1.1. Иммуноцитохимический метод выявления антигенов клеток
реклама
1.1. Иммуноцитохимический метод выявления антигенов клеток крови. Классическими работами Coons’a [77], в последующем продолженными исследованиями Sternberg’a [216] и Brandzaeg’a [57] были заложены два основных направления развития ИФТ: использование флюоресцентной и нефлюоресцентной меток для выявления целевого антигена. Для количественного определения популяционного состава клеток крови и их функциональных особенностей, для идентификации опухолевых клеток в биологическом материале разработаны различные варианты ИФТ. Некоторые из них имеют уже сугубо историческое значение, и применение их на практике может быть объяснено только данью традиции, но не современными требованиями клиники в области диагностики и мониторинга патологических состояний. К ним относятся метод розеткообразования, основанный на сродстве определенных антигенов клеточной поверхности лимфоцитов человека и гликопротеинов мембраны эритроцитов барана, и лимфоцитотоксический тест, основанный на образовании на поверхностной мембране лимфоцита комплекса антиген-антитело, активирующего комплемент с последующим повреждением мембраны и лимфоцитолизом, выявляемым методом суправитального окрашивания [8, 3]. Оба метода предназначены для оценки только нормальных лимфоцитов периферической крови ex temporae, не могут быть полностью стандартизированы, а учет результатов достаточно субъективен и в значительной мере зависит от опыта исследователя. диагностические Перечисленные возможности особенности использующих их ограничивают лабораторий, не позволяя оценивать трансформированные клетки и малоклеточные популяции [26]. Другие варианты ИФТ, основанные на способности рецепторов взаимодействовать со специфическими антителами с образованием стабильных комплексов на поверхностной мембране клетки, достаточно широко применяются современной диагностической службой, так как максимально адаптированы для практических целей [14]. К ним относятся: • иммуноцитохимический метод [17], в том числе традиционная иммуноцитохимия с оценкой результатов методами световой микроскопии; прямая и непрямая иммунофлюоресценция с оценкой результатов методом люминесцентной микроскопии; • проточная цитометрия [36]. Однако, не только в клинически сложных случаях, но и в повседневной диагностике онкогематологических заболеваний, микроскопия все чаще уступает место проточной цитометрии (ПЦ) [173]. Это связано с необходимостью использования метода, предоставляющего максимальную свободу выбора способа идентификации антигена клетки [242] при минимальных временных затратах для получения достаточного объема фактических данных [39] с тем, чтобы основные усилия врача были отданы интерпретации результатов, а не их получению [59, 61] (табл.1). Таблица 1 Сопоставление методов ИФТ Характеристика Чувствительность Методы ИФТ РО1 ЛЦТТ2 ИЦХ3 ПЦ4 - + ++ +++ Воспроизводимость - +/- ++ +++ ++ ++ + - Универсальность - - ++ +++ Возможность автоматизации - - + + Высокие требования к оборудованию - - - ++ Биологическая безопасность - + + + проведении - - + - Метод выбора при постоянном проведении большого - - - + Низкая себестоимость Метод выбора при постоянном умеренного количества исследований количества исследований 1 – розеткообразование; 2 – лимфоцитотоксический тест; 3 – иммуноцитохимия; 4 – проточная цитометрия. Вне зависимости от способа учета результатов (световая, люминесцентная, конфокальная, электронная микроскопия, проточная цитометрия) при ИФТ применяют моноклональные или поликлональные антитела, конъюгированные с меткой. Соединенные с меткой, или меченые антитела, образующие нерастворимый комплекс с антигеном клетки и создают возможность ее идентификации. В качестве метки используют различные вещества, особенности которых определяют способ их применения в соответствии с условиями и задачей исследования [57]: частицы коллоидного золота или серебра, радиоактивные вещества, флюорохромы, ферменты и т.д. (табл.2). Причины широкого применения ИЦХ очевидны: широкий выбор качественных реагентов, простота реализации и обучения персонала навыкам учета результатов, а при световой микроскопии – возможность сопоставления с морфологией, хранения и транспортировки препаратов, отсутствие необходимости в узкоспециальном оборудовании [57, 122]. Отрицательными моментами, несомненно, являются, субъективность визуальной оценки, трудность организации контроля качества, невозможность учета большого количества клеток и, как следствие, вероятность неадекватной оценки малоклеточных популяций (активированных клеток, бластов при минимальной остаточной болезни, гемопоэтических стволовых клеток) [2]. Таблица 2 Типы меток и их особенности Типы меток Особенности практического Качество Удобство использования визуализации практического антигенов клеток применения крови Флюорохром • нестабильные препараты • необходимо ++ +/- специальное оборудование и помещение • затруднено сопоставление с морфологией Фермент наличие эндогенных ферментов ++ ++ Металлы высокая +++ - + - ++ - стоимость исследования при каждого относительно небольшом объеме информации Металло- электронная микроскопия протеины Радиоизотопы • наукоемкие исследования • трудность обеспечения биологической безопасности Визуальный учет результатов в определенной мере ограничивает количество проводимых исследований в условиях современной гематологической клиники. Особенности иммунофлюоресцентной и иммуноферментной цитохимии сопоставлены в таблице 3. Таблица 3 Особенности иммунофлюоресцентной и иммуноферментной цитохимии при визуализации антигенов клеток крови Особенности Иммунофлюоресцентный метод Иммуноферментный метод Оборудование люминесцентный микроскоп световой микроскоп - + сутки недели - + - + высокая низкая - + Соотнесение с морфологией Оптимальные сроки учета результатов Транспортировка готовых препаратов Архивное хранение препаратов Концентрация первых и вторых антител Возможность автоматизации На практике использование световой микроскопии для учета результатов иммуноцитохимического метода более удобно для исследований в области клинической иммунологии по сравнению с люминесценцией, так как при равном качестве препаратов, дает возможность отсроченного учета, проведения контроля качества и удаленного консультирования препаратов. В световой ИЦХ используют различные ферменты и соответствующие им хромогены. Топография окрашенных нерастворимых конечных продуктов ферментативной реакции определяется классическими гистохимическими методами. Так, начиная с работ Avrameas and Uriel [37] и Nakane and Pierce [168] применяют пероксидазу хрена (ПОХ), а в качестве субстрата ПОХ чаще всего используют диаминобензидин (ДАБ), полимеризующийся при окислении с образованием коричневого окрашивания, хорошо контрастирующего с клетками, докрашенными гематоксилином. Реакция выявления ДАБ может быть при необходимости дополнительно усилена различными веществами, такими как осмий [62], хлорид никеля или хрома [124], имидазол [221], азотнокислое серебро [101], железистый ферроцианид [170] и другими, что позволяет значительно повысить чувствительность метода. В целом, спектр ферментов и соответствующих им субстратов, применяемых на современном этапе ИЦХ, очень широк. Особенности некоторых из них представлены ниже (табл.4). Таблица 4 Ферменты и соответствующие им субстраты, используемые в ИЦХ Фермент Хромоген Цвет реакции Удобство практического применения Пероксидаза хрена диаминобензидин (ДАБ) коричневый ++ 3-амино-9-этилкарбозол (АЭК) красноватый ++ тетраметилбензидин (ТМБ) коричневато- возможна черный кристаллизация на синий препаратах 4-хлор-1-нафтол сине-черный - соль синего быстрого BB и синий - соль красного быстрого красный - новый фуксин красный + нитросиний тетразолий сине-черный - дигидрохлорид бензидина (ДГБХ) Щелочная фосфатаза (ЩФ) нафтол AS-MX нитросиний тетразолий Глюкозооксидаза Преимуществом продуктов реакции, основанных на бензидине, является их стабильность во времени при хранении препаратов и нерастворимость в органических растворителях, но практика его использования требует соблюдения определенных мер безопасности [246]. Аналогом ДАБ является 3-амино-9-этилкарбозол (АЭК) [110], способность которого диссоциировать в органических растворителях требует заключения водорастворимыми средами. Это обстоятельство в практике лабораторной службы может быть расценено как положительный фактор, так как значительно сокращает общее время подготовки препарата к учету. С другой стороны, использование АЭК исключает длительное, архивное хранение препаратов, создание библиотеки микроскопических препаратов диагностически сложных случаев. Применение тетраметилбензидина высокочувствительного в ИЦХ ограничено хромогена возможностью его кристаллизации на цитологических препаратах и срезах тканей [162]. Хромогены дигидрохлорид бензидина и 4-хлор-1-нафтол дают синий продукт реакции, что может быть использовано в двойном окрашивании [155, 57]. Однако, иммуноцитохимическим использование методом двойного является окрашивания довольно трудоемким процессом и нечасто применяется в диагностических лабораториях. Преимущества использования щелочной фосфатазы (ЩФ) в качестве метки связанно с отсутствием этого фермента в клетках крови. Практическим фонового следствием окрашивания, является отсутствие обусловленного неспецифического наличием эндогенных ферментов, и высокая чувствительность метода для определения единичных положительных клеток в мазках [57]. Однако, гистохимический этап выявления данного фермента более трудоемок по сравнению с выявлением ПОХ [237]. Идея использования ферментов, отсутствующих в тканях млекопитающих и исключающих проблемы эндогенного окрашивания была реализована на примере глюкозооксидазы из Aspergillus niger [38] и β-галактозидазы [68] достаточно давно. Однако, небольшой выбор хромогенов и высокая требовательность к условиям проведения реакции не способствуют их рутинному применению. У каждого из упомянутых ферментов и их субстратов есть не только преимущества, но и недостатки, использование диагностической службой: • наличие аналогичных эндогенных ферментов, ограничивающие их • зависимость результатов (чувствительности) от концентрации первых или вторых антител; • субъективность учета результатов; • ограниченность времени анализа препаратов и др. Таким образом, выбор иммуноцитохимического метода визуализации антигенов лейкоцитов не так уж очевиден. Единственным положением, не вызывающим сомнений, является предпочтение ПОХ в диагностической ИЦХ [238]. На сегодняшний день разработана методическая база, позволяющая воспроизвести практически любой метод ИЦХ в исследовательской работе, но не достаточная для применения в диагностике заболеваний человека. Оборотной стороной доступности различных методов ИЦХ оказалось отсутствие системы, правил, критериев выбора оптимального подхода, способного обеспечить надежность результатов в условиях конкретной диагностической лаборатории. И более того, отсутствие системы контроля качества проведения методики и учета ее результатов лишает нас длительном учреждениях. возможности сопоставлять наблюдении за пациентом данные, полученные в разных при медицинских
