экспериментальные данные о взаимодействии пестицидов с

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ДАННЫЕ О ВЗАИМОДЕЙСТВИИ ПЕСТИЦИДОВ С
ALTERNARIA TENIUS 41
Кунанбаев К.К., Науанова А.П.
Одним из наиболее распространенных следствий многолетнего применения пестицидов
является перегруппировка видового состава в микробных сообществах почв [1]. Однако при
этом возрастает уровень нагрузки на почвенную биоту, что может приводить к смене
доминирующих форм микроорганизмов [2].
С целью экологического мониторинга загрязнение почв пестицидами теоретически, для
каждого вновь синтезированного препарата должен быть подобран свой спектр показателей,
адекватно отражающих степень отрицательного воздействия пестицида на экосистему.
Как отмечают многие исследователи проблема деструкции пестицидов с помощью
микроорганизмов находится на стадии научных изысканий в нескольких направлениях [3-4]. В
нашем случае, проводился скрининг микроорганизмов в природной среде, способных к
деструкции пестицидов. Встречаются мнение о том, что поиск микроорганизмов можно
проводить со смешанными культурами бактерий, выделенных из почвы, сточных вод или
активного ила, либо с неидентифицированными до вида культурами, что исключает
возможность воспроизведения экспериментов или создания коллекции чистых культур
микроорганизмов-деструкторов [5].
Целью нашей работы было изучить влияние пестицидов: стриг, клинч, виллан – супер и
эльф на Alternaria tenius 41 выделенного в виде чистой культуры на кафедре почвоведения и
агрохимии АО «КАТУ им. С.Сейфуллина». Анализ деструктивной активности был проведен в
лаборатории экологии и почвенно – агрохимических исследований ТОО «НПЦ ЗХ им. А.И.
Бараева».
Материалы и методы
Определение чувствительности к химическому препарату почвенных микромицетов рода
Alternaria проводился на твердой питательной среде Чапека. После стерилизации в
питательные среды вносили пестицид с таким расчетом, чтобы конечная концентрация
препарата соответствовала производственной дозе. Для посева получали отпечатки чистых
культур в четырехкратной повторности с целью получения достоверных результатов. Чашки с
посевами культивировали в термостате при температуре 28°С в течение 6-7 суток. После
инкубации учитывали диаметр выросших колоний и сравнивали с ростом аналогичных культур
в контроле без гербицида. Торможение и стимулирование роста штаммов рассчитывали по
формуле Эббота [5]:
Т= (Дк – Д0)/ Дк × 100
где Т- торможение роста; Дк - диаметр колоний в контроле; До - диаметр колоний в опыте.
В случае стимулирования роста микроорганизмов показатель Т - торможение имеет
отрицательное значение, а при подавлении их роста — положительное.
Способность грибов использовать углерод пестицидов изучалась на жидкой минеральной
среде М9. Для этого в среду М9, содержащий пестицид вносился штамм гриба A. tenius 41.
Снятие спектра на 1 сутки было контролем, по отношению к которому снимались
последующие спектры. Спектрофотометрический анализ проводили в супернатанте после
центрифугирования среды с микроорганизмами. Контролем служила среда с пестицидом, не
содержащая микроорганизм. Для записи спектров использовался спектрофотометр Varian Cary 50
(США).
Результаты исследований
Анализ экспериментальных данных показал, что пестицид топик стимулировал рост
почвенного гриба A. tenius 41 на всех вариантах с 9 дозами препаратов (таблица 1). Так в дозе
превышающую рекомендованную в два раза (0,8 л/га) коэффициент торможения (КТ)
С. Сейфуллин атындағы ҚазАТУ –ң Ғылым жаршысы /
Вестник науки КазАТУ им. С.Сейфуллина. – 2011. - № 2 (69).- С. 23-29.
достигает – 80,77%, на 6 сутки КТ по отношению к контролю снизился, тем не менее,
рост колонии продолжался. Наименьший коэффициент торможения был зафиксирован в
дозировке препарата 0,16 л/га, где КТ составил – 13,85%, на 6 – е сутки несмотря на снижение
КТ, диаметр колоний гриба продолжает возрастать.
Иная ситуация наблюдается при использовании препарата стриг. Его действие оказало
ингибирующий эффект на все варианты. Наибольший коэффициент торможения составил
30,7% при дозировке препарата (0,80 л/га), однако на 6 – е сутки с использованием этой же
дозы коэффициент торможения
снизился до 10%. В это же время на варианте с контролем, диаметр колоний возрос
примерно на 10%, при максимальной дозе препарата 2л/га.
Действие препарата эльф на всех гербицидных вариантах вызвал небольшое снижение
роста колоний. Максимальное снижение роста по сравнению с контролем было зафиксировано
на 19%. Однако на 6 – е сутки коэффициент торможения постепенно снизился, заметно
возрастание диаметра колоний в 1,1 и 1,5 раза. На контрольном варианте наблюдался
небольшой рост штамма из-за неактивного усвоения элементов питания.
Коэффициент торможения на варианте с препаратом виллан – супер на 3 сутки был
положительным и варьировал в пределах от 8 до 22%, где с увеличением концентрации
пестицида идет снижение диаметра колоний по сравнению с контролем. На 6 сутки диаметр
колоний на всех вариантах был практически одинаков, но превышал контрольный вариант (КТ
= -27,80).
На варианте с препаратом клинч, пестициды оказали индифферентное воздействие,
наиболее сильное ингибирование нами было отмечено на варианте, где концентрация
пестицида превышала рекомендованную дозу в 2 раза.
Таким образом, один пестицид может вызывать угнетение, стимуляцию и проявлять
индифферентное отношение, даже если судить по одному и тому же показателю
микробиологической активности. Часто один и тот же исследователь наблюдал прямо
противоположные эффекты. Аналогичные спектры несогласующихся эффектов можно
привести и для других пестицидов. Причин такому явлению, вероятно множество, однако не
последнее место, на наш взгляд, занимают неодинаковость условий экспериментов и
разночтения в трактовке результатов.
Таблица 1 - Влияние пестицидов на рост и развитие Alternaria tenius 41
Название препаратов
Доза
л/га
Топик
3 сутки
6 сутки
Диаметр колоний, см
0,80
0,72
0,64
0,56
0,48
0,4
0,32
0,24
0,16
К
НСР05
2,35 ± 0,15
1,85 ± 0,41
2,20 ± 0,13
2,23 ± 0,15
2,20 ± 0,14
2,40 ± 0,17
2,28 ± 0,26
2,33 ± 0,46
1,48 ± 0,35
1,30 ± 0,17
0,27
Доза
л/га
3,35 ± 0,15
2,85 ± 0,34
3,03 ± 0,17
3,15 ± 0,35
2,70 ± 0,18
4,03 ± 0,19
3,93 ± 0,24
3,58 ± 0,27
2,55 ± 0,19
2,50 ± 0,17
0,32
Виллан - супер
3 сутки
6 сутки
Диаметр колоний, см
1,02
1,08
0,96
0,84
0,72
0,60
0,48
0,36
0,24
К
НСР05
2,85 ± 0,06
2,80 ± 0,08
2,95 ± 0,10
2,98 ± 0,12
2,88 ± 0,15
2,68 ± 0,09
2,88 ± 0,09
3,18 ± 0,15
3,18 ± 0,05
3,13 ± 0,09
0,21
4,00 ± 0,17
4,00 ± 0,19
4,00 ± 0,22
4,00 ± 0,15
4,00 ± 0,14
4,00 ± 0,31
4,00 ± 0,16
4,00 ± 0,07
4,00 ± 0,09
3,48 ± 0,45
0,09
3 сутки 6 сутки
Коэффициент
торможения, %
-80,77
-34,00
-42,33
-14,00
-69,23
-21,20
-71,54
-26,00
-69,23
-8,00
-84,62
-61,20
-75,38
-57,20
-79,23
-43,20
-13,85
-2,00
Доза
л/га
Стриг
3 сутки
6 сутки
Диаметр колоний, см
2,00
1,80
1,60
1,40
1,20
1,00
0,80
0,60
0,40
К
НСР05
2,63 ± 0,63
2,45 ± 0,45
2,68 ± 0,17
2,43 ± 0,22
2,78 ± 0,14
2,33 ± 0,52
2,08 ± 0,39
2,48 ± 0,17
2,50 ± 0,26
3,00 ± 0,19
0,35
3 сутки 6 сутки
Коэффициент
торможения, %
18,10
-27,80
19,54
-27,80
15,23
-27,80
14,37
-27,80
17,24
-27,80
22,99
-27,80
17,24
-27,80
8,62
-27,80
8,62
-27,80
Доза
л/га
2,88 ± 0,21
3,23 ± 0,02
3,33 ± 0,06
3,20 ± 0,17
3,58 ± 0,18
3,65 ± 0,32
3,28 ± 0,05
3,43 ± 0,07
3,68 ± 0,09
3,68 ± 0,12
0,32
Эльф
3 сутки
6 сутки
Диаметр колоний, см
0,40
0,36
0,32
0,28
0,24
0,20
0,16
0,12
0,08
К
НСР05
2,98 ± 0,12
2,53 ± 0,20
2,73 ± 0,12
2,83 ± 0,09
2,68 ± 0,05
3,03 ± 0,09
3,10 ± 0,37
2,93 ± 0,09
3,05 ± 0,10
3,13 ± 0,09
0,31
3,95 ± 0,06
3,50 ± 0,21
3,68 ± 0,23
3,98 ± 0,05
3,70 ± 0,35
4,00 ± 0,01
3,95 ± 0,10
4,00 ± 0,01
4,00 ± 0,01
4,00 ± 0,07
0,17
3 сутки 6 сутки
Коэффициент
торможения, %
12,33
21,74
18,33
12,23
10,67
9,51
19,00
13,04
7,33
2,72
22,33
0,82
30,67
10,89
17,33
6,79
16,67
0
3 сутки 6 сутки
Коэффициент
торможения, %
4,79
1,25
19,17
12,5
12,78
8,00
9,58
0,50
14,38
7,50
3,19
0
0,96
1,25
6,39
0
2,56
0
Клинч
Доза
л/га
1,73
1,53
1,36
1,19
1,02
0,85
0,68
0,51
0,34
К
НСР05
Клинч
Доза
л/га
1,73
1,53
1,36
1,19
1,02
0,85
0,68
0,51
0,34
К
НСР05
3 сутки
Диаметр
колоний, см
1,78 ± 0,22
2,10 ± 0,18
2,28 ± 0,05
1,95 ± 0,16
2,08 ± 0,37
2,25 ± 0,08
2,10 ± 0,09
2,33 ± 0,18
2,03 ± 0,15
2,70 ± 0,14
0,14
6 сутки
Диаметр
колоний, см
2,83 ± 0,17
2,98 ± 0,19
2,95 ± 0,16
2,83 ± 0,25
2,93 ± 0,07
3,15 ± 0,18
3,18 ± 0,12
2,85 ± 0,30
3,20 ± 0,46
-
Для выявления закономерностей между ростом колоний и дозой вносимых препаратов,
нами было составлено уравнение множественной регрессии и вычислены коэффициенты
корреляции (таблица 2), которые показали тесную связь между дозой вносимых препаратов и
диаметром колоний r = - 0,74 для препарата эльф и средняя для препаратов стриг r = - 0,59.
Слабая корреляционная зависимость отмечалась при применении препарата топик r = - 0,12.
Таблица 2 - Корреляционная связь между дозой вносимых пестицидов и диаметром колоний
Alternaria tenius 41
Пестицид
топик
стриг
клинч
виллан-супер
эльф
Уравнение
множественной
линейной регрессии
Y=3,03 – 0,31 × x
Y=3,74 – 0,01 × x
Y=3,14 – 0,15 × x
Y=3,62 – 0,47 × x
Y=3,14 – 0,15 × x
Коэффициент
множественной
регрессии
0,15
0,54
0,59
0,62
0,76
Коэффициент
корреляции
-0,12
-0,50
-0,48
-0,59
-0,74
Характер действия любого токсического соединения зависит от его концентрации.
Поэтому основным является вопрос о реакции микроорганизмов на определенную
концентрацию субстрата-яда в среде. Особенности роста микроорганизмов в зависимости от
концентрации субстрата в среде впервые наиболее полно исследовал Моно [6]. Позднее,
зарубежные исследователи [7] показали, что расход субстрата на энергию поддержания
наблюдается всегда, а в некоторых случаях достигает значительной величины. Очевидно, что
чем больше субстрата расходуется на энергию поддержания, тем ниже экономический
коэффициент. Скорость роста микроорганизмов также пропорциональна концентрации
субстрата, но в этом случае зависимость сложнее. Графически она представлена кривой,
напоминающей гиперболу. Следовательно, после возрастания концентрации до определенного
уровня скорость роста далее сколь-либо заметно не увеличивается. Такая зависимость
характерна для любой гетерогенной системы, в которой установилось динамическое
равновесие между поступлением и удалением конкретного компонента при его различных
концентрациях, что описывается изотермой Лангмюра.
Имеются три типа реакции микроорганизмов на изменение концентрации любого
субстрата: 1) в определенном диапазоне концентраций скорость роста прямо пропорциональна
концентрации; 2) в определенном диапазоне скорость роста не зависит от концентрации; 3) в
определенном диапазоне скорость роста обратно пропорциональна концентрации. Для
исследования кинетики роста на субстратах-ядах в периодической культуре и в протоке
использовал метод математического моделирования и с помощью ЭВМ получил семейство
кривых, характеризующих процесс. Был сделан вывод, что в периодической культуре при
возрастании концентрации субстрата-яда в среде увеличивается лаг-период, но в фазе
экспоненциального роста время генерации практически не зависит от исходной концентрации
субстрата-яда [8].
Для изучения деструктивной активности A. tenius 41 нами проводилось изучение
спектральной характеристики минеральной среды М9, в которой пестициды выступали в
качестве энергетического и питательного субстратов. Спектры со средой снимались на 1, 3, 9 и
14 сутки. Максимальное поглощение препарата топик ультрафиолетовыми лучами (УФ) было
зафиксировано при длине волны 200 – 210 нм, которое сохранялось на протяжении 9 суток, что
свидетельствовало о стойкости препарата в среде (рисунок 2). Однако на 14 – е сутки мы
наблюдали рост колоний и изменения в спектральной характеристике препарата. Пик
максимального спектра (УФ) смещался к области 210 нм. Результаты полученных данных
показали, что под воздействием штамма происходит трансформация топика, о чем
свидетельствуют изменения в спектральном анализе деструкции.
клинч
стриг
виллан - супер
топик
Рисунок 2 – Спектральная характеристика Alternaria tenius 41 с пестицидами (минеральная среда М9
Наблюдение за деструктивной активностью штамма с препаратом стриг на жидкой
минеральной среде М9 велось в течение недели. Максимальное поглощение ультрафиолетовых
лучей было зафиксировано в области 270 – 290 нм. Анализ полученных данных показал, что
под воздействием микроорганизма, изменение в спектральной характеристике происходило
только на 7 – е сутки.
При использовании препарата виллан – супер в качестве источника углерода, было
обнаружено, что диапазон поглощения ультрафиолетовых лучей приходился на 260 – 310 нм.
Изменение спектральной характеристики препарата было выявлено на 3 – й день. Дальнейшие
изменения в спектральной характеристике продолжались в течении 9 суток и зафиксировано в
области 190 – 200 нм.
Таким образом, по результатам полученных данных с препаратами топик, стриг, виллан –
супер и эльф была обнаружено, что под воздействием A. tenius 41, вероятно происходит
трансформация пестицидов, о чем свидетельствуют изменения в спектральном анализе
деструкции жидкой минеральной среды.
По данным Ю.В. Круглова [9] к деградации пестицидов способны микроорганизмы
различных таксономических групп. Пестициды группы оксикарбоновых и ароматических
кислот в чистых культурах активно разрушают, грибы родов
Trichoderma, Penicillim,
Chaetomium, Fusarium. Производные мочевины способны разрушать бактерии родов, грибы
родов Penicillim, Aspergillus, Fusarium.
Следует отметить, что концентрации гербицидов, токсичные для микроорганизмов,
иногда отличаются на один-два порядка. Это объясняется, по-видимому, как отсутствием
единой методики проведения исследований, так и значительной вариабельностью в
чувствительности к гербицидам.
Заключение
Анализ результатов, полученных при изучении взаимодействия пестицидов со штаммом
A. tenius 41 выявил, что пестициды не полностью ингибировали развитие колоний
микромицета. Максимальный коэффициент торможения был зафиксирован на варианте с
препаратом стриг на 3 сутки - 30,67%, на остальных вариантах коэффициент торможения
находился в пределах 5 - 15%. На вариантах, где наблюдалась стимуляция роста колоний,
разброс КТ в зависимости от концентрации и вида пестицида варьировал от 2 до 85%. Анализ
жидкой минеральной среды М9 с химическими препаратами зафиксировал изменения в
спектрах поглощения на 3 – 9 сутки по сравнению с контролем, что свидетельствует об
использовании A. tenius 41 пестицидов в качестве источников углерода и энергии.
Литература
1. Ананьева Н. Д., Стрекозов Б. П., Тюрюканова Г. К. Изменение микробной биомассы в
почвах под действием пестицидов // Агрохимия. -1986.- №5.- С.84-90.
2. Алферов В.А., Российская И.В., Понаморева О.Н., Решетилов А.И., Кошелева И.А.
Изучение путей деградации ксенобиотиков с помощью микробного сенсора // Материалы II
Международной научн. Конф. «Ксенобиотики и живые системы». - Минск: БГУ. 2003. С. 36-39.
3. Головлева Л. А., Головлева Е.Л. Микробиологическая деградация пестицидов
//Успехи микробиологии.- 1980.-№ 15. С. 137-139.
4. Звягинцев Д.Г. Эколого-микробиологические основы очистки почв от загрязнений
//Микробиологические методы борьбы с загрязнением окружающей среды: Тез докл. конф. Пущино, 1975.- С. 87-88.
5. Cook А. М., Grossebcher Н., Wolfram Н., Hutter R. Biodegradion if xenobiotic undustrial
wastes: арр1iеd microbiology complementing chemical treatments//Biotechn. 83. Ргос. Int. Cont
Соmmег.Арр1. and lmplicat. Вiоtесhnо1." Nortwood, 1983. P. 451-455.
6. Андреева Е.И., Картомышева B.C. Методические рекомендации по испытанию
химических веществ на фунгицидную активность. – Черкассы. 1990. - 67 с.
7. Monod J. Recherches sur la croissance des cultures bacteriennes. 1958.
8. Dean A.C.R., Hibchelwood C. Grouwth function and regulation in bacterial cell. L.: Oxford
Clarendon Press, 1966.
9. Круглов Ю.В. Влияние пестицидов и продуктов их трансформации на сообщества
почвенных микроорганизмов //Экология почвенных микроорганизмов. - М., 1975.- С. 23-27.
Түйін
Солтүстік Қазақстанның оңтүстік карбонатты қарашірігінде гербицид қолданылған
егістіктен микроорганизмдер штаммдары бөліп алынды. Топырақ саңырауқұлақтарының
өсуіне әртүрлі пестицидтердің әсері зерттелді. Пестицидтердің әсер етуіне төзімді топырақ
микроорганизмдері анықталды. Спектрофотометрлік
талдау барысында
аталған
микромицеттің деструкторлық спектрлеріне сипаттама берілді. Сұйық минералды ортадағы
спектрлі талдау нәтижесі Alterrnaria tenius 41 саңырауқұлағының виллан-супер, топик, ельф
және стринг пестицидті препараттарын көміртегі мен энергия көзі ретінде қолдана
алатындығын көрсетті. Регрессия және корреляция коэффициенті аркылы препараттарды доза
мөлшерінде қолдану және колония диаметрі арқылы алынды.
Summary
From crops where herbicides are applied on the southern carbonate black soils of the Northern
Kazakhstan strains of microorganisms were isolated. Was studied the effect of various pesticides on
the development of soil fungi. Soil microorganisms resistant to pesticides were isolated. In the
spectrophotometric analysis were given the characteristics of spectra destruction of the given
micromycetes. Spectral analysis on liquid mineral medium showed the possibility of using pesticide
products, such as super villain, tonic, elf, strig, and Alternaria tenius fungus 41 as sources of carbon
and energy. The coefficients of regression and correlation between the dose of medications and the
diameter of the colonies were obtained.