HLA типирование - исследование главного комплекса

HLA-типирование
HLA типирование - исследование главного комплекса гистосовместимости человека
- HLA комплекса. Это образование включает в себя область генов на 6-й хромосоме,
которые кодируют HLA-антигены, участвующие в различных реакциях иммунного
ответа.
Задачи при HLA типировании могут стоять самые разные - биологическая
идентификация (HLA-тип наследуется вместе с родительскими генами), определение
предрасположенности к различным заболеваниям, подбор доноров для пересадки
органов - при этом производится сравнение результатов HLA типирования тканей
донора и реципиента. С помощью HLA типирования определяют, и насколько супруги
сходны или различимы по антигенам тканевой совместимости, чтобы диагностировать
случаи бесплодия.
HLA типирование предполагает анализ полиморфизма HLA и проводится двумя
методами - серологическим и молекулярно-генетическим. Классический серологический
метод HLA типирования основан на микролимфоцитотоксическом тесте, а молекулярный
метод использует проведение ПЦР (полимеразную цепную реакцию).
Серологическое HLA типирование проводится на выделенных клеточных популяциях.
Антигены главного комплекса гистосовместимости несут на себе в основном лимфоциты.
Поэтому суспензию Т лимфоцитов используют в качестве основных носителей антигенов
I класса, и суспензию В лимфоцитов для определения антигенов HLA II класса. Для
выделения необходимых клеточных популяций из цельной крови используют либо
центрифугирование, либо иммуномагнитную сепарацию. Считается, что первый способ
может привести к ложноположительным данным, так как при этом происходит гибель
части клеток. Второй способ признан более специфичным - при этом более 95% клеток
остаются жизнеспособными.
1/4
HLA-типирование
Но основой постановки лимфоцитотоксического теста HLA типирования является
специфическая сыворотка, содержащая антитела к различным аллельным вариантам
антигенов HLA I и II классов. Серологический тест позволяет определить HLA-тип путем
изучения того, какие из сывороток реагируют с лимфоцитами, а какие - нет.
Если между клетками и сывороткой происходит реакция, в результате на поверхности
клетки образуется комплекс антиген-антитело. После добавления раствора,
содержащего комплемент, происходит лизис и гибель клетки. Оценивают
серологический тест HLA типирования с помощью флуоресцентной микроскопии по
оценке позитивной (красная флуоресценция) и негативной (зеленая флуоресценция)
реакций, или фазово-контрастной микроскопии по окраске ядер погибших клеток.
Результат HLA типирования выводят с учетом специфичности прореагировавших
сывороток и перекрестно реагирующих групп антигенов, интенсивности реакции
цитотоксичности.
Недостатками серологического HLA типирования являются наличие перекрестных
реакций, слабое сродство антител или низкая экспрессия HLA-антигенов, отсутствие
белковых продуктов у ряда HLA-генов.
Более современные, молекулярные методы HLA типирования используют уже
стандартизованные синтетические образцы, которые реагируют не с антигенами на
поверхности лейкоцитов, а с ДНК и прямо указывают на то, какие антигены
присутствуют в пробе. Молекулярные методы не требуют живых лейкоцитов, любая
человеческая клетка может быть подвержена изучению, и для работы достаточно
несколько микролитров крови или можно ограничиться соскобом со слизистой оболочки
рта.
2/4
HLA-типирование
Молекулярно-генетическое HLA типирование использует метод ПЦР, первым этапом
которой является получение чистой геномной ДНК (из цельной крови, лейкоцитарной
суспензии, тканей).
Затем образец ДНК копируется - амплифицируется в пробирке с использованием
праймеров (коротких одноцепочечных ДНК), специфичных к определенному HLA
-локусу. Концы каждого из пары праймеров должны быть строго комплементарны
уникальной последовательности, соответствующей конкретному аллелю, в противном
случае амплификация не осуществляется.
После ПЦР, в ходе многократного копирования, получается большое количество
фрагментов ДНК, которое можно оценить визуально. Для этого реакционные смеси
подвергают электролизу или гибридизации, и определяют, произошла ли
специфическая амплификация, при помощи программы или таблицы. Результат HLA
типирования представляется в форме всестороннего отчета на генном и аллельном
уровнях. Из-за стандартизованности используемых образцов, молекулярное HLA
типирование
точнее серологического. Кроме того, оно дает больше информации (больше новых
аллелей ДНК) и более высокий уровень ее детализации, поскольку позволяет
идентифицировать не только антигены, но и сами аллели, обуславливающие, какой
именно антиген присутствует на клетке.
3/4
HLA-типирование
4/4