У Arabidopsis thaliana - Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН
реклама
На правах рукописи ОСИПЕНКОВА Ольга Валерьевна РОЛЬ РЕТРОГРАДНЫХ ПЛАСТИДНЫХ СИГНАЛОВ В ЭКСПРЕССИИ ЯДЕРНЫХ ГЕНОВ СТРЕССОВЫХ БЕЛКОВ ELIP1 И ELIP2 У Arabidopsis thaliana 03.00.04 – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2009 Работа выполнена в лаборатории биохимии хлоропластов Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Научный руководитель: доктор биологических наук Н.П. ЮРИНА Официальные оппоненты: доктор биологических наук И.В. ЕЛАНСКАЯ доктор биологических наук, профессор В.В. КУЗНЕЦОВ Ведущая организация: Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского при МГУ им. М.В. Ломоносова Защита состоится 18 èþíÿ 2009 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 2. С диссертационной работой можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, г. Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 1. Автореферат разослан 2009 г. Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук А.Ф. Орловский 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Хлоропласты являются не только центрами фотосинтетической деятельности растительных тканей, но принимают участие также в биосинтезе аминокислот, витаминов, пиримидинов, начальных этапах биосинтеза абсцизовой кислоты, восстановлении сульфатов и ряде других процессов. Хотя хлоропласты имеют собственный геном, большинство белков, необходимых для их функционирования, кодируется ядерным геномом и только небольшая часть кодируется геномом органелл (Leister, 2003; Одинцова и Юрина, 2003). Координированная экспрессия генов ядра и пластид, необходимая для развития и функционирования растительной клетки, достигается путем внутриклеточных взаимодействий ядра и пластид с помощью антероградного (от ядра к пластидам) и ретроградного (от пластид к ядру) механизмов регуляции (Taylor, 1989; Rodermel and Park, 2003). Важная роль ретроградных пластидных сигналов показана для биосинтеза хлорофилла, транспорта белков в органеллы и ответных реакций растений на стрессовые воздействия (Strand et al., 2003; Юрина и Одинцова, 2006). Роль таких сигналов выполняют продукты синтеза белка в пластидах, тетрапирролы (интермедиаты биосинтеза хлорофилла), а также редокс-состояние пула пластохинонов фотосинтетической электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) пластид (Leister, 2003; Strand et al., 2003; Beck, 2005; Погульская и др., 2006; Юрина и Одинцова, 2006; Осипенкова и др., 2007). Для исследования ретроградных пластидных сигналов используют genome uncoupled (gun) мутанты Arabidopsis с нарушенной передачей пластидных сигналов (Strand et al., 2003). Идентифицированы пять неаллельных gun мутантов, у которых экспрессия кодируемых ядром генов хлоропластных белков, таких как Lhcb1 и RbcS, увеличивалась на свету в присутствии гербицида норфлуразона, подавляющего синтез каротиноидов и вызывающего значительные фотоокислительные повреждения хлоропластов из-за образования активных форм кислорода (АФК). Клонированные гены соответствовали пяти оригинальным локусам GUN1-GUN5, четыре из которых (GUN2-GUN5) кодировали белки, участвующие в метаболизме тетрапирролов (Mochizuki et al., 2001; Larkin et al., 2003). Было высказано предположение, что высшие растения могут использовать Mg-протопорфирин IX (Mg-Proto) и его монометиловый эфир (Mg-ProtoMe) в качестве сигнальных молекул хлоропластов (Woodson and Chory, 2008), хотя до сих пор этот вопрос остается спорным. Так как растения постоянно подвергаются воздействию неблагоприятных факторов внешней среды, особый интерес приобретает исследование экспрессии ядерных генов 3 стрессовых белков пластид ELIP (Early Light-Inducible Proteins), которые играют важную роль в защитных реакциях растений в ответ на действие стрессовых факторов. Эти белки синтезируются на ранних этапах зеленения этиолированных проростков, в условиях светового стресса, засухи и действия низких температур (Grimm and Kloppstech, 1987; Adamska et al., 2001). высокомолекулярный светособирающих У (ELIP2) хлорофилл высших белки, растений низкомолекулярный относящиеся a/b-связывающих (LHC) к (ELIP1) мультигенному белков, и семейству кодируются ядром, синтезируются на цитоплазматических рибосомах, и в форме предшественников посттрансляционно транспортируются в хлоропласты (Montane and Kloppstech, 2000). Имеющиеся данные о ретроградных сигналах не позволяют судить о том, какие соединения являются сигнальными молекулами и как влияют пластидные сигналы на экспрессию генов белков светового стресса. Изучение экспрессии ядерных генов стрессовых белков пластид ELIP1 и ELIP2 у gun мутантов Arabidopsis поможет получить информацию о роли пластидных сигналов в регуляции транскрипции ядерных генов фотосинтеза. Цель и задачи работы. Целью настоящей работы было изучение роли ретроградных пластидных сигналов в экспрессии ядерных генов стрессовых белков пластид ELIP1 и ELIP2 с помощью gun и hy (аллельных gun) мутантов Arabidopsis thaliana, характеризующихся нарушениями биосинтеза тетрапирролов. В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи: 1. Изучить влияние нарушений передачи тетрапиррол-медиированного ретроградного пластидного сигнала на экспрессию ядерных генов стрессовых белков пластид ELIP1 и ELIP2, а также корреляцию между экспрессией этих генов и содержанием хлорофилла на разных стадиях развития hy и gun мутантов Arabidopsis. 2. Выяснить роль предшественников биосинтеза тетрапирролов в экспрессии генов ELIP у hy и gun мутантов с помощью ингибиторного анализа и увеличения содержания Mgпротопорфирина IX. Определить содержание предшественников тетрапирролов (протопорфирина IX, Mg-протопорфирина IX и его монометилового эфира). 3. Изучить действие других типов пластидных сигналов (активных форм кислорода и редокс-состояния пула пластохинонов) на экспрессию генов ELIP1 и ELIP2. 4. Изучить влияние некоторых сигнальных систем клетки (световой, гормональной и углеводной) на экспрессию генов ELIP при нарушении пластидного сигнала у gun мутантов Arabidopsis. 4 Научная новизна. Впервые показано, что нарушения в HY1, HY2 и GUN4 (но не GUN5) сигнальных путях приводят к изменению экспрессии генов стрессовых белков пластид ELIP1 и ELIP2. Ретроградные пластидные сигналы негативно регулируют экспрессию этих генов. Выявлены различия в световой и пластидной регуляции экспрессии генов близкородственных белков ELIP и Lhcb и генов, кодирующих ферменты биосинтеза хлорофилла. Впервые показано, что интермедиаты биосинтеза тетрапирролов - Mg-Proto и его монометиловый эфир - влияют на экспрессию генов ELIP1 и ELIP2, возможно, опосредованно через АФК и редокс-состояние компонентов электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) хлоропластов. Эти тетрапирролы непосредственно не участвуют в регуляции экспрессии генов ELIP1 и ELIP2. Обнаружена обратная корреляция между экспрессией генов ELIP1 и ELIP2 и содержанием хлорофилла у gun мутантов. Показано, что белки ELIP модулируют синтез хлорофилла, предотвращая накопление свободного пигмента и, таким образом, фотоокислительный стресс. Научно-практическая ценность. Детальное изучение молекулярных механизмов экспрессии генов и путей передачи сигналов, регулирующих экспрессию генов, необходимых для функционирования ядра и хлоропластов, является перспективным. Биохимические и молекулярно-биологические методы и подходы, используемые при изучении этих механизмов, не уступают мировому уровню и являются пионерскими. Выявление процессов, участвующих в генерации и передаче пластидных сигналов, имеет не только самостоятельный научный интерес, но и позволяет расширить представления о механизмах передачи сигналов и координированной регуляции экспрессии ядерных генов пластид. Молекулярная характеристика индивидуальных компонентов, участвующих в передаче сигналов, необходима для дальнейших исследований в этом направлении. Эти результаты могут быть использованы для регуляции процессов фотосинтеза, который определяет продуктивность сельскохозяйственных растений. Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на международных симпозиумах «Сигнальные системы клеток растений: роль в адаптации и иммунитете» (Россия, Татарстан, Казань, 2006); “Photosynthesis in the post-genomic era: structure and function of photosystems” (Россия, Пущино, 2006); «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии», посвященном 100-летию акад. Н.М. Сисакяна (Россия, Дубна, 2007; Армения, Ереван, 2007) и на международной конференции FEBS "Origin and evolution of mitochondria and chloroplasts" (Италия, Маратея, 2007), а также на VI съезде общества физиологов растений России «Современная физиология растений: от 5 молекул до экосистем» (Россия, Коми, Сыктывкар, 2007) и семинаре кафедры физиологии растений университета им. А. Гумбольдта «Retrograde signaling in plants» (Германия, Берлин, 2008). Публикации. Опубликовано 2 статьи в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК РФ, 1 статья в сборнике и 6 тезисов докладов конференций. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (4 главы), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы ( изложена на страницах, содержит рисунков и источников). Диссертация таблиц. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обзор литературы В обзоре литературы дана общая характеристика антероградных и ретроградных сигналов. Детально рассмотрены современные представления о роли тетрапирролов, как возможных пластидных сигналов, в экспрессии ядерных генов белков пластид. Дан краткий обзор биосинтеза тетрапирролов. Приведено краткое описание некоторых сигнальных систем клетки и их роли в экспрессии ядерных генов белков, участвующих в фотосинтезе, а также структуры и функций белков ELIP . Материалы и методы исследования Растения и условия выращивания. В работе были использованы мутанты (hy, gun) и растения дикого типа (ДТ) Arabidopsis thaliana (Arabidopsis): gun5 мутанты были предоставлены проф. Дж. Чори (The Salk Institute for Biological Studies, USA); gun5-1 и gun4 мутанты были получены от ABRC (Ohio State University, USA); hy1 (gun2) и hy2 (gun3) мутанты были получены от проф. А. Смит (University of Cambridge, UK). Поверхностно стерилизованные семена растений проращивали в стерильных чашках Петри на 2xMС (Murashige and Scoog) среде в течение 9 дней при режиме 8 ч свет/ 16 ч темнота, низкой освещенности (LL) (30 µмоль м-2 с-1) и температуре 20-23° С. Для экспериментов со взрослыми растениями проростки растили в 6 земле в течение 30 дней на свету стандартной интенсивности (SL) (70 µмоль м-2 с-1). Некоторые чашки с семенами подвергали 30-мин экспозиции на свету (70 µмоль м-2 с-1) и затем помещали в темноту для прорастания в течение 10 дней. Семена ячменя (Hordeum vulgare L) проращивали в чашках Петри на смоченной водой фильтровальной бумаге при 2023° С в темноте или при освещении (12 ч свет/ 12 ч темнота) в течение 7 дней. Растения перед всеми опытами выставляли на свет высокой интенсивности (HL) (350 или 550 µмоль м2 с-1), либо холод (10° С) на 2 ч для индукции белков светового стресса пластид ELIP. Обработка растений. Норфлуразон (НФ) добавляли в среду для выращивания растений в концентрации 5 µМ, или растения опрыскивали на свету ежедневно в течение одной недели раствором НФ той же концентрации. С 5 мМ 2,2'-дипиридила (ДП) растения инкубировали в течение 8 ч (6 ч при 20-23° C и 2 ч при 10° C). Ацифлуорфен (АФ) добавляли в среду (0.05 µM) или опрыскивали им растения (1, 5, 10, 20, 30 и 50 µM) в течение трех дней. В опытах с интермедиатами тетрапирролов инкубацию листьев проводили в водном растворе 50 µМ MgProto в течение 5 ч (3 ч при 20-23° C и 2 ч при 10° C). Инкубацию с 1 мM 5аминолевулиновой кислоты (АЛК) проводили в течение 2 ч в условиях HL. Для ингибирования фотохимической активности фотосистемы 2 (ФС2) растения инфильтрировали водным раствором 120 µМ 3-(3,4-дихлорфенил)-1,1-диметилмочевины (диурон). Для опытов с абсцизовой кислотой (АБК) или глюкозой растения в течение 4 дней выращивали на стерильных бумажных фильтрах, погруженных в 2хMС среду, содержащую 2% сахарозу. Затем их переносили на среду, содержащую 5 μM АБК или 7% глюкозу, и выращивание продолжали еще в течение 6 дней. Семена ячменя замачивали в водном растворе меламиновой соли бис(оксиметил)-фосфиновой кислоты (мелафена) различной концентрации (0.5х10-10 М; 0.5х10-8 М; 0.5х10-5 М; 0.5х10-3 М) в течение 2 ч. Выделение РНК. Из гомогенизированных образцов растений с помощью набора «RNeasy Plant Mini kit» («QIAGEN», Германия), «TRIsure» («BIOLINE», Германия) или «YellowSolve» («Клоноген», Санкт-Петербург, Россия) выделяли суммарную РНК в соответствии с рекомендациями производителей. Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически. Электрофорез проводили при напряжении 70 В в течение 1 ч в 1хМОРS буфере (0.2 М MOPS; 50 мМ ацетат Na; 1 мМ ЭДТА, рН 8.0). РНК предварительно смешивали с 10 µл буфера для нанесения «LoadingMix» (10хMOPS - 10 µл, 37% формальдегид - 35 µл, 100% формамид - 100 µл, стерильная вода - 53 µл, 0.5 µг/мл этидий бромид (EthBr - 2 µл), прогревали при 65° С в течение 5 мин и наносили на 1.5% агарозный гель. Флуоресценцию комплекса РНК-EthBr обнаруживали в УФ-свете (трансиллюминатор ТСР-15М «Vilber Lourmat», Франция) и 7 анализировали с использованием видеосистемы «DNA Analyzer» («Хеликон», Россия) и «AlphaEaseFS StandAlone» («Alpha INNOTECH», «BIOZYM», Германия). Подбор праймеров. Праймеры для последовательностей генов ELIP1, ELIP2, 18S рРНК, UBQ10, ChlH, Lhcb2, HEMA1 и HEMA2 Arabidopsis и ячменя выбирали с помощью программы «Primer3 Input 0.4.0» (http://frodo.wi.mit.edu) и заказывали у фирм «БиоТехЛит» (Россия) или «SIGMAAldrich» (Германия). Последовательности праймеров представлены в таблице 1. Таблица 1. Специфические праймеры, использованные для ПЦР. название гена номер в базе генов направление последовательность праймеров (5´-3´) длина праймера темп. отжига 20 20 20 20 21 20 61 61 61 61 61 61 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 19 21 22 20 61 61 61 61 61 61 61 61 61 61 61 61 61 61 61 61 длина ПЦР продукта, п.н. Arabidopsis thaliana ELIP1 AT3G22840 ELIP2 AT4G14690 UBQ10 AT4G05320.2 ELIP1 AT3G22840 ELIP2 AT4G14690 Lhcb2 AT2G05070 ChlH AT5G13630 HEMA1 AT1G58290 HEMA2 AT1G09940 UBQ10 AT4G05320.2 18S рРНК X16077 ПЦР в режиме реального времени прямой gacgtttagcgatggttgga обратный taccgaggaaccatgagacg прямой gtggtgtcgggtggtttcta обратный cctctgcccttattcccttg прямой cgtcttcgtggtggtttctaa обратный tacaaggccccaaaacacaa Стандартная ПЦР прямой tatccggtgggagtgagatg обратный gagtgtcccacctttgacga прямой ctgctccttccggtgtattg обратный cctctgcccttattcccttg прямой gacccattgaacttggctga обратный caagacgaccgttcttgagc прямой attcgcatcctacgaagtgg обратный ttaatcgccaattcctcgac прямой tattgcttctggtgcggttt обратный ttttccagcgccaattacac прямой ggttgtgaatcgaagcgaag обратный ctgcagcacaagacagcatc прямой cgtctcatcttcgctggaa обратный agccatccttagaacccaaca прямой cggagtaatgattaacagggac обратный ccgcgatccgaacacttca 108 84 101 468 429 76 138 112 107 437 840 Ячмень Стандартная ПЦР ELIP клон HVLP60 ELIP клон HVLP58 18S рРНК X15691 прямой обратный ccgtccgaacaactagcagc ttatccggtcgacagcaaagc 20 21 54 652 X15693 прямой обратный cttagcaaggagcaccttc cgagcatagcgaagcggcc 19 19 54 697 AY552749 прямой обратный caaggaaggcagcaggcgc cctggtaagtttccccgtgtt 19 21 54 800 8 Получение комплементарной ДНК (кДНК) с помощью реакции обратной транскрипции (ОТ). кДНК синтезировали, используя набор «Синтез первой цепи кДНК (базовый)» («СилексМ», Россия) или «Omniscript RT kit» («QIAGEN», Германия), согласно рекомендациям производителей. Для проведения реакции использовали Олиго-дТ или специфические праймеры. Реакцию ОТ проводили на амплификаторе «ДНК ТП-4ПЦР-01 Терцик» («ДНК-Технология», Россия) или «T3 THERMOCYCLER» («Biometra», Германия). Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени («Real-time» ПЦР). «Real-time» ПЦР проводили на роторном анализаторе «Rotor-Gene (RG) 3000» («Corbett Research», Англия) с реакционной смесью, которая содержала: 2х «ImmoMix» (с 1.5 мМ MgCl2) («BIOLINE», Германия) – 10 µл; 35 мМ MgCl2 («BIOLINE», Германия) – 2 µл; 50xSYBR Green («QIAGEN», Германия) – 0.4 µл; 10 мМ прямого и обратного праймеров – по 1 µл; кДНК – 2 µл; стерильная вода – 2.6 µл. Реакцию проводили по следующей схеме: 1. Начальная денатурация - 94°С, 3 мин – 1 цикл. 2. Амплификационный цикл (40 повторов): денатурация - 94°С, 30 с; отжиг праймеров - 61° С, 30 с; элонгация - 72° С, 15 с. 3. Достраивание цепей ДНК - 72° С, 3 мин – 1 цикл. Кривую плавления строили, устанавливая базовую линию и порог амплификации в соответствии с рекомендациями производителя роторного анализатора. Полученные данные анализировали с помощью программного обеспечения LinRegPCR (Pfaff, 2001; Ramakers, 2003). Относительное содержание транскриптов нормализировали по UBQ10. Для подтверждения отсутствия примесей проводили реакции «негативного контроля» без добавления кДНК со всеми используемыми праймерами. Стандартная ПЦР. Для ПЦР использовали наборы «ОТ-ПЦР базовый» («СилексМ», Россия) и «BIOTAG PCR Kit» («BIOLINE», Германия). Реакционные смеси (25 µл) готовили согласно рекомендациям производителей. Реакцию амплификации проводили по следующей схеме: 1. Начальная денатурация - 94°С, 3 мин – 1 цикл. 2. Амплификационный цикл (35 повторов): денатурация - 94°С, 30 с; отжиг праймеров - 54 (61)° С (в зависимости от используемых праймеров), 30 с; элонгация - 72° С, 15 с. 3. Достраивание цепей ДНК - 72° С, 5 мин – 1 цикл. 4. Хранение – 4°С. Было выбрано оптимальное число циклов ПЦР. Контролем, подтверждающим нанесение равных количеств суммарной кДНК, служили 18S рРНК и UBQ10. Параллельно проводили реакции без добавления полимеразы для доказательства отсутствия примесей. Электрофорез ПЦР-продуктов. 9 Амплифицированные фрагменты разделяли с помощью электрофореза в 1.5% (для фрагментов > 300 п.н.) и 2% (для фрагментов < 300 п.н.) агарозном геле, содержащем 1хТАЕ буфер (0.04 М Трис-ацетат, 2 мМ ЭДТА) в присутствии 0.5 µг/мл EthBr при напряжении 120В в течение 25 мин. Размер продукта амплификации определяли сравнением с маркерами длин фрагментов. Гель фотографировали и анализировали, как описано выше. Рестрикция амплифицированного фрагмента ДНК ферментами HindIII и BamHI являлась доказательством, что амплификация прошла корректно. Определение содержания интермедиатов биосинтеза тетрапирролов. Содержание протопорфирина IX (Proto), Mg-Proto и Mg-ProtoМе определяли по методу, описанному в литературе (Alawady and Grimm, 2005). Измерение фотохимической активности ФС2. Флуоресценцию хлорофилла a измеряли на импульсном флуориметре РАМ (РАМ 101/PDA, Heinz Walz, Effeltrich, Германия). Результаты и их обсуждение 1. Участие интермедиатов биосинтеза тетрапирролов в ретроградной регуляции экспрессии ядерных генов пластидных белков ELIP1 и ELIP2 у Arabidopsis. 1.1. Экспрессия генов ELIP и содержание хлорофилла у hy и gun мутантов на разных стадиях развития растений. Для того чтобы выяснить, участвуют ли интермедиаты биосинтеза тетрапирролов в экспрессии ядерных генов белков фотосинтеза, мы исследовали экспрессию генов ELIP1 и ELIP2 у четырех мутантов с нарушениями в ферментах биосинтеза тетрапирролов: hy мутанты (аллельные gun) с нарушениями в биосинтезе гема (где HY1 гены кодируют гемоксигеназу; HY2 – фитохромобилинсинтазу) и gun мутанты с нарушениями в биосинтезе Рис. 1. Уровень экспрессии ELIP1 и ELIP2 у 10- и 30-дневных hy и gun мутантов Arabidopsis. Содержание транскриптов определяли относительно уровня экспрессии генов ELIP1 у ДТ растений, который принимали за 100%. хлорофилла (где GUN4 гены кодируют белок, участвующий в регуляции активности Mgхелатазы; GUN5 ген - H-субъединицу этого фермента). 10 Анализ ОТ-ПЦР показал, что уровень экспрессии генов ELIP1 и ELIP2 у 10-дневных gun5 и gun5-1 мутантов (полиморфизм в экзоне 3) сходны с уровнем экспрессии этих генов у растений дикого типа. Однако уровень экспрессии генов ELIP у hy1, hy2 мутантов увеличивался на 30-40%, а у gun4 мутантов на 50-60% по сравнению с растениями дикого типа. Уровень экспрессии ELIP2 был ниже, чем ELIP1, как у мутантов, так и у растений дикого типа (рис. 1). Для того чтобы исследовать экспрессию генов ELIP1 и ELIP2 в процессе развития растений, был проведен эксперимент со взрослыми растениями hy и gun мутантов Arabidopsis. ОТ-ПЦР анализ содержания транскриптов генов ELIP у 30-дневных растений показал, что различия в уровнях экспрессии этих генов у мутантов и растений дикого типа сходны с различиями, наблюдающимися у 10-дневных растений (рис. 1). Исследование содержания хлорофилла в хлоропластах hy и gun мутантов и ДТ растений Arabidopsis показало, что растения с мутациями, повреждающими пластидные ферменты биосинтеза тетрапирролов, характеризуются пониженным содержанием хлорофилла (у gun4, hy1 и hy2 мутантов накапливалось ~ 50% хлорофилла; у gun5-1 (gun5) ~ 80%, по сравнению с растениями дикого типа). Различия по содержанию хлорофилла между мутантами и диким типом не зависят от возраста растений. В то же время у взрослых растений хлорофилла накапливалось больше (~ в 2 раза), чем у 10-дневных проростков (рис. 2). Рис. 2. Содержание хлорофилла у 10- и 30- дневных gun мутантов Arabidopsis. (А) Растения gun5-1, gun4, hy1, hy2 мутантов и ДТ Arabidopsis, выращенные в течение 10 и 30 дней. (Б) Диаграмма накопления хлорофилла у мутантов и растений дикого типа. СВ –сырой вес. Приведенные на рисунке данные являются средними не менее трех независимых экспериментов. ± стандартное отклонение. Таким образом, было показано, что HY1, HY2 и GUN4 пластидные сигналы позитивно регулируют экспрессию генов ELIP независимо от возраста растений. Эти факты свидетельствуют о том, что экспрессия генов ELIP находится под влиянием пластидных сигналов, генерируемых биосинтезом тетрапирролов. Обнаруженная обратная корреляция между накоплением транскриптов ELIP и содержанием хлорофилла у gun мутантов с нарушениями биосинтеза тетрапирролов, по-видимому, указывает на то, что белки ELIP 11 модулируют синтез хлорофилла, предотвращая накопление свободного пигмента и, таким образом, защищая клетки от фотоокисления. 1.2. Действие норфлуразона на экспрессию генов ELIP у hy и gun мутантов и растений дикого типа Arabidopsis. Для того чтобы изучить участие интермедиатов биосинтеза тетрапирролов, как пластидных сигналов, в регуляции экспрессии генов ELIP, были проведены опыты с gun мутантами и ДТ растениями Arabidopsis в присутствии НФ. Как известно, обработка растений НФ - ингибитором биосинтеза каротиноидов, приводит к нарушению функционирования хлоропластов (Mayfield and Taylor, 1987) и подавлению пластидного сигнала (Woodson and Chory, 2008). Анализ пигментного состава пластид растений, обработанных НФ, показало полное отсутствие хлорофилла и каротиноидов у 10-дневных проростков. Исследование содержания транскриптов ELIP1 и ELIP2 с помощью ОТ-ПЦР и ПЦР в режиме реального времени у растений дикого типа показало, что полная дисфункция пластид (при обработке НФ) приводит к значительному ингибированию (на 80-90%) экспрессии ELIP (рис. 3). Однако у НФ-обработанных hy и gun мутантов Arabidopsis наблюдалось только частичное ингибирование экспрессии этих генов (на 40-50%). Рис. 3. Содержание транскриптов ELIP1 и ELIP2 у 10-дневных растений hy и gun мутантов и ДТ Arabidopsis, выросших в присутствии 5 µM НФ (+) и без добавления ингибитора (-). (A) ОТ-ПЦР анализ накопления ELIP. (Б, В) ПЦР анализ в режиме реального времени. UBQ10 использовали для стандартизации ОТ-ПЦР. Содержание транскриптов ELIP1 и ELIP2 определяли относительно уровня экспрессии генов ELIP1 у контрольных растений, который принимали за 100%. Для того чтобы изучить изменяется ли действие ретроградного сигнала на экспрессию ELIP в процессе развития растений, было изучено действие НФ на 30-дневные растения 12 Arabidopsis. Результаты, полученные с помощью ОТ-ПЦР, показали, что экспрессия ядерных генов стрессовых белков ELIP1 и ELIP2 у НФ-обработанных растений дикого типа была подавлена (на 80-90%), а у hy и gun мутантов практически не изменялась (рис. 4). Рис. 4. Содержание транскриптов ELIP1 и ELIP2 у НФ-обработанных (+) и контрольных (-) 30-дневных hy и gun мутантов и ДТ растений Arabidopsis. UBQ10 использовали для стандартизации ОТ-ПЦР. Таким образом, результаты, полученные при исследовании мутантов с нарушениями в передаче пластидного сигнала, и с помощью ингибиторного анализа, показали, что пластидные сигналы, индуцируемые интермедиатами биосинтеза тетрапирролов, участвуют в регуляции экспрессии ядерных генов хлоропластных белков ELIP в зависимости от возраста растений. 1.3. Влияние экзогенного и эндогенного Mg-Proto на экспрессию генов ELIP1 и ELIP2 у gun5 мутантов и растений дикого типа Arabidopsis. Ранее было высказано предположение, что Mg-Proto и Mg-ProtoМе – интермедиаты биосинтеза тетрапирролов могут выступать в роли молекул, передающих сигнал от пластид к ядру. Мы проверили, существует ли зависимость между накоплением этих молекул и содержанием транскриптов ядерных генов ELIP с помощью увеличения их содержания эндогенно (добавлением гербицида ДП) и экзогенно (добавлением Mg-Proto). Как известно, ДП ингибирует биосинтез тетрапирролов на стадии превращения Mg-ProtoМе в протохлорофиллид, в результате чего происходит избыточное накопление Mg-ProtoМе. ДП в условиях фотодеструкции, вызванной НФ, приводил к значительному подавлению экспресии генов ELIP, как у растений дикого типа, так и у gun5 мутантов (рис. 5А). Как было сказано выше, экспрессия этих же генов у растений, которые были обработаны одним НФ, была только частично подавлена у мутантов (рис. 5Б). Следовательно, повышение содержания Mg-Proto в хлоропластах коррелирует с экспрессией генов ELIP. Кроме того, дополнительным доказательством было значительное снижение экспрессии генов ELIP у 13 растений дикого типа и gun5 мутантов при действии самого Mg-Proto на клетки растений (рис. 5В). Рис. 5. Содержание транскриптов ELIP1 и ELIP2 после обработки НФ, ДП и Mg-Proto (+) у gun5 (gun5-1) мутантов и ДТ растений Arabidopsis и контрольных растений (-). (А) 10дневные растения инкубировали с раствором 5мM ДП. (Б) Растения росли на НФ-среде. (В) Листья 30-дневных растений инкубировали с 50 µM Mg-Proto. UBQ10 и 18S рРНК использовали для стандартизации ОТ-ПЦР. Эти данные и данные литературы позволяли предполагать, что Mg-Proto может выступать в роли сигнальной молекулы, которая участвует в передаче сигналов от хлоропластов к ядру, регулируя экспрессию ядерных генов белков хлоропластов ELIP1 и ELIP2. 1.4. Содержание интермедиатов биосинтеза тетрапирролов у gun мутантов и растений дикого типа Arabidopsis, выращенных в присутствии или без НФ. Для того чтобы выяснить, коррелирует ли содержание интермедиатов биосинтеза тетрапирролов с уровнем экспрессии ядерных генов белков пластид ELIP, было изучено содержание предшественников хлорофилла (Proto, Mg-Proto и Mg-ProtoMe) в присутствии НФ у проростков Arabidopsis в условиях светового стресса. Результаты высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) показали, что в отсутствие ингибитора уровень Proto был выше у gun5-1 и gun4 мутантов по сравнению с ДТ (рис. 6А). В присутствии НФ накопление Proto было подавлено ~ на 100% у gun4 мутантов и ДТ растений, и у gun5-1 мутантов ~ на 50%. Содержание Mg-Proto и Mg-ProtoMe у необработанных gun5-1, gun4 мутантов не отличалось от их уровня у растений дикого типа. Видимо, gun мутации не влияют на накопление этих интермедиатов у растений. В присутствии НФ содержание Mg-Proto и Mg-ProtoMe снижалось как у ДТ растений, так и у gun мутантов. Как следует из рис. 6Б, в присутствии НФ экспрессия генов ELIP была подавлена у растений дикого типа и частично восстановлена у gun5-1 и gun4 мутантов. Таким образом, прямое определение содержания Mg-Proto и Mg-ProtoMe с помощью HPLC не выявило корреляции между уровнем накопления Mg-Proto и Mg-ProtoМе в 14 условиях фотодеструкции, вызванной НФ, и экспрессией генов ELIP. Следовательно, эти интермедиаты биосинтеза тетрапирролов не являются сигнальными молекулами при передаче ретроградного пластидного сигнала в ядро. Рис. 6. Содержание тетрапирролов (А) и транскриптов ELIP1 и ELIP2 (Б) у 10-дневных gun4, gun5-1 мутантов и ДТ растений Arabidopsis, выросших на НФ-среде (+) или на среде без ингибитора (-). СВ - сырой вес. UBQ10 использовали для стандартизации ОТ-ПЦР. Содержание транскриптов ELIP1 и ELIP2 определяли относительно уровня экспрессии генов ELIP1 у ДТ растений, который принимали за 100%. Это, однако, не означает, что тетрапирролы вообще не участвуют в передаче пластидного сигнала. Не исключено, что деградация Mg-Proto приводит к образованию побочных продуктов (например, АФК) или к сдвигу редокс-состояния ЭТЦ пластид, которые и могут выступать в качестве ретроградных сигналов. Кроме того, возможно побочное действие ингибиторов (НФ, ДП), поскольку эти гербициды влияют на различные биологические процессы в клетке, которые также могут участвовать в регуляции экспрессии ядерных генов. Несмотря на большое количество полученных данных, остается неясным, как нарушение метаболизма тетрапирролов может приводить к восстановлению транскрипции ELIP, и каков механизм передачи пластидного сигнала, Для того чтобы это выяснить, необходимы дальнейшие исследования. 2. Влияние других типов пластидных сигналов на экспрессию генов ELIP при нарушении биосинтеза тетрапирролов у hy и gun мутантов. Для того чтобы изучить участие АФК, как возможных пластидных сигналов, в экспрессии генов ELIP использовали ацифлуорфен, который ингибирует протопорфириноген-оксидазу (ППО) и приводит к образованию АФК (Matringe et al., 1989). Обработка АФ растений дикого типа и gun5-1, hy1, hy2 мутантов Arabidopsis на разных стадиях их развития показала, что взрослые растения более АФ-толерантны, чем молодые 15 растения, причем толерантность растений на HL выше, чем на LL. Была обнаружена также повышенная резистентность к АФ у молодых проростков gun5-1 мутантов, имеющих дефект в Н-субъединице Mg-хелатазы, что указывает на участие этого фермента в резистентности к гербициду. С помощью ОТ-ПЦР было показано, что содержание транскриптов ELIP1 и ELIP2 было снижено у 30-дневных растений дикого типа, обработанных 50 µM ингибитора, и составляло всего около 30% и 15%, соответственно. Обработка 30 µM АФ приводила к снижению уровня экспрессии генов ELIP1 и ELIP2 на ~ 50% и ~ 65%, соответственно (рис. 7А). Рис. 7. Уровень экспрессии генов ELIP1 и ELIP2 у 30- (А) и 10-дневных (Б) растений Arabidopsis, обработанных АФ. UBQ10 использовали для стандартизации ОТ-ПЦР. Содержание транскриптов ELIP1 и ELIP2 определяли относительно уровня экспрессии у ДТ растений, который принимали за 100%. Изучение экспрессии этих генов у молодых растений, развитие которых было подавлено гербицидом, показало, что экспрессия генов ELIP у 10-дневных проростков ДТ и hy мутантов, выращенных на АФ-среде, подавляется на 80-90%. У АФ-обработанных gun5-1 мутантов было обнаружено снижение экспрессии генов ELIP только ~ на 30% (рис. 7Б). Таким образом, АФ влияет на экспрессию генов ELIP у растений Arabidopsis, причем увеличение концентрации АФ приводит к более сильному ингибированию экспрессии генов ELIP1 и ELIP2. В основе этой регуляции, вероятно, лежит е накопление Proto, которое ведет к образованию АФК. По-видимому, можно говорить о негативной регуляции экспрессии генов ELIP пластидным сигналом с участием АФК. Однако нельзя исключить возможного побочного действия АФ, что может приводить к накоплению других соединений, которые также могут участвовать в экспрессии ядерных генов ELIP. Для того чтобы изучить экспрессию ядерных генов ELIP1 и ELIP2 при накоплении интермедиатов биосинтеза тетрапирролов, в условиях, когда хлоропласты подвержены 16 фотоокислению, была использована АЛК. При действии АЛК на HL избыточное накопление тетрапирролов в клетках приводит к индукции АФК (рис. 8). У мутантов с нарушенной передачей сигнала содержание транскриптов ELIP коррелирует с фотоокислением клеток и заметно ниже (10-20% от контроля), чем у растений дикого типа (60-80% от контроля) после воздействия АЛК (рис. 8). Таким образом, можно предположить, что избыточное накопление тетрапирролов при действии АЛК на клетки растений приводит к индукции АФК, которые негативно регулируют экспрессию генов ELIP. Возможно, содержание тетрапирролов, вызывающих фотодинамические повреждения, обработанных мутантов gun сильные у АЛК- превышает их содержание у растений дикого типа, или эти Рис. 8. ОТ-ПЦР анализ накопления транскриптов ELIP1 и ELIP2 у 30дневных gun4, gun5-1 мутантов и растений дикого типа (ДТ) Arabidopsis, инкубированных с 1 мМ АЛК на HL (2 ч). UBQ10 использовали для стандартизации ОТ-ПЦР. мутанты имеют более слабый механизм защиты от окислительного стресса, что может являться причиной отличий в экспрессии генов ELIP у этих растений. Для того чтобы изучить участие редокссостояния пула пластохинонов (ПП) пластид в регуляции экспрессии генов ELIP у растений ячменя и Arabidopsis были проведены опыты со специфическим ингибитором, блокирующим транспорт электронов от ФС2 к ПП, диуроном. Этот ингибитор препятствует восстановлению пула пластохинонов и приводит к накоплению окисленных форм ПП. Наши данные показали, что действие диурона приводит к снижению транскрипции генов ELIP и подавлению фотохимической активности ФС2 (Осипенкова и др., 2007). Обработка растений ячменя диуроном с помощью опрыскивания приводила к снижению уровня транскрипции генов ELIP на 70-80%, с помощью инфильтрации - к значительному ингибированию (~ на 90%) экспрессии этих генов (рис. 9). Нарушение биосинтеза тетрапирролов (у gun5 мутантов) не влияло на экспрессию генов ELIP при обработке диуроном. Фотохимическая активность ФС2 у 7-дневных растений ячменя, обработанных диуроном, была подавлена ~ на 30% (Осипенкова и др., 2007). 17 Рис. 9. ОТ-ПЦР анализ экспрессии генов ELIP1 и ELIP2 у обработанных диуроном (+) и контрольных (-) растений ячменя и Arabidopsis. 18S рРНК использовали для стандартизации ОТ-ПЦР. Таким образом, эти результаты подтверждают, что редокс-состояние пула пластохинонов хлоропластов может выступать в роли негативного пластидного сигнала при экспрессии генов ELIP у растений ячменя и Arabidopsis. 3. Влияние некоторых сигнальных систем клетки на экспрессию генов ELIP при нарушении пластидного сигнала у gun мутантов Arabidopsis. 3.1. Действие пластидного сигнала при разной интенсивности света на экспрессию генов мультигенного семейства белков LHC: ELIP1, ELIP2 и Lhcb2 и экспрессию генов, кодирующих ферменты биосинтеза тетрапирролов (HEMA1, HEMA2 и ChlH). Был проведен анализ экспрессии генов стрессовых белков хлоропластов ELIP и близкородственного гена Lhcb2 с генами, кодирующими ферменты биосинтеза тетрапирролов (HEMA1, HEMA2 и ChlH) у hy и gun мутантов при разной интенсивности света, для того чтобы сравнить участие ретроградной регуляции и света в их экспрессии. Изучение влияния пластидного сигнала на экспрессию Lhcb2, HEMAs и ChlH показало, что, в противоположность экспрессии генов ELIP, HY1 и HY2 пластидные сигналы участвуют в негативной регуляции экспрессии генов Lhcb2 и HEMA1, снижая ее (на 30-50%) и не влияют на экспрессию генов HEMA2 и ChlH (рис. 10). Кроме того, GUN4 мутация, приводящая к активации экспрессии генов ELIP и подавлению экспрессии гена ChlH (~ на 50%) не влияла на экспрессию генов HEMAs и Lhcb2. Мутация GUN5-1 не влияла на экспрессию изученных генов, кроме гена ChlH, содержание транскриптов которого было понижено (на 70-80%) у gun5-1 мутантов. Таким образом, экспрессия генов ELIP1 и ELIP2 регулируется пластидным сигналом противоположно генам Lhcb2, HEMA1 и ChlH. Пластидная регуляция не вовлечена в экспрессию генов HEMA2. 18 Было показано, что при увеличении интенсивности освещения уровень экспрессии генов ELIP1 и ELIP2 увеличивается (~ в 3 раза), а генов Lhcb2 и HEMA1 снижается (более чем вдвое). Световой сигнал не влияет на экспрессию генов HEMA2 и ChlH. Таким образом, экспрессия генов ELIP зависит от интенсивности освещения, как и генов Lhcb2 и HEMA1, однако, эти гены регулируются противоположным образом. Предполагали, пластидный пластидный что сигналы сигнал световой тесно может и связаны: модулировать действие света и являться его эндогенным регулятором Некоторые (Larkin and пластидные Ruckle, 2008). сигналы могут усиливать действие световых сигналов, как в нашем случае, индукторов в или превращать репрессоры генов их из белков фотосинтеза. Таким образом, несмотря на то, Рис. 10. Накопление транскриптов ELIP1, ELIP2, Lhcb2, HEMA1, HEMA2 и ChlH у gun и hy мутантов и растений дикого типа (ДТ) Arabidopsis. UBQ10 использовали для стандартизации ОТ-ПЦР. что гены ELIP и Lhcb2 относятся к одному и тому же семейству, они регулируются поразному световыми и пластидными сигналами, а гены, относящиеся к различным семействам (Lhcb2 и HEMA1), регулируются сходным образом, что согласуется с литературными данными (McCormac and Terry, 2002; Ruckle et al., 2007). 3.2. Влияние регуляторов роста растений и углеводов на экспрессию генов ELIP. Изучение действия природного гормона - абсцизовой кислоты, ингибирующей рост растений, на экспрессию генов ELIP показало, что сигналы, индуцируемые АБК, в условиях светового стресса позитивно регулируют экспрессию генов ELIP, приводя к ее повышению в 2-2.5 раза (рис. 11). Исследование участия АБК в передаче ретроградных сигналов с помощью gun5 мутантов показало, что у мутантов наблюдается некоторое снижение экспрессии этих генов. В условиях фотодеструкции, вызванной НФ, АБК значительно ингибировала (на 80-90%) экспрессию генов ELIP1 и ELIP2 у растений дикого типа и частично (~ на 50%) у gun5 мутантов (рис. 11). 19 Рис 11. Содержание транскриптов ELIP1 и ELIP2 у gun5 мутантов и ДТ растений Arabidopsis, обработанных АБК, НФ (+) или в отсутствие ингибитора и гормона (-). 18S рРНК использовали для стандартизации ОТ-ПЦР. Таким образом, АБК в условиях светового стресса позитивно регулирует экспрессию генов ELIP1 и ELIP2 у растений дикого типа Arabidopsis, что согласуется с современными представлениями о механизме влияния АБК на экспрессию генов стрессовых белков (Wierstra and Kloppstech, 2000; Shen et al., 2006; Koussevitzky et al, 2007). Наши данные об экспрессии генов стрессовых белков при АБК-обработках gun5 мутантов, свидетельствуют в пользу ранее высказанных предположений о том, что ChlH (GUN5) участвует в передаче пластидных сигналов и восприятии АБК-сигналов (Shen et al., 2006). Поскольку у gun5 мутантов отсутствует рецептор сигналов, индуцируемых АБК, поэтому не было обнаружено повышения экспрессии ELIP при действии абсцизовой кислоты. Однако остается неясным, как СhlH выполняет роль посредника между пластидными и АБК-сигналами, участвуя в регуляции экспрессии генов. На основании этих данных можно также говорить о наличии связи между пластидными и АБК-сигналами. Так как природный фитогормон АБК, ингибирующий развитие и рост растений, позитивно регулирует экспрессию ядерных генов стрессовых белков пластид ELIP1 и ELIP2 у растений Arabidopsis, представляло интерес рассмотреть, как влияют на экспрессию этих генов природные регуляторы обладающие стимулирующим процессы Рис. 12. Содержание транскриптов генов ELIP1 и ELIP2 у растений ячменя, обработанных мелафеном в разных концентрациях. 18S рРНК использовали для стандартизации ОТ-ПЦР. развития. роста Для растений, действием экспериментов на был выбран препарат нового поколения - мелафен (Патент РФ № 2158735, 2000). Концентрация приводит к мелафена усилению роста 0.5х10-8 растений М и повышению экспрессии гена высокомолекулярного стрессового белка ELIP2 (~ на 35%), однако, более высокие концентрации мелафена негативно влияют на экспрессию этого гена (рис. 12). При этом не было обнаружено влияния мелафена на экспрессию гена, кодирующего стрессовый 20 белок пластид ELIP1. Во всех использованных концентрациях мелафен не влиял на содержание хлорофилла и каротиноидов (Осипенкова и др., 2008). Наши данные показали, что регулятор роста растений мелафен, повышая экспрессию генов стрессового белка хлоропластов ELIP2, видимо, влияет на биогенез хлоропластов и приводит к усилению защиты растений от различных стрессовых воздействий. Таким образом, различные по механизму действия регуляторы роста растений могут сходно влиять на экспрессию генов ELIP. Для того чтобы изучить участие углеводов в экспрессии ядерных генов стрессовых белков пластид Arabidopsis ELIP1 были и ELIP2 выращены проростки на среде, содержащей 2%-ную или 7%-ную глюкозу. Как следует из полученных данных, глюкоза значительно ингибирует транскрипцию ядерных генов белков фотосинтеза ELIP1 и ELIP2 у Рис. 13. Содержание транскриптов ELIP1 и ELIP2 у растений gun5 мутантов и дикого типа Arabidopsis, выращенных на среде с 2% или 7% глюкозой. 18S рРНК использовали для стандартизации ОТ-ПЦР. растений дикого типа (~ на 80%) (рис. 13). Анализ содержания транскриптов у gun5 мутантов, выращенных на среде с 7% глюкозой, показал, что экспрессия генов ELIP1 и ELIP2 была снижена только на 60-70%. Таким образом, изучение участия углеводов в экспрессии ELIP показало, что глюкоза в высокой концентрации ингибирует транскрипцию генов ELIP у растений дикого типа. У обработанных глюкозой gun5 мутантов было обнаружено, что нарушения биосинтеза тетрапирролов Рис. 14. Содержание транскриптов ELIP1 и ELIP2 у 10-дневных gun мутантов и ДТ растений Arabidopsis, выросших в присутствии НФ (+) и без добавления ингибитора (-) на среде без сахарозы. UBQ10 использовали для стандартизации ОТ-ПЦР. способствовали восстановлению экспрессии. частичному Это видимо, указывает на связь углеводного статуса и ретроградных сигналов, индуцируемых интермедиатами биосинтеза тетрапирролов. Наличие выращивания сахарозы также влияло в среде на для экспрессию ядерных генов стрессовых белков пластид ELIP в условиях фотодеструкции. Как было сказано выше, экспрессия генов ELIP была значительно подавлена у НФ-обработанных растений дикого типа и восстанавливалась у gun5-1, gun4 21 мутантов, выращенных на среде, содержащей 2%-ную сахарозу (рис. 3, 4). Содержание транскриптов у тех же растений, обработанных ингибитором, но выращенных на среде без сахарозы, отличалось от содержания транскриптов генов ELIP у проростков, выращенных на содержащей сахарозу среде. Не наблюдалось восстановления транскрипции ELIP1 и ELIP2 у gun мутантов, обработанных НФ и выращенных на среде без сахарозы. Результаты ОТ-ПЦР показали, что у ДТ растений в этих же условиях подавляется экспрессия генов ELIP1 и ELIP2 только на 70-80% по сравнению с растениями, выращенными на НФ-среде с 2%-ной сахарозой (рис. 14). Можно предположить, что при фотодеструкции на транскрипцию ядерных генов не только влияют нарушения биосинтеза тетрапирролов, но и углеводный статус, что предполагает связь этих двух сигнальных путей. Наши данные согласуются с ранее опубликованными данными о регуляции экспрессии ядерных генов Lhcb и HEMA1 сахарами и GUN4, GUN5 ретроградными сигналами (McCormac and Terry, 2004). Таким образом, нами показано, что экспрессия ядерных генов стрессовых белков пластид ELIP1 и ELIP2 регулируется гормональными сигналами. Так, фитогормон АБК и регулятор роста мелафен на свету повышают экспрессию ядерных генов ELIP. Углеводы подавляют экспрессию генов ELIP. Заключение Ретроградные пластидные сигналы координируют экспрессию ядерного и органелльного геномов и влияют на экспрессию ядерных генов белков хлоропластов в зависимости от функционального состояния этих органелл. Мы исследовали экспрессию ELIP1 и ELIP2 у gun и hy мутантов, имеющих нарушения в передаче пластидного сигнала. Было обнаружено, что ретроградные пластидные сигналы, зависящие от HY1, HY2 и GUN4 белков (но не GUN5), влияют на экспрессию ядерных генов стрессовых белков пластид ELIP1 и ELIP2, негативно регулируя их экспрессию. Кроме того, было обнаружено, что пластидные сигналы по-разному регулируют экспрессию родственных генов ELIP и Lhcb2, и генов биосинтеза тетрапирролов HEMA1, ChlH: у gun мутантов экспрессия ELIP1 и ELIP2 увеличивается, а экспрессия Lhcb2, HEMA1, ChlH уменьшается. На экспрессию гена HEMA2 пластидные сигналы не влияют. Экспрессия генов ELIP, Lhcb2 и HEMA1 зависит также от интенсивности освещения: увеличение интенсивности освещения приводит к повышению экспрессии генов ELIP1 и ELIP2 и снижению экспрессии генов Lhcb2, HEMA1. Световой и пластидный сигналы взаимодействуют друг с другом. На экспрессию генов HEMA2 и ChlH интенсивность освещения не влияет. Исследования gun мутантов Arabidopsis с помощью ингибиторного анализа (норфлуразон, дипиридил) и экзогенного добавления Mg-Proto 22 указывают на участие тетрапирролов в ретроградной регуляции экспрессии ядерных генов пластидных белков ELIP. Однако такие предшественники биосинтеза тетрапирролов, как Mg-Proto и Mg-ProtoMe, индуцирующими по-видимому, пластидный сигнал. не являются Обнаружена сигнальными обратная молекулами, зависимость между содержанием хлорофилла и экспрессией генов ELIP, что указывает на возможное участие белков светового стресса ELIP в регуляции биосинтеза хлорофилла и/или защите хлоропластов от фотоокисления. Подавление экспрессии генов ELIP при использовании ингибиторов (ацифлуорфен) и предшественника биосинтеза тетрапирролов (5-аминолевулиновая кислота), приводящих к накоплению активных форм кислорода свидетельствует о том, что эти молекулы вовлечены в передачу пластидного сигнала и являются негативными регуляторами экспрессии этих генов. Изучение участия редокс-состояния компонентов ЭТЦ фотосинтеза показало, что этот тип ретроградного сигнала также негативно влияет на транскрипцию генов ELIP. При ингибировании (с помощью диурона) транспорта электронов от ФС2 к пулу пластохинонов в хлоропластах, приводящем к окислению пула пластохинонов, экспрессия генов ELIP снижается. Кроме пластидных сигналов на экспрессию ядерных генов ELIP действуют сигналы, индуцируемые гормонами и углеводами. Действие регуляторов роста растений с разным механизмом действия (абсцизовая кислота и мелафен) приводит к активации экспрессии генов ELIP на свету. Углеводы подавляют экспрессию генов ELIP. На основе наших данных можно говорить, что на экспрессию генов ELIP действуют сигналы экзогенного (свет) и эндогенного происхождения (ретроградные сигналы, гормоны, углеводы). Поскольку наши результаты показали, что молекулы Mg-Proto и Mg-ProtoMe не являются сигнальными, возможно, что эти интермедиаты биосинтеза тетрапирролов могут связываться с компонентами Mg-хелатазного мультибелкового комплекса (в частности, с субъединицей ChlH и/или белком GUN4), которые участвуют в регуляции экспрессии ядерных генов. Кроме того, изменения Mg-хелатазного комплекса могут приводить к индукции пластидного сигнала. Известно, что фактор транскрипции ABI4 вовлечен в экспрессию генов белков фотосинтеза (Koussevitzky et al., 2007). Поскольку общие принципы работы сигнальных систем, по-видимому, универсальны в клетках, не исключено, что ABI4 влияет на экспрессию генов ELIP1 и ELIP2. Возможно, что ABI4 может обеспечивать связь ретроградных сигналов хлоропластов с углеводными сигналами и сигналами, индуцируемыми абсцизовой кислотой, которые также участвуют в регуляции экспрессии ядерных генов стрессовых белков пластид ELIP1 и ELIP2. 23 Таким образом, в клетках существует сложная сигнальная сеть, регулирующая координированную экспрессию ядерных генов, при этом различные типы пластидных сигналов могут конвергировать друг с другом и с другими сигнальными системами клетки и ингибировать (или активировать) транскрипцию ядерных генов ELIP1 и ELIP2. Выводы 1. Показано, что нарушения ретроградных пластидных сигналов, зависящие от HY1, HY2 и GUN4 белков (но не GUN5), у мутантов Arabidopsis позитивно влияют на экспрессию ядерных генов стрессовых белков пластид ELIP1 и ELIP2. 2. При исследовании hy и gun мутантов Arabidopsis впервые обнаружена обратная зависимость между экспрессией генов ELIP и содержанием хлорофилла. Это свидетельствует о том, что белки ELIP1 и ELIP2 участвуют в защите хлоропластов от фотоокисления. 3. Показано участие тетрапирролов в ретроградной регуляции экспрессии генов ELIP1 и ELIP2. Mg-протопорфирин IX и его монометиловый эфир, по-видимому, не являются сигнальными молекулами при передаче ретроградного пластидного сигнала в ядро, поскольку их содержание не коррелирует с уровнем экспрессии генов ELIP. 4. Подавление экспрессии генов ELIP1 и ELIP2 ацифлуорфеном и 5- аминолевулиновой кислотой свидетельствует о том, что возникающие активные формы кислорода участвуют в передаче пластидного сигнала. Ингибирование экспрессии генов ELIP диуроном указывает на то, что ретроградный сигнал зависит от редокс-состояния компонентов электрон-транспортной цепи в хлоропластах Arabidopsis. 5. Сравнение действия тетрапиррол-медиированного пластидного сигнала на экспрессию близкородственных генов (ELIP1, ELIP2 и Lhcb2) показало, что они регулируются этими сигналами по-разному, а гены, относящиеся к различным семействам (Lhcb2 и HEMA1), регулируются сходным образом. У hy и gun мутантов световой сигнал, подобно пластидному, увеличивает экспрессию генов ELIP и снижает экспрессию генов Lhcb2 и HEMA1. 6. Так как регуляторы роста (абсцизовая кислота и мелафен) усиливают, а углеводы подавляют экспрессию генов ELIP, высказано предположение, что на экспрессию генов стрессовых белков ELIP Arabidopsis наряду с пластидными сигналами действуют сигналы экзогенного (свет) и эндогенного происхождения (гормональные и углеводные). 24 Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в рецензируемых журналах: 1. Осипенкова О.В., Рахимбердиева М.Г., Карапетян Н.В., Юрина Н.П. Участие двух пластидных сигналов в регуляции экспрессии ядерного гена хлоропластного белка ELIP. Доклады Российской Академии наук, 2007, т. 416, № 4, с. 546-549. 2. Осипенкова О.В., Ермохина О.В., Белкина Г.Г., Фаттахов С.Г., Юрина Н.П. Влияние мелафена на экспрессию генов белков светового стресса хлоропластов Elip1 и Elip2 у ячменя. Прикладная биохимия и микробиология, 2008, т. 44, № 6, с. 701-708. Статьи в сборниках: 3. Осипенкова О.В., Юрина Н.П. Влияние ретроградных сигналов на экспрессию ядерных генов стрессового белка пластид Elip и генов белков фотосинтеза Lhcb1, RbcS. Труды III Международного симпозиума «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии», посвященного 100-летию акад. Н.М. Сисакяна, 2007, с. 184-186. Тезисы докладов: 4. Юрина Н.П., Погульская Е.Н., Осипенкова О.В., Олескина Ю.П., Белкина Г.Г. Роль пластидных сигналов в регуляции экспрессии ядерных генов стрессовых белков Elip и Hsp32 у ячменя. Второй Международный симпозиум «Сигнальные системы клеток растений: роль в адаптации и иммунитете». Россия, Казань, 2006, с. 142-143. 5. Osipenkova O., Pogulskaya E., Yurina N. Regulation of nuclear gene expression of plastid stress protein Elip by tetrapyrrole biosynthesis intermediates and chloroplast redox activity. International Meeting «Photosynthesis in the post-genomic era: structure and function of photosystems». Россия, Пущино, 2006, с. 211. 6. Осипенкова О.В., Юрина Н.П. Влияние ретроградных сигналов на экспрессию ядерных генов стрессового белка пластид Elip и генов белков фотосинтеза Lhcb1, RbcS. III Международный симпозиум «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии», посвященный 100-летию акад. Н.М. Сисакяна. Россия, Дубна, 2007, с. 205-206. 7. Осипенкова О.В., Юрина Н.П. Хлоропластные сигналы и экспрессия ядерных генов, кодирующих стрессовые белки хлоропластов. III Международный симпозиум «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии», посвященный 100-летию акад. Н.М. Сисакяна. Армения, Ереван, 2007, с. 100. 25 8. Osipenkova O.V., Yurina N.P. Chloroplasts regulate the expression of nuclear genes encoding ELIP in barley. FEBS Advanced Lecture Course: «Origin and Evolution of Mitochondria and Chloroplasts». Италия, Маратея, 2007, с. 79. 9. Юрина Н.П., Осипенкова О.В. Пластидные сигналы: регуляция экспрессии ядерных генов. VI съезд общества физиологов растений России - Международная конференция «Современная физиология растений: от молекул до экосистем». Россия, Сыктывкар, 2007, с. 225-226. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ, Программы «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН и стипендии FEBS. Список сокращений АБК - абсцизовая кислота АЛК – 5-аминолевулиновая кислота АФ - ацифлуорфен АФК – активные формы кислорода Диурон – [3-(3,4-дихлорфенил)-1,1-диметилмочевина] ДП – 2,2’-дипиридил ДТ – дикий тип Arabidopsis НФ – норфлуразон п.н. – пара нуклеотидов ПП – пул пластохинонов ФС2 – фотосистема 2 ЭТЦ – электрон-транспортная цепь HL – свет высокой интенсивности LL – свет низкой интенсивности Mg-Proto – магний протопорфирин IX Mg-ProtoMe – монометиловый эфир магний протопорфирина IX SL – стандартное освещение 26
