SWorld – 18-27 December 2012 http://www.sworld.com.ua/index.php/ru/conference/the-content-of-conferences/archives-of-individual-conferences/december-2012 MODERN PROBLEMS AND WAYS OF THEIR SOLUTION IN SCIENCE, TRANSPORT, PRODUCTION AND EDUCATION‘ 2012 УДК 577.15:663.12 Черно Н.К., Коваленко А.В., Шапкина К.И. ПОЛУЧЕНИЕ И ЧАСТИЧНЫЙ ГИДРОЛИЗ БЕТА-ГЛЮКАНА КЛЕТОЧНЫХ СТЕНОК ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCESS CEREVISIE Одесская национальная академия пищевых технологий, Украина, г.Одесса, ул.Канатная 112, 65039 UDC 577.15:663.12 Cherno N.K., Kovalenko A.V., Shapkina K.I. ISOLATION AND PARTIAL HYDROLYSIS OF THE BETA-GLUCAN OF THE YEAST CELL WALLS SACCHAROMYCESS CEREVISIE Odessa National Academy of Food Technologies, Ukraine, Odessa, st. Kanatnaya 112, 65039 Разработан упрощенный метод получения β-глюкана клеточных стенок дрожжей Saccharomyces водорастворимой cerevisiae. формы Показана глюкана возможность посредствам получения ограниченного ферментативного гидролиза. The simple method for isolating β-glucan from the cell walls of Saccharomyces cerevisiae is developed. A water-soluble glucan was obtained by the limited enzymatic hydrolysis of the water-insoluble glucan. Ключевые слова: β-глюкан, дрожжи, ферментативный гидролиз, водорастворимый дрожжевой β-глюкан. Key words: β-glucan, yeast, enzymatic hydrolysis, water-soluble yeast glucan. Бета-глюканы – полисахариды, присутствующие в клеточных стенках различных зерновых культур (овес, ячмень), водорослей, микроорганизмов и грибов. В последние годы они привлекают к себе пристальное внимание как иммуномодуляторы, вещества, обладающие онко- и радиопротекторными свойствами. Бета-глюканы различных источников имеют некоторые отличия в своей структуре. Так например, зерновые β-глюканы имеют линейное строение макромолекул, в состав которых входит блоки из остатков β-(1→4)- связанных D-глюкопираноз, разделенные β-(1→3)- связями. Блочные фрагменты представляют собой три- либо тетрамеры, соотношение которых варьирует. Бета-глюканы дрожжей и грибов, в отличие от зерновых глюканов, имеют разветвленное строение. Основная цепь их макромолекул состоит из остатков β-D-глюкопираноз, соединенных (1→3) гликозидными связями. К ней в положениях О-6 подсоединяются боковые ответвления, частота и размер которых вариабельны [1]. Считается, что наиболее важным физиологическим эффектом β-глюканов является их способность влиять на иммунную систему. Механизм действия β-глюканов заключатся в активации иммунной системы человека. Особенностью иммуномодулирующего действия является адекватное повышение активности иммунной системы без ее чрезмерной стимуляции, что нередко служит причиной возникновения аутоиммунных заболеваний [2]. Биологическая действие β-глюканов определяется многими факторами: типом и конфигурацией разветвленностью и связей конформацией между остатками макромолекулы, моносахаридов, степенью ее полимеризации; растворимостью в воде и др. [3]. Установлено, что растворимые β-глюканы обладают большей физиологической активностью, чем нерастворимые. Показано, что, в сравнении с другими глюканами, β-(1→3), (1→6)-D-глюкан дрожжей Saccharomyces cerevisiae проявляет наибольшую физиологическую активность [4]. В клеточных оболочках дрожжей β-глюкан находится во внутреннем слое клеточной стенки [5], где он соединен с белком, мананом и хитином. Эти компоненты связаны ковалентными связями, что усложняет технологию получению глюкана клеточной стенки. Существуют различные подходы к выделению β-глюкана из клеточной стенки хлебопекарных дрожжей. Они, преимущественно, основаны на разрушении клеточной оболочки путем физического воздействия (обработка ультразвуком, разрушение клеток дрожжей с помощью бус Балотини и др.) с последующей обработкой щелочью или ферментами для удаления сопутствующих веществ. Имеются данные о получении глюкана клеточной стенки путем непосредственной обработки биомассы дрожжей ферментными препаратами [6], которые способствуют декструкции сопутствующих ему соединений. Описан последовательную метод обработку получения β-глюкана, дрожжей растворами предусматривающий гидроксида натрия, уксусной кислоты и ацетата натрия с последующим автоклавированием для удаления белка, гликогена и маннана [7]. Однако эти способы трудоемки и энергозатратны. Вышеизложенное определяет актуальность данной работы, посвященной разработке упрощенного способа получения дрожжевого β-глюкана и его наиболее физиологически активной – водорастворимой формы. Сущность разработанного метода заключается в использовании для разрушения клеточных оболочек обработки дрожжей пероксидом водорода и последующего удаления сопутствующих глюкану соединений посредствам их ступенчатой экстракции из дезинтегрированной дрожжевой биомассы. В экспериментах по дезинтеграции клеточных оболочек использовали 3 %, 15 % и 24 % растворы H2O2, варьируя продолжительность обработки и массовое соотношение дрожжи–раствор пероксида водорода. Дезинтегрированную дрожжевую массу промывали дистиллированной водой и центрифугировали. Для удаления белка и маннана твердый остаток обрабатывали 3%-ным раствором NaOH в течение 30 минут при температуре 18 – 22 °С, а затем 6%ным раствором NaOH в течение 60 минут при температуре 50 – 60 °С. Смесь центрифугировали, твердую фазу суспендировали в дистиллированной воде добавляли 0,1 н раствор НСl до рН среды 5,0. Надосадочную жидкость отделяли центрифугированием, остаток суспендировали в 0,5 н растворе уксусной кислоты и нагревали до температуры 75 °С для удаления гликогена, затем промывали несколько раз дистиллированной водой и высушивали. Содержание углеводной составляющей в получаемых продуктах варьировало в диапазоне 82,6 – 97,3 %, белка 0 – 14,5 %, гликоген отсутствовал. Выход продуктов составлял 8,1 – 19,7 %. Установлено, что условиями обработки дрожжей пероксидом водорода, обеспечивающими высокий выход продукта в сочетании с низким содержанием в нем белка, являются следующие: концентрация H2O2 в растворе 3 %, соотношение дрожжи – раствор пероксида водорода 1:2, продолжительность обработки 180 минут. При этих условиях выход целевого продукта – 14,7 %, содержание в нем β-глюкана – 89,7 %, белка – 8,3 %. Получить глюкан, не содержащий сопутствующие соединения, возможно обработкой сырья 24 % раствором H2O2 при массовом соотношении дрожжи – раствор пероксида водорода 1:2 и продолжительности обработки 300 минут. Выход – 8,1 %, содержание глюкана 97,3 %, белок отсутствует. Для получения водорастворимой формы глюкана использовали ферментный препарат, обладающий эндо-1,3-β-глюканазной активностью. Ферментативный гидролиз проводили при Т = 50 °С и рН 4,5, варьируя концентрацию фермента в растворе, продолжительность ферментолиза и соотношение фермент: субстрат (E:S). По окончании процесса смесь кипятили в течение 15 минут для инактивации фермента, охлаждали и центрифугировали. Накопление водорастворимых углеводов – продуктов частичного гидролиза глюкана, определяли антроновим методом. Степень перехода в раствор твердой фазы в условиях эксперимента колебалась в диапазоне 45 – 91% (табл.1). Таблица 1 Выход водорастворимых продуктов, % от массы исходного полисахарида № Концентрация Продолжительность образ- фермента, ца мг/см3 1 0,25 ферментолиза, ч Соотноше- Выход ние E:S водорастворимых углеводов, % 24 1:15 45,3 2 3 48 4 5 72 6 7 0,50 24 8 9 48 10 11 72 12 1:30 52,1 1:15 63,2 1:30 67,3 1:15 91,5 1:30 87,0 1:15 45,1 1:30 45,8 1:15 61,5 1:30 71,3 1:15 80,7 1:30 81,5 Установлено, что варьируя условия ферментативного гидролиза, можно получить фрагментированный водорастворимый глюкан, молекулярная масса, которая находится в интервале от 0,5 120 кДа и выше. Так например, ферментативный гидролиз исходного глюкана при концентрации фермента в растворе 0,25 мг/см3, соотношение E:S=1:15 и продолжительности ферментолиза 72 часа позволяет получить водорастворимые фрагменты, в которые содержание фракции с молекулярной массой 1 – 30 кДа, считающейся наиболее физиологически активной [8], составляет 67,9 % от сухой массы глюкана клеточных стенок. Таким образом, разработан простой в применении способ получения βглюкана клеточных стенок хлебопекарных дрожжей Saccharomyces cerevisiae с высоким выходом. Установлены условия преобразования β-глюкана в водорастворимую форму с применением ограниченного ферментативного гидролиза. Литература: 1. Syed, H. A. The world of β‐glucans – a review of biological roles, applications and potential areas of research / H. A. Syed // Thesis for the requirement of master of Science – Medical Biology. – 2009. – P. 13-18. 2. Chen, Jiezhong. Medicinal importance of fungal β-(1→3), (1→6)-glucans / Jiezhong Chen, Robert Seviour // Mycological research. – 2007. – P. 635–652. 3. Беседнова, Н. Н. Иммунотропные свойства (1→3), (1→6)-β-D-глюканов / Н. Н. Беседнова, Л. А. Иванушко, Т. Н. Звягинцева Л. А. Елякова // Антибиотики и химиотерапия. – 2000. – № 5. – С. 37– 44. 4. Petravic-tominac, Vlatka Biological effects of yeast β-glucans / Vlatka Petravic-tominac, Vesna Zechner-krapan, Slobodan Grba, Siniša Srecec and all // Agriculturae Conspectus Scientificus – 2010. – Vol. 75. – 149–158. 5. Catalli, A. «Chitin and β-glucan polysaccharides as immunomodulators of airway inflammation and atopic disease» / A. Catalli, M. Kulka // Metabolic & Immune Drug Discovery. – 2010. – Vol. 4. – P. 175-189. 6. Пат. 2216595 МКП C12P19/04, C08B37/00, C12N1/16 A61K31/716. Способ получения бета-глюкана клеточной стенки дрожжей / Тонева-Давидова Е.Г.; заявитель и патентообладатель закрытое акционерное общество "Торговозакупочная фирма ВАИГ"№ 2002130728/13: Заяв. 18.11.2002; опубл. 20.11.2003, 7. Методы химии углеводов / под ред. Н. К. Кочеткова. – М.: Мир, 1967. – 125 с. 8. Patent 6143883, Water-soluble low molecular weight beta-glucans for modulating immunological responses in mammalian system / Lehmann, Joachim (Scottsdale, AZ), Kunze, Rudolf (Berlin, DE). – №09/224145; Filing Date 12.31.1998; Publication Date 11.07.2000. – 8с. References: 1. Syed, H. A. The world of β‐glucans – a review of biological roles, applications and potential areas of research / H. A. Syed // Thesis for the requirement of master of Science – Medical Biology. – 2009. – P. 13-18. 2. Chen, Jiezhong. Medicinal importance of fungal β-(1→3), (1→6)-glucans / Jiezhong Chen, Robert Seviour // Mycological research. – 2007. – P. 635–652. 3. Besednova N. N., Immynotropnue svoistva (1→3), (1→6)-β-D-glucan / N. N. Besednova, L. A. Ivanyshko, T. N. Zvaigiceva, L. A. Elaikova //Antibiotiki I himioterapiai. – 2000. – № 5. – S. 37– 44. 4. Petravic-tominac, Vlatka Biological effects of yeast β-glucans / Vlatka Petravic-tominac, Vesna Zechner-krapan, Slobodan Grba, Siniša Srecec and all // Agriculturae Conspectus Scientificus – 2010. – Vol. 75. – 149–158. 5. Catalli, A. «Chitin and β-glucan polysaccharides as immunomodulators of airway inflammation and atopic disease» / A. Catalli, M. Kulka // Metabolic & Immune Drug Discovery. – 2010. – Vol. 4. – P. 175-189. 6. Pat. 2216595 MKP C12P19/04, C08B37/00, C12N1/16 A61K31/716. Sposob polycheniai beta-glucana kletochoi stenki Toneva-Davidova E.G./ № 2002130728/13: Zaaiv. 18.11.2002; opybl. 20.11.2003. 7. Metod himai yglevodov / pod red. N. K. Kochetkov. M.: Mir, 1967. – 125 s. 8. Patent 6143883, Water-soluble low molecular weight beta-glucans for modulating immunological responses in mammalian system / Lehmann, Joachim (Scottsdale, AZ), Kunze, Rudolf (Berlin, DE). – №09/224145; Filing Date 12.31.1998; Publication Date 11.07.2000. – 8с.