍ 7,0. Äëÿ îïðåäåëåíèÿ ðàäèîàêòèâíîñòè èñïîëüçóåòñÿ 0,1 ìë ãèäðîëèçàòà â äèîêñàíîâîì ñöèíòèëëÿòîðå. Ïðîèçâîäèòñÿ ïîäñ÷åò êëåòîê ïî îêðàñêå êðèñòàëëâèîëåòîì è ðàññ÷èòûâàåòñÿ ÷èñëî èìïóëüñîâ â ìèíóòó íà 1000 êëåòîê. Ðåçóëüòàòû âûðàæàþòñÿ â ïðîöåíòàõ ïî îòíîøåíèþ ê êîíòðîëþ. 13 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð II ýòàï. Îöåíêà íåïðÿìîãî öèòîòîêñè÷åñêîãî ýôôåêòà 1. Ïîëó÷åíèå àêòèâèðîâàííûõ ïåðèòîíåàëüíûõ ìàêðîôàãîâ Ìûøàì âíóòðèáðþøèííî ââîäèòñÿ 5 ìë 3% ðàñòâîðà ïåïòîíà â ñðåäå Õåíêñà. ×åðåç 3 ñóò âíóòðèáðþøèííî ââîäèòñÿ 7 ìë õîëîäíîé ñðåäû 199, ñîäåðæàùåé 10% áû÷üåé ñûâîðîòêè, àíòèáèîòèêè è 10 ÅÄ ãåïàðèíà (ðàñòâîð À). ×åðåç 1 ìèí æèäêîñòü èç áðþøíîé ïîëîñòè, ñîäåðæàùàÿ àêòèâèðîâàííûå ìàêðîôàãè, àñïèðèðóåòñÿ, öåíòðèôóãèðóåòñÿ â òå÷åíèå 10 ìèí ïðè 1000 îá./ìèí. Çàòåì ìàêðîôàãè ïðîìûâàþòñÿ 10 ìë ðàñòâîðà À áåç ãåïàðèíà è ñóñïåíçèðóþòñÿ â òîì æå ðàñòâîðå. Ïîëó÷åííûå ìàêðîôàãè ïàññèðóþòñÿ íà 24-ëóíî÷íûå ïëàíøåòû ñ ïëîòíîñòüþ 5´106 êëåòîê/ìë. 2. Îïðåäåëåíèå öèòîòîêñè÷åñêîãî ýôôåêòà ×åðåç ñóòêè ê îáðàçîâàâøåìóñÿ ìîíîñëîþ äîáàâëÿþòñÿ èññëåäóåìûå ïðåïàðàòû è ìàêðîôàãè èíêóáèðóþòñÿ â òåðìîñòàòå ïðè 37° Ñ â òå÷åíèå 24 ÷. ×åðåç 24 ÷ êîíäèöèîíèðîâàííàÿ ñðåäà ìàêðîôàãîâ ñîáèðàåòñÿ, öåíòðèôóãèðóåòñÿ è òåñòèðóåòñÿ íà êëåòêàõ L929. Äëÿ ýòîãî ê ìîíîñëîþ êëåòîê L929 äîáàâëÿåòñÿ ñóïåðíàòàíò ìàêðîôàãîâ è àêòèíîìèöèí Ä (0,05 ìã/ìë ñðåäû). ×åðåç 18 ÷ èíêóáàöèè ïðè 37° Ñ â àòìîñôåðå ñ 5% ÑÎ2 ñðåäà óäàëÿåòñÿ, êîëè÷åñòâî êëåòîê ïîäñ÷èòûâàþò ïîñëå îêðàñêè êðèñòàëëâèîëåòîì (ñì. âûøå). Ðàññ÷èòûâàåòñÿ öèòîòîêñè÷åñêèé èíäåêñ: (a-b) ´ 100% , à ãäå à îïòè÷åñêàÿ ïëîòíîñòü êîíòðîëÿ (ñóïåðíàòàíò áåç äîáàâëåíèÿ ïðåïàðàòà), b îïòè÷åñêàÿ ïëîòíîñòü îïûòà (ñóïåðíàòàíò ñ äîáàâëåíèåì ïðåïàðàòà). 14 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð III ýòàï. Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ñ èñïîëüçîâàíèåì êóëüòóðû ãåïàòîöèòîâ 1. Ïîëó÷åíèå ãåïàòîöèòîâ Ïåðåä íà÷àëîì îïåðàöèè îïåðàöèîííûé áîêñ è ñòîë ïðîòèðàþòñÿ äåçèíôèöèðóþùèì ðàñòâîðîì. Àíåñòåçèÿ ïðîèçâîäèòñÿ ïóòåì âíóòðèìûøå÷íîãî ââåäåíèÿ ñìåñè êåòàìèí/ ðîìïóí (êåòàìèí (ìêë) = ìàññà (ã)´1; ðîìïóí (ìêë) = ìàññà (ã) ´0,4). Íîæíèöàìè è ïèíöåòîì óäàëÿåòñÿ øåðñòü îò æèâîòà äî ãðóäíîé êëåòêè. Ïî ñðåäíåé ëèíèè âñêðûâàåòñÿ áðþøíàÿ ïîëîñòü. Íàêëàäûâàþòñÿ ëèãàòóðû íà âîðîòíóþ âåíó è íèæíþþ ïîëóþ âåíó íèæå ïå÷åíè. Âîðîòíàÿ âåíà âñêðûâàåòñÿ, êàíþëèðóåòñÿ èãëîé äëÿ ïåðôóçèè, êîòîðàÿ ôèêñèðóåòñÿ ëèãàòóðîé. Íèæíÿÿ ïîëàÿ âåíà ïåðåðåçàåòñÿ. Âñêðûâàåòñÿ ãðóäíàÿ êëåòêà, íà íèæíþþ ïîëóþ âåíó âûøå ñåðäöà íàêëàäûâàåòñÿ ëèãàòóðà, âñòàâëÿåòñÿ ïëàñòèêîâûé êàòåòåð è ëèãàòóðà çàòÿãèâàåòñÿ. Íèæíÿÿ ïîëàÿ âåíà íèæå ïå÷åíè ïåðåæèìàåòñÿ ëèãàòóðîé. Ïå÷åíü ïåðôóçèðóåòñÿ ñáàëàíñèðîâàííûì ðàñòâîðîì Õåíêñà, ñîäåðæàùèì ãëþêîçó (5,5 ììîëü), HEPES (10 ììîëü), NaHCO3 (4,17 ììîëü), Na 2HPO4 (0,27 ììîëü), ÊÍ2ÐÎ4 (0,44 ììîëü), KCl (5,36 ììîëü), NaCl (136,9 ììîëü) ñî ñêîðîñòüþ 20 ìë/ìèí ïðè òåìïåðàòóðå ðàñòâîðà 37° Ñ. Äëÿ ðàçðóøåíèÿ ñîåäèíèòåëüíîé òêàíè ïå÷åíè ïåðôóçèÿ ïðîäîëæàåòñÿ ðàñòâîðîì êîëëàãåíàçû (òèï I, SeromedR, Biochrom KG, Berlin, Germany, 40 ìã/100 ìë ñðåäû Õåíêñà), ñîäåðæàùèì 1 ììîëü/ë Ñà2 +, â ðåöèðêóëèðóþùåì ðåæèìå â òå÷åíèå 10 ìèí (II ýòàï). Âñå ðàñòâîðû äî ïðèìåíåíèÿ íàñûùàþòñÿ 95% Î2 è 5% ÑÎ2 è äîâîäèòñÿ ðÍ äî 7,2. Ïåðåä èñïîëüçîâàíèåì ðàñòâîðû ñòåðèëèçóþòñÿ ïðîïóñêàíèåì ÷åðåç ôèëüòðû. 15 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð Äëÿ ïîëó÷åíèÿ ñóñïåíçèè ãåïàòîöèòîâ ïîñëå ðàçðóøåíèÿ ñîåäèíèòåëüíîé òêàíè ïå÷åíü âûäåëÿåòñÿ è èçìåëü÷àåòñÿ â ðàñòâîðå, ñîäåðæàùåì HEPES (50 ììîëü), ÑàÑl2 (476 ììîëü), NaHCO3 (125 ììîëü), KCl (268,2 ììîëü), MgSO4´7 H2O (4,06 ììîëü), Ê2ÍÐÎ4 (22,04 ììîëü), Na 2HPO4 (16,85 ììîëü), àëüáóìèí (1,0 ã), ÄÍÊ-àçó (1 ìêã). Ñóñïåíçèÿ ãåïàòîöèòîâ ôèëüòðóåòñÿ ÷åðåç 6-ñëîéíûé ñòåðèëüíûé ìàðëåâûé ôèëüòð è öåíòðèôóãèðóåòñÿ ïðè 500 g â òå÷åíèå 2 ìèí äëÿ óäàëåíèÿ íåïàðåíõèìàòîçíûõ è ïîãèáøèõ êëåòîê. Ãåïàòîöèòû ðåñóñïåíçèðóþòñÿ â ñðåäå William E, ñîäåðæàùåé 10% ôåòàëüíîé ñûâîðîòêè, 26 ììîëü NaHCO3 è 50 ìêã/ìë ãåíòàìèöèíà. Îöåíêà æèçíåñïîñîáíîñòè ïðîèçâîäèòñÿ ïîñëå îêðàñêè ãåïàòîöèòîâ òðèïàíîâûì ãîëóáûì. Äëÿ ýòîãî 20 ìêë êëåòî÷íîé ñóñïåíçèè ñìåøèâàåòñÿ ñ 20 ìêë 0,4% ðàñòâîðà òðèïàíîâîãî ãîëóáîãî, ïðîèçâîäèòñÿ ïîäñ÷åò âñåõ áîëüøèõ ñâåòëûõ êëåòîê è áîëüøèõ ãîëóáûõ êëåòîê â 20 ïîëÿõ çðåíèÿ êàìåðû Áþðêåðà (âîçìîæíî èñïîëüçîâàíèå êàìåðû Ãîðÿåâà). Ðàñ÷åò âèòàëèòåòà ïðîèçâîäèòñÿ ïî ôîðìóëå: (îáùåå êîëè÷åñòâî êëåòîê êîëè÷åñòâî ãîëóáûõ êëåòîê/îáùåå êîëè÷åñòâî êëåòîê)´100.  ýêñïåðèìåíòå èñïîëüçóþòñÿ ñóñïåíçèè ñ êîëè÷åñòâîì æèçíåñïîñîáíûõ êëåòîê íå ìåíåå 85%. 16 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð 2. Èçó÷åíèå âëèÿíèÿ ïðåïàðàòîâ íà áèîñèíòåç ÄÍÊ Èçîëèðîâàííûå ãåïàòîöèòû (ïî 0,6 ìë ñóñïåíçèè, ïëîòíîñòü 0,5´10 6 êëåòîê/ìë) ïàññèðóþòñÿ â îáðàáîòàííûå êîëëàãåíîì 12-ëóíî÷íûå ïëàíøåòû è êóëüòèâèðóþòñÿ ïðè òåìïåðàòóðå 37° Ñ â àòìîñôåðå ñ 5% ÑÎ2. ×åðåç 2 ÷ ïîñëå ïàññàæà ñðåäà çàìåíÿåòñÿ, äîáàâëÿþòñÿ ïðåïàðàòû â äèàïàçîíå äîç 251000 ìêã/ìë è 1 ìêÊè/ëóíêà (63Í-òèìèäèíà). Êëåòêè ñ ïðåïàðàòàìè èíêóáèðóþòñÿ ïðè òåìïåðàòóðå 37° Ñ â àòìîñôåðå ñ 5% ÑÎ2 â òå÷åíèå 12 ÷. Ïîñëå èíêóáàöèè ñðåäà óäàëÿåòñÿ, êëåòêè ïðîìûâàþòñÿ ñìåñüþ òðèõëîðóêñóñíàÿ êèñëîòà/ìåòàíîë è ñîëþáèëèçèðóþòñÿ 1 ìë 0,3 N ÊÎÍ â òå÷åíèå 30 ìèí ïðè òåìïåðàòóðå 37° Ñ. Ñóïåðíàòàíò ñîáèðàåòñÿ â ïðîáèðêè «Ýïïåíäîðô», äîáàâëÿåòñÿ 1 ìë 40% òðèõëîðóêñóñíîé êèñëîòû, ïðîáèðêè âñòðÿõèâàþòñÿ è öåíòðèôóãèðóþòñÿ 10 ìèí ïðè 14 000 g. Ê ñåäèìåíòàì äîáàâëÿåòñÿ ïî 1 ìë 5% òðèõëîðóêñóñíîé êèñëîòû è ïðîáû ïîìåùàþòñÿ â òåðìîáëîê íà 15 ìèí ïðè òåìïåðàòóðå 90° Ñ. Ïîñëå îõëàæäåíèÿ ïðîáû öåíòðèôóãèðóþòñÿ 10 ìèí ïðè 14 000 g è ïî 250 ìêë ñóïåðíàòàíòà äîáàâëÿþòñÿ ê 4 ìë ñöèíòèëëÿöèîííîé æèäêîñòè «Rotiscint eco plus». Êîëè÷åñòâî èìïóëüñîâ ïîäñ÷èòûâàåòñÿ ñ ïîìîùüþ b-ñ÷åò÷èêà. Ðåçóëüòàòû âûðàæàþòñÿ êàê èìïóëüñû/ìèí/ìêã ÄÍÊ. 17 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð Äëÿ îïðåäåëåíèÿ êîëè÷åñòâà ÄÍÊ ïîñëå èíêóáàöèè êëåòêè ïðîìûâàþòñÿ ôîñôàòíûì áóôåðîì (37° Ñ), ñíèìàþòñÿ ñ ïëàøåê èíêóáàöèåé ñ ðàñòâîðîì êîëëàãåíàçû (0,5 ìã/ìë ôîñôàòíîãî áóôåðà, 30 ìèí, 37° Ñ), ïåðåíîñÿòñÿ â ïðîáèðêè «Ýïïåíäîðô» è öåíòðèôóãèðóþòñÿ 5 ìèí ïðè 5 000 g. Ñåäèìåíòû çàìîðàæèâàþòñÿ ïðè 20° Ñ äî èññëåäîâàíèÿ. Ïåðåä îïðåäåëåíèåì ÄÍÊ ïðîáû ðàçìîðàæèâàþòñÿ è êëåòêè ëèçèðóþòñÿ áóôåðîì, ñîäåðæàùèì 0,1% äîäåöèëñóëüôàò íàòðèÿ, 1 ììîëü ÝÄÒÀ, 100 ììîëü ÒðèñÍÑl (ðÍ 7,4) â òå÷åíèå 1 ÷ ïðè ïîñòîÿííîì âñòðÿõèâàíèè. Êîëè÷åñòâî ÄÍÊ îïðåäåëÿåòñÿ ôëóîðåñöåíòíîé ñïåêòðîìåòðèåé ïîñëå îêðàøèâàíèÿ êðàñèòåëåì Hoechst 33342 (1 ìã/ ìë), èñïîëüçóÿ â êà÷åñòâå ñòàíäàðòà ÄÍÊ òèìóñà òåëåíêà. Äëèíà âîçáóæäåíèÿ 350 íì, äëèíà âûäåëåíèÿ 450 íì. 18 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð 3. Èçó÷åíèå âëèÿíèÿ ïðåïàðàòîâ íà áèîñèíòåç áåëêà Ãåïàòîöèòû ïàññèðóþòñÿ è èíêóáèðóþòñÿ àíàëîãè÷íî îïèñàííîìó âûøå ìåòîäó (ñì. èññëåäîâàíèå áèîñèíòåçà ÄÍÊ). 35S-ìåòèîíèí (40 ìêÊè/ìë) è ïðåïàðàòû äîáàâëÿþòñÿ ê ãåïàòîöèòàì ÷åðåç 2 ÷ êóëüòèâèðîâàíèÿ ïîñëå çàìåíû ñðåäû. ×åðåç 3 ÷ èíêóáàöèè 50 ìêë ñðåäû ïåðåíîñèòñÿ íà ôèëüòð (äëÿ îïðåäåëåíèÿ ñåêðåòèðóåìûõ èç êëåòêè áåëêîâ). Îñòàëüíàÿ ñðåäà êóëüòèâèðîâàíèÿ óäàëÿåòñÿ, êëåòêè ïðîìûâàþòñÿ äâàæäû õîëîäíûì ôîñôàòíûì áóôåðîì, â ëóíêè äîáàâëÿåòñÿ ïî 0,5 ìë ëèçèðóþùåãî áóôåðà (25 ììîëü ÒðèñÍÑl (ðÍ 7,5), 5 ììîëü ÝÄÒÀ, 250 ììîëü NaCl, 1% Òðèòîí Õ-100) è ïðîáû èíêóáèðóþòñÿ 30 ìèí ïðè 4° Ñ. Êëåòêè ìåõàíè÷åñêè ñíèìàþòñÿ ñ ïëàøåê è ïåðåíîñÿòñÿ â ïðîáèðêè «Ýïïåíäîðô». Ëóíêè ïðîìûâàþòñÿ äâàæäû (ïî 250 ìêë) ëèçèðóþùèì áóôåðîì è ïðîáèðêè èíêóáèðóþòñÿ 30 ìèí ïðè 4° Ñ. Ïîñëå èíêóáàöèè ïðîáèðêè öåíòðèôóãèðóþòñÿ 5 ìèí ïðè 14 000 g è ïî 50 ìêë ñóïåðíàòàíòà ïåðåíîñÿòñÿ íà ôèëüòðû. Ôèëüòðû ïðîìûâàþòñÿ 3 ðàçà õîëîäíîé 10% òðèõëîðóêñóñíîé êèñëîòîé (ïî 5 ìë), 1 ðàç âîäîé è ïåðåíîñÿòñÿ â ñöèíòèëëÿöèîííóþ æèäêîñòü. Êîëè÷åñòâî èìïóëüñîâ ïîäñ÷èòûâàåòñÿ íà bñ÷åò÷èêå. Ðåçóëüòàòû âûðàæàþòñÿ êàê èìïóëüñû/ìèí/ìã áåëêà. Äëÿ îïðåäåëåíèÿ êîëè÷åñòâà áåëêà ïîñëå êóëüòèâèðîâàíèÿ ñðåäà óäàëÿåòñÿ, êëåòêè ïðîìûâàþòñÿ ôîñôàòíûì áóôåðîì, ñíèìàþòñÿ ñ ïëàøåê èíêóáàöèåé ñ ðàñòâîðîì êîëëàãåíàçû (0,1 ìã/ìë ôîñôàòíîãî áóôåðà) â òå÷åíèå 15 ìèí ïðè 37° Ñ, ïåðåíîñÿòñÿ â ïðîáèðêè «Ýïïåíäîðô» è öåíòðèôóãèðóþòñÿ 5 ìèí ïðè 5 000 g. Êëåòêè ðåñóñïåíçèðóþòñÿ â 0,5 ìë ôîñôàòíîãî áóôåðà è ðàçðóøàþòñÿ ñ ïîìîùüþ óëüòðàçâóêà. Êîëè÷åñòâî áåëêà îïðåäåëÿåòñÿ ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêè (l 562 íì) ñ ïîìîùüþ Pierce ÂÑÀ-ìèêðîìåòîäà, èñïîëüçóÿ â êà÷åñòâå ñòàíäàðòà áû÷èé ñûâîðîòî÷íûé àëüáóìèí. Âîçìîæíî èñïîëüçîâàíèå äðóãèõ íàáîðîâ, îñíîâàííûõ íà áèóðåòîâîì ìåòîäå. 19 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð 4. Èçó÷åíèå âëèÿíèÿ ïðåïàðàòîâ íà íåêðîç ãåïàòîöèòîâ Èçîëèðîâàííûå ãåïàòîöèòû (ïî 0,6 ìë ñóñïåíçèè, ïëîòíîñòü 0,5´10 6 êëåòîê/ìë) ïàññèðóþòñÿ â îáðàáîòàííûå êîëëàãåíîì 12-ëóíî÷íûå ïëàíøåòû è êóëüòèâèðóþòñÿ ïðè òåìïåðàòóðå 37° Ñ â àòìîñôåðå ñ 5% ÑÎ2. ×åðåç 2 ÷ ïîñëå ïàññàæà ñðåäà çàìåíÿåòñÿ è äîáàâëÿþòñÿ ïðåïàðàòû â äèàïàçîíå äîç 251000 ìêã/ìë. Êëåòêè ñ ïðåïàðàòàìè èíêóáèðóþòñÿ ïðè òåìïåðàòóðå 37° Ñ â àòìîñôåðå ñ 5% ÑÎ2 â òå÷åíèå 4 ÷. Ïîñëå èíêóáàöèè êóëüòóðàëüíàÿ ñðåäà ñîáèðàåòñÿ è èññëåäóåòñÿ àêòèâíîñòü ëàêòàòäåãèäðîãåíàçû ñ èñïîëüçîâàíèåì ñòàíäàðòíûõ íàáîðîâ ôèðìû «Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Âîçìîæíî èñïîëüçîâàíèå äðóãèõ íàáîðîâ äëÿ îïðåäåëåíèÿ àêòèâíîñòè ëàêòàòäåãèäðîãåíàçû. Îáùàÿ àêòèâíîñòü ëàêòàòäåãèäðîãåíàçû îïðåäåëÿåòñÿ ïîñëå îáðàáîòêè êëåòîê 0,1% ðàñòâîðîì Òðèòîíà Õ-100. Âûñâîáîæäåíèå ëàêòàòäåãèäðîãåíàçû ðàññ÷èòûâàåòñÿ êàê ïðîöåíò îò îáùåé àêòèâíîñòè ôåðìåíòà. 20 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð 5. Èçó÷åíèå âëèÿíèÿ ïðåïàðàòîâ íà àïîïòîç ãåïàòîöèòîâ Èçîëèðîâàííûå ãåïàòîöèòû (ïî 1,5 ìë ñóñïåíçèè, ïëîòíîñòü 0,5´10 6 êëåòîê/ìë) ïàññèðóþò íà îáðàáîòàííûå êîëëàãåíîì 35 ìì êóëüòóðàëüíûå ÷àøêè. ×åðåç 2 ÷ ñðåäó çàìåíÿþò è äîáàâëÿþò èññëåäóåìûå ïðåïàðàòû. Êîíòðîëü ñðåäà êóëüòèâèðîâàíèÿ. ×åðåç 4 ÷ èíêóáàöèè ïðè òåìïåðàòóðå 37° Ñ â àòìîñôåðå ñ 5% ÑÎ2 êëåòêè ïðîìûâàþòñÿ õîëîäíûì ôîñôàòíûì áóôåðîì è ëèçèðóþòñÿ áóôåðîì, ñîäåðæàùèì 100 ììîëü Òðèñ-ÍÑl (ðÍ 8,0), 200 ììîëü NaCl, 5 ììîëü ÝÄÒÀ è 2% ðàñòâîð äîäåöèëñóëüôàòà íàòðèÿ è ÷åðåç 15 ìèí ìåõàíè÷åñêè ñíèìàþòñÿ ñ ïëàøåê è ïåðåíîñÿòñÿ â ïðîáèðêè «Ýïïåíäîðô». Çàòåì ê ãåïàòîöèòàì äîáàâëÿåòñÿ ïðîòåèíêèíàçà Ê (20 ìã/ìë) è ñìåñü èíêóáèðóåòñÿ â òå÷åíèå íî÷è ïðè 56° Ñ. ÄÍÊ ýêñòðàãèðóåòñÿ ñìåñüþ ôåíîë/õëîðîôîðì/èçîàìèëîâûé ñïèðò (25:24:1) (öåíòðèôóãèðîâàíèå 30 ìèí, 15 000 g, ïðè 4° Ñ), ïðîìûâàåòñÿ 70% ýòàíîëîì, îñàäîê âûñóøèâàåòñÿ (ïåðåâåðíóâ ïðîáèðêó íà ôèëüòðîâàëüíóþ áóìàãó), ðåñóñïåíçèðóåòñÿ â 10 ììîëü Òðèñ-ÍÑl è îáðàáàòûâàåòñÿ ðèáîíóêëåàçîé À (10 ìã/ìë) â òå÷åíèå 30 ìèí ïðè òåìïåðàòóðå 37° Ñ. Ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêè îïðåäåëÿþò êîëè÷åñòâî ïîëó÷åííîé ÄÍÊ (l 260 è 280 íì). Ýëåêòðîôîðåç ÄÍÊ (5 ìêã/ïðîáà) îñóùåñòâëÿþò â 1,5% àãàðîçíîì ãåëå, îêðàøåííîì ýòèäèóì áðîìèäîì, ïðè 35  â òå÷åíèå 4 ÷. Íàëè÷èå àïîïòîçà îöåíèâàþò ïî îáðàçîâàíèþ ïðè ýëåêòðîôîðåçå «ÄÍÊ-ëåñòíèöû», êîòîðàÿ âûÿâëÿåòñÿ ïðè ïðîïóñêàíèè óëüòðàôèîëåòîâûõ ëó÷åé ÷åðåç ãåëü. 21 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð ÂÎÇÌÎÆÍÛÅ ÎÑËÎÆÍÅÍÈß È ÎØÈÁÊÈ Âîçìîæíûå îøèáêè ïðè îïðåäåëåíèè ïðÿìîãî öèòîòîêñè÷åñêîãî ýôôåêòà ìîãóò âîçíèêíóòü ïðè óâåëè÷åíèè èëè óìåíüøåíèè êîëè÷åñòâà ïàññèðóåìûõ êëåòîê. Ïðè èçó÷åíèè öèòîòîêñè÷íîñòè íà ãåïàòîöèòàõ ìîãóò âîçíèêíóòü çàòðóäíåíèÿ ïðè ïîëó÷åíèè ñóñïåíçèè, îáóñëîâëåííûå íåäîñòàòî÷íîé ïåðôóçèåé ïå÷åíè ðàñòâîðîì êîëëàãåíàçû. Ïðè èçáûòî÷íîì âðåìåíè ïåðôóçèè âîçìîæíî ðàçðóøåíèå ãåïàòîöèòîâ è ñíèæåíèå âèòàëèòåòà. ÏÐÎÒÈÂÎÏÎÊÀÇÀÍÈß Ê ÏÐÈÌÅÍÅÍÈÞ Ïðîòèâîïîêàçàíèÿ ê èñïîëüçîâàíèþ ìåòîäà îòñóòñòâóþò. 22 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ