Роль дрожжей рода Rhodotorula в развитии гуморального

Иммунопатология, аллергология, инфектология
Immunopathology, allergology, infectology
2011, №4:2732
АЛЛЕРГОЛОГИЯ
Роль дрожжей рода Rhodotorula в развитии гуморального
иммунного ответа у больной атопическим дерматитом
В.Г. Арзуманян *, О.А. Баева*, О.А.Сердюк**, О.О. Магаршак*, Л.И. Краснопрошина*
* Учреждение Российской академии медицинских наук НИИ вакцин и сывороток имени И.И.Мечникова РАМН,
Москва
** НОУ Институт профилактики и диагностики социально значимых заболеваний, Москва
Role of Rhodotorula yeast in humoral immume response in patient with atopic
dermatitis
V.G. Arzumanian*, O.A. Baeva*, O.A. Serdyuk**, O.O. Magarshak*, L.I. Krasnoproshina *
* Mechnikov Research Institute for vaccines and Sera Russian Academy of Medical Sciences, Moscow,
** Institute for Profilacsis and Diagnostic of Socially Significant Diseases, Moscow, Russia
Аннотация
Summary
Изучены некоторые показатели общего и специфичес
кого специфического гуморального и клеточного ответа
у больной атопическим дерматитом в возрасте 6 лет на
фоне носительства дрожжей рода Rhodotorula sp. на
коже кистей. Тест на чувствительность дрожжей к про
тивогрибковым препаратам показал, что данный изолят
устойчив к азолам, как и многие базидиомицеты, но
чувствителен к пимафуцину и цитросепту. После ана
лиза иммунного статуса оказалось, что большинство
показателей лежит за пределами возрастной нормы;
выявлен дисбаланс в содержании Тлимфоцитов и на
рушение фагоцитарной активности нейтрофилов; на
блюдалась повышенная концентрация иммуноглобули
нов классов G и M, что свидетельствовало о наличии
активного инфекционного процесса. Ребенку были на
значены зиртек, ликопид, линекс и лактофильтрум, а
местно – раствор цитросепта, крема Пимафукорт и Ло
кобейз рипеа. Улучшение наступило уже через 2,5 не
дели, а на протяжении как минимум 6 месяцев сохра
нялась стойкая ремиссия заболевания. При повторном
обследовании кожи дрожжи Rhodotorula sp. не были
обнаружены. Повторное иммунологическое обследова
ние показало положительную динамику в виде норма
лизации показателей фагоцитоза и гуморального имму
нитета, а также тенденцию к улучшению субпопуляци
онного состава лимфоцитов. Исследование сыворотки
крови методом дотблот анализа и иммуноблоттинга с
препаратами поверхностных слоев клеток Rhodotorula
позволило установить наличие специфических имму
ноглобулинов классов G и E, что может свидетельство
вать об участии этих дрожжей в развитии аллергичес
кого воспаления. Причинно значимым антигеном (ал
лергеном) дрожжей Rhodotorula у данной больной
явился белок с молекулярной массой 73,5 кДа.
Some parameters of total and specific humoral and cellular
immunity were searched in 6 years old girl – patient with
atopic dermatitis, which had yeast Rhodotorula sp. on the
hands skin. Yeasts sensitivity test showed a resistance to
azoles, but susceptibility to pimafucin and citrosept. The
immune status analysis demonstrated the following: most
of parameters were out of age limit norms; disbalance in T
lymphocytes content and phagocytal activity of
neutrophils; increased concentration of IgG and IgM,
which concerned with the active inflectional process. Zirtek,
likopid, linex, and lactofiltrum were administered pes os,
but citrosept solution, Pimafucort crиme and Locobase
repare – locally. Amelioration became after 2,5 weeks, with
minimum 6 months remission of disease. At the repeated
examination of the skin yeast was not detected. Control
immunological examination showed the positive dynamics,
which consist in normalization of parameters of
phagocytosis and humoral immunity, with a tendency to
improvement of subpopulational content of lymphocytes.
A study of child serum by dotblot analysis and
immunoblotting with extracts of surface layers of
Rhodotorula cells allowed to determine a presence of
specific IgG and IgE, that may indicate the participation of
this yeast in allergic inflammation process. A causative
antigen (allergen) of the yeast for the patient was a protein
with molecular mass about 73,5 kDa.
Иммунопатология, Аллергология, Инфектология 2011 N°4
27
В.Г. Арзуманян, О.А. Баева, О.А.Сердюк и др.
Ключевые слова
Key words
Атопический дерматит, Rhodotorula, причинно значимый
аллергенный белок
Atopic dermatitis, Rhodotorula, causative allergen protein
Немаловажную роль в развитии атопическо
го дерматита (АД) могут играть дрожжевые
грибы, зачастую обитающие на коже, а именно
дрожжи родов Candida и Malassezia. Однако на
ряду с этими превалирующими родами дрож
жей на коже больных АД встречаются и прочие
рода, такие как Rhodotorula, Cryptococcus,
Trichosporon и др. Исследование, проведенное
ранее на 326 больных АД, показало, что в 39%
случаев выделяются дрожжевые грибы, из кото
рых в 21% случаев обнаруживаются дрожжи
рода Rhodotorula [1]. Для дрожжей Candida и
Malassezia описаны белковые и гликопротеино
вые антигены, участвующие в формировании
аллергического иммунного ответа [2; 3; 4]. Име
ется одна публикация, в которой дрожжи рода
Rhodotorula описаны как причинно значимый
агент в развитии аллергического альвеолита
[5]. Известен факт наличия перекрестных ал
лергенов маннопротеиновой природы, содер
жащихся в грубых экстрактах из дрожжей раз
ных родов и вызывающих формирование гумо
рального иммунного ответа у больных аллерги
ческими заболеваниями [6]. Описан также ряд
перекрестно реагирующих аллергенных белков
– енолаз, протеиназ и др. из разных родов
дрожжей [7]. Однако до сих пор ничего неизве
стно о высоко специфичных белковых аллер
генных субстанциях дрожжей рода Rhodotorula
и об их роли в патогенезе АД.
Целью настоящей работы явилось изучение
показателей общего и специфического гумо
рального и клеточного ответа у больной АД на
фоне носительства дрожжей рода Rhodotorula.
Посев на микрофлору производили с кожи
кистей ребенка методом отпечатков на бакпе
чатки «Ленмедполимер» контейнеры с селек
тивными питательными средами. Количествен
ный учет и идентификацию полученной микро
флоры проводили ранее описанным методом
[8]. Определение чувствительности грибов к
противогрибковым препаратам проводили ме
тодом микроразведений [9].
Изучение показателей иммунного статуса
проводили путем определения уровня попу
ляций лимфоцитов методом иммунофлуо
ресцентного анализа с использованием мо
ноклональных антител при подсчете на
проточном цитофлуориметре. Уровень им
муноглобулинов в сыворотке крови опре
деляли методом иммунодиффузии в агаре
по Манчини. Оценку фагоцитарной актив
ности нейтрофилов крови проводили путем
определения поглощения культуры стафило
кокка и использования теста с нитросиним
тетразолием (НСТ).
Антигенный комплекс для изучения уровней
специфических иммуноглобулинов получали из
биомассы дрожжей коллекционного штамма
Rhodotorula mucilaginosa № 132, выращенной до
экспоненциальной фазы роста [10], путем из
бирательной экстракции детергентом [11]. Та
кой метод экстракции позволяет выделить пре
имущественно поверхностные белки и гликоп
ротеины. Уровни иммуноглобулинов классов
IgE и IgG определяли методом дотблот анали
за и иммуноблоттинга [12].
Материалы и методы
Объектом наблюдения явилась девочка 6
лет, страдающая АД в течение 3 лет. На кистях
ребенка наблюдалась типичная морфологичес
кая картина обострения: эритема, экскориа
ции, лихенификация кожи, сопровождающие
ся выраженным зудом. С диагностической це
лью были проведены: микробиологическое ис
следование кожных покровов на наличие гриб
ной инфекции с определением чувствительнос
ти к антимикотическим препаратам; исследова
ние некоторых иммунологических показателей.
28
Результаты и обсуждение
При микологическом исследовании с кистей
ребенка были выделены дрожжи Rhodotorula
spp. в количестве 220 КОЕ/дм2 (десятикратное
превышение нормы высева для данного мето
да). Чувствительность полученной культуры
дрожжей оценивали в отношении 11 препара
тов (см. табл. 1). Очевидно, что, как было ранее
установлено для базидиомицетов [9], данный
изолят нечувствителен к азолам – низоралу,
орунгалу, дифлюкану и клотримазолу, однако,
проявлял чувствительность к антисептикам нитроксолину и.цитросепту.
Immunopathology, Allergology, Infectology 2011 N°4
Аллергология: Роль дрожжей рода Rhodotorula в развитии гуморального иммунного ответа у больной атопическим дерматитом
Таблица 1. Чувствительность изолята дрожжей Rhodotorula к набору противогрибковых препаратов, оцененная
методом микроразведений
Противогрибковый препарат
Нижний и верхний оцениваемые
пределы концентраций, мкг/мл
Чувствительность,
баллы
Низорал (кетоконазол)
Клотримазол (канестен)
Экзодерил (ламизил)
Дифлюкан (флюконазол)
Нитрофунгин
Амфотерицин В
Орунгал (итраконазол)
Пимафуцин (натамицин)
5НОК (нитроксолин)
Мирамистин
Цитросепт
0,5 – 4,0
0,5 – 4,0
64 – 256
8 – 64 1
2,0 – 16,0
1,0 – 2, 0
0,5 – 4,0
2,0 – 16,0
2,0 16,0
16 – 100
1:10001:100
(разведения аптечного
препарата)
1
1
1
2
1
1
2
3
2
3
«3» означает, что микроорганизмы чувствительны к обеим оцениваемым концентрациям препарата; «2» – нечувствительны к нижнему, но чувствительны к
верхнему пределу, т.е. умеренно устойчивы; «1»– нечувствительны к обеим испытуемым концентрациям.
Исходя из данных микробиологического и
иммунологического обследования (результа
ты которого приведены ниже) ребенку была
назначена следующая терапия: зиртек, лико
пид, линекс и лактофильтрум, а местно – ра
створ цитросепта, крема Пимафукорт и Ло
кобейз рипеа. Уже к концу первой недели ле
чения наблюдалось значительное улучшение
состояния кожных покровов кистей, а через
2,5 недели кожные проявления были полнос
тью купированы. В дальнейшем на протяже
нии как минимум 6 месяцев сохранялась
стойкая ремиссия заболевания. При повтор
ном обследовании кожи дрожжи рода
Rhodotorula не обнаружены.
Данные иммунологических показателей в
динамике приведены в табл.2. При анализе ис
ходных значений обращает на себя внимание
то, что большинство этих показателей лежит
за пределами возрастной нормы. Как и следо
вало ожидать при хронической грибковой
инфекции, выявлен дисбаланс в содержании
Тлимфоцитов и нарушение фагоцитарной
активности нейтрофилов [13]. Кроме того,
наблюдалась повышенная концентрация им
муноглобулинов классов G и M, что свиде
тельствовало о наличии активного инфекци
онного процесса. При контрольном иммуно
логическом обследовании отмечена положи
Иммунопатология, Аллергология, Инфектология 2011 N°4
тельная динамика в виде нормализации пока
зателей фагоцитоза и гуморального иммуните
та, а также тенденция к улучшению субпопуля
ционного состава лимфоцитов.
Дотблот анализ сыворотки крови для вы
явления специфических иммуноглобулинов
проводили с использованием экстрактов, по
лученных на 1 7 сутки роста культуры и урав
ненных по белку (рис. 1). В изучаемой сыво
ротке были выявлены иммуноглобулины
классов G и E к белковому комплексу дрож
жей Rhodotorula mucilaginosa. При этом препа
рат, выделенный из клеток стационарной
фазы роста (7 сутки), содержал наибольшее
количество антигенных белков, вызывающих
как IgG, так и IgE ответ.
Определение антител к определенным бел
кам дрожжей проводили методом иммуно
блоттинга, для которого использовали препа
рат, полученный из клеток стационарной
фазы роста (рис. 2). После инкубации нитро
целлюлозы с сывороткой и последующей об
работки антителами к человеческому IgG
оказалось, что единственным антигенным
белком явился белок с молекулярной массой
73,5 кДа. При обработке нитроцеллюлозы
антителами к человеческому IgE было уста
новлено, что тот же белок 73,5 кДа явился
причинно значимым аллергеном.
29
В.Г. Арзуманян, О.А. Баева, О.А.Сердюк и др.
Таблица 2. Данные иммунологического обследования
Показатель
Норма для 46 лет
Лейкоциты, тыс. в мкл
Лимфоциты, %
6,8 10
38 53
Результат
До лечения
После лечения
9,9
10
7,65
20
Популяционный состав лимфоцитов
CD3 (Тлимфоциты), %
CD3 (Тлимфоциты), abs
CD4 (Тхелперы), %
CD4 (Тхелперы), abs
CD8 (Тсупрессоры), %
CD8 (Тсупрессоры), abs
ИРИ (иммунорегуляторный
индекс = CD4/CD8)
CD16 (натуральные киллеры), %
CD16 (натуральные киллеры), abs
CD72 (Влимфоциты), %
CD72 (Влимфоциты), abs
62 – 69
1800 – 3000
30 – 40
1000 – 1800
25 – 32
800 – 1500
1,2 – 2,0
78
887
40
441
19
216
2,1
76
1173
38
587
21
324
1,8
8 – 15
200 – 600
21 – 28
700 – 1300
10,6
146
12
130
8
127
15
232
Иммуноглобулины сыворотки крови
IgG, мг/мл
IgM, мг/мл
IgA, мг/мл
5,5 – 14,1
0,51 – 1,38
0,73 – 5,3
14,58
2,58
1,48
11,43
1,54
4,9
Фагоцитарная активность нейтрофилов
Фагоцитарный индекс, %
Содержание формазан
позитивных нейтрофилов, %
Цитологический показатель, у.е.
Индекс активации латексом
40 – 80
5 – 23
29
40
61
8
0,1 – 0,32
Более 3
0,48
1,0
0,12
2,5
Рис. 1. Дотблот анализ препаратов поверхностных белков клеток Rhodotorula с сывороткой крови больной
атопическим дерматитом:
1 – клетки экспоненциальной фазы роста;
2 7 клетки фазы замедления роста;
3, 4 и 7 – клетки разных стадий стационарной фазы роста;
7 К – отрицательный контроль;
+К – положительный контроль.
30
Immunopathology, Allergology, Infectology 2011 N°4
Аллергология: Роль дрожжей рода Rhodotorula в развитии гуморального иммунного ответа у больной атопическим дерматитом
Рис. 2. Иммуноблоттинг препарата поверхностных белков Rhodotorula с сывороткой больной АД.
Цифры слева относятся к полосе № 3 7 белковым маркёрам молекулярной массы (кДа)
• Использован препарат, выделенный из клеток поздней стационарной фазы роста 7 7 сутки.
• 1 и 2 7 блоты инкубированы в сыворотке, разб в 20 раз, проявлены антителами к человеческому IgG, разведение 1:2000.
• 3 7 маркёры молекулярной массы,
• 4 и 5 7 блоты инкубированы в сыворотке, разб в 2 раза, проявлены антителами к человеческому IgE, разведение 1:500.
Окраска ТМБ.
Выводы
Таким образом, наличие иммуноглобу
линов классов G и E к поверхностным бел
кам дрожжей Rhodotorula в сыворотке кро
ви больной АД, может свидетельствовать
об участии этого гриба в развитии аллерги
ческого воспаления. При этом причинно
значимым антигеном дрожжей Rhodotorula
у данной больной явился белок с молеку
лярной массой 73,5 кДа.
Литература
1 . Aрзуманян В.Г.,Магаршак О.О.,Семенов Б.Ф.
Дрожжеподобные грибы у пациентов с аллергически
ми заболеваниями: видовое разнообразие и чувстви
тельность к противогрибковым препаратам. Бюлле
тень экспериментальной биологии и медицины.
2000; 6: 704708.
7. Crameri R., Zeller S., Glaser A. et al. Crossreactivity among
fungal allergens: a clinically relevant phenomenon? Mycoses.
2008; 52: 99–106.
2. Akiyama K. The role of fungal allergy in bronchial asthma.
[Review]. Nippon Ishinkin Gakkai Zasshi. 2000; 3: 14955.
8 . Арзуманян В.Г., Зайцева Е.В., Кабаева Т.И. и др.
Оценка стафилококковой и нелипофильной дрожже
вой микрофлоры кожи у больных с кожной патоло
гией при контактном способе посева . Вестник дер
матологии и венерологии. 2004; 6: 36.
3 . Ballantyne Denis S. Warmington John R. Purification
of native enolase from medically important Candida
species. Biotechnology & Applied Biochemistry. 2000; 3:
2138.
9. Арзуманян В.Г. Минимальные ингибирующие кон
центрации некоторых противогрибковых препаратов
для клинически значимых базидиомицетных дрожжей.
Антибиотики и химиотерапия. 2002; 2: 7–10.
4. Zargari A. Identification and characterization of allergen
components of the opportunistic yeast Malassezia furfur. Repro
Print AB.: Stockholm. 1998; 5056.
10. Арзуманян В. Г., Кабаева Т. И., Шелемех О. В.
Прогнозирование сохранности клинически значи
мых коллекционных культур дрожжей на примере
Malassezia. Иммунопатология, аллергол, инфектол.
2004; 1: 569.
5. Siersted HC. Gravesen S. Extrinsic allergic alveolitis after
exposure to the yeast Rhodotorula rubra . Allergy. 1993; 4: 298
9.
6. Savolainen J., KortekangasSavolainen O., Nermes M. et al.
IgE, IgA, and IgG responses to common yeasts in atopic patients.
Allergy. 1998; 5: 50612.
Иммунопатология, Аллергология, Инфектология 2011 N°4
11. Арзуманян В.Г., Быкова С.А., Сердюк О.А. и др. Ал
лергенсодержащий препарат из дрожжей Malassezia spp.
Бюллетень эксперим.биологии и медицины. 2000; 11:
54851.
31
В.Г. Арзуманян, О.А. Баева, О.А.Сердюк и др.
12. Towbin H., Gordon U., Staehelin T., Electrophoretic
transfer of proteins from poly acrylamid gels to nitro cellulose
sheets procedure and some. Proc. Nat. Acad. Sci. (USA). 1979;
9: 435054.
13. Сергеев А. Ю., Сергеев Ю. В. Факторы резистентности
и иммунитет при грибковых инфекциях кожи и слизис
тых оболочек. Иммунопатология, аллергол, инфектол.
2004; 1:614.
Сведения об авторах:
1. Арзуманян Вера Георгиевна – зав. лабораторией физиологии грибов и бактерий, д.б.н., НИИ ВС им. Мечникова РАМН, Москва, 105064, Малый Казённый
переулок, 5а.,
879167495720721 (моб.), 4957917709703 (р.).
2. Баева Ольга Андреевна – аспирант, «7«
3. Сердюк Ольга Анатольевна – ведущий научный сотрудник, к.б.н., Институт профилактики и диагностики социально значимых заболеваний, 8791676517
10769.
4. Магаршак Ольга Олеговна – старший научный сотрудник, к.м.н., Лаборатория вакцинопрофилактики НИИВС им. Мечникова, «7« , 4957917741749.
5. Краснопрошина Людмила Ивановна – зав. лабораторией иммунологических методов исследования, д.м.н., проф., НИИВС им.Мечникова, « 7 « , 49579177
34772.
32
Immunopathology, Allergology, Infectology 2011 N°4