© Êîëëåêòèâ àâòîðîâ, 2012 Ä. À. Ãóñàðîâ, È. Â. Ñîêîëîâà, Â. Ä. Ãóñàðîâà, Å. À. Åâòååâà, Ò. Â. Âîðîáüåâà, Ñ. À. Êîñàðåâ, Å. Ä. Øèáàíîâà, Ä. È. Áàèðàìàøâèëè ÐÀÇÐÀÁÎÒÊÀ ÝÔÔÅÊÒÈÂÍÎÉ ÎÏÛÒÍÎ-ÏÐÎÌÛØËÅÍÍÎÉ ÒÅÕÍÎËÎÃÈÈ ÏÎËÓ×ÅÍÈß N,N-ÁÈÑÌÅÒÈÎÍÈËÃÈÑÒÎÍÀ H1.3, ÈÑÏÎËÜÇÓÅÌÎÃÎ ÄËß ÒÅÐÀÏÈÈ ËÈÌÔÎÌ Ôåäåðàëüíîå ãîñóäàðñòâåííîå áþäæåòíîå ó÷ðåæäåíèå íàóêè Èíñòèòóò áèîîðãàíè÷åñêîé õèìèè èì. àêàäåìèêîâ Ì. Ì. Øåìÿêèíà è Þ. À. Îâ÷èííèêîâà ÐÀÍ, Ìîñêâà, Ðîññèÿ  íàñòîÿùåå âðåìÿ â ìåäèöèíå âñå áîëüøåå âíèìàíèå óäåëÿåòñÿ òåðàïåâòè÷åñêîìó ëå÷åíèþ ëèìôîì ñ ïîìîùüþ ìîíîêëîíàëüíûõ àíòèòåë. Îäíàêî îòñóòñòâèå â íàøåé ñòðàíå ïðîèçâîäñòâà ïîäîáíûõ ïðåïàðàòîâ âûíóæäàåò çàêóïàòü èõ çà ðóáåæîì. Ïîêàçàíî, ÷òî ãèñòîíû êëàññà Í1 ìîãóò áûòü èñïîëüçîâàíû êàê êîíêóðåíòíûå àíàëîãè ìîíîêëîíàëüíûõ àíòèòåë ïî ðåçóëüòàòàì òåðàïåâòè÷åñêîãî âîçäåéñòâèÿ. Íàìè ðàçðàáîòàíà ýôôåêòèâíàÿ îòå÷åñòâåííàÿ îïûòíî-ïðîìûøëåííàÿ òåõíîëîãèÿ ïîëó÷åíèÿ ðåêîìáèíàíòíîãî N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîíà Í1.3, îïèñàííàÿ â íàñòîÿùåé ñòàòüå. Íàðàáîòàííîå êîëè÷åñòâî ïðåïàðàòà, ÷èñòîòà è àêòèâíîñòü êîòîðîãî ïîäòâåðæäåíû ðàçëè÷íûìè òåñòàìè, ïîçâîëèëî íà÷àòü êëèíè÷åñêèå èñïûòàíèÿ â íàøåé ñòðàíå. Êëþ÷åâûå ñëîâà: N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîí, ëèìôîìà, õðîìàòîãðàôèÿ, òåõíîëîãèÿ. Îäíèì èç íàèáîëåå îïàñíûõ îíêîëîãè÷åñêèõ çàáîëåâàíèé ÿâëÿþòñÿ ëèìôîìû, â ïðîöåññå êîòîðûõ ïðîèñõîäèò áåñêîíòðîëüíîå íàêîïëåíèå îïóõîëåâûõ ëèìôîöèòîâ. Ïî êëàññèôèêàöèè ÂÎÇ âûäåëÿþò 43 ðàçëè÷íûå ôîðìû ëèìôîì [1].  íàèáîëåå îáùåì ðàññìîòðåíèè âñå ýòè ôîðìû âõîäÿò ëèáî â êëàññè÷åñêèå õîäæêèíñêèå (ëèìôîãðàíóëåìàòîç õîäæêèíñêîãî òèïà), ëèáî â íåõîäæêèíñêèå ëèìôîìû. Ëå÷åíèå òàêèõ îáðàçîâàíèé ìîæåò âêëþ÷àòü ãîðìîíàëüíóþ, ðàäèî-, õèìèî- è êîìáèíàöèîííóþ òåðàïèè, ãåìàòîïîýçíóþ ïåðåñàäêó ñòâîëîâûõ êëåòîê, à òàêæå òåðàïèþ ìîíîêëîíàëüíûìè àíòèòåëàìè. Ïîñëåäíåé â íàñòîÿùåå âðåìÿ óäåëÿþò îñîáåííîå âíèìàíèå. Ïðè òåðàïèè ìîíîêëîíàëüíûìè àíòèòåëàìè, íàèáîëåå èçâåñòíûì èç êîòîðûõ ÿâëÿåòñÿ ðèòóêñèìàá (ìàáòåðà), ìèøåíüþ â îðãàíèçìå áîëüíîãî ÿâëÿåòñÿ ñïåöèôè÷åñêàÿ ïîâåðõíîñòíàÿ äåòåðìèíàíòà CD20, ïðåäñòàâëÿþùàÿ ñîáîé íåãëèêîçèëèðîâàííûé ôîñôîðèëèðîâàííûé áåëîê, ñîñòîÿùèé èç 297 à.ê.î. (ìîëåêóëÿðíàÿ ìàññà 32 – 37 êÄà) [2, 3]. Îäíàêî òàêîå òåðàïåâòè÷åñêîå ëå÷åíèå èìååò ðÿä íåäîñòàòêîâ: âîçìîæíûå àíàôèëàêòè÷åñêèå ðåàêöèè [4]; îñëîæíåíèÿ, âûçûâàåìûìè ðàäèîàêòèâíûìè èçîòîïàìè (÷àùå âñåãî éîäà 131 èëè èòòðèÿ 90), êîòîðûìè ìå÷åíî ìîíîêëîíàëüíîå àíòèòåëî (íàïðèìåð, èáðèòóìîìàá, èëè çåâàëèí, à òàêæå òîñèòóìîìàá, èëè áåêññàð). Ïîýòîìó íàì ïðåäñòàâëÿåòñÿ áîëåå ïåðñïåêòèâíûì èñïîëüçîâàíèå ïðåïàðàòîâ íà îñíîâå ëèíêåðíûõ ãèñòîíîâ äëÿ òåðàïèè ëèìôîì. Ãèñòîíû êëàññà Í1 è èõ ïðîèçâîäíûå ìîãóò îáðàçîâûâàòü àãðåãàòû ñ ôîñôàòèäèëñåðèíîì ìåìáðàíû îïóõîëåâîé êëåòêè, «âûìûâàÿ» åãî èç áèñëîÿ ôîñôîëèïèäîâ, ÷òî ïðèâîäèò ê àïîïòîçó óæå â ñ÷èòàííûå ìèíóòû äåéñòâèÿ ãèñòîíà è ê íåêðîçó îïóõîëè ÷åðåç íåñêîëüêî ÷àñîâ òåðàïèè [5]. Îäíàêî íà ñîâðåìåííîì áèîôàðìàöåâòè÷åñêîì ðûíêå â íàñòîÿùåå âðåìÿ ïðèñóòñòâóþò òîëüêî ïðåïàðàòû íà îñíîâå Õèìèêî-ôàðìàöåâòè÷åñêèé æóðíàë. Òîì 46, ¹ 4, 2012 ìîíîêëîíàëüíûõ àíòèòåë, ïðè÷åì â íàøåé ñòðàíå, íå èìåþùåé ñîáñòâåííûõ ïðîèçâîäñòâ, íåîáõîäèìî çàêóïàòü èõ çà ñ÷åò ãîñóäàðñòâåííîãî áþäæåòà [6]. Ïðåäñòàâëÿåòñÿ ïåðñïåêòèâíûì ðàçðàáîòàòü ýôôåêòèâíóþ îòå÷åñòâåííóþ òåõíîëîãèþ ïðîèçâîäñòâà ëåêàðñòâåííûõ ôîðì íà îñíîâå ãèñòîíîâ, êàê êîíêóðåíòíûõ çàìåñòèòåëåé ìîíîêëîíàëüíûõ àíòèòåë. Îäíèì èç òàêèõ ãèñòîíîâ ÿâëÿåòñÿ N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîí Í1.3 [7]. Öåëü íàñòîÿùåé ðàáîòû — ðàçðàáîòêà îïûòíî-ïðîìûøëåííîé òåõíîëîãèè ïðîèçâîäñòâà àêòèâíîé ôàðìàöåâòè÷åñêîé ñóáñòàíöèè (ÀÔÑ) ðåêîìáèíàíòíîãî N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîíà Í1.3, íà îñíîâå óæå ðàçðàáîòàííîé ëàáîðàòîðíîé òåõíîëîãèè [8]. Ýêñïåðèìåíòàëüíàÿ ÷àñòü Ïðèáîðû è ìàòåðèàëû  êà÷åñòâå ñèñòåìû äëÿ ñèíòåçà ðåêîìáèíàíòíîãî N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîíà Í1.3 èñïîëüçîâàëñÿ øòàìì-ïðîäóöåíò E. coli BL21/prhH1.3, ïîëó÷åííûé îò ÇÀÎ “Êðèîíèêñ” (Ðîññèÿ).  ýêñïåðèìåíòàõ ïî áèîñèíòåòè÷åñêîé íàðàáîòêå áåëêà èñïîëüçîâàëèñü ñëåäóþùèå ðåàêòèâû êâàëèôèêàöèè ÷., ÷.ä.à., õ.÷: ãëþêîçà; àìèíîòîí; äðîææåâîé ýêñòðàêò; êàëèé ôîñôîðíîêèñëûé äâóçàìåùåííûé; íàòðèé õëîðèñòûé; ìàãíèé ñåðíîêèñëûé; êàíàìèöèí; àììèàê; èçîïðîïèë-b-D-òèîãàëàêòîïèðàíîçèä (ÈÏÒÃ); âîäà î÷èùåííàÿ. Èñïîëüçîâàëîñü ñëåäóþùåå îáîðóäîâàíèå: åìêîñòíîé òàíê âìåñòèìîñòüþ 2,5 ì3; ôåðìåíòåð âìåñòèìîñòüþ 3 ì3; ñåïàðàòîð Westfallia (GEA Westfallia, Ãåðìàíèÿ); ïðîòî÷íûé äåçèíòåãðàòîð Gaulin MC 211 (APV, Ãåðìàíèÿ).  ýêñïåðèìåíòàõ ïî âûäåëåíèþ è î÷èñòêå èñïîëüçîâàíû ñëåäóþùèå ðåàêòèâû êâàëèôèêàöèè õ.÷. è ôàðìàêîïåéíîé ÷èñòîòû: õëîðíàÿ, ëèìîííàÿ êèñëîòû; ýòàíîë; õëîðèä íàòðèÿ; ãèäðîêñèä íàòðèÿ; âîäà äëÿ èíú35 NH2 Met Ser Glu Thr Ala Pro Leu Ala Pro Thr Ile Pro Ala Pro Ala Glu Lys Thr Pro Val Lys Val Pro Pro Gly Ser Ala Lys Arg Lys Gly Ala Thr Ala Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Leu Ile Thr Lys Ala Val Ala Ala Ser Lys Glu Arg Ser Gly Val Ser Leu Ala Ala Ser Glu Leu Leu Arg Ile Arg Ser Asn Asn Lys Glu Val Asp Tyr Gly Ala Ala Ala Leu Ala Lys Lys Lys Ser Leu Val Ser Lys Gly Thr Leu Val Gln Thr Lys Gly Thr Gly Ala Ser Gly Gly Leu Ser Gly Ala Lys Lys Ala Lys Pro Lys Gly Glu Gly Ser Ala Ala Lys Lys Asn Leu Lys Phe Lys Pro Arg Lys Pro Ala Gly Ala Ala Lys Lys Pro Lys Lys Val Ala Gly Ala Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Thr Ala Pro Lys Lys Val Lys Lys Pro Thr Lys Lys Ile Ser Lys Lys Pro Lys Val Ala Lys Ser Ala Lys Lys Val Lys Thr Pro Gln Pro Lys Lys Ala Ala Lys Thr Lys Ser Lys Pro Lys Gly Ser Lys Pro Lys Ala Ala Lys Lys Ala Lys Lys Ala Ala Pro Lys Lys Lys Pro Lys Pro Ala Lys Ala Lys Ala Pro Val Thr COOH Ðèñ. 1. Àìèíîêèñëîòíàÿ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü ÷åëîâå÷åñêîãî ãèñòîíà Í1.3. à 1 2 á 3 Äà, ìÂò 94000 67000 43000 30000 21100 14400 6 8 10 12 14 16 18 ìèí Ðèñ. 2. Ðåçóëüòàòû àíàëèòè÷åñêîãî êîíòðîëÿ ñòàäèè ýêñòðàêöèè öåëåâîãî áåëêà èç ñóñïåíçèè äåçèíòåãðàòà êëåòî÷íîé ìàññû: à — ÏÀÀÃÝ, äîðîæêà 1 ñîîòâåòñòâóåò áåëêó äî ýêñòðàêöèè, äîðîæêà 2 — áåëêó ïîñëå ýêñòðàêöèè, äîðîæêà 3 — ñòàíäàðòàì ìàññ LMW; á — îáðàùåíî-ôàçîâàÿ ÂÝÆÕ, âðåìÿ óäåðæàíèÿ öåëåâîãî áåëêà ñîñòàâëÿåò ïðèìåðíî 13,4 ìèí. åêöèé (î÷èùåííàÿ íà äèñòèëëÿöèîííîé óñòàíîâêå ÄÝ-25, ìîäåëü 784, Ðîññèÿ). Ðàñòâîðû âñåõ ïîäâèæ- 36 íûõ ôàç ôèëüòðîâàëè ÷åðåç ôèëüòð 0,22 ìêì, ðàñòâîðû N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîíà — ÷åðåç ôèëüòð 1,2 ìêì. Õèìèêî-ôàðìàöåâòè÷åñêèé æóðíàë. Òîì 46, ¹ 4, 2012 Äèíàìè÷åñêàÿ åìêîñòü àäñîðáåíòà, ìã/ìë mAU 24 % Ãðàäèåíòíîå ñíèæåíèå ðÍ 2500 22 20 40 30 2000 18 20 Ãðàäèåíò ïîäâèæíûõ ôàç 1500 15 16 1000 10 14 500 12 10 5 0 50 100 150 200 250 Ñêîðîñòü ïîòîêà, ñì/÷ 300 350 Ìåìáðàííàÿ õðîìàòîãðàôèÿ (Startobind S) Êîëîíî÷íàÿ õðîìàòîãðàôèÿ (Âiopro S-75) Ðèñ. 3. Ñðàâíåíèå äèíàìè÷åñêîé åìêîñòè êàòèîíîîáìåííûõ ìåìáðàíû è ñîðáåíòà ïðè ðàçëè÷íûõ ëèíåéíûõ ñêîðîñòÿõ ïîòîêà. Èñïîëüçîâàëîñü ñëåäóþùåå îáîðóäîâàíèå: õðîìàòîãðàôè÷åñêàÿ ñèñòåìà BioProcess 6 mm (GE Healthcare, Øâåöèÿ), ñíàáæåííàÿ õðîìàòîãðàôè÷åñêîé êîëîííîé äèàìåòðîì 300 ìì (GE Healthcare, Øâåöèÿ), óïàêîâàííîé ñîðáåíòîì Macroprep S (Biorad, ÑØÀ); ÂÝÆÕ ñèñòåìà, ñîñòîÿùàÿ èç ãðàäèåíòíîãî íàñîñà K-1800 (Knauer, Ãåðìàíèÿ), ÓÔ-äåòåêòîðà Smartline 2500 (Knauer, Ãåðìàíèÿ), ñàìîïèñöà R-18 (GE Healthcare, Øâåöèÿ) è êîëîííû äèíàìè÷åñêîãî àêñèàëüíîãî ñæàòèÿ äèàìåòðîì 100 ìì (Áèîõèììàê, Ðîññèÿ), óïàêîâàííîé ñîðáåíòîì Kromasil KR-300-C4-16 (Akzo Nobel Eka Chemicals Separation AB, Øâåöèÿ); õðîìàòîãðàôè÷åñêàÿ ñèñòåìà, ñîñòîÿùàÿ èç èçîêðàòè÷åñêîãî íàñîñà MCP (Ismatec, Øâåéöàðèÿ), ÓÔ-äåòåêòîðà Smartline 2500 (Knauer, Ãåðìàíèÿ), ñàìîïèñöà R-18 (GE Healthcare, Øâåöèÿ) è õðîìàòîãðàôè÷åñêîé êîëîííû äèàìåòðîì 200 ìì (GE Healthcare, Øâåöèÿ), óïàêîâàííîé ñîðáåíòîì Sephacryl S-100 (GE Healthcare, Øâåöèÿ).  îïûòàõ ïî ñðàâíèòåëüíîìó èçó÷åíèþ ìåìáðàííîé è êîëîíî÷íîé õðîìàòîãðàôèè áûëè èñïîëüçîâàíû ìåìáðàíà Sartobind S mini (Ñàðòîðîñ, Ðîññèÿ) è êîëîíêà BioPro S-75 (YMC, Ãåðìàíèÿ); âíóòðåííèé îáúåì îáåèõ òåñò-ñèñòåì ïðèìåðíî îäèíàêîâ è ðàâåí 7 ìë. Ìåòîäû àíàëèçà Ýëåêòðîôîðåç â ïîëèàêðèëàìèäíîì ãåëå (ÏÀÀÃÝ) ïðîâîäèëè ñîãëàñíî ìåòîäó Laemmli [9]. Îêðàøèâàíèå ïðîâîäèëè ïðè ïîìîùè Coomassie Brilliant Blue R-250 (Bio-Rad, USA). ×èñòîòó è êîíöåíòðàöèþ ãèñòîíà â ðàñòâîðàõ àíàëèçèðîâàëè ìåòîäîì ÎÔ ÂÝÆÕ íà õðîìàòîãðàôè÷åñêîé ñèñòåìå Agilent 1200 (Agilent Technologies, ÑØÀ), ñíàáæåííîé õðîìàòîãðàôè÷åñêîé êîëîíêîé YMC Butyl 5 ìêì 30 íì, 150 ´ 2,1 ìì (YMC Co, Ãåðìàíèÿ), ÓÔ-äåòåêòîðîì (äëèíà âîëíû 214 íì) è ñèñòåìîé äîçèðîâàííîãî ââîäà ïðîáû (îáúåì ïðîáû 20 ìêë). Ïîäâèæíàÿ ôàçà ñîñòîÿëà èç àöåòîíèòðèëà, âîäû äëÿ èíúåêöèé, 20 ìÌ ôîñôàòà íàòðèÿ, 0,1 % îðòîôîñôîðíîé êèñëîòû (ðÍ 2,5 – 3,0). Ýëþèðîâàíèå ïðîâîäèëè â ðåæèìå ãðàäèåíòà êîíöåíòðàöèè àöåòîÕèìèêî-ôàðìàöåâòè÷åñêèé æóðíàë. Òîì 46, ¹ 4, 2012 0 0 2 4 6 8 10 ë Ðèñ. 4. Õðîìàòîãðàììà ïðîöåññà îáðàùåíî-ôàçîâîé ÂÝÆÕ î÷èñòêè N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîíà. Ëåâàÿ îñü îðäèíàò — îïòè÷åñêàÿ ïëîòíîñòü; ïðàâàÿ îñü — ïðîöåíòíîå ñîäåðæàíèå ïîäâèæíîé ôàçû “”. íèòðèëà (îò 0 äî 60 îá. %). Ñêîðîñòü ïîòîêà 1,0 ìë/ìèí. Âðåìÿ àíàëèçà 20 ìèí. Ñîäåðæàíèå ìîíîìåðíîé ôîðìû ãèñòîíà, à òàêæå ïðîäóêòîâ åãî äåãðàäàöèè îïðåäåëÿëè ìåòîäîì âûñîêîýôôåêòèâíîé ýêñêëþçèîííîé õðîìàòîãðàôèè (ÂÝÝÕ). Àíàëèç îñóùåñòâëÿëñÿ íà õðîìàòîãðàôè÷åñêîé ñèñòåìå Agilent 1100 (Agilent Technologies, ÑØÀ), ñíàáæåííîé õðîìàòîãðàôè÷åñêîé êîëîíêîé YMC SEC-DIOL 5 ìêì 20 íì, 300 ´ 8 ìì (YMC Co, Ãåðìàíèÿ), ÓÔ-äåòåêòîðîì (äëèíà âîëíû 214 íì) è ñèñòåìîé äîçèðîâàííîãî ââîäà ïðîáû (îáúåì ïðîáû 2 ìêë). Ïîäâèæíàÿ ôàçà ñîñòîÿëà èç 5 ìÌ àöåòàòà íàòðèÿ, 5 ìÌ óêñóñíîé êèñëîòû, 250 ìÌ õëîðèäà íàòðèÿ â âîäå äëÿ èíúåêöèé, ðÍ 4,8. Ñêîðîñòü ïîòîêà 1 ìë/ìèí. Âðåìÿ àíàëèçà 15 ìèí. Ñîäåðæàíèå áàêòåðèàëüíûõ ýíäîòîêñèíîâ îïðåäåëÿëè ñ ïîìîùüþ ãåëü-òðîìá ËÀË-òåñòà, êàê îïèñàíî â ðàáîòå [10], ÷óâñòâèòåëüíîñòü ËÀË-ðåàêòèâà (ïðîèçâîäèòåëü Cape Cod, Inc., ÑØÀ) 0,03 ÝÅ/ìã.  êà÷åñòâå ïîëîæèòåëüíîãî êîíòðîëÿ èñïîëüçîâàëè êîíòðîëüíûé ñòàíäàðò ýíäîòîêñèíà O113:H10 (Cape Cod, Inc., ÑØÀ). Ñîäåðæàíèå îñòàòî÷íûõ áåëêîâ êëåòîê ïðîäóöåíòà îïðåäåëÿëè ñ ïîìîùüþ ÈÔÀ (èììóííî-ôåðìåíòíîãî àíàëèçà), êàê îïèñàíî â èíñòðóêöèè, ïðèëàãàåìîé ê íàáîðó ELISA E.coli Host Cell Proteins (Cygnus Technologies Inc., ÑØÀ). Ïðîìûøëåííîå êóëüòèâèðîâàíèå ïðîäóöåíòà è áèîñèíòåç áåëêà Êóëüòèâèðîâàíèå êëåòîê øòàìì-ïðîäóöåíòà ïðîâîäèëè â íåñêîëüêî ýòàïîâ. Íà ïåðâîì ýòàïå âûðàùèâàëè ïîñåâíîé ìàòåðèàë â êîëáàõ, êàê îïèñàíî ðàíåå [8]. Íà âòîðîì ýòàïå äëÿ âûðàùèâàíèÿ ïðîäóöåíòà â ôåðìåíòåðå ãîòîâèëè è ñòåðèëèçîâàëè ïèòàòåëüíóþ ñðåäó, ñîäåðæàùóþ àìèíîòîí, äðîææåâîé ýêñòðàêò, ôîñôîðíîêèñëûé äâóçàìåùåííûé êàëèé, õëîðèñòûé íàòðèé è ñåðíîêèñëûé ìàãíèé. Çàòåì â ïèòàòåëüíóþ ñðåäó äîáàâëÿëè ñòåðèëüíûå ãëþêîçó è êàíàìèöèí. Ïîñëå ýòîãî îñóùåñòâëÿëè çàñåâ ôåðìåíòåðà ïîñåâíûì ìàòåðèàëîì (0,2 % îá.) è âûðàùèâàëè êëåòêè ïðîäóöåíòà ïðè òåìïåðàòóðå 37 °C äî äîñòèæåíèÿ â êóëüòóðàëüíîé 37 à 1 2 á 3 Äà, ìÂò 94000 67000 43000 30000 21100 14400 6 8 10 12 14 16 18 ìèí Ðèñ. 5. Ðåçóëüòàòû àíàëèòè÷åñêîãî êîíòðîëÿ ñòàäèè îáðàùåíî-ôàçîâîé ÂÝÆÕ: à — ÏÀÀÃÝ, äîðîæêà 1 ñîîòâåòñòâóåò áåëêó äî î÷èñòêè, äîðîæêà 2 — áåëêó ïîñëå î÷èñòêè, äîðîæêà 3 — ñòàíäàðòàì ìàññ LMW; á — îáðàùåíî-ôàçîâàÿ ÂÝÆÕ, âðåìÿ óäåðæàíèÿ öåëåâîãî áåëêà ñîñòàâëÿåò ïðèìåðíî 13,4 ìèí. æèäêîñòè îïòè÷åñêîé ïëîòíîñòè, ðàâíîé 10 îïòè÷åñêèì åäèíèöàì. Íà ñëåäóþùåì ýòàïå ïðîâîäèëè èíäóêöèþ ñèíòåçà ðåêîìáèíàíòíîãî áåëêà ïóòåì ââåäåíèÿ â ôåðìåíòåð âîäíîãî ñòåðèëüíîãî ðàñòâîðà ÈÏÒÃ. ×åðåç 2,0 – 2,5 ÷ ïîñëå ââåäåíèÿ èíäóêòîðà ïðîöåññ áèîñèíòåçà áåëêà îñòàíàâëèâàëè, à êóëüòóðó êëåòîê ïîäàâàëè íà ñåïàðàòîð äëÿ îòäåëåíèÿ êëåòîê îò êóëüòóðàëüíîé æèäêîñòè. Ïîëó÷åííóþ ñóñïåíçèþ êëåòîê ðàçðóøàëè ñ ïîìîùüþ ïðîòî÷íîãî äåçèíòåãðàòîðà. Ïðîìûøëåííîå âûäåëåíèå áåëêà Öåëåâîé áåëîê âûäåëÿëè èç äåçèíòåãðàòà êëåòî÷íîé ìàññû ñ ïîìîùüþ ýêñòðàêöèè 1,0 – 2,5 % õëîðíîé êèñëîòîé. Äëÿ ýòîãî ìåäëåííî (â òå÷åíèå 10 – 15 ìèí) ïðè àêòèâíîì ïåðåìåøèâàíèè äîáàâëÿëè êîíöåíòðèðîâàííóþ õëîðíóþ êèñëîòó â ñóñïåíçèþ äåçèíòåãðàòà äî óñòàíîâëåíèÿ ðÍ ìåíåå 2,0. Ïðè ýòîì ðåêîìáèíàíòíûé N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîí Í1.3 îêàçûâàëñÿ â íàäîñàäî÷íîé æèäêîñòè, êîòîðóþ îòäåëÿëè îò êîàãóëèðîâàííûõ ïðèìåñåé íà ñåïàðàòîðå. Ïðîìûøëåííàÿ î÷èñòêà áåëêà Áåëîê, âûäåëåííûé ñ ïîìîùüþ ýêñòðàêöèè õëîðíîé êèñëîòîé, î÷èùàëè â 3 ïîñëåäîâàòåëüíûõ õðîìàòîãðàôè÷åñêèõ ýòàïà. Íà ïåðâîì ýòàïå áåëîê êîíöåíòðèðîâàëè, îäíîâðåìåííî èçáàâëÿÿ îò ïðèìåñåé, ñèëüíî îòëè÷íûõ îò öåëåâîãî ïî ôèçèêî-õèìè÷åñêèì ñâîéñòâàì, ñ ïîìîùüþ êàòèîíîîáìåííîé õðîìàòîãðàôèè íà ñîðáåíòå Macroprep S. Ïîëó÷åííûå öåëåâûå ôðàêöèè î÷èùàëè ñ ïîìîùüþ îáðàùåíî-ôàçîâîé ÂÝÆÕ íà ñîðáåíòå Kromasil Ñ4. Íà ýòîì ýòàïå äîñòèãàëè ôàðìàêîïåéíîé ÷èñòîòû áåëêà, ìàêñèìàëüíî óäàëÿÿ âñå ïðèìåñè, âêëþ÷àþùèå ðîäñòâåííûå áåëêè, îñòàòî÷íûå áåëêè øòàìì-ïðîäóöåíòà, ÄÍÊ, áàêòåðèàëüíûå ýíäîòîêñèíû è ò.ä. Äàëåå ïðåäâàðèòåëüíî îñàæäåííóþ ýòèëîâûì ñïèðòîì öåëåâóþ ôðàêöèþ áåëêà èçáàâëÿëè îò êîìïîíåíòîâ ïîäâèæíîé ôàçû ïîñëå ÂÝÆÕ ñ ïîìîùüþ ãåëü-ôèëüòðàöèè, ýëþèðóÿ âîäîé äëÿ èíúåêöèé. Î÷èùåííóþ áåëêîâóþ ôðàêöèþ ïîñëå ãåëü-ôèëüòðàöèè çàìîðàæèâàëè è ëèîôèëèçîâàëè äëÿ ïîëó÷åíèÿ ÀÔÑ. Ðåçóëüòàòû è èõ îáñóæäåíèå Ïðîìûøëåííîå êóëüòèâèðîâàíèå ïðîäóöåíòà è áèîñèíòåç áåëêà Ãèñòîíû — îñíîâíîé êëàññ íóêëåîïðîòåèíîâ, ÿäåðíûõ áåëêîâ, íåîáõîäèìûõ äëÿ ñáîðêè è óïàêîâêè íèòåé ÄÍÊ â õðîìîñîìû. Äàííûå áåëêè èãðàþò âàæíóþ ðîëü â ïîääåðæàíèè è èçìåíåíèè ñòðóêòóðû õðîìîñîì íà ðàçíûõ ñòàäèÿõ êëåòî÷íîãî öèêëà, à òàêæå â ðåãóëÿöèè àêòèâíîñòè ãåíîâ [11]. Ãèñòîí Í1.3 ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé áåëîê ñ ìîëåêóëÿðíîé ìàññîé îêîëî 22,5 êÄà (221 à.ê.î.) [12]. Êàê âèäíî èç ïðåäñòàâëåííîé àìèíîêèñëîòíîé ïîñëåäîâàòåëüíî- Àíàëèòè÷åñêèé êîíòðîëü ñóáñòàíöèè N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîíà Í1.3 Ïîêàçàòåëü ×èñòîòà, % ×èñòîòà, % Âûñîêîìîëåêóëÿðíûå ïðèìåñè, % Íèçêîìîëåêóëÿðíûå ïðèìåñè, % Áàêòåðèàëüíûå ýíäîòîêñèíû, ÝÅ/ìã Áåëêè êëåòîê E. coli, íã/ìã Îñòàòî÷íàÿ ÄÍÊ, ïã/ìã Àêòèâíîñòü, ìêÌ 38 Ìåòîä àíàëèçà Ðåçóëüòàò Òðåáîâàíèå Ñîîòâåòñòâèå ÂÝÆÕ ÂÝÝÕ ÏÀÀÃÝ ÏÀÀÃÝ ËÀË-òåñò ÈÔÀ ÏÖÐ Êëåòî÷íûé òåñò 99,6 98,1 0 <1 < 0,125 0,15 2,5 2,5 Íå ìåíåå 98 Íå ìåíåå 97 Íå áîëåå 2 Íå áîëåå 2 Íå áîëåå 0,5 Íå áîëåå 100 Íå áîëåå 5 IC50: 0,5 – 3,5 Ñîîòâåòñòâóåò Ñîîòâåòñòâóåò Ñîîòâåòñòâóåò Ñîîòâåòñòâóåò Ñîîòâåòñòâóåò Ñîîòâåòñòâóåò Ñîîòâåòñòâóåò Ñîîòâåòñòâóåò Õèìèêî-ôàðìàöåâòè÷åñêèé æóðíàë. Òîì 46, ¹ 4, 2012 ñòè (ðèñ. 1), îí î÷åíü áîãàò îñòàòêàìè ëèçèíà (61 à.ê.î.), êîòîðûå ïðèäàþò åìó ÿðêî âûðàæåííûé ïîëîæèòåëüíûé çàðÿä (pI 11,02). Ïðîèçâîäíîå ãèñòîíà Í1.3, èìåþùåå íà N-êîíöå äîïîëíèòåëüíûé îñòàòîê ìåòèîíèíà è íàçâàííîå ðàçðàáîò÷èêîì “N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîí Í1.3”, áûëî ïðåäëîæåíî èñïîëüçîâàòü äëÿ ñîçäàíèÿ ïðåïàðàòà “Oncohist” äëÿ òåðàïèè ëèìôîì [7]. Äëÿ áèîñèíòåçà ðåêîìáèíàíòíûõ áåëêîâ ÷àñòî èñïîëüçóþòñÿ øòàììû-ïðîäóöåíòû Escherichia coli ïî ìíîãèì ïðè÷èíàì, à èìåííî: êóëüòèâèðîâàòü ïðîêàðèîòè÷åñêèå ìèêðîîðãàíèçìû äåøåâëå ïî ñðàâíåíèþ ñ ýóêàðèòèî÷åñêèìè êëåòêàìè, áàêòåðèè ñïîñîáíû áûñòðî ñèíòåçèðîâàòü áåëêè â áîëüøèõ êîëè÷åñòâàõ, è, íàêîíåö, íàêîïëåí çíà÷èòåëüíûé îïûò ðàáîòû èìåííî ñ E. coli.  õîäå ïðîìûøëåííîãî êóëüòèâèðîâàíèÿ øòàììïðîäóöåíòà è áèîñèíòåçà ïîëó÷àëè N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîí Í1.3, ñîäåðæàíèå êîòîðîãî â äåçèíòåãðàòå, îïðåäåëåííîå ìåòîäîì ÏÀÀÃÝ, ñîñòàâëÿëî âñåãî 10 %, ÷òî ñîîòâåòñòâîâàëî âûõîäó 160 – 180 ã öåëåâîãî áåëêà/ì3 êóëüòóðàëüíîé æèäêîñòè. Îïòèìèçàöèÿ óñëîâèé ôåðìåíòàöèè íå ïðèâåëà ê çàìåòíîìó óâåëè÷åíèþ âûõîäà. Îäíàêî íåêîòîðîå óëó÷øåíèå ìîæíî áûëî ñòàòèñòè÷åñêè ïðîñëåäèòü ïðè ñíèæåíèè òåìïåðàòóðû ïðîöåññà äî ââåäåíèÿ èíäóêòîðà ÈÒÏÃ, ÷òî ñâÿçàíî ñ óâåëè÷åíèåì ðîñòà êëåòîê. Òåì íå ìåíåå ðîñò êëåòîê íå ïðîïîðöèîíàëüíî îòðàæàëñÿ íà óâåëè÷åíèè âûõîäà, èç ÷åãî ìîæíî çàêëþ÷èòü, ÷òî â E. coli ïîñëå íà÷àëà èíäóêöèè â áîëüøåé ñòåïåíè áèîñèíòåçèðîâàëèñü ïðèìåñíûå áåëêè. Äàëüíåéøåå âûäåëåíèå áåëêà èç ñóñïåíçèè äåçèíòåãðàòà ñ ïîìîùüþ ýêñòðàêöèè õëîðíîé êèñëîòîé ïðîõîäèëî ñ äîñòàòî÷íî âûñîêèì âûõîäîì (íå ìåíåå 90 %) è ïðèâîäèëî ê ïîëó÷åíèþ ðàñòâîðà áåëêà ñ êîíöåíòðàöèåé îêîëî 2,5 ìã/ìë, çàãðÿçíåííîãî ïðèìåñÿìè ðàçëè÷íîé ïðèðîäû. Íà ðèñ. 2 ïðåäñòàâëåíû ðåçóëüòàòû àíàëèòè÷åñêîãî êîíòðîëÿ ýêñòðàêöèè ñ ïîìîùüþ ÏÀÀÃÝ è ÂÝÆÕ. Íåîáõîäèìî îòìåòèòü, ÷òî ýëåêòðîôîðåòè÷åñêàÿ ïîäâèæíîñòü ïðîèçâîäíîãî ãèñòîíà (ðèñ. 2, à ) ñîîòâåòñòâóåò ïîäâèæíîñòè áåëêà ñ ìîëåêóëÿðíîé ìàññîé 32,5 êÄà (áûëî ïîäòâåðæäåíî ìåòîäîì âíóòðåííåãî ñòàíäàðòà). Ýòî, ïî-âèäèìîìó, ñâÿçàíî ñ ñèëüíûì ïîëîæèòåëüíûì çàðÿäîì ìîëåêóëû, ñíèæàþùèì ýëåêòðîôîðåòè÷åñêóþ ïîäâèæíîñòü. Êàê âèäíî èç ðèñóíêà, â õîäå ýêñòðàêöèè áûëà óäàëåíà áîëüøàÿ ÷àñòü áàëëàñòíûõ áåëêîâ E. coli ñ ìîëåêóëÿðíîé ìàññîé âûøå 35 êÄà, à òàêæå çíà÷èòåëüíàÿ ÷àñòü áåëêîâ ñ ìàññîé ìåíåå 21 êÄà. Ïî äàííûì ÂÝÆÕ àíàëèçà ñîäåðæàíèå îñíîâíîãî âåùåñòâà ïîñëå ýêñòðàêöèè ñîñòàâëÿëî 33 – 46 % (ðèñ. 2, á ). Äëÿ äàëüíåéøåé î÷èñòêè áåëîê íåîáõîäèìî ñêîíöåíòðèðîâàòü. Ìåòîäû êîíöåíòðèðîâàíèÿ ñ ïîìîùüþ ñîëåâîãî îñàæäåíèÿ, êàê íè ñòðàííî, íå îêàçàëèñü ýôôåêòèâíûìè. Äàæå ïðè èñïîëüçîâàíèè ñóëüôàòà àììîíèÿ â êîíöåíòðàöèè íàñûùåíèÿ, êàê îïèñàíî â [13], íå óäàâàëîñü îñàäèòü âåñü N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîí èç Õèìèêî-ôàðìàöåâòè÷åñêèé æóðíàë. Òîì 46, ¹ 4, 2012 ðàñòâîðà, çíà÷èòåëüíàÿ ÷àñòü áåëêà îñòàâàëàñü â íàäîñàäî÷íîé æèäêîñòè. Äëÿ êîíöåíòðèðîâàíèÿ áåëêà ðàíåå íàìè áûëî ïðåäëîæåíî èñïîëüçîâàòü êàòèîíîîáìåííóþ õðîìàòîãðàôèþ [14]. ßðêî âûðàæåííûé çàðÿä íà áåëêå, ñîçäàâàåìûé îñòàòêàìè ëèçèíà, îáåñïå÷èâàåò îòëè÷íîå ñâÿçûâàíèå ñ êàòèîíîîáìåííûì ñîðáåíòîì. Îäíàêî íà ïðîèçâîäñòâåííîì óðîâíå ðàçäåëåíèé áåëêîâûõ ìîëåêóë âñå áîëüøåå âíèìàíèå óäåëÿåòñÿ ìåìáðàííîé õðîìàòîãðàôèè [15]. Îíà îáëàäàåò òàêèìè ïðåèìóùåñòâàìè ïåðåä êëàññè÷åñêîé êîëîíî÷íîé õðîìàòîãðàôèåé, êàê áîëüøàÿ ïðîèçâîäèòåëüíîñòü, îáåñïå÷èâàåìàÿ çà ñ÷åò âûñîêèõ ñêîðîñòåé ýëþèðîâàíèÿ; ïðîñòîòà âàëèäàöèè; îòñóòñòâèå òðóäîçàòðàò íà óïàêîâêó êîëîííû. Òåì íå ìåíåå èçâåñòíîé ïðîáëåìîé èîíîîáìåííûõ ìåìáðàí îñòàåòñÿ îòíîñèòåëüíî íèçêàÿ åìêîñòü ñâÿçûâàíèÿ áåëêîâ. Íàìè áûëî ïðîâåäåíî ñðàâíèòåëüíîå èçó÷åíèå ìåìáðàííîé è êëàññè÷åñêîé êîëîíî÷íîé õðîìàòîãðàôèé ïðèìåíèòåëüíî ê ïðåäâàðèòåëüíîé î÷èñòêå N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîíà. Äëÿ ýòîãî ìû èñïîëüçîâàëè îòðèöàòåëüíî çàðÿæåííóþ ñóëüôîïðîïèëüíóþ ñâåðõïîðèñòóþ ìåìáðàíó Sartobind S è êîëîíêó, óïàêîâàííóþ ïîëèìåòàêðèëàòíûì ñîðáåíòîì ñ ïðèâèòîé ñóëüôîïðîïèëüíîé ãðóïïîé, Biopro S-75. Êàæäàÿ èç ýòèõ ñèñòåì õîðîøî çàðåêîìåíäîâàëà ñåáÿ íà ðûíêå òîâàðîâ äëÿ áèîòåõíîëîãèè è áèîôàðìàöåâòèêè è âûïóñêàåòñÿ êàê äëÿ àíàëèòè÷åñêèõ, òàê è äëÿ ïðîèçâîäñòâåííûõ íóæä; êðîìå òîãî, ñîðáåíò Biopro S-75 óæå áûë íàìè èçó÷åí ðàíåå [14], è ðåçóëüòàòû ðàáîòû ñ íèì îêàçàëèñü ïîëîæèòåëüíûìè. Íà êàæäóþ èç òåñò-ñèñòåì, ïðåäâàðèòåëüíî óðàâíîâåøåííóþ ïîäâèæíîé ôàçîé, ñîäåðæàùóþ 10 ìÌ ëèìîííîé êèñëîòû (ðÍ 3,0), íàíîñèëè ðàñòâîð ýêñòðàãèðîâàííîãî áåëêà, ðÍ â êîòîðîì òàêæå áûë äîâåäåí äî 3,0 ñ ïîìîùüþ 10 Ì NaOH. Íàíåñåíèå çàêàí÷èâàëè, êîãäà öåëåâîé áåëîê íà÷èíàë ýëþèðîâàòüñÿ áåç ñîðáöèè, ò.å. êîãäà âñå àêòèâíûå öåíòðû òåñò-ñèñòåìû áûëè çàíÿòû ìîëåêóëàìè áåëêà. Áûëî îáíàðóæåíî, ÷òî äèíàìè÷åñêàÿ åìêîñòü êîëîíêè, óïàêîâàííîé êàòèîíèòîì, ñîñòàâèëà 18,5 ìã áåëêà/ìë àäñîðáåíòà.  òî æå âðåìÿ åìêîñòü ìåìáðàíû îêàçàëàñü íåñêîëüêî íèæå, 15,5 ìã/ìë. Ðàíåå óæå áûëî ïîêàçàíî, ÷òî ñêîðîñòü ýëþèðîâàíèÿ ìîæåò äîñòàòî÷íî ñèëüíî âëèÿòü íà äèíàìè÷åñêóþ åìêîñòü àäñîðáåíòà, îñîáåííî â ñëó÷àå êîëîíî÷íîé õðîìàòîãðàôèè [15]. Ïîýòîìó íàìè áûëè ïðîâåäåíû àíàëîãè÷íûå îïûòû ïî îïðåäåëåíèþ äèíàìè÷åñêîé åìêîñòè, íî ïðè ðàçëè÷íûõ ñêîðîñòÿõ íàíåñåíèÿ. Äåéñòâèòåëüíî, êàê âèäíî èç ðèñ. 3, äèíàìè÷åñêàÿ åìêîñòü Biopro S-75 ïðàêòè÷åñêè íåèçìåííà ïðè ñêîðîñòÿõ íèæå 200 ñì/÷, à ïðè äàëüíåéøåì óâåëè÷åíèè ñêîðîñòè íàíåñåíèÿ îáðàçöà äèíàìè÷åñêàÿ åìêîñòü íà÷èíàëà ñíèæàòüñÿ. Ñ äðóãîé ñòîðîíû, ïðè èñïîëüçîâàíèè ìåìáðàí íå áûëî çàìå÷åíî ÿâíîé çàâèñèìîñòè äèíàìè÷åñêîé åìêîñòè îò ñêîðîñòè ïîòîêà. Ñòîèò òàêæå îòìåòèòü, ÷òî ïðè ñêîðîñòÿõ âûøå 350 ñì/÷ äàâëåíèå â êîëîíêå Biopro S-75 ïðåâûøàëî óñòàíîâëåííûé ïåðåäåë â 3 áàð (èìåííî òàêîå îãðàíè÷åíèå ÷àùå âñåãî óñòàíàâëèâàåòñÿ íà ïðîèçâîäñòâåííûõ ñèñòåìàõ), äåëàÿ íåâîçìîæ39 íîé äàëüíåéøóþ ðàáîòó, ïîýòîìó îïûòû ïðè ñêîðîñòÿõ âûøå 350 ñì/÷ íå ïðîâîäèëèñü. Îäíàêî ìîæíî îæèäàòü, ÷òî ïðè ñâåðõâûñîêèõ ñêîðîñòÿõ äèíàìè÷åñêàÿ åìêîñòü ñîðáåíòà áóäåò íèæå åìêîñòè ìåìáðàíû. Ïîñëå íàíåñåíèÿ îáðàçöà îáå òåñò-ñèñòåìû ïðîìûâàëèñü ïîäâèæíîé ôàçîé, ñîäåðæàùåé 10 ìÌ ëèìîííîé êèñëîòû (ðÍ 3,0) è 2,0 Ì NaCl ñ òåì, ÷òîáû äåñîðáèðîâàòü öåëåâîé áåëîê ñ îäíîâðåìåííûì êîíöåíòðèðîâàíèåì.  îáîèõ ñëó÷àÿõ áåëîê ýëþèðîâàëñÿ ñ âûñîêèìè êîíöåíòðàöèÿìè (îêîëî 20 ìã/ìë, ò.å. ôàêòîð êîíöåíòðèðîâàíèÿ ðàâåí 8) è âûõîäîì (82 – 85 %). Òàêèì îáðàçîì, ìåìáðàííàÿ õðîìàòîãðàôèÿ N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîíà Í1.3 ÿâëÿåòñÿ äîñòàòî÷íî ïåðñïåêòèâíîé çàìåíîé êëàññè÷åñêîé êîëîíî÷íîé õðîìàòîãðàôèè íà ïðîèçâîäñòâåííîì óðîâíå. Ïîëó÷åííûé âûñîêîêîíöåíòðèðîâàííûé N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîí äîëæåí áûòü î÷èùåí îò ðÿäà ïðèìåñåé, à èìåííî îò ðîäñòâåííûõ áåëêîâ, îñòàòî÷íûõ áåëêîâ (HCP, èëè host-cell proteins) øòàìì-ïðîäóöåíòà, âûñîêîìîëåêóëÿðíûõ è íèçêîìîëåêóëÿðíûõ ïðèìåñåé, áàêòåðèàëüíûõ ýíäîòîêñèíîâ, îñòàòî÷íîé ÄÍÊ E. coli. Ïðè ýòîì íàèáîëüøóþ òðóäíîñòü äëÿ î÷èñòêè áåëêîâ ïðåäñòàâëÿþò ïðèìåñíûå áàêòåðèàëüíûå ýíäîòîêñèíû (ÁÝ), íàëè÷èå êîòîðûõ ÿâëÿåòñÿ íåèçáåæíûì âñëåäñòâèå èñïîëüçîâàíèÿ ïðîêàðèîòè÷åñêèõ ñèñòåì ýêñïðåññèè. ÁÝ — ýòî ëèïîïîëèñàõàðèäíûå ôðàãìåíòû âíåøíåé êëåòî÷íîé ñòåíêè âñåõ ãðàìîòðèöàòåëüíûõ áàêòåðèé, âûñîêî òîêñè÷íûå äëÿ ÷åëîâåêà. ÀÔÑ, îñîáåííî ñëóæàùèå äëÿ ñîçäàíèÿ èíúåêöèîííûõ ëåêàðñòâåííûõ ôîðì, äîëæíû áûòü ìàêñèìàëüíî èçáàâëåíû îò ïîäîáíûõ ïðèìåñåé. Ðàçðàáàòûâàåìàÿ íàìè òåõíîëîãèÿ äîëæíà áûëà ïîçâîëÿòü ïîëó÷àòü ìàêñèìàëüíî î÷èùåííûé îò ÁÝ N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîíà Í1.3 (ñîäåðæàíèå ÁÝ â ÀÔÑ íå áîëåå 0,5 ÝÅ/ìã), ò.ê. ïðîèçâîäèìàÿ ÀÔÑ èñïîëüçóåòñÿ äëÿ ñîçäàíèÿ ãîòîâûõ ëåêàðñòâåííûõ ôîðì äëÿ èíôóçèîííîãî ââåäåíèÿ. Ðàíåå íàìè áûëè îïèñàíû ðàçëè÷íûå ìåòîäû î÷èñòêè áåëêîâ îò ÁÝ [16]. Ñðåäè íàèáîëåå ðàñïðîñòðàíåííûõ ñëåäóåò óêàçàòü äâóõôàçíóþ ýêñòðàêöèþ ëèïîïîëèñàõàðèäîâ äåòåðãåíòàìè, èîíîîáìåííóþ, îáðàùåíî-ôàçîâóþ è àôôèííóþ õðîìàòîãðàôèè, à òàêæå õðîìàòîãðàôèþ ãèäðîôîáíûõ âçàèìîäåéñòâèé. Îäíàêî òîëüêî ñ ïîìîùüþ îáðàùåíî-ôàçîâîé ÂÝÆÕ íà àíàëèòè÷åñêîì óðîâíå íàì óäàëîñü äîñòè÷ü ìàêñèìàëüíî íèçêîãî ñîäåðæàíèÿ ÁÝ â ñóáñòàíöèè N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîíà [17]. Òðóäíîñòè, âîçíèêàþùèå ïðè î÷èñòêå öåëåâîãî ðåêîìáèíàíòíîãî áåëêà, ïî-âèäèìîìó, ñâÿçàíû ñ ñèëüíûì ïîëîæèòåëüíûì çàðÿäîì ìîëåêóëû, êîòîðûé îáåñïå÷èâàåò êðàéíå óñòîé÷èâîå âçàèìîäåéñòâèå ñ îòðèöàòåëüíî çàðÿæåííûìè ëèïîïîëèñàõàðèäàìè. Ñèëèêàãåëü, èñïîëüçóåìûé äëÿ îáðàùåíî-ôàçîâîé õðîìàòîãðàôèè, âñåãäà èìååò êàêîå-òî, õîòü è íåáîëüøîå, êîëè÷åñòâî ñèëàíîëüíûõ ãðóïï, êîòîðûå îñòàëèñü íå ïðèâèòûìè íè ëèïîôèëüíûì óãëåâîäîðîäíûì ëèãàíäîì, íè àãåíòîì ýíä-êýïïèíãà. Ýòè ãðóïïû îáëàäàþò îòðèöàòåëüíûì çàðÿäîì, è, âîçìîæíî, êîíñòàíòà ñâÿçûâàíèÿ N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîíà ñ íèìè âûøå, ÷åì êîíñòàíòà ñâÿçûâàíèÿ áåëêà ñ ýíäîòîêñèíàìè. Ýòèì ìîæåò îáúÿñíÿòüñÿ óñïåõ ïðè40 ìåíåíèÿ îáðàùåíî-ôàçîâîé ÂÝÆÕ äëÿ î÷èñòêè N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîíà îò ÁÝ, â òî âðåìÿ êàê îñòàëüíûå, äîñòàòî÷íî ïðèçíàííûå âî âñåì ìèðå ìåòîäû íå ïîçâîëÿþò ïîëó÷èòü òðåáóåìîé ÷èñòîòû ñóáñòàíöèè. Âñå ýêñïåðèìåíòû ìû ïðîâîäèëè íà êîëîíêàõ, óïàêîâàííûõ ñîðáåíòîì Kromasil KR-C4-300-16. Ýëþèðîâàëè â ãðàäèåíòå ïîäâèæíûõ ôàç îò ôàçû “À” äî ôàçû “” çà 10 êîëîíî÷íûõ îáúåìîâ. Ôàçà “À” ñîäåðæàëà 10 ìÌ ëèìîííóþ êèñëîòó (ðÍ 4,0) â âîäå äëÿ èíúåêöèé è ýòèëîâîì ñïèðòå (20 % îá.). Ôàçà “Â”: 10 ìÌ ëèìîííàÿ êèñëîòà (ðÍ 2,0) â âîäå äëÿ èíúåêöèé è ýòèëîâîì ñïèðòå (50 % îá.). Òàêèì îáðàçîì, ìû ïðèìåíèëè ñìåøàííûé ãðàäèåíò: ïîëîæèòåëüíûé ãðàäèåíò êîíöåíòðàöèè îðãàíè÷åñêîãî ìîäèôèêàòîðà (ýòèëîâîãî ñïèðòà) è íåãàòèâíûé ãðàäèåíò ðÍ (ðèñ. 4). Ýòî ðåøåíèå ïîçâîëèëî ìèíèìèçèðîâàòü ðàñõîä îðãàíè÷åñêîãî ìîäèôèêàòîðà è ïîâûñèòü ñåëåêòèâíîñòü ïðîöåññà. Èíòåðåñíî, ÷òî ïèê îñíîâíîãî âåùåñòâà èìååò âûðàæåííîå ïðàâîå “ïëå÷î”. Ïî ðåçóëüòàòàì ÏÀÀÃÝ è ÂÝÆÕ â îñíîâíîé ôðàêöèè ñîäåðæàëñÿ N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîí Í1.3 ñ ÷èñòîòîé, áëèçêîé ê 100 %, à â “õâîñòîâîé” ôðàêöèè (ïðàâîå “ïëå÷î” ïèêà) — êîìïîíåíòû ñ ìîëåêóëÿðíûìè ìàññàìè íèæå 30 êÄà (ðèñ. 5). Ïî äàííûì ËÀË-òåñòà îñíîâíàÿ ôðàêöèÿ N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîíà ñîäåðæàëà ÁÝ ìåíåå 0,125 ÝÅ/ìã. Ëèíåéíîå ìàñøòàáèðîâàíèå ïîëó÷åííûõ ðåçóëüòàòîâ äî ïðîèçâîäñòâåííîãî óðîâíÿ áûëî îñíîâàíî íà óâåëè÷åíèè âíóòðåííåãî äèàìåòðà êîëîííû ïðè íåèçìåííîé âûñîòå ñëîÿ ñîðáåíòà. Ïðè ýòîì ëèíåéíàÿ ñêîðîñòü ýëþèðîâàíèÿ îñòàåòñÿ íåèçìåííîé è, â íàøåì ñëó÷àå, ðàâíîé 120 ñì/÷ [18]. Òàêèì îáðàçîì, ïðè ïåðåõîäå îò àíàëèòè÷åñêèõ óñëîâèé, îïèñàííûõ â [17], äî ïðîèçâîäñòâåííûõ äèàìåòð êîëîííû áûë óâåëè÷åí â 10 ðàç, à îáúåìíàÿ ñêîðîñòü — ñîîòâåòñòâåííî â 100 ðàç. Ïðè ýòîì ïðîèçâîäèòåëüíîñòü ïðîöåññà ñîñòàâèëà ïðèìåðíî 2,0 ã áåëêà/ë ñîðáåíòà çà 1 ÷, ÷òî ïîçâîëèëî çà 1 ðàáî÷óþ ñìåíó (8 ÷) î÷èùàòü äî 32 ã âåùåñòâà íà 1 ÂÝÆÕ êîëîííå îáúåìîì 2 ë. Îñíîâíóþ ôðàêöèþ îñàæäàëè ýòèëîâûì ñïèðòîì, îñàäîê îòäåëÿëè öåíòðèôóãèðîâàíèåì (6 – 8 òûñ. îá/ìèí) è ðàñòâîðÿëè â âîäå äëÿ èíúåêöèé äî êîíöåíòðàöèè N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîíà Í1.3 30 ìã/ìë. Çàòåì ïðîâîäèëè ôèíàëüíóþ î÷èñòêó (îò îñòàòî÷íûõ êîìïîíåíòîâ ïîäâèæíûõ ôàç ïîñëå ÂÝÆÕ è ýòèëîâîãî ñïèðòà) îáðàçöà ãåëü-ôèëüòðàöèåé íà ñîðáåíòå Sephacryl S-100, íàíîñÿ îáðàçåö â îáúåìå, íå ïðåâûøàþùåì 10% îò îáúåìà êîëîííû è ýëþèðóÿ âîäîé äëÿ èíúåêöèé. Âûõîä îñíîâíîé ôðàêöèè (ñ êîíöåíòðàöèåé N,N-áèñ-ìåòèîíèëãèñòîíà Í1.3 8 – 10 ìã/ìë) ñîñòàâèë 80 – 90 %. Çàòåì ïîëó÷åííûé ðàñòâîð ëèîôèëèçîâàëè äî ïîëó÷åíèÿ ÀÔÑ ñ âëàæíîñòüþ íå áîëåå 10 %. Ðåçóëüòàòû êîíòðîëÿ êà÷åñòâà ïîëó÷àåìîé ÀÔÑ äåìîíñòðèðóþò âûñîêóþ ñòåïåíü ÷èñòîòû áåëêà (òàáëèöà). Ñ ïîìîùüþ ðàçðàáîòàííîé òåõíîëîãèè áûëî íàðàáîòàíî êîëè÷åñòâî ÀÔÑ, äîñòàòî÷íîå äëÿ êëèíè÷åñêèõ èñïûòàíèé, êîòîðûå áûëè íà÷àòû â 2010 ã. Ïîäàíà çàÿâêà íà ïàòåíò Ðîññèéñêîé Ôåäåðàöèè. Õèìèêî-ôàðìàöåâòè÷åñêèé æóðíàë. Òîì 46, ¹ 4, 2012 Ë È Ò Å ÐÀ Ò Ó ÐÀ 1. A. Fritz, C. Percy, A. Jack, et al. (eds.), International Clessification of Diseases for Oncology, Third Edition, World Health Organization, Geneva (2000). 2. P. Stashenko, L. M. Nadler, R. Hardy, and S. F. Schlossman, J. Immunol., 125, 1678 – 1685 (1980). 3. J. Ernst, H. Li, H. S. Kim, et al., Biochemistry, 44, 15150 – 15158 (2005). 4. Â. Ì. Ìîèñååíêî, Ïðàêòè÷. îíêîëîãèÿ, 3(4), 253 – 261 (2002). 5. M. Zeppezauer, European Patent, EP 0973541 (2000). 6. Ä. À. Ãóñàðîâ, Áèîôàðì. æ., 2(4), 8 – 13 (2010). 7. P. Gross, H. Jornvall, M. Thiry, et al., Bis-Met Histone, World Intellectual Property Organization Patent Application, WO 2008 / 122434 A1.2008 8. Ëàáîðàòîðíûé ðåãëàìåíò ¹ËÐ 02699487-13-01 (2009). 9. J. King and U. K. Laemmli, J. Mol. Biol., 75(2), 315 – 324 (1973). 10. Þ. Ñ. Ðÿáêî, Î. Â. Ëóêèí, Å. Í. Øåïåëü è äð., Áèîôàðì. æ., 1(1), 34 – 37 (2009). 11. W. Albig, D. M. Runge, M. Kratzmeier, and D. Doenecke, FEBS Let., 435, 425 – 450 (1998). 12. http: // www.ncbi.nlm.nih.gov / protein / 4885377?report=GenPept. 13. M. Kratzmeier, W. Albig, T. Meergans, and D. Doenecke, Biochem. J., 337, 319 – 327 (1999). 14. Ä. À. Ãóñàðîâ, Â. À. Ëàñìàí, Ñ. À. Êîñàðåâ è äð., Áèîôàðì. æ., 2(1), 42 – 48 (2010). 15. Ã. Ë. Âîëêîâ, Ñ. Ï. Ãàâðèëþê, Â. Â. Ñêàëêà è äð., Áèîôàðì. æ., 2(2), 24 – 31 (2010). 16. Ä. À. Ãóñàðîâ, Áèîôàðì. æ., 1(3), 10 – 17 (2009). 17. Í. Ñ. Áðûêîâà, Í. À. Áðàãèíà, Ä. À. Ãóñàðîâ è Ä. È. Áàèðàìàøâèëè, Áèîôàðì. æ., 2(4), 25 – 31 (2010). 18. Ä. À. Ãóñàðîâ, Â. À. Ëàñìàí, À. Ô. Ìèðîíîâ è Ä. È. Áàèðàìàøâèëè, Áèîôàðì. æ., 1(3), 30 – 35 (2009). Ïîñòóïèëà 12.08.10 DEVELOPING EFFECTIVE EXPERIMENTAL COMMERCIAL TECHNOLOGY FOR THE PRODUCTION OF N,N-BIS-MET-HISTONE H1.3 USED IN THE TREATMENT OF LYMPHOMAS D. A. Gusarov, I. V. Sokolova, V. D. Gusarova, E. A. Evteeva, T. V. Vorob’eva, S. A. Kosarev, E. D. Shibanova, and D. I. Bairamashvili Shemyakin – Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, Moscow, 117997, Russia At present, much attention is devoted to the treatment of lymphomas by means of monoclonal antibodies. Unfortunately, no preparations such as Rituximab (Mabthera) are produced in the Russian Federation and these have to be imported from abroad. It is shown that H1 type histones possessing an activity similar to that of Rituximab can be used for such a therapy. We have developed an experimental commercial technology for the production of recombinant N,N-bis-met-histone H1.3. The activity and purity of the obtained preparation were demonstrated in various tests. The accumulated amount of the active pharmaceutical substance is enough to start clinical trials in Russia. Key words: N,N-bis-Met-histone H1.3, lymphoma, chromatography, technology Õèìèêî-ôàðìàöåâòè÷åñêèé æóðíàë. Òîì 46, ¹ 4, 2012 41