3.1. Организация и проведение

3.1. Организация и проведение внутрилабораторного контроля
качества иммуноцитохимического метода ИФТ.
Проспективный
метода
определения
контроль
качества
иммуноцитохимического
субпопуляционного
состава
лимфоцитов
периферической крови, на наш взгляд, невозможен без применения
контрольных материалов и четкого алгоритма его проведения. Причин
выбора
критерия
воспроизводимости
в
качестве
основы
внутрилабораторного контроля качества ИЦХ несколько: в реализации
иммуноцитохимического метода принимают участие представители и
среднего звена, и врачебного состава лаборатории; учет результатов
проводится с использованием световой микроскопии, и, следовательно,
существует
определенная
субъективность
оценки
данных.
С
диагностической точки зрения принципиально важно, чтобы реально
существующие субъективные расхождения в оценке препаратов не
приводили к искажению фактических данных, и, как следствие, к
искажению
клинической
Информативность
критерия
интерпретации
воспроизводимости
иммунограммы.
для
определения
необходимого числа учитываемых событий и проведения контроля
качества позволила разработать такой способ его проведения, при
котором
• объектом исследования (измерения) становятся не контрольные
материалы, а «случайные» образцы периферической крови пациентов,
т.е. не обязателен стандартный контрольный материал;
• могут быть обнаружены ошибки, не выявляемые другими методами;
• контролируется весь процесс исследования.
В
каждую
постановку
выявления
поверхностных
маркеров
лимфоцитов нами было включено одно дополнительное («случайное»)
стекло, на лунках которого было определено относительное содержание
основных популяций лимфоцитов, в том числе Т-клеток (по маркеру
СD3+), В-клеток (по маркеру СD20+) и натуральных киллеров (по маркеру
СD56+). Результаты учета, определявшие относительное содержание
позитивных
лимфоцитов,
были
использованы
для
построения
контрольных карт отдельно для каждого определяемого типа клеток с
последующей оценкой доверительных границ погрешностей результатов
измерений согласно предупредительным и контрольным критериям.
Проспективный внутрилабораторный контроль качества был основан на
воспроизводимости
результатов
оценки
случайных
образцов
периферической крови. Для этого было осуществлено включение
препаратов случайных образцов периферической крови в рутинные
постановки
выявления
поверхностных
маркеров
лимфоцитов.
Основываясь на критерии воспроизводимости, было необходимо оценить
не только воспроизводимость результатов учета, но соответствие
препаратов разных лаборантов требованиям диагностического процесса.
Иммуноцитохимический
метод
выявления
поверхностных
маркеров лимфоцитов организационно делится на три этапа:
1. Выделение мононуклеаров периферической крови и подготовка
цитологических препаратов;
2. Выявление поверхностных маркеров с помощью специфических
антител и системы визуализации;
3. Учет и регистрация результатов.
Следовательно,
и
внутрилабораторный
контроль
качества
иммуноцитохимического метода должен четко разграничивать сферы
действия различных звеньев персонала лаборатории с тем, чтобы
максимально
соответствовать
целям
управления
качеством
диагностического процесса.
Алгоритм действий при проведении внутрилабораторного контроля
качества
Руководитель определяет регулярность подготовки и исследования
контрольных препаратов из случайным образом выбранных образцов
периферической крови, а затем проводит оценку контрольных карт,
коэффициента вариации и корректировку выявленных нарушений
технологического процесса.
Персонал среднего уровня (лаборанты) осуществляет подготовку
контрольных препаратов из каждого образца периферической крови,
включенного во внутренний контроль качества.
Врачебный
персонал
осуществляет
визуализацию
маркеров
основных популяций лимфоцитов на препаратах, включенных во
внутренний контроль качества. Учет результатов проводится каждым
врачом по своим препаратам и по препаратам коллег для выявления
индивидуальных различий учета.
Оператор вносит результаты учета ИФТ в таблицы (например,
Еxcel), .рассчитывает контрольные пределы различий (±2σ) и строит
контрольные карты для каждого маркера отдельно.
В
качестве
внутрилабораторнго
примера
контроля
использования
качества
алгоритма
представлены
проведения
данные
по
лаборатории клинической иммунологии СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова,
в которой подготовка препаратов для ИФТ рутинно осуществлялась не
менее, чем двумя лаборантами (Л1 и Л2), а визуализация маркеров и учет
результатов проводилась не менее, чем тремя врачами (В1, В2, В3, В4 и
В5).
Подготовка препаратов. В течение каждых 30 рабочих дней
десятикратно (т.е. два раза в неделю) из случайным образом выбранных
образцов
периферической
крови
осуществлялась
подготовка
дополнительных препаратов. Выделение мононуклеаров и нанесение
суспензии клеток на подготовленные стекла проводили два лаборанта: Л1
и Л2. Из одного образца периферической крови каждый из них
самостоятельно
выделял
мононуклеары
и
готовил
определенное
количество (n=5) предметных стекол с нанесенной на них суспензией и
маркировал их соответственно Л1 или Л2 дополнительно к стандартной
маркировке стекол по потоку.
Выявление маркеров дифференцировки лимфоцитов. Выявление
маркеров дифференцировки лимфоцитов было осуществлено согласно
рутинно используемому лабораторией протоколу проведения ИФТ
иммуноцитохимическим методом. Для выявления возможных различий
качества работы разных лаборантов (Л1 и Л2) подготовленные ими
препараты были проставлены и учтены каждым из врачей, принимавших
участие в реализации иммуноцитохимического метода (рис.13).
100,00
%
2,50
1,50
0,50
-0,50
50,00
0,00
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
нормализованн
ые значения
Т-лимфоциты
контрольные препараты
нормализо
ванные
значения
количество
Bлимфоцито
в(%)
В-лимфоциты
30,00
3,00
20,00
10,00
0,00
2,00
1,00
0,00
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
контрольныепрепараты
1,50
10,00
1,00
5,00
0,50
0,00
0,00
количество
NK(%)
15,00
нормализов
анные
значения
Натуральныекиллеры
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
контрольныепрепараты
Рис.13. Сопоставление относительного содержания основных популяций
лимфоцитов по препаратам, подготовленным разными лаборантами и
проанализированными
всеми
врачами,
принимавшими
участие
в
реализации ИЦХ. Графики учета препаратов построены с учетом
доверительных интервалов. При оценке полученных данных нулевая
гипотеза составила более 5% (при доверительном интервале 95%), а
доверительные интервалы каждого значения перекрывались.
Независимый учет препаратов обоих лаборантов, проведенный
разными врачами не выявил статистически значимых различий (p>0,05)
учета результатов визуализации маркеров лимфоцитов. Практически это
означало, что качество препаратов обоих лаборантов было адекватно
поставленной задаче выявления маркеров лимфоцитов и не определяло
конечный результат исследования.
Проведение ИФТ препаратов, подготовленных лаборантами (Л1 и
Л2)
было
осуществлено
независимо
каждым
из
докторов,
осуществляющих ИФТ и, соответственно, принимавших участие во
внутреннем
контроле
качества.
Для
этого
каждый
врач
при
осуществлении стандартной постановки дополнительно включал два
стекла,
подготовленные
соответственно
лаборантами
Л1
и
Л2,
визуализируя Т-лимфоциты (CD3+), В-лимфоциты (CD20+) и натуральные
киллеры (CD56+).
В течение 30 рабочих дней шаги 1 и 2 (подготовка препаратов и
выявление маркеров дифференцировки лимфоцитов) были осуществлены
не менее 10 раз, т.е. в течение 30 рабочих дней лаборанты 10 раз (два раза
в
неделю)
осуществляли
параллельную
подготовку
специально
маркированных стекол из одного образца крови. Вслед за ними каждый из
врачей регулярно включал в рутинные постановки дополнительные
стекла
для
осуществления
внутреннего
контроля
качества
по
воспроизводимости получаемых результатов.
Учет результатов. Независимый учет результатов ИФТ означал
определение относительного содержания популяций Т-лимфоцитов
(CD3+), В-лимфоцитов (CD22+) и натуральных киллеров (CD56+). Для
этого каждый врач проводил учет всех препаратов, подготовленных
каждым из лаборантов и каждым из врачей, фиксируя результаты учета
каждой сотни лимфоцитов отдельно.
Было
проведено
сопоставление
результатов
учета
контрольных
препаратов, осуществленное разными врачами (рис.14) и выявлено, что,
несмотря на наличие определенных расхождений, это не приводит к
необходимости менять клиническую интерпретацию иммунограммы.
%
Т-лимфоциты
90
85
80
75
70
65
60
55
50
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
25
В-лимфоциты
20
15
10
5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Натуральные киллеры
15
10
5
0
1
2
3
4
5
6
врач 1
7
8
врач 2
9
10
11
12
13
врач 3
Рис.14. Контрольные карты результатов учета основных популяций
лимфоцитов тремя врачами.
Несмотря на то, что не все результаты учета по отдельным
препаратам вошли в область нормальных значений, нами не было
выявлено достоверных различий результатов учета препаратов разными
врачами
(p>0,05).
Несоответствие
данных
некоторых
препаратов
диапазону нормальных значений было связано с тем, что в качестве
источника клеток для создания контрольных препаратов служили
случайные образцы крови пациентов, а не стандартизированный
контрольный материал.
Таким образом, при проведении внутрилабораторного контроля
качества иммуноцитохимического метода ИФТ лимфоцитов согласно
разработанному алгоритму было выявлено следующее:
• отсутствие различий в качестве препаратов, подготовленных разными
лаборантами;
• различия
в
результатах
учета
препаратов
разными
врачами
статистически недостоверны и не дают оснований изменения
клинической интерпретации.
Отсутствие
достоверных
различий
в
результатах
оценки
препаратов, подготовленных разными лаборантами и оцененными
разными
врачами,
позволяет
рассматривать
каждый
образец,
дополнительно включенный в ИФТ как одну и ту же, многократно
исследованную пробу. По результатам исследования этой пробы были
построены контрольные карты, при анализе которых мы исходили из
того, что результаты, не вошедшие в контрольные пределы, с 95%
вероятностью покажут наличие каких-то нарушений в реализации метода.
Отсутствие
повторяемости
ошибок
разных
врачей
является
доказательством отсутствия системной ошибки в использовании системы
визуализации и проведении учета результатов ИФТ, а на практике
означает возможность замены одного врача другим при учете препаратов.