БИОХИМИЯ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ Л.Е. Панин, Н.Е

БИОХИМИЯ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК:616.633.937:591.35:599.323:547.53
Л.Е. Панин, Н.Е. Костина, Л.В. Шестопалова
НАРУШЕНИЕ ОБМЕНА БИЛИРУБИНА И РАЗВИТИЕ
ГИПЕРБИЛИРУБИНЕМИЙ У НОВОРОЖДЕННЫХ КРЫСЯТ
ПОД ВЛИЯНИЕМ НЕСИММЕТРИЧНОГО ДИМЕТИЛГИДРАЗИНА
(ГЕПТИЛА)
ГУ НИИ биохимии СО РАМН, Новосибирск
Связь рождения желтых детей в местах контакта населения с токсическими элементами ракетного топлива именно с этим фактором до сих пор не подтверждена экспериментально.
Впервые разработана экспериментальная модель развития гипербилирубинемии у новорожденных крысят и выявлены ее причины. Показано, что гептил в малых дозах повреждает различные биологические мембраны. Это касается плазматических мембран эритроцитов периферической крови и эритроцитов в очагах печеночного кроветворения. Дефектные
эритроциты активно захватываются макрофагами печени, что приводит к освобождению
гема. Последний в гепатоцитах превращается в желтые пигменты (билирубин и его производные), которые выделяются с желчью. Однако действие гептила в малых дозах приводит к
гипотрофии гепатоцитов и образованию межклеточных щелей, которые открываются в желчные протоки. По ним желчь попадает в межклеточное пространство и через лимфатические
протоки — в кровь. Развивается гипербилирубинемия, которая приводит к рождению «желтых детей».
Ключевые слова: гептил, обмен билирубина, гипербилирубинемия
У взрослых крыс резидентные макрофаги
играют важную роль как в эритропоэзе, так и в
разрушении стареющих эритроцитов. В красном костном мозге всегда выявляется большое
количество эритропоэтических островков, в
центре которых находится макрофаг [3]. Считается, что в данных островках макрофаги обеспечивают гемопоэз необходимым количеством
железа для синтеза гемоглобина. Однако полного значения макрофагов в эритропоэзе пока
не установлено.
В разрушении стареющих эритроцитов макрофаги также занимают ключевые позиции.
Известно, что эритроциты в процессе старения
теряют сиаловую кислоту и становятся легкой
добычей для макрофагов. Последние захватывают их через Fc-рецепторы (опсонизированные IgG эритроциты) или через CR3-рецепторы
(опсонизированные IgM+ C3 эритроциты). При
участии лизосомальных гидролаз макрофагов
происходит разрушение мембран эритроцитов
и освобождение гемоглобина. Белковый компонент гемоглобина (глобин) подвергается гидролизу под влиянием лизосомальных протеиназ, а
протопорфириновые кольца гема разрушаются
под влиянием микросомальных оксидаз непаБЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, №4 (118), 2005 г.
ренхимных клеток печени и гепатоцитов, разрушающих α-метиновые связи. В конечном итоге
гем превращается в желчный пигмент — билирубин. Последний поступает в кровь, где может
находиться в свободной или связанной с белком
форме (конъюгированный билирубин).
У взрослых крыс этот процесс протекает очень
активно. По данным Kondo H. et al. [2], у крысы в сутки обменивается 0,6% эритроцитов или
7,8×108 клеток. В эритрофагоцитозе одновременно участвуют клетки Купфера (печень), а также
макрофаги селезенки, легких и костного мозга.
Лидером в этом процессе являются клетки Купфера. Предположительно каждая клетка Купфера
захватывает и перерабатывает один эритроцит
в сутки. Учитывая, что в среднем их число составляет 109, можно составить представление о
мощности процесса в целом. В среднем из одного
эритроцита выделяется 109 атомов железа. Около
половины этого железа в течение суток выводится из макрофагов в связанной с ферритином или
трансферином форме. Если этот процесс ингибируется, то развивается гемосидероз.
Точно так же обмен эритроцитов и гемоглобина происходит и у человека. Таким образом, крысу можно рассматривать как вполне адекватную
73
Панин Л.Е. Нарушение обмена билирубина и развитие гипербилирубинемий у новорожденных крысят
под влиянием несимметричного диметилгидразина (гептила) / с. 73-78
модель для изучения обмена гемоглобина и билирубина.
В эмбриогенезе у крысы и человека эритропоэз имеет свои особенности.
Материалы и методы
Обоснование экспериментальной модели
Эритропоэз в организме млекопитающих
(крыса, мышь, человек и др.) в эмбриогенезе проходит стадию эмбрионального кроветворения в
печени. Клетки Купфера, так же, как и макрофаги
костного мозга взрослых животных, участвуют в
образовании эритробластических островков. В
печени эмбрионов крыс первые макрофаги появляются к 11-12-м суткам внутриутробного
развития, а печеночный гемопоэз начинается несколькими днями позже. В печени 17-дневных
эмбрионов крыс приблизительно 75% резидентных макрофагов находится в тесном контакте с
эритроидными клетками. Последние скапливаются в пространстве Диссе и в просвете печеночных синусоидов.
В процессе эмбриогенеза печеночное кроветворение угнетается, и к моменту рождения незрелых элементов миэлоидного ряда в печени
практически не остается. Однако эритроидные
островки могут сохраняться в печени после рождения по крайней мере в течение недели [3, 4].
Возврат к печеночному кроветворению возможен у взрослых животных при некоторых патологических состояниях: при спленомегалии, гипоксии, частичной резекции печени и т.д. Во всех
этих случаях четко просматривается связь развивающихся эритробластов с клетками Купфера.
Развитие печеночного кроветворения в эмбриогенезе накладывает определенные требования
на экспериментальную модель, связанную с изучением токсического действия гептила на обмен
гемоглобина и билирубина.
Данное исследование проводили на крысах линии Вистар (самках и самцах) массой приблизительно 250 г. Сроки оплодотворения определяли
по присутствию спермы во влагалищных мазках.
Гептил вводили внутрибрюшинно в дозе 100 мкг
на 1 кг массы животного. Таким образом, крысе
массой 250 г вводили 25 мкг гептила в 1 мл физраствора, а контрольным самкам вводили внутрибрюшинно 1 мл физраствора в те же сроки от
начала беременности, т.е. введение осуществляли
соответственно на 7-е, 12-е и 17-е сутки беременности. В крови новорожденных крысят на 7-е, 14-е,
21-е и 28-е сутки определяли содержание общего,
свободного и конъюгированного билирубина.
Определение билирубина
Определение общего и конъюгированного
билирубина проводили реакцией диазотирования билирубина (по методу Ендрашека-Грофа)
74
диазосульфаниловой кислотой в присутствии
катализатора реакции кофеина-бензоата натрия
(общий билирубин) и в отсутствии катализатора
(конъюгированный билирубин) [1]. Количество
свободного (неконъюгированного) билирубина
рассчитывали как разницу общего и конъюгированного билирубина. Для определения билирубина использовали набор BIOCON® Fluitest® Bili-T/
D. Содержание общего билирубина определяли
на спектрофотометре Ultrospec 1100Pro Classic
при длине волны Hg 578 (560-600 нм), температуре — от +20 до +25 °С, конъюгированного билирубина — при длине волны Hg 546 (530-555 нм) и
той же температуре.
Для патологоанатомического исследования
эмбрионального печеночного кроветворения
брали материал на световую и электронную микроскопию. На световую микроскопию материал
фиксировали в 10% нейтральном формалине и
заливали в парафин. Для электронно-микроскопического исследования быстро извлеченные
кусочки печени фиксировали в 2,5% растворе
глутарового альдегида на фосфатном буфере
рН 7,4 в течение 3,5-4 часов при t=4 °С, дофиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия.
Обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации (50°, 70°, 96°, абсолютный спирт), смеси
ацетона и абсолютного спирта и завершали проводку в ацетоне. Заливали в аралдит-эпоновую
смесь (1:6) с добавлением катализатора DMP-30.
Полимеризовали при комнатной температуре,
затем в термостате при 60 °С. Тонкие и полутонкие срезы получали на ультрамикротоме Теslа
ВS-100Å. Для ориентации на блоке полутонкие
срезы печени окрашивали 1% раствором метиленового синего в 1% растворе буры. Ультратонкие
срезы, толщиной 50-80 нм контрастировали в
насыщенном растворе уранилацетата и цитрате
свинца в парах NaOH [1]. Исследования ультраструктуры и фотографирование объекта проводили на электронном микроскопе JЕМ-100 СХ
при ускоряющем напряжении 60-80 kV при разных увеличениях.
Эксперименты на животных проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с
использованием экспериментальных животных»
(Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. №755).
Результаты исследований
Использование малых доз гептила позволило получить ожидаемый результат в отношении
развития гипербилирубинемии (Таблица). Из-за
малого количества сыворотки новорожденных
крысят результаты на 1-е сутки пока не получены.
Здесь необходимо использовать ферментативные
методы определения билирубина.
БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, №4 (118), 2005 г.
Панин Л.Е. Нарушение обмена билирубина и развитие гипербилирубинемий у новорожденных крысят
под влиянием несимметричного диметилгидразина (гептила) / с. 73-78
На 7-е сутки внутриутробного развития содержание общего билирубина в сыворотке крови крысят от матерей, получавших гептил, более
чем в 4 раза превышало аналогичную величину в
контрольной группе крысят. Развитие гипербилирубинемии определялось увеличением в крови
содержания как свободного, так и конъюгированного билирубина.
На 14-е сутки внутриутробного развития содержание общего билирубина в сыворотке крови
крысят несколько снижалось как в контроле, так
и в опыте, однако в опытных группах продолжала
сохраняться выраженная гипербилирубинемия.
Как и на 7-е сутки, она определялась более высоким содержанием в крови свободного и конъюгированного билирубина.
На 21-е сутки содержание в крови общего, конъюгированного и свободного билирубина продолжало снижаться, но все три показателя оставались выше, чем в контроле.
Таблица
Влияние гептила на концентрацию билирубина в сыворотке крови
а) На 7-й день жизни крысят
Группа
Контроль
Гептил (1-я группа)
Гептил (2-я группа)
Концентрация билирубина, мкмоль/л
Конъюгированный
Общий билирубин
билирубин
M±m
M±m
8,09±2,51
4,72±2,46
37,39±5,53*
19,44±3,93*
28,37±9,40*
17,22±4,11*
Количество
крысят (n)
10
4
7
Свободный
билирубин
M±m
3,65±2,23
17,95±1,61*
11,15±5,30*
б) На 14-й день жизни крысят
Группа
Контроль
Гептил (1-я группа)
Гептил (2-я группа)
Концентрация билирубина, мкмоль/л
Конъюгированный
Общий билирубин
билирубин
M±m
M±m
5,52±3,65
4,58±3,25
28,45±11,37*
21,06±7,44*
18,44±8,68*
10,56±4,89
Количество
крысят (n)
4
4
4
Свободный
билирубин
M±m
0,94±0,47
10,13±4,92*
7,88±5,10*
в) На 21-й день жизни крысят
Группа
Контроль
Гептил (1-я группа)
Гептил (2-я группа)
Концентрация билирубина, мкмоль/л
Конъюгированный
Общий билирубин
билирубин
M±m
M±m
6,02±1,31
2,62±1,49
18,25±1,76*
9,17±2,73*
17,18±0,82*
10,95±3,65*
Количество
крысят (n)
4
4
4
Свободный
билирубин
M±m
3,40±1,14
9,09±0,99
4,84±1,22
г) На 28-й день жизни крысят
Группа
Контроль
Гептил (1-я группа)
Гептил (2-я группа)
Количество
крысят (n)
6
4
5
Концентрация билирубина, мкмоль/л
Конъюгированный
Общий билирубин
билирубин
M±m
M±m
7,29±2,35
5,54±1,96
15,29±3,11*
2,93±1,43
9,88±2,24
2,93±0,89
Свободный
билирубин
M±m
1,75±0,99
12,36±0,60*
6,95±4,60
д) Самки крыс
Группа
Контроль
Гептил (1-я группа)
Гептил (2-я группа)
Количество
крысят (n)
5
4
5
Концентрация билирубина, мкмоль/л
Конъюгированный
Общий билирубин
билирубин
M±m
M±m
2,68±1,45
1,45±0,81
1,89±0,67
1,36±0,52
2,15±0,68
1,64±0,76
Свободный
билирубин
M±m
1,23±0,41
0,53±0,25
0,51±0,3 1
Примечание: * - р < 0,05 по отношению к контролю.
БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, №4 (118), 2005 г.
75
Панин Л.Е. Нарушение обмена билирубина и развитие гипербилирубинемий у новорожденных крысят
под влиянием несимметричного диметилгидразина (гептила) / с. 73-78
На 28-е сутки все еще сохранялись достоверные отличия от контроля в содержании общего и
и свободного билирубина.
Таким образом, можно сделать заключение,
что гипербилирубинемия у крысят опытной группы сохранялась на протяжении месяца. У самок,
получавших гептил, достоверных изменений в
содержании общего, конъюгированного и свободного билирубина обнаружено не было. Это
свидетельствует о том, что на механизм образования свободного билирубина в организме матери
(взрослого животного) гептил в малых дозах влияния не оказывал. Токсическое действие гептила
обнаружено только в организме развивающихся
плодов и, несомненно, связано с механизмом эмбрионального печеночного кроветворения.
Морфологические исследования печени помогли раскрыть причины развития функциональной недостаточности гепатоцитов и развития
гипербилирубинемии. Оказалось, что на первые
сутки после рождения количество островков печеночного кроветворения в опытной группе было
ниже, чем в контрольной. Одновременно была
ниже и плотность островков, что позволяет говорить о функциональной недостаточности эмбрионального кроветворения и, возможно, о тканевой гипоксии у плода. Инволюция островков
печеночного кроветворения в контроле в постэмбриональный период шла довольно быстро. На
14-е сутки в печени они практически не обнаруживались. Однако и в опытной группе они тоже
отсутствовали. Это говорит о том, что активность
макрофагов печени как в контрольной, так и в
опытной группах новорожденных крысят была
достаточно высокой. Причем речь идет о макрофагах костномозгового происхождения, которые
участвуют в разрушении эритроцитов в очагах
эмбрионального кроветворения. Эту работу выполняют интерстициальные макрофаги и макрофаги печеночных синусоидов.
В печени крысят, рожденных от самок, получавших гептил, развивалась совсем другая картина. В центральных венах и других сосудах наблюдался выраженный гемостаз. Эритроциты в
участках гемостаза были сильно деформированы,
часто имели форму цилиндра с неровными контурами. Они плотно прилегали друг к другу и полностью закрывали просвет сосуда.
Синусы были заполнены эритроцитами, гетерогенными по форме, и фрагментами клеток
крови. Все это свидетельствует о том, что гептил
является мощным мембранотропным ядом. Он
нарушает нормальную структуру клеточных мембран даже в низких концентрациях, что приводит
к фрагментации и полному разрушению клеток.
Поврежденные и фрагментированные клетки за76
хватываются резидентными макрофагами (клетками Купфера), где и подвергаются полному разрушению под влиянием лизосомальных гидролаз.
Разрушение эритроцитов в сосудистом русле
приводит к развитию гемолиза. Гемолиз — частое
явление у крысят опытной группы. Поврежденные эритроциты и свободный гемоглобин крови
являются причинами повышенного образования
билирубина в печени.
На полутонких срезах выявлено нарушение
балочного строения. Среди гепатоцитов выделяются два типа клеток: светлые и темные. На
ультратонких срезах в светлых клетках видны
признаки снижения функциональной активности. Это крупные митохондрии с обводненным матриксом, многочисленный агранулярный
эндоплазматический ретикулум (ЭПР), очень
фрагментированный шероховатый эндоплазма-
Рис. 1. Жировая дистрофия в печени крысы.
Воздействие гептилом, 7 суток после рождения
Увеличение 11200
Рис. 2. Фрагмент печени крысы. Воздействие гептилом,
14 сутки после рождения. Видны неплотные контакты (↑)
между гепатоцитами в области желчных капилляров
Увеличение 23000
БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, №4 (118), 2005 г.
Панин Л.Е. Нарушение обмена билирубина и развитие гипербилирубинемий у новорожденных крысят
под влиянием несимметричного диметилгидразина (гептила) / с. 73-78
тический ретикулум (ШЭПР), большое количество миелиновых структур. В клетках отсутствует
гликоген. Крупные жировые капли свидетельствуют о развитии жировой дистрофии (Pис. 1).
Ведущая триада обнаруженных изменений — гемостаз, гемолиз, некроз. Фрагментация ШЭПР
и утрата рибосом на его поверхности позволяют
понять главные причины нарушения синтеза белка в гепатоцитах. Можно также утверждать, что
под влиянием гептила происходит повреждение
не только плазматических мембран, но и любых
биологических мембран: митохондриальных,
ЭПР, вероятно, и лизосомальных тоже. Видимо,
поэтому лизосомы встречаются довольно редко.
Это тоже может быть причиной дистрофических
изменений в печени.
Структура темных клеток напоминает таковую
гепатоцитов контрольных животных: длинные
узкие профили ШЭПР, плотные митохондрии,
многочисленные глыбки гликогена. В клетках
встречаются гипертрофированные лизосомы, что
является реакцией на действие химического агента. Макрофаги характеризуются многочисленными признаками активации: остатки эритроцитов в
клетках, наличие гетерофаголизосом, изрезанные
контуры с множеством микроворсин.
На 7-е сутки после рождения у контрольных
крысят структура печени несколько отличалась
от таковой на 1-е сутки. Состояние гепатоцитов
свидетельствует об их высокой функциональной активности: длинные узкие профили ШЭПР,
митохондрии с плотным матриксом, достаточно
много лизосом, большое количество глыбок гликогена. Однако в синусах и центральных венах
встречаются фрагменты клеток и нити фибрина.
На полутонких срезах выявляется балочное строение печеночных долек, однако границы клеток
по-прежнему не отчетливы. В сосудах присутствует большое количество клеточных фрагментов и нитей фибрина, однако гемостаза уже нет.
В гепатоцитах обнаружено большое количество
жировых капель. Во множестве клеток обнаруживаются признаки балонной дистрофии или жировой дистрофии. Встречаются клетки со сливными
некрозами. Одновременно с этим в темных клетках, в отличие от суточных животных, наблюдается лучшая сохранность внутриклеточных органелл и большое количество глыбок гликогена. На
уровне световой микроскопии отмечено зональное ожирение, наличие большого количества поврежденных клеток в портальной области. Вблизи
центральных сосудов клетки сохранены лучше.
На 14-е сутки после рождения в контрольной
группе животных ткань печени имеет классическое балочное строение, паренхима в хорошем состоянии. Гепатоциты преимущественно темные, с
БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, №4 (118), 2005 г.
большим количеством плотных митохондрий, с
большим количеством глыбок гликогена, встречаются отдельные жировые включения.
На 14-е сутки после рождения в опытной группе крысят все еще обнаруживаются выраженные
дистрофические изменения в печени. С помощью
световой микроскопии выявлялось хорошо выраженное балочное строение печеночных долек, однако балки были тоньше по сравнению как с контролем, так и с 7-суточными животными. Темных
клеток значительно больше, чем светлых. Клетки
плотные, неправильной формы, между балочными гепатоцитами межклеточные пространства
расширены. В средней зоне дольки часто встречаются «пустые» клетки, имеющие признаки колликвационного некроза. В сосудах нет гемостаза,
эндотелий в хорошем состоянии. Синусы расширены, в них по-прежнему много фибрина и клеточных фрагментов. Пространства Диссе расширены (Pис. 2).
В области желчных капилляров межклеточные
контакты расширены и образуют межклеточные
щели, по которым желчь проникает в паренхиму
печени (Pис. 2) и далее по лимфатическим сосудам в кровь. Именно это служит причиной того,
что печень крысят опытной группы интенсивно
прокрашена в желтый цвет. Во многих клетках
видны обширные зоны цитоплазмы со светлым
зернистым содержимым, которые можно квалифицировать как проявление белковой дистрофии.
Гликоген в этих клетках отсутствует.
Отсутствие гемостаза обусловлено высокой
активностью синусоидных макрофагов, которые
разрушают поврежденные эритроциты, образующие в сосудах «пробки». Это восстанавливает
нарушенный сосудистый кровоток, но одновременно способствует активному образованию билирубина и еще больше — инфильтрации паренхимы печени желчью.
Описанные выше изменения являются основной причиной развития гипербилирубинемии
при действии на организм малых доз гептила. Полученные результаты хорошо согласуются с данными биохимических исследований.
Заключение
Впервые получена патофизиологическая
модель развития гипербилирубинемии у новорожденных крысят и раскрыты ее механизмы.
Показано, что гептил в малых дозах действует
как мембранотропный яд, повреждающий эритроцитарные мембраны. Последние теряют свои
эластические свойства, что приводит к стазу в
центральных венах и печеночных синусоидах.
Поврежденные эритроциты фагоцитируются синусоидными макрофагами. Эритроциты в очагах
печеночного кроветворения фагоцитируются
77
Панин Л.Е. Нарушение обмена билирубина и развитие гипербилирубинемий у новорожденных крысят
под влиянием несимметричного диметилгидразина (гептила) / с. 73-78
интерстициальными макрофагами. Это создает
предпосылки для повышенного образования билирубина в гепатоцитах.
Известно, что вновь синтезированный билирубин попадает в желчные протоки и вместе с
желчью — в желудочно-кишечный тракт. Однако
под влиянием гептила развивается гипотрофия
гепатоцитов, между ними формируются межклеточные щели. Такие щели выявлены нами в районе желчных капилляров. Это приводит к тому, что
желчь проникает в паренхиму органа и далее по
лимфатическим сосудам — в кровь. Развивается
гипербилирубинемия, грозным осложнением которой является билирубиновая энцефалопатия и
ядерная желтуха.
Работа выполнялась по проекту МНТЦ
№ 1924 (головная организация — Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»).
INFRINGEMENT OF BILIRUBIN
METABOLISM AND DEVELOPMENT
OF HYPERBILIRUBINEMIA IN NEWBORN
RATS UNDER INFLUENCE OF IRREGULAR
DIMETHYLHYDRAZINE (HEPTYL)
L.E. Panin, N.E. Kostina, L.V. Shestopalova
Birth of yellow children in places of contact of
the population with toxic elements of rocket fuel
has not received the experimental confirmation till
78
now. The experimental model of hyperbilirubinemia
at newborn rats is worked up for the first time and
its reasons are revealed. It is shown that heptyl in
small dozes damages various biological membranes.
It concerns plasmatic membranes of peripheral blood
erythrocytes and those in the centers of hepatic
haemopoiesis. Defective erythrocytes are actively
grasped liver macrophages that results in clearing of
haem. The last turns in hepatocytes to yellow pigments (bilirubin and its derivatives) which are allocated with bile. However the action of heptyl in
small dozes results to hepatocyte hypotrophy and
to formation of intercellular cracks which open in
bilious channels. On them bile gets in intercellular
space and through lymphatic channels in blood. Hyperbilirubinemia develops that results in a birth of
«yellow children».
Литература:
1. Уикли Б. Электронная микроскопия / Б. Уикли
— М., 1975. — 324 с.
2. Kondo H. Iron metabolism in the erythrophagocytosing Kupffer cell / H. Kondo, K. Saito, J.P. Grasso, P. Aisen
// Hepatology. — 1988. — Vol. 8. — № 1. — P. 32-38.
3. Naito M. Development, differentiation and maturation of macrophages in fetal mouse liver / M. Naito, K.
Takahashi, S. Nishikawa // J. Leukoc. Biol. — 1990. — Vol.
48. — № 1. — P. 27-37.
4. Naito M. Development, differentiation and maturation of Kupffer cells / M. Naito, G. Hasegawa , K. Takahashi // Microsc. Res. Tech. — 1997. — Vol. 39. — №4.
— P. 350-364.
БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, №4 (118), 2005 г.