dissertaciya - Институт водных и экологических проблем ДВО РАН
реклама
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ВОДНЫХ И ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ПРОБЛЕМ ДАЛЬНЕВОСТОЧНОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК На правах рукописи Литвиненко Зоя Николаевна ВЛИЯНИЕ ОРГАНИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ НА ФОРМИРОВАНИЕ БИОПЛЕНОК В ВОДНЫХ СИСТЕМАХ Специальность 03.02.08 – Экология (биологические науки) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Л.М. Кондратьева Хабаровск-2015 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………….... 4 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………….. 9 1.1 Терминология………………………………………………………….. 10 1.2 Структура и формирование биопленок………………………………. 12 1.2.1 Структура биопленок………………………….………………….. 12 1.2.2 Стадии формирования биопленок………………..……………… 14 1.2.3 Социальное поведение микроорганизмов в биопленке………… 16 1.3 Факторы, влияющие на образование биопленок…………….…….. 18 1.3.1 Биотические факторы…………………………………………….. 18 1.3.2 Абиотические факторы…………………………………………… 20 1.4 Физиолого-биохимическая и экологическая активность биопленок………………………………………………………..…… 29 1.5 Участие биопленок в формировании биоминералов………………... 35 1.6 Практические проблемы биологического обрастания……………… 36 Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ……………………... 40 2.1 Объекты и место исследования…………………………………..…… 40 2.2 Материалы исследования……………………………………………... 42 2.3 Микробиологические исследования…………………………………. 43 Глава 3. ОБРАЗОВАНИЕ БИОПЛЕНОК ПРИ ТРАНСФОРМАЦИИ ГИДРОФОБНЫХ УГЛЕВОДОРОДОВ МИКРОБНЫМИ КОМПЛЕКСАМИ ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОД……………………………... 49 3.1 Загрязнение реки Амур полициклическими ароматическими углеводородами………………………………………………………. 3.2 Активность микробиологической трансформации нафталина и 50 3 фенантрена на трансграничном участке р. Амур …….……………... 53 3.2.1 Развитие микробных комплексов на нафталине………………... 53 3.2.2 Развитие микробных комплексов на фенантрене…………......... 63 3.3 Продукты трансформации нафталина и фенантрена……………...… 67 Глава 4. ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕДПОСЫЛКИ ОБРАЗОВАНИЯ БИОПЛЕНОК В ЖЕЛЕЗОСОДЕРЖАЩИХ ПОДЗЕМНЫХ ВОДАХ……. 71 4.1 Роль микроорганизмов в миграции ионов железа….……………….. 72 4.2 Физиолого-биохимические характеристики штаммов, выделенных из биопленок……..…………………………………….... 73 4.3 Образование биопленок в присутствии органических веществ и Fe(OH)3…………………..………………………………....................... 78 4.4 Анализ электронных изображений и элементного состава биопленок……………………………………………………………..... 83 Глава 5. ВЛИЯНИЕ ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ НА ОБРАЗОВАНИЕ БИОПЛЕНОК В ПОДЗЕМНЫХ ВОДАХ……….……………………..…… 90 5.1 Загрязнение подземных вод органическими веществами…….…….. 90 5.2 Сезонная динамика численности физиологических групп в подземных водах………...................................................................... 93 5.3 Особенности роста микробоценозов из подземных вод на пептоне и гуминовых веществах ….………….……………………................... 96 5.4 Формирование биопленок микробоценозами подземных вод in vitro …………………..……………………………………………… 102 ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………….……… 114 ВЫВОДЫ……………………………………………………………………... 116 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………………. 118 4 ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования. Живое вещество определяет миграцию и дифференциацию химических элементов в биосфере. Главную роль в экологических процессах играют микроорганизмы, участвуя в передаче энергии и вещества в пищевых сетях и в биогеохимических циклах многих элементов (Вернадский, 2001). Нет ни одной природной или искусственной системы, лишенной микробной составляющей (Бутюгин, 2007; Кампер, 2012; Kim et al., 2013). Микроорганизмы быстро осваивают новые местообитания, адаптируются к чужеродным соединениям, нивелируют негативные антропогенные воздействия (Prakash, 2003; Steinberg, 2012). Большинство микроорганизмов существуют в виде структурированных сообществ – «биопленок» («biofilms») (Николаев, Плакунов, 2007; Costerton et al., 2007). Они образуются на биогеохимических барьерах и при достаточном количестве питательных веществ быстро разрастаются до макроскопических размеров (Flemming et al., 2000; Заварзин, Колотилова, 2001; Парфенова и др., 2008). Формирование биопленок (БП) начинается с бактериальной адгезии и синтеза полимерного матрикса, выполняющего защитную функцию (Sutherland, 2001; Куюкина и др., 2011; Flemming, 2011; Стрелкова и др., 2013). БП могут быть индикаторами загрязнения поверхностных и подземных вод легкодоступными и стойкими органическими веществами (ОВ) различного происхождения, отражая самоочищающий потенциал и вторичное загрязнение водных экосистем (Davey, O’Toole, 2000; Кондратьева, 2005), а также могут являться причиной возникновения комплекса проблем при эксплуатации ирригационных систем (Zhou et al., 2014); зарастания порового пространства железосодержащих и подземных кольматации вод, которые скважин связаны на с водозаборах недостаточной изученностью биогеохимических процессов и цикла железа, неразрывно связанного с преобразованием ОВ (Менча, 2006; Бондарева, 2009; Кармалов, Филимонова, 2011; Bhattacharyya et al., 2013). В связи с этим, исследования локальных экологических условий, абиотических и биотических факторов, 5 влияющих на формирование биопленок на биогеохимических барьерах, чрезвычайно актуальны для оценки самоочищения водных экосистем и прогнозирования биологического зарастания порового пространства водоносных горизонтов. Цель исследования: оценить влияние органических веществ различного строения на образование биопленок in vitro микробными комплексами поверхностных и подземных вод. Задачи: 1. Определить влияние температурного фактора на характер формирования биопленок и трансформацию гидрофобных полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) микробными комплексами из различных местообитаний. 2. Выявить факторы, инициирующие способность микроорганизмов железосодержащих подземных вод к адгезии и формированию биопленок. 3. Оценить влияние легкодоступных азотсодержащих ОВ и стойких гуминовых веществ на образование биопленок микробными комплексами подземных вод. 4. Провести сравнительный анализ элементного состава биопленок микробных сообществ железосодержащих подземных вод на разных этапах их формирования. Защищаемые положения: 1. Адаптация микробных комплексов к загрязнению среды обитания высокомолекулярными углеводородами, температурный фактор и адгезивная активность микроорганизмов влияют на процессы трансформации полициклических ароматических углеводородов. 2. Легкодоступные органические вещества и гидроксиды железа Fe(OH)3 могут выступать инициаторами формирования биопленок на биогеохимических барьерах водоносного горизонта. 6 3. Поступление в гумифицированные железосодержащие подземные воды легкодоступных азотсодержащих органических веществ провоцирует образование биопленок в поровом пространстве и скважинах. Научная новизна. Впервые показано, что в трансформации стойких углеводородов принимают участие бактериальные биопленки, которые при изменении температурного режима могут образовывать различные токсичные продукты, представляющие риск для гидробионтов. Экспериментально обоснованы предпосылки образования биопленок в поровом пространстве водоносного горизонта железосодержащих подземных вод и доказана их определяющая роль в трансформации органических веществ различного строения и происхождения. Практическая значимость. Обнаруженные при трансформации ПАУ метилированные производные бензола могут выступать в качестве химических индикаторов загрязнения водных экосистем в зимнее время высокомолекулярными углеводородами различного происхождения. Полученные результаты исследований показали, что для контроля образования биопленок и поиска эффективных методов борьбы с биообрастанием необходимы глубокие исследования факторов, стимулирующих первые этапы бактериальной адгезии и прежде всего предотвращение поступления органических веществ. Материалы, подтверждающие формирование биопленок при поступлении в железосодержащие подземные воды легкодоступных ОВ и гуминовых веществ, могут быть использованы для прогнозирования кольматации порового пространства у скважин при внедрении технологии обезжелезивания в пласте в различных регионах. Результаты исследования переданы в МУП «Водоканал» г. Хабаровска. Апробация работы. Основные результаты исследований представлены и обсуждены на Всероссийских и международных научных конференциях: «Научно-технические проблемы транспорта, промышленности и образования», 21-23 апреля, 2010 г. (Хабаровск); «Фундаментальные проблемы воды и водных 7 ресурсов», 24-28 августа, 2010 г., (Барнаул); «Научно-техническое и экономическое сотрудничество стран АТР в XXI веке», 20-22 апреля 2011 г., (Хабаровск); Третий Байкальский Микробиологический Симпозиум с международным участием: «Микроорганизмы и вирусы в водных экосистемах», 3-8 октября, 2011 г., (Иркутск); «Антропогенное влияние на водные организмы и экосистемы», 27 сентября – 2 октября, 2011 г., (Борок); 3rd Biohydrology conference «Water for life», 2013 (Landau, Germany); «Водные и экологические проблемы, преобразование экосистем в условиях глобального изменения климата», 29 сент.-3 окт. 2014 г., (Хабаровск), а также на региональных конференциях студентов, аспирантов, молодых ученых в 2013, 2014 гг. Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 2 статьи в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК Министерства образования и науки РФ. Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), трех глав собственных исследований (главы 3, 4, 5), заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 239 наименования, из которых 111 на русском, 128 на английском языках. Объем работы составляет 143 страницы машинописного текста, в том числе 15 таблиц и 35 рисунков. Личный вклад. Диссертант лично участвовал в проведении экспериментов, обработке и обобщении результатов, подготовке иллюстрационного материала, формулировке выводов в диссертации, материалах научных конференций и публикациях. Благодарности. Автор выражает искреннюю признательность за постоянную помощь, внимание и поддержку при выполнении работы научному руководителю – профессору, д.б.н, Л. М. Кондратьевой. Автор благодарит д.г.м.н. В.В. Кулакова за ценные рекомендации и интерес к работе; В.Л. Рапопорт за помощь в идентификации продуктов трансформации ПАУ и В.С. Комарову за получение электронных изображений биопленок, а также сотрудников 8 лаборатории гидрологии и гидрогеологии ИВЭП ДВО РАН за отбор проб воды (поверхностных, подземных) и донных отложений. 9 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Микроорганизмы составляют основную часть живой биомассы на Земле и населяют большинство природных сред обитания. Они играют уникальную решающую роль в биогеохимических циклах планеты (Вернадский, 2001; Пиневич, 2006 Бутюгин, 2007, Steinberg, 2012). В природных условиях большинство микроорганизмов существует в виде структурированных ассоциаций, обозначаемых общим термином «биопленки» (БП) (Costerton, 2007). Они формируются на границе средовых фаз и способны развиваться на твердых субстратах, погруженных в воду или создавать плавающие маты на жидких поверхностях. БП могут быть образованы бактериями одного или нескольких видов и состоять как из активно функционирующих клеток, так и из покоящихся или некультивируемых форм (Звягинцев, 1973; Заварзин, Колотилова, 2001). Известно, что БП, сформированные одним видом in vitro, при сравнении с ассоциациями, образованными в естественных экосистемах, демонстрируют общие для всех структурные особенности (O’Toole et al., 2000). Микробные пленки нельзя рассматривать только как простую совокупность составляющих их клеток. Скорее, они представляют собой качественно новый тип сообществ, которые многие исследователи справедливо называют «городами микробов» (Watnick, Kolter, 2000; Николаев, Плакунов, 2007). Биопленки играют важную экологическую роль в окружающей среде (Davey, O’Toole, 2000). Они принимают участие в поставке энергии и органического вещества в пищевые сети экосистем, вовлекаются в биогеохимические пути круговорота углерода, азота, водорода, серы, фосфора и большей части металлов. Также БП могут служить пищевым ресурсом для организмов высших трофических уровней. Было обнаружено, что многие беспозвоночные получают питательные вещества из БП в дополнение к растительным остаткам (Lear, Lewis, 2012). 10 На формирование и функционирование сообществ микроорганизмов в биопленке оказывают влияние различные факторы окружающей среды. Микробные пленки реагируют на любые нарушения естественной среды обитания уменьшением или увеличением численности различных физиологических групп, изменением структуры сообщества. Быстро приспосабливаясь к меняющимся условиям, БП активно участвуют в процессах самоочищения, что способствует поддержанию стабильности природных экосистем (Costerton, 1978; Flemming, 2002). 1.1 Понятие «биопленка» Терминология изменялось с развитием инструментальных технологий, которые позволили провести более точные наблюдения при помощи микроскопии высокого разрешения и методов молекулярной биологии. Начиная с 2000 годов понятие «биопленка» («biofilms») использовалось в модельных системах научных исследований. В настоящее время приоритетным направлением исследований становится оценка влияния биопленок на различные процессы в природе, медицине и промышленности. В таблице 1 приведен краткий обзор понятия «биопленка», предложенный различными авторами. Таблица 1 Изменение понятия «биопленка» за период с 1984 по 2013 годы. Год 1984 Определение понятия «биопленка» Скопление микроорганизмов, погруженных в матрикс внеклеточных полимеров, прикрепленных к субстрату. 1989 Клетки, иммобилизованные на субстрате и часто встроенные в органическую полимерную матрицу микробного происхождения, неравномерно аккумулированную на поверхности. 1999 Бактерии с высокоорганизованным режимом роста, развивающиеся в замкнутой системе, обеспечивающей развитие специальных, кооперирующих функций для защиты от антибактериальных агентов. Автор Marshal K.C., et al. Marshall K.C., Bitton G. Ben-Ari E.T. 11 Продолжение таблицы 1. 2000 Мультивидовое микробное сообщество, которое оставляет или покидает место прикрепления с целью передачи их генетического материала и заполнения различных ниш. По структуре организации оно напоминает города, в которых живут люди. 2002 Сообщества бактериальных клеток, прикрепленных к субстрату, какой-либо поверхности или друг к другу, внедренных в матрицу из внеклеточных полимерных веществ, которые они произвели, и демонстрирующие измененный фенотип в отношении скорости роста и транскрипции генов. 2007 Пространственно и метаболически структурированное сообщество, заключенное во внеклеточный полимерный матрикс и расположенное на границе раздела фаз. 2013 Прикрепленные к поверхности микробные сообщества, окруженные внеклеточными полимерными веществами, оказывающие огромное влияние на процессы, происходящие в природе, промышленности и медицине. Watnick P., Kolter R. Donlan R., Costerton J.W. Николаев Ю.А., Плакунов В.К. Patel I., et al. Первые работы отечественных ученых по изучению адгезии почвенных микроорганизмов на стеклах обрастания были проведены биологом Н.Г. Холодным и затем подробно документированы Д.Г. Звягинцевым (Заварзин, Колотилова, 2001). Изучение таких понятий и процессов как «межклеточные контакты бактериальных колоний», «процессы колонизации, обрастания микроорганизмами» были отражены в работах Иерусалимского Н.Д. (1963) и Раилкина А.И. (1998). В настоящее время изучением вопросов адгезивной активности микроорганизмов и формирования биопленок в различных направлениях занимаются такие ученые, как Николаев Ю.А. (2007, 2011), Плакунов В.К. (2008, 2010), Могильная О.А. (2005, 2007), Парфенова В.В. (2002, 2008), Дрюккер В.В. (2002), Мальник В.В. (2007), Рубцова Е.В. (2007, 2009, 2010), Куюкина М.С. 12 (2011), Романова Ю.М. (2006, 2011), Гинцбург А.Л. (2003) и др. Существенный вклад в исследование биопленок внесли зарубежные ученые: Costerton J.W. (1978, 1995, 2003, 2007), Flemming H.-C. (2000, 2002, 2007, 2008, 2010, 2011), Stoodely P. (1998, 2002), Donlan R. (2002), Lappin-Scott H.M. (2001), Lewandowsky Z. (2003) и др. 1.2 Структура и формирование биопленок Формирование биопленок микроорганизмами происходит под влиянием различных факторов. Развитие БП – сложный, регулируемый и генетически запрограммированный процесс. В составе биопленок бактерии объединены сложными межклеточными связями, поэтому такое сообщество микроорганизмов можно рассматривать как функциональный аналог многоклеточного организма (Costerton, 2007). 1.2.1 Структура биопленок Сложная метаболической архитектоника кооперации биопленок клеток и обеспечивает возможность создает условия, способствующие симбиотическим взаимоотношениям между бактериями разных видов, при которых образование или потребление какого-либо субстрата в биопленке происходит с большей интенсивностью, чем в случае свободных (планктонных) популяций (Flemming, Wingender, 2010). Зрелая, полноценная биопленка высоко гидратирована и состоит из колоний микроорганизмов (15% объема), окруженных экзополимерным матриксом (85% объема) (Kokare et al., 2009; Смирнова и др., 2010). Биополимерные соединения действуют как молекулярный фильтр, сорбируя и концентрируя питательные вещества из внешней среды, а также ограничивая проникновение антимикробных средств к микроорганизмам. Физиологическое значение экзополимерного матрикса (ЭПМ) бактерий состоит в создании и поддержании благоприятных условий для их существования (Watnick et al., 2000; Sutherland, 2001; Николаев, 13 2011). Биополимерный матрикс, окружающий биопленку, неоднороден в разных слоях, и у различных видов бактерий не одинаков по физическим свойствам и химическому составу (Ras et al., 2011). Он меняется в результате адаптации бактерий к условиям внешней среды и состоит из смеси природных полимеров – экзополисахаридов, экзолипополисахаридов, гликопротеинов, протеогликанов, аналогичных веществу клеточной стенки, гликокаликса белков, полипептидов, нуклеиновых кислот и др. В состав экзополисахаридов входят уроновые кислоты (главным образом, глюкуроновая) и аминосахара (Flemming et al., 2007; Занина и др., 2009). ЭПМ прикрепляется и удерживается на поверхности благодаря межмолекулярным ковалентным и внутримолекулярным водородным связям, а также действию сил Ван-дер-Ваальса (рисунок 1) (Flemming, 2008). Рисунок 1. Силы, удерживающие и предотвращающие распад ЭПМ: 1водородные связи, 2-катионные мостичные связи, 3-силы Ван-дер-Ваальса, 4силы отталкивания (Mayer et al., 1999). Матрикс пронизан каналами, по которым циркулируют питательные субстраты, ферменты, сигнальные метаболиты, кислород, продукты метаболизма бактериальных клеток (Li et al., 2008). Поры и каналы, пронизывающие всю биопленку образно сравнивают с кровеносной системой (Dong et al., 2001). 14 При использовании гранулометрических методов было доказано движение потока жидкости через эти каналы. Измерение in situ растворенного кислорода с использованием микроэлектродов показало, что кислород, как и субстраты, доступен в любой точке биопленки (Beer et al., 1994). При этом важно отметить, что биопленки непроницаемы для достаточно крупных молекул (большинство антибиотиков), так как пропускают лишь вещества с низким молекулярным весом (Романова, Гинцбург, 2011). 1.2.2 Стадии формирования биопленок Жизненный цикл биопленки представлен несколькими этапами (Donlan, Costerton, 2002; Costerton, 2007): 1. Первичная (обратимая) адгезия микроорганизмов к поверхности из окружающей среды; 2. Окончательная (необратимая) адгезия, иначе называемая фиксацией; 3. Рост колонии и продукция межклеточного матрикса, формирование и созревание биопленки; 4. Дисперсия (выброс бактерий), при которой периодически от зрелой биопленки отрываются отдельные клетки, способные вновь прикрепиться к поверхности и образовать новые колонии. Начальные элементы биопленки могут сформироваться в течение двух часов инкубации, достигая максимальной интенсивности уже через 24 часа (рисунок 2). Первым этапом формирования биопленки на незаселенной поверхности является адгезия (прикрепление) на ней отдельных бактериальных клеток. Адгезия является ключевым моментом в образовании биопленки, а адгезины способствуют преодолению сил отталкивания, при взаимодействии одноименно заряженных поверхностей, участвуя в переходе к формирования биопленки (Lappin-Scott, 2001; Singh, 2006). необратимой стадии 15 Рисунок 2. Процесс формирования и роста биопленки (Singh, 2006). Различают две основные группы бактериальных адгезинов: те, что связанны с органеллами на поверхности клетки – фимбриями (F-пили; curli-пили; пили I, IV типа и др.), и адгезивные факторы нефимбриальной природы (экзополисахариды и другие полимерные соединения). Было показано, что важную роль играют 16 жгутики, которые обеспечивают хемотаксис бактерий и играют решающую роль в архитектуре биопленок (О’Tool, 2000). В качестве адгезинов рассматривают также S-слои клеточной стенки, состоящие из упорядоченно расположенных протеиновых или гликопротеиновых субъединиц (Северина, 1995). После прикрепления к поверхности у бактерий включаются механизмы синтеза белков и активации деления микроорганизмов с продукцией протеаз, амилаз и липаз, обеспечивающих развитие растущего бактериального сообщества за счет использования питательных веществ окружающей среды. В отдельных участках сформированной биопленки периодически возникают очаги размножения, в результате чего, в окружающую среду выделяются планктонные клетки микроорганизмов (Николаев, Плакунов, 2007). 1.2.3 Социальное поведение микроорганизмов в биопленке В настоящее время межклеточные коммуникации у микроорганизмов биопленок являются объектом пристального изучения и одним из наиболее приоритетных направлений развития микробиологии (Олескин и др., 2000). Микробные ансамблях комплексы связаны между (МК) в развивающихся собой сложными структурированных системами межклеточных взаимоотношений и для своего выживания широко используют преимущество коллективного поведения (Гинцбург и др., 2003; Романова и др., 2006; Мулюкин, 2010; Николаев, 2011). Эффективность клеточных ответов на воздействие стрессфакторов зависит от степени специфичности сенсорных механизмов, которые участвуют в проведении сигналов стресса. Термин «Quorum Sensing» (QS, «чувство кворума»), использованный для обозначения поведенческих механизмов такого типа, был предложен французским ученым в 1994 году (Fuqua et al., 1994). «Quorum sensing» (QS) – это механизм коллективной координации, основанный на экспрессии генов в популяции бактерий и определяющий специфическое поведение клеток (Мелькина и др., 2010). 17 Известно, что реакции адаптации осуществляются на химическом, молекулярно-биологическом, клеточном и популяционном уровнях и на всех уровнях контролируются специфическими внеклеточными низкомолекулярными метаболитами различной химической природы. Низкомолекулярные сигнальные молекулы, названные аутоиндукторами (АИ) (рисунок 3), легко диффундируют через клеточную стенку (Эль-Регистан, 2011). Рисунок 3. Виды АИ, участвующих в коммуникационных процессах между микроорганизмами (Waters et al., 2005). С помощью АИ осуществляется коммуникация – межклеточная передача информации между бактериями, поэтому сигнальные молекулы считают «словами» в своеобразном «языке» микроорганизмов. По мере того, как численность МК увеличивается и достигает критического уровня, АИ накапливаются до необходимого порогового значения и взаимодействуют с соответствующими регуляторными белками, что приводит к резкой активации экспрессии определенных генов, которые запускают синтез полисахаридов, образующих капсулы на поверхности бактериальной массы (Miller, Bassler, 2001; Воробей и др., 2012). 18 В подобном поведении бактерий проявляются черты сходства с многоклеточными организмами. Они используют преимущества «социального» поведения, которые не были доступны им как индивидуальным клеткам. Передача информации от клетки к клетке с использованием QS-механизмов приводит к индукции определенных наборов генов и способствует быстрой адаптации бактерий к изменению состояния окружающей среды и их выживанию в экстремальных условиях (Khmel, Metlitskaya, 2006). Известно, что QSмеханизмы обнаружены у более 50 видов бактерий (Schauder et al., 2001; Veselova et al., 2003; Waters et al. 2005). Факторы, влияющие на образование биопленок 1.3 Физиологическая активность биопленки определяется созданием и поддержанием благоприятных условий для ее существования. В процессе жизнедеятельности микроорганизмов на них оказывают свое влияние различные факторы – биотические (состав микробного сообщества, коммуникативные связи между различными группами микроорганизмов) и абиотические (pH, температура, количество питательных веществ и др.) (Costerton, 2007; Flemming, Wingender, 2010). 1.3.1 Биотические факторы Действие биотических факторов выражается в форме взаимовлияний одних микроорганизмов на жизнедеятельность других и всех вместе на среду обитания (Шлегель, 1987). Микроорганизмы в связи с изменением условий местообитания вынуждены искать выход в формировании ассоциаций с другими бактериями, которые позволяют находить защиту от негативных последствий воздействия факторов окружающей среды (Mogilnaya et al. 2005; Плакунов, Николаев, 2010). В многовидовой биопленке микроорганизмы взаимодействуют посредством механизма «Quorum sensing», а также через метаболические связи, которые в дальнейшем могут привести к фенотипическим изменениям (устойчивость к 19 антимикробным препаратам, проявление защитных свойств, пространственное распределение и т.д.) (рисунок 4). Рисунок. 4. Индивидуальные и «социальные» процессы, происходящие в многовидовой биопленке (Elias, Banin, 2012). Взаимосвязи между видами в пределах биопленки могут быть антагонистическими или синергическими. Среди них отмечают конкуренцию – антагонистические отношения между видами, связанные с борьбой за местообитание, питательные вещества и другие ресурсы; протокооперацию – полезные взаимоотношения между микроорганизмами, когда они могут существовать раздельно, но вместе они стимулируют рост друг друга; комменсализм – способ совместного существования (симбиоз) двух разных видов живых организмов, при котором один из партнёров этой системы (комменсал) возлагает на другого (хозяина) регуляцию своих отношений с внешней средой, не вступая с ним в тесные взаимоотношения (Wolin, 1988; Журина, 2009). В качестве примера можно привести потребление кислорода аэробным микроорганизмом, способствующее росту микроаэрофильных или анаэробных «сожителей» (Costerton, 2007). 20 В биопленках конкуренция между видами обнаруживается редко. И даже в том случае, когда один из видов благодаря более высокой скорости роста занимает господствующее положение, второй сохраняет жизнеспособность и высокую численность (Плакунов и др., 2010). Наиболее часто устанавливаются взаимоотношения, близкие к симбиозу. Например, в биопленках, состоящих из целлюлолитиков и их спутников, неспособных к гидролизу целлюлозы последние потребляют продукты гидролиза, репрессирующие биосинтез целлюлаз и повышают образование этих ферментов (Weimer et al., 2003). Множество исследований посвящено изучению биопленок, образованных одним видом, однако в природных условиях они чаще всего состоят из смешанных консорциумов (Elias, Banin, 2012). Разница в развитии многовидовой биопленки и отдельного штамма обусловлена сложной структурой сообщества микроорганизмов, которая позволяет оптимально использовать все доступные источники питания и энергии, и обеспечивает лучшую защищенность от воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды. 1.3.2 Абиотические факторы Совокупность физико-химических условий окружающей среды относят к абиотическим факторам (таблица 2). Жизнедеятельность любых микроорганизмов возможна в определенном интервале значений каждого фактора. Этот интервал условно делят на три области: зона лимитирования (низкие значения фактора ограничивают жизнедеятельность), оптимальная зона (область значений, в которой жизненные показатели микроорганизмов постоянны), зона ингибирования - область избыточных значений фактора, где жизнедеятельность подавляется. Известно, что в природе микроорганизмы испытывают на себе влияние не одного, а множества факторов, поэтому необходимо учитывать их комплексное воздействие (Коростелева, Кощаев, 2013). 21 Таблица 2. Основные факторы среды, определяющие интенсивность метаболизма микроорганизмов (Колесников, Вильсон, 2005). Роль при культивировании Методы управления фактором Состав и концентрация питательных веществ Обеспечивают метаболизм химических реакций Составление оптимальной композиции; непрерывность процесса, многостадийность с учетом потребности продуцента по фазам Концентрации продуктов и ингибиторов Замедление биохимических процессов Удаление продукта метаболизма. Разбавление с целью снижения концентрации ингибитора и др. Фактор pH Оптимизирует скорость Регулирование путем добавления биохимических кислоты или щелочи реакций Оптимизирует скорость биохимических реакций Охлаждение или подогрев субстратов Осмотическое давление или активность среды Определяет границы жизни Составление сред с оптимальной концентрацией питательных веществ, поддерживание на постоянном уровне путем разбавления или увеличения концентрации питательных веществ. Содержание растворенного кислорода Для аэробов – обеспечивает метаболизм, является акцептором протонов, ингибирует развитие анаэробов Регулируют интенсивность аэрации, анаэробные процессы реализуют в бескислородной среде, что достигается продувкой углекислого газа или добавкой восстановителей Температура 22 Продолжение таблицы 2. Содержание растворенного кислорода Для аэробов – обеспечивает метаболизм, является акцептором протонов, ингибирует развитие анаэробов Регулируют интенсивность аэрации, анаэробные процессы реализуют в бескислородной среде, что достигается продувкой углекислого газа или добавкой восстановителей Содержание диоксида углерода Источник углерода для автотрофов, гетеротрофы некоторые нуждаются, а некоторые замедляют метаболизм в присутствии диоксида углерода Продувание газовой средой, обогащенной диоксидом углерода, выделению способствует перемешивание Перемешивание среды Равномерное распределение питательных веществ Механическое перемешивание, барботаж, циркуляция, аэрация Вязкость среды Определяет дифференциацию питательных веществ и перемешивание клеток продуцента Регулируется состав питательных веществ и концентрация биомассы. Вязкость влияет на перемешивание и аэрацию Биопленки могут быть сформированы на самых разнообразных поверхностях, включая живые ткани, медицинские приборы, промышленные системы, водопроводные сети и др. Их можно обнаружить в любом месте, где существуют благоприятные условия для колонизации (Kanatiwela, 2014). Прикрепление микроорганизмов к поверхности представляет собой сложный процесс, который дополнительно контролируется различными экологическими условиями. Степень микробной колонизации зависит от свойств поверхности (Martinez, Casadevall, 2007; Парфенова и др., 2008). Ученые доказали, что лучшему микробному прикреплению способствуют грубые, шероховатые, гидрофобные поверхности (тефлон, резина, пластик), в отличие от гидрофильных 23 материалов, таких как стекло и некоторые металлы (Pringle, Fletcher, 1983; Звягинцев, 1987; Bendinger et al., 1993). Было установлено, что наличие катионов (Na+, Ca2+, Fe3+) способствуют прикреплению биопленки к стеклу, вследствие снижения сил отталкивания между отрицательно заряженными клетками и поверхностью стекла (Fletcher, 1988). Поверхности, которые подвергаются аэрации, также способствуют образованию и прикреплению микробных комплексов (Mittelman, 1996; Kokare et al., 2009). Микроорганизмы, гидрофильной которые поверхности, способны прикрепляться характеризующейся и удерживаться высокой на смачиваемостью, проявляют максимальные адгезивные свойства (Prakash et al., 2003). Температура оказывает значительное влияние на рост и выживаемость микроорганизмов (Bott Pinheiro, 1977; Melo, Vieira, 1995). Существует минимальная температура, ниже которой рост невозможен; оптимальная, при которой происходит наиболее интенсивный рост; и максимальная температура, выше которой рост прекращается. В зависимости от существования микроорганизмов в тех или иных температурных условиях, они подразделяются на 4 группы: психрофилы (например, Flavobacterium spp., оптимальный рост при 13ºС), мезофилы (Escherichia coli – при 39ºС), термофилы (Bacillus spp. – 60ºС) и гипертермофилы (Thermococcus spp. и Pyrodictum spp. – при 88ºC и 105ºC, соответственно) (Beech et al., 2000; Flemming et al., 2000). При оптимальной температуре происходит активизация метаболических процессов клеток и интенсивное потребление питательных веществ, в результате происходит быстрое формирование биопленки. С другой стороны, температура, далекая от оптимума, снижает эффективность бактериального роста (Stepanovic et al., 2003). Процессы разложения органических веществ регулируются температурным режимом, так как определяются синтезом соответствующих микробных ферментов (Somero, 2004). Принимая во внимание, что некоторые стойкие органические вещества разлагаются очень медленно, они вовлекаются в процессы трансформации, происходящие в течение разных сезонов года при изменяющемся 24 температурном режиме. При этом влияние температуры на структуру микробных комплексов связано с их адаптацией к условиям местообитания и регулируется активностью ферментов. Некоторые исследователи отмечают влияние сезонного фактора на бактериальное прикрепление (Prakash et al., 2003). Этот эффект может быть связан с температурой среды или другими сезонно меняющимися параметрами. Также отмечено, что при оптимальном повышении температуры полисахариды могут быть представлены желеобразным веществом, которое способствует более сильному прикреплению БП к поверхности (Simonnet et al., 2000). Экспериментальные исследования показали, что появление жгутиков у микроорганизмов может контролироваться температурой (Herald, Zolotta, 1988). При температуре 35ºC у клеток наблюдали по одному жгутику, а при уменьшении температуры до 10ºC их количество значительно увеличивалось. Это позволило предположить, что с понижением температуры адгезивные свойства уменьшаются, и микробоценозы для того, чтобы лучше закрепиться на поверхности, используют специализированные клеточные структуры, включая жгутики. Исследования влияния высоких температур (80-90ºC) на удаление биопленок показали, что эти температуры не являются эффективными, возможно, из-за большего слипания клеток (Marion-Ferey et al., 2002). Резкие изменения рН внешней среды оказывают биоцидный эффект на микроорганизмы. Бактерии реагируют на изменения рН внутри клетки и окружающей среды, регулируя активность и синтез белков, связанных со множеством различных клеточных процессов. Постепенное увеличение кислотности среды повышает шансы на выживание клеток по сравнению с внезапным добавлением HCl. Это значит, что бактерии способны адаптироваться к малым изменениям рН окружающей среды. Однако существует ряд клеточных процессов, которые не зависят от колебаний рН. Например, формирование экзополимерных веществ (полисахаридов, белков, нуклеиновых кислот и др.). 25 Оптимальный рН для производства полисахарида зависит от вида микроорганизмов (для большинства бактерий – рН около 7) (Garrett et al., 2008). Соленость и pH влияют на плотность водной среды – следовательно, могут повлиять и на микробиологические процессы, происходящие в водных экосистемах (Pederson, 1982). Известно, что при изменении солености, меняются и доминирующие микроорганизмы в биопленке (Zhang et al., 2014). Многими исследователями было отмечено, что производство бактериями аутоиндукторов зависит от солености, однако механизм этой зависимости пока не ясен (Zhou L. et al., 2014). Отмечено, что некоторые элементы при таких условиях усваиваются биопленкой при определенном режиме солености, например, фосфор лучше потребляется микроорганизмами при 10-35% солености (Underwood et al., 2000). В отдельных случаях показано, что 20% соленость ингибирует утилизацию аммония (Chapanova et al., 2007). Свет также играет определенную роль в образовании БП. Он усиливает рост и потребление питательных веществ микробными комплексами и оказывает положительное влияние на активность внеклеточных ферментов. Однако и в темноте микробные клетки способны активно размножаться, образуя бактериальные сообщества (Ylla et al., 2009). При развитии биопленок в жидкой среде уделяется внимание таким факторам, как гидродинамические условия. Было установлено, что биопленки, развивающиеся в ламинарном течении, оказываются неоднородными и состоят из грубых клеточных агрегатов, разделенных промежуточными пустотами. В турбулентных потоках БП характеризуются наличием длинных «косм», слизистых ответвлений, которые колеблются в объеме жидкости. Доказано, что толщина биопленки в турбулентном потоке выше, чем в ламинарном (Stoodely et al., 1998; Herbert-Guilow, Tribollet, 2000). Влияние скорости течения на питание и рост биопленок более сложно и многообразно. В стоячей воде вокруг прикрепленных бактерий возникает зона с пониженной концентрацией питательных веществ. Повышение скорости течения 26 приводит к усилению питания и роста МК только в определенных пределах неодинаковых у разных видов. Было показано, что если толщина биопленки, выращенной в бескислородных условиях при скорости потока 0,7 м/с составляла 300 мкм, то при скорости потока 2 м/с ее толщина была 600 мкм. Разница между этими показателями объясняется более высокой скоростью массопереноса и появлением новых доступных питательных веществ (Patel, Bott, 1991). При превышении критической скорости течения, скорости питания и роста бактерий снижаются, что обусловлено физическими и биологическими причинами (Николаев, 2011). Взвешенные частицы (ВЧ) могут выступать в качестве важного фактора формирования биопленок. ВЧ транспортируются с поступающей водой, образуются в результате производственных процессов, а также являются следствием коррозии металлов. В большинстве случаев в БП присутствуют неорганические частицы (глина, песок, оксиды железа), которые относительно инертны с метаболический точки зрения, но, тем не менее, могут стать причиной изменения структуры и деятельности сообщества биопленки. Существует ряд публикаций о взаимодействии неорганических частиц и микроорганизмов в почвах и жидких средах (Burns et al., 1989; Marshall, Bitton, 1989). Известно, что наличие в микробных пленках неорганических ВЧ (глина, каолин, карбонат кальция и др.) способствует механическому уплотнению структуры биопленки (Bowen, Dempsey, 1992; Chudoba, Pannier, 1994). Было показано, что увеличение количества биопленки происходит при турбулентном режиме течения воды в присутствии 150 мг/л взвешенных частиц каолина с диаметром 10-20 мкм (Oliveira et al., 1993). При этом частицы глины входили в состав полимерного матрикса, а биопленка долгое время сохраняла целостную структуру при исключении питательных веществ из движущегося потока жидкости. Частицы глины физически влияли на БП и способствовали поддержанию оптимального значения pH благодаря своим адсорбционным и ионообменным свойствам (Melo et al., 1995). Было также установлено, что 27 биопленки, выращенные в присутствии взвешенных неорганических частиц (каолин, карбонат кальция 50 мг/л), обладали устойчивостью к воздействию различных биоцидов (Srinivasan et al., 1995). По своему отношению к кислороду микроорганизмы условно делятся на несколько групп (рисунок 5). Аэробы Факультативные анаэробы Микроаэрофилы Облигатные анаэробы Рисунок. 5. Влияние кислорода на локализацию растущих клеток (Beech et al., 2000). Облигатные аэробы нуждаются в молекулярном кислороде для окисления питательных веществ и осуществления аэробного дыхания. Это значительная часть микроорганизмов, живущих на различных поверхностях и в верхних слоях почвы и водоемов (например, Micrococcus luteus). Среди аэробов выделяют группу микроорганизмов-микроаэрофилов, которым кислород необходим, но в концентрации ниже атмосферной (менее 5%). Такие организмы встречаются на границе анаэробной и аэробной зон в естественных местообитаниях. К ним относятся многие тионовые и железоокисляющие бактерии (в том числе, представители родов Beggiatoa, Galionella) (Beech et al., 2000). 28 Факультативные анаэробные микроорганизмы способны переключать свой обмен веществ в зависимости от наличия или отсутствия кислорода с аэробного дыхания на анаэробные процессы. Как правило, в присутствии кислорода такие микроорганизмы растут быстрее и накапливают больше биомассы. Облигатные анаэробы не нуждаются в кислороде для своей жизнедеятельности, более того, в его присутствии происходит угнетение или гибель клеток. В эту группу входят метанобразующие археи, гомоацетогенные бактерии, большинство сульфатредукторов (Плакунов и др., 2010). Так как биопленка представлена различными видами микроорганизмов, присутствие кислорода определяет зональность и положение анаэробных и аэробных представителей микробоценозов при изменяющихся условиях (рисунок 6) (Sauer et al., 2002; Stewart, Franklin, 2008). Рисунок. 6. Распределение аэробных и анаэробных форм микроорганизмов в биопленке в зависимости от поступления кислорода и питательных веществ(Sauer et al., 2002; Stewart, Franklin, 2008). Быстрорастущие гетеротрофные аэробные микроорганизмы располагаются на внешнем уровне, а медленнорастущие анаэробы – во внутренних зонах биопленки (Николаев, Плакунов 2007). 29 1.4 Физиолого-биохимическая и экологическая активность биопленок В состав биопленок входят различные виды микроорганизмов, которые играют важную роль в цикле биогенных элементов и трансформации органических соединений. Присутствие в природной среде питательных веществ является важным фактором для развития и роста биопленок (Battin et al., 2003; Besemer et al., 2007). Процессы потребления различных органических и неорганических соединений обеспечивают энергией, необходимой для метаболизма биопленки, и способствуют или препятствуют образованию экзополимерного матрикса (Flemming, 2011). Микроорганизмы, находясь в структурированных сообществах, потребляют питательные вещества, концентрируя их на поверхности полимерного матрикса, используя остатки лизированных клеток, продукты метаболизма вторичных колонизаторов. Поскольку матрица биопленки заряжена отрицательно, множество питательных веществ (заряженных положительно) притягиваются к ее поверхности и также используются МК (Prakash et al., 2003). Из внешней среды клетки поглощают питательные вещества всей поверхностью. При этом потребляемые субстраты обязательно должны находиться в растворенном виде и размеры их молекул должны быть значительно меньше самой клетки, ионы и молекулы небольшого размера беспрепятственно поступают в клетку. Макромолекулы иногда имеют размер больше, чем сама клетка и для поступления в клетку они должны подвергаться расщеплению и гидролизу. Если вещество является трудно растворимым, то процесс гидролиза может быть более длительным. Для расщепления трудноминерализуемых соединений, микроорганизмы прикрепляются к субстрату, образуют биопленки и при помощи экзоферментов ускоряют процесс деградации. Продукты гидролиза диффундируют в клетку, где происходит их дальнейшее окисление с целью получения энергии и более простых соединений, используемых в качестве строительных блоков клеточного вещества (Кондратьева и др., 2000). 30 Благодаря высокой численности микроорганизмов, развивающихся в биопленках, и разнообразию их метаболических процессов, происходит активное использование органических веществ (ОВ) различного происхождения (Moldoveanu, 2011). Продуктивность и активность микробоценоза определяется в первую очередь количеством и биохимическим составом органических веществ, которые представлены растворенной и нерастворенной формами (Таубе, Баранова, 1983). По данным многих авторов (Muster, Chrost, 1990; Azua et al. 2003) в естественной среде содержится достаточное количество растворенных ОВ, способствующих росту биопленок. Однако большее значение имеет происхождение и строение органических веществ, а также их концентрация (Koetsier et al., 1997; Battin et al., 2003; Rodrigues et al., 2010). ОВ, содержащиеся в природных объектах, подразделяются результате жизнедеятельности и на автохтонные, отмирания различных образующиеся в организмов, и аллохтонные, поступающие извне. Химический состав их весьма сложен и разнообразен (Олейник, 1991). Органический азот представлен белками и продуктами их гидролиза – пептидами и аминокислотами, различного строения с алифатическими или гетероциклическими радикалами. Он входит в состав микроорганизмов, низших растений и неразложившихся остатков высших растений и может быть продуктом биологических процессов, а также попадать в окружающую среду со сточными водами. Кроме обычных белков (протеинов) встречаются более сложные молекулы глико- Азотсодержащие и мукопротеидов, органические липопротеидов вещества, как и нуклеопротеидов. правило, являются легкодоступными и быстро утилизируются микробоценозами (Кондратьева, 2005). Вещества с высоким молекулярным весом (полимерные субстраты растительных остатков, полициклические углеводороды природного и антропогенного происхождения, различные ксенобиотики, поступающие извне) менее доступны для большинства микроорганизмов, их деградация 31 осуществляется специализированными группами с использованием специальных ферментов (Нгандже и др. 2009, Moldoveanu, 2011). Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) – органические соединения, состоящие из двух, трех или более конденсированных ароматических колец, в которых определенные атомы углерода являются общими. Кольца могут располагаться по прямой линии, под углом или в виде кластерных соединений. Более того, название «углеводород» указывает на то, что молекула состоит только из углерода и водорода (Геннадиев и др., 2000). Простейшая структура, содержащая только два конденсированных ароматических кольца – нафталин (С10Н8), бициклический представитель ПАУ, который получают из каменноугольной смолы и продуктов пиролиза нефти. Период полураспада в воде 1-2 суток. Нафталин используют при синтезе красителей, для получения фталевого ангидрида и фталевой кислоты при производстве пестицидов, пластмасс. Фенантрен (C14H10) – трехциклический ПАУ, широко распространен в живой природе. Фенантрен и его производные содержатся в каменноугольной смоле, входят в состав нефтяных углеводородов, а также могут образовываться в результате лесных пожаров, при затоплении почв и растительных остатков (поймы рек и заболоченные участки). Фенантрен применяется при производстве красителей, является стабилизатором взрывчатых веществ, содержится в табачном дыме и среди продуктов различных процессов пиролиза (Шабаров, 1994; Зилов, 2009). С увеличением молекулярного веса ПАУ, уменьшается их растворимость в воде, что характеризует их устойчивость к биодеградации и определяет потенциальную возможность накопления в биологических мембранах и тканях (Trzesicka-Mlynarz, Ward, 1995; Гаджиева и др., 2009). Они накапливаются в почве, донных осадками и в других компонентах окружающей среды (Клименков, Борзенко, 2005). Основные физико-химические свойства ПАУ представлены в таблице 3. 32 Таблица 3. Химические и физические свойства некоторых ПАУ (Mrozik et al., 2003). Молеку- Температура лярный плавления, вес ºС Нафталин 128,2 Аценафтилен Температура Растворимость в кипения, ºС воде, мг/л 80,2 218,0 30,6 154,2 96,0 278,0 3,9 Фенантрен 178,2 100,0 339,0 1,2 Антрацен 178,2 217,0 340,0 0,7 Пирен 202,26 150,4 393,0 0,145 Флуорантен 202,26 108,8 383,0 0,262 Хризен 228,29 253,8 431,0 0,003 Вещество Полная биодеградация моно- и полициклических ароматических углеводородов может осуществляться как одной культурой, так и комплексом бактерий (Шумкова и др., 2009). В природе чаще всего встречается поэтапная биодеградация ароматических веществ, каждый этап которой осуществляют отдельные микроорганизмы. В состав микробных ассоциаций могут входить организмы различного трофического уровня, которые используют продукты метаболизма основной группы деструкторов (Парфенова, Дрюккер, 2002; Кондратьева и др., 2013). Наиболее распространенными интермедиатами являются ароматические соединения фенольного ряда, которые составляют основную долю продуктов деградации лигнин содержащих субстратов, входят в состав сырой нефти, выделяются водорослями и макрофитами, содержатся в угольной пыли, сточных водах промышленных предприятий и сельскохозяйственных комплексов. Однако разные пути их деструкции сводятся к образованию либо пирокатехина, либо протокатеховой кислоты, других представителей гомологического ряда фенолов (Шлегель, 1987). Среди соединений природного происхождения особое место занимают гуминовые вещества (ГВ) (рисунок 7), которые играют важную роль в 33 биогеохимических процессах, происходящих в почвах и природных водах. Гуминовые соединения, особенно гуминовые и фульвокислоты (ГФК), составляют около 75% растворенного органического углерода в водной толще. Они вносят существенный вклад в поток медленно разлагаемых органических веществ (Wetzel, 2001; Kim et al., 2006). Известно, что их содержание существенно изменяется в природных средах: морские воды (до 1 мг/л), речные воды (до 20 мг/л), болотные воды (до 300 мг/л), почвы (1-12%), торф (до 40%), бурые угли (леонардит) (до 85%) (Орлов, 1992). Рисунок 7. Структурная формула ГФК почвы (Rice, McCarthy, 1991). Образование ГВ в природных средах происходит в результате химического и биологического разложения растительных и животных остатков. В основе данного процесса лежит отбор устойчивых к биодеградации структур и соединение их в макромолекулы (Frimmel, Cristman, 1988; Орлов, 1992; Bollag, Mayers, 1992). Гуминовые и высокомолекулярных функциональные фульвокислоты (ГФК) соединений, имеющих группы, способные к представляют собой смесь в своем составе различные химическим взаимодействиям. 34 Макроэлементами, образующими молекулы гумусовых кислот, являются углерод, водород и кислород. Азот и сера содержатся на уровне 1-3%. Молекулы гумусовых кислот состоят из «каркасной» (негидролизуемой) и периферической (гидролизуемой) части. «Каркасная» часть представлена высокозамещенными ароматическими фрагментами. Преобладающими заместителями являются кислородсодержащие функциональные группы: карбоксильные, фенольные, карбонильные, метоксильные и др. (Lin et al., 2001). Периферийная часть представлена углеводно-протеиновым комплексом. Наличие в молекулах гумусовых кислот ароматического каркаса обеспечивает их высокое сродство к полициклическим ароматическим углеводородам (Геннадиев и др., 2003). В связи с этим взаимодействие МК с гумусовыми кислотами является важнейшим фактором, контролирующим концентрацию растворимой формы ПАУ в водных экосистемах. Нерегулярность строения углеродного скелета ГФК в совокупности с обогащением различными элементами обусловливает разнообразие и переменный состав структурных фрагментов, образующих их молекулы (Ковалевский и др., 2000; Перминова, 2004, 2008). Увеличение числа микробных клеток коррелирует с увеличением концентрации питательных веществ. Однако даже небольшого количества питательного субстрата достаточно для образования и роста биопленки. Известно, что использование низких концентраций ОВ для некоторых микроорганизмов является наиболее оптимальным для их нормального роста и развития. Органические вещества с низкой концентрацией быстрее потребляются микроорганизмами (Парфенова и др., 2008). Высокие концентрации органических соединений провоцируют максимальный прирост биомассы, и могут быть показателем органического загрязнения окружающей среды. Например, гетеротрофные бактерии предпочитают вещества с низкой молекулярной массой (продукты разложения растительных остатков (глюкоза) и белков (аминокислоты)), которые быстрее усваиваются бактериальными клетками. Большое количество питательных веществ способствует формированию более 35 рыхлой, крупной биопленки, тогда как при низких концентрациях структура биопленок становится более плотной и компактной. Рыхлая структура облегчает диффузию новых питательных веществ к клеткам и в значительной степени зависит от присутствия молекулярного кислорода (Patel, Bott, 1991). Бактерии имеют очень разнообразные физиологические возможности в отношении питательных веществ и условий окружающей среды, которые дополняются внутривидовыми и межвидовыми взаимодействиями. Поведение и ответные реакции микробных сообществ напрямую зависят от изменений биотических и абиотических факторов и могут играть положительную или отрицательную роль в природных и технологических процессах. 1.5 Роль Участие биопленок в формировании биоминералов биогенного фактора в процессе минералообразования широко обсуждается с разных позиций (Zegeye et al., 2010; Барабашева, 2014; Kondratyeva, Golubeva, 2014). Микроорганизмы рассматриваются, во-первых, как накопители элементов, необходимых для формирования ряда минералов в определенных условиях, во-вторых, изучается их воздействие на вещество минералов в результате образования биопленок на поверхности последних, в-третьих, микроорганизмы сами формируют некоторые минералы в процессе своей жизнедеятельности (Лысюк, 2011). При окислении ОВ железоредуцирующими бактериями, Fe(III) служит терминальным акцептором электронов. Известны две принципиально различные стратегии микробного восстановления нерастворимых оксидов Fe(III): (1) прямой контакт клетки с минералом с помощью белков, локализованных снаружи клеточной мембраны или электропроводящих пилей; (2) использование растворимых веществ, переносящих электроны между клеткой и минералом по челночному механизму, либо повышающих растворимость соединений железа (Bazilinsky et al., 2007). Наиболее распространенным в земной коре является окисленное железо в трехвалентном состоянии, находящееся в нерастворимой форме. Локальная 36 аккумуляция нерастворимых форм железа в природных системах может свидетельствовать о микробиологической активности (Потехина, 2006). Микроорганизмы определяют динамику геохимического цикла химического элемента железа, осуществляя донорно-акцепторные связи между ионами железа и бактериальными клетками и накопление этого рудообразующего элемента (Шварцев и др., 2007). Формирование биоминералов происходит при активизации биогеохимических процессов на природной минеральной матрице при наличии железосодержащих подземных вод (Kondratyeva, Golubeva, 2014). 1.6 Практические проблемы биологического обрастания Исследование биопленок приобрело систематический характер лишь в последнее время. Вероятно, это связано с тем, что функционирование этих особых бактериальных агломераций в ряде случаев значительно осложняет практическую деятельность человека (Коробов и др., 2010). Развитие высокотехнологичных направлений медицины значительно расширило лечебное применение различных долгосрочных инвазивных устройств – от сосудистых катетеров до сердечных клапанов, кардиостимуляторов, глазных протезов и даже информационно-коммуникационных микрочипов (Habash, Reid, 1999). Функционирование этих устройств часто сопровождается заселением их поверхностей микробными пленками (Donlan, Costerton, 2002). Образование биопленок патогенными бактериями способствует инфекционным поражениям большинства органов (верхних дыхательных путей, легких, сердца, почек, кожи, костей, системы пищеварения) и практически всех искусственных имплантатов. Биопленки влияют на течение хронических воспалительных заболеваний и играют существенную роль в нарушении течения процессов заживления хронических ран (Costerton, биопленках, обладают 2007). высоким Микроорганизмы, уровнем развивающиеся толерантности к в антителам, антибиотикам, антисептикам, дезинфектантам и фагоцитам. Устойчивость к антибиотикам поддерживается фильтрующей способностью полимерного 37 матрикса, который заполняет межклеточные пространства и связывает клетки в единую структуру. Это свойство позволяет замедлить диффузию антибактериальных веществ внутрь БП (Dawson et al., 2011). Кроме того, множественная резистентность биопленочных бактерий может быть связана с существованием в БП устойчивых клеток (персистеров), с обычным для данного штамма генотипом, но с сильно заторможенным метаболизмом (Плакунов и др., 2010). Главной особенностью персистентных клеток является их удивительная способность к выживанию при воздействии антибактериальных препаратов (Мальцев, Мансурова, 2013). Изучение экологических закономерностей распространения и развития БП является ключевым моментом дальнейшего развития медицинской микробиологии (Хмель, 2006). Способность бактерий формировать биопленки вызывает серьезные трудности в промышленности. БП вызывают биокоррозию трубопроводов, обрастания различного технологического оборудования, корпусов судов, нефтяных платформ (Flemming, 2002; Менча, 2006; Сosterton, 2007). В пищевой промышленности образование биопленок на продуктах повышает риск заражения пищи патогенными микроорганизмами и в результате возникновения значимых инфекций у людей (Kumar, Anand, 1998). Биопленки также могут являться причиной возникновения комплекса проблем при эксплуатации ирригационных систем (Zhou B. et al., 2014). Развитие биообрастаний в системе питьевого водоснабжения приводит к значительным осложнениям в результате образования микроорганизмами достаточно толстого слоя отложений, которые, сокращая исходное сечение и изменяя гидравлический режим работы водопроводной сети, вызывают увеличение энергетических затрат на подачу воды потребителям. Возникновение зон с повышенной концентрацией ОВ способствует появлению и развитию патогенных микроорганизмов (Плакунов, Николаев, 2008; Доброхотский и др., 2009; Кампер, 2012).Результаты недавних исследований развития микробных комплексов Pseudomonas Aeruginosa (синегнойная палочка), выращенных во время космического полета, показали, что их биопленки обладали 38 большей биомассой и большим количеством живых клеток, в отличие от тех же представителей, выросших в земных условиях. В дальнейшем это явление может оказывать негативное влияние на различные материалы космических кораблей в связи с возникновением коррозии (Kim et al., 2013). Однако, биопленки могут играть положительную роль в биотехнологии (Maric, Vranes, 2007; Kanatiwela, 2014). В связи с растущей антропогенной нагрузкой, все больший интерес вызывает искусственное конструирование биопленок в качестве биореакторов (Nicolella et al., 2000). В таких системах можно получать новые физиологически активные продукты, которые образуются при биотрансформации сложных органических соединений (Morrish et al., 2008; Garikipati et al., 2009; Плакунов, Николаев, 2010). Огромное значение имеет возможность управления процессами развития и функционирования микроорганизмов в биореакторах, а также прогноз их поведения при изменении условий окружающей среды. Отсутствие подобных исследований способно привести к возникновению новых проблем. Например, подобные «биореакторы» образуются при эксплуатации подземных источников водоснабжения с использованием искусственной аэрации. В результате происходит активизация железомарганцевых бактерий, которые осуществляют процессы обезжелезивания и деманганации в пласте с накоплением осадков оксидов железа и марганца (Кулаков, Кондратьева, 2008; Аскерния и др., 2014). При этом подземные воды, подверженные поступлению органических веществ различного строения и происхождения, способствуют развитию и других физиологических групп микроорганизмов, образующих биопленки (Rodrigues, 2010). Локализация активных БП в поровом пространстве водоносных горизонтов (ВГ), может приводить к их постепенному заполнению различными химическими элементами, содержащимися в подземных водах и, в дальнейшем – к образованию биоминералов (Kondratyeva, Golubeva, 2014). Поэтому возникают предпосылки для биокольматажа (от фр. colmatage – закупорка, засорение, естественная цементация) скважин и порового пространства водоносного горизонта (Walter, 39 1997; Cullimore, 1999; Кондратьева, Литвиненко, 2014). Биологическое обрастание сетей и сооружений систем водоснабжения создает противоречие между жизнедеятельностью, присущей водным микроорганизмам, и эффективным функционированием поверхностей, омываемых водой, которая является естественной средой обитания этих организмов. Эту проблему необходимо решать не путем борьбы с природными процессами, а методами избирательного предупреждения обрастания в системе водоснабжения (Mains, 2008; Кармалов, Филимонова, 2011). Это определяет необходимость глубоких и разносторонних исследований механизмов образования биопленок в водных системах (природных и технологических) и поиска эффективных методов борьбы. 40 ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Объекты и место исследования В качестве объектов исследования были использованы микробные комплексы из различных местообитаний: вода и донные отложения (ДО), отобранные на разных участках р. Амур (выше и ниже устья р. Сунгари, Нижний Амур); подземные воды и обрастания из водозаборных скважин пилотной установки Тунгусского месторождения (Приамурье). Река Амур – одна из крупнейших рек в мире (длина реки 4444 км), образованная слиянием рек Шилки и Аргуни. Река Амур делится на Верхний Амур (до устья Зеи), Средний (до впадения Уссури) и Нижний (до Амурского лимана). Сток реки Амур распределяется в зависимости от сезона года в Татарский пролив и Сахалинский залив, а далее в Охотское и Японское моря (Крюков и др., 2005; Воронов, Махинов, 2009). Площадь бассейна реки Амур разделена горными хребтами на три области: Верхнеамурскую (начинается от места слияния Шилки и Аргуни и заканчивается в районе г. Благовещенска у устья р. Зеи – длина его 883 км), Среднеамурскую (охватывает участок между городами Благовещенском и Хабаровском, длина 975 км), Нижнеамурскую (от г. Хабаровска до устья, длина 966 км). Отмеченным областям соответствуют разнообразные ландшафты, которые несут определенную экологическую нагрузку: водостабилизирующую, водорегулирующую и влагосберегающую (Факторы формирования…, 2008). Амур со своими притоками относится к рекам дождевого питания. Поэтому весеннее половодье небольшое, но зато летом, в июле-августе, в период муссонных дождей и обильного таяния снега в горах на реках наступают высокие паводки. Ледостав на реках амурского бассейна начинается в конце октября и полностью заканчивается в начале или во второй декаде ноября (Махинов, 2008). 41 Отличительной чертой р. Амур является ее пограничный статус. Бассейн реки охватывает огромную территорию – свыше 1,8 млн. кв. км и расположен на территории трех стран – России, Китая и Монголии. На участке от г. Благовещенска до г. Хабаровска в формировании качества воды и химического состава донных отложений принимают участие три крупных притока – р. Зея, р. Бурея, р. Сунгари. На двух крупных левобережных притоках р. Амур на российской территории созданы водохранилища: с 1975 г. работает Зейская ГЭС, в 2003 г. началась эксплуатация Бурейской ГЭС. (Крюков и др., 2005). Интенсивное развитие промышленности и сельскохозяйственное освоение территорий в бассейне р. Амур оказывает влияние на формирование стока, прохождение паводков и качество воды в р. Амур (Факторы формирования…, 2008). Состав подземных вод (ПВ) Тунгусского месторождения значительно отличается от показателей речной воды (таблица 4). Бескислородная подземная вода содержит высокие значения соединений железа, марганца, характеризуется низким значением рН и высокой концентрацией растворенной углекислоты (Кулаков и др., 1998; Кулаков, 2011). Таблица 4. Показатели качества воды р. Амур и подземной воды Тунгусского месторождения (Кулаков, 2011; Гришек и др., 2012). Показатель Температура, ºC pH Кислород, мг/л Двуокись углерода, мг/л Железо, мг/л Марганец, мг/л Аммоний, мг/л Кремний, мг/л Растворенный органический углерод, мг/л Речная вода 0,1-26 6,7-7,2 5-8 14-30 0,2-1,2 0,1-1 1 – 1,5 2–6 Подземная вода 6 5,9-6,2 < 0,1 180-250 25-30 2-3 0,5 18-20 10-14 1,3-3,8 42 Тунгусское месторождение подземных вод расположено на территории Смидовичского района Еврейской автономной области между поймой реки Амур и железной и автомобильной дорогами, в непосредственной близости от русла реки (Труфанов, 1982; Кулаков и др., 2012; Шевцов и др., 2012). Месторождение находится почти в самом центре Среднеамурской низменности, представляющей собой крупную межгорную впадину, которая имеет сложное геологическое строение и значительные размеры, сложена озерно-аллювиальными песчаносуглинистыми толщами мощностью представлены различными в сотни водоносными метров. горизонтами, Подземные воды последовательно залегающими в соответствии с геологическим разрезом (в направлении сверху вниз), в отложениях – от современных аллювиальных до трещиноватых позднепалеозойских пород, также присутствуют угленосные отложения (Караванов, 1996; Кулаков и др., 1998). 2.2 Материалы исследования Для модельных экспериментов в качестве инокулята были использованы пробы воды и ДО из р. Амур, отобранные сотрудниками ИВЭП ДВО РАН во время комплексной экспедиции летом 2009 г.: № 19 – проба воды от 04.07.09 г., р. Амур, 300 км, фарватер, середина, выше устья Сунгари; № 20 – проба воды от 04.07.09 г., р. Амур, 266 км, фарватер, 400 м от правого берега, ниже устья р. Сунгари (в зоне влияния Cунгарийских вод); № 37 – проба воды от 11.08.09 г., Нижний Амур, с. Савинское; № 32 – проба ДО от 04.07.09 г., р. Амур, 300 км, фарватер, середина, выше устья Сунгари; № 33 – проба ДО 04.07.09 г., р. Амур, 266 км, фарватер, 400 м от правого берега, ниже устья р. Сунгари (в зоне влияния Cунгарийских вод); № 36 – проба ДО от 11.08.09 г., Нижний Амур, с. Савинское. Пробы ДО отбирали штанговым дночерпателем Петерсона с захватом 0-5 см слоя. До начала эксперимента отобранные пробы воды и ДО хранили в холодильнике при температуре 4оС. Многофакторный эксперимент был заложен через неделю 43 после отбора проб, которые использовали в качестве накопительных культур для микробиологических посевов. Детали эксперимента приведены в разделе 2.3. Пробы подземных вод Тунгусского месторождения для экспериментальных микробиологических исследований согласно поставленным задачам отбирали сотрудники ИВЭП ДВО РАН во время проводимого мониторинга качества подземных вод (2011-2013 гг.). Для исследования способности образовывать биопленки МК из разных слоев водоносного горизонта подземных вод были использованы пробы воды из нескольких наблюдательных скважин: 2-1 (глубина 26 м); 2-2, 5-2 (глубина 36 м); 2-3 (глубина 47 м) и обрастания из скважин пилотной установки (БП-5; БП-6; БП-7; БП-8; БП-9). Физиолого-биохимические исследования проводили на примере 120 штаммов, выделенных из проб воды и непосредственно из биопленок. 2.3 Микробиологические исследования Экспериментальные работы проводили на базе лаборатории гидрологии и гидрогеологии микробиологии ИВЭП ДВО методы РАН. Использовали культивирования стандартные микроорганизмов на в водной твердых (агаризованных) и жидких питательных средах различного состава (таблица 5) (Родина, 1965 Герхардт, 1983; Кузнецов, Дубинина, 1989). Все эксперименты проводили в стерильных условиях, в трехкратной повторности. В качестве контроля использовали питательную среду с различными добавками, без добавления микробного инокулята. Активность роста МК в жидких средах оценивали фотометрически по изменению оптической плотности (ОП) при 490 нм на КФК-56 М. Адгезивную активность и образование биопленок исследовали при помощи метода «Стекла обрастания» (Намсараев и др., 2006). Для оценки влияния ОВ различного строения и происхождения на образование биопленок природными МК из различных местообитаний была проведена серия экспериментов с 44 легкодоступными азотсодержащими субстратами – пептон, дрожжевой экстракт; гидрофобными ароматическими полициклическими углеводородами – нафталин, фенантрен; трудноминерализуемыми гуминовыми веществами. Таблица 5. Состав использованных агаризованных селективных сред. Питательная среда Состав, г/л Дистиллированная вода – 1; рыбный питательный агар, гидролизат кильки – 3,5; пептон – 1; NaCl – 0,5; агар – 20. Дистиллированная вода – 1; рыбный питательный агар, РПА гидролизат кильки – 35; пептон – 1; NaCl – 0,5; агар – 20. Дистиллированная вода – 1; крахмал растворимый – 10; КАА (NH4)2SO4 -2; K2HPO4 -1; MgSO4·7H2O – 1; NaCl – 1; CaCO3 – 3; агар – 20. Для жидкой среды: Дистиллированная вода – 1; MnSO4·Н2О – 0,1; KH2PO4 – 0,05; MgSO4·7Н2О – 0,02; (NH4)2SO4 – 0,1; Бромфильда Ca3(PO4)2 – 0,1. Для твердой среды: Дистиллированная вода – 1; дрожжевой автолизат – 0,1 г; MnSO4·Н2О – 0,1; KH2PO4 – 0,05; MgSO4·7Н2О – 0,02; (NH4)2SO4 – 0,1; Ca3(PO4)2 – 0,1; Fe(OH)3 – 5 г, агар – 20 г. РПА:10 Среда М9 Дистиллированная вода – 1, KH2PO4 -1,33; K2HPO4 – 2,67; NH4Cl – 1; Na2SO4 – 2; KNO3 – 2; FeSO4·7H2O – 0,001; MgSO4·7H2O – 0,1. Среда Мф Дистиллированная вода – 1; KNO3 - 1; MgSO4·7H2O – 0,2; K2HPO4 -1; NaCl – 1; агар – 20; фенол – 1. Исследованы ответные реакции на условия культивирования более 120 микрокосмов и проведен анализ 288 описаний; физиолого-биохимические свойства 120 штаммов, выделенных из поверхностных, подземных вод и биообрастаний; выполнено более 1000 микробиологических посевов и анализов. 45 Образование биопленок при микробиологической трансформации ПАУ. Для определения роли биопленок в трансформации ПАУ планктонными и бентосными микробными комплексами р. Амур проводили культивирование на минеральной среде М9. В колбы объемом 250 мл с горячей стерильной средой М9 в условиях асептики добавляли нафталин и фенантрен, в виде тонкоизмельченной пудры из расчета 100 мг на 100 мл. После остывания питательной среды вносили 1 мл водной пробы. Инокулят из ДО готовили из расчета 1 г сырой навески на 100 мл дистиллированной воды, встряхивали на шейкере в течение 20 минут. Затем 1 мл суспензии вносили в колбы со 100 мл стерильной питательной среды, с предварительно внесенными источниками углерода. Учитывая сезонный фактор, характер трансформации ПАУ оценивали при трех вариантах температурного режима: 1 вариант: 2ºС — имитация зимнего периода; 2 вариант: 23ºС — условия, приближенные к теплому периоду года (середина лета); 3 вариант: переходный температурный режим — 30 суток культивировали при 2ºС, затем до конца эксперимента при 23ºС. Длительность эксперимента составляла 80 суток. Для оценки активности трансформации ПАУ проводили описание культуральных характеристик 72 модельных комплексов (на 7, 14, 30, 60, 80 сутки), учитывали следующие показатели: изменение цветности культуральной жидкости (КЖ), разрыхление частиц субстрата, образование биопленок, адгезию на стекле (на дне колб). Качественные показатели выражали в баллах от 0 до 2. Такой подход позволяет определить: активность биосорбции микроорганизмов на гидрофобных углеводородах; влияние температурного фактора на характер трансформации; адаптационный потенциал к загрязнению местообитаний выше и ниже устья р. Сунгари. Идентификацию продуктов трансформации ПАУ проводили в 36 образцах с выраженным образованием биопленок в аналитической лаборатории Хабаровского краевого центра экологического мониторинга природной среды методом хроматомасс-спектрометрии на приборе GCMS-QP 2010 «Shimadzu» по 46 полному ионному току (аналитик Рапопорт В.Л.). В диссертации приведена лишь часть хроматограмм¸ подтверждающих основные выводы, полученные в результате этих исследований. Построение графиков осуществляли при помощи программы Microsoft Excel 2010. Формирование микробных пленок на частицах Fe(OH)3. В данном эксперименте были использованы биопленка (БП-8) из скважины пилотной установки Тунгусского месторождения подземных вод и музейный штамм из коллекции лаборатории Гидрологии и гидрогеологии (ИВЭП ДВО РАН) Caulobacter sp., Т-20. В качестве источника азота, углерода и других компонентов для роста и развития микроорганизмов использовали дрожжевой экстракт (ДЭ), который представляет собой сложную смесь органических веществ из предварительно гидролизованных или подвергшихся автолизу дрожжевых клеток. Дрожжевые клетки содержат значительное количество различных протеолитических ферментов, под действием которых в определенных условиях происходит автолиз клеток и высвобождение из них белков в виде пептонов, альбумоз, а также аминокислот, нуклеиновых кислот и др. Эти компоненты определяют состав автолизата, который сопоставим с триптическим гидролизатом других белков, в том числе и по содержанию аминного азота. Содержание аминного азота дрожжевого автолизата достигает 1000 – 1200 мг%. В эксперименте ДЭ имитировал поступление природных органических веществ в водную среду в результате сукцессии микробных комплексов и лизиса бактериальных клеток. Инокулят, приготовленный из суспензии микроорганизмов (БП-8 и Caulobacter sp., Т-20) вносили по 1 мл в конические колбы со 100 мл жидкой среды Бромфильда (СБ) (MnSO4 – 0,1г; KH2PO4 – 0,05 г; MgSO4 – 0,02 г; (NH4)2SO4 – 0,1 г; Ca3(PO4)2 – 0,1 г; 1 л воды) с различными добавками: I вариант: СБ + ДЭ (0,1 г/л); II вариант: СБ + Fe(OH)3 (5 г/л); III вариант: СБ + ДЭ+ Fe(OH)3 (в тех же концентрациях). Культивирование микроорганизмов проводили при 47 температуре 22-23ºС в стационарных условиях. Известно, что для большинства изученных Fe (III) – редуцирующих микроорганизмов оптимальная температура для роста составляет психрофильные, 20-30ºС, хотя встречаются и психротолерантные, термофильные и гипертермофильные представители железобактерий (Finnerant et al., 2003). В течение 60 суток наблюдали за характером формирования биомассы (гомогенный или пленочный рост) и особенностью бактериальной адгезии (на стекле или нерастворимых частицах гидрата окиси железа). Через 60 суток были проведены исследования биомассы на электронном микроскопе (EVO-40HV, Carl Zeiss). Для обеспечения необходимой электронной проводимости осуществляли напыление тонким слоем платины. Электронные изображения были получены в режиме вторичных электронов. Для определения элементного состава биомассы (биопленок) использовали кремний-дрейфовый рентгеновский детектор X-MAX 80мм2. Адгезия на стекле в присутствии стойких и биохимически лабильных органических веществ. Для оценки характера адгезии микробных комплексов на стекле в присутствии органических веществ разной степени доступности был использован метод «Стекла обрастания» (Намсараев и др., 2006). В колбы со 100 мл жидкой питательной среды Бромфильда вносили источники углерода и помещали стерильные предметные стекла. В качестве инокулята использовали по 1 мл суспензии, приготовленной из диспергированной в течение 20 мин на шейкере (150 об/мин) биопленки БП-8 и 3х-суточной музейной культуры Pseudomonas sp. Для сравнения активности адгезии и способности к образованию биопленок использовали комплексные микробоценозы из 4-х проб подземной воды (5-2, 2-1, 2-2, 2-3) из скважин пилотной установки Тунгусского месторождения. В качестве источников углерода использовали: препарат растворимых гуминовых веществ (ГВ) (Humic acid sodium salt, H16752, «SigmaAldrich», Germany), как аналог трудноминерализуемых органических веществ; 48 пептон (П) (ООО НПО «Порт-Петровск», ГОСТ 13805-76, г. Оболенск, Московская обл., серия 299), представляющий собой смесь полипептидов, свободных аминокислот, ферментов, нуклеиновых кислот и некоторых витаминов. При культивировании микроорганизмов использовали 4 модельных варианта питательных сред с разными добавками: I вариант: СБ+5 г/л FeSO4+2 г/л пептона (П+FeSO4); II вариант: СБ+5 г/л FeSO4+0,025 г/л препарата гуминовых веществ (ГВ+FeSO4); III вариант: СБ+П (П); IV вариант: СБ+ГВ (ГВ). Визуальные особенности бактериальной адгезии и формирование БП на 28 стеклах фиксировали на 7 и 30 сутки (проведено 56 описаний). В конце эксперимента производили высев культуральной жидкости на агаризованные питательные среды (РПА, РПА-10, КАА и Мф) для выявления жизнеспособных форм микроорганизмов и выделения отдельных штаммов. Стекла вынимали, фиксировали, окрашивали по Граму генцианвиолетом и фуксином (Герхардт, 1983); проводили световую микроскопию (микроскоп Carl Zeiss Imager-A2). Электронную микроскопию проводили как и в предыдущем эксперименте (EVO40HV, Carl Zeiss). 49 ГЛАВА 3. ОБРАЗОВАНИЕ БИОПЛЕНОК ПРИ ТРАНСФОРМАЦИИ ГИДРОФОБНЫХ УГЛЕВОДОРОДОВ МИКРОБНЫМИ КОМПЛЕКСАМИ ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОД Среди широко распространенных загрязняющих веществ полициклические ароматические соединения представляют главный интерес из-за их стойкости к разложению и токсичности. ПАУ – органические соединения бензольного ряда, различающиеся по числу бензольных колец и особенностям их присоединения (Шабаров, 1994). Главными участниками процессов трансформации загрязняющих веществ и самоочищения различных экосистем являются микроорганизмы, обладающие высокими адаптационными способностями и пластичностью обменных процессов (Шлегель, 1987; Кондратьева и др., 2010; 2011 а, б). Трансформация моно- и полициклических ароматических углеводородов может осуществляться как отдельными штаммами (Tabak et al., 2003; Пунтус и др., 2008), так и комплексом бактерий в виде биопленок (Шумкова и др., 2009; Морозова, Литвиненко, 2011; Kondratyeva, Litvinenko, 2013). В исследованиях (Rockne, Strand, 1998) было показано, что культуры в консорциуме более эффективно утилизируют нафталин и его производные, чем монокультуры. В природе чаще всего встречается поэтапная биодеградация ароматических веществ, каждый этап которой осуществляют отдельные виды микроорганизмов (Kanaly, Harayama, 2000). Разнообразие механизмов преобразования сложных органических молекул микробными консорциумами регулируется множеством абиотических и биотических факторов, а также их суммарным воздействием (Кондратьева и др., 2000, 2007). 50 3.1 Загрязнение реки Амур полициклическими ароматическими углеводородами Существует множество предпосылок загрязнения р. Амур ПАУ. Наиболее весомыми факторами можно считать: трансграничное загрязнение с сопредельных территорий Китая; выбросы от энергетических источников, транспортных средств; лесные пожары (Кондратьева, 2005). Рост промышленного производства в бассейне р. Сунгари, активное освоение территории правобережья р. Амур способствуют поступлению в р. Амур значительных количеств биогенных элементов, органических веществ различного происхождения, включая стойкие ароматические углеводороды. Многие ПАУ обладают канцерогенным эффектом и способны вызывать функциональные расстройства у гидробионтов различного уровня организации. В результате биогеохимических процессов, происходящих в илах при участии бентосных биоценозов, осуществляется деструкция и трансформация стойких ПАУ с образованием токсичных промежуточных продуктов, влияющих на санитарногигиеническую обстановку в водных экосистемах и способных выступать факторами риска для воспроизводства рыбных ресурсов (Кондратьева и др., 2007; Рапопорт, Кондратьева, 2008). В ходе комплексных научных исследований, впервые проведенных в 2002 г. учеными Института водных и экологических проблем ДВО РАН и Института тектоники и геофизики ДВО РАН (г. Хабаровск), было установлено, что природные воды одной из крупнейших рек Дальнего Востока и мира характеризуются высоким уровнем загрязнения органическими веществами, включая полициклические ароматические углеводороды различного происхождения (Кондратьева и др., 2003). Более подробные исследования загрязнения р. Амур ПАУ были проведены в августе 2005 г. в устьевых зонах крупных притоков на участке от г. Благовещенск до г. Хабаровск. В пробах воды, отобранных на разных створах, были выявлены 51 различные комбинации из ПАУ. Наиболее существенно состав ПАУ изменялся на трансграничных участках. Так, возле левого российского берега в зоне влияния г. Благовещенска в пробах воды доминировали антрацен и пирен в концентрации 0,014 нг/л, на середине реки концентрации ПАУ были ниже пределов обнаружения, а возле правого китайского берега (г. Хайхэ) присутствовали фенантрен (0,032 нг/л) и антрацен (0,021 нг/л). В воде, выносимой со стоком р. Сунгари, максимальные концентрации приходились на бенз(b)флуорантен (рисунок 8) (Кондратьева, 2005). К основным технологическим процессам, при которых выделяется бенз(b)флуорантен, относятся: сжигание нефтепродуктов и угля, работа дизельных и бензиновых двигателей. Нг/л Левый берег -ЛБ Середина - С Правый берег -ПБ Рисунок 8. Распределение ПАУ в воде р. Амур ниже устья р. Сунгари (лето, 2005 г.) (Кондратьева, 2005). Анализ последствий загрязнения р. Амур после техногенной аварии в КНР на нефтеперерабатывающем заводе г. Цзилинь в ноябре 2005 показал, что после прохождения загрязненных нитробензолом водных масс, в них значительно возросли концентрации ПАУ. Это обусловлено тем, что бензол способствует 52 растворимости ПАУ в воде. Фактически, техногенная авария в КНР имела множество скрытых экологических эффектов, которые могут проявляться длительное время и иметь непредсказуемые последствия (Кондратьева и др., 2007). На фоне значительного трансграничного загрязнения Амура со стоком р. Сунгари с китайской территории вклад сточных вод Амурско-Комсомольского промышленного комплекса и г. Николаевск-на-Амуре в суммарное загрязнение речных вод незначителен. Исследования показали (Чижова и др., 2013)., что интенсивность процессов очищения амурских вод снижается по мере продвижения их к устьевой зоне. В Амурском лимане в воде возрастает доля трудноминерализуемых и стойких органических соединений. Основную их массу составляют ароматические соединения Ситуация с загрязнением р. Амур постоянно изменяется в связи расширением масштабов хозяйственного использования водных, земельных и биологических ресурсов в бассейне Амура на территории России и особенно в Китае, а также с происходящими промышленными авариями на химических предприятиях, расположенных в бассейне реки Сунгари (территория КНР) (Кондратьева, 2003; Рапопорт, Кондратьева, 2008). Высокая уязвимость и слабая естественная регенерация водных экосистем Амура в условиях антропогенной нагрузки на окружающую среду, а также несбалансированное природопользование не соответствуют экологическим возможностям природной среды бассейна реки Амур к самовосстановлению. Поэтому исследования факторов самоочищения водных экосистем в Приамурье от стойких органических веществ, включая ПАУ, имеет важное научное и прикладное значение. 53 3.2 Активность микробиологической трансформации нафталина и фенантрена на трансграничном участке р. Амур Механизмы микробиологической трансформации ПАУ зависят не только от строения их молекулы, концентрации, растворимости, присутствия дополнительных питательных веществ, рН, температуры и др., но и от способности микроорганизмов вести прикрепленный образ жизни на различных нерастворимых субстратах (Рубцова, Куюкина, 2010; Серебренникова и др., 2014). Для экспериментального исследования адгезивной активности микроорганизмов из 6 различных местообитаний были использованы два представителя ПАУ – бициклический нафталин и трехциклический фенантрен. Эксперимент проводили при различном температурном режиме. 1 вариант: 2ºС — имитация зимнего периода; 2 вариант: 23ºС — условия, приближенные к теплому периоду года (середина лета); 3 вариант: переходный температурный режим — 30 суток культивирование при 2ºС, затем до конца эксперимента при 23ºС. Температура определяет ферментативную активность микроорганизмов- деструкторов, кроме того от нее значит возможность полного разложения токсичных веществ. Изучение влияния температуры связано с выявлением сезонных особенностей разложения стойких ОВ. В качестве добавок к питательным средам вносили 3% NaCl и ко-субстрат — 0,2% пептон. При оценке интенсивности микробиологической трансформации ПАУ использовали несколько культуральных признаков: изменение цветности питательной среды при накоплении интермедиатов, способность микробоценозов к адгезии на частицах ПАУ и образованию биопленок. 3.2.1 Развитие микробных комплексов на нафталине При оценке интенсивности микробиологической трансформации ПАУ наиболее показательными культуральными признаками являются изменение 54 цветности и оптической плотности (ОП при 490 нм) питательной среды, в которой культивируются микробные комплексы, присутствующие в пробах воды и донных отложений. Сравнительный анализ визуального изменения цветности является самым простым и доступным методом определения активности трансформации нафталина и фенантрена (Кондратьева и др., 2011б). Изменение цветности при отсутствии увеличения мутности может происходить при трансформации ПАУ за счет участия экзогенных ферментов, выделяемых в КЖ. При этом промежуточные продукты деструкции не утилизируются и не используются в качестве источника углерода. Чаще всего в этом случае наблюдается токсикологический эффект и МК не развиваются. В другом варианте при одновременном изменении цветности и нарастании оптической плотности КЖ можно говорить о трансформации и последующей утилизации интермедиатов (промежуточных продуктов разложения ПАУ). Ниже приводятся результаты экспериментального исследования цветности КЖ при трансформации нафталина и фенантрена планктонными и бентосными микробными комплексами р. Амур при изменении абиотических условий культивирования (изменение температуры, увеличение солености, внесение дополнительного источника питания). Максимальное увеличение цветности КЖ через 30 суток при развитии МК из пробы воды, отобранной выше устья р. Сунгари при 23ºС наблюдали в двух вариантах: на одном нафталине и в присутствии ко-субстрата пептона. При внесении 3% NaCl в питательную среду с нафталином и пептоном окраска КЖ существенно изменялась в зависимости от местообитания микробного сообщества (рисунок 9). Бактериопланктон, который подвергался воздействию стока р. Сунгари активно трансформировал нафталин во всех вариантах эксперимента. Внесение соли существенно активизировало образование цветных интермедиатов нафталина особенно в присутствии азотсодержащих ОВ. Окраска КЖ становилась 55 темно-коричневого цвета. Планктонные микробные комплексы с Нижнего Амура (с. Савинское) на одном нафталине не развивались в течение 30 суток, цветные продукты не накапливались. Их развитие происходило вероятнее всего только за счет пептона. Рисунок 9. Развитие планктонных микробных комплексов с разных участков р. Амур на нафталине при различных условиях культивирования: 19 – выше устья Сунгари; 20 –ниже устья р. Сунгари; 37 –Нижний Амур, с. Савинское; К – контроль: нафталин+ пептон без инокулята. Учитывая потенциальные возможности МК трансформировать нафталин можно предположить, что в р. Амур в районе с. Нижнеленинское (выше устья р. Сунгари) регулярно поступают разнообразные ароматические углеводороды, в 56 состав которых могут входить бициклические представители. Ниже устья р. Сунгари в связи с повышенным содержанием взвешенных веществ в воде МК развивались непосредственно на частицах нафталина. Это дает основание предполагать, что в состав взвесей, поступающих со стоком р. Сунгари могут входить различные ПАУ (Кондратьева и др., 2010; 2013; Матрошилова и др., 2010; Кондратьева и др., 2011 а). На Нижнем Амуре присутствие нафталина может быть ограниченным в связи с седиментацией ПАУ на выше расположенных участках и отсутствием их поступления от других источников. Можно предположить, что МК из зоны влияния р. Сунгари могут быть адаптированы к повышенной минерализации воды. Разная цветность КЖ в присутствии 3% NaCl дает основание предполагать о существовании различных механизмов трансформации нафталина, в которых участвует бактериопланктон из из разных местообитаний (проб воды, отобраны выше и ниже устья р. Сунгари). В данном случае ведущим фактором, определяющим эти механизмы, является структура микробоценозов, сформировавшихся при различном характере загрязнения р. Амур на этих створах. Легкодоступные источники питания в виде азотсодержащих ОВ, практически не влияют на активность трансформации нафталина, сохраняется высокая цветность КЖ при развитии МК на участке выше и ниже устья р. Сунгари. Микробоценозы с Нижнего Амура начинают развиваться только за счет пептона. Однако увеличение солености на фоне двух ко-субстратов (нафталин+пептон+3 % NaCl) существенно влияет на механизмы трансформации, что легко выявляется по различной цветности КЖ. Самое максимальное накопление цветных интермедиатов наблюдается при участии МК, адаптированных к хроническому загрязнению водной среды ниже устья р. Сунгари. В данном случае высокая соленость 3% NaCl выступает главным фактором, влияющим на накопление цветных интермедиатов. 57 Отдельно стоит отметить существенное влияние температуры не только на скорость образования цветных продуктов, при различном наборе источников углерода. Так при температуре 2ºС через 17 суток культивирования на одном нафталине и в присутствии пептона бактериопланктон с контрольного участка реки (выше устья р. Сунгари) не изменял цветность КЖ, слабый рост наблюдался только в присутствии ко-субстрата. Микробоценозы воды, которые подвергались влиянию стока р. Сунгари даже при низкой температуре трансформировали нафталин с образованием продуктов, придающих КЖ светло-желтую окраску, причем они развивались в прикрепленном состоянии на частицах нафталина. Характерная бактериальная адгезия на стекле наблюдалась у бактериопланктона из проб воды, отобранных ниже устья р. Сунгари, особенно когда они развивались на одном нафталине. Микроорганизмы из проб воды, отобранных с Нижнего Амура, при росте на одном нафталине такой способностью не обладали. Однако дополнительное внесение пептона и соли приводило к появлению адгезивной способности и у этих комплексов. В разных вариантах эксперимента микроорганизмы развивались в прикрепленном состоянии либо на частицах нафталина, либо на дне колб. Причем, в некоторых вариантах образовывались слизистые биопленки, объединяющие разрыхленные частицы нафталина. Накопленная таким образом биомасса имела различную окраску, это свидетельствует о селективном отборе отдельных групп микроорганизмов. Специальных отсев слизистых биопленок на агаризованные среды показал, что они отличаются по своей структуре. Иногда эти биопленки были представлены монокультурами, имеющими характерный цветлимонный или желтый. Селективным фактором выступал добавленный к нафталину ко-субстрат – пептон, а прикрепление к частицам нафталина происходило при повышенной солености. Можно предположить, что механизмы трансформации нафталина зависят не только от состава питательных веществ, присутствия соли, а также от 58 способности микроорганизмов вести прикрепленный образ жизни либо на частицах нафталина, либо в толще КЖ или непосредственно на дне колб. Наиболее интенсивная окраска КЖ развивалась при участии бактерий, образующих биопленки на частицах нафталина. Показателем утилизации продуктов трансформации нафталина является рост оптической плотности в вариантах, где этот субстрат используется в качестве единственного источника углерода. При одновременном культивировании на двух ко-субстратах уже труднее оценить возможность образования биомассы за счет конкретного субстрата. Однако образование цветных продуктов в присутствии азотсодержащих ОВ, может свидетельствовать о том, что нафталин, по крайней мере, подвергается трансформации, несмотря на наличие другого более доступного субстрата. Например, максимальную биомассу на нафталине в течение 30 суток накапливали МК из проб воды, отобранных ниже устья р. Сунгари развивающиеся на нафталине в присутствии пептона (таблица 6). Бактериопланктон с Нижнего Амура не развивался на одном нафталине. Таблица 6. Рост планктонных микробных комплексов с различных участков р. Амур на нафталине, в присутствии пептона и повышенной солености (ОП, 490 нм). Условия Нафталин Нафталин+пептон Нафталин+3% NaCl Нафталин+пептон +3% NaCl Выше устья р. Сунгари 10 30 суток суток 0,191 0,227 0,353 0,392 0 0,219 Ниже устья р. Сунгари 10 30 суток суток 0,257 0,317 0,687 0,400 0,117 0,098 10 суток 0 0,191 0 30 суток 0 0,117 0 0,175 0,397 0,282 0,121 0,279 0,475 Нижний Амур В присутствии ко-субстрата биомасса увеличивалась у всех МК, особенно развивающихся в зоне влияния р. Сунгари. Причем, наиболее активное изменение 59 оптической плотности происходило в первые 10 суток. Через 30 суток произошло снижение ОП, возможно, за счет гибели части клеток при накоплении токсичных цветных интермедиатов. Было отмечено не однозначное влияние 3% NaCl на интенсивность роста МК, выделенных из пробы воды, отобранной ниже устья р. Сунгари. При росте на единственном источнике углерода – нафталине в присутствии соли накопление биомассы этих микробных комплексов замедлялось. В присутствии пептона соль не оказывала такого влияния на накопление биомассы этих микробоценозов. Это может быть связано с селекцией МК, способных утилизировать дополнительный ко-субстрат при повышенной солености. Минимальную биомассу при различных сочетаниях абиотических факторов накапливали МК с Нижнего Амура. В качестве основного источника углерода выступал пептон, нафталин ими не разлагался и не утилизировался. Довольно неожиданные данные получены при культивировании бентосных МК с различных участков р. Амур (Kondratyeva, Litvinenko, 2013). Прежде всего, следует обратить внимание на характер отобранных проб донных отложений. Выше и ниже устья р. Сунгари ДО были представлены тонкодисперсным песком, но в зоне влияния стока р. Сунгари в песке встречались илистые частицы. В пробе ДО с Нижнего Амура преобладали глинистые частицы. Различные характеристики ДО определяли активность бентосных МК по отношению к нафталину. Например, бентосные МК с участка выше устья р. Сунгари не развивались на нафталине. Слабый рост без изменения окраски КЖ наблюдался только в присутствии пептона, независимо от условий солености. Бентосные МК, которые подвергались влиянию поллютантов, поступающих со стоком р. Сунгари, не росли на нафталине. Они проявляли слабую активность только в присутствии пептона. Микробные комплексы из ДО с Нижнего Амура по своим культуральным признакам существенно отличались от бентосных сообществ со среднего Амура. Они развивались, главным образом, в нижних слоях КЖ на частицах нафталина и суспендированных ДО. Изменение цветности было не 60 характерным для культивирования на нафталине. Окраска была бледно желтого цвета на одном нафталине и в присутствии пептона. Внесение соли ингибировало развитие бентосных МК на одном нафталине, однако в присутствии пептона такого эффекта не наблюдали. Исследованные бентосные микробные комплексы, обитающие в зоне влияния р. Сунгари, проявляли низкую активность по отношению к нафталину, как к единственному источнику углерода, и не трансформировали его до цветных продуктов (рисунок 10). Возможно, это было связано с нехваткой дополнительных легкодоступных органических веществ. Рисунок 10. Развитие бентосных микробных комплексов выше и ниже устья реки Сунгари при различных температурах на 80 сутки. Однако даже при отсутствии цветности, трансформация сопровождалась адгезией бактериобентоса на частицах нафталина (рисунок 11), которая наблюдалась уже на 10-15 сутки при температурах 2ºС и 23ºС. Наиболее активно 61 этот процесс происходил у микробоценозов из проб, отобранных выше устья реки Сунгари. Сформированные биопленки представляли собой длинные тонкие тяжи из частиц нафталина, заключенные в прозрачное вещество – полимерный матрикс, продуцированный микробными комплексами. Кроме образования биопленок, к концу эксперимента (40-80 сутки) наблюдалось разрыхление частиц субстрата. Максимальное проявление изменения состояния частиц ПАУ зарегистрировано при 23ºС выше устья реки Сунгари. Смена температурного режима не повлияла на интенсивность трансформации нафталина. Микробные пленки развивались в свободном состоянии, при встряхивании распадались на мелкие частицы и практически не проявляли адгезивной активности к частицам субстрата. Это свидетельствовало об обратимой адгезии микробных комплексов, которая является способом быстрого реагирования на стресс без изменения жизненной стратегии (Costerton, 2007). 62 Рисунок 11. Трансформация нафталина бактериобентосом р. Амур при различной температуре: А, Б – при 2ºС выше и ниже устья р. Сунгари соответственно; В, Г – при смене температур от 2˚Сдо 23ºС там же; Д, Е – при 23ºС, там же. 63 3.2.2 Развитие микробных комплексов на фенантрене Проведенные in vitro исследования трансформации фенантрена свидетельствовали о том, что микробные комплексы донных отложений показали достаточно высокую активность по отношению к фенантрену. Изменение цветности культуральной жидкости происходило при трех вариантах температурного режима при участии бентосных микробоценозов из ДО, отобранных выше и ниже устья р. Сунгари (рисунок 12). Рисунок 12. Развитие бентосных микробных комплексов проб, отобранных выше и ниже устья р. Сунгари, при трех различных температурах на 80 сутки. Активное образование биопленок микробными комплексами (выше и ниже устья р. Сунгари) было отмечено уже на 15 сутки при температуре 23ºС (рисунок 13). 64 Рисунок 13. Трансформация фенантрена бактериобентосом р. Амур при различной температуре: А, Б – при 2ºС выше и ниже устья р. Сунгари; В, Г – при смене температур от 2ºСдо 23ºС там же; Д, Е – при 23ºС, там же. 65 Интенсивное образование бурых биопленок к концу эксперимента наблюдали при смене температурного режима с 2ºС до 23ºС при участии бактериобентоса из ДО, отобранных в зоне влияния стока р. Сунгари. При температуре 2ºС активность трансформации фенантрена была слабой и характеризовалась разрыхлением частиц фенантрена лишь на 40-80 сутки. Трансформация фенантрена при температуре 23ºС сопровождалась бактериальной адгезией к стеклу (на дне колб) в зоне непосредственного контакта с частицами субстрата. Вместе с интенсивным изменением цветности КЖ за счет образования водорастворимых «цветных» интермедиатов происходило образование слизистых темно-бурых биопленок. Это может быть связано с дифференциацией бактериального сообщества на представителей, способных к необратимой адгезии на стекле (рисунок 14) и развивающихся в виде биопленок в толще КЖ за счет растворенной составляющей фенантрена. Интенсивное образование слизистого матрикса (рисунок 15) можно связать с защитным механизмом против накопления в КЖ токсичных цветных продуктов деградации ПАУ. Ранее было показано, что среди продуктов микробиологической трансформации нафталина, присутствовал 1,4-бензохинон, изменяющий окраску КЖ до интенсивно бурого цвета (Рапопорт, Кондратьева, 2008). 66 Рисунок 14. Биосорбция бентосных микробных комплексов, культивируемых на фенантрене, 15 сутки, температура 23ºС. Рисунок 15. Образование слизистых скоплений на частицах фенантрена Бактериальная адгезия является начальным этапом процесса биотрансформации и ассимиляции органических субстратов (Куюкина и др., 2011). Известно, что микробные комплексы, адаптированные к хроническому загрязнению, характеризуются повышенной адгезивной активностью 67 (Криворучко, 2008). В нашем случае необратимая адгезия и образование крупных слизистых биопленок происходили в вариантах с МК из ДО, отобранных ниже устья р. Сунгари при температуре 23ºС и смене температурного режима 2-23°С. Ранее было отмечено, что чем больше растворимость ПАУ, тем меньше на них образуется биопленок (Johnsen, 2004). Этим можно объяснить различия в интенсивности образования биопленок на частицах нафталина и фенантрена в нашем эксперименте. 3.3 Продукты трансформации нафталина и фенантрена Экспериментальные исследования показали, что при трансформации ПАУ накопление цветных продуктов определяется температурным режимом, структурой и адгезивной способностью микробных комплексов, местом отбора проб донных отложений и степенью их загрязнения ароматическими углеводородами (Кондратьева и др., 2013). Ранее, на примере актинобактерий рода Rhodococcus было установлено, что их адгезивные свойства по отношению к жидким углеводородам зависели от штаммовой специфичности, экологической приуроченности и условий культивирования (Рубцова и др., 2009). Кроме того, было отмечено, что соленость и внесение легкодоступных ОВ может оказывать существенное влияние на метаболизм МК в зависимости от их местообитания. При повышении солености и в присутствии пептона происходило образование слизистого матрикса биопленок на частицах субстрата и интенсивное окрашивание КЖ цветными интермедиатами. Такими свойствами обладали бентосные микробоценозы, сформировавшиеся в зоне влияния р. Сунгари. Адгезивная способность у планктонных микробных комплексов не выявлена. Показано, что образование токсичных цветных продуктов стимулировало продуцирование бактриобентосом защитного слизистого полимерного матрикса. Изменение абиотических и биотических факторов оказывало существенное влияние на спектр образуемых токсичных продуктов. Так, при трансформации нафталина и фенантрена было отмечено образование диметилбензолов (м- и п- 68 ксилолы), они накапливались в КЖ независимо от местообитания бактериобентоса. Причем при трансформации нафталина при низкой температуре, доминировали м- и п-ксилолы. Экспериментальное моделирование процессов трансформации нафталина позволило выявить вероятность образования в природных условиях целого комплекса метилированных производных бензола (Рисунок 16). Рисунок 16. Идентификация продуктов трансформации нафталина: 1,5– бактериобентос из разных местообитаний (выше и ниже устья р. Сунагри) при 23ºС; 24, 26–то же при 2ºС; 2,6–то же в присутствии пептона при 23ºС; 25,27–тоже в присутствии пептона при 2ºС. Максимальное содержание метилбензола (толуола) было отмечено при трансформации нафталина в присутствии дополнительного источника углерода (0,2% пептона) при 23ºС с участием бактериобентоса, испытывающего хроническое загрязнение в зоне влияния реки Сунгари. Характер трансформации фенантрена пленками бактериопланктона из различных местообитаний зависел от условий присутствия ко-фактора (пептона) и NaCl (Рисунок 17). температурного режима, 69 Например, при низкой температуре в результате роста МК из проб воды, отобранных ниже устья р. Сунгари (ph 8), в КЖ накапливался нафтотиофен. При имитации в модельных условиях летнего евтрофирования (присутствие азотсодержащих ОВ), то же самое сообщество микроорганизмов формировало БП без образования нафтотиофена (ph 7). Рисунок 17. Продукты трансформации фенантрена микробоценозами из разных местообитаний: выше устья р. Сунгари (ph 7) – культивирование при 23°C, в присутствии пептона и NaCl; ниже устья р. Сунгари (ph 8) – при 2°C с добавлением пептона; Нижний Амур (ph 9) – культивирование при 23°C, на фенантрене, (ph 10) – то же с добавлением пептона, (ph 11) – то же с добавлением пептона и NaCl. В аналогичных условиях МК из проб воды, отобранных на Нижнем Амуре, также были способны к трансформации фенантрена с образованием этого интермедиата (ph 9, 10, 11). Экспериментальные данные свидетельствует о том, что при участии биопленок механизмы трансформации ПАУ и образующиеся продукты существенно изменяются при смене экологических условий и адаптационного 70 потенциала МК к загрязнению. В зимний период при загрязнении водных экосистем гидрофобными углеводородами существует риск образования метилированных производных бензола. Выводы 1. На примере микробных комплексов р. Амур показано, что трансформация ПАУ определяется влиянием различных абиотических и биотических факторов (температура, местообитание микробоценозов, степень растворимости ароматических углеводородов). 2. Наиболее активная трансформация фенантрена с образованием цветных продуктов происходила при температуре 23°C и переходном режиме 2-23°C, при участии МК, адаптированных к загрязнению ПАУ ниже устья реки Сунгари. На нафталине бентосные МК развивались без образования цветных продуктов и слизистых биопленок, наиболее активная трансформация с разрыхлением частиц субстрата зафиксирована при участии МК, развивающихся вне зоны влияния стока р. Сунгари при температуре 2°C и 23°C. 3. В трансформации гидрофобных ароматических углеводородов принимают участие МК, обладающие адгезивной активностью по отношению к нерастворимым частицам субстрата и выделяющие экзогенные ферменты. Образование биопленок активизируется на ПАУ, обладающих меньшей растворимостью в воде. 4. Трансформация нафталина и фенантрена микробными комплексами из различных местообитаний, производных экологического бензола, происходит которые риска могут с образованием выступать для в метилированных качестве факторов гидробионтов. 71 ГЛАВА 4. ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕДПОСЫЛКИ ОБРАЗОВАНИЯ БИОПЛЕНОК В ЖЕЛЕЗОСОДЕРЖАЩИХ ПОДЗЕМНЫХ ВОДАХ Подземные воды (ПВ) представляют собой сложную многокомпонентную систему, формирующуюся под влиянием многочисленных природных и антропогенных факторов. В подземных водах кроме макрокомпонентов (Cl-, HCO3+, SO42-, Na+, Mg2+, Ca2+ и др.) в заметных количествах могут содержаться ионы H+, NO3+, NO2+, H3SiO4-, Fe2+, Fe3+, Mn2+; сульфидные соединения H2S и HS-, органические вещества, газы, микроорганизмы (Кулаков, Кондратьева, 2008). ПВ многих регионов часто характеризуются повышенным содержанием соединений железа и марганца. В подземных водах суммарное содержание ионов железа может изменяться от от 1 до 20 (иногда до 40) мг/л (Крайнов и др., 2004). Миграция и накопление соединений железа в подземных водах обусловлены внешними (геолого-литологические, гидрогеологические, геохимические и пр.) и внутренними факторами, обеспечивающими гидрогеохимические особенности этого элемента, важнейшие из которых: a) переменная валентность и образование малорастворимых соединений со многими анионами подземных вод (Fe(OH) 3, Fe(OH)2, FeCO3, FePO4 и др.); б) окисление Fe2+ с последующим гидролизом Fe3+ + 3ОН- → Fe(OH)3 и образованием малорастворимого гидроксида Fe(OH)3; в) образование ионами железа устойчивых комплексных соединений с органическими веществами гумусового ряда, что способствует их накоплению в ПВ в концентрации, во много раз превышающей ПДК (Казак, 2010). Концентрация ионов марганца в подземных водах изменяются от следовых количеств до 2-3 мг/л. В природном круговороте марганца участвуют ионы Mn2+, Mn3+, Mn4+. При биологическом окислении Mn2+ превращается в Mn3+ и затем снова восстанавливается в Mn2+. Окислительная способность ионов с высокой валентностью возрастает при увеличении кислотности среды (Иванова и др., 2014). 72 4.1 Роль микроорганизмов в миграции ионов железа Трансформация форм железа в подземных водах происходит в результате биохимических процессов при участии различных физиологических групп микроорганизмов. Среди них огромную роль играют железомарганцевые бактерии (ЖМБ), отлагающие на своих поверхностях окислы железа и (или) образующие его оформленные осадки (Кармалов, Филимонова, 2011). Типичным представителем одноклеточных железобактерий является Gallionella. Бактерии этого рода представляют собой слегка изогнутые бобовидные клетки, от вогнутой стороны которых отходят длинные переплетенные «стебельки», хорошо различимые при микроскопировании. В состав стебелька входят соединения железа в аморфном состоянии и органическое вещество. Gallionella способна расти на минеральной среде без органических веществ, получая энергию в результате окисления закисного железа (Квартенко, Говорова, 2013). Leptothrix – нитчатый микроорганизм. Наиболее распространенный вид данного рода – L. ochracea. Окисляя закисное железо, он выделяет гидроокись железа, которая откладывается на поверхности клеток. При этом образуется типичный слизистый чехол, который препятствует сообщению клеток с внешней средой. Когда чехол становится достаточно плотным, клетки погибают или покидают его. Освободившиеся клетки имеют жгутики и поэтому подвижны. Покинув старый чехол, они приступают к выработке нового. У представителей рода Leptothrix окисление двухвалентных соединений железа связано с выделением перекиси водорода в метаболических процессах при окислении ОВ. Отложение гидроокиси железа на поверхности клеточных структур в чехлах происходит в результате взаимодействия перекиси водорода с ионами Fe2+. Для Crenothrix характерны коническая форма чехла и прикрепление к субстрату узким концом. Гидроксиды железа откладываются только у основания. Деятельность Arthrobacter связывают с окислением и разложением органоминеральных комплексов, например соединений железа с гумусовыми веществами (Costerton et al., 1995). В подземных водах наряду с процессами 73 окисления и осаждения ионов железа идут противоположные процессы восстановления и растворения его соединений (Непомнящая и др., 2010). Микробное восстановление соединений трехвалентного железа (Fe3+) является основным путем окисления ОВ. Особенностью Fe3+ как акцептора электронов, является то, что он превалирует в водной среде и его основная часть в осадках находится в твердой нерастворенной форме (оксиды – гетит, лимонит, гематит, магнетит; гидроксиды – ферригидрит, аморфные оксигидроксиды и др.) (Lovley, 1991; Slobodkin et al., 1999). В работе французских ученых показано, что Fe3+ часто является акцептором электронов для микробиологического дыхания в подземных средах и донных отложениях. Различные виды микроорганизмов (Geobacter, Desulfuromonas, Geothrix fermentants, Rhodoferaх ferrireducens sp. nov. и др.) утилизируют органическую составляющую, которая является донором электронов и восстанавливают трехвалентное железо, являющееся акцептором электронов (Nevin, Lovley, 2002; Finnerant et al., 2003). В результате окисления или восстановления соединений железа различными видами микроорганизмов в подземных водах возникают проблемы, связанные с процессами кольматажа скважин и порового пространства водоносного горизонта, а также коррозии металлического оборудования водозаборных сооружений (Абакумов и др., 2009). Поэтому изучение основных предпосылок формирования биопленок в железосодержащих подземных водах является одной из актуальных задач. 4.2 Физиолого-биохимические характеристики штаммов, выделенных из биопленок Важным фактором, влияющим на формирование биопленок, является способность микроорганизмов продуцировать полимерные соединения, позволяющие им закрепляться на различных поверхностях. Эта способность обеспечивает физиологическую и функциональную стабильность микробной 74 пленки и, следовательно, является залогом конкурентного выживания в различных экологических нишах (Costerton, 2007). Помимо слизистого матрикса защитную функцию выполняет каталазная активность микроорганизмов – способность защитить себя от воздействия перекиси водорода (Stewart et al., 2000). Данный фермент катализирует реакцию расщепления перекиси водорода на воду и кислород. Функция каталазы состоит в защите микроорганизмов от слишком высоких концентраций токсичной перекиси водорода. Каталаза не только внутриклеточный фермент, она также активно выделяется микроорганизмами в среду их обитания и, обладая высокой устойчивостью, может накапливаться и долгое время сохраняться в ней. По данным некоторых авторов, активность этого фермента в подземных водах является показателем антропогенного загрязнения и токсикологической ситуации, а также индикатором интенсивности процесса деструкции органических веществ (Коптева и др., 2009; Олейник, Старосила, 2013). Из биомассы биопленок (БП-5, БП-6, БП-7, БП-8, БП-9), сформировавшихся в скважинах пилотной установки Тунгусского месторождения подземных вод, методом предельных разведений на агаризованных средах разного состава было выделено более 100 штаммов. К индикаторным группам бактерий, синтезирующим полимерный матрикс и наиболее часто встречающимся в БП, были отнесены штаммы, образующие перламутровые и палевые слизистые колонии, S- и R-форм. Была определена активность роста культивируемых представителей биопленок на агаризованных питательных средах с различной концентрацией азотсодержащих органических веществ (рыбо-пептонный агар – РПА и РПА разбавленный в 10 раз), а также способность этих бактериальных штаммов к синтезу слизистых полимерных соединений (СПС). Качественное определение каталазы проводили на предметных стеклах с использованием биомассы 3-х суточной культуры, выросшей на РПА:10 согласно тесту на каталазу 20.1.12 (Герхардт, 1983) и непосредственно при обработке выросшей биомассы биопленок на агаризованной среде. Разнообразие ответных 75 реакций некоторых штаммов, выделенных из БП, представлено в таблице 7. Многие микроорганизмы, входящие в состав биопленок, обладали высокой каталазной активностью независимо от характера роста при разных концентрациях азотсодержащих ОВ и синтеза СПС. Таблица 7. Характеристика некоторых штаммов из биопленок подземных вод. Биопленка Штаммы БП-5 БП-6 5-1 5-2 5-3 5-4 5-5 5-6 6-1 6-2 6-3 6-4 6-5 6-6 6-7 6-8 6-9 6-10 6-11 6-12 6-13 6-14 6-15 6-16 6-17 6-18 6-19 РПА:10 СПС РПА СПС Каталазная активность ++ ++ +++ +++ +++ +++ + ++ + ++ + ++ ++ ++ ++ ++ + +++ ++ + + ++ ++ ++ ++ +++ +++ +++ - ++++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++++ ++ ++++ ++++ ++++ + +++ +++ +++ ++ +++ +++ +++ ++++ ++++ +++ ++ +++ - ++ ++++ +++ ++ ++ + ++ +++ ++ ++ ++ +++ ++ ++ ++ ++ +++ +++ 76 Продолжение таблицы 7. 7-3 + +++ +++ 7-4 + +++ ++++ ++ 7-5 ++ ++ +++ +++ 7-6 ++ +++ ++++ 7-7 ++ +++ ++ 7-8 ++ +++ + БП-7 7-9 ++ + +++ 7-10 ++ ++ 7-11 ++ +++ +++ 7-12 ++ +++ ++ 7-13 ++ ++++ + 8-1 + + +++ 8-2 + +++ + 8-3 + + +++ 8-4 + 8-5 +++ + +++ +++ 8-6 + БП-8 8-7 + ++ + 8-8 + ++ 8-9 + + ++ 8-10 ++ +++ ++++ 8-11 ++ +++ ++ 9-1 +++ +++ 9-2 +++ +++ +++ 9-3 ++ +++ 9-5 +++ +++ + БП-9 9-6 ++ +++ ++ 9-7 +++ ++ +++ + 9-8 ++ ++ ++ 9-10 +++ ++++ +++ + Примечание: (+, ++, +++, ++++) – интенсивность роста, слизеобразования и каталазной активности штаммов, (-) – отсутствие показателя. 77 На рисунке 18 представлен микробный консорциум из биопленки БП-5, культивированный на агаризованной питательной среде РПА:10. При обработке биомассы БП 3% Н2О2, наблюдали ее активное разложение с выделением кислорода. За счет интенсивного газообразования происходило диспергирование слизи и образование хлопьев. После их удаления и промывки биопленки дистиллированной водой, оставшиеся колонии вновь проявляли каталазную активность при повторной обработке Н2О2. В результате экзогенной реакции разложения Н2О2 наблюдали появление мелких трещин и нарушение однородности агаризованной среды. Рисунок 18. Активность консорциума из биопленки БП-5 до обработки 3 % перекисью водорода, через 1 минуту после обработки, через 5 минут после обработки. Среди 120 штаммов микроорганизмов, выделенных из биопленок, сформированных при участии МК подземных вод, каталазной активностью обладало более 75%. Микроорганизмы, входящие в состав биопленок БП-5, БП-8, БП-9 утилизировали как высокие, так и низкие концентрации органических веществ. Высокие концентрации ОВ провоцировали рост штаммов, выделенных из выросшей биомассы биопленок БП-6 и БП-7. У большинства штаммов отмечали слабое слизеобразование, возможно, это объясняется тем, что интенсивное формирование СПС возникает при активизации механизмов кооперации клеток и 78 начала бактериальной адгезии, а также под воздействием различных стрессфакторов. Стоит отметить, что практически в каждом сообществе биопленки (кроме БП-5) присутствовали фенолрезистентные бактерии, развивающиеся на агаризованной среде с фенолом. Это может быть связано со способностью микроорганизмов трансформировать гуминовые вещества, в структуру которых входят фенольные группы. Полученные данные железосодержащих свидетельствуют подземных вод о том, что сформированы биопленки, из разнообразными микроорганизмами, которые отличаются своими «пищевыми» потребностями и защитными механизмами, включая синтез СПС, продуцирование каталазы и фенолоксидазы. Это свидетельствует о способности микробоценозов адаптироваться и стабильно развиваться в постоянно изменяющихся условиях окружающей среды, а также проявлять защитные реакции в ответ на появление стресс-факторов. 4.3 Образование биопленок в присутствии органических веществ и Fe(OH)3 При изучении процессов зарастания порового пространства и кольматации скважин на водозаборах железосодержащих подземных вод долгое время мало уделялось внимания инициирующим факторам начала формирования биопленок. Многие авторы неоднократно подчеркивали недостаточную изученность биогеохимических процессов в водоносных горизонтах, хотя были убеждены в том, что цикл железа, неразрывно связан с преобразованием ОВ (Менча, 2006; Бондарева, 2009; Кармалов, Филимонова, 2011; Bhattacharyya et al., 2013). Одна из задач наших исследований состояла в определении ведущих факторов, инициирующих микроорганизмов железосодержащих подземных вод к адгезии и формированию биопленок. В модельном эксперименте были использованы сформировавшаяся биопленка (БП-8) из скважины пилотной установки Тунгусского месторождения и штамм Caulobacter sp. Т-20, выделенный из БП-8, наряду с другими штаммами, который отличался от них повышенной 79 активностью образования СПС на обедненных питательных средах и яркой пигментацией колоний. Известно, что представители рода Caulobacter широко распространены при температуре 7-8ºС в подземных водах с низким содержанием питательных веществ, дефицитом кислорода, но богатых ионами железа (Mazzon et al., 2008). В модельном эксперименте использовали несколько вариантов культивирования микроорганизмов: I вариант - жидкая среда Бромфильда + ДЭ (0,1г/л); II вариант - жидкая среда Бромфильда + Fe(OH)3 (5 г/л); III вариант жидкая среда Бромфильда + ДЭ+ Fe(OH)3 (в тех же концентрациях). Частицы гидроксида железа выступали в роли субстрата для адгезии бактериальных клеток или центра их иммобилизации для формирования биопленок. В качестве источника азота, углерода и других компонентов для роста и развития микроорганизмов использовали дрожжевой экстракт (ДЭ), который представляет собой сложную смесь ОВ из предварительно гидролизованных или подвергшихся автолизу дрожжевых клеток. В нашем случае ДЭ имитировал поступление автохтонных природных органических веществ в водную среду в результате сукцессии микробных комплексов и лизиса бактериальных клеток. Предварительно из биопленки было выделено 13 штаммов, которые исследовали на способность синтезировать СПС при росте на азотсодержащих органических веществах: рыбо-пептонном агаре (РПА) и на РПА разбавленном в 10 раз (таблица 8). Выделенные бактерии можно условно разделить на две группы: первая образует слизистый матрикс на богатых питательных средах, вторая – при более низком содержании ОВ. Так, сообщество биопленки обеспечивает себя запасным источником питания, путем образованием слизистого матрикса для сохранения своей структуры независимо от количества органических веществ в окружающей среде. Комплексная смесь органических веществ (ДЭ) в присутствии и без Fe(OH)3 оказывала определяющее влияние на образование биопленок и адгезивную активность микроорганизмов (Литвиненко, 2013). 80 Таблица 8. Характер роста штаммов, выделенных из БП -8 (через 7 суток). Рост на РПА Рост на РПА:10 № штамма Интенсивность Образование Интенсивность Образование роста СПС роста СПС 1 ++++ ++ ++ 2 ++ +++ 3 ++ ++ 4 5 ++ ++ 6 +++ ++ 7 +++ +++ 8 +++ ++ +++ 9 ++ ++ 10 11 +++ +++ 12 +++ ++ Caulobacter + +++ sp. Т-20 Примечание: (+, ++, +++, ++++) – интенсивность роста или + ++ ++ ++ ++ +++ образования слизи, (-) – отсутствие показателя. В модельном варианте I при культивировании БП-8 формировались бурые слизистые биопленки и происходила интенсивная адгезия на стекле. В варианте (II) в присутствии Fe(OH)3 наблюдали слабую обратимую адгезию, после встряхивания тонкие темно-бурые биопленки отделялись от стекла. Сочетание органических веществ и Fe(OH)3 в варианте III стимулировало образование крупных БП, которые формировались вокруг частиц гидроксида железа. В этом случае адгезия на стекле отсутствовала. В вариантах II и III с Fe(OH)3 через 60 суток культивирования БП-8 в слизистой биомассе были отмечены черные вкрапления, образование которых может быть связано с бактериальным восстановлением Fe(OH)3 до сульфидов железа. Наиболее существенные изменения в характере роста происходили в вариантах с сообществом биопленки (БП-8) на 14 и 28 сутки (таблица 9). 81 Таблица 9. Характер роста, образование биопленок и адгезия микроорганизмов в Штамм (Caulobacter sp.Т-20) Характеристики роста Адгезия Биопленка (БП-8) Адгезия Вариант среды присутствии Fe(OH)3. Характеристики роста 14 суток I + Темные хлопья в толще КЖ, рост БП на дне (+) II - Сорбция Fe(OH)3 на БП, рост БП на дне (++) - III - Сорбция Fe(OH)3 на БП, рост БП на дне (+++) - - Гомогенный рост в толще КЖ, БП нет (-) Светлые хлопья, БП и сорбции Fe(OH)3 нет Гомогенный рост в толще КЖ, БП и сорбции Fe(OH)3 нет (-) 28 суток I ++ Темные хлопья в толще КЖ, рост БП на дне (+) II + Сорбция Fe(OH)3 на БП, рост БП на дне (++) - III - Сорбция Fe(OH)3 на БП, рост БП на дне (+++) - - Гомогенный рост в толще КЖ, БП нет (-) Светлые хлопья, сорбции Fe(OH)3 нет, рост БП на дне (+) Гомогенный рост в толще КЖ, БП и сорбции Fe(OH)3 нет (-) 60 суток I ++ Темные хлопья в толще КЖ, рост БП на дне (+) - Гомогенный рост в толще КЖ, БП нет (-) Сорбция Fe(OH)3 на БП, рост БП и сорбции Fe(OH)3 нет (-) БП на дне (+) Сорбция Fe(OH)3 на БП, рост III БП и сорбции Fe(OH)3 нет (-) БП на дне (++) Примечание: БП – биопленки; КЖ – культуральная жидкость; (+, ++, +++) – II - интенсивность бактериальной адгезии на стекле или роста биопленок, (-) – отсутствие показателя. Это процесс мог стимулироваться сульфатредуцирующими бактериями при использовании серосодержащих аминокислот в метаболических процессах. 82 Комплексное сообщество из БП-8 в зависимости от абиотических условий, может изменять интенсивность адгезии. В присутствии нерастворимых тонкодисперсных частиц Fe(OH)3 происходило более активное взаимодействие с их поверхностью, по сравнению со стеклом. При отсутствии гидроокиси железа, можно было наблюдать более активную биосорбцию на стекле. Можно предположить, что потенциально сообщество биопленки, организовано так, что в зависимости от сложившихся условий, оно выбирает разные стратегии адгезии. Локальное образование сульфидов железа доказывает присутствие сульфатредуцирующих бактерий в структуре сообщества биопленки, которые также погружены в полимерный матрикс, определяющий формирование трехмерной структуры биопленки. Было показано, что полимерный матрикс, удерживает клетки в сообществе, обеспечивает их контакт и предохраняет от сил гидродинамического сдвига на поверхности раздела жидкость – твердое тело. Матрикс играет защитную роль, повышая устойчивость микробных клеток к неблагоприятным воздействиям (Стрелкова и др., 2013). Во всех вариантах эксперимента рост штамма Caulobacter sp., Т-20 был слабым, адгезия на стекле не зафиксирована (таблица 9). В вариантах со смесью органических веществ, присутствующих в ДЭ, отмечен гомогенный рост в питательной среде. Образование биопленок в этих двух вариантах отсутствовало. Только в варианте с добавлением Fe(OH)3 наблюдали образование небольших светлых хлопьев. Известно, что дрожжевой экстракт выступает хорошим стимулятором роста бактериальной биопленки, но по сравнению с другими ОВ (аминокислоты, триптон, крахмал, глюкоза), микроорганизмы используют его в меньших количествах (Moldoveanu, 2011). Возможно, в связи с этим развитие Caulobacter sp., Т-20 в эксперименте проходило не так интенсивно. Разница в развитии комплексной биопленки и отдельного штамма может быть обусловлена сложной структурой сообщества микроорганизмов, оптимально использующих все доступные источники питания и энергии. Такое «социальное 83 поведение» микроорганизмов из структурированной биопленки обеспечивает им защиту и позволяет выжить при минимуме питательных веществ (Николаев, Плакунов, 2007). Впервые дополнительная информация об этапах формирования биопленок была получена в результате анализа электронных изображений (электронного микроскопирования) и их элементного состава в отдельных локусах без предварительной минерализации (Кондратьева, Литвиненко, 2014). 4.4 Анализ электронных изображений и элементного состава биопленок Интенсивное образование полимерного матрикса (включающего СПС) происходило при участии БП-8 в варианте с ДЭ. На электронных изображениях легко различимы структурированные слизистые тяжи, много частиц включенных в полупрозрачное вещество (рисунок 19 А, B). В состав биопленки входили следующие элементы: C, O, Na, P, Ca, Mn, Fe, Mg, Si, S. Согласно элементному составу бактериальные клетки могли быть инкрустированы Fe(OH)3, кроме того на электронных изображениях хорошо видны разрыхленные остатки бактериальных чехлов из гидратов окиси железа (рисунок 19 C, D). Образование черных вкраплений в биопленке в вариантах II и III согласно культуральным характеристикам, было объяснено образованием сульфидов железа. Элементный состав биопленки подтверждает наличие в ее составе серы. Однако присутствие марганца дает основание сделать еще одно предположение, что в биопленке могла происходить аккумуляция и этого элемента (рисунок 20). 84 Рисунок 19. Электронное изображение биопленки БП-8 из различных вариантов культивирования: A, B – в присутствии ДЭ; C – в присутствии Fe(OH)3; D – Fe(OH)3 + ДЭ. Рисунок 20. Образование марганцевых структур в составе биопленки БП-8 через 60 суток. 85 Накопление окислов железа и марганца на поверхности бактериальных клеток — результат двух взаимосвязанных процессов: аккумуляции (поглощения) клетками этих металлов из раствора и окисления, сопровождающегося обильным отложением нерастворимых окислов на поверхности бактериальных клеток. Процесс аккумуляции металлов из растворов в основе имеет физико-химическую природу и в значительной мере обусловлен химическим составом и свойствами поверхностных структур клетки. Он включает связывание металлов с клеточной стенкой и выделения). ее внеклеточными Сорбционные структурами свойства (капсулы, поверхностных чехлы, клеточных слизистые структур определяются в большой степени суммарным отрицательным зарядом молекул, входящих в их состав. Поглощение металлов приводит к значительному концентрированию их вокруг клеток по отношению к среде (Квартенко, Говорова, 2013). В составе биопленки БП-8 после длительного культивирования были обнаружены крупные кальцинированные глобулы (рисунок 21). Рисунок 21. Образование кальцинированных глобул в составе БП-8 через 60 суток. Один из вариантов их образования связан с аккумуляцией на поверхности бактериальных клеток ионов кальция. Известно, что двухвалентные катионы кальция и магния увеличивают вязкость и эластичность биополимерного геля микробных пленок (Sutherland, 2001; Das et al., 2014). Поэтому выявленные образования в составе биопленки также могут выступать в качестве предпосылки 86 для биокольматажа скважин и/или порового пространства водоносного горизонта в зависимости от места ее формирования. Через 60 суток культивирования БП-8 в варианте III образовался интенсивный бурый осадок, который можно было принять за осажденный гидроксид железа. Однако, как видно на электронном изображении, этот осадок представлен слизистой массой, состоящей из клеток различной морфологии (рисунок 22). Рисунок 22. Электронное изображение осадка, полученного в результате культивирования БП-8 в присутствии Fe(OH)3. Можно предположить, что это часть клеток, которые развивались в толще питательной среды и не участвовали в формировании биопленки, они постепенно оседали на дно, формируя биомассу инкрустированную ионами различных элементов, в том числе ионами железа и марганца. Возможно, что таким образом могли образовываться железо-марганцевые конкреции в палеогидросфере при участии первичных микробных комплексов. В эксперименте со штаммом Caulobacter sp., Т-20 бактериальные овальные клетки с ровной поверхностью присутствовали только в вариантах с ДЭ. Они 87 характеризовались богатым элементным составом (С, O, Ca, P, Mn, Na, Cu, S, K, N, Si, Mg, Sr). Исследование элементного состава некоторых структурных образований (рисунок 23), обнаруженных методом электронного сканирования в составе биомассы Caulobacter sp., Т-20 после культивирования на ДЭ показало, что все они в своем составе содержат такие химические элементы, как углерод, кислород, марганец и железо с различными концентрационными вариациями (таблица 10). Например, присутствие азота в склеенных овальных структурах (спектр 2), дает основание предположить, что это действительно бактериальная клетка. На ее долю приходилось высокое содержание аккумулированных ионов марганца и железа. Среди всех структур выделялись «микросферы» со сложным элементным составом (спектр 7), в которой дополнительно содержались кремний, свинец и магний. Для сравнения был использован элементный состав мелких частиц (спектр 6), который представлен гидроокислами железа, где марганец отсутствовал. Рисунок 23. Электронное изображение биомассы штамма Caulobacter sp.,Т-20 при культивировании с дрожжевым экстрактом 88 Таблица 10. Элементный состав биомассы штамма Caulobacter sp., Т-20. № спектра 1 2 3 4 5 6 7 Fe 19,40 20,86 18,60 19,23 20,80 19,36 5,13 Mn 0,26 0,30 0,27 0,25 0,22 0,17 O 61,79 58,97 61,81 61,56 57,85 59,58 69,22 Атомное соотношение (%) C Al N Ca 18,55 15,83 0,90 3,14 19,31 18,96 21,06 0,07 21,06 12,05 1,21 Si 8,68 Pb 0,08 Mg 1,9 Электронные изображения бактериальной массы Caulobacter sp., Т-20, развивающегося в присутствии гидроксида железа (варианты II и III) наглядно демонстрируют инкрустирование Fe(OH)3 на поверхности клеток (рисунок 24 А, B). Рисунок 24. Электронное изображение Caulobacter sp., Т-20 в разных условиях культивирования: A) - без органических веществ; B) – с внесением ДЭ и Fe(OH)3. Возможно, что избыток Fe(OH)3, его сорбция на поверхности клеток тормозят деление и препятствуют их диспергированию в культуральной жидкости. Поэтому представленного мы наблюдали конгломератами слизистых биопленок. Содержимое интенсивное образование осадка, бактериальных клеток, без образования этого осадка было представлено богатым элементным составом: С, O, Ca, K, S, Al, Zr, Cu, Cr, Mn и Fe. Исследование 89 спектров отдельных структур показало, что в состав бактериальных клеток, в том числе собранных в «пакеты» входила сера. Практически все структурные образования содержали кальций. Разница в развитии комплексной биопленки и отдельного штамма может быть обусловлена видовым многообразием микроорганизмов, которые являются более резистентными к воздействию неблагоприятных факторов. Такое «социальное поведение» бактерий из биопленки обеспечивает им защиту и позволяет выжить при минимуме питательных веществ (Квартенко, Говорова, 2013). В результате длительного культивирования структурированного сообщества происходило дальнейшее восстановление Fe(OH)3, что подтверждается изменением окраски его частиц до бурого и черного цвета. В отдельных локусах БП-8 доминировали элементы Fe и S. Это может быть связано с активизацией процессов сульфатредукции и образованием сульфида железа (предшественника пирита). Аналогичные процессы могут происходить в поровом пространстве in situ, в результате которых складываются предпосылки для кольматации скважин на водозаборах подземных вод. Выводы 1. Микробное окисление органических веществ за счет восстановления Fe(OH)3 сопровождалось образованием биопленок в вариантах с более сложным сообществом микроорганизмов, которые наиболее активно восстанавливали гидрат окиси железа. Это подтверждается изменением окраски осадка от охристого до темно-бурого или черного цвета, обусловленного образованием сульфида железа и/или аккумуляцией четырехвалентного марганца. 2. Каталазная активность, обнаруженная у большинства штаммов, входящих в состав биопленки, не зависела от характера слизеобразования и концентрации азотсодержащих веществ в питательной среде. 3. Различные химические элементы, выявленные в составе биопленок (Fe, Ca, Mn), оказывают «цементирующий эффект» и играют значительную роль в укреплении биопленок. 90 ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ НА ОБРАЗОВАНИЕ БИОПЛЕНОК В ПОДЗЕМНЫХ ВОДАХ Подземные воды в Приамурье характеризуются особенностями природного формирования химического состава (высокое содержание растворенных соединений железа и марганца) и существующими рисками загрязнения геологической среды органическими соединениями в результате развития бытовой и производственной инфраструктуры (Кулаков, 2011; Кулаков и др., 2012). Органические вещества являются важными регуляторами образования биопленок в подземной гидросфере, независимо от их строения и генезиса. Главную функцию выполняют бактериальные клетки, способные к синтезу слизистого матрикса, объединяющего все сообщество в единое целое и обеспечивающего защиту от неблагоприятных факторов окружающей среды. В результате окисления Fe2+ происходит образование осадка, заохривание (процесс химического и микробиологического отложения трудно растворимых соединений железа, марганца и других химических элементов) и отложение различных соединений в водопроводах, которое может привести к кольматации порового пространства водоносного горизонта и снижению эффективности подачи воды (Walter, 1997; Cullimore, 1999; Менча, 2006). 5.1 Загрязнение подземных вод органическими веществами Наблюдения за изменением качества природных вод, проведенные в последние десятилетия, свидетельствуют об общей тенденции к его снижению. Важным аспектом сохранения высокого качества поверхностных и подземных вод, является предотвращение их загрязнения органическими веществами различного строения и генезиса (Кондратьева, 2005). Органические вещества, содержащиеся в природных водах, подразделяются на автохтонные, образующиеся в результате жизнедеятельности и распада водных организмов и растений, и аллохтонные, поступающие извне с атмосферными 91 осадками, хозяйственно-бытовыми и техническими сточными водами. К основным загрязнителям относятся ионы аммония, нитрит- и нитрат-ионы, углеводороды различного строения и происхождения. Вместе с природными соединениями железа и марганца, сероводородом, гуминовыми комплексами они усложняют процессы водоподготовки (Matilainen et al., 2010). Быстро подвергаются разложению водорастворимые формы органического азота (NОВ), которые могут поступать в природные воды от хозяйственнобытовых источников и в результате биохимических процессов, связанных с циклами углерода и азота. Органический азот представлен продуктами разложения животных, растительных белков и микробиальной биомассы: низкомолекулярными пептидами и аминокислотами (Lee et al., 2006). Среди соединений природного происхождения особое место занимают гуминовые вещества (ГВ), которые представляют собой сложные смеси биологически устойчивых, высокомолекулярных соединений, обладающих повышенной комплексообразующей способностью. Они содержатся во всех природных водах, где происходят процессы биотрансформации органических остатков (Перминова, Жилин, 2004; Van Zomeren et al., 2008), а также участвуют в инактивации токсичных металлов (Моисеенко, 2011). В подземных водах растворенный органический углерод варьирует в концентрационных пределах от 0,2 до 15 мг/л. Гуминовые вещества составляют до 90% органического углерода (РОУ), поступающего в ПВ от растворенного с поверхностным инфильтратом, либо в результате биогеохимических процессов, происходящих в водоносном горизонте (ВГ). В большинстве случаев в подземных водах с низким содержанием РОУ (0,2-1 мг/л) ГВ образуются в результате взаимодействия микроорганизмов с органогенными породами в водоносных горизонтах. Стоит отметить, что даже при низких концентрациях ГВ, их биодеградация влияет на функционирование экосистем подземных вод и на химический состав воды (Thurman, 1985; Young, 2004). Хотя ГВ представляют собой смесь макромолекул переменного состава и 92 нерегулярного строения с высокой степенью устойчивости к разложению, они подвергаются микробиологической трансформации. Сорбция микроорганизмов на частицах гуминовых веществ с высокой молекулярной массой выступает в качестве предварительного шага, предшествующего их ферментативному расщеплению, гидролизу и дальнейшей утилизации. Ключевыми факторами при этом выступают способность микроорганизмов продуцировать внеклеточные полимеры и присутствие двухвалентных катионов, в том числе кальция и магния (Esparza-Soto, Westerhoff, 2003; Rodrigues, 2010; Goode, Allen, 2011). Дальнейшая судьба ГВ зависит от присутствия низкомолекулярных органических кислот, гидрофобности биополимеров и различных элементов, образующих с ними подвижные хелатные комплексы (Huber et al., 2011). В этом отношении значимое место занимают ионы железа, образующие коллоидные соединения с ГВ в природных водах (Перминова, 2008) и в процессе водоподготовки (Букреева и др., 2009; Шиян и др., 2013). В результате преобразования органических соединений в водных средах и на разделе фаз вода-порода микроорганизмы способны образовывать биопленки. Установлено, что внеклеточные полимерные вещества, включая СПС, производятся в основном в экспоненциальной фазе и служат в дальнейшем источником углерода и энергии, также они определяют внешнюю и внутреннюю структуру БП, поддерживают их целостность (Sutherland, 2001). Формирование биопленок контролируется комплексом взаимосвязанных физических, химических и биологических процессов (Fang et al., 2009; Flemming, 2011; Пуриш и др., 2012). Смена физико-химической обстановки может повлиять на качественные и количественные перестройки в подземных микробных комплексах (МК), которые способны привести к биообрастанию порового пространства вокруг водозаборных скважин и самих скважин, а также к ухудшению качества подземных вод (Кармалов, Филимонова, 2011; Singh, 2006). Процессы, связанные с появлением и эволюцией биопленки при многофакторных условиях очистки воды, в том числе при периодической обратной промывке, до 93 сих пор остаются недостаточно изученными, находятся в состоянии неопределенности и во многом зависят от предварительных экспериментальных проверок (Gilbert et al., 2013). 5.2 Сезонная динамика численности физиологических групп в подземных водах В связи с тем, что формирование биопленок в значительной степени определяется присутствием ОВ и количеством микроорганизмов в подземных водах, нами была определена численность культивируемых физиологических групп микроорганизмов, принимающих участие в формировании качества воды в разных слоях водоносного горизонта: 2-1 (глубина 26 м); 2-2, 5-2 (глубина 36 м); 2-3 (глубина 47 м). Существенный вклад в разнообразие МК верхнего слоя водоносного горизонта вносили железомарганцевые бактерии (ЖМБ), образующие на среде Бромфильда различные морфотипы колоний. С глубиной увеличивалась численность аммонифицирующих бактерий (АМБ), предпочитающих NОВ. Максимальная численность нитрифицирующих бактерий была характерна для среднего слоя ВГ (скважина 2-2) (рисунок 25). Рисунок 25. Численность культивируемых микроорганизмов в разных слоях водоносного горизонта, ноябрь 2011 г. (АМБ – аммонифицирующие бактерии, НБ – нитрифицирующие бактерии, ФРБ – фенол резистентные бактерии, ЖМБ – железомарганцевые бактерии. 94 Максимальная численность фенолрезистентных бактерий (ФРБ) была установлена в нижнем ВГ (скважина 2-3). Это может быть связано с трансформацией ГВ в подземных водах до водорастворимых фенольных соединений или присутствием ароматических углеводородов. Микроорганизмы, адаптированные к ароматическим соединениям, как правило, активно развиваются на средах содержащих фенол, причем некоторые микроорганизмы способны образовывать биопленки в присутствии фенольных кислот (Jagani et al., 2009; Lemos et al., 2014). В этом случае ФРБ могут выступать в качестве индикаторов загрязнения ПВ гуминовыми веществами и ароматическими углеводородами. Сезонные микробиологические исследования подземных вод показали, что увеличение численности ФРБ в теплый период года происходило на всех уровнях ВГ (рисунок 26). Сравнительно высокая численность АМБ в верхнем ВГ (2-1) была установлена во все сезоны года. В весенний период в верхнем и среднем слоях ВГ (2-1, 2-2) преобладали нитрифицирующие бактерии. Такие перестройки МК подземных вод, прежде всего, обусловлены поступлением ОВ с поверхностным стоком. В присутствии азотсодержащих ОВ возрастает роль бактерий, участвующих в цикле азота (аммонификаторы-нитрификаторыденитрификаторы). При дефиците кислорода в нижних слоях ВГ существуют предпосылки для интенсификации процессов денитрификации. Это значит, что независимо от окислительно-восстановительных условий в железосодержащих подземных водах могут происходить активные процессы микробиологической трансформации NОВ. Увеличению численности микроорганизмов в нижних слоях водоносного горизонта могут способствовать автохтонные и аллохтонные ОВ. Они образуются в результате нескольких взаимосвязанных микробиологических процессов, происходящих в водоносном горизонте: образование биомассы бактерий при утилизации разных групп ОВ, поступивших в результате инфильтрации и вторичное выделение ОВ в водную среду продуктов жизнедеятельности МК , а также при лизисе бактериальных клеток. 95 Рисунок 26. Сезонная динамика численности отдельных физиологических групп в разных слоях водоносного горизонта, 2012 г. (обозначения как в рисунке 25). 96 5.3 Особенности роста микробоценозов из подземных вод на пептоне и гуминовых веществах Как было отмечено в главе 1, продуктивность и активность микробоценозов определяется, в первую очередь, количеством и биохимическим составом органических веществ. Поэтому при экспериментальном изучении особенностей формирования биопленок в железосодержащих подземных водах были использованы легкодоступные (пептон) и трудноминерализуемые источники углерода (гуминовые вещества). Варианты эксперимента отличались не только качественным составом ОВ, а также присутствием или отсутствием растворимых солей двухвалентного железа: I вариант – минеральная среда Бромфильда (СБ) +5 г/л FeSO4 +2 г/л пептона; II вариант – СБ+5 г/л FeSO4 +0,025 г/л препарата гуминовых веществ; III вариант – СБ + 2 г/л пептона (П); IV вариант – СБ + 0,025 г/л ГВ. В качестве инокулята были использованы пробы воды из разных скважин пилотной установки Тунгусского месторождения подземных вод, отдельные штаммы и БП-8. Визуальный анализ бактериальной адгезии и формирования БП в присутствии разных по доступности ОВ был проведен на примере 28 стекол обрастания на 7 и 30 сутки. В конце эксперимента производили высев КЖ методом предельных разведений на агаризованные питательные среды (РПА, РПА-10, КАА и Мф). Проведенные исследования показали, что на характер развития МК существенное влияние оказало внесение быстро метаболизируемых азотсодержащих ОВ (таблица 11, 12). Наиболее активный рост в толще культуральной жидкости был установлен при культивировании комплексного микробоценоза биопленки БП-8 на пептоне в присутствии FeSO4, а на гуминовых веществах рост был слабее. Штамм Pseudomonas sp. также как и микроорганизмы БП-8 предпочитали сопровождался азотсодержащие образованием органические биопленок. На вещества, гуминовых их веществах рост они развивались слабо. Микроорганизмы из скважины 5-2 активно потребляли 97 легкодоступные органические вещества (вариант с пептоном в присутствии и без FeSO4), а на гуминовых веществах их активный рост был отмечен на 7 сутки. Однако в варианте ГВ+FeSO4 рост практически отсутствовал. Микробоценозы из скважины 2-1 уже на 7 сутки образовали биопленки в присутствии ГВ. Однако на 30 сутки активность их роста на гуминовых веществах снизилась, возможно, за счет накопления продуктов трансформации, а утилизация пептона активизировалась даже в присутствии FeSO4. Микробные комплексы из скважины 2-2 развивались менее интенсивно, по сравнению с МК из скважин 2-1 и 2-3. На 7 сутки отмечен рост на гуминовых веществах в присутствии FeSO4 без образования биопленок. На 30 сутки микробоценозы стали интенсивно использовать пептон в присутствии FeSO4. Активность по отношению к гуминовым веществам снизилась. Микроорганизмы из скважины 2-3 очень активно образовывали биопленки на разных органических субстратах, начиная с 7 суток. Активность микробных комплексов из группы скважин при различных условиях может свидетельствовать об их разнообразных потребностях, обусловленных поступлением ОВ в водоносный горизонт с инфильтрационными поверхностными водами. 98 Таблица 11. Развитие микроорганизмов при разных условиях на 7 сутки. Рост в толще КЖ № Микробные комплексы Образование биопленок пептон + FeSO4 ГВ + FeSO4 пептон ГВ пептон + FeSO4 ГВ + FeSO4 пептон ГВ 1 БП-8 ++++ ++ +++ ++ +++ - +++ - 2 Pseudomonas sp. ++++ + ++ + ++++ - ++ - 3 5-2 ++++ + +++ +++ + ++++ - ++++ + 4 2-1 + +++ ++ ++ + +++ - + 5 2-2 + ++ + + + - - + 6 2-3 + ++++ ++++ +++ + +++ ++++ + Примечание: (+, ++, +++, ++++) – интенсивность роста и образования биопленок, (-) – отсутствие показателя. 99 Таблица 12. Развитие микроорганизмов при разных условиях на 30 сутки. Рост в толще КЖ № Объект исследования Образование биопленок пептон + FeSO4 ГВ + FeSO4 пептон ГВ пептон + FeSO4 ГВ + FeSO4 пептон ГВ 1 БП-8 ++++ + ++ + ++++ ++ + + 2 Pseudomonas sp. +++ + ++ ++ +++ ++ - - 3 5-2 ++++ - +++ + ++++ - +++ + 4 2-1 ++++ + ++ + +++ +++ + + 5 2-2 ++++ + +++ - +++ - + + 6 2-3 +++ + ++ + +++ ++ +++ ++ Примечание: (+, ++, +++, ++++) – интенсивность роста и образования биопленок, (-) – отсутствие показателя. 100 В варианте II (ГВ+FeSO4) было установлено снижение активности роста, просветление культуральной жидкости за счет оседания биомассы и охристых частиц, вероятнее всего железо-гуматных комплексов. Важно подчеркнуть, что максимальную активность роста на гуминовых веществах и пептоне на 7 сутки проявляли микробные комплексы из нижних слоев водоносного горизонта (скважина 2-3). Известно, что микробные сообщества предпочитают гуминовые и фульватные комплексы, если они характерны для среды обитания (Yong, 2004). Интенсивное использование пептона в присутствии FeSO4 отмечено у микроорганизмов из БП-8, скважины 5-2 и штамма Pseudomonas sp. Самая слабая активность была отмечена у микробных комплексов из скважины 2-2. Учитывая, что многие виды гетеротрофных бактерий способны к росту при высоких и низких концентрациях ОВ, в конце эксперимента было проведено определение пищевой потребности сформировавшихся МК. Для этого на 30 сутки был проведен посев культуральной жидкости методом «штриха» на РПА, РПА:10, и на минеральную среду с фенолом. В результате адаптации к условиям культивирования произошли существенные перестройки в структуре бактериального сообщества, которые отразились на характере их роста (таблица 13). Так, высокие концентрации NОВ стимулировали рост микроорганизмов, предварительно культивируемых на пептоне с FeSO4. МК из верхних и нижних слоев водоносного горизонта (2-1, 2-3), утилизирующие ГВ в присутствии FeSO4 в дальнейшем росли как при высоких, так и при низких концентрациях NОВ. Микробоценозы из БП-8 и скважины 5-2 в варианте ГВ+FeSO4 не росли. Практически все представители МК, которые предварительно были культивированы в жидкой среде, содержащей ГВ и пептон оказались жизнеспособными при высоких и низких концентрациях азотсодержащих органических веществ (Литвиненко, 2014). 101 Таблица 13. Активность роста МК из подземных вод на агаризованных средах после предварительного адаптационного культивирования. Питательные I (П+ FeSO4) II(ГВ+ FeSO4) среды БП-8 РПА:10 ++ РПА Фенол РПА:10 РПА Фенол РПА:10 РПА Фенол РПА:10 РПА Фенол РПА:10 РПА Фенол РПА:10 РПА Фенол Примечание: ++ - Pseudomonas sp. ++ + +++ ++ 5-2 ++ +++ 2-1 ++ +++ ++++ +++ 2-2 + ++ +++ ++ 2-3 + ++++ ++++ ++++ +, ++, +++, ++++ – интенсивность III(П) IV(ГВ) +++ ++++ +++ - ++++ - ++ +++ - ++ +++ - +++ ++++ - ++++ ++++ - ++ ++++ - +++ ++++ - +++ ++++ - +++ +++ - ++ +++ ++++ ++++ роста МК, (-) – отсутствие показателя. Среди всех вариантов адаптационного культивирования ФРБ не были выявлены. Хотя, в подземных водах исследованных скважин в структуре сообщества эта индикаторная группа микроорганизмов присутствовала. Можно 102 предположить, что в условиях эксперимента бактерии утилизировали растворенные ГВ без образования фенольных соединений, и группа ФРБ постепенно была элиминирована. 5.4. Формирование биопленок микробоценозами подземных вод in vitro Анализ формирования слизистых БП на предметных стеклах показал, что бактерии из скважины пилотной установки 5-2, из трех скважин разных слоев водоносного горизонта (2-1, 2-2, 2-3), а также штамм Pseudomonas sp. вели себя так же, как и микроорганизмы, входящие в состав сформировавшейся биопленки (БП-8) (рисунок 27). Рисунок 27. Образование модельных биопленок на предметных стеклах при различном составе питательной среды (окраска по Граму): (I – П+ FeSO4; II – ГВ+FeSO4, III-П, IV – ГВ). 103 Наиболее активное образование БП происходило на пептоне, независимо от присутствия ионов железа. Следует подчеркнуть, что тонкие ярко выраженные биопленки на ГВ формировались без участия ионов железа независимо от места отбора проб воды. Поэтому есть основание предполагать, что процесс образования БП может активизироваться в обезжелезенной воде в присутствии гуминовых веществ. Такая ситуация может наблюдаться в околоскважинном пространстве, куда при откачке поступают воды при использовании внутрипластовой технологии обезжелезивания подземных вод. Спектр реакций, в которые могут вступать ГВ, очень широк. Благодаря карбоксильным, гидроксильным, карбонильным группам и ароматическим фрагментам гумусовые кислоты вступают в ионные, донорно-акцепторные и гидрофобные взаимодействия (таблица 14), поэтому они способны связывать различные классы экотоксикантов, образовывать комплексы с металлами и другими классами ОВ (Перминова, Жилин, 2004). Таблица 14. Химические свойства гуминовых веществ (Перминова, 2008). Экспериментально установлено, что устойчивость коллоидов гидроксида железа Fe3+ в подземных водах повышается в присутствии ионов кремния и ОВ гумусового происхождения (Шиян и др., 2013). В результате взаимодействия ГВ с ионами железа образуются хелатные комплексы и трудно растворимый осадок. Комплексные соединения металлов с органическими лигандами природного и 104 синтетического происхождения менее доступны водным микроорганизмам (Моисеенко, 2011). В связи с этим можно предположить, что отсутствие ярко выраженных биопленок на стеклах на границе раздела фаз жидкая среда - воздух в экспериментальном варианте II (ГВ+FeSO4) объясняется блокированием ионами железа доступности гуминовых веществ в качестве источника углерода для микроорганизмов, их переходом из растворенного состояния в хелатные комплексы с последующим осаждением. По характеру образования биопленки на стекле можно судить об их отношении к кислороду. В контактной зоне воздух – питательная среда могут развиваться аэробные формы. Микроорганизмы, способные развиваться на стекле в погруженном состоянии – можно отнести к факультативно-анаэробным формам. Среди исследованных микробоценозов доминировали аэробные формы. Факультативно-анаэробные представители встречались в образцах БП-8. Микроскопирование образцов биопленок показало, что различные по морфологии бактериальные клетки из модельных микрокосмов были окружены слизистыми капсулами (рисунок 28, 29). Среди скоплений палочек разной длины и толщины были визуально различимы слизистые образования инкрустированные гидратами окиси железа (рисунок 30, 31). После окраски по Граму прикрепленных к стеклу клеток выяснили, что в структуру БП, образованной МК из верхних слоев водоносного горизонта входили в основном Грам(-) бактерии, а МК из нижнего слоя водоносного горизонта были представлены Грам (+) и Грам (-) бактериями (рисунок 29). 105 Рисунок 28. Микроорганизмы биопленок обрастания при культивировании с пептоном. 106 Рисунок 29. Микроорганизмы биопленок обрастания при культивировании с гуминовыми веществами. 107 Рисунок 30. Микроорганизмы, образующие биопленки, при культивировании на пептоне в присутствии FeSO4. 108 Рисунок 31. Микроорганизмы, образующие биопленки, при культивировании на гуминовых веществах в присутствии FeSO4. 109 Эффекты инкрустации гидроксида железа на поверхности бактериальных клеток можно наглядно продемонстрировать на примере анализа электронных изображений БП-8 на разных стадиях развития (рисунок 32, 33). Рисунок 32. Электронное изображение 7-суточной культуры БП-8 при культивировании на пептоне в присутствии ионов железа. Рисунок 33. Электронное изображение 30-суточной культуры БП-8 при культивировании на пептоне в присутствии ионов железа. 110 На первых этапах формирования БП-8 бактериальные клетки находились в стадии активного деления и плотно упакованы в слизистый матрикс. Биомасса 7суточной культуры имела богатый элементный состав (C, O, N, Na, K, P, S, Si, Mg, Ca), однако соединения железа в этот период в ней отсутствовали (таблица 15). Таблица 15. Сравнение элементного состава БП-8 на 7 и 30 сутки. Элемент Весовой % Весовой % (7 суток) (30 суток) C 58,04-59,74 52,35-54,38 N 12,01-14,50 10,66-12,21 O 24,58-26,60 28,09-29,84 Na 0,18-0,24 0,18-0,22 Mg 0,11-0,17 - Si 0,08-0,09 0,14-0,17 P 0,63-0,93 - S 0,31-0,38 0,36-0,52 K 0,12-0,16 0,07-0,12 Ca 0,17-0,33 - Fe 0,15 3,75-5,87 Mn - 0,16-0,27 Около 94 % элементного состава БП было представлено углеродом, азотом и кислородом. Спустя 30 суток БП стали более зернистыми, клетки были погружены в слизистую массу и инкрустированы Fe(OH)3. Анализ элементного состава биопленки на 30-сутки свидетельствует (рисунок 34), что по всем локусам исследуемого образца присутствовали ионы железа и их концентрация в составе БП существенно увеличивалась. 111 Рисунок 34. Элементный состав 7- и 30-суточной культуры БП-8 при культивировании на пептоне в присутствии ионов железа. Как видно из таблицы 15 в конце эксперимента в биопленках был зарегистрирован марганец. Это может быть предпосылкой образования устойчивых железомарганцевых конкреций, которые способны выступать в качестве предпосылки для биокольматажа скважин и порового пространства водоносного горизонта. Известно, что различные вещества биополимерного матрикса (метаболиты БП) и продукты лизиса отдельных дисперсных клеток, могут служить источником питательного субстрата для других микроорганизмов (Плакунов, Николаев, 2010). 112 Эту концепцию в приложении к подземным водам можно выразить в виде схемы, отражающей влияние ОВ на образование биопленок (рисунок 35). Рисунок 35. Факторы, влияющие на образование биопленок в подземной гидросфере. Проведенные экспериментальные исследования показали, что характер образования слизистых БП в подземных водах зависел от степени доступности источника углерода и присутствия ионов Fe+2. Это было подтверждено при анализе культуральных характеристик МК из разных слоев ВГ, особенностью роста жизнеспособных представителей модельного сообщества на агаризованных питательных средах, способностью к адгезии, а также методами световой и электронной микроскопии. Аккумуляция в зрелой биопленке ионов кальция, железа и марганца вызывает ее уплотнение и фактически служит предпосылкой к образованию кристаллических структур вторичных минералов, заполняющих поровое пространство. 113 Выводы 1. Присутствие в природных подземных водах ОВ, отличающихся по своей биохимической доступности, оказывает существенное влияние на рост, развитие и образование слизистых биопленок. В вариантах с биохимически лабильным источником углерода (пептон) вероятность образования биопленок существенно возрастает. Гуминовые вещества в значительной степени способствовали изменению структуры сообщества и увеличению микробиологического разнообразия. 2. Биопленки, содержащие в своем составе ионы Ca2+, Mn2+, Fe3+, могут составлять основу для образования кристаллических, железосодержащих биоминералов, которые в дальнейшем могут вовлекаться в более длительные биогеохимические процессы и заполнять поровое пространство. 3. При загрязнении гуминосодержащих подземных вод быстро разлагаемыми органическими веществами, существует риск интенсивного кольматирования порового пространства вокруг скважин, что может привести к снижению эффективности подачи воды. Негативным последствием образования биопленок обрастания также является создаваемый ими потенциал микробиологического загрязнения воды. В результате жизнедеятельности и отмирания микроорганизмов, входящих в состав биопленок, существует риск снижения качества воды. 114 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Исследование активности микроорганизмов из различных местообитаний показали, что трансформация органических веществ в поверхностных и подземных водах происходит при участии структурированных сообществ микроорганизмов, организованных в виде биопленок. Экспериментально установлено, что микробиологическая трансформация полициклических ароматических углеводородов сопровождалась изменением цветности культуральной жидкости и образованием биопленок. Интенсивное формирование слизистых микробных пленок и повышенная адгезивная активность к частицам субстрата были характерны для микроорганизмов, адаптированных к загрязнению углеводородами водной среды на участке ниже устья р. Сунгари. Микробные комплексы, формирующие биопленки, с одной стороны проявляли защитные реакции от токсичного влияния цветных продуктов, с другой – закрепившись на поверхности частиц углеводородов, трансформировали их с помощью экзогенных ферментов. При разложении нафталина и фенантрена в водной среде накапливались растворимые промежуточные продукты, которые могут влиять на цветность воды и вызывать вторичное загрязнение водных экосистем. Методом хроматомасс-спектрометрии установлено, что трансформация ПАУ сопровождается образованием токсичных метилированных производных бензола, которые выступают факторами экологического риска для гидробионтов в зимний период. В железосодержащих подземных водах определяющими предпосылками для образования биопленок служат: присутствие органических веществ различного строения и происхождения, способность микроорганизмов продуцировать внеклеточные полимеры и аккумулировать гидроксиды железа на поверхности клеток. Стабильность биопленок обеспечивается разнообразием физиологических функций микроорганизмов, которые способствуют конкурентному выживанию в 115 специфической экологической нише. Выделенные из биопленок штаммы характеризовались интенсивным ростом на азотсодержащих питательных средах различной концентрации, образованием слизистого матрикса и каталазной активностью. Экспериментальное гуминосодержащих моделирование подземных вод показало, быстро что при разлагаемыми загрязнении органическими веществами, существует риск интенсивной кольматации порового пространства вокруг скважин, что может привести к снижению эффективности откачки воды. Использование методов световой и электронной микроскопии позволило определить основные этапы развития биопленок, их элементный состав, по которому можно судить об аккумуляции в сформировавшейся биомассе различных элементов. Биопленки, содержащие в своем составе ионы Ca2+, Mn2+, Fe3+, могут составлять основу для образования кристаллических, железосодержащих биоминералов, которые в дальнейшем вовлекаются в более длительные биогеохимические процессы и заполняют поровое пространство. Результаты исследований показали, что для контроля образования биопленок и поиска эффективных методов борьбы с биообрастанием необходимы глубокие исследования факторов, стимулирующих первые этапы бактериальной адгезии и определяющих накопление биомассы при поступлении органических веществ различного генезиса. 116 ВЫВОДЫ 1. Экспериментально установлено, что в трансформации гидрофобных ароматических углеводородов принимают участие бактериальные биопленки, способные к синтезу полимерных соединений и адгезии на поверхности взвешенных частиц. При разложении нафталина и фенантрена в водной среде накапливаются растворимые промежуточные продукты, которые могут влиять на цветность воды и вызывать вторичное загрязнение водных экосистем. Впервые показано, что при низких температурах трансформация ароматических углеводородов при участии микробных комплексов сопровождается образованием токсичных метилированных производных бензола, которые выступают факторами экологического риска для гидробионтов в зимний период. 2. В железосодержащих подземных водах определяющими предпосылками образования биопленок служат: присутствие органических веществ различной степени биодоступности (азотсодержащие и гуминовые вещества); способность микроорганизмов продуцировать внеклеточные полимеры и аккумуляция гидроксидов железа на поверхности клеток. Защитную функцию, препятствующую разрушению биопленок, выполняют полимерный матрикс и каталазная активность микроорганизмов. При неблагоприятных условиях и дефиците ОВ экзополимерный матрикс поддерживает жизнеспособность членов микробного сообщества водоносного горизонта во времени. 3. При загрязнении гуминосодержащих подземных вод быстро разлагаемыми ОВ, существует риск интенсивной кольматации порового пространства вокруг скважин, что может привести к снижению эффективности откачки воды. Бактериальные клетки и продукты их жизнедеятельности, входящие в состав биопленок, могут снижать качество воды, прошедшей обезжелезивание в водоносном пласте. 117 4. Биопленки, содержащие в своем составе ионы Ca2+, Mn2+, Fe3+, могут составлять основу для образования кристаллических, железосодержащих биоминералов, которые в дальнейшем могут вовлекаться в более длительные биогеохимические процессы и заполнять поровое пространство. Ограничение роста биомассы обрастаний представляет собой важнейшую стратегию борьбы с биопленками. 118 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Абакумов Е.В., Власов Д.Ю., Старцев С.А. Гуминовые вещества, как фактор риска для подземных сооружений// Инженерно-строительный журнал. – 2009. – №5(7). – С. 10-17. 2. Аскерния А.А., Сорокина А.Ю., Дубинина Г.А. Микробиологические аспекты процессов обезжелезивания и деманганации природных подземных вод// Водоснабжение и санитарная техника. Питьевое водоснабжение. – 2014. – № 12. – С. 14-20. 3. Барабашева Е.Е. Роль органического вещества в процессах миграции, минералообразования и рудогенеза с точки зрения биогеохимического рециклинга/ Материалы Всерос. науч. конф. с междунар. участием, РАН, Сибирское отделениение, Ин-т геологии и минералогии им. В.С. Соболева. – Новосибирск: ИНГГ СО РАН, 2014. – С. 64-70. 4. Бондарева Д.Г. Влияние природных и антропогенных факторов на повышенную концентрацию железа в питьевых водах Еврейской автономной области// Известия Самарского научного центра Российской академии наук. – 2009. – Т.11(27), № 1(6). – С. 1123-1126. 5. Букреева В.Ю., Грабович М.Ю., Епринцев А.Т., Дубинина Г.А. Сорбция коллоидных соединений оксидов железа и марганца с помощью железобактерий на песчаных загрузках очистных сооружений водоподъемных станций// Сорбционные и хроматографические процессы. – 2009. – № 4. – С. 506–514. 6. Бутюгин А.В. Кто хозяин на земле// Наука и жизнь. – 2007. – № 1. – C. 57-62. 7. Вернадский В.И. Химическое строение Биосферы Земли и ее окружения. – М.: Наука, 2001. – 376 с. 8. Воробей Е.С., Воронкова О.С., Винников А.И. Бактериальные биопленки. Quorum sensing –«чувство кворума» у бактерий в биопленках// Вестник 119 Днепропетровского Университета. Биология. Экология. – 2012. – Т.1., № 20. – С. 13-22. 9. Воронов Б.А. Комплексные экспедиционные исследования природной среды бассейна реки Амур/ Б.А. Воронов, А.Н. Махинов// Вестник ДВО РАН. – 2009. – № 3. – С. 3-14. 10. Гаджиева С.Р. Распределение полициклических углеводородов в различных средах/ С.Р. Гаджиева, А. Ф. Аминбеков, Т. И. Алиева, Ш.Б. Гурбанпур// Журнал научных публикаций аспирантов и докторантов. Науки о Земле. – 2009. – № 4. – C. 15-25. 11. Геннадиев А.Н. Полициклические ароматические углеводороды в первичных компонентах фоновых почв Зауралья/ А.Н. Геннадиев, Ю.И. Псковский, С.С. Чернянский, Т.А. Алексеева// География и окружающая среда. – М.: ГЕОС, 2000. – С. 404-414. 12. Геннадиев А.Н. Геохимия полициклических ароматических углеводородов в связи с гумусным и структурным состоянием почв/ А.Н. Геннадиев, С.С. Чернянский, Ю.И. Пиковский, Т.А. Алексеева// География и окружающая среда. – СПб.: Наука, 2003. – С. 124-133. 13. Герхард Ф. Методы общей бактериологии. – М.: Мир, 1983. – 536 с. 14. Гинцбург А.Л. «Quorum sensing» или социальное поведение бактерий/ А.Л. Гинцбург, Т.С. Ильина, Ю.М. Романова// Журнал микробиологии. – 2003. – № 5. – С. 86–93. 15. Гришек Т., Херлитциус Й., Арнс Й., Тесля В.Г., Расторгуев И.А. Взаимодействие внутрипластовой очистки и речной фильтрации при водоподготовке на Тунгусском водозаборе// Водоснабжение и санитарная техника. – 2012. – № 7. – С. 21–28. 16. Доброхотский О.Н. Эпидемиологическое значение формирования биоплёнок в технических системах/ О. Н. Доброхотский, Ю. Н. Хомяков, Т. И. Хомякова// Жизнь без опасностей. – 2009. – № 1. – C. 78-80. 120 17. Журина М.В. Взаимодействие нефтеокисляющих микроорганизмов с хемоорганотрофными бактериями – спутниками, неспособными к окислению углеводородов, в структурированных микробных сообществах (биопленках): автореферат дис. канд. биол. наук: 03.00.07/ Журина Марина Владимировна. – М., 2009. – 25 с. 18. Заварзин Г.А., Колотилова Н.Н. Введение в природоведческую микробиологию. Учебное пособие. – М.: Книжный дом, 2001. – 256 с. 19. Занина В.В. Моносахаридный состав экзополимерного комплекса бактерийдеструкторов защитных покрытий/ В.В. Занина, Ж.П. Коптева, Ю.М. Юмына, А.Н. Остапчук // Мікробіологічний журнал. – 2009. – Т. 71, № 4. – С. 21-27. 20. Звягинцев Д.Г. Взаимодействие микроорганизмов с твердыми поверхностями. – М.: МГУ, 1973. – 176 с. 21. Звягинцев Д. Г. Почва и микроорганизмы. – М.: Изд-во Моск. ун-та, 1987. 256 с. 22. Зилов Е.А. Гидробиология и водная экология (организация, функионирование и загрязнение водных экосистем). – Иркутск: Изд-во Иркут. гос. ун-та, 2009. – 147 с. 23. Иванова И.С., Лепокурова О.Е., Покровский О.С., Шварцев С.Л. Железосодержащие подземные воды верхней гидродинамической зоны центральной части Западно-Сибирского артезианского бассейна// Водные ресурсы. – 2014. – Т. 41, № 2. – С. 164-179. 24. Иерусалимский Н.Д. Основы физиологии микроорганизмов. – М.: Изд-во Академии наук СССР, 1963. – 239 с. 25. Казак Е.С. Изучение миграции железа в подземных водах (на примере водозаборов г. Воронеж)// Геоэкология. Инженерная геология. Гидрогеология. Геокриология. – 2010. – № 6. – С. 513-520. 26. Кампер Э.К. Биопленки в процессах обработки и распределения питьевой воды// Водоподготовка и водоснабжение. – 2012. – № 11. – С. 42-55. 121 27. Караванов К.П. Гидрогеологические области и основные водоносные горизонты Приамурья. – Хабаровск: ИВЭП ХНЦ ДВО РАН, 1996. – 78 с. 28. Кармалов А.И., Филимонова С.В. Анализ причин кольматации и коррозии оборудования водозаборных скважин в условиях повышенной техногенной нагрузки// Водоснабжение и санитарная техника. – 2011. – № 9. – С. 16–20. 29. Кармалов А.И., Филимонова С.В. Методы борьбы с последствиями кольматации и коррозии оборудования водозаборных скважин// Водоснабжение и санитарная техника. – 2011. – № 9. – С. 21–25. 30. Квартенко А.Н., Говорова Ж.М. Модернизированные технологии комплексного кондиционирования подземных вод // Вестник МГСУ. – 2013. – № 5. – С. 118-123. 31. Клименков В.Г. Определение ПАУ в воде на основе многокомпонентного анализа флуориметрических данных/ В.Г. Клименков, А.Г. Борзенко// Вестник Московского университета. Химия. – 2005. – Т.46, № 6. – C. 392-394. 32. Ковалевский Д.В., Пермин А.Б., Перминова И.В., Петросян В.С. Выбор условий регистрации количественных 13 С ЯМР-спектров гумусовых кислот// Вестник Московского Университета. Химия. – 2000. – Т. 41, №1. – С.39-42. 33. Колесников В.П. Современное развитие технологических процессов очистки сточных вод в комбинированных сооружениях/ В.П. Колесников, Е.В. Вильсон. – Ростов-на-Дону: Изд-во Юг, 2005. – 212 с. 34. Кондратьева Л.М. Микроорганизмы в экосистемах Приамурья/ Л.М.Кондратьева, Л.А. Гаретова, Е.Л. Имранова, О.А. Кириенко, Л.М. Чухлебова, Е.А. Каретникова. – Владивосток: Дальнаука, 2000. – 198 с. 35. Кондратьева Л.М. Проблема загрязнения р. Амур стойкими органическими соединениями/ Л.М. Кондратьева, В.Л. Рапопорт, Г.Ф. Золотухина, Л.В. Васильева// Экологические проблемы бассейнов крупных рек. – Тольятти: ИЭВБ РАН, 2003. – С. 125. 36. Кондратьева Л.М. Экологический риск загрязнения водных экосистем/ Л.М. Кондратьева. – Владивосток: Дальнаука, 2005. – 299 с. 122 37. Кондратьева Л.М. Загрязнение р. Амур полиароматическими углеводородами/ Л.М. Кондратьева, Н.К. Фишер, О.Ю. Стукова, Г.Ф. Золотухина// Вестник ДВО РАН. – 2007. – № 4. – С. 17-26. 38. Кондратьева Л.М., Литвиненко З.Н. Формирование биопленок микробными комплексами подземных вод in vitro// Биотехнология. – 2014. – № 3. – С. 73– 82. 39. Кондратьева Л.М., Литвиненко З.Н., Морозова О.Ю. Роль биопленок в трансформации гидрофобных ароматических углеводородов// Вода: химия и экология. – 2013. – № 5. – С. 51-59. 40. Кондратьева Л.М., Матрошилова О.Ю., Литвиненко З.Н. Исследование самоочищающей способности реки Амур от стойких ароматических углеводородов// Научно-технические проблемы транспорта, промышленности и образования: Труды Всероссийской научно-практической конференции/ Под ред. О.Л. Рудых. Хабаровск: Изд-во ДВГУПС, 2010. Т. 6. С. 28-32. 41. Кондратьева Л.М., Морозова О.Ю., Литвиненко З.Н. Роль биосорбции в трансформации гидрофобных ароматических углеводородов// Научно- техническое и экономическое сотрудничество стран АТР в XXI веке: Труды Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. Хабаровск: Изд-во ДВГУПС, 2011 а. Т. 3. С. 85-89. 42. Кондратьева Л.М., Морозова О.Ю., Литвиненко З.Н. Роль биопленок в трансформации стойких ароматических углеводородов// Антропогенное влияние на водные организмы и экосистемы: Материалы IV всероссийской конференции по водной экотоксикологии. Борок: Изд-во ИБВВ, 2011 б. Часть 1. С. 22-26. 43. Коптева Ж.П., Занина В.В., Коптева А.Е., Айзенберг В.Л., Борисенко А.В. Липолитическая и каталазная активность бактерий-деструкторов защитных покрытий// Мікробіол. журнал. – 2009. – Т. 71, № 4. – С. 45-50. 44. Коробов В.П., Лемкина Л.М., Монахов В.И. Анализ чувствительности процессов формирования биопленки Staphylococcus Epidermidis 33 к 123 некоторым факторам внешней среды// Вестник Пермского университета. Биология. – 2010. – Т. 1, № 1. – С. 59-63. 45. Коростелева Л.А., Кощаев А.Г. Основы экологии микроорганизмов. – СанктПетербург: Лань, 2013. – 240 с. 46. Крайнов С.Р., Рыженко Б.Н., Швец В.М. Геохимия подземных вод. Теоретические, прикладные и экологические аспекты. – М.: Наука, 2004. – 677 с. 47. Криворучко А.В. Адсорбционная иммобилизация клеток алканотрофных родококков: автореферат дис. канд. биол. наук: 03.00.07/ Криворучко Анастасия Владимировна. – Пермь, 2008. – 28 c. 48. Крюков В.Г. Река Амур: проблемы и пути решения: результаты деятельности Координационного комитета по устойчивому развитию бассейна р. Амур/ В.Г. Крюков, Б.А. Воронов, А.В. Гаврилов, А.В. Макаров; отв. ред. С.А. Зражевский, Г. Е. Почеревин. – Хабаровск: Приамурское Географическое общество, 2005. – 153 с. 49. Кузнецов С.И., Дубинина Г.А. Методы изучения водных микроорганизмов. – М.: Наука, 1989. – 289 с. 50. Кулаков В.В. Геохимия подземных вод Приамурья. – Хабаровск: ИВЭП ДВО РАН, 2011. – 254 с. 51. Кулаков В.В., Кондратьева Л.М. Биогеохимические аспекты очистки подземных вод Приамурья// Тихоокеанская геология. – 2008. – Т. 27, № 1. – С. 109–118. 52. Кулаков В.В., Сошников Е.В., Чайковский Г.П. Обезжелезивание и деманганация подземных вод: Учебное пособие. – Хабаровск: ДВГУПС, 1998. –100 с. 53. Кулаков В.В., Стеблевский В.И., Домнин К.В., Тесля В.Г., Херлитциус Й. Опытно-промышленная эксплуатация пилотной установки внутрипластовой очистки подземных вод на Тунгусском водозаборе// Водоснабжение и санитарная техника. – 2012. – № 7. – С. 29–35. 124 54. Куюкина М.С. Адсорбционная гидрофобизованных иммобилизация производных клеток широкопористого родококков в полиакриламидного криогеля/ М.С. Куюкина, И.Б. Ившина, Е.В. Рубцова, Р.В. Иванов, В.И. Лозинский// Прикладная биохимия и микробиология. – 2011. – Т. 47, № 2. – С. 176-182. 55. Литвиненко З.Н. Влияние ионов железа на характер развития биопленок// Актуальные проблемы биологических наук. Материалы I межрегиональной молодежной школы-конференции. – Владивосток: «Русский остров», 2013. – С. 164-168. 56. Литвиненко З.Н. Влияние гуминовых веществ на микробные комплексы подземных вод// Материалы Всероссийской Конференции «Водные и экологические проблемы, преобразование экосистем в условиях глобального изменения климата». Сборник докладов. – Хабаровск: ИВЭП ДВО РАН, 2014. – С. 111-114. 57. Лысюк Г.Н. Кристаллохимия Минералогические наноразмерных перспективы: марганцевых Материалы агрегатов// Международного минералогического семинара. – Сыктывкар: УрО РАН, 2011. – С. 97-100. 58. Мальник В.В., Габаев И.И., Парфенова В.В. Разнообразие микроорганизмов, входящих в состав биопленок оз. Байкал на основе данных молекулярного анализа// Материалы Микроорганизмы 2-го в экосистемах Байкальского озер, рек, Микробиологического водохранилищ. Симпозиума с международным участием. – Иркутск, 2007. – С. 152-153. 59. Мальцев С.В., Мансурова Г.Ш. Что такое биопленка?// Природная медицина. – Т.13, № 1. – 2013. – С. 86-89. 60. Матрошилова О.Ю., Ширшова Е.В., Литвиненко З.Н. Микробиологическая трансформация нафталина при различных температурах// Фундаментальные проблемы воды и водных ресурсов: Материалы конференции. Барнаул: Изд-во АРТ, 2010. С. 176-179. III всероссийской 125 61. Махинов А.Н. Влияние гидрологических факторов на экологическое состояние реки Амур// Регионы нового освоения: экологические проблемы, пути решения: материалы межрегиональной научно-практической конференции. – Хабаровск: ДВО РАН, 2008. – Т. 1. – С. 320-324. 62. Мелькина О.Е., Манухов И.В., Завильгельский Г.Б. С-домен LuxR, активатора транскрипции lux-оперона Vibrio fischeri, не является мишенью для lon протеазы// Молекулярная биология. – 2010. – Т. 44, № 3. – С. 515-519. 63. Менча М.Н. Железобактерии в системах питьевого водоснабжения из подземных источников// Водоснабжение и санитарная техника. – 2006. – № 7. – С. 25–32. 64. Могильная О.А., Попова Л.Ю. Электронно-микроскопическое исследование биопленок бинарного бактериального сообщества// Микробиология. – 2007. – Т. 76, № 2 . – С. 279-281. 65. Моисеенко Т.И. Инактивация токсичных металлов в водах суши гумусовыми веществами/ Т.И. Моисеенко// Вестник Тюменского государственного университета. – 2011. – № 5. – С. 6-19. 66. Морозова О.Ю., Литвиненко З.Н. Формирование биопленок при трансформации фенантрена бактериобентосом реки Амур// Микроорганизмы и вирусы в водных экосистемах: Материалы 3-го Байкальского Микробиологического Симпозиума с международным участием. Иркутск: Издательство Института географии СО РАН, 2011. C. 90-92. 67. Мулюкин А.Л. Внутривидовое разнообразие покоящихся форм Mycobacterium smegmatis// Микробиология. – 2010. – Т. 79, № 4. – С. 496-497. 68. Намсараев Б.Б, Бархутова Д.Д., Хахинов В.В. Полевой практикум по водной микробиологии и гидрохимии// Методическое пособие. – Улан-Удэ: Издательство Бурятского госуниверситета, 2006. – 68 с. 69. Нгандже T.Н. Экологическое и токсикологическое воздействие полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) на окружающую среду/ T.Н. Нгандже, Э.A. Абара, K.A. Ибе, П.А. Неджи// Журнал научных 126 публикаций аспирантов и докторантов. Науки о Земле. – 2009. – №8. – C. 2438. 70. Непомнящая Я.Н., Слободкина Г.Б., Колганова Т.В., Бонч-Осмоловская Е.А., Нетрусов А.И., Слободкин А.И. Филогенетический состав накопительных культур термофильных прокариот, восстанавливающих слабокристаллический оксид Fe(III) при наличии и отсутствии прямого контакта клеток с минералом// Микробиология. – 2010. – Т.79, № 5. – С. 672-681. 71. Николаев Ю.А. Ауторегуляция стрессового ответа микроорганизмов: автореферат дис. докт. биол. наук: 03.02.03/ Николаев Юрий Александрович. – М., 2011. – 48с. 72. Николаев Ю.А., Плакунов В.К. Биопленка – «город микробов» или аналог многоклеточного организма?// Микробиология. – 2007. – Т. 76, № 2. – С. 149163. 73. Олейник Г.Н. Бактериальная деструкция органического вещества в водоемах и водотоках// Водные ресурсы. – 1991. – № 2. – С. 89–97. 74. Олейник Г.Н., Старосила Е.В. Активность каталазы в донных отложениях урбанизированных водоемов Киева. Питьевая вода в XXI веке/ Материалы научно-практической конференции с международным участием – Иркутск: Изд-во Института геогрфии им. В.Б. Сочавы СО РАН, 2013. – 100 с. 75. Олескин А.В., Ботвинко И.В., Цавкелова Е.А. Колониальная организация и межклеточная коммуникация у микроорганизмов// Микробиология. – 2000. – Т. 69, № 3. – С. 309–327. 76. Орлов Д.С. Химия почв. – М.: Изд-во МГУ, 1992. – 376 с. 77. Парфенова В.В. Микроорганизмы озера Байкал – как объекты исследования их способности к очищению вод от загрязнения ПАУ/ В.В. Парфенова, В.В. Дрюккер// Проблемы биоремедиации в XXI веке: материалы междунар. рабочего совещ. Институт биофизики СО РАН. – Красноярск, 2002. – С. 36-40. 78. Парфенова В.В., Мальник В.В., Бойко С.М., Шевелева Н.Г., Логачева Н.Ф., Евстигнеева Т.Д., Сутурин А.Н., Тимошкин О.А. Сообщества гидробионтов, 127 развивающиеся на поверхности раздела фаз: вода – горные породы в озере Байкал// Экология. – 2008. – № 3. – С. 211-216. 79. Перминова И.В. Гуминовые вещества - вызов химикам XXI века// Химия и жизнь - XXI век. – 2008. – № 1. – С. 50–55. 80. Перминова И.В., Жилин Д.М. Гуминовые вещества в контексте зеленой химии /Зеленая химия в России, В.В. Лунин, П. Тундо, Е.С. Локтева – М.: Издво Московского Университета, 2004. – С. 146-162. 81. Пиневич А.В. Микробиология. Биология прокариотов: учебник/ А.В. Пиневич – Спб.: Издательство С.-Петербургского университета. Т.1., 2006. – 350 с. 82. Плакунов В.К. Основы динамической биохимии: учебник/ В.К. Плакунов, Ю.А. Николаев – М.: Логос, 2010. – 216 с. 83. Плакунов В.К., Николаев Ю.А. Микробные биопленки: перспективы использования при очистке сточных вод// Вода: химия и экология. – 2008. – № 2. – С. 11-13. 84. Плакунов В.К., Стрелкова Е.А., Журина М.В. Персистенция и адаптивный мутагенез в биопленках// Микробиология. – 2010. – Т. 79, № 4. – C. 447-458. 85. Потехина Ж.С. Метаболизм Fe(III) восстанавливающих бактерий. – Тольятти: ИЭВБ РАН, 2006. – 225с. 86. Пунтус И.Ф., Фионов А.Е., Ахметов Л.И., Карпов А.В., Боронин А.М. Деградация фенантрена бактериями родов Pseudomonas и Burkholderia в модельных почвенных системах// Микробиология. – 2008. – Т. 77, №. 1. – С. 11-20. 87. Пуриш Л.М., Асауленко Л.Г., Абдулина Д.Р., Васильев В.Н., Иутинская Г.А. Роль экзополимерного комплекса в формировании биопленки на поверхности стали коррозионно-агрессивными бактериями// Прикладная биохимия и микробиология. – 2012. – Т. 48, № 3. – С. 294–301. 88. Раилкин А.И. Процессы колонизации и защита от обрастания/ А.И. Раилкин, СПб.:С.-Петербург. Университет, 1998. – 272 с. 128 89. Рапопорт В.Л. Загрязнение реки Амур антропогенными и природными органическими веществами/ В.Л. Рапопорт, Л.М. Кондратьева// Сибирский экологический журнал. – 2008. – Т. 15, № 3. – С. 485-496. 90. Родина А.Г. Методы водной микробиологии. Практическое руководство. – М.: Наука, 1965. – 363 с. 91. Романова Ю.М. Бактериальные биопленки, как естественная форма существования бактерий в окружающей среде и в организме хозяина/ Ю.М. Романова, А.Л. Гинцбург// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2011. – № 3. – С. 99-109. 92. Романова Ю.М., Смирнова Т.А., Андреев А.Л., Ильина Т.С., Диденко Л.В., Гинцбург А.Л. Образование биопленок – пример «социального» поведения бактерий// Микробиология. – 2006. – Т.75, № 4 . – С. 556-561. 93. Рубцова Е.В. Влияние условий культивирования родококков на их адгезивную активность в отношении жидких углеводородов/ Е.В. Рубцова, М.С. Куюкина// Матер. VII Междунар.науч.конф. «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии». –Минск: Изд-во Беларуская навука, 2010. – С. 328-384. 94. Рубцова Е.В. Адгезия клеток родококков, выделенных из разных экосистем/ Е.В. Рубцова, А.В. Криворучко, Р.А. Харахорина, М.С. Куюкина, И.Б. Ившина// Матер. Всерос. конф. «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» – М., 2009. – Т. 114, № 2. – С. 262-264. 95. Рубцова Е.В. Изучение адгезионной способности клеток родококков в отношении углеводородных субстратов// Матер. Регион. Науч. Конф. студентов, аспирантов, молодых ученых «Современные проблемы экологии, микробиологии, иммунологии». – Пермь, 2007. – С. 91. 96. Северина Л.О. Бактериальные S-слои // Микробиология. – 1995. – Т. 64, № 6. – С. 725-733. 129 97. Серебренникова М.К., Куюкина М.С., Криворучко А.В., Ившина И.Б. Адаптация коиммобилизованных родококков к нефтяным углеводородам в колоночном биореакторе// Прикладная биохимия и микробиология. – 2014. – Т. 50, № 3. – С. 295-303. 98. Смирнова Т.А., Диденко Л.В., Азизбекян Р.Р., Романова Ю.М. Структурно– функциональная характеристика бактериальных биопленок// Микробиология. – 2010. – Т. 79, № 4. – С. 435-446. 99. Стрелкова Е.А., Позднякова Н.В., Журина М.В., Плакунов В.К., Беляев С.С. Роль внеклеточного полимерного матрикса в устойчивости бактериальных биопленок к экстремальным факторам среды// Микробиология. – 2013. – Т. 82, № 2. – С. 131-139. 100. Таубе П.Р., Баранова А.Г. Химия и микробиология воды. – М.: Высш. Школа, 1983. – 280 с. 101. Труфанов А.И. Формирование железистых подземных вод. – М.: Наука, 1982. – 132 с. 102. Факторы формирования качества воды на Нижнем Амуре/ под ред. Л.М. Кондратьевой. – Владивосток: Дальнаука, 2008. – 217 с. 103. Хмель И.А. Quorum sensing регуляция экспрессия генов: фундаментальные и прикладные аспекты, роль в коммуникации бактерий/ И.А. Хмель// Молекулярная биология. – 2006. – № 75. – С. 1-9. 104. Чижова Т.Л., Тищенко П.Я., Кондратьева Л.М., Кудряшова Ю.В., Каваниши Т. Полициклические ароматические углеводороды в эстуарии р. Амур// Вода: химия и экология. – 2013. – № 10. – С. 14-22. 105. Шабаров Ю.С. Органическая химия. Циклические соединения. Часть 2. – М.: Химия, 1994. – 848 с. 106. Шварцев С. Л., Рыженко Б.Н., Алексеев В.А. и др. Геологическая эволюция и самоорганизация системы вода-горная порода. – Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2007. – 389 с. 130 107. Шевцов М.Н., Махинов А.Н., Литвинчук А.А. Экологические приоритеты при организации водообеспечения Хабаровска// Водоснабжение и санитарная техника. – 2012. – № 7. – С. 9–13. 108. Шиян Л.Н., Мачехина К.И., Кончакова Н.В. Механизм образования коллоидных соединений железа в процессе водоподготовки// Современные проблемы науки и образования. – 2013. – № 4. – С. 1–8. 109. Шлегель Г. Общая микробиология/ Г. Шлегель. – М.:Мир, 1987. –567 с. 110. Шумкова Е.С. Разложение фенола штаммом Rhodococcus opacus 1G/ Е.С. Шумкова, И.П. Соляникова, Е.Г. Плотникова, Л.А. Головлева// Прикладная биохимия и микробиология. – 2009. – Т. 45, № 1. – С. 51-57. 111. Эль-Регистан Г.И. Популяционные аспекты адаптации микроорганизмов// Вестник Уральской Медицинской Академической Науки. – 2011. – Т. 38, № 4/1. – С. 16. 112. Azua L., Unanue M., Ayo B., Artolozaga L., Arrieta J. M., Iriberri J. Influence of organic matter quality in the cleavage of polymers by marine bacterial communities// Journal of Plankton Research. – 2003. – V.25, № 12. – P. 14511460. 113. Battin T.J., Kaplan L.A., Newbold J.D., Hansen C. Contributions of microbial biofilms to ecosystem processes in stream mesocosms// Nature. – 2003. – V.426. – P. 439–442. 114. Bazilinski D.A., Frankel R.B., Konhauser K.O. Modes of biomineralization on magnetite by microbes// Geomicrobiology journal. – 2007. – V. 24, № 6. – P. 465475. 115. Beech I., Bergel A., Mollica A., Flemming H.-C., Scotto V., Sand W. Microbially influenced corrosion of industrial materials simple methods for the investigation of the role of biofilms in corrosion// Brite-Euram III Thematic Network of Industrial Materials, Biofilm fundamentals, 2000. – 27 p. 131 116. Beer D., Stoodley P., Roe F., Lewandowski Z. Effects of biofilm structures on oxygen distribution and mass transport// Biotechnology and bioengineering. – 1994. – V. 43, № 11. – P. 1131-1138. 117. Ben-Ari E.T. Not just slime// Bioscience. – 1999. – V.49, №9. – P. 689-695. 118. Bendinger B., Rijnaarts H.H.M., Altendorf K., Zehnder A.J.B. Physicochemical cell surface and adhesive properties of coryneform bacteria related to the presence and chain length of mycolic acids// Applied Environmental Microbiology. – 1993. – V. 59, № 11. – Р.3973–3977. 119. Besemer K., Singer G., Limberger R., Chlup A.K., Hochedlinger G., Hudl I., Baranyi C., Battin T.J. Biophysical controls on community succession in stream biofilms// Applied Environmental Microbiology. – 2007. – V. 73. – Р. 4966–4974. 120. Bhattacharyya A., Stavitski E., Dvorak J., Martínez C.E. Redox interactions between Fe and cysteine: Spectroscopic studies and multiplet calculations// Geochimica et Cosmochimica Acta. – 2013. – V. 2, № 1. – P. 89–100. 121. Bollag J.M., Mayers K. Detoxification of aquatic and terrestrial sites through binding of pollutants to humic substances// Science Total Environment. – 1992. – V. 117/118. – P. 357-366. 122. Bott T.R., Pinheiro M.M.V.P.S. Biological fouling: Velocity and temperature Effects// The Canadian Journal of Chemical Engineering. – 1977. – V. 55. – Р. 473-474. 123. Bowen R.B., Dempsey B.A. Improved performance of activated sludge with addition of inorganic solids// Water Science and Technology. – 1992. – V.26, № 911. – P. 2511-2514. 124. Burns R.G. Microbial and enzymic activities in soil biofilms. In structure and function of biofilms/ W. G. Characklis, P. A. Wilderer, Eds. – New York: Wiley, 1989. – Р. 333-349. 125. Chapanova G., Jank M., Schlegel S., Koeser H. Effect of temperature and salinity on the wastewater treatment performance of aerobic submerged fixed bed biofilm reactors// Water Science and Technology. – 2007. – V. 55, № 8-9. – Р. 159. 132 126. Chudoba P., Pannier M. Use of powdered clay to upgrade activated sludge process// Environmental Technology. – 1994. – V. 15. – P. 863-870. 127. Costerton J.W. The Biofilm Primer. – Springer, Hiedelberg, 2007. – 200 p. 128. Costerton J.W., Geesey G.G., Cheng K.J. How bacteria stick// Scientific American. – 1978. – V. 238. – Р. 86-95. 129. Costerton J.W., Lewandowski Z., Caldwell D. E., Korber D.R., Lappin-Scott H.M. Microbial biofilms// Annual Review of Microbiology. – 1995. – V.49. – P. 711-745. 130. Costerton J.W., Veeh R., Shirtliff M. The application of biofilm science to the study and control of chronic bacterial infections// Journal of clinical investigation. – 2003. – V.112. – Р. 1466-1477. 131. Cullimore D.R. Microbiology of well biofouling. – Boca Raton, Florida: CRS Press, 1999. – 435 p. 132. Das T., Sehar S., Koop L., Wong Y.K., Ahmed S. Influence of calcium in extracellular DNA mediated bacterial aggregation and biofilm formation// Plos one. – 2014. – V.9, №3. – P. 1–11. 133. Davey M.E. Microbial biofilm: from ecology to molecular genetics/ M.E. Davey, G.A. O’Toolе// Microbiology and molecular biology reviews. – 2000. – V.19. – P. 847-867. 134. Dawson C.C., Intapa C., Jabra-Rizk M.A. «Persisters»: Survival at the Cellular Level// Plos Pathogens. – 2011. – V.7, №7. – P. 1-3. 135. Dong Y. Quenching quorum-sensing-dependent bacterial infection by an N-acylhomoserine lactonase/ Y. Dong, L. Wang, J. Xu// Nature. – 2001. – V. 411. – P. 813-817. 136. Donlan R.M., Costerton J.W. Bioflms: Survival mechanisms of clinically relevant microorganisms// Clinical Microbiology Reviews. – 2002. – V.15, № 2. – P. 167193. 137. Elias S., Banin E. Multi-species biofilms: living with friendly neighbors// FEMS Microbiology Reviews. – 2012. – V. 36, № 5. – P. 990-1004. 133 138. Esparza-Soto M., Westerhoff P. Biosorption of humic and fulvic acids to live activated sludge biomass// Water Research. – 2003. – V.37, № 10. – P. 2301–2310. 139. Fang W., Huand J.Y., Ong S.L. Influence of phosphorus on biofilm formation in model drinking water distribution systems// Journal of Applied Microbiology. – 2009. – V.106, № 4. – P. 1328–1335. 140. Finnerant, K.T. Rhodoferax ferrireducens sp. nov., a psychrotolerant, facultatively anaerobic bacterium that oxidizes acetate with the reduction of Fe (III)/ K.T. Finnerant, C.V. Johnsen, D.R. Lovley// International journal of systematic and evolutionary microbiology. – 2003. – V. 53. – P. 669-673. 141. Flemming H.-C. Biofouling in water systems–cases, causes, countermeasures// Applied Environmental Biotechnology. – 2002. – V. 59. – P. 629-640. 142. Flemming H.-C. Microbial biofouling: unsolved problems, insufficient approaches, and possible solutions. – Berlin: Springer Verlag Heidelberg, 2011. – 12 p. 143. Flemming H.-C. Why Microorganisms Live in Biofilms and the Problem of Biofouling. – Berlin: Springer Verlag Heidelberg, 2008. – 109 p. 144. Flemming H.-C., Thomas R.N., Wozniak D.J. The EPS Matrix: The «House of Biofilm Cells»// Journal of Bacteriology. – 2007. – V.189, № 22. – P. 7945-7947. 145. Flemming H.-C., Wingender J. The biofilm matrix// Nature Reviews Microbiology. –2010. – V.8, №9. – P. 623-633. 146. Flemming H.-C., Wingender J., Griebe T., Mayer C. Physico-chemical properties of biofilms/ L.V. Evans// Biofilms: Recent Advances in their Study and Control, Amsterdam: Harwood Academic Publishers, 2000. – P. 19–34. 147. Fletcher M. Attachment of Pseudomonas fluorescence to glass and influence of electrolytes on bacterium substratum separation distance// Journal of Bacteriology. – 1988. – V. 170. – P. 2027-2030. 148. Frimmel F.H., Christman R.F. Humic substances and their role in the environment. Chichester, West Sussex: J. Wiley & Sons Ltd., 1988. – 271 p. 134 149. Fuqua W.C., Winans S.C., Greenberg E.P. Quorum Sensing in Bacteria: the LuxR-LuxI Family of cell density-responsive transcriptional regulators// Journal of bacteriology. – 1994. – V. 176, № 2. – P. 269-275. 150. Garikipati S.V.B.J., Mc.Lver A.M., Peeples T.L. Whole-cell biocatalysis for 1naphthol production in liquid-liquid biphasic systems// Applied Environment Microbiolology. – 2009. – V.75, № 20. – P. 6545-6552. 151. Garrett T.R., Bhakoo M., Zhang Z. Bacterial adhesion and biofilms on surfaces// Progress in Natural Science. – 2008. – V.18, № 9. – Р. 1049-1056. 152. Gilbert О., Lefèvre B., Fernández M., Bernat X., Paraira M., Calderer M., Martínez-Ladó X. Characterising biofilm development on granular activated carbon used for drinking water production// Water Research. – 2013. – V.4, № 3. – P. 1101–1110. 153. Goode С., Allen D.G. Effect of calcium on moving-bed biofilm reactor biofilms// Water Environment Research. – 2011. – V.83, № 3. – P. 220–232. 154. Habash M., Reid G. Microbial biofilms: Their development and significance for medical device-related infections// The journal of clinical pharmacology. – 1999. – V.39. – P. 887–898. 155. Herald P.J., Zottola E.A. Attachment of Listeria monocytogenes to stainless steel surfaces at various temperatures and pH values// Journal of food Science. – 1988. – V.53. – P. 1549–1552. 156. Herbert-Guillou D.B., Tribollet D.F. Influence of the hydrodynamics on the biofilm formation by mass transport analysis// Bioelectrochemistry. – 2000. – V. 53. – Р. 119–125. 157. Huber S.A., Balz A., Abert M., Pronk W. Characterisation of aquatic humic and non-humic matter with size-exclusion chromatography – organic carbon detection – organic nitrogen detection (LC-OCD-OND)// Water Research. – 2011. – V.45, № 2. – P. 879–885. 135 158. Jagani S., Chelikani R., Kim D.S. Effects of phenol and natural phenolic compounds on biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa// Biofouling. – 2009. – V.25. – P. 321–324. 159. Johnsen A.R. Evaluation of bacterial strategies to promote the availability of PAHs// Applied Microbiology and biotechnology. – 2004. – V. 63, № 4. – P. 452459. 160. Kanaly R. A., Harayama S. Biodegradation of high-molecular-weight polycyclic aromatic hydrocarbons by bacteria// Journal of Bacteriology. – 2000. – V. 182, № 8. – P. 2059-2067. 161. Kanatiwela D. Biofilms – a friend or foe?// Sciscitator. – 2014. – V.1. – Р. 1-2. 162. Khmel I.A., Metlitskaya A.Z. Quorum Sensing regulation of gene expression: a promising target for drugs against bacterial pathogenicity// Molecular biology. – 2006. – V.40, №2. – Р. 169-182. 163. Kim S., Kaplan L.A., Hatcher P.G. Biodegradable dissolved organic matter in a temperate and a tropical stream determined from ultra-high resolution mass spectrometry// Limnology and Oceanography. – 2006. – V.51. – P. 1054–1063. 164. Kim W., Tengra F.K., Young Z., Shong J., Marchand N. Spaceflight Promotes Biofilm Formation by Pseudomonas aeruginosa// Plos one. – 2013. – V. 8, № 4. – P. 1-8. 165. Koetsier P., McArthur V., Leff L.G. Spatial and temporal response of stream bacteria to sources of dissolved organic carbon in a blackwater system// Freshwater Biology. – 1997. – V.37. – P. 79–89. 166. Kokare C.R., Chakraborty S., Khopade A.N., Mahadik K.R. Biofilm: Importance and Applications// Indian Journal Biotechnology. – 2009. – V. 8. – P. 159-168. 167. Kondratyeva L.M., Golubeva E.M. Formation of iron minerals on zeolite matrix// Russian Geology and Geophysics. – 2014. – V. 55. – P. 1387-1394. 168. Kondratyeva L., Litvinenko Z. Transformation of hydrophobic hydrocarbons by biofilms of bacteriobenthos// Abstracts International conference Biohydrology 2013. Bio meets Hydrology «Water for life». Germany Landau/Pfalz, 2013. P. 59. 136 169. Kumar C.G., Anand S.K. Significance of microbial biofilms in food industry: a review// International journal of food microbiology. – 1998. – V.42, №1-2. – P. 927. 170. Lappin-Scott H.M., Bass C. Biofilm formation: attachment, growth, and detachment of microbes from surfaces// American journal of infection control. – 2001. – V.29, № 4. – Р. 250-251. 171. Lear G., Lewis G. Microbial biofilms. Current research and applications. – Norwich, UK: Caister Academic Press, 2012. – 220 p. 172. Lee M., Lee K., Hyun Y., Clement T., Hamilton D. Nitrogen transformation and transport modeling in groundwater aquifers// Ecological Modelling. – 2006. – V.192. – P. 143–159. 173. Lemos M., Borges A., Teodosio J., Araujo P., Mergulhao F., Melo L., Simoes M. The effect of ferulic and salicylic acids on Bacillus cereus and Pseudomonas fluorescens single- and dual- species biofilms// International biodeterioration and biodegradation. – 2014. – V. 86. – P. 42–51. 174. Lewandowsky Z., Beyenal H. Masstransfer in heterogeneous biofilms/ Wuertz S., Bishop P., Wilderer P.A// Biofilms in wastewater treatment. – London: IWA Publishing, 2003. – Р. 145-172. 175. Li T., Bai R., Liu J. Distribution and composition of extracellular substances in membrane-aerated biofilm// Journal of Biotechnology. – 2008. – V.135. – P. 52– 57. 176. Lin C.F., Liu S.H., Hao O.J. Effect of functional groups of humic substances on UF performance// Water Research. – 2001. – V. 35. – P. 2395–2402. 177. Lovley D.R. Dissimilatory Fe (III) and Mn (IV) Reduction// Microbiological reviews. – 1991. – V.55, № 2. – P. 259-287. 178. Mains C. Biofilm control in distribution systems// Tech Brief. – 2008. – V.8, № 2. – P. 1-4. 179. Maric C., Vranes J. Characteristics and significance of microbial biofilm formation// Periodicum biologorum. – 2007. – V.109, № 2. – P. 1-7. 137 180. Marion-Ferey K., Pasmore M., Stoodley P., Wilson S., Husson G.P., Costerton J.W. Biofilm removal from silicone tubing: an assessment of the efficacy of dialysis machine decontamination procedures using an in vitro model// Journal of Hospital Infection. – 2002. – V.53. – P. 64–71. 181. Marshall K.C. Adsorption of Microorganisms to Solids and Sediments. In Adsorption of Microorganisms to Surfaces/ G. Bitton and K. C. Marshall// New York: Wiley, 1989. – P. 317-329. 182. Marshall K.C., Characklis W.G., Filip Z., Fletcher M., Hirsch P., Jones G.W., Mitchell R., Pethica B.A., Rose A.H., Calleja G.B. Microbial Adhesion and Aggregation. – Berlin: Springer-Verlag, 1984. – 424 p. 183. Martinez L.R., Casadevall A. Cryptococcus neoformans biofilm formation depends on surface support and carbon source and reduces fungal cell susceptibility to heat, cold, and UV light// Applied and Environmental Microbiology. – 2007. – V.73, № 14. – Р. 4592–4601. 184. Matilainen A., Vepsäläinen M., Sillanpää M. Natural organic matter removal by coagulation during drinking water treatment: A review// Advances in Colloid and Interface Science. – 2010. – V.159, № 15. – P. 189–197. 185. Mayer C., Moritz R., Kirschner C., Borchard W., Maibaum R., Wingender J., Flemming H.-C. The role of intermolecular interactions: studies on model systems for bacterial biofilms// International Journal of Biological Macromolecules. – 1999. – № 26. – P. 3-16. 186. Mazzon R.R., Lang E.A., Braz V.S., Marques M.V. Characterization of Caulobacter crescentus response to low temperature and identification of genes involved in freezing resistance// FEM Microbiology letters. – 2008. – V.288, № 2. – P. 178-185. 187. Melo L.F., Vieira M.J. Effect of clay particles on the behaviour of biofilms formed by Pseudomonas fluorescens// Water Science and Technology. –1995. – V.32, №8. – Р. 45-52. 138 188. Miller M.B. Quorum sensing in bacteria/ M.B. Miller, B.L. Bassler// Annual Review of Microbiology. – 2001. – V.55. – P. 165-199. 189. Mittelman M.W. In bacterial adhesion: molecular and ecological diversity. – New York: Wiley–Liss Inc., 1996. – Р. 89–127. 190. Mogilnaya O.A., Lobova T.I., Kargatova T.V., Popova L.Yu. Biofilm formation by bacterial associations under various salinities and cooper ion stress// Biofouling. – 2005. – V. 21. – №5/6. – P. 247-255. 191. Moldoveanu A. M. Bacterial biofilms utilization of low concentrations of organic matter on hydrophile surfaces submerged in sea water// Scientific Annals of Al. I. Cuza University. – 2011. – V.12. - № 4. – P. 165 – 175. 192. Morrish J.L.E., Brennan E.T., Dry H.C., Daugulis A.J. Enhanced bioproduction of carvone in a two-liquid-phase partitioning bioreactor with a highly hydrophobic biocatalyst// Biotechnology and Bioengineering. – 2008. – V.101, № 4. – P. 768775. 193. Mrozik A., Piotrowska-Serget Z., Labuzek S. Bacterial degradation and bioremediation of polycyclic aromatic hydrocarbons// Polish journal of environmental studies. – 2003. – V. 12, № 1. – P. 15-25. 194. Muster U., Chrost R.J. Origin composition and microbial utilization of dissolved organic matter// Journal of Aquatic Ecology. Biochemical and Molecular Approaches. – New York: Springer, 1990. – Р. 8-46. 195. Nevin K.P. Mechanisms for Accessing Insoluble Fe(III) Oxide during dissimilatory Fe(III) reduction by Geothrix fermentans/ K.P. Nevin, D.R. Lovley // Applied and environmental microbiology. – 2002. – V. 68, № 5. – P. 2294–2299. 196. Nicolella C., van Loosdrecht M.C., Heijnen J.J. Wastewater treatment with particulate biofilm reactors// Journal of biotechnology. – 2000. – V.80, №1. – P. 133. 197. Oliveira R., Melo L.F., Pinheiro M.M., Vieira M.J. Surface Interactions and Deposit Growth in Fouling of Heat Exchangers// Corrosion Reviews. – 1993. – V.11, № 1-2. – P. 59-95. 139 198. O’Toolе G.A., Kaplan H.B., Kolter R. Biofilm formation as microbial development// Annual Review of Microbiology. – 2000. – V.54. – P. 49-79. 199. Patel T.D., Bott T.R. Oxygen diffusion through a developing biofilm of Pseudomonas fluorescens// Journal of Chemical Technology and Biotechnology. – 1991. – V.52. – P. 187-199. 200. Patel I., Patel V., Thakkar A., Kothari V. Microbial biofilms: microbes in social mode// International journal of biotechnology research and practice. – 2013. – V.1, №1. – P. 19-34. 201. Pederson K. Factors regulating microbial biofilm development in a system with slowly flowing seawater// Applied and Environmental Microbiology. – 1982. – V.44, №5. – P. 1196-1204. 202. Prakash B., Veeregowda B.M., Krishnappa G. Biofilms: a survival strategy of bacteria// Сurrent science. –2003. – V. 85, № 9. – P. 10. 203. Pringle J.H., Fletcher M. Influence of substratum wettability on attachment of freshwater bacteria to solid surfaces// Applied Environment Microbiology. – 1983. – V.45. – P. 811–817. 204. Ras M., Lefebvre D., Derlon N., Paul E., Girbal-Neuhauser E. Extracellular polymeric substances diversity of biofilms grown under contrasted environmental conditions// Water Research. – 2011. – V.45, № 4. – Р.1529–1538. 205. Rice J.A., McCarthy P. Statistical evaluation of the elemental composition of humic substances// Organic Geochemistry. – 1991. – V.17, № 5. – P.635-648. 206. Rockne K.J., Strand S.E. Biodegradation of bicyclic and polycyclic aromatic hydrocarbons in anaerobic enrichments// Environmental Science and Technology. – 1998. – V. 32, № 19. – P. 2962–3967. 207. Rodrigues A.L., Pereira M.A., Janknecht P., Brito A.G., Nogueira R. Biofilms formed on humic substances: response to flow conditions and carbon concentrations// Bioresource Technology. – 2010. – V. 101, № 18. – P. 6888– 6894. 140 208. Sauer K., Camper A.K., Ehrlich G.D., Costerton J.W., Davies D.G. Pseudomonas aeruginosa displays multiple phenotypes during development as a biofilm// Journal of Bacteriology. – 2002. – V.184, № 4. – Р.1140–1154. 209. Schauder S., Basler B.L. The languages of bacteria// Genes and Development. – 2001. – V. 15. – Р.1468-1480. 210. Simonnet V.A., Milas M., Rinaudo M.A. New bacterial exopolysaccharide (YAS34). Influence of thermal treatments on the conformation and structure// International Journal of Biological Macromolecules. – 2000. – V.27. – P. 77–87. 211. Singh R. India Biofilms: implications in bioremediation/ R. Singh, D. Paul, R.K. Jain// TRENDS in Microbiology. – 2006. – V.14, № 9. – P. 49-64. 212. Slobodkin A.I., Tourova T.P., Kuznetsov B.B., Kostrikina N.A., Chernyh N.A., Bonch-Osmolovskaya E.A. Thermoanaerobacter siderophilus sp. nov., a novel dissimilatory Fe(III)-reducing, anaerobic, thermophilic bacterium// International Journal of Systematic Bacteriology. – 1999. – V 49. – P. 1471-1478. 213. Somero G.N. Adaptation of enzymes to temperature: searching for basic «strategies»// Comparative biochemistry and physiology, Part B. – 2004. – V.139. – P. 321-333. 214. Srinivasan R., Stewart P., Griebe T., Chen C.I., Xu X. Biocide parameters influencing biocide efficacy// Biotechnology and Bioengineering. – 1995. – V.46, № 6. – P. 553-560. 215. Steinberg C.E.W. Stress Ecology: Environmental stress as ecological driving force and key player in evolution. – Netherlands: Springer science, 2012. – 480 p. 216. Stepanovic S., Cirkovic I., Mijac V., Svabic-Vlahovic M. Influence of the incubation temperature, atmosphere and dynamic conditions on biofilm formation by Salmonella spp.// Food Microbiology – 2003. – V.20. – P. 339–343. 217. Stewart P.S., Franklin M.J. Physiological heterogeneity in biofilms// Nature Reviews Microbiology. – 2008. – V.6, № 3. – P. 199–210. 218. Stewart P.S., Roe F., Rayner J., Elkins J.G., Lewandowski Z., Ochsner U.A., Hassett D.J. Effect of catalase on hydrogen peroxide penetration into Pseudomonas 141 aeruginosa biofilms// Applied and Environmental Microbiology. – 2000. – V.66, № 2. – P. 836–838. 219. Stoodley P., Dodds I., De Beer D., Scott H.L., Boyle J.D. Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure// Journal of Applied Microbiology. – 1998. – V.85. – P. 19–28. 220. Stoodley P., Sauer K., Davies D.G., Costerton J.W. Biofilms as complex differentiated communities// Annual Reviews of Microbiology. – 2002. – V.56. – P. 187-209. 221. Sutherland I.W. Biofilm exopolysaccharides: a strong and sticky framework// Microbiology. – 2001. – V.147, №1. – P. 3–9. 222. Tabak H.H., Lazorchak J.M., Lei L., Khodadoust A.P., Antia J.E., Bagchi R., Suidan M.T. Studies on bioremediation of polycyclic aromatic hydrocarboncontaminated sediments: bioavailability, biodegradability, and toxicity issues// Environmental Toxicological Chemistry. – 2003. – V. 22, № 3. – P. 473-482. 223. Thurman E.M. Organic geochemistry of natural waters. – The Netherlands, Dordrecht: D. Reidel Publ. Co, 1985. – 497 p. 224. Trzesicka-Mlynarz D., Ward O.P. Degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) by a mixed culture and its component pure cultures, obtained from PAH-contaminated soil// Canadian Journal of Microbiology. – 1995. – V. 41, № 6. – P. 470-476. 225. Walter D.A. Geochemistry and microbiology of iron-related well-screen encrustation and aquifer biofouling in suffolk county// Water-Resources Investigations Report 97-4032. – USA, New York, 1997. – 37 p. 226. Waters C., Basler B.L. QS cell to cell communication in bacteria// Annual Review of Cell and Developmental Biology. – 2005. – V.21. – P. 319-346. 227. Watnick P., Kolter R. Biofilm, city of microbes// Journal of Bacteriology. – 2000. – V.182. – P. 2675-2679. 228. Weimer P.J., Conner A.H., Lorenz L.F. Fermentation residues from Ruminococcus cellulose fermentations as novel components of wood adhesive 142 formulations// Applied microbiology and biotechnology. – 2003. – V. 63. – P. 2934. 229. Wetzel R.G. Limnology: Lake and River Ecosystems. – San Diego: Academic Press, 2001. – 1006 p. 230. Wolin M.J., Miller T.L. Microbe-microbe interactions/ P.J. Hobson (Ed.)// The Rumen Microbial Ecosystem. – London, UK: Elsevier Applied Science Publishers Ltd, 1988. – Р.343–359. 231. Underwood G.J.C., Provot L. Determining the environmental preferences of four estuarine epipelic diatom taxa: growth across a range of salinity, nitrate and ammonium conditions// European Journal of Phycology. – 2000. – V.35, № 2. – Р.173-182. 232. Van Zomeren A., Van der Weij-Zuiver E., Comans R.N. Development of an automated system for isolation and purification of humic substances// Analytical and Bioanalytical Chemistry. – 2008. – V. 391, № 6. – Р. 2365–2370. 233. Veselova M., Kholmeckaya M., Klein S., Voronina E., Lipasova V., Metlitskaya A., Mayatskaya A., Lobanok E., Khmel I., Chernin L. Production of Nacylhomoserine lactone signal molecules by gram-negative soil-borne and plantassociated bacteria// Folia Microbiology. – 2003. – V.48. –P. 794-798. 234. Ylla I., Borrego C., Romani A. M., Sabater S. Availability of glucose and light modulates the structure and function of a microbial biofilm// FEMS Microbiology Ecology. – 2009. – V.69. – P. 27-42. 235. Young K.C., Maurice P.A., Docherty K.M., Bridgham S.D. Bacterial degradation of dissolved organic matter from two northern Michigan streams// Geomicrobiology Journal. – 2004. – V. 21, № 8. – P. 521–528. 236. Zegeye A., Mustin C., Jorand P. Bacterial and iron oxide aggregates mediate secondary iron mineral formation: green rust versus magnetite// Geobiology. – 2010. – V. 8, № 3. – P. 209–222. 143 237. Zhang L., Gao G., Tang X., Shao K. Impacts of different salinities on bacterial biofilm communities in fresh water// Canadian Journal of Microbiology. – 2014. – V.60, № 5. – P. 319-326. 238. Zhou B., Li Y., Liu Y., Pei Y., Jiang Y., Liu H. Effects of flow path depth on emitter clogging and surface topographical characteristics of biofilms// Irrigation and Drainage. – 2014. – V. 63, № 1. – P. 46-58. 239. Zhou L., Xia S., Zhang Z., Ye B., Xu X., Gu Z., Wang X. Effects of pH, temperature and salinity on extracellular polymeric substances of Pseudomonas aeruginosa biofilm with N-(3-Oxooxtanoyl)-L-Homoserine Lactone addition// Wang Journal of Water Sustainability. – 2014. – V. 4, № 2. – Р. 91-100.
