ÓÄÊ 577.23 ÑÍÈÆÅÍÈÅ ×ÓÂÑÒÂÈÒÅËÜÍÎÑÒÈ ÌÈÒÎÕÎÍÄÐÈÉ Ê Ñà2+-ÇÀÂÈÑÈÌÎÌÓ ÎÒÊÐÛÒÈÞ ÏÎÐÛ Â ÓÑËÎÂÈßÕ ÈÕ ÄËÈÒÅËÜÍÎÉ ÈÍÊÓÁÀÖÈÈ Î. Â. ÀÊÎÏÎÂÀ, Â. Ô. ÑÀÃÀ× Èíñòèòóò ôèçèîëîãèè èì. À. À. Áîãîìîëüöà ÍÀÍ Óêðàèíû, Êèåâ; e-mail: circul@serv.biph.kiev.ua Ïîêàçàíî, ùî ³çîëüîâàí³ ì³òîõîíä𳿠ñåðöÿ ùóð³â âèÿâëÿþòü âèñîêó ÷óòëèâ³ñòü äî Ñà2+-çàëåæíîãî óòâîðåííÿ ì³òîõîíäð³àëüíî¿ ïîðè ïðîòÿãîì ãîäèíè ï³ñëÿ ¿õíüîãî âèä³ëåííÿ. Ïîðîãîâ³ êîíöåíòðàö³¿, íåîáõ³äí³ äëÿ â³äêðèòòÿ ïîðè, íèçüê³ ³ ñòàíîâëÿòü 25–50 íìîëü Ñà2+/ìã á³ëêà. Óÿâíà êîíñòàíòà àêòèâàö³¿ öüîãî ïðîöåñó ³îíàìè êàëüö³þ (ÊÑà ) äîð³âíþº 40 ìêÌ. Ïîäàëüøà ³íêóáàö³ÿ ñóñïåí糿 ïðîòÿãîì 2, 3 òà 4 ãîä ïðèçâîäèòü äî ïîñòóïîâîãî ï³äâèùåííÿ ÊÑà äî 0,4 ìÌ ³, â³äïîâ³äíî, ñò³éêîñò³ ì³òîõîíäð³é äî â³äêðèòòÿ ïîðè. Çðîáëåíî ñïðîáó ïîÿñíèòè ôåíîìåí çíèæåííÿ ÷óòëèâîñò³ ì³òîõîíäð³é äî â³äêðèòòÿ Ñà2+-çàëåæíî¿ ïîðè ó ïðîöåñ³ ñòàð³ííÿ ñóñïåí糿 ì³òîõîíäð³é çà óìîâ òðèâàëî¿ ³íêóáàö³¿. Ê ë þ ÷ î â ³ ñ ë î â à: ì³òîõîíäð³¿, ïîðà, Ñà2+, òðèâàë³ñòü ³íêóáàö³¿. Ç “ñòàðåíèè” in vitro, áëèçêè ê òåì, êîòîðûå ñâîéñòâåííû îðãàíåëëàì, âûäåëåííûì èç òêàíåé ñòàðûõ îñîáåé [1, 2]. Ñîãëàñíî äàííûì ëèòåðàòóðû, ìèòîõîíäðèè, âûäåëåííûå èç òêàíåé ñòàðûõ æèâîòíûõ, îáíàðóæèâàþò òàêæå ïîâûøåííóþ ÷óâñòâèòåëüíîñòü ê èíäóêöèè Ñà2+-çàâèñèìîé íåñåëåêòèâíîé ïðîíèöàåìîñòè, ïîðû [3, 5]. Ïîýòîìó äëÿ íàñ ïðåäñòàâëÿëî èíòåðåñ âûÿñíèòü, êàêèì îáðàçîì áóäåò èçìåíÿòüñÿ âî âðåìåíè ÷óâñòâèòåëüíîñòü ìèòîõîíäðèé ìèîêàðäà êðûñ ê èíäóêöèè ÌÐÒ ïîä äåéñòâèåì Ñà2+ïðè “ñòàðåíèè” îðãàíåëë in vitro è ñîïîñòàâèòü ýòè èçìåíåíèÿ ñ ïðåäïîëàãàåìîé âàðèàáåëüíîñòüþ äðóãèõ ôóíêöèîíàëüíûõ ïîêàçàòåëåé, íàïðèìåð ìåìáðàííîãî ïîòåíöèàëà, õàðàêòåðèçóþùåãî ðàáîòó äûõàòåëüíîé öåïè. Ñ ýòîé öåëüþ íàìè áûëà ïîñòàâëåíà çàäà÷à èçó÷èòü èíäóêöèþ íåñåëåêòèâíîé ïðîíèöàåìîñòè, ïîðû, ïîä äåéñòâèåì Ñà2+ â ìèòîõîíäðèÿõ ìèîêàðäà êðûñ â óñëîâèÿõ èõ äëèòåëüíîé èíêóáàöèè. íà÷èòåëüíîå êîëè÷åñòâî ôàêòîâ, íàêîïëåííûõ ê íàñòîÿùåìó âðåìåíè, ñâèäåòåëüñòâóåò, ÷òî îäíîé èç ïðè÷èí âûñîêîãî óðîâíÿ ïðîäóêòîâ ñâîáîäíîðàäèêàëüíûõ ðåàêöèé (â ÷àñòíîñòè àêòèâíûõ ôîðì êèñëîðîäà) è âûçâàííûõ èìè êëåòî÷íûõ ïîâðåæäåíèé, ñîïðîâîæäàþùèõ ñòàðåíèå îðãàíèçìà, ÿâëÿþòñÿ ðàçëè÷íîãî ðîäà ìèòîõîíäðèàëüíûå äèñôóíêöèè [1]. Ôóíêöèîíàëüíûå èçìåíåíèÿ â ìèòîõîíäðèÿõ îáíàðóæèâàþòñÿ íå òîëüêî â íàðóøåíèè ðàáîòû ôåðìåíòíûõ êîìïëåêñîâ äûõàòåëüíîé öåïè è äèñáàëàíñå â ñèñòåìå àíòèîêñèäàíòíîé çàùèòû ýòèõ îðãàíåëë [1], íî è â íàðóøåíèè áàðüåðíûõ ôóíêöèé ìèòîõîíäðèàëüíîé ìåìáðàíû [2], êîòîðîå ïðîÿâëÿåòñÿ â ïîâûøåíèè åå ïðîíèöàåìîñòè äëÿ ìàëûõ ìîëåêóë è ïîâûøåííîé ñïîñîáíîñòè ê îáðàçîâàíèþ ìèòîõîíäðèàëüíûõ ïîð – êàíàëîâ, íåñåëåêòèâíî ïðîíèöàåìûõ äëÿ ìîëåêóë ñ ìîëåêóëÿðíîé ìàññîé ìåíåå 1500 Äà [2, 3]. Ñïîíòàííàÿ ïåðìåàáèëèçàöèÿ ìèòîõîíäðèàëüíîé ìåìáðàíû (mitochondrial permeability transition – MPT) ïîä äåéñòâèåì èíäóêòîðîâ – èîíîâ Ñà, àêòèâíûõ ôîðì êèñëîðîäà, ïðîäóêòîâ ÏÎË, – êàê èçâåñòíî, ïðèâîäèò ê íàáóõàíèþ ìàòðèêñà, ðàçðûâó íàðóæíîé ìåìáðàíû è âûõîäó â öèòîçîëü ðÿäà ôàêòîðîâ, çàïóñêàþùèõ ïðîãðàììó àïîïòîçà – êàñêàä ñïåöèôè÷åñêèõ ðåàêöèé, âûçûâàþùèõ äåãðàäàöèþ êëåòî÷íûõ ñòðóêòóð è ðàçðóøåíèå êëåòêè [2, 4]. Èçâåñòíî, ÷òî îñíîâíûå ôóíêöèîíàëüíûå ïîêàçàòåëè (ñíèæåííûé ìåìáðàííûé ïîòåíöèàë è äûõàòåëüíûé êîíòðîëü, íèçêèé óðîâåíü ãëóòàòèîíà, ýíäîãåííûõ ïèðèäèíîâûõ è àäåíèíîâûõ íóêëåîòèäîâ è äð.) èçîëèðîâàííûõ ìèòîõîíäðèé â óñëîâèÿõ äëèòåëüíîé èíêóáàöèè, ò.å. ïðè èõ  îïûòàõ èñïîëüçîâàëè áåëûõ êðûñ ñ ìàññîé òåëà 200 – 250 ã. Âûäåëåííûå ñåðäöà ïðîìûâàëè îõëàæäåííûì 0,9%-íûì ðàñòâîðîì KCl (4 °Ñ), èçìåëü÷àëè è ãîìîãåíèçèðîâàëè â 10-êðàòíîì îáúåìå ñðåäû, ñîäåðæàùåé (â ìÌ): 250 ñàõàðîçû, 20 òðèñ-ÍCl-áóôåðà, 1 ÝÄÒÀ (ðÍ 7,4). Äëÿ âûäåëåíèÿ ìèòîõîíäðèé ãîìîãåíàò âíà÷àëå öåíòðèôóãèðîâàëè 7 ìèí ïðè 700 g (4 °Ñ), à çàòåì öåíòðèôóãèðîâàëè ñóïåðíàòàíò (15 ìèí, 11 000 g, 4 °Ñ). Îñàäîê ñóñïåíäèðîâàëè â íåáîëüøîì îáúåìå ñðåäû áåç äîáàâëåíèÿ ÝÄÒÀ è õðàíèëè íà ëüäó â òå÷åíèå äëèòåëüíîãî âðåìåíè. Èçìåðåíèÿ ïðîâîäèëè ÷åðåç 1, 2, 3 è 4 ÷ ïîñëå íà÷àëà èíêóáàöèè. ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2004, ò. 76, ¹ 5 61 Ìàòåðèàëû è ìåòîäû ÅÊÑÏÅÐÈÌÅÍÒÀËÜͲ ÐÎÁÎÒÈ Îòêðûòèå ïîðû ðåãèñòðèðîâàëè ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêè êàê öèêëîñïîðèí À-÷óâñòâèòåëüíîå ñíèæåíèå ñâåòîïîãëîùåíèÿ ïðè 540 íì (À540) âñëåäñòâèå íàáóõàíèÿ ìèòîõîíäðèé. Îïðåäåëåíèå ìåìáðàííîãî ïîòåíöèàëà ïðîâîäèëè â ïðèñóòñòâèè ñàôðàíèíà Î (êîíå÷íàÿ êîíöåíòðàöèÿ 9 ìêÌ) ïî ðàçíîñòè ñâåòîïîãëîùåíèÿ ïðè 515 è 525 íì (∆À515-525) [3]. Äëÿ ðåãèñòðàöèè íàáóõàíèÿ è ìåìáðàííîãî ïîòåíöèàëà èñïîëüçîâàëè ñðåäó ñëåäóþùåãî ñîñòàâà (â ìÌ): ÊCl – 120, ÊÍ2ÐÎ4 – 1, ãëóòàìàòà – 2, ìàëàòà – 1, òðèñ-ÍCl-áóôåðà (ðÍ 7,4) – 20, ÝÃÒÀ – 5 ìêÌ. Êîíå÷íàÿ êîíöåíòðàöèÿ áåëêà â ñóñïåíçèè ñîñòàâëÿëà 0,7– 0,8 ìã/ìë.  ðàáîòå èñïîëüçîâàëè ñàôðàíèí Î («Aldrich», ÑØÀ); Na2-ÀÒÐ, òðèñ (îñíîâàíèå), ãëóòàìàò Na, D,L-ìàëàò Na («Sigma», ÑØÀ); öèêëîñïîðèí À («Fluka», Øâåéöàðèÿ) è äðóãèå ðåàêòèâû êâàëèôèêàöèè î. ñ. ÷. è ÷. ä. à. Ðàñòâîðû ãîòîâèëè íà áèäèñòèëëÿòå. Äîñòîâåðíîñòü ðåçóëüòàòîâ îöåíèâàëè ñ ïîìîùüþ t-êðèòåðèÿ Ñòüþäåíòà. Âåëè÷èíó p < 0,05 ñ÷èòàëè ñòàòèñòè÷åñêè äîñòîâåðíîé. Ðåçóëüòàòû è îáñóæäåíèå Îáðàçîâàíèå ìèòîõîíäðèàëüíîé ïîðû èçó÷àëè â øèðîêîì äèàïàçîíå êîíöåíòðàöèé êàëüöèÿ: 10-6–10-3 Ì. Îá îòêðûòèè åå ñóäèëè ïî öèêëîñïîðèí À-÷óâñòâèòåëüíîìó ñíèæåíèþ ñâåòîïîãëîùåíèÿ ñóñïåíçèè (âñëåäñòâèå îòêðûòèÿ ïîðû è íàáóõàíèÿ ìèòîõîíäðèé). Îïðåäåëÿëè ñêîðîñòü èçìåíåíèÿ ñâåòîïîãëîùåíèÿ çà åäèíèöó âðåìåíè, ∆À540/ìèí (ðèñ. 1). Îòêðûòèå ïîðû, êàê èçâåñòíî, ñîïðîâîæäàåòñÿ ñíèæåíèåì ìåìáðàííîãî ïîòåíöèàëà ìèòîõîíäðèé (∆Ψm) äî 0 . Èçìåíåíèå âåëè÷èíû ∆Ψm, îïðåäåëÿåìîå â % îò èñõîäíîé âåëè÷èíû, ïðèíèìàåìîé çà 100%, ðåãèñòðèðîâàëè ÷åðåç 3 ìèí ïîñëå äîáàâëåíèÿ CaCl2 ê ñóñïåíçèè (ðèñ. 2). Ðåçóëüòàòû ýêñïåðèìåíòà ïîêàçûâàþò âûñîêóþ ÷óâñòâèòåëüíîñòü ìèòîõîíäðèé ìèîêàðäà ê Ñà2+-çàâèñèìîé ÌÐÒ â òå÷åíèå ïåðâûõ 60 ìèí ïîñëå âûäåëåíèÿ ìèòîõîíäðèé. Çàìåòíîå íàáóõàíèå îðãàíåëë âûçûâàþò óæå ñðàâíèòåëüíî íèçêèå äîáàâêè â èíêóáàöèîííóþ ñðåäó Ñà2+ – 10– 20 ìêÌ (ðèñ. 1, êðèâàÿ 1). Ïðè ýòîì êàæóùàÿñÿ êîíñòàíòà èíäóêöèè ÌÐÒ èîíàìè Ñà (KCa), êîòîðóþ îïðåäåëÿëè ïî äàííûì ñâåòîïîãëîùåíèÿ èç ëèíåàðèçîâàííîé çàâèñèìîñòè ñêîðîñòè íàáóõàíèÿ îðãàíåëë îò êîíöåíòðàöèè Ñà2+ â äâîéíûõ îáðàòíûõ êîîðäèíàòàõ, ñîñòàâëÿåò 40,0 ± 10,0 ìêÌ (òàáëèöà). Îäíàêî èíêóáàöèÿ ñóñïåíçèè â òå÷åíèå áîëåå äëèòåëüíîãî âðåìåíè ïðèâîäèò ê ïîñòåïåííîìó ïîâûøåíèþ ïîðîãîâûõ êîíöåíòðàöèé Ñà 2+, íåîáõîäèìûõ äëÿ èíäóêöèè ÌÐÒ (ðèñ. 1). Ïðè ýòîì ïðîèñõîäèò ïîñëåäîâàòåëüíîå ñòàòèñòè÷åñêè äîñòîâåðíîå âîçðàñòàíèå âåëè÷èí KCa äî 0,280 ± 0,025 ìÌ (p < 0,05) è 0,40 ± ± 0,01 ìÌ (p < 0,05) â òå÷åíèå äâóõ è ÷åòûðåõ- Ðèñ. 1. Âëèÿíèå äëèòåëüíîñòè èíêóáàöèè ìèòîõîíäðèé íà èçìåíåíèå ñâåòîïîãëîùåíèÿ çà 1 ìèí ïîä äåéñâèåì Ñà2+. Çäåñü è íà ðèñ. 2 ñîñòàâ ñðåäû èíêóáàöèè (â ìÌ): KCl – 120, KÍ2ÐÎ4 – 1, ãëóòàìàò – 2, ìàëàò – 1 , òðèñ-ÍCl-áóôåð – 20 (ðÍ 7,4); ïðîäîëæèòåëüíîñòü èíêóáàöèè – 1 ÷ (êðèâàÿ 1), 2–3 ÷ (êðèâàÿ 2), 4 ÷ (êðèâàÿ 3). 62 ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2004, ò. 76, ¹ 5 Î. Â. ÀÊÎÏÎÂÀ, Â. Ô. ÑÀÃÀ× Ðèñ. 2. Èçìåíåíèå ìåìáðàííîãî ïîòåíöèàëà (∆Ψm ) â % îò èñõîäíîé âåëè÷èíû ïîä äåéñòâèåì Ñà2+ â çàâèñèìîñòè îò ïðîäîëæèòåëüíîñòè èíêóáàöèè. Èçìåðåíèÿ ïðîâîäèëè ÷åðåç 3 ìèí ïîñëå âíåñåíèÿ â ñðåäó ÑàÑl2 â ïðèñóòñòâèè 9 ìêÌ ñàôðàíèíà Î. Êðèâàÿ 4 – ðåãèñòðàöèþ ∆Ψm ïðîâîäèëè â ïðèñóòñòâèè 10-5 Ì ðóòåíèåâîãî êðàñíîãî ïîñëå 1 ÷ èíêóáàöèè ìèòîõîíäðèé. ÷àñîâîé èíêóáàöèè îðãàíåëë, ÷òî ñîîòâåòñòâóåò ïîñòåïåííîìó ñíèæåíèþ ÷óâñòâèòåëüíîñòè ìèòîõîíäðèàëüíîé ïîðû ê èîíàì Ñà. Ñëåäóåò îòìåòèòü, ÷òî Vmax îñòàåòñÿ ïî÷òè áåç èçìåíåíèé â òå÷åíèå âñåãî îïûòà (òàáëèöà). Ìîæíî áûëî áû ïðåäïîëîæèòü, ÷òî íàáëþäàåìîå ñíèæåíèå ÷óâñòâèòåëüíîñòè ìèòîõîíäðèé ê îòêðûòèþ ïîðû, è, ñîîòâåòñòâåííî, ïîâûøåíèå KCa ñ òå÷åíèåì âðåìåíè îáóñëîâëèâàåòñÿ ïîñòåïåííûì ñíèæåíèåì ∆Ψm, îáåñïå÷èâàþùåãî ýëåêòðîôîðåòè÷åñêèé òðàíñïîðò Ñà2+ ïî óíèïîðòåðó â ìèòîõîíäðèàëüíûé ìàòðèêñ. Îäíàêî, êàê ïîêàçàëè ïðîâåäåííûå èçìåðåíèÿ, èñõîäíàÿ âåëè÷èíà ∆Ψm â îòñóòñòâèå äîáàâëåííîãî Ñà2+ îñòàåòñÿ ïðàêòè÷åñêè ïîñòîÿííîé â õîäå âñåãî îïûòà. Ñíèæåíèå ∆Ψm ïîä äåéñòâèåì Ñà2+, êàê è íàáóõàíèå, âûçâàííîå îòêðûòèåì ïîðû, îáóñëîâëåíî òîëüêî âõîäîì êàòèîíîâ â ìàòðèêñ ìèòîõîíäðèé.  ïðèñóòñòâèè ðóòåíèåâîãî êðàñíîãî, áëîêèðóþ- ùåãî óíèïîðòåð, íå íàáëþäàþòñÿ íè äåïîëÿðèçàöèÿ ìåìáðàíû, íè íàáóõàíèå ìèòîõîíäðèé âî âñåé èññëåäóåìîé îáëàñòè êîíöåíòðàöèé êàëüöèÿ. Ïîëó÷åííûé ðåçóëüòàò ñâèäåòåëüñòâóåò î íåîáõîäèìîñòè òðàíñëîêàöèè êàòèîíà ê âíóòðåííåé ìåìáðàíå îðãàíåëë äëÿ èíäóêöèè Ñà2+-çàâèñèìîé ìèòîõîíäðèàëüíîé ïîðû. Ïîëó÷åííûå äàííûå ïîêàçûâàþò òàêæå, ÷òî èíäóêöèÿ ÌÐÒ ïîä äåéñòâèåì Ñà2+ ïðîèñõîäèò â äâå ñòàäèè (ðèñ. 1, êðèâàÿ 2). Ïîäîáíàÿ çàêîíîìåðíîñòü îáíàðóæèâàåòñÿ è ïðè èçó÷åíèè âëèÿíèÿ Ñà2+ íà ìåìáðàííûé ïîòåíöèàë (ðèñ. 2). Òàê, â ìèòîõîíäðèÿõ, âûñîêî÷óâñòâèòåëüíûõ ê îòêðûòèþ ïîðû, ïðîèñõîäèò áûñòðîå ïàäåíèå ìåìáðàííîãî ïîòåíöèàëà äî 0 óæå ïîä äåéñòâèåì î÷åíü íèçêèõ êîíöåíòðàöèé Ñà2+ (~20 ìêÌ) (ðèñ. 2, êðèâàÿ 1). Ñíèæåíèå ÷óâñòâèòåëüíîñòè îðãàíåëë ê èíäóêöèè ÌÐÒ ñîïðîâîæäàåòñÿ ïîñòåïåííûì ïîâûøåíèåì èõ óñòîé÷èâîñòè ê äå- Âëèÿíèå ïðîäîëæèòåëüíîñòè èíêóáàöèè ñóñïåíçèè ìèòîõîíäðèé íà èçìåíåíèå ïàðàìåòðîâ KCa ³ Vmax öèêëîñïîðèí À-÷óâñòâèòåëüíîãî íàáóõàíèÿ îðãàíåëë ïîä äåéñòâèåì Ñà2+ (M ± m, n = 4–6). Длительность инкубации, ч 1 2−3 4 KCa, мкМ Vmax, ед. ∆А⋅мин-1 K Ca 1 K Ca 2 Vmax 1 Vmax 2 40,0 ± 10,0 не установлено − 280,0 ± 25,0 400,0 ± 10,0 0,100 ± 0,008 0,037±0,010 − 0,090 ± 0,010 0,075 ± 0,008 − ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2004, ò. 76, ¹ 5 − 63 ÅÊÑÏÅÐÈÌÅÍÒÀËÜͲ ÐÎÁÎÒÈ ïîëÿðèçàöèè ìåìáðàíû ïîä äåéñòâèåì Ñà2+ (ðèñ. 2, êðèâûå 2 è 3); ïðè ýòîì, êàê è íà êðèâûõ ðèñ. 1, îáíàðóæèâàþòñÿ äâå îáëàñòè àêòèâàöèè ÌÐÒ. Ñëåäóåò îòìåòèòü, ÷òî âñå íàáëþäàåìûå èçìåíåíèÿ ∆Ψm îáóñëîâëåíû òîëüêî òðàíñëîêàöèåé Ñà2+ ÷åðåç ìèòîõîíäðèàëüíóþ ìåìáðàíó. Îäíî ëèøü ïðèñóòñòâèå â ñðåäå ýòèõ êàòèîíîâ, ïðè áëîêèðîâàíèè èõ òðàíñïîðòà, íå âûçûâàåò èçìåíåíèé ∆Ψm (ðèñ. 2, êðèâàÿ 4). Õîòÿ âûÿñíåíèå èñòèííîé ïðè÷èíû ïîâûøåíèÿ óñòîé÷èâîñòè ìèòîõîíäðèé ê Ñà2+-çàâèñèìîé èíäóêöèè ÌÐÒ îñòàåòñÿ çàäà÷åé äàëüíåéøåãî èññëåäîâàíèÿ, ìîæíî âñå æå ïîïûòàòüñÿ íàéòè ïðåäïîëîæèòåëüíîå îáúÿñíåíèå íàáëþäàåìîé çàêîíîìåðíîñòè. Òàê, ðåçóëüòàòû ïðîâåäåííîãî ýêñïåðèìåíòà ñâèäåòåëüñòâóþò, ÷òî îáðàçîâàíèå ïîðû îáóñëîâëåíî òðàíñïîðòîì Ñà2+ ÷åðåç ìåìáðàíó ìèòîõîíäðèé. Ïî íàøåìó ìíåíèþ, ïîëó÷åííûå äàííûå óêàçûâàþò íå òîëüêî íà çàâèñèìîñòü èíäóêöèè ÌÐÒ îò òðàíñïîðòà êàëüöèÿ, íî è íà ïðÿìóþ âçàèìîñâÿçü ìåæäó àêòèâàöèåé îòêðûòèÿ ïîðû èîíàìè Ñà è êèíåòè÷åñêèìè õàðàêòåðèñòèêàìè Ñà2+-óíèïîðòåðà, èçâåñòíûìè èç ëèòåðàòóðû. Òàê, Km äëÿ óíèïîðòåðà íàõîäèòñÿ â ïðåäåëàõ 10–20 ìêÌ [7]. Àêòèâàöèÿ ÌÐÒ èîíàìè Ñà íàáëþäàåòñÿ â òîé æå îáëàñòè êîíöåíòðàöèé êàòèîíà: ~10-5 Ì (ðèñ. 1, êðèâàÿ 1). Ñëåäóåò îòìåòèòü òàêæå è îïðåäåëåííóþ êîððåëÿöèþ ìåæäó îáíàðóæåííîé íàìè äâóõñòàäèéíîé èíäóêöèåé îáðàçîâàíèÿ ïîðû ïîä äåéñòâèåì Ñà2+ (ðèñ. 1, 2) è ñòóïåí÷àòîé àêòèâàöèåé óíèïîðòåðà äàííûìè èîíàìè, ïîêàçàííîé ðàíåå G. F. Azzone et al. [8], â ïðèñóòñòâèè íèçêèõ êîíöåíòðàöèé ñïåöèôè÷åñêîãî èíãèáèòîðà ðóòåíèåâîãî êðàñíîãî, êîòîðàÿ îáóñëîâëåíà îòðèöàòåëüíîé êîîïåðàòèâíîñòüþ äâóõ Ñà2+-ñâÿçûâàþùèõ ñàéòîâ óíèïîðòåðà [8]. Äâóõñòàäèéíîñòü ïðîöåññà èíäóêöèè ÌÐÒ èîíàìè Ñà, îáíàðóæåííàÿ â óñëîâèÿõ äëèòåëüíîé èíêóáàöèè ìèòîõîíäðèé, òàê æå, êàê è â ñëó÷àå Ñà2+-óíèïîðòåðà, ïîçâîëÿåò ïðåäïîëîæèòü ñóùåñòâîâàíèå äâóõ òèïîâ öåíòðîâ ñâÿçûâàíèÿ Ñà2+ – âûñîêîãî è íèçêîãî ñðîäñòâà, ó÷àñòâóþùèõ â ìåõàíèçìå òðàíñïîðòà êàòèîíà è îáðàçîâàíèÿ ïîðû, à ïîâûøåíèå óñòîé÷èâîñòè ìèòîõîíäðèé ê èíäóêöèè ÌÐÒ – ñâÿçàòü ñ ÷àñòè÷íîé èíàêòèâàöèåé ïðåäïîëàãàåìûõ âûñîêîàôôèííûõ öåíòðîâ ñâÿçûâàíèÿ Ñà2+ ïðè ñòàðåíèè ñóñïåíçèè ìèòîõîíäðèé in vitro. Ïðîâîäÿ ïàðàëëåëü ìåæäó ýòèìè ïîêàçàòåëÿìè è ôèçèîëîãè÷åñêèìè óñëîâèÿìè, ìîæíî ïðåäïîëîæèòü, ÷òî ïîäîáíîå ñíèæåíèå ñðîäñòâà Ñà2+-ñâÿçûâàþùèõ ñàéòîâ ìèòîõîíäðèàëüíîé ìåìáðàíû ê êàëüöèþ äîëæíî ïðèâîäèòü ê çíà÷èòåëüíîìó íàðóøåíèþ Ñà2+-ãîìåîñòàçà êàðäèîìèîöèòîâ. Òàê, èçâåñòíî, ÷òî ôèçèîëîãè÷åñêèé óðîâåíü êàëüöèÿ â êëåòêàõ â ñîñòîÿíèè ïîêîÿ ñîñòàâëÿåò ~10-7 Ì è äîñòèãàåò ~10-6 Ì ïðè èõ âîçáóæäåíèè [7]. Ìèòîõîíäðèè â ôèçèîëîãè÷åñêèõ óñëîâèÿõ ñïîñîáíû áûñòðî íàêàïëèâàòü êàëüöèé, çàùèùàÿ, òàêèì îáðàçîì, êëåòêè îò Ñà2+ïåðåãðóçêè. Ñíèæåíèå ÷óâñòâèòåëüíîñòè ìèòîõîíäðèé ê ìèêðîìîëÿðíûì (ôèçèîëîãè÷åñêèì) êîíöåíòðàöèÿì êàòèîíà, ïðè êîòîðîì óòðà÷èâàåòñÿ ôóíêöèÿ “Ñà2+-ëîâóøêè”, õîòÿ è ïðåäîõðàíÿåò îðãàíåëëû îò ïîâðåæäåíèÿ, îäíàêî ìîæåò ïðèâîäèòü ê ïîâûøåíèþ óðîâíÿ öèòîçîëüíîãî Ñà2+ è ðàçâèòèþ øèðîêîãî ñïåêòðà îòêëîíåíèé îò íîðìàëüíûõ ôèçèîëîãè÷åñêèõ óñëîâèé, ñîïðîâîæäàþùèõ, â ÷àñòíîñòè, ñòàðåíèå îðãàíèçìà. Ñëåäóåò îòìåòèòü, ÷òî, ñîãëàñíî ñ äàííûìè ëèòåðàòóðû, â óñëîâèÿõ ôèçèîëîãè÷åñêîãî ñòàðåíèÿ, íàðÿäó ñî ñíèæåíèåì Ñà2+-åìêîñòè [3], ÷óâñòâèòåëüíîñòü ìèòîõîíäðèé ê îòêðûòèþ ïîðû ïîâûøàåòñÿ [3, 5]. Ýòîìó ìîãóò ñïîñîáñòâîâàòü ðàçíûå ïðè÷èíû, â ÷àñòíîñòè ïîâûøåíèå àêòèâíîñòè ôîñôîëèïàç, à òàêæå óâåëè÷åííîå ñîäåðæàíèå ïðîäóêòîâ ïåðîêñèäíîãî îêèñëåíèÿ ëèïèäîâ â òêàíÿõ ñòàðûõ æèâîòíûõ – ôàêòîðû, îòñóòñòâóþùèå ïðè “ñòàðåíèè” ìèòîõîíäðèé in vitro. Ðåçóëüòàòû ýêñïåðèìåíòà, ïðîâåäåííîãî in vitro, ïî íàøåìó ìíåíèþ, óêàçûâàþò íà òî, ÷òî ÷óâñòâèòåëüíîñòü ìèòîõîíäðèé ê èíäóêöèè íåñåëåêòèâíîé ïðîíèöàåìîñòè ïîä äåéñòâèåì Ñà2+ íåïîñðåäñòâåííî îïðåäåëÿåòñÿ Ñà2+-òðàíñïîðòíîé “àêòèâíîñòüþ” îðãàíåëë, à êèíåòè÷åñêèå ïàðàìåòðû èíäóêöèè ÌÐÒ íàõîäÿòñÿ â ïðÿìîé çàâèñèìîñòè îò êèíåòè÷åñêèõ õàðàêòåðèñòèê Ñà2+òðàíñïîðòíîãî ìåõàíèçìà, îáåñïå÷èâàþùåãî äîñòàâêó êàòèîíà ê ñâÿçûâàþùèì åãî ñàéòàì âíóòðåííåé ìåìáðàíû ìèòîõîíäðèé. Ïîäîáíîå ïðåäïîëîæåíèå íå ïðåäñòàâëÿåòñÿ ñëèøêîì íåîæèäàííûì, åñëè ó÷åñòü, ÷òî îäíèì èç ñòðóêòóðíûõ êîìïîíåíòîâ, âõîäÿùèõ â ñîñòàâ áåëêîâîãî êîìïëåêñà, ñîáñòâåííî ïîðû, ÿâëÿåòñÿ ïîòåíöèàëçàâèñèìûé àíèîííûé êàíàë [9]. Èçâåñòíî, ÷òî âõîä Ñà2+ â ìèòîõîíäðèè ïåðâîíà÷àëüíî îñóùåñòâëÿåòñÿ èìåííî ÷åðåç áåëîê íàðóæíîé ìåìáðàíû îðãàíåëëû – ïîðèí, áëîêèðóåìûé ðóòåíèåâûì êðàñíûì è La3+ [10]; òå æå àãåíòû, ÿâëÿþòñÿ èíãèáèòîðàìè è Ñà2+-óíèïîðòåðà. Òàêèì îáðàçîì, ðåçóëüòàòû ïðîâåäåííîãî ýêñïåðèìåíòà ïîçâîëÿþò ïðåäïîëîæèòü íåïîñðåäñòâåííîå ó÷àñòèå âñåé Ñà2+-òðàíñïîðòíîé ñòðóêòóðû, âêëþ÷àþùåé è Ñà2+-óíèïîðòåð, â ìåõàíèçìå èíäóêöèè ÌÐÒ ïîä äåéñòâèåì èîíîâ Ñà, à ñíèæåíèå ÷óâñòâèòåëüíîñòè ìèòîõîíäðèé ê îòêðûòèþ ïîðû ñâÿçàòü ñ èçìåíåíèåì êèíåòè÷åñêèõ õàðàêòåðèñòèê òðàíñïîðòà êàëüöèÿ ïðè ñòàðåíèè ñóñïåíçèè ìèòîõîíäðèé â óñëîâèÿõ èõ äëèòåëüíîé èíêóáàöèè. 64 ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2004, ò. 76, ¹ 5 Î. Â. ÀÊÎÏÎÂÀ, Â. Ô. ÑÀÃÀ× DECREASE OF MITOCHONDRIAL SENSITIVITY TO Ñà2+-INDUCED PORE OPENING DURING LONG-TERM INCUBATION O. V. Akopova, V. F. Sagach Bogomolets Institute of Physiology, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv; e-mail: circul@serv.biph.kiev.ua Summary It is shown that mitochondria of rat myocardium exhibit high sensitivity to Ñà2+-induced permeability transition pore (PTP) during an hour after their isolation. The threshold Ñà2+ concentrations necessary to induce PTP are as low as 25–50 nmol/mg of protein. Apparent KCa constant of Ñà2+-dependent PTP activation is 40 µM. Incubation of mitochondria during 2, 3 and 4 hours after their isolation leads to gradual increase in KCa values up to 0.4 µM, which is accompanied by simultaneous decrease in sensitivity of mitochondria to pore opening. A correlation is supposed between changes of kinetic parameters of Ñà2+-uniporter and changes in sensitivity of mitochondria to Ñà2+-induced permeability transition. ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2004, ò. 76, ¹ 5 K e y w o r d s: mitochondria, pore, Ca2+, long-term incubation. 1. Lenaz G. // Biochim. Biophys. Acta. 1998. 1366. P. 53–67. 2. Âëàäèìèðîâ Þ. À. // Áèîë. ìåìáðàíû. 2002. 19, ¹ 5. Ñ. 356–377. 3. Mather M., Rottenberg H. // Biophys. Biochem. Res. Commun. 2000. 273. P. 603–608. 4. Kroemer G., Zamzami N., Susin S. A. // Immunol. Today. 1997. 18. P. 44–51. 5. Ñàãà÷ Â. Ô., Âàâ³ëîâà Ã. Ë., Ñòðóòèíñüêà Í. À., Ðóäèê Î. Â. // Ô³ç³îë. æóðí. 2004. ¹ 2. 6. Akerman K. E. O., Wikstrom M. K. F. // FEBS Lett. 1976. 68, N 2. P. 191–197. 7. Gunter T. E., Pfeiffer D.R. // Amer. J. Physiol. 1994. 267. P. C313–C339. 8. Bragadin M., Pozzan T., Azzone G. F. // Biochemistry. 1979. 18, N 26. P. 5972–5978. 9. Crompton M. // J. Physiol. 2000. 529, N 1. P. 11–21. 10. Gincel D., Zaid H., Shoshan-Barmatz V. // Biochem. J. 2001. 358. P.147–155. Ïîëó÷åíî 09.03.2003 65