иммуномодулирующие свойства рекомбинантного белка
реклама
На правах рукописи ШЕВЦОВ Максим Алексеевич ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА HSP70 В ТЕРАПИИ ОПУХОЛЕЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА 03.03.04 – Клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2013 г. Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт цитологии Российской академии наук Научные руководители: доктор биологических наук Борис Александрович Маргулис Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург доктор медицинских наук, профессор Вильям Арамович Хачатрян ФГБУ «РНХИ им. проф. А.Л.Поленова» Минздравсоцразвития России, Санкт-Петербург Официальные оппоненты: кандидат биологических наук Наталья Алексеевна Филатова Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург доктор медицинских наук, профессор Евгений Наумович Имянитов ФГБУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздравсоцразвития России, Санкт-Петербург Ведущая организация: ФГБУ «НИИ экспериментальной медицины» СЗО РАМН, Санкт-Петербург Защита состоится «15» февраля 2013 года в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.230.01 на базе Института цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., 4. Сайт института: www.cytspb.rssi.ru Адрес электронной почты института: cellbio@mail.cytspb.rssi.ru Факс института (812) 297-03-41 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН Автореферат разослан «___» января 2013 г. Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Е.В. Каминская ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Иммунотерапия онкологических заболеваний привлекает внимание специалистов в особенности с развитием методов, основанных на использовании молекулярных шаперонов, в частности белка теплового шока Hsp70. Данные, полученные к настоящему времени, указывают на то, что Hsp70 способен активировать адаптивный и врождённый иммунный ответ организма [1]. В частности было установлено, что находящийся на поверхности раковых клеток Hsp70 вызывает активацию цитолитической функции NK-клеток, тем самым указывая на участие белка в стимуляции системы врожденного иммунитета [2]. Аутологичный опухолевый Hsp70, возможно благодаря своей шаперонной активности, способен доставлять опухолевые пептиды в антиген-презентирующие клетки (АПК), и в результате последующей презентации антигенов в комплексе с молекулами MHC I и II классов Т-клеткам формируется генерализованный специфический противоопухолевый ответ [3,4]. Эти открытия привели к появлению десятков конструкций противоопухолевых вакцин на базе молекулярных шаперонов, часть которых находится на разных фазах клинических испытаний [5–7]. Среди подобных технологий обращают на себя внимание способы иммунотерапии с помощью препаратов очищенного Hsp70, доставляемого непосредственно в опухоль. Так, внутриопухолевое введение препарата Hsp70 в комплексе с магнитными наночастицами с последующей локальной гипертермией приводило к задержке прогрессии меланомы [8]. В другом исследовании сочетание рекомбинантного Hsp70 с ДНК-плазмидой, блокирующей иммуносупрессорные молекулы B7-H1 на поверхности клеток меланомы, также приводило к замедлению роста опухоли in vivo [9]. Отчасти описанные эффекты объясняются способностью провоспалительных шаперона цитокинов активировать (TNF-α, GM-CSF созревание и другие), АПК, а продукцию также ряда стимулировать цитолитическую и миграционную активность NK-клеток [10–12]. Однако механизмы запуска как врожденного, так и приобретенного противоопухолевого иммунитета введенным в опухоль или культуру раковых клеток шапероном пока остаются не ясными. Таким образом, учитывая актуальность исследований противоопухолевых эффектов шаперона Hsp70, необходимы работы, как по пониманию механизмов этих эффектов, так и по анализу последних на животных моделях различных онкологических патологий. Цель исследования. Целью работы было изучение влияния иммуномодулирующих противоопухолевых свойств рекомбинантного белка теплового шока Hsp70 человека на раковые клетки in vitro с последующей оценкой таких эффектов in vivo в модели интракраниальной глиомы С6 крыс. Цель отдельной части работы состояла в оценке возможности использования препарата очищенного рекомбинантного белка теплового шока Hsp70 в качестве адьювантной противоопухолевой терапии у больных злокачественными опухолями головного мозга. 3 Задачи исследования. (1) Изучение механизма взаимодействия экзогенного Hsp70 с опухолевыми клеточными линиями различного происхождения (глиома крысы С6, меланома мыши В16, клетки эритроидной лейкемии цитотоксическую человека активность К562) и лимфоцитов. влияния (2) внутриклеточного Оценка терапевтической транспорта на эффективности однократного либо непрерывного внутриопухолевого введения Hsp70 in vivo на модели интракраниальной глиомы С6 у крыс. (3) Изучение иммуномодулирующего влияния Hsp70 на развитие противоопухолевого ответа и мониторинг параметров врожденного и адаптивного иммунного ответа в динамике на модели глиомы С6. (4) Оценка возможности применения препарата очищенного рекомбинатного белка теплового шока Hsp70 в адьювантной терапии злокачественных образований головного мозга в серии ограниченных клинических исследований. Научная новизна работы. противоопухолевого эффекта Впервые экзогенного был продемонстрирован Hsp70 на примере возможный раковых механизм клеток разного происхождения. Был обнаружен феномен транслокации внутриклеточного Hsp70 на поверхность опухолевых клеток под влиянием экзогенного шаперона, что, в свою очередь, приводило к повышению чувствительности клеток к цитолитической активности NK-клеток иммунной системы. Цитотоксическая активность естественных киллеров различалась в зависимости от типа раковых клеток-мишеней, концентрации вносимого в клеточную среду очищенного Hsp70 и продолжительности инкубации клеток с экзогенным белком. Результаты этих экспериментов позволили предложить оригинальную концепцию механизма действия белка Hsp70 в активации противоопухолевого ответа. В ходе экспериментов in vivo на модели внутричерепной опухоли у крыс мы впервые доказали терапевтическую эффективность локальной, внутриопухолевой доставки препарата белка теплового шока Hsp70. Установлено, что внутриопухолевое введение шаперона Hsp70 приводит к задержке прогрессии опухоли и, как следствие этого, к увеличению продолжительности жизни животных. Причинами этого эффекта по нашим данным была последовательная активация врождённого и адаптивного иммунного ответа организма, индуцированная внутриопухолевым введением шаперона. Впервые проведены ограниченные клинические исследования возможности локальной аппликации шаперона Hsp70 у нейроонкологических больных. Установлено, что препарат обладает приемлемым уровнем токсичности и безопасен к применению у больных со злокачественными новообразованиями головного мозга. Личный вклад автора. Все экспериментальные процедуры и обработка результатов выполнены автором лично. Материалы, вошедшие в представленную работу, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научными руководителями. 4 Теоретическое и практическое значение работы. Обнаруженное явление активации белком Hsp70 клеток иммунной системы за счет транслокации собственного, внутриклеточного шаперона на поверхность раковых клеток, с одной стороны, является научным обоснованием противоопухолевого действия Hsp70, а с другой – делает возможным применение препарата белка в качестве средства монотерапии либо в комбинации с другими методами в клинической онкологии. Работа по анализу эффективности технологии с использованием Hsp70 уже начата, и её предварительные результаты указывают на безвредность очищенного Hsp70 для лабораторных животных. Следует отметить, что в Институте цитологии РАН в кооперации с ФГУП «Гос. НИИ ОЧБ» ФМБА России начата работа по подготовке препарата Hsp70 к госрегистрации как лекарственного средства, а также проводится разработка технического задания на доклинические испытания препарата. В техническое задание внесены данные, представленные в диссертации, и это также указывает на высокую практическую значимость выполненной диссертационной работы. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Шестнадцатом международном европейском междисциплинарном онкологическом конгрессе (Швеция, 2011); на Британском нейроонкологическом конгрессе (Великобритания, 2011); на Международном конгрессе педиатрической нейро-онкологии (США, 2011); на Девятом съезде общества европейской ассоциации нейро-онкологии (Румыния, 2011); на VI и VII Международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых учёных (Москва, 2011, 2012); на X и XI Всероссийской научно-практической конференции «Поленовские чтения» (СанктПетербург, 2011, 2012). По материалам диссертации опубликовано 26 работ, в том числе 6 в рецензируемых научных журналах из перечня изданий, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией для публикации материалов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук. Структура и объём диссертации. Диссертационная работа изложена на ___ страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, методы, результаты, обсуждение и выводы. Материал иллюстрирован ___ рисунками и ___ таблицами. Библиографический указатель содержит ____ источников. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Клеточные линии. Клетки крысиной глиомы С6, эритроидной лейкемии человека К562, мышиной меланомы В16 были получены из банка клеточных культур Института цитологии РАН. Клетки С6 выращивались на питательной среде DMEM/F12 с 2мM L-глутамином, содержащей 5 10% фетальной сыворотки (FBS), антибиотики пенициллин 100 ЕД/мл и стрептомицин 100 мкг/мл в 5% СО2 при 37 °С. Для К562 и В16 применяли питательные среды DMEM и RPMI-1640, соответственно. Очищенный человеческий рекомбинантный белок теплового шока Hsp70. Рекомбинантный Hsp70 человека, полученный совместно с ФГУП «Гос. НИИ ОЧБ» ФМБА России, очищали с помощью двухступенчатой хроматографии на геле DEAE-Sepharose и аффинной хроматографии с применением АТФ-агарозы (Sigma, USA). Примеси бактериального липополисахарида (ЛПС) удаляли при помощи хроматографии с гелем Полимиксин В-Агарозы (Sigma, USA). Оценку количества ЛПС в растворе очищенного белка осуществляли с помощью теста LAL E-Toxate (Sigma Aldrich, USA). В конечном растворе белка содержание эндотоксина было ниже 0,1 МЕ/мг. Анализ взаимодействия шаперона Hsp70 с раковыми клетками. Для оценки распределения Hsp70 в клетках-мишенях белок конъюгировали с флуоресцентым агентом Alexa555 (Invitrogen, USA) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Далее Hsp70 вносили в клеточную среду в различных концентрациях на разные временные интервалы, и по окончании инкубации клетки отмывали от экзогенного белка, фиксировали и окрашивали антителами, узнающими конститутивную или индуцибельную форму внуктриклеточного Hsp70. В качестве первичных применяли следующие антитела: BRM-22a (Sigma, USA) (к индуцибельной Hsp70 и конститутивной Hsc70 формам шаперона) и SPA815 (Stressgen, USA) (к конститутивной форме). Анализ проводили с помощью метода конфокальной микроскопии с использованием микроскопа Leica TCS SP5 (Leica Microsystems, Heidelberg, Germany). Оценка выхода внутриклеточного Hsp70 в среду под воздействием экзогенного шаперона. Экспорт эндогенного Hsp70 во внеклеточную среду под действием вносимого в культуру шаперона оценивали, используя клетки глиомы крысы С6 в качестве донора белка. Предварительно Нsp70, связанный с биотином, вносили в клеточную среду на различные промежутки времени. После отмывки клеток от экзогенного белка и инкубации в бессывороточной среде в супернатант последовательно вносили Нейтравидин-Агарозу (Pierce Biotechnology, USA) и АТФ-агарозу с целью захвата сначала внесенного, биотинилированного белка и, далее, собственного шаперона, экспортированного в среду. Пробы геля наносили на полиакриламидный гель для электрофореза, а зоны Нsp70 выявляли с помощью окраски блотов поликлональными антителами RS-2 (1:500) либо авидин-пероксидазой (1:10000). В качестве контроля использовался бычий сывороточный альбумин (БСА) (Sigma, USA). Дизайн исследования in vivo. Экспериментальные животные. Исследования противоопухолевой активности Hsp70 in vivo проводили в опытах на самцах крыс породы Wistar весом 290-340 грамм, полученных из питомника «Рапполово» РАМН. Изучали терапевтическую эффективность локального, внутриопухолевого введения Hsp70. Для этого на 6-е сутки от момента 6 имплантации клеток С6 производили однократное либо длительное введение шаперона при помощи осмотической помпы Alzet®. Были выбраны следующие группы сравнения: (1) контрольная группа; (2) однократное введение Hsp70; (3) однократное введение бычьего сывороточного альбумина (БСА); (4) длительное введение Hsp70 при помощи осмотической помпы; (5) длительное введение БСА при помощи осмотической помпы. Динамику роста опухоли анализировали при помощи метода динамической магнитно-резонансной томографии (МРТ). Мониторинг иммунологических параметров проводили в тестах определения цитолитической активности лимфоцитов, продукции цитокина интерферон гамма (INFγ), в иммуногистохимическом исследовании опухолевой ткани на инфильтрацию Т-лимфоцитами и естественными киллерами (NK-клетки). Интракраниальное введение клеток С6 и имплантация осмотической помпы Alzet®. Крысы были анестезированы введением интраперитонеально раствора «Zoletyl-100» (Virbac santé Animale, France) и 2%-ного раствора «Rometar» (SPOFA, Czech Republic), 10,0 мг и 2,0 мг соответственно. После фиксации головы животного в рамке стереотаксического аппарата производили трепанацию черепа и вводили 10 мкл суспензии клеток глиомы С6 (1x106 клеток/мл). Область введения соответствовала nucl. caudatus dexter (по стереотаксическому атласу Pellegrino L.J.). В случае имплантации осмотической помпы первым этапом устанавливали канюлю для интратуморального введения, далее в межлопаточной области подкожно имплантировали резервуар помпы, содержащий шаперон Hsp70, и герметично соединяли с канюлей. Была использована осмотическая помпа Alzet® (модель 1003D) со скоростью инфузии 1,0 мкл/час в течение 3 суток (объём резервуара 100 мкл). Магнитно-резонансная томография головного мозга и измерение объема опухоли. Магнитнорезонансная томография выполнялась на томографе Siemens Magnetom Verio с индукцией напряженностью магнитного поля 3,0 Tл с получением изображений, взвешенных по Т1 и Т2 в корональной, сагиттальной и аксиальной плоскостях с толщиной среза 1,0 мм (TR 6000 мс, TE 100 мс, FoV 220 мм, всего 11 срезов) на 7, 14, 21 и 28-е сутки от момента имплантации клеток С6. Определение объёма опухолевого узла проводили по Т1-взвешенным постконтрастным (1,0 мл 1,0 ммоль/мл, Gadovist, Germany) и Т2-взвешенным снимкам во фронтальной плоскости на каждом снимке с последующим умножением на количество выполненных срезов. Определение цитотоксической активности лимфоцитов. Для определения цитолитической активности лимфоцитов на 7, 14 и 21-е сутки от момента введения белка производили забор селезёнок крыс. Спленоциты (клетки-эффекторы) контрольной группы, групп однократного введения БСА или Hsp70 добавляли к клеткам глиомы С6 (клетки-мишени) в соотношениях 25:1, 50:1, 100:1. Цитотоксический эффект определяли по активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ), вышедшего в культуральную среду в результате лизиса опухолевых клеток. Измерение проводили 7 с помощью диагностического набора CytoTox 96® non-radioactive cytotoxicity assay (Promega Inc., USA) по протоколам фирмы-производителя. Определение концентрации INFγ. Уровень INFγ определяли в (1) сыворотке, (2) в среде со спленоцитами животного (спонтанная продукция) и (3) при стимуляции облученных (300 Гр) клеток глиомы С6 или рабдомиосаркомы крысы RA-2 (индуцированная продукция). Клетки RA-2 использовали в качестве отрицательного контроля специфической продукции интерферона в ответ на стимуляцию Нsp70. В случае индуцированной продукции цитокина спленоциты (1×106 клеток/мл) добавляли к раковым клеткам (0,2×106 клеток/мл) и инкубировали в течение 48 ч. Уровень INFγ измеряли с помощью готового набора для анализа крысиного INFγ ELISA Set (BD Biosciences, USA) в соответствии с протоколами фирмы-производителя. Иммуногистохимическое исследование инфильтрации опухолевой ткани лимфоцитами. Анализ инфильтрации опухоли лимфоцитами проводили на криосрезах при помощи метода иммунофлуоресценции. Для оценки степени инфильтрации опухоли использовали моноклональные антитела к следующим маркерам: Т-лимфоциты, CD3+ (клон G4.18, 1:100, FITC, зеленый), CD4+ (клон OX-35, 1:100, Alexa567, красный) и CD8+ (клон OX-8, 1:100, FITC, зеленый); NK-клетки (CD56+) (1:100, Alexa567, красный), и макрофаги (CD11b+) (клон М1/70, 1:100, Alexa567, красный). Ограниченное клиническое исследование Hsp70 у нейроонкологических больных. Дизайн исследования. В пилотное исследование были включены пациенты (4,5–14 лет) с первично выявленными злокачественными опухолями головного мозга без предшествующего лечения (n=12). Курс введения препарата Hsp70 проводили с информированного согласия родителей пациента и решения Этического комитета Российского нейрохирургического института им. проф. А.Л. Поленова. научно-исследовательского После резекции опухоли в резидуальную полость имплантировали силиконовый катетер. На 1, 3, 5, 7 и 9-е сутки после операции в ложе удаленной опухоли вводился препарат рекомбинантного белка Hsp70 в физиологическом растворе (500 мкг на 1 введение, 0,5 мл раствора; общая доза на курс 2,5 мг). Во время прохождения курса введения шаперона пациенты не получали терапии (за исключением симптоматической). До начала курса шаперона и по его окончании проводили оценку иммунологических изменений (иммунологическое исследование субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови, анализ продукции цитокинов (IL-4, IL-6, IL-10, INFγ, TNFα), тест гиперчувствительности замедленного типа (DTH)). Токсичность оценивали в соответствии с критериями National Cancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events (NCICTCAE), version 3.0. Для мониторинга динамики изменения опухолевой ткани во время терапии Hsp70 проводили МРТ (Т1-взвешенные постконтрастные снимки). Клинический ответ оценивали согласно критериям Macdonald et al. По окончании введения Hsp70 пациенты получали 8 стандартное лечение (радио- и(или) химиотерапия) в соответствии с гистологическим диагнозом. Период наблюдения составил 12 мес. Статистическая обработка экспериментальных данных. Полученные в процессе исследования медико-биологические данные обрабатывали c использованием программы STATISTICA for Windows (версия непараметрических 8). Оценку критериев динамики Вилкоксона, показателей Фридмана. проводили Различия с считали использованием статистически значимыми при Р<0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Взаимодействие экзогенного Hsp70 с раковыми клетками in vitro. В экспериментах in vitro на различных клеточных линиях (клетки эритроидной лейкемии человека К562, меланомы В16, крысиной глиомы С6) с помощью метода конфокальной микроскопии нами было установлено, что белок Hsp70, внесённый в клеточную культуру, способен проникать внутрь клеток, при этом собственный (эндогенный) Hsp70 вытесняется на их поверхность (рис. 1). Рис. 1. Результаты экспериментов in vitro по изучению взаимодействия Hsp70 с раковыми клетками на примере клеток линии глиомы С6. (А) Конфокальная микроскопия клеток крысиной глиомы С6 после 18 ч инкубации с экзогенным белком теплового шока Hsp70, меченным флуорохромом Alexa555 (красный цвет). Выходящий на поверхность мембраны внутриклеточный шаперон Hsp70 окрашен антителами BRM-22a (Alexa488, зелёный цвет). Ядра клеток окрашены DAPI (синий цвет). (Б) Результаты теста цитотоксической активности лимфоцитов крысы к клеткам глиомы С6, предварительно инкубированных в течение 18 ч с рекомбинантным Hsp70. В качестве контроля использованы клетки С6, не обработанные Hsp70 и после инкубации с иммунологически нейтральным белком овальбумином. По вертикальной оси представлена доля (в %) активности лимфоцитов (M±m); по горизонтальной оси указан титр эффекторных клеток к клеткам-мишеням. Динамика описанных процессов различалась для каждого типа клеток и определялась концентрацией вносимого в среду экзогенного шаперона и временем инкубации. Так, для клеток крысиной глиомы С6 и мышиной меланомы В16 внутриклеточное накопление Hsp70 отмечалось после 1 ч инкубации с шапероном. Спустя 3 ч наблюдали появление эндогенного Hsp70 (но не его конститутивной формы Hsc70) на поверхности мембраны с максимумом экспрессии через 18 ч от 9 внесения очищенного белка в среду. Для клеток эритроидной лейкемии человека К562 максимальная эффективность экспорта внутриклеточного Hsp70 отмечалась в точке 6 ч. При использовании БСА, коньюгированного с Alexa555, подобного эффекта выхода эндогенного Hsp70 не наблюдали, поэтому экспорт шаперона связывали со специфическим действием экзогенного Hsp70. По данным Мультхофф с соавторами, Hsp70 способен активировать цитотоксические лимфоциты (NK-клетки) за счет экспозиции своего 14-мерного TKD-пептида на поверхности раковых клеток [13]. Предполагая, что наблюдаемый нами выход на поверхность Hsp70 может приводить к повышению чувствительности опухолевых клеток к противоопухолевой активности лимфоцитов, мы измерили такой эффект с помощью теста цитотоксических лимфоцитов (CTLтест). Внесение экзогенного Hsp70 в культуру вызывало увеличение литической активности естественных киллеров на 35–40% в зависимости от типа раковых клеток и концентрации шаперона (рис. 2). В наших исследованиях был выявлен дозо-зависимый эффект шаперона: чем больше Hsp70 вносилось в клеточную среду, тем выше был цитолитический эффект лимфоцитов. Так, для клеток глиомы С6 при максимальной концентрации вносимого в среду Hsp70 (50 мкг/мл) цитотоксическая активность NK-клеток составила 89±9%, тогда как в контроле (без добавления шаперона) доля активности эффекторов составила всего 36±5% (Р<0,001). Рис. 2. Цитотоксическая активность спленоцитов к клеткам глиомы С6, В16 и К562. Литическую функцию киллеров оценивали после инкубации клеток при разных концентрациях вносимого в среду экзогенного Hsp70 – 50, 25 и 5 мкг/мл. По горизонтальной соотношения оси представлены различные «клетки-эффекторы:клетки-мишени». По вертикальной оси представлена доля (в %) цитотоксической активности спленоцитов (M±m). Иммунологически нейтральный белок овальбумин использовался в качестве контроля. Поскольку ранее было показано, что количество мембрано-связанного Hsp70 коррелирует с чувствительностью раковых клеток к литической активности естественных киллеров [13], мы предполагаем, что при возрастании концентрации вносимого в среду экзогенного Hsp70 увеличивается и количество транслоцируемого к мембране эндогенного шаперона, чем и объясняется наблюдаемый эффект в CTL-тесте. Важно отметить, что продемонстрированный нами эффект замещения эндогенного шаперона экзогенным с сопутствующим увеличением чувствительности клеток-мишеней к цитотоксическим лимфоцитам был сходным для трех разных 10 типов раковых клеток, что, с нашей точки зрения, говорит об универсальности явления. Описанный нами феномен миграции внутриклеточного шаперона на поверхность мембраны раковых клеток под влиянием экзогенного белка позволяет прояснить механизм противоопухолевого действия очищенного Hsp70 в повышении чувствительности раковых клеток к цитотоксическому действию клеток врожденного иммунитета. Выход внутриклеточного Hsp70 в среду под влиянием экзогенного шаперона. В серии экспериментов на линии клеток глиомы С6 мы оценили влияние очищенного Hsp70 на выход внутриклеточного шаперона не только на поверхность раковых клеток, но и во внеклеточную среду. Ранее была продемонстрирована возможность секреции опухолевыми клетками Hsp70 (в комплексе с пептидами) в составе экзосом или с помощью иных механизмов [11,15,16]. Для того, чтобы подтвердить возможность транспорта внутриклеточного шаперона во внеклеточную среду под воздействием экзогенного мы определили содержание внеклеточного Hsp70 с помощью оригинального метода, разработанного в Лаборатории защитных механизмов клетки Института цитологии РАН. Белок Hsp70 биотинировали и вносили в культуру клеток глиомы крысы С6. По прошествии 1, 6 или 18 ч клетки отмывали и помещали в среду без сыворотки, которую подвергали инкубации последовательно с гелем Авидин-сефарозы (удаление биотинилированного белка) и АТФ-агарозы для выделения фракции бывшего внутриклеточного Hsp70. Оказалось, что спустя 1 ч после внесения экзогенного белка наблюдается выход из клеток С6 как экзогенного, так и внутриклеточного белка. При этом максимальный экспорт экзогенного Hsp70 приходился на точку 1 ч, и далее наблюдалось последовательное уменьшение выхода белка с минимумом в точке 18 ч (рис. 3). Рис. 3. Иммуноблоттинг внеклеточной среды клеток С6 после предварительной инкубации клеток с белком Hsp70. После инкубации с биотинилированным Hsp70 клетки отмывали от экзогенного белка. Далее последовательно в супернатант вносили авидин-сефарозу и АТФ-агарозу. В качестве контроля (С) оценивали среду клеток без инкубации их с шапероном Hsp70, также использовали контроль в виде клеток, подвергнутых нагреванию (HS) (42 °С, 30 мин). Выход шаперона оценивали через 1, 6 и 18 ч после инкубации с экзогенным Hsp70. Белок на блоте выявляли либо поликлональными антителами RSII (RS-GAR-POD) (верхний ряд), либо авидином коньюгированным с пероксидазой (Av-POD) (нижний ряд). Выход бывшего эндогенного Hsp70 продолжался в течение минимум 18 ч с практически неизменной динамикой. Ранее было установлено, что комплекс «Hsp70-опухолевый пептид» может попадать в антиген-презентирующие клетки (АПК) с последующей презентацией антигена 11 в комплексе с молекулами класса MHC I эффекторным клеткам с развитием адаптивного иммунного ответа [17]. К настоящему времени охарактеризовано несколько рецепторов на поверхности АПК, ответственных за интернализацию комплекса «Hsp70-пептид»: CD14, TLR-2 и TLR-4, CD91, а также LOX-1 [18]. Доставленные в АПК опухолевые пептиды далее могут быть презентированы в комплексе с молекулами MHC I класса и, возможно, MHC II класса Тлимфоцитам с развитием адаптивного иммунного ответа [19]. По результатам проведенных in vitro исследований была предложена оригинальная концепция противоопухолевого механизма действия шаперона Hsp70 (рис.4) [20]. Рис. 4. Гипотеза противоопухолевого механизма действия белка теплового шока Hsp70. При внесении к раковым клеткам экзогенный шаперон Hsp70 способен проникать внутрь клеток, при этом он вытесняет собственный внутриклеточный Hsp70 на поверхность мембраны. При взаимодействии мембранно-связанного Hsp70 c рецептором CD94 на поверхности NK-клеток происходит активация последних, в результате чего наблюдается секреция Granzyme B и гибель раковых клеток. Экзогенный белок, проникая внутрь клеток, стимулирует выход внутриклеточного Hsp70 не только на поверхность мембраны, но и во внеклеточную среду. В дальнейшем внеклеточный Hsp70 (вероятно в комплексе с опухолевыми пептидами) может связываться с антигенпрезентирующими дендритными клетками с последующей презентацией опухолевых антигенов в комплексе с MHC I класса и развитием адаптивного ответа. Заключая раздел экспериментальной работы in vitro, можно отметить, что описанный нами феномен транслокации внутриклеточного шаперона под влиянием экзогенного очищенного Hsp70 присущ всем типам клеток, хотя для различных клеточных линий характерна индивидуальная кинетика обмена экзо- и эндогенного шаперона. Наиболее важным является тот факт, что в результате этого явления раковые клетки становятся более чувствительными к воздействию эффекторных клеток иммунной системы. Для доказательства иммуномодулирующей противоопухолевой активности шаперона Hsp70 в условиях in vivo была выбрана модель интракраниальной глиомы С6 [21,22]. Основным условием в проведении эксперимента была внутриопухолевая доставка белка, что, с одной стороны, позволяет достичь высокой локальной концентрации препарата, а с другой – предупредить его захват макрофагами, что может происходить в условиях системного введения. 12 Внутриопухолевое введение Hsp70 приводит к увеличению продолжительности жизни и задержке роста опухоли. В исследовании оценивалась выживаемость животных при внутриопухолевом введении Hsp70 (50 мкг на введение) на 6-е сутки от момента имплантации опухолевых клеток. В качестве контроля использовали БСА (50 мкг на введение). Мы наблюдали увеличение продолжительности жизни животных в группе введения Hsp70 по сравнению с контрольной группой и группой БСА, 31±4, 21±3, и 21±2 сут соответственно (Р<0,001) (рис. 5) [22]. Как мы предполагали, в группе длительной инфузии шаперона Hsp70 посредством осмотической помпы общая выживаемость животных была увеличена до 39±5 сут, тогда как в группе длительного введения БСА уровень выживаемости составил только 23±3 сут (Р 0,001). Рис. Cumulative Proportion Surviving (Kaplan-Meier) Complete Censored Кривые Kaplan-Meier выживаемости животных. Представлены кривые выживаемости для 1,0 контрольной (control) (n=10), группы однократного 0,9 Cumulative Proportion Surviving 5. введения Hsp70 (Hsp70) (n=10), группы однократного 0,8 0,7 введения иммунологически нейтрального белка БСА 0,6 (BSA) (n=10), группы длительного введения Hsp70 с 0,5 использованием осмотической помпы (Hsp70 pump) 0,4 (n=10), группы длительного введения белка БСА с 0,3 0,2 Control 0,1 Hsp70 BSA 0,0 -0,1 10 Hsp70 (pump) 15 20 25 30 35 40 45 использованием осмотической помпы (BSA pump) (n=10). Различия между всеми пятью группами статистически достоверны (Р 0,001). BSA (pump) Time (days) Предполагая, что клинический эффект от применения Hsp70 может быть обусловлен непосредственным влиянием шаперона на рост опухоли, мы оценили последний с помощью метода динамической магнитной резонансной томографии (МРТ) (рис. 6). Рис. 6. МРТ головного мозга крыс в корональной плоскости на 7, 14, 21 и 28-е сутки от момента имлантации клеток С6. Объём опухолевого узла (мм3) (M±m) для каждой исследуемой группы определялся по Т1-взвешенным постконтрастным изображениям. На 7-е сутки от момента после инокуляции клеток глиомы С6 в головной мозг крыс опухолевый узел визуализировался на МРТ: 22,2±3,1 мм3, 24,0±2,7 мм3, 23,2±3,0 мм3 в контрольной, группе БСА и Hsp70, соответственно. После интратуморального введения Hsp70 на 14-е сутки мы наблюдали задержку в опухолевой прогрессии – объём узла составил 31,6±2,9 мм3, тогда как в контрольной группе и группе однократного введения БСА отмечали двукратное 13 увеличение роста опухоли: 71,2±6,2 мм3, 66,4±6,0 мм3, соответственно (Р 0,001). На 21-е сутки также размер объёмного образования в группе однократного введения Hsp70 значимо отличался от контрольной и БСА-групп – 64,2±7,2 мм3, 109,8±12,4 мм3, 92,2±8,9 мм3, соответственно (Р 0,001). Следует отметить, что задержка в росте опухоли в группе однократного введения Hsp70 была временной, и к 28-му дню объём глиомы был сопоставим с размерами контрольной группы. Полученные данные в задержке роста глиомы С6 перекликаются с результатами Geng et al., когда применение рекомбинантного Hsp70 первоначально приводило к существенному подавлению формирования метастатических очагов меланомы; однако, спустя две недели от момента окончания шаперонной терапии, вновь отмечалась прогрессия заболевания [9]. Индукция системного противоопухолевого иммунного ответа при внутриопухолевом введении Hsp70. Анализ системного противоопухолевого иммунного ответа мы проводили с использованием теста цитотоксических лимфоцитов и метода иммуноферментного определения продукции цитокина INFγ. Спустя неделю от момента интратуморального введения Hsp70 противоопухолевая активность лимфоцитов составила 34,5±3,7% (в контроле – 26,4±4,0%), при этом отмечался значительный рост индуцированной продукции INFγ (до 243,6±37,4 пг/мл с 45,3±10,8 пг/мл) (рис. 7). Описанные изменения могут быть обусловлены активацией NK-клеток под влиянием Hsp70 [23]. Рис. 7. Цитотоксическая активность спленоцитов крыс. На 7, 14 и 21-е сутки от момента инокуляции опухоли производился забор спленоцитов в контрольной группе, группах введения БСА и Hsp70. Лимфоциты инкубировали с клетками С6 в соотношениях 25:1, 50:1, 100:1 в течение 4 ч. По вертикальной оси представлена доля (в %) активности лимфоцитов (M±m). По горизонтальной оси указан титр эффекторных клеток к клеткам-мишеням. Через 2 нед от момента инъекции шаперона мы наблюдали двукратное увеличение цитотоксической активности спленоцитов в группе Hsp70 – 64,6±8,0% (Р 0,001). В контроле и БСА-группе подобного роста активности не было – 34,0±4,8% и 32,6±2,1%, соответственно. Это увеличение противоопухолевой активности в динамике свидетельствует о том, что в организме животного развился эффективный Т-клеточный ответ с появлением в периферической крови эффекторных Т-клонов. Для подтверждения специфичности иммунного ответа мы использовали иммунологически иррелевантную опухолевую линию клеток рабдомиосаркомы RA-2 в CTL-тесте. 14 При оценке динамики литической функции лимфоцитов мы не наблюдали повышение последней к клеткам RA-2, что свидетельствует в пользу развития специфического ответа к клеткам глиомы С6. Рост системного цитотоксического противоопухолевого ответа (до 64,6±8,0%) коррелировал с двукратным увеличением индуцированной продукции INFγ (до 516,2±201,0 пг/мл) и сывороточного уровня цитокина (до 66,2±16,0 пг/мл по сравнению с контрольной группой – 20,8±4,2 пг/мл) (рис. 8). Рис. 8. Уровень спонтанной и индуцированной продукции спленоцитами INFγ. Продукция цитокина определялась на 7, 14 и 21-е сутки от момента инокуляции клеток С6 для животных из контрольной, групп введения БСА и Hsp70. По вертикальной оси указана продукция INFγ в пг/мл (M±m). Повышение цитотоксической активности лимфоцитов вероятно связано с развитием адаптивного иммунного ответа спустя две недели после локальной инфузии Hsp70. Ранее было продемонстрировано, что спустя уже неделю от начала применения шаперона Hsp70 количество лимфоцитов в меланоме, экспрессирующих INFγ, увеличивается в 3,2 раза, что отражает формирование адаптивного противоопухолевого иммунного ответа [9]. Рис. 9. Иммунофлуоресцентное исследование инфильтрации опухолевой ткани Т-лимфоцитами (CD3+, CD4+, CD8+), NK-клетками (СD56+). Представлены опухоли животных из контрольной, групп однократного введения БСА и Hsp70, а также введения группы Hsp70 осмотической длительного при помпы помощи Alzet®. Т- лимфоциты CD3+ и CD8+ окрашены антителами коньюгированными с флуорохромом FITC (зелёный цвет); CD4+ и антителами NK-клетки окрашены меченными флуорохромом Alexa567 (красный цвет). Ядра клеток окрашены DAPI (синий цвет). Шкала – 25 мкм. 15 Изменения иммунологических параметров коррелировали с данными гистохимического анализа лимфоцитарной инфильтрации ткани глиомы (рис. 9). Так, спустя неделю после инъекции шаперона в ткани опухоли наблюдалась выраженная инфильтрация естественными киллерами (CD56+). К 21-м суткам выявлялись не только NK-клетки, но и Т-лимфоциты (CD3+, CD4+, CD8+), что свидетельствует в пользу формирования приобретенного иммунного ответа с характерными фенотипическими проявлениями Т-хелперных и Т-цитотоксических фенотипов. Ранее было показано, что белки теплового шока способны активировать системы адаптивного и врожденного иммунитета [1,24], однако в цитируемых работах речь шла о шаперонных вакцинах, сильно отличных по конструкции от наших. В проведенном исследовании впервые было продемонстрировано, что даже однократное введение очищенного шаперона Hsp70 обладает высоким терапевтическим потенциалом. Локальная аппликация Hsp70 может эффективно стимулировать специфический противоопухолевый иммунный ответ, причем длительная, курсовая доставка препарата является значительно более эффективной. Так, в экспериментальной группе применения системы длительной инфузии Alzet® наблюдалась более выраженная инфильтрация Т-клетками и более высокая продолжительность жизни животных (до 39±5 сут). Вероятно, продолжительное применение Hsp70 модулирует иммуносупрессивное опухолевое микроокружение и способствует поддержанию эффективного иммунного ответа. Интересно отметить, что, согласно полученным нами данным, применение очищенного рекомбинантного Hsp70 в качестве монотерапии по своей терапевтической эффективности нисколько не уступает ранее описанным методикам шаперонной терапии с адьювантным использованием нанолипосомальных препаратов [8] или ДНК-плазмид [9]. В обоих случаях продолжительность жизни животных с опухолью, подвергнутых шаперонной терапии, увеличивалась на 70-100%, а продукция INFγ, как характеристика специфического Т-клеточного ответа не превышала величин, полученных нами. Результаты экспериментов in vivo, показавшие высокую противоопухолевую активность препарата Hsp70, послужили поводом для оценки возможности клинического применения шаперона в качестве адьюванта в лечении злокачественных новообразований головного мозга в рамках ограниченного клинического исследования. Оценка возможности локального применения и токсичности препарата Hsp70 в ограниченной серии клинических исследований. 12 пациентов (4,5–14 лет, средний возраст 9,9 лет) были включены в пилотное исследование (таблица). Основным критерием для включения пациента в пилотное исследование был интраоперационно полученный диагноз злокачественной опухоли. После резекции опухоли пациентам была выполнена серия инъекций шаперона Hsp70 в резидуальную полость. Общая доза белка составила 2,5 мг (500 мкг на 1 введение; всего 5 введений). Оценка токсичности проводилась с первого дня введения шаперона. Всем пациентам 16 до начала курса препарата было выполнено МРТ в течение 48 ч после операции. Согласно результатам томографии у всех пациентов определялась остаточная опухолевая ткань. Интратуморальное введение шаперона Hsp70 хорошо переносилось больными, за исключением трех пациентов (№№ 5, 6, 10), у которых наблюдались побочные эффекты (III степени токсичности) (таблица). Tаблица. Результаты терапии шапероном Hsp70 № Гистология Возрас наблюде Пол т (лет) ния 1 2 3 4 5 13 M Глиобластома 13 M 7 M 13 M 4 M Aнапластическая астроцитома (GIII) Анапластическая эпендимома (GIII) B-клеточная не Ходжкинская лимфома Хориодкарцинома (GIV) 12 Ж Побочные эффекты DTH Радиологичес кий ответ Лихорадка (grade II) + SD Нет _ SD Нет Нет _ _ SD SD Лихорадка (grade II); Головная боль (grade III); Рвота (grade II) + PR Лихорадка (grade II); Головная боль (grade III) _ SD + CR _ SD Головная боль (grade II) _ SD 10 Ж 14 Ж 12 Ж Примитивная нейроэктодермальная опухоль Анапластическая астроцитома (GIII) Анапластическая эпендимома (G III) Астроцитома (GII) 10 4,5 Ж Астроцитома (GII) Лихорадка (grade II); Головная боль (grade III); Рвота (grade I) _ SD 11 6 Ж Анапластическая астроцитома (GIII) Нет _ SD 12 10 M Глиобластома Нет _ PD 6 7 8 9 Лихорадка (grade II); Головная боль (grade II) Лихорадка (grade II); Головная боль (grade II) Сокращения: DTH, гиперчувствительность замедленного типа; SD, стабилизация заболевания; CR, полный ответ; PR, частичный ответ; PD, прогрессия заболевания. Токсичность препарата Hsp70 оказалась сопоставимой с таковой для других цитокинов (GM-CSF, INF-α-2B), которые в настоящее время широко применяются в терапии пациентов с меланомой [25,26]. Согласно радиологическим критериям Macdonald у 9 пациентов не наблюдалось изменений по данным МРТ (стабилизация заболевания), у 1 пациента отмечался полный ответ (№7), у 1 пациента – частичный ответ (№5), 1 – прогрессия заболевания (наблюдение №12). Изучение иммунологических изменений при локальном введении шаперона Hsp70. Анализ субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови проводился на 1-е сутки после операции и спустя 4 недели по окончанию курса введения препарата Hsp70. У 12 пациентов отмечалось увеличение содержания Т-лимфоцитов в периферической крови (включая субпопуляции CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3+HLADR+) (Р<0,001), что коррелировало со снижением содержания уровня В-лимфоцитов. 17 Анализ продукции цитокинов выявил увеличение сывороточного уровня, а также спонтанной и индуцированной продукции цитокинов INFγ, TNFα. Так, индуцированная продукция INFγ повышалась с 344,2 ± 111,9 пг/мл до 862,9 ± 283,0 пг/мл, а продукция цитокина TNFα возрастала c 66,4 ± 17,5 до 225,3 ± 47,9 пг/мл. Впервые клинически охарактеризованный феномен Th1-поляризации иммунной системы под воздействием Hsp70 соответствует результатам ранее проведенных экспериментальных исследований на различных клеточных линиях [27]. Преимущественная Тh1-поляризация иммунного ответа приводит к секреции ряда цитокинов (INFγ, TNFα), обеспечивающих противоопухолевый ответ. Раннее было показано, что положительные результаты теста гиперчувствительности замедленного типа (DTH) коррелируют с Т-клеточным противоопухолевым ответом [28]. Однако проведенный анализ специфического противоопухолевого иммунного ответа в реакции DTH показал, что только у 3 пациентов результаты теста были положительными. Отчасти это объясняется иммуносупрессирующей активностью раковых клеток [29]. Существенно, что под воздействием очищенного Hsp70 наблюдается уменьшение содержания иммуносупрессивных Т-регуляторных клеток (CD4+CD25+CD127-) в периферической крови с 8,1±0,6% до 5,7 ± 0,5% (Р<0,001); при этом также уменьшается и продукция IL-10. Ранее было показано, что Т-регуляторные лимфоциты подавляют функцию CD8+ эффекторов за счет секреции TGF-β и IL-10 [30], и их снижение может привести к формированию эффективного противоопухолевого ответа [31]. Вероятно, под иммуномодулирующим влиянием Hsp70 происходит поляризация иммунного ответа у нейро-онкологических больных по Th1-типу с подавлением функции Т-регуляторных клеток, что, в свою очередь, может приводить к формированию эффективного противоопухолевого иммунитета. ВЫВОДЫ 1. Рекомбинантный белок теплового шока Hsp70 с кинетикой входа, специфичной для данного клеточного типа, способен проникать внутрь опухолевых клеток при его добавлении в культуру. 2. Интернализация экзогенного Hsp70 стимулирует выход собственного внутриклеточного шаперона на поверхность мембраны опухолевых клеток, что повышает чувствительность этих клеток in vitro к цитолитичекой активности NK-клеток. 3. Экзогенный шаперон Hsp70 при захвате его опухолевыми клетками стимулирует экспорт внутриклеточного белка в культуральную среду. 4. Интратуморальное введение белка Hsp70 в модели внутричерепной глиомы С6 у крыс приводит к замедлению темпов роста опухоли и, как следствие, увеличению продолжительности жизни животных. 18 5. Улучшение клинических показателей при локальной аппликации Hsp70 в условиях in vivo обусловлено параллельной активацией систем врожденного и приобретенного противоопухолевого иммунного ответа. 6. Клиническое применение шаперона Hsp70 в качестве иммуномодулирующего средства в адьювантной терапии злокачественных новообразований центральной нервной системы безопасно с приемлемым уровнем токсичности. Практические рекомендации Молекулярный шаперон Hsp70 обладает иммуномодулирующей активностью, стимулируя как врожденный, так и приобретенный противоопухолевый иммунный ответ организма. Предварительные ограниченные исследования препарата очищенного человеческого рекомбинантного белка теплового шока Hsp70 показали его безопасность в терапии нейроонкологических больных, что открывает перспективы использования шаперона в адьювантной комбинированной терапии новообразований головного мозга. Однако, необходимо проведение дальнейших рандомизированных клинических исследований для оценки оптимальной терапевтической дозы, схемы лечения и клинической эффективности. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК МОН России 1. Шевцов М.А., Поздняков А.В., Михрина А.Л., Мешалкина Д.А., Бычкова Н.В., Романова И.В., Гужова И.В., Хачатрян В.А., Маргулис Б.А. Рекомбинантный белок теплового шока Hsp70 в иммунотерапии опухолей головного мозга. «Медицинский академический журнал», Том 12, №3, 2012, стр. 99–101. 2. Шевцов М.А., Хачатрян В.А., Поздняков А.В., Романова И.В., Гужова И.В., Маргулис Б.А. Шаперонная терапия в модели интракраниальной глиобластомы крыс. «Вопросы онкологии», Том 58, №5, 2012, стр. 653–657. 3. Шевцов М.А., Хачатрян В.А., Маргулис Б.А. Иммунотерапия в нейро-онкологии: перспективы развития. «Российский нейрохирургический журнал имени профессора А.Л. Поленова», Том 4, Специальный выпуск, 2012, стр. 69–71. 4. Шевцов М.А., Хачатрян В.А., Маргулис Б.А. Применение белков теплового шока в клинической онкологии. «Современная онкология», Том 14, №1, 2012, стр. 63–68. 5. Шевцов М.А., Хачатрян В.А., Поздняков А.В., Романова И.В., Гужова И.В., Маргулис Б.А. Модели интракраниальной опухоли у животных в доклинической нейроонкологии. «Нейрохирургия и неврология детского возраста», № 4(30), 2011, стр. 20–32. 19 6. Шевцов М.А., Хачатрян В.А., Оникиенко С.Б., Маргулис Б.А. Молекулярные шапероны и бактериальный полисахарид как иммуномодулирующие факторы в противоопухолевой терапии новообразований головного мозга. «Нейрохирургия и неврология детского возраста», № 2(28), 2011, стр. 73–84. Тезисы конференций 1. Margulis B.A., Guzhova I.V., Ekimova I., Shevtsov M.A. Effects of exogenously delivered Hsp70: from brain to blood. 5th International Symposium on Heat Shock Proteins in Biology and Medcine “Heat Shock Proteins in Cancer and Immunology”, Woods Hole Marine Laboratory, Woods Hole, MA, November 7-11, 2010, p. 2D. 2. Shevtsov M.A. Application of chaperone therapy in the model of intracranial rat glioblastoma. VII International Pirogov scientific medical conference of students and young scientists, 15 March, 2012, Moscow. Journal “Vestnik RGMU”, Special edition №1, 2012, p. 323. 3. Shevtsov M.A., Khachatryan W.A., Pozdnyakov A.V., Samochernych K.A., Kim A.V., Romanova I.V., Guzhova I.V., Margulis B.A. Hsp70 stress protein is a promising tool in the treatment of brain tumors in children. 2011 European Multidisciplinary Cancer Congress, Stockholm, 23-27 September 2011. European Journal of Cancer, Abstract book, Vol. 47, Suppl. 1, 2011, p. 291. 4. Shevtsov M.A., Khachatryan W.A., Pozdnyakov A.V., Samochernych K.A., Kim A.V., Romanova I.V., Guzhova I.V., Margulis B.A. Recombinant human heat shock protein Hsp70 as possible adjuvant in treatment of malignant brain tumors in children. Abstracts from the 2011 BNOS Conference, June 29 - July 1, 2011, Homerton College, Cambridge. Neuro-Oncology, Vol. 13, Suppl. 2, 2011, p. 11. 5. Shevtsov M.A., Kim A.V., Pozdnyakov A.V., Samochernych K.A., Guzhova I.V., Romanova I.V., Margulis B.A., Khachatryan W.A. Anti-tumor immunomodulatory activity of recombinant heat shock protein Hsp70 in therapy of malignant brain tumors. The 12th International Conference on Progress in Vaccination Against Cancer, September 11–13, 2012, Nottingham, UK. Proceedings book, 2012, p. 13. 6. Shevtsov M.A., Kim A.V., Pozdnyakov A.V., Samochernych K.A., Romanova I.V., Margulis B.A., Guzhova I.V., Khachatryan W.A. Phase I study of intratumoral injection of pure recombinant human heat shock protein rhHsp70 in treatment of malignant brain tumors. International Neurosurgical Forum in Siberia, 18-21 June 2012, Novosibirsk, Russia. Collection of Scientific Papers, 2012, p. 225. 7. Shevtsov M.A., Pozdnyakov A.V., Kim A.V., Samochernych K.A., Guzhova I.V., Romanova I.V., Khachatryan W.A., Margulis B.A. Clinical application of chaperone Hsp70 in the treatment 20 of malignant brain tumors. 10th Congress of the European Association of Neurooncology, September 6–9, 2012, Marseille, France. Neuro-Oncology, Vol. 14, Suppl. 3, 2012, p. 23. 8. Shevtsov M.A., Pozdnyakov A.V., Romanova I.V., Guzhova I.V., Margulis B.A. Immunomodulatory effect of Hsp70 in the model of rat glioblastoma C6 in rodents. EORTCEANO Conference 2011. Trends in Central Nervous System Malignancies, Bucharest, Romania, 25-26 March 2011. Proceedings book, p. 31. 9. Shevtsov M.A., Pozdnyakov A.V., Romanova I.V., Guzhova I.V., Margulis B.A., Samochernych K.A., Kim A.V., Khachatryan W.A. Immunomodulatory effect of purified heat shock protein Hsp70 in treatment of malignant brain tumors. 2011 Pediatric Neuro-Oncology Basic and Translational Research Conference, May 19-20, 2011, New Orleans, Louisiana. Neuro-Oncology, Vol. 13, Suppl. 1, 2011, p. 119. 10. Шевцов М.А. Применение шаперонной терапии в модели интракраниальной глиабластомы у крыс Wistar. VII Международная (XVI Всероссийская) Пироговская научная медицинская конференция студентов и молодых ученых, 15 марта 2012 г., г. Москва. «Вестник РГМУ», Специальный выпуск, № 1, 2012, стр. 322–323. 11. Шевцов М.А. Участие белка теплового шока Hsp70 в активации противоопухолевого иммунного ответа на модели интракраниальной опухоли у крыс. VI Международная Пироговская научная медицинская конференция студентов и молодых учёных. «Вестник РГМУ», Дополнение к Специальному выпуску, № 1, 2011, стр. 15–16. 12. Шевцов М.А., Ким А.В., Поздняков А.В., Самочерных К.А., Романова И.В., Маргулис Б.А., Гужова И.В., Хачатрян В.А. Локальная аппликация рекомбинантного белка теплового шока Hsp70 в иммунотерапии злокачественных опухолей головного мозга. «Нейрохирургия и неврология Казахстана», № 2,3 (27,28), 2012, стр.12. 13. Шевцов М.А., Лазарев В.Ф., Абкин С.В., Маргулис Б.А., Гужова И.В. Особенности иммуномодулирующей активности Hsp70 в его реакции с опухолевыми клетками различных линий. XXIII Международная зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Тезисы докладов и стендовых сообщений, 2011, стр. 102. 14. Шевцов М.А., Поздняков А.В., Романова И.В., Гужова И.В., Маргулис Б.А. Иммуномодуляция противоопухолевого ответа белком теплового шока Hsp70 на модели интракраниальной глиомы С6 у крыс Wistar. Петровские чтения 2011. «Вопросы онкологии», Том 57, № 2, 2011, стр. 67–68. 15. Шевцов М.А., Поздняков А.В., Романова И.В., Хачатрян В.А., Гужова И.В., Маргулис Б.А. Иммуномодулирующие противоопухолевые свойства шаперона Hsp70 на модели интракраниальной глиомы С6 у крыс Wistar. Научная конференция по биоорганической 21 химии и биотехнологии «X чтения памяти академика Ю.А.Овчинникова» 14-17 ноября 2011 г. Сборник тезисов, М., 2011. 16. Шевцов М.А., Поздняков А.В., Хачатрян В.А., Романова И.В., Гужова И.В., Маргулис Б.А. Шаперонная терапия в модели интракраниальной глиомы С6. XI Всероссийская научнопрактическая конференция «Поленовские чтения». «Российский нейрохирургический журнал им. проф. А.Л. Поленова», Том 4, Специальный выпуск, 2012, стр. 286. 17. Шевцов М.А., Хачатрян В.А., Поздняков А.В., Романова И.В., Гужова И.В., Маргулис Б.А. Иммуномодуляция противоопухолевого ответа белком теплового шока Hsp70 на модели интракраниальной опухоли у крыс Wistar. X Всероссийская научно-практическая конференция «Поленовские чтения». «Российский нейрохирургический журнал им. проф. А.Л. Поленова», Том 3, Специальный выпуск, 2011, стр. 385. 18. Шевцов М.А., Хачатрян В.А., Поздняков А.В., Романова И.В., Гужова И.В., Маргулис Б.А. Использование иммуномодулирующих свойств рекомбинантного человеческого белка теплового шока Hsp70 на модели интракраниальной глиомы С6 у крыс Wistar. XVIII Всероссийская конференция «Нейроиммунология. Рассеянный склероз». «Нейроиммунология», Том 9, № 3-4, 2011, стр. 171. 19. Шевцов М.А., Хачатрян В.А., Поздняков А.В., Романова И.В., Гужова И.В., Маргулис Б.А. Применение белка теплового шока Hsp70 в противоопухолевой терапии на модели интракраниальной глиабластомы С6 у крыс линии Wistar. VIII Конференция по фундаментальной онкологии «Петровские чтения 2012». Сборник тезисов, СПб, 2012, стр. 159–160. 20. Шевцов М.А., Хачатрян В.А., Поздняков А.В., Романова И.В., Гужова И.В., Маргулис Б.А. Иммуномодулирющие противоопухолевые свойства шаперона Hsp70 в модели интракраниальной глиабластомы крыс. III Конференция молодых учёных Института цитологии РАН, Санкт-Петербург, 15-16 мая 2012 г. «Цитология», Том 54, №4, 2012, стр. 364. СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Srivastava P., 2002. Annual Review of immunology. 20:395–425. 2. Multhoff G., 2007. Methods. 43:229–237. 3. Calderwood S.K. et al., 2012. Autoimmune Diseases. 2012:486069. 4. Murshid A. et al., 2012. Frontiers in Immunology. 3:63. 5. Srivastava P.K., 2006. Current Opinion in Immunology. 18:201–205. 6. Шевцов М.А. соавт., 2011. Нейрохирургия и неврология детского возраста. 2:73–84. 7. Шевцов М.А. соавт., 2012. Современная онкология. 14: 63–68. 8. Ito A. et al., 2004. Cancer Immunol. Immunother. 53:26–32. 9. Geng H. et al., 2006. Int. J. Cancer. 118:2657–2664. 10. Asea A., 2008. Novartis Found. Symp. 291:173–179. 11. Gastpar R. et al., 2005. Cancer Res. 22 65:5238–5247. 12. Calderwood S.K. et al., 2005. Eur. J. Immunol. 35:2518–2527. 13. Multhoff G. et al., 2001. Cell Stress Chaperones. 6:337–344. 14. Botzler C. et al., 1996. J. Cancer Immunol. Immunother. 43:226–230. 15. Mambula S. et al., 2006. International Journal of Hyperthermia. 22:575–585. 16. Chalmin F. et al., 2010. Journal of Clinical Investigation. 120:457–471. 17. Srivastava P.K. et al., 2009. Expert. Opin. Biol. Ther. 9:179–186. 18. Murshid A. et al., 2011. Methods Mol. Biol. 787:289–302. 19. Matsutake T. et al., 2010. Cancer Immunity. 10:1–8. 20. Shevtsov M.A. et al., 2011. Neuro-Oncology. 14:119. 21. Шевцов М.А. соавт., 2011. Нейрохирургия и неврология детского возраста. 4:20–32. 22. Шевцов М.А. соавт., 2012. Вопросы онкологии. 58:653–657. 23. Breloer M. et al., 2001. Eur. J. Immunol. 31:2051–2059. 24. Quintana F.J. et al., 2005. J. Immunol. 175:2777–2782. 25. Kirkwood J.M. et al., 1996. J. Clin. Oncol. 14:7–17. 26. Spitler L.E. et al., 2000. J. Clin. Oncol. 18:1614–1621. 27. Asea A. et al., 2000. Cell Stress Chaperones. 5:425–431. 28. Disis M.L. et al., 2000. Clin. Cancer Res. 6:1347–1350. 29. Marincola F. et al., 2000. Adv. Immunol. 74:181–273. 30. Li M.O. et al., 2008. Immunity. 28:468– 476. 31. Rolle C.E. et al., 2010. Neurosurg. Clin. N. Am. 21:201–214. 23 Подписано в печать 09.01.2013 Формат 60х90/16 Бумага офсетная. Усл . печ. л. 1,75 Тираж 100 экз. Заказ 1 Отпечатано в типографии «Адмирал» 199178, Санкт-Петербург, В.О., 7-я линия, д. 84 А
