СНИЖЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИТОХОНДРИЙ К Са2+

реклама
ÓÄÊ 577.23
ÑÍÈÆÅÍÈÅ ×ÓÂÑÒÂÈÒÅËÜÍÎÑÒÈ ÌÈÒÎÕÎÍÄÐÈÉ
Ê Ñà2+-ÇÀÂÈÑÈÌÎÌÓ ÎÒÊÐÛÒÈÞ ÏÎÐÛ Â ÓÑËÎÂÈßÕ
ÈÕ ÄËÈÒÅËÜÍÎÉ ÈÍÊÓÁÀÖÈÈ
Î. Â. ÀÊÎÏÎÂÀ, Â. Ô. ÑÀÃÀ×
Èíñòèòóò ôèçèîëîãèè èì. À. À. Áîãîìîëüöà ÍÀÍ Óêðàèíû, Êèåâ;
e-mail: circul@serv.biph.kiev.ua
Ïîêàçàíî, ùî ³çîëüîâàí³ ì³òîõîíä𳿠ñåðöÿ ùóð³â âèÿâëÿþòü âèñîêó ÷óòëèâ³ñòü äî Ñà2+-çàëåæíîãî óòâîðåííÿ ì³òîõîíäð³àëüíî¿ ïîðè ïðîòÿãîì ãîäèíè ï³ñëÿ ¿õíüîãî âèä³ëåííÿ. Ïîðîãîâ³ êîíöåíòðàö³¿,
íåîáõ³äí³ äëÿ â³äêðèòòÿ ïîðè, íèçüê³ ³ ñòàíîâëÿòü 25–50 íìîëü Ñà2+/ìã á³ëêà. Óÿâíà êîíñòàíòà àêòèâàö³¿ öüîãî ïðîöåñó ³îíàìè êàëüö³þ (ÊÑà ) äîð³âíþº 40 ìêÌ. Ïîäàëüøà ³íêóáàö³ÿ ñóñïåí糿 ïðîòÿãîì 2, 3
òà 4 ãîä ïðèçâîäèòü äî ïîñòóïîâîãî ï³äâèùåííÿ ÊÑà äî 0,4 ìÌ ³, â³äïîâ³äíî, ñò³éêîñò³ ì³òîõîíäð³é äî
â³äêðèòòÿ ïîðè. Çðîáëåíî ñïðîáó ïîÿñíèòè ôåíîìåí çíèæåííÿ ÷óòëèâîñò³ ì³òîõîíäð³é äî â³äêðèòòÿ
Ñà2+-çàëåæíî¿ ïîðè ó ïðîöåñ³ ñòàð³ííÿ ñóñïåí糿 ì³òîõîíäð³é çà óìîâ òðèâàëî¿ ³íêóáàö³¿.
Ê ë þ ÷ î â ³ ñ ë î â à: ì³òîõîíäð³¿, ïîðà, Ñà2+, òðèâàë³ñòü ³íêóáàö³¿.
Ç
“ñòàðåíèè” in vitro, áëèçêè ê òåì, êîòîðûå ñâîéñòâåííû îðãàíåëëàì, âûäåëåííûì èç òêàíåé ñòàðûõ îñîáåé [1, 2]. Ñîãëàñíî äàííûì ëèòåðàòóðû,
ìèòîõîíäðèè, âûäåëåííûå èç òêàíåé ñòàðûõ æèâîòíûõ, îáíàðóæèâàþò òàêæå ïîâûøåííóþ ÷óâñòâèòåëüíîñòü ê èíäóêöèè Ñà2+-çàâèñèìîé íåñåëåêòèâíîé ïðîíèöàåìîñòè, ïîðû [3, 5]. Ïîýòîìó
äëÿ íàñ ïðåäñòàâëÿëî èíòåðåñ âûÿñíèòü, êàêèì
îáðàçîì áóäåò èçìåíÿòüñÿ âî âðåìåíè ÷óâñòâèòåëüíîñòü ìèòîõîíäðèé ìèîêàðäà êðûñ ê èíäóêöèè ÌÐÒ ïîä äåéñòâèåì Ñà2+ïðè “ñòàðåíèè” îðãàíåëë in vitro è ñîïîñòàâèòü ýòè èçìåíåíèÿ ñ ïðåäïîëàãàåìîé âàðèàáåëüíîñòüþ äðóãèõ ôóíêöèîíàëüíûõ ïîêàçàòåëåé, íàïðèìåð ìåìáðàííîãî
ïîòåíöèàëà, õàðàêòåðèçóþùåãî ðàáîòó äûõàòåëüíîé öåïè. Ñ ýòîé öåëüþ íàìè áûëà ïîñòàâëåíà
çàäà÷à èçó÷èòü èíäóêöèþ íåñåëåêòèâíîé ïðîíèöàåìîñòè, ïîðû, ïîä äåéñòâèåì Ñà2+ â ìèòîõîíäðèÿõ ìèîêàðäà êðûñ â óñëîâèÿõ èõ äëèòåëüíîé
èíêóáàöèè.
íà÷èòåëüíîå êîëè÷åñòâî ôàêòîâ, íàêîïëåííûõ ê íàñòîÿùåìó âðåìåíè, ñâèäåòåëüñòâóåò, ÷òî îäíîé èç ïðè÷èí âûñîêîãî óðîâíÿ
ïðîäóêòîâ ñâîáîäíîðàäèêàëüíûõ ðåàêöèé (â ÷àñòíîñòè àêòèâíûõ ôîðì êèñëîðîäà) è âûçâàííûõ
èìè êëåòî÷íûõ ïîâðåæäåíèé, ñîïðîâîæäàþùèõ
ñòàðåíèå îðãàíèçìà, ÿâëÿþòñÿ ðàçëè÷íîãî ðîäà
ìèòîõîíäðèàëüíûå äèñôóíêöèè [1].
Ôóíêöèîíàëüíûå èçìåíåíèÿ â ìèòîõîíäðèÿõ
îáíàðóæèâàþòñÿ íå òîëüêî â íàðóøåíèè ðàáîòû
ôåðìåíòíûõ êîìïëåêñîâ äûõàòåëüíîé öåïè è
äèñáàëàíñå â ñèñòåìå àíòèîêñèäàíòíîé çàùèòû
ýòèõ îðãàíåëë [1], íî è â íàðóøåíèè áàðüåðíûõ
ôóíêöèé ìèòîõîíäðèàëüíîé ìåìáðàíû [2], êîòîðîå ïðîÿâëÿåòñÿ â ïîâûøåíèè åå ïðîíèöàåìîñòè äëÿ ìàëûõ ìîëåêóë è ïîâûøåííîé ñïîñîáíîñòè ê îáðàçîâàíèþ ìèòîõîíäðèàëüíûõ ïîð –
êàíàëîâ, íåñåëåêòèâíî ïðîíèöàåìûõ äëÿ ìîëåêóë ñ ìîëåêóëÿðíîé ìàññîé ìåíåå 1500 Äà [2, 3].
Ñïîíòàííàÿ ïåðìåàáèëèçàöèÿ ìèòîõîíäðèàëüíîé
ìåìáðàíû (mitochondrial permeability transition –
MPT) ïîä äåéñòâèåì èíäóêòîðîâ – èîíîâ Ñà,
àêòèâíûõ ôîðì êèñëîðîäà, ïðîäóêòîâ ÏÎË, –
êàê èçâåñòíî, ïðèâîäèò ê íàáóõàíèþ ìàòðèêñà,
ðàçðûâó íàðóæíîé ìåìáðàíû è âûõîäó â öèòîçîëü ðÿäà ôàêòîðîâ, çàïóñêàþùèõ ïðîãðàììó
àïîïòîçà – êàñêàä ñïåöèôè÷åñêèõ ðåàêöèé, âûçûâàþùèõ äåãðàäàöèþ êëåòî÷íûõ ñòðóêòóð è ðàçðóøåíèå êëåòêè [2, 4].
Èçâåñòíî, ÷òî îñíîâíûå ôóíêöèîíàëüíûå
ïîêàçàòåëè (ñíèæåííûé ìåìáðàííûé ïîòåíöèàë
è äûõàòåëüíûé êîíòðîëü, íèçêèé óðîâåíü ãëóòàòèîíà, ýíäîãåííûõ ïèðèäèíîâûõ è àäåíèíîâûõ
íóêëåîòèäîâ è äð.) èçîëèðîâàííûõ ìèòîõîíäðèé
â óñëîâèÿõ äëèòåëüíîé èíêóáàöèè, ò.å. ïðè èõ
 îïûòàõ èñïîëüçîâàëè áåëûõ êðûñ ñ ìàññîé òåëà 200 – 250 ã. Âûäåëåííûå ñåðäöà ïðîìûâàëè îõëàæäåííûì 0,9%-íûì ðàñòâîðîì KCl
(4 °Ñ), èçìåëü÷àëè è ãîìîãåíèçèðîâàëè â 10-êðàòíîì îáúåìå ñðåäû, ñîäåðæàùåé (â ìÌ): 250 ñàõàðîçû, 20 òðèñ-ÍCl-áóôåðà, 1 ÝÄÒÀ (ðÍ 7,4). Äëÿ
âûäåëåíèÿ ìèòîõîíäðèé ãîìîãåíàò âíà÷àëå öåíòðèôóãèðîâàëè 7 ìèí ïðè 700 g (4 °Ñ), à çàòåì
öåíòðèôóãèðîâàëè ñóïåðíàòàíò (15 ìèí, 11 000 g,
4 °Ñ). Îñàäîê ñóñïåíäèðîâàëè â íåáîëüøîì îáúåìå ñðåäû áåç äîáàâëåíèÿ ÝÄÒÀ è õðàíèëè íà ëüäó
â òå÷åíèå äëèòåëüíîãî âðåìåíè. Èçìåðåíèÿ ïðîâîäèëè ÷åðåç 1, 2, 3 è 4 ÷ ïîñëå íà÷àëà èíêóáàöèè.
ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2004, ò. 76, ¹ 5
61
Ìàòåðèàëû è ìåòîäû
ÅÊÑÏÅÐÈÌÅÍÒÀËÜͲ ÐÎÁÎÒÈ
Îòêðûòèå ïîðû ðåãèñòðèðîâàëè ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêè êàê öèêëîñïîðèí À-÷óâñòâèòåëüíîå
ñíèæåíèå ñâåòîïîãëîùåíèÿ ïðè 540 íì (À540)
âñëåäñòâèå íàáóõàíèÿ ìèòîõîíäðèé. Îïðåäåëåíèå ìåìáðàííîãî ïîòåíöèàëà ïðîâîäèëè â ïðèñóòñòâèè ñàôðàíèíà Î (êîíå÷íàÿ êîíöåíòðàöèÿ
9 ìêÌ) ïî ðàçíîñòè ñâåòîïîãëîùåíèÿ ïðè 515 è
525 íì (∆À515-525) [3]. Äëÿ ðåãèñòðàöèè íàáóõàíèÿ
è ìåìáðàííîãî ïîòåíöèàëà èñïîëüçîâàëè ñðåäó
ñëåäóþùåãî ñîñòàâà (â ìÌ): ÊCl – 120, ÊÍ2ÐÎ4 –
1, ãëóòàìàòà – 2, ìàëàòà – 1, òðèñ-ÍCl-áóôåðà
(ðÍ 7,4) – 20, ÝÃÒÀ – 5 ìêÌ. Êîíå÷íàÿ êîíöåíòðàöèÿ áåëêà â ñóñïåíçèè ñîñòàâëÿëà 0,7–
0,8 ìã/ìë.
 ðàáîòå èñïîëüçîâàëè ñàôðàíèí Î («Aldrich»,
ÑØÀ); Na2-ÀÒÐ, òðèñ (îñíîâàíèå), ãëóòàìàò Na,
D,L-ìàëàò Na («Sigma», ÑØÀ); öèêëîñïîðèí À
(«Fluka», Øâåéöàðèÿ) è äðóãèå ðåàêòèâû êâàëèôèêàöèè î. ñ. ÷. è ÷. ä. à. Ðàñòâîðû ãîòîâèëè íà
áèäèñòèëëÿòå. Äîñòîâåðíîñòü ðåçóëüòàòîâ îöåíèâàëè ñ ïîìîùüþ t-êðèòåðèÿ Ñòüþäåíòà. Âåëè÷èíó p < 0,05 ñ÷èòàëè ñòàòèñòè÷åñêè äîñòîâåðíîé.
Ðåçóëüòàòû è îáñóæäåíèå
Îáðàçîâàíèå ìèòîõîíäðèàëüíîé ïîðû èçó÷àëè â øèðîêîì äèàïàçîíå êîíöåíòðàöèé êàëüöèÿ: 10-6–10-3 Ì. Îá îòêðûòèè åå ñóäèëè ïî öèêëîñïîðèí À-÷óâñòâèòåëüíîìó ñíèæåíèþ ñâåòîïîãëîùåíèÿ ñóñïåíçèè (âñëåäñòâèå îòêðûòèÿ ïîðû
è íàáóõàíèÿ ìèòîõîíäðèé). Îïðåäåëÿëè ñêîðîñòü
èçìåíåíèÿ ñâåòîïîãëîùåíèÿ çà åäèíèöó âðåìåíè, ∆À540/ìèí (ðèñ. 1). Îòêðûòèå ïîðû, êàê èçâåñòíî, ñîïðîâîæäàåòñÿ ñíèæåíèåì ìåìáðàííîãî
ïîòåíöèàëà ìèòîõîíäðèé (∆Ψm) äî 0 . Èçìåíåíèå âåëè÷èíû ∆Ψm, îïðåäåëÿåìîå â % îò èñõîäíîé âåëè÷èíû, ïðèíèìàåìîé çà 100%, ðåãèñòðèðîâàëè ÷åðåç 3 ìèí ïîñëå äîáàâëåíèÿ CaCl2 ê
ñóñïåíçèè (ðèñ. 2).
Ðåçóëüòàòû ýêñïåðèìåíòà ïîêàçûâàþò âûñîêóþ ÷óâñòâèòåëüíîñòü ìèòîõîíäðèé ìèîêàðäà
ê Ñà2+-çàâèñèìîé ÌÐÒ â òå÷åíèå ïåðâûõ 60 ìèí
ïîñëå âûäåëåíèÿ ìèòîõîíäðèé. Çàìåòíîå íàáóõàíèå îðãàíåëë âûçûâàþò óæå ñðàâíèòåëüíî íèçêèå äîáàâêè â èíêóáàöèîííóþ ñðåäó Ñà2+ – 10–
20 ìêÌ (ðèñ. 1, êðèâàÿ 1). Ïðè ýòîì êàæóùàÿñÿ
êîíñòàíòà èíäóêöèè ÌÐÒ èîíàìè Ñà (KCa), êîòîðóþ îïðåäåëÿëè ïî äàííûì ñâåòîïîãëîùåíèÿ
èç ëèíåàðèçîâàííîé çàâèñèìîñòè ñêîðîñòè íàáóõàíèÿ îðãàíåëë îò êîíöåíòðàöèè Ñà2+ â äâîéíûõ
îáðàòíûõ êîîðäèíàòàõ, ñîñòàâëÿåò 40,0 ± 10,0 ìêÌ
(òàáëèöà). Îäíàêî èíêóáàöèÿ ñóñïåíçèè â òå÷åíèå áîëåå äëèòåëüíîãî âðåìåíè ïðèâîäèò ê ïîñòåïåííîìó ïîâûøåíèþ ïîðîãîâûõ êîíöåíòðàöèé Ñà 2+, íåîáõîäèìûõ äëÿ èíäóêöèè ÌÐÒ
(ðèñ. 1). Ïðè ýòîì ïðîèñõîäèò ïîñëåäîâàòåëüíîå
ñòàòèñòè÷åñêè äîñòîâåðíîå âîçðàñòàíèå âåëè÷èí
KCa äî 0,280 ± 0,025 ìÌ (p < 0,05) è 0,40 ±
± 0,01 ìÌ (p < 0,05) â òå÷åíèå äâóõ è ÷åòûðåõ-
Ðèñ. 1. Âëèÿíèå äëèòåëüíîñòè èíêóáàöèè ìèòîõîíäðèé íà èçìåíåíèå ñâåòîïîãëîùåíèÿ çà 1 ìèí ïîä
äåéñâèåì Ñà2+. Çäåñü è íà ðèñ. 2 ñîñòàâ ñðåäû èíêóáàöèè (â ìÌ): KCl – 120, KÍ2ÐÎ4 – 1, ãëóòàìàò –
2, ìàëàò – 1 , òðèñ-ÍCl-áóôåð – 20 (ðÍ 7,4); ïðîäîëæèòåëüíîñòü èíêóáàöèè – 1 ÷ (êðèâàÿ 1), 2–3 ÷
(êðèâàÿ 2), 4 ÷ (êðèâàÿ 3).
62
ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2004, ò. 76, ¹ 5
Î. Â. ÀÊÎÏÎÂÀ, Â. Ô. ÑÀÃÀ×
Ðèñ. 2. Èçìåíåíèå ìåìáðàííîãî ïîòåíöèàëà (∆Ψm ) â % îò èñõîäíîé âåëè÷èíû ïîä äåéñòâèåì Ñà2+ â
çàâèñèìîñòè îò ïðîäîëæèòåëüíîñòè èíêóáàöèè. Èçìåðåíèÿ ïðîâîäèëè ÷åðåç 3 ìèí ïîñëå âíåñåíèÿ â ñðåäó
ÑàÑl2 â ïðèñóòñòâèè 9 ìêÌ ñàôðàíèíà Î. Êðèâàÿ 4 – ðåãèñòðàöèþ ∆Ψm ïðîâîäèëè â ïðèñóòñòâèè 10-5 Ì
ðóòåíèåâîãî êðàñíîãî ïîñëå 1 ÷ èíêóáàöèè ìèòîõîíäðèé.
÷àñîâîé èíêóáàöèè îðãàíåëë, ÷òî ñîîòâåòñòâóåò
ïîñòåïåííîìó ñíèæåíèþ ÷óâñòâèòåëüíîñòè ìèòîõîíäðèàëüíîé ïîðû ê èîíàì Ñà. Ñëåäóåò îòìåòèòü, ÷òî Vmax îñòàåòñÿ ïî÷òè áåç èçìåíåíèé â
òå÷åíèå âñåãî îïûòà (òàáëèöà).
Ìîæíî áûëî áû ïðåäïîëîæèòü, ÷òî íàáëþäàåìîå ñíèæåíèå ÷óâñòâèòåëüíîñòè ìèòîõîíäðèé
ê îòêðûòèþ ïîðû, è, ñîîòâåòñòâåííî, ïîâûøåíèå KCa ñ òå÷åíèåì âðåìåíè îáóñëîâëèâàåòñÿ ïîñòåïåííûì ñíèæåíèåì ∆Ψm, îáåñïå÷èâàþùåãî
ýëåêòðîôîðåòè÷åñêèé òðàíñïîðò Ñà2+ ïî óíèïîðòåðó â ìèòîõîíäðèàëüíûé ìàòðèêñ. Îäíàêî, êàê
ïîêàçàëè ïðîâåäåííûå èçìåðåíèÿ, èñõîäíàÿ âåëè÷èíà ∆Ψm â îòñóòñòâèå äîáàâëåííîãî Ñà2+ îñòàåòñÿ ïðàêòè÷åñêè ïîñòîÿííîé â õîäå âñåãî îïûòà.
Ñíèæåíèå ∆Ψm ïîä äåéñòâèåì Ñà2+, êàê è íàáóõàíèå, âûçâàííîå îòêðûòèåì ïîðû, îáóñëîâëåíî
òîëüêî âõîäîì êàòèîíîâ â ìàòðèêñ ìèòîõîíäðèé.
 ïðèñóòñòâèè ðóòåíèåâîãî êðàñíîãî, áëîêèðóþ-
ùåãî óíèïîðòåð, íå íàáëþäàþòñÿ íè äåïîëÿðèçàöèÿ ìåìáðàíû, íè íàáóõàíèå ìèòîõîíäðèé âî
âñåé èññëåäóåìîé îáëàñòè êîíöåíòðàöèé êàëüöèÿ.
Ïîëó÷åííûé ðåçóëüòàò ñâèäåòåëüñòâóåò î íåîáõîäèìîñòè òðàíñëîêàöèè êàòèîíà ê âíóòðåííåé
ìåìáðàíå îðãàíåëë äëÿ èíäóêöèè Ñà2+-çàâèñèìîé ìèòîõîíäðèàëüíîé ïîðû.
Ïîëó÷åííûå äàííûå ïîêàçûâàþò òàêæå, ÷òî
èíäóêöèÿ ÌÐÒ ïîä äåéñòâèåì Ñà2+ ïðîèñõîäèò
â äâå ñòàäèè (ðèñ. 1, êðèâàÿ 2). Ïîäîáíàÿ çàêîíîìåðíîñòü îáíàðóæèâàåòñÿ è ïðè èçó÷åíèè âëèÿíèÿ Ñà2+ íà ìåìáðàííûé ïîòåíöèàë (ðèñ. 2). Òàê,
â ìèòîõîíäðèÿõ, âûñîêî÷óâñòâèòåëüíûõ ê îòêðûòèþ ïîðû, ïðîèñõîäèò áûñòðîå ïàäåíèå ìåìáðàííîãî ïîòåíöèàëà äî 0 óæå ïîä äåéñòâèåì
î÷åíü íèçêèõ êîíöåíòðàöèé Ñà2+ (~20 ìêÌ)
(ðèñ. 2, êðèâàÿ 1). Ñíèæåíèå ÷óâñòâèòåëüíîñòè
îðãàíåëë ê èíäóêöèè ÌÐÒ ñîïðîâîæäàåòñÿ ïîñòåïåííûì ïîâûøåíèåì èõ óñòîé÷èâîñòè ê äå-
Âëèÿíèå ïðîäîëæèòåëüíîñòè èíêóáàöèè ñóñïåíçèè ìèòîõîíäðèé íà èçìåíåíèå ïàðàìåòðîâ KCa ³ Vmax
öèêëîñïîðèí À-÷óâñòâèòåëüíîãî íàáóõàíèÿ îðãàíåëë ïîä äåéñòâèåì Ñà2+ (M ± m, n = 4–6).
Длительность
инкубации, ч
1
2−3
4
KCa, мкМ
Vmax, ед. ∆А⋅мин-1
K Ca 1
K Ca 2
Vmax 1
Vmax 2
40,0 ± 10,0
не установлено
−
280,0 ± 25,0
400,0 ± 10,0
0,100 ± 0,008
0,037±0,010
−
0,090 ± 0,010
0,075 ± 0,008
−
ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2004, ò. 76, ¹ 5
−
63
ÅÊÑÏÅÐÈÌÅÍÒÀËÜͲ ÐÎÁÎÒÈ
ïîëÿðèçàöèè ìåìáðàíû ïîä äåéñòâèåì Ñà2+
(ðèñ. 2, êðèâûå 2 è 3); ïðè ýòîì, êàê è íà êðèâûõ ðèñ. 1, îáíàðóæèâàþòñÿ äâå îáëàñòè àêòèâàöèè ÌÐÒ. Ñëåäóåò îòìåòèòü, ÷òî âñå íàáëþäàåìûå èçìåíåíèÿ ∆Ψm îáóñëîâëåíû òîëüêî òðàíñëîêàöèåé Ñà2+ ÷åðåç ìèòîõîíäðèàëüíóþ ìåìáðàíó. Îäíî ëèøü ïðèñóòñòâèå â ñðåäå ýòèõ êàòèîíîâ, ïðè áëîêèðîâàíèè èõ òðàíñïîðòà, íå âûçûâàåò èçìåíåíèé ∆Ψm (ðèñ. 2, êðèâàÿ 4).
Õîòÿ âûÿñíåíèå èñòèííîé ïðè÷èíû ïîâûøåíèÿ óñòîé÷èâîñòè ìèòîõîíäðèé ê Ñà2+-çàâèñèìîé èíäóêöèè ÌÐÒ îñòàåòñÿ çàäà÷åé äàëüíåéøåãî èññëåäîâàíèÿ, ìîæíî âñå æå ïîïûòàòüñÿ
íàéòè ïðåäïîëîæèòåëüíîå îáúÿñíåíèå íàáëþäàåìîé çàêîíîìåðíîñòè.
Òàê, ðåçóëüòàòû ïðîâåäåííîãî ýêñïåðèìåíòà ñâèäåòåëüñòâóþò, ÷òî îáðàçîâàíèå ïîðû îáóñëîâëåíî òðàíñïîðòîì Ñà2+ ÷åðåç ìåìáðàíó ìèòîõîíäðèé. Ïî íàøåìó ìíåíèþ, ïîëó÷åííûå äàííûå óêàçûâàþò íå òîëüêî íà çàâèñèìîñòü èíäóêöèè ÌÐÒ îò òðàíñïîðòà êàëüöèÿ, íî è íà ïðÿìóþ âçàèìîñâÿçü ìåæäó àêòèâàöèåé îòêðûòèÿ
ïîðû èîíàìè Ñà è êèíåòè÷åñêèìè õàðàêòåðèñòèêàìè Ñà2+-óíèïîðòåðà, èçâåñòíûìè èç ëèòåðàòóðû. Òàê, Km äëÿ óíèïîðòåðà íàõîäèòñÿ â ïðåäåëàõ 10–20 ìêÌ [7]. Àêòèâàöèÿ ÌÐÒ èîíàìè Ñà
íàáëþäàåòñÿ â òîé æå îáëàñòè êîíöåíòðàöèé êàòèîíà: ~10-5 Ì (ðèñ. 1, êðèâàÿ 1).
Ñëåäóåò îòìåòèòü òàêæå è îïðåäåëåííóþ
êîððåëÿöèþ ìåæäó îáíàðóæåííîé íàìè äâóõñòàäèéíîé èíäóêöèåé îáðàçîâàíèÿ ïîðû ïîä äåéñòâèåì Ñà2+ (ðèñ. 1, 2) è ñòóïåí÷àòîé àêòèâàöèåé
óíèïîðòåðà äàííûìè èîíàìè, ïîêàçàííîé ðàíåå
G. F. Azzone et al. [8], â ïðèñóòñòâèè íèçêèõ
êîíöåíòðàöèé ñïåöèôè÷åñêîãî èíãèáèòîðà ðóòåíèåâîãî êðàñíîãî, êîòîðàÿ îáóñëîâëåíà îòðèöàòåëüíîé êîîïåðàòèâíîñòüþ äâóõ Ñà2+-ñâÿçûâàþùèõ ñàéòîâ óíèïîðòåðà [8]. Äâóõñòàäèéíîñòü ïðîöåññà èíäóêöèè ÌÐÒ èîíàìè Ñà, îáíàðóæåííàÿ
â óñëîâèÿõ äëèòåëüíîé èíêóáàöèè ìèòîõîíäðèé,
òàê æå, êàê è â ñëó÷àå Ñà2+-óíèïîðòåðà, ïîçâîëÿåò ïðåäïîëîæèòü ñóùåñòâîâàíèå äâóõ òèïîâ öåíòðîâ ñâÿçûâàíèÿ Ñà2+ – âûñîêîãî è íèçêîãî ñðîäñòâà, ó÷àñòâóþùèõ â ìåõàíèçìå òðàíñïîðòà êàòèîíà è îáðàçîâàíèÿ ïîðû, à ïîâûøåíèå óñòîé÷èâîñòè ìèòîõîíäðèé ê èíäóêöèè ÌÐÒ – ñâÿçàòü ñ ÷àñòè÷íîé èíàêòèâàöèåé ïðåäïîëàãàåìûõ
âûñîêîàôôèííûõ öåíòðîâ ñâÿçûâàíèÿ Ñà2+ ïðè
ñòàðåíèè ñóñïåíçèè ìèòîõîíäðèé in vitro.
Ïðîâîäÿ ïàðàëëåëü ìåæäó ýòèìè ïîêàçàòåëÿìè è ôèçèîëîãè÷åñêèìè óñëîâèÿìè, ìîæíî
ïðåäïîëîæèòü, ÷òî ïîäîáíîå ñíèæåíèå ñðîäñòâà
Ñà2+-ñâÿçûâàþùèõ ñàéòîâ ìèòîõîíäðèàëüíîé
ìåìáðàíû ê êàëüöèþ äîëæíî ïðèâîäèòü ê çíà÷èòåëüíîìó íàðóøåíèþ Ñà2+-ãîìåîñòàçà êàðäèîìèîöèòîâ. Òàê, èçâåñòíî, ÷òî ôèçèîëîãè÷åñêèé
óðîâåíü êàëüöèÿ â êëåòêàõ â ñîñòîÿíèè ïîêîÿ
ñîñòàâëÿåò ~10-7 Ì è äîñòèãàåò ~10-6 Ì ïðè èõ
âîçáóæäåíèè [7]. Ìèòîõîíäðèè â ôèçèîëîãè÷åñêèõ óñëîâèÿõ ñïîñîáíû áûñòðî íàêàïëèâàòü êàëüöèé, çàùèùàÿ, òàêèì îáðàçîì, êëåòêè îò Ñà2+ïåðåãðóçêè. Ñíèæåíèå ÷óâñòâèòåëüíîñòè ìèòîõîíäðèé ê ìèêðîìîëÿðíûì (ôèçèîëîãè÷åñêèì)
êîíöåíòðàöèÿì êàòèîíà, ïðè êîòîðîì óòðà÷èâàåòñÿ ôóíêöèÿ “Ñà2+-ëîâóøêè”, õîòÿ è ïðåäîõðàíÿåò îðãàíåëëû îò ïîâðåæäåíèÿ, îäíàêî ìîæåò
ïðèâîäèòü ê ïîâûøåíèþ óðîâíÿ öèòîçîëüíîãî
Ñà2+ è ðàçâèòèþ øèðîêîãî ñïåêòðà îòêëîíåíèé
îò íîðìàëüíûõ ôèçèîëîãè÷åñêèõ óñëîâèé, ñîïðîâîæäàþùèõ, â ÷àñòíîñòè, ñòàðåíèå îðãàíèçìà.
Ñëåäóåò îòìåòèòü, ÷òî, ñîãëàñíî ñ äàííûìè
ëèòåðàòóðû, â óñëîâèÿõ ôèçèîëîãè÷åñêîãî ñòàðåíèÿ, íàðÿäó ñî ñíèæåíèåì Ñà2+-åìêîñòè [3], ÷óâñòâèòåëüíîñòü ìèòîõîíäðèé ê îòêðûòèþ ïîðû
ïîâûøàåòñÿ [3, 5]. Ýòîìó ìîãóò ñïîñîáñòâîâàòü
ðàçíûå ïðè÷èíû, â ÷àñòíîñòè ïîâûøåíèå àêòèâíîñòè ôîñôîëèïàç, à òàêæå óâåëè÷åííîå ñîäåðæàíèå ïðîäóêòîâ ïåðîêñèäíîãî îêèñëåíèÿ ëèïèäîâ â òêàíÿõ ñòàðûõ æèâîòíûõ – ôàêòîðû, îòñóòñòâóþùèå ïðè “ñòàðåíèè” ìèòîõîíäðèé in
vitro.
Ðåçóëüòàòû ýêñïåðèìåíòà, ïðîâåäåííîãî in
vitro, ïî íàøåìó ìíåíèþ, óêàçûâàþò íà òî, ÷òî
÷óâñòâèòåëüíîñòü ìèòîõîíäðèé ê èíäóêöèè íåñåëåêòèâíîé ïðîíèöàåìîñòè ïîä äåéñòâèåì Ñà2+
íåïîñðåäñòâåííî îïðåäåëÿåòñÿ Ñà2+-òðàíñïîðòíîé
“àêòèâíîñòüþ” îðãàíåëë, à êèíåòè÷åñêèå ïàðàìåòðû èíäóêöèè ÌÐÒ íàõîäÿòñÿ â ïðÿìîé çàâèñèìîñòè îò êèíåòè÷åñêèõ õàðàêòåðèñòèê Ñà2+òðàíñïîðòíîãî ìåõàíèçìà, îáåñïå÷èâàþùåãî äîñòàâêó êàòèîíà ê ñâÿçûâàþùèì åãî ñàéòàì âíóòðåííåé ìåìáðàíû ìèòîõîíäðèé.
Ïîäîáíîå ïðåäïîëîæåíèå íå ïðåäñòàâëÿåòñÿ ñëèøêîì íåîæèäàííûì, åñëè ó÷åñòü, ÷òî îäíèì èç ñòðóêòóðíûõ êîìïîíåíòîâ, âõîäÿùèõ â
ñîñòàâ áåëêîâîãî êîìïëåêñà, ñîáñòâåííî ïîðû,
ÿâëÿåòñÿ ïîòåíöèàëçàâèñèìûé àíèîííûé êàíàë
[9]. Èçâåñòíî, ÷òî âõîä Ñà2+ â ìèòîõîíäðèè ïåðâîíà÷àëüíî îñóùåñòâëÿåòñÿ èìåííî ÷åðåç áåëîê
íàðóæíîé ìåìáðàíû îðãàíåëëû – ïîðèí, áëîêèðóåìûé ðóòåíèåâûì êðàñíûì è La3+ [10]; òå æå àãåíòû, ÿâëÿþòñÿ èíãèáèòîðàìè è Ñà2+-óíèïîðòåðà.
Òàêèì îáðàçîì, ðåçóëüòàòû ïðîâåäåííîãî
ýêñïåðèìåíòà ïîçâîëÿþò ïðåäïîëîæèòü íåïîñðåäñòâåííîå ó÷àñòèå âñåé Ñà2+-òðàíñïîðòíîé ñòðóêòóðû, âêëþ÷àþùåé è Ñà2+-óíèïîðòåð, â ìåõàíèçìå èíäóêöèè ÌÐÒ ïîä äåéñòâèåì èîíîâ Ñà, à
ñíèæåíèå ÷óâñòâèòåëüíîñòè ìèòîõîíäðèé ê îòêðûòèþ ïîðû ñâÿçàòü ñ èçìåíåíèåì êèíåòè÷åñêèõ õàðàêòåðèñòèê òðàíñïîðòà êàëüöèÿ ïðè ñòàðåíèè ñóñïåíçèè ìèòîõîíäðèé â óñëîâèÿõ èõ äëèòåëüíîé èíêóáàöèè.
64
ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2004, ò. 76, ¹ 5
Î. Â. ÀÊÎÏÎÂÀ, Â. Ô. ÑÀÃÀ×
DECREASE OF MITOCHONDRIAL
SENSITIVITY TO Ñà2+-INDUCED PORE
OPENING DURING LONG-TERM
INCUBATION
O. V. Akopova, V. F. Sagach
Bogomolets Institute of Physiology, National
Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv;
e-mail: circul@serv.biph.kiev.ua
Summary
It is shown that mitochondria of rat myocardium
exhibit high sensitivity to Ñà2+-induced permeability
transition pore (PTP) during an hour after their isolation. The threshold Ñà2+ concentrations necessary
to induce PTP are as low as 25–50 nmol/mg of
protein. Apparent KCa constant of Ñà2+-dependent
PTP activation is 40 µM. Incubation of mitochondria during 2, 3 and 4 hours after their isolation
leads to gradual increase in KCa values up to 0.4 µM,
which is accompanied by simultaneous decrease in
sensitivity of mitochondria to pore opening. A correlation is supposed between changes of kinetic parameters of Ñà2+-uniporter and changes in sensitivity of mitochondria to Ñà2+-induced permeability transition.
ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2004, ò. 76, ¹ 5
K e y w o r d s: mitochondria, pore, Ca2+,
long-term incubation.
1. Lenaz G. // Biochim. Biophys. Acta. 1998. 1366.
P. 53–67.
2. Âëàäèìèðîâ Þ. À. // Áèîë. ìåìáðàíû. 2002.
19, ¹ 5. Ñ. 356–377.
3. Mather M., Rottenberg H. // Biophys. Biochem.
Res. Commun. 2000. 273. P. 603–608.
4. Kroemer G., Zamzami N., Susin S. A. // Immunol.
Today. 1997. 18. P. 44–51.
5. Ñàãà÷ Â. Ô., Âàâ³ëîâà Ã. Ë., Ñòðóòèíñüêà Í. À.,
Ðóäèê Î. Â. // Ô³ç³îë. æóðí. 2004. ¹ 2.
6. Akerman K. E. O., Wikstrom M. K. F. // FEBS
Lett. 1976. 68, N 2. P. 191–197.
7. Gunter T. E., Pfeiffer D.R. // Amer. J. Physiol.
1994. 267. P. C313–C339.
8. Bragadin M., Pozzan T., Azzone G. F. //
Biochemistry. 1979. 18, N 26. P. 5972–5978.
9. Crompton M. // J. Physiol. 2000. 529, N 1.
P. 11–21.
10. Gincel D., Zaid H., Shoshan-Barmatz V. //
Biochem. J. 2001. 358. P.147–155.
Ïîëó÷åíî 09.03.2003
65
Скачать