Потребление аминокислот некультивируемым

реклама
Ñèáèðñêèé ýêîëîãè÷åñêèé æóðíàë, 1 (2011) 13–21
ÓÄÊ 579.68
Ïîòðåáëåíèå àìèíîêèñëîò
íåêóëüòèâèðóåìûì áàêòåðèîïëàíêòîíîì
ýâòðîôíîãî âîäîõðàíèëèùà
Î. Â. ÊÎËÌÀÊÎÂÀ, Ì. Þ. ÒÐÓÑÎÂÀ*
Ñèáèðñêèé ôåäåðàëüíûé óíèâåðñèòåò
660041, Êðàñíîÿðñê, ïðîñï. Ñâîáîäíûé, 79
*Èíñòèòóò áèîôèçèêè ÑÎ ÐÀÍ
660036, Êðàñíîÿðñê, Àêàäåìãîðîäîê
E-mail: mtrusova@ibp.krasn.ru
ÀÍÍÎÒÀÖÈß
 ýêñïåðèìåíòàëüíûõ ìèêðîýêîñèñòåìàõ âûÿâëåíû c èñïîëüçîâàíèåì íåñòåðèëüíîãî êóëüòèâèðîâàíèÿ âèäû (êëîíû) áàêòåðèîïëàíêòîíà âîäîõðàíèëèùà, ïèòàþùèåñÿ ëèçèíîì è ãëèöèíîì. Ñòðóêòóðó
ñîîáùåñòâà àíàëèçèðîâàëè, ïðèìåíÿÿ ìåòîä ðàçäåëåíèÿ àìïëèôèöèðîâàííûõ ôðàãìåíòîâ ãåíà 16S
ðÐÍÊ áàêòåðèé â óñëîâèÿõ äåíàòóðèðóþùåãî ãðàäèåíòíîãî ãåëü-ýëåêòðîôîðåçà. Èäåíòèôèêàöèÿ äîìèíèðóþùèõ âèäîâ (êëîíîâ) áàêòåðèîïëàíêòîíà ïðîâåäåíà ñ èñïîëüçîâàíèåì ìîëåêóëÿðíîãî êëîíèðîâàíèÿ è îïðåäåëåíèÿ íóêëåîòèäíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ó÷àñòêà ãåíà 16S ðèáîñîìàëüíîé ÐÍÊ. Îáíàðóæåíî, ÷òî ãëèöèí – îäíà èç ïðåâàëèðóþùèõ àìèíîêèñëîò ýâòðîôíîãî âîäîåìà, è ëèçèí, ÷üå ñîäåðæàíèå â ïðèðîäíîé âîäå áîëåå íèçêîå, ñëóæèëè ïèòàòåëüíûìè ñóáñòðàòàìè äëÿ ðàçíûõ ñóáäîìèíàíòíûõ âèäîâ (êëîíîâ) áàêòåðèîïëàíêòîíà. Òàêèì îáðàçîì, óñòàíîâëåíî, ÷òî âèäû ñâîáîäíîæèâóùåãî áàêòåðèîïëàíêòîíà ÿâëÿþòñÿ óçêîñïåöèàëèçèðîâàííûìè ïî ïîòðåáëåíèþ îòäåëüíûõ àìèíîêèñëîò.
Êëþ÷åâûå ñëîâà: ñâîáîäíîæèâóùèé íåêóëüòèâèðóåìûé áàêòåðèîïëàíêòîí, àìèíîêèñëîòû, ÏÖÐÄÃÃÝ, ìèêðîýêîñèñòåìû, 16S ðèáîñîìàëüíàÿ ÐÍÊ.
Âàæíåéøèì òðîôè÷åñêèì çâåíîì ëþáîé
ýêîñèñòåìû, êàê èçâåñòíî, ÿâëÿþòñÿ ðåäóöåíòû.  ïåëàãè÷åñêèõ ýêîñèñòåìàõ çâåíî ðåäóöåíòîâ ïðåäñòàâëåíî áàêòåðèîïëàíêòîíîì. Âî
ìíîãèõ ìîäåëÿõ êà÷åñòâà ïðèðîäíûõ âîä áàêòåðèîïëàíêòîí îïèñûâàåòñÿ êàê àãðåãèðîâàííàÿ êîìïîíåíòà [1, 2]. Ïðè÷èíîé àãðåãèðîâàíèÿ çàâåäîìî ðàçíûõ âèäîâ áàêòåðèé â îäíî
çâåíî ÿâëÿåòñÿ òðóäíîñòü èäåíòèôèêàöèè
âèäîâîãî ñîñòàâà áàêòåðèîïëàíêòîíà. Îñíîâíûì ìåòîäîì îïðåäåëåíèÿ âèäîâîé ïðèíàäëåæíîñòè áàêòåðèé â òå÷åíèå äëèòåëüíîãî
ïåðèîäà áûëî êóëüòèâèðîâàíèå íà òâåðäûõ
Êîëìàêîâà Îëåñÿ Âëàäèìèðîâíà
Òðóñîâà Ìàðèÿ Þðüåâíà
ñåëåêòèâíûõ ñðåäàõ. Îäíàêî, ïîñêîëüêó íà
òâåðäûõ ñðåäàõ âûðàñòàåò íå áîëåå 1–3 %
ñâîáîäíîæèâóùèõ ïëàíêòîííûõ áàêòåðèé,
îïðåäåëÿåìûõ ïðÿìûì ñ÷åòîì [3–5], äî íåäàâíåãî âðåìåíè âèäîâîé ñîñòàâ 97 % âèäîâ
áàêòåðèé îñòàâàëñÿ íåèçâåñòíûì.
Îòñóòñòâèå âèäîâîé èäåíòèôèêàöèè äåëàëî íåâîçìîæíûì îïðåäåëåíèå ôóíêöèîíàëüíîé ðîëè áîëüøèíñòâà âèäîâ íåêóëüòèâèðóåìîãî áàêòåðèîïëàíêòîíà â ýêîñèñòåìå. Êàê
ïðàâèëî, âûäåëÿëèñü öåëûå ãðóïïû áàêòåðèé, ïðåäïîëîæèòåëüíî îáúåäèíåííûå îáùåé
áèîãåîõèìè÷åñêîé ôóíêöèåé. Ïîäðîáíî èçó÷àëîñü ó÷àñòèå àãðåãèðîâàííûõ ãðóïï âîäíûõ
ìèêðîîðãàíèçìîâ â ïðîöåññàõ ôîòî- è õåìîñèíòåçà è äåñòðóêöèè îðãàíè÷åñêèõ âåùåñòâ
!
(óãëåâîäîâ, áåëêîâ, àìèíîêèñëîò, àìèíîñàõàðîâ, àëüãèíîâûõ êèñëîò, óãëåâîäîðîäîâ,
ãóìèíîâûõ âåùåñòâ è äð.) â êðóãîâîðîòå àçîòà è äðóãèõ ýëåìåíòîâ [3, 6–10]. Îäíàêî ðîëü
îòäåëüíûõ âèäîâ â äåñòðóêöèè îðãàíè÷åñêèõ
âåùåñòâ, â ÷àñòíîñòè àìèíîêèñëîò, äî ñèõ
ïîð îñòàåòñÿ íåèçâåñòíîé â ñâÿçè ñ òðóäíîñòÿìè âèäîâîé èäåíòèôèêàöèè áàêòåðèîïëàíêòîíà. Ïðè ýòîì ìíîãèå àâòîðû óêàçûâàþò íà
íåîáõîäèìîñòü îïðåäåëåíèÿ ôèëîãåíåòè÷åñêîé
ïðèíàäëåæíîñòè áàêòåðèîïëàíêòîíà, ó÷àñòâóþùåãî â òåõ èëè èíûõ áèîãåîõèìè÷åñêèõ
ïðîöåññàõ [7, 9]. Òàêóþ âîçìîæíîñòü ïîòåíöèàëüíî ïðåäîñòàâëÿåò ïðèìåíåíèå ìîëåêóëÿðíî-ãåíåòè÷åñêîãî ìåòîäà îïðåäåëåíèÿ âèäîâîé ïðèíàäëåæíîñòè áàêòåðèé, ïîÿâèâøåãîñÿ â ïîñëåäíèå äâà äåñÿòèëåòèÿ. Öåëü íàøåé ðàáîòû – ìîëåêóëÿðíî-ãåíåòè÷åñêàÿ
èäåíòèôèêàöèÿ áàêòåðèîïëàíêòîíà, ïîòðåáëÿþùåãî àìèíîêèñëîòû.
ÌÀÒÅÐÈÀË È ÌÅÒÎÄÛ
Îïèñàíèå ýêñïåðèìåíòà. Ïðèðîäíóþ âîäó
äëÿ ýêñïåðèìåíòîâ îòáèðàëè â ýâòðîôíîì
âîäîõðàíèëèùå Áóãà÷. Ïîäðîáíîå îïèñàíèå
ýêîñèñòåìû âîäîõðàíèëèùà, âêëþ÷àÿ ñîñòàâ
ðàñòâîðåííûõ â âîäå àìèíîêèñëîò, ïðèâåäåíî â ðàáîòàõ [11, 12].
Ýêñïåðèìåíò ïðîâîäèëè ñ 30 èþíÿ ïî
6 èþëÿ â ëàáîðàòîðíûõ ìèêðîýêîñèñòåìàõ
(ÌÝÑ) îáúåìîì 10 ë. Ïîäðîáíîå îïèñàíèå
ÌÝÑ ïðèâåäåíî â ðàáîòàõ [13, 14]. Ðàíåå
óñòàíîâëåíî, ÷òî â ÌÝÑ â òå÷åíèå 7–10 ñóò
ñîõðàíÿåòñÿ è ôóíêöèîíèðóåò åñòåñòâåííîå
ïëàíêòîííîå ñîîáùåñòâî, âêëþ÷àþùåå ôèòî-,
çîî- è áàêòåðèîïëàíêòîí [15]. Íåñòåðèëüíîå
êóëüòèâèðîâàíèå â ÌÝÑ – åäèíñòâåííûé ýêñïåðèìåíòàëüíûé ñïîñîá ðàáîòû ñ íåêóëüòèâèðóåìûìè âèäàìè áàêòåðèîïëàíêòîíà, ìíîãèå
èç êîòîðûõ íå ñïîñîáíû ñóùåñòâîâàòü âíå ñîîáùåñòâà [5]. Ïðîáû âîäû èç âîäîõðàíèëèùà,
ñîäåðæàùèå åñòåñòâåííûé ïëàíêòîí, èíîêóëèðîâàëè â òðè ÌÝÑ. Â ÌÝÑ ¹ 1 äîáàâèëè
àìèíîêèñëîòó L-ëèçèí (ëèçèíà ìîíîõëîðãèäðàò, Ðåàõèì) â êîíöåíòðàöèè 100 ìã  ë–1, â
ÌÝÑ ¹ 3 – L-ãëèöèí (Reanàl) â òîé æå êîíöåíòðàöèè. Ïîñêîëüêó â âîäîõðàíèëèùå Áóãà÷ íàáëþäàåìûå êîíöåíòðàöèè äàííûõ àìèíîêèñëîò ñîñòàâëÿëè ìåíåå 1 ìã  ë–1 [11],
äëÿ îáåñïå÷åíèÿ îòêëèêà áàêòåðèàëüíîãî ñî"
îáùåñòâà íà äîáàâëÿåìûé ñóáñòðàò èñïîëüçîâàíû 100-êðàòíûå êîíöåíòðàöèè ãëèöèíà
è ëèçèíà. ÌÝÑ ¹ 2 áûëà êîíòðîëüíîé. Òåìïåðàòóðó âîäû â ÌÝÑ ïîääåðæèâàëè íà óðîâíå ëåòíåé â âîäîåìå – 22 Ñ. Îñâåùåííîñòü
ÌÝÑ áûëà 7,0 Âò/ì2, ôîòîïåðèîä – 16 ÷ ñâåò,
8 ÷ òåìíîòà. Ïåðåìåøèâàíèå âîäû â ÌÝÑ
ïðîèçâîäèëîñü äâàæäû â ñóòêè ñòåêëÿííûì
øïàòåëåì.
Ïðîáû âîäû äëÿ îïðåäåëåíèÿ âèäîâîãî
ñîñòàâà áàêòåðèîïëàíêòîíà â îáúåìå 100 ìë
îòîáðàëè ïåðâîíà÷àëüíî èç îáùåé ïðîáû
âîäû âîäîõðàíèëèùà ïåðåä çàïîëíåíèåì
ÌÝÑ, à çàòåì – îòäåëüíî èç êàæäîé ÌÝÑ
íà 2, 3, 4, 5 è 6-å ñóò ýêñïåðèìåíòà.
Âûäåëåíèå ãåíîìíîé ÄÍÊ. Ïîñëå ïðåäâàðèòåëüíîé ôèëüòðàöèè ÷åðåç êðóïíîïîðèñòûå ìåìáðàííûå ôèëüòðû 2,5 ìêì áàêòåðèîïëàíêòîí êîíöåíòðèðîâàëè èç îáúåìà
100 ìë ôèëüòðîâàíèåì íà ñòåðèëüíûõ áàêòåðèàëüíûõ ôèëüòðàõ 0,22 ìêì. Ãåíîìíóþ ÄÍÊ
èç áàêòåðèîïëàíêòîíà, ñêîíöåíòðèðîâàííîãî
íà ìåìáðàíàõ, âûäåëÿëè ïî ìåòîäó Áîñòðîìà ñ ñîàâòîðàìè [16]. Äëÿ ýòîãî ìåìáðàíû ðàçðåçàëè íà ÷àñòè, ïîìåùàëè â ñòåðèëüíûå
2 ìë ïëàñòèêîâûå ïðîáèðêè è äîáàâëÿëè
525 ìêë ëèçèðóþùåãî áóôåðà (400 ìÌ NaCl,
750 ìÌ ñàõàðîçà, 20 ìÌ ÝÄÒÀ, 50 ìÌ òðèñHCl pH 9,0) è 11 ìêë ðàñòâîðà ëèçîöèìà (êîíå÷íàÿ êîíöåíòðàöèÿ 1 ìã/ìë), èíêóáèðîâàëè 30 ìèí ïðè 37 Ñ. Çàòåì â ïðîáèðêè äîáàâëÿëè 60 ìêë ðàñòâîðà äîäåöèëñóëüôàòà
íàòðèÿ (SDS, êîíå÷íàÿ êîíöåíòðàöèÿ 1 %) è
3 ìêë ðàñòâîðà ïðîòåèíàçû Ê (êîíå÷íàÿ êîíöåíòðàöèÿ 100 ìêã/ìë) è èíêóáèðîâàëè ïðè
55 Ñ 12 ÷. Ïðîäóêòû ëèçèñà ïåðåíîñèëè â
÷èñòûå ïðîáèðêè, ôèëüòðû äîïîëíèòåëüíî
ïðîìûâàëè 500 ìêë ÒÅ áóôåðà (10 ìM òðèñHCl pH 8,0, 2 ìM ÝÄÒÀ), êîòîðûé çàòåì
îáúåäèíÿëè ñ ëèçàòàìè. Ê ÄÍÊ-ñîäåðæàùèì
ðàñòâîðàì äîáàâëÿëè 1/10 îáúåìà 3 Ì ðàñòâîðà àöåòàòà íàòðèÿ, ïåðåìåøèâàëè è îñàæäàëè ÄÍÊ 2,5 îáúåìàìè 96%-ãî ýòàíîëà ïðè
–20 C â òå÷åíèå 1 ÷. Ïðîáèðêè öåíòðèôóãèðîâàëè 20 ìèí ïðè 20000 g è 4 Ñ. Îñàäêè
ïðîìûâàëè 70%-ì ýòàíîëîì. Ïîñëå óäàëåíèÿ
ýòàíîëà îñàäêè ïîäñóøèâàëè íà âîçäóõå è
ðàñòâîðÿëè â 100 ìêë áóôåðà ÒÅ.
Êà÷åñòâî è êîëè÷åñòâî âûäåëåííîé âûñîêîìîëåêóëÿðíîé ÄÍÊ àíàëèçèðîâàëè ìåòîäîì
ýëåêòðîôîðåçà â 1%-ì àãàðîçíîì ãåëå.
Äåíàòóðèðóþùèé ãðàäèåíòíûé ãåëü-ýëåêòðîôîðåç. Ôðàãìåíòû ãåíà 16S ðÐÍÊ äëèíîé 586 ï. í. àìïëèôèöèðîâàëè èç ñóììàðíîé
ãåíîìíîé ÄÍÊ áàêòåðèîïëàíêòîíà ñ ïîìîùüþ
ïîëèìåðàçíîé öåïíîé ðåàêöèè (ÏÖÐ) ñ óíèâåðñàëüíûìè ïðàéìåðàìè GC-341F (5-CCT
ACG GGA GGC AGC AG-3, íà 5-êîíöå ïðèñîåäèíåí “GC-clamp” 5CGC CCG CCG CGC
CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC
C-3) è 926R (5¢-CCG TCA ATT CA/CT TTG
AGT TT-3) [17]. Ðåàêöèîííàÿ ñìåñü äëÿ ÏÖÐ
îïòèìèçèðîâàíà ïîä äàííóþ ïàðó ïðàéìåðîâ
è ñîäåðæàëà 67 ìÌ òðèñ-ÍÑ1, ðÍ 8,8 ïðè
25 Ñ, 0,01 % Tween 20, 16,6 ìÌ (NH4)2SO4,
1,5 ìÌ MgÑ1 2, 3 % äèìåòèëñóëüôîêñèäà
(ÄÌÑÎ), 0,2 ìÌ êàæäîãî dNTP, ïî 10 ïìîëåé êàæäîãî ïðàéìåðà, 2,5 åä. àêò. Taq ÄÍÊ
ïîëèìåðàçû, 10 íã ÄÍÊ. ÏÖÐ ïðîâîäèëè íà
ïðèáîðå Biometra TPersonàl (Biometra, Ãåðìàíèÿ) â ñëåäóþùåì òåìïåðàòóðíî-âðåìåííîì ðåæèìå: ïåðâûé öèêë – 94 Ñ, 30 ñ;
65 Ñ, 35 ñ; 72 Ñ, 40 ñ; çàòåì ïîíèæåíèå
òåìïåðàòóðû îòæèãà íà 1 Ñ/öèêë â òå÷åíèå
10 öèêëîâ; 20 öèêëî⠖ 94 Ñ, 30 ñ; 56 Ñ,
35 ñ; 72 Ñ, 40 ñ è îêîí÷àòåëüíàÿ ïîëèìåðèçàöèÿ ïðè 72 Ñ, 5 ìèí. Äëÿ êîíòðîëÿ êîíòàìèíàöèè ñòàâèëè îòðèöàòåëüíóþ êîíòðîëüíóþ
ðåàêöèþ, â êîòîðóþ âìåñòî ÄÍÊ-ìàòðèöû
äîáàâëÿëè ñòåðèëüíóþ âîäó. Àíàëèç ïðîäóêòîâ ÏÖÐ ïðîâîäèëè ïðè ïîìîùè ýëåêòðîôîðåçà â 1,2 % àãàðîçíîì ãåëå. ÏÖÐ-ïðîäóêòû
êîíöåíòðèðîâàëè ñïèðòîâûì ïåðåîñàæäåíèåì è èñïîëüçîâàëè 800 íã ïîëó÷åííîé ÄÍÊ
äëÿ àíàëèçà ìåòîäîì ÄÃÃÝ.
ÄÃÃÝ âûïîëíÿëè íà ïðèáîðå DCode Universal Mutation Detection System (BioRad,
ÑØÀ) â 6%-ì ïîëèàêðèëàìèäíîì ãåëå ñ ãðàäèåíòîì äåíàòóðèðóþùåãî ôàêòîðà îò 40 äî
70 % (100%-é äåíàòóðèðóþùèé ôàêòîð ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé ñìåñü 7Ì ðàñòâîðà ìî÷åâèíû
è 40%-ãî äåèîíèçîâàííîãî ôîðìàìèäà). Ýëåêòðîôîðåç âåëè ïðè 60 Ñ â îäíîêðàòíîì ÒÀÅ
áóôåðå ïðè íàïðÿæåíèè 100  â òå÷åíèå 17 ÷.
Ïî îêîí÷àíèè ýëåêòðîôîðåçà ãåëü îêðàøèâàëè áðîìèñòûì ýòèäèåì è ïîëó÷àëè öèôðîâûå èçîáðàæåíèÿ â ÓÔ (302 íì) ñâåòå íà ïðèáîðå AlphaImager (Alpha Innotech Corp., ÑØÀ).
Ïîëîñû ÄÍÊ, ñîîòâåòñòâóþùèå ñóáäîìèíàíòíûì âèäàì áàêòåðèé, ïîòðåáëÿþùèõ ãëèöèí
è ëèçèí, âûðåçàëè èç ãåëÿ ñòåðèëüíûì ñêàëüïåëåì è õðàíèëè â ñòåðèëüíûõ ìèêðîïðîáèðêàõ ïðè –20 Ñ.
Êëîíèðîâàíèå. Äëÿ êëîíèðîâàíèÿ ÏÖÐïðîäóêòîâ ãîòîâèëè Ò-âåêòîð [18]. Äëÿ ýòîãî ïëàçìèäó pBluescri pt II (Stratagene,
ÑØÀ) îáðàáàòûâàëè ðåñòðèêòàçîé EcoR V
(ÑèáÝíçèì, Íîâîñèáèðñê), äîñòðàèâàëè “ëèïêèå” 3-Ò-êîíöû äâóõ÷àñîâûì èíêóáèðîâàíèåì ïðè 72 Ñ ñ Taq ÄÍÊ ïîëèìåðàçîé è
dTTP. Ïîëó÷åííûé Ò-âåêòîð î÷èùàëè ïðåïàðàòèâíûì ýëåêòðîôîðåçîì â 0,8%-ì àãàðîçíîì ãåëå è âûäåëÿëè èç ãåëÿ ñ ïîìîùüþ
íàáîðà MinElute Gel Extraction Kit (QIAGen,
Ãåðìàíèÿ).
Ôðàãìåíòû ãåíà 16S ðÐÍÊ áàêòåðèé è Òâåêòîð ëèãèðîâàëè âûñîêîàêòèâíîé Ò4 ÄÍÊ
ëèãàçîé (ÑèáÝíçèì, Íîâîñèáèðñê) ïðè 16 Ñ.
Ëèãàçíîé ñìåñüþ òðàíñôîðìèðîâàëè êëåòêè
E. coli XL-1 Blue (Stratagene, ÑØÀ). Êîìïåòåíòíûå êëåòêè E. coli ãîòîâèëè ñòàíäàðòíûì
ìåòîäîì, èñïîëüçóÿ TFB áóôåð, êàê îïèñàíî ó Ñýìáðóêà è äð. [19]. Êëåòî÷íóþ ñóñïåíçèþ âûñåâàëè íà 1,5%-é LB-àãàð, ñîäåðæàùèé 100 ìêã/ìë àìïèöèëëèíà, 80 ìêã/ìë
X-Gal (5-áðîì-4-õëîð-3-èíäîëèë-áåòà-D-ãàëàêòîïèðàíîçèä) è 80 ìêã/ìë ÈÏÒà (èçîïðîïèë-áåòà-D-òèîãàëàêòîïèðàíîçèä). Îòáîð êëîíîâ, ñîäåðæàùèõ âñòàâêó, ïðîâîäèëè ìåòîäîì “áåëî-ãîëóáîãî” ñêðèíèíãà [19]. Áåëûå êîëîíèè ïåðåíîñèëè â ìèêðîïðîáèðêè, ñîäåðæàùèå 20 ìêë 10 ìÌ òðèñ-ÍÑ1, ðÍ 8,0. Äëÿ
àíàëèçà ðàçìåðà âñòàâîê ïðîâîäèëè ÏÖÐ ñ
2 ìêë ñóñïåíçèè êëåòîê â êà÷åñòâå ìàòðèöû,
èñïîëüçóÿ ïðàéìåðû, êîìïëåìåíòàðíûå ó÷àñòêàì ïëàçìèäû â ðàéîíå âñòàâêè (Ì13-Up
5-CCT TTG TCG ATA CTG GTA-3, M13Down 5-GTT GTA AAA CGA CGG CCA GTG
A-3). Óñëîâèÿ ðåàêöèè: ïåðâûé öèêë – 94 Ñ,
2 ìèí; 60 Ñ, 1 ìèí; 72 Ñ, 1 ìèí; 29 öèêëî⠖ 94 Ñ, 30 ñ; 60 Ñ, 40 ñ; 72 Ñ, 40 ñ è
îêîí÷àòåëüíàÿ ïîëèìåðèçàöèÿ 72 Ñ, 5 ìèí.
Ïîëó÷åííûå ïðîäóêòû ðåàêöèè àíàëèçèðîâàëè ýëåêòðîôîðåçîì â 1,2%-ì àãàðîçíîì ãåëå.
Ïîñëå îêðàøèâàíèÿ ãåëÿ áðîìèñòûì ýòèäèåì ïîëîñû èñêîìîãî ðàçìåðà (1124 ï. í.) âûðåçàëè èç ãåëÿ ïîä äëèííîâîëíîâûì ÓÔ è âûäåëÿëè ÄÍÊ êàê îïèñàíî âûøå.
Îïðåäåëåíèå íóêëåîòèäíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè. Íóêëåîòèäíóþ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü
ïîëó÷åííûõ âñòàâîê îïðåäåëÿëè íà àâòîìàòè÷åñêîì ñåêâåíàòîðå ALFexpress II (Amersham Pharmacia Biotech, ÑØÀ) Öåíòðà êîëëåêòèâíîãî ïîëüçîâàíèÿ ïðèáîðàìè ÍÎÖ “Åíèñåé” (ÑÔÓ, Êðàñíîÿðñê) ñ ïîìîùüþ íàáîðà
#
Thermo Sequenàse Cy5 Dye Termin ator Kit
(Amersham Pharmacia Biotech, ÑØÀ) ñîãëàñíî ðåêîìåíäàöèÿì ïðîèçâîäèòåëÿ. Äëÿ ñåêâåíèðîâàíèÿ ïðèìåíÿëè óíèâåðñàëüíûå ïëàçìèäíûå ïðàéìåðû Ì13. Ïîëó÷åííûå íóêëåîòèäíûå ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ãåíîâ 16S ðÐÍÊ
äåïîíèðîâàíû â áàçå äàííûõ GenBank ïîä
íîìåðàìè HM072086 è HM072087, à òàêæå â
áàçå EMBL ïîä íîìåðàìè FN773496-FN773499.
Ôèëîãåíåòè÷åñêèé àíàëèç. Ïîëó÷åííûå
íóêëåîòèäíûå ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ãåíà 16S
ðÐÍÊ ñðàâíèâàëè ñ ïîñëåäîâàòåëüíîñòÿìè áàç
äàííûõ GenBank è EMBL ñ ïîìîùüþ îíëàéíñåðâèñà BLAST [URL: http://www.ncbi.nlm.
nih.gov/blast]. Äàëåå áûëî ïîñòðîåíî ôèëîãåíåòè÷åñêîå äðåâî ñ ïîìîùüþ ïðîãðàììíîãî îáåñïå÷åíèÿ Mega [URL: http://www.
megasoftware.net/]. Èñïîëüçîâàëñÿ ìåòîä
ïðèñîåäèíåíèÿ áëèæàéøèõ ñîñåäåé ñ 1000
ïîâòîðîâ áóòñòðåï-àíàëèçà.  êà÷åñòâå âíåøíåãî (êîðíåâîãî) âèäà âûáðàíà àðõåÿ Halobacterium sp.
ÐÅÇÓËÜÒÀÒÛ È ÈÕ ÎÁÑÓÆÄÅÍÈÅ
Íà îñíîâàíèè àíàëèçà ÄÃÃÝ-ãåëÿ (ðèñ. 1)
â èñõîäíîé ïðîáå (ñì. ðèñ. 1, Èñõ) âûÿâëåíî
25 êëîíîâ (âèäîâ) áàêòåðèé. Â êîíòðîëüíîé
ÌÝÑ ¹ 2 (ñì. ðèñ. 1, Ê-2 – Ê-6) â òå÷åíèå
âñåãî ýêñïåðèìåíòà íå ïðîèñõîäèëî ñóùåñòâåííûõ êà÷åñòâåííûõ è êîëè÷åñòâåííûõ
èçìåíåíèé ñîñòàâà áàêòåðèîïëàíêòîíà ïî
ñðàâíåíèþ ñ èñõîäíîé ïðîáîé (ñì. ðèñ. 1, Èñõ).
Äàííûé ðåçóëüòàò îçíà÷àåò, ÷òî â êîíòðîëüíîé ÌÝÑ ¹ 2 â òå÷åíèå âñåãî ýêñïåðèìåíòà ôóíêöèîíèðîâàëî åñòåñòâåííîå ñîîáùåñòâî áàêòåðèîïëàíêòîíà âîäîõðàíèëèùà.
 ÌÝÑ ¹ 3 ñ äîáàâêîé ãëèöèíà ñîñòàâ áàêòåðèîïëàíêòîíà óæå íà âòîðûå ñóòêè ýêñïåðèìåíòà (ñì. ðèñ. 1, Ã-2) ðåçêî îòëè÷àëñÿ îò
èñõîäíîé ïðîáû (ñì. ðèñ. 1, Èñõ). Êëîí Gly1,
ïðèñóòñòâîâàâøèé â èñõîäíîé ïðîáå (ñì. ðèñ.
1, Èñõ), âûøåë â äîìèíàíòû óæå íà âòîðûå
ñóòêè (ñì. ðèñ. 1, Ã-2) è ïðîäîëæàë äîìèíèðîâàòü äî ÷åòâåðòûõ ñóòîê ýêñïåðèìåíòà (ñì.
ðèñ. 1, Ã-2 – Ã-4). Íà òðåòüè ñóòêè â ÌÝÑ
¹ 3 ïîÿâèëñÿ ñóáäîìèíàíò Gly2 (ñì. ðèñ. 1,
Ã-3). Íà ÷åòâåðòûå ñóòêè ýêñïåðèìåíòà ïðîôèëü ñóùåñòâåííî íå ìåíÿëñÿ, íà÷àëà óâåëè÷èâàòüñÿ äîëÿ âèäà Gly3 (ñì. ðèñ. 1, Ã-4).
Íà ïÿòûå ñóòêè âèä Gly1 èñ÷åç èç áàêòåðèàëüíîãî ñîîáùåñòâà ÌÝÑ ¹ 3, îäíàêî ïîÿâèëñÿ íîâûé äîìèíèðóþùèé êëîí Gly4 (ñì.
ðèñ. 1, Ã-5). Â ïîñëåäíèé äåíü åãî âûòåñíèë
äðóãîé íîâûé êëîí Gly5 (ñì. ðèñ. 1, Ã-6).  òå÷åíèå òðåòüèõ – ïÿòûõ ñóòîê â ñîîáùåñòâå
ÌÝÑ ¹ 3 ïðîèñõîäèëà òàêæå ïîëîæèòåëüíàÿ äèíàìèêà åùå äâóõ âèäîâ, îäíàêî â äîìèíàíòû ê êîíöó ýêñïåðèìåíòà îíè íå âûøëè. Òàêèì îáðàçîì, â áàêòåðèàëüíîì ñîîáùåñòâå ïðè äîáàâëåíèè ãëèöèíà ïðîèçîøëè ðîñò
÷èñëåííîñòè äâóõ èñõîäíî çàìåòíûõ âèäîâ ñ
ïîñëåäóþùèì èñ÷åçíîâåíèåì îäíîãî èç íèõ
ê êîíöó ýêñïåðèìåíòà è ïðîÿâëåíèå òðåõ íå
îáíàðóæèâàåìûõ â èñõîäíîé ïðîáå âèäîâ áàêòåðèé (ñì. ðèñ. 1, Èñõ).
Ðèñ. 1. ÏÖÐ-ÄÃÃÝ îáðàçöîâ áàêòåðèîïëàíêòîíà èç ÌÝÑ ¹ 1 (ëèçèí, äîðîæêè Ë-2 – Ë-6), ÌÝÑ ¹ 2
(êîíòðîëü, äîðîæêè Ê-2 – Ê-6), ÌÝÑ ¹ 3 (ãëèöèí, äîðîæêè Ã-2 – Ã-6) è èñõîäíîé ïðîáû (Èñõ).
Ñòðåëêè óêàçûâàþò íà ïîëîñû ÄÍÊ, íóêëåîòèäíàÿ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü êîòîðûõ îïðåäåëåíà. Öèôðû
ðÿäîì ñî ñòðåëêàìè îáîçíà÷àþò íîìåð êëîíà â òàáëèöå
$
Ðèñ. 2. Ôèëîãåíåòè÷åñêîå äðåâî ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé ãåíà 16S ðÐÍÊ ñóáäîìèíàíòíûõ êëîíîâ, âûäåëåííûõ èç ïîëîñ ÄÃÃÝ
 ÌÝÑ ¹ 1 ñ äîáàâêîé ëèçèíà íà âòîðûå
ñóòêè ýêñïåðèìåíòà îäíî èç äîìèíèðóþùèõ
ïîëîæåíèé çàíÿë âèä Lys1 (ñì. ðèñ. 1, Ë-2),
îäíàêî ê êîíöó ýêñïåðèìåíòà åãî äîëÿ óìåíüøèëàñü (ñì. ðèñ. 1, Ë-3 – Ë-6). Ê ÷åòâåðòûì
ñóòêàì â äîìèíàíòû âûøåë âèä Lys2 (ñì.
ðèñ. 1, Ë-3 – Ë-4), íî âïîñëåäñòâèè îí òàêæå óñòóïèë ìåñòî äâóì íîâûì âèäàì (ñì. ðèñ.
1, Ë-5 – Ë-6).
Ïî ðåçóëüòàòàì ôèëîãåíåòè÷åñêîãî àíàëèçà (ðèñ. 2) êëîíû Lys1 è Lys2, äîìèíèðîâàâøèå â òå÷åíèå ïåðâûõ òðåõ ñóòîê â ÌÝÑ
¹ 1 ñ äîáàâêîé ëèçèíà (ñì. ðèñ. 1, Ë-1 – Ë-3),
ïðèíàäëåæàëè ê ñåìåéñòâó Burkholderiaceae
êëàññà Áåòàïðîòåîáàêòåðèé. Áëèæàéøèå ðîäñòâåííèêè êëîíîâ Gly2, Gly4 è Gly5 èç ÌÝÑ
¹ 3 ñ äîáàâêîé ãëèöèíà (ñì. ðèñ. 1, Ã-2 – Ã-6)
ïðèíàäëåæàëè ê ñåìåéñòâó Comamon adaceae
òîãî æå êëàññà. Êëîí Gly5 (ñì. ðèñ. 1, Ã-6)
îáðàçîâàë îòäåëüíóþ âåòâü, äàëåêî îòñòîÿùóþ îò âñåõ îñòàëüíûõ ïðåäñòàâèòåëåé ñå-
ìåéñòâà Comamonàdaceae (ñì. ðèñ. 2). Êëîí
Gly1 (ñì. ðèñ. 1, Ã-2) îêàçàëñÿ íàèáîëåå áëèçîê íåêóëüòèâèðóåìûì êëîíàì êëàññà Chloroflexi (ñì. ðèñ. 2). Íåêóëüòèâèðóåìûå êëîíû
ýòîãî êëàññà, âêëþ÷àÿ Gly1, îáðàçóþò îòäåëüíûé êëàñòåð, äàëåêî îòñòîÿùèé îò âñåõ
èçâåñòíûõ êóëüòèâèðóåìûõ âèäîâ ýòîãî êëàññà (ñì. ðèñ. 2). Îïðåäåëèòü íóêëåîòèäíóþ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü èññëåäóåìîãî ó÷àñòêà ãåíà
16S ðÐÍÊ êëîíà Gly3 (ñì. ðèñ. 1, Èñõ – Ã6)
íà äàííûé ìîìåíò íå óäàëîñü.
Èòàê, îòäåëüíûå âèäû (êëîíû) íåêóëüòèâèðóåìîãî ñâîáîäíîæèâóùåãî áàêòåðèîïëàíêòîíà îêàçàëèñü óçêîñïåöèàëèçèðîâàííûìè ïî
ñïîñîáíîñòè ê ïîòðåáëåíèþ îòäåëüíûõ àìèíîêèñëîò. Íà äîáàâëåíèå îòäåëüíîé àìèíîêèñëîòû ðåàãèðîâàëî íå âñå áàêòåðèàëüíîå ñîîáùåñòâî, à ëèøü íåáîëüøîå ÷èñëî êëîíîâ,
èìåâøèõ â èñõîäíûõ ïðîáàõ ñðàâíèòåëüíî
íèçêóþ ÷èñëåííîñòü. Ïîëó÷åííûå ðåçóëüòàòû ïîëíîñòüþ ñîãëàñóþòñÿ ñ ðàíåå ïðîâå%
äåííûìè ýêñïåðèìåíòàìè [20], îäíàêî ìîëåêóëÿðíî-ãåíåòè÷åñêàÿ èäåíòèôèêàöèÿ
óçêîñïåöèàëèçèðîâàííûõ êëîíîâ ïðîâåäåíà
âïåðâûå.
Ðàíåå íàìè âûäâèíóòî ïðåäïîëîæåíèå,
÷òî â îòëè÷èå îò òðàäèöèîííûõ ïðåäñòàâëåíèé, ñîãëàñíî êîòîðûì ãðóïïû âîäíûõ áàêòåðèé ïîäðàçäåëÿþòñÿ íà ïîòðåáèòåëåé âñåãî êëàññà òåõ èëè èíûõ âåùåñòâ (íàïðèìåð,
ëèïèäîâ, ñàõàðîâ, àìèíîêèñëîò), ìàññîâûå
âèäû áàêòåðèîïëàíêòîíà ìîãóò îêàçàòüñÿ óçêîñïåöèàëèçèðîâàííûìè, ò. å. ïîòðåáëÿþùèìè ïðåèìóùåñòâåííî îäíî ïðîñòîå âåùåñòâî
[20]. Õîðîøî èçâåñòíî, ÷òî îäíè è òå æå êëîíû (âèäû) áàêòåðèîïëàíêòîíà îáíàðóæèâàþòñÿ â àáñîëþòíî ðàçíûõ ýêîñèñòåìàõ, êàðäèíàëüíî îòëè÷àþùèõñÿ ïî ñîñòàâó ïðîäóöåíòîâ è êîíñóìåíòîâ [21–23]. Íå èñêëþ÷åíî, ÷òî
ïîäîáíûé êîñìîïîëèòèçì (ýâðèòîïíîñòü) ñâèäåòåëüñòâóåò î ïîòðåáëåíèè áàêòåðèîïëàíêòîíîì ïðîñòûõ âåùåñòâ, óíèâåðñàëüíûõ äëÿ
âñåõ âîäíûõ ýêîñèñòåì, íàïðèìåð àìèíîêèñëîò. Åñëè áû òå èëè èíûå êëîíû ñâîáîäíîæèâóùèõ ïëàíêòîííûõ áàêòåðèé ïîòðåáëÿëè
ñëîæíûå îðãàíè÷åñêèå ìåòàáîëèòû è ïðîäóêòû ðàçëîæåíèÿ äðóãèõ îðãàíèçìîâ, èõ ïðèñóòñòâèå çàâèñåëî áû îò âèäîâîãî ñîñòàâà
äðóãèõ ãðóïï ïëàíêòîíà, êàê ýòî ïðîèñõîäèò â ñëó÷àå ïðèêðåïëåííîãî áàêòåðèîïëàíêòîíà [4]. Ïèòàíèå ïðîñòûìè ñóáñòðàòàìè òðåáóåò óçêîé ñïåöèàëèçàöèè ãåòåðîòðîôîâ, èíà÷å íåâîçìîæíûì ñòàíîâèòñÿ äîñòèæåíèå òàêîãî âàæíîãî ôàêòîðà óñòîé÷èâîñòè ñîîáùåñòâ, êàê áèîðàçíîîáðàçèå.
 ñâÿçè ñ óïîìÿíóòûì âûøå êîñìîïîëèòèçìîì (ýâðèòîïíîñòüþ) âîçíèêàåò âîïðîñ,
äåéñòâèòåëüíî ëè âñå èäåíòèôèöèðîâàííûå
êëîíû èçíà÷àëüíî ïðèñóòñòâîâàëè â ïðèðîäíîé âîäå âîäîõðàíèëèùà, à íå áûëè çàíåñåíû ñëó÷àéíî èç âîçäóõà èëè ñ îáîðóäîâàíèÿ
ïðè çàâåäîìî íåñòåðèëüíîì êóëüòèâèðîâàíèè? Ïðåæäå âñåãî, îòìåòèì, ÷òî êëîíû Gly1,
Gly3, Lys1 è Lys2 ïðèñóòñòâîâàëè êàê â èñõîäíîé ïðîáå èç âîäîõðàíèëèùà, òàê è â êîíòðîëå, íî â çíà÷èòåëüíî ìåíüøåì êîëè÷åñòâå, ÷åì â ýêñïåðèìåíòàëüíûõ ÌÝÑ ñ ñîîòâåòñòâóþùèìè äîáàâêàìè (ñì. ðèñ. 1). Âåðîÿòíî, Gly2, Gly4 è Gly5 òàêæå ñîäåðæàëèñü
â èñõîäíîé ïðîáå èç âîäîõðàíèëèùà, íî íå
ïðîÿâëÿëèñü ïðè ÄÃÃÝ-àíàëèçå. Ñëåäóåò îòìåòèòü, ÷òî ìåòîä ÄÃÃÝ ïîçâîëÿåò îáíàðó&
æèòü âèäû, ÷èñëåííîñòü êîòîðûõ â ñîîáùåñòâå ñîñòàâëÿåò áîëåå 1–2 %, ïîýòîìó ïîÿâëåíèå íîâûõ ïîëîñ ÄÍÊ íà “ïðîôèëå ñîîáùåñòâà” ñâèäåòåëüñòâóåò, êàê ïðàâèëî, íå
î ïîÿâëåíèè íîâîãî âèäà â ýêîñèñòåìå, à îá
óâåëè÷åíèè åãî ÷èñëåííîñòè äî îïðåäåëÿåìîé âåëè÷èíû [24]. Âàæíî ïîä÷åðêíóòü, ÷òî
â êîíòðîëüíîé ÌÝÑ ¹ 2 (ñì. ðèñ. 1, Ê-2 –
Ê-6) â òå÷åíèå âñåãî ýêñïåðèìåíòà íå ïðîèñõîäèëî ñóùåñòâåííûõ êà÷åñòâåííûõ è êîëè÷åñòâåííûõ èçìåíåíèé ñîñòàâà áàêòåðèîïëàíêòîíà ïî ñðàâíåíèþ ñ èñõîäíîé ïðîáîé
(ñì. ðèñ. 1, Èñõ). Äàííûé ðåçóëüòàò õîðîøî
ñîãëàñóåòñÿ ñ ïîëó÷åííûìè ðàíåå äîêàçàòåëüñòâàìè óñòîé÷èâîãî ôóíêöèîíèðîâàíèÿ
åñòåñòâåííûõ ïëàíêòîííûõ ñîîáùåñòâ â àíàëîãè÷íûõ ÌÝÑ [15]. Òàêèì îáðàçîì, âñå êëîíû Gly è Lys ïðîÿâëÿëèñü è óâåëè÷èâàëè
÷èñëåííîñòü â ÌÝÑ ñ äîáàâêàìè àìèíîêèñëîò íå â ðåçóëüòàòå àðòåôàêòîâ, ñâÿçàííûõ
ñ íåñòåðèëüíûì êóëüòèâèðîâàíèåì, à âñëåäñòâèå äîáàâîê îïðåäåëåííûõ àìèíîêèñëîò.
Äîáàâëÿåìûå àìèíîêèñëîòû òàêæå ÿâëÿþòñÿ
îáû÷íûìè êîìïîíåíòàìè âîäû âîäîõðàíèëèùà Áóãà÷.  ïðåäûäóùèå ãîäû ãëèöèí îòìå÷åí ñðåäè àìèíîêèñëîò ñ íàèáîëåå âûñîêîé
êîíöåíòðàöèåé, åãî ñîäåðæàíèå ñîñòàâëÿëî â ñðåäíåì 7,72 % îò èõ îáùåé ñóììû.
Ñîäåðæàíèå ëèçèíà áûëî íåñêîëüêî íèæå
(4,46 %), íî ýòà àìèíîêèñëîòà òàêæå ïðèñóòñòâîâàëà â ïðîáàõ â òå÷åíèå âñåãî âåãåòàöèîííîãî ñåçîíà [11].
Õîòÿ ìû ñâÿçûâàåì ïðîÿâëåíèå è äîìèíèðîâàíèå êëîíîâ Gly èìåííî ñ äîáàâêîé ãëèöèíà, íå èñêëþ÷åíî, ÷òî íåïîñðåäñòâåííî
ïîòðåáëÿþò ýòó àìèíîêèñëîòó ëèøü êëîíû
Gly1 è Gly2. ×èñëåííîñòü ýòèõ êëîíîâ ðåçêî
óâåëè÷èëàñü íåïîñðåäñòâåííî ïîñëå äîáàâêè
ãëèöèíà, à íà ïÿòûå ñóòêè ðåçêî ñíèçèëàñü
(ñì. ðèñ. 1). Ìàëîâåðîÿòíî, ÷òî íà ñíèæåíèå
÷èñëåííîñòè êëîíà Gly1 îêàçàëî âëèÿíèå
“âûåäàíèå” ãëèöèíà, ïîñêîëüêó åãî êîíöåíòðàöèÿ â 100 ðàç ïðåâûøàëà ìàêñèìàëüíóþ,
õàðàêòåðíóþ äëÿ âîäîõðàíèëèùà. Âîçìîæíî,
â ñíèæåíèè ÷èñëåííîñòè ýòèõ êëîíîâ ñûãðàë
ðîëü íåèçâåñòíûé íàì ëèìèòèðóþùèé ôàêòîð. Ïîñëå ñíèæåíèÿ ÷èñëåííîñòè Gly1 äîìèíèðóþùåå ïîëîæåíèå â ÄÃÃÝ-ïðîôèëå
áàêòåðèàëüíîãî ñîîáùåñòâà çàíÿëè íåèäåíòèôèöèðîâàííûå êëîíû Gly3, Gly4 è ïîçäíåå
Gly5 (ñì. ðèñ. 1). Íå èñêëþ÷åíî, ÷òî êëîíû
Ñóáäîìèíàíòíûå êëîíû, âûäåëåííûå èç íàèáîëåå ÿðêèõ ïîëîñ ÄÃÃÝ áàêòåðèàëüíîãî ñîîáùåñòâà
ìèêðîýêîñèñòåì â õîäå ýêñïåðèìåíòà ñ äîáàâëåíèåì àìèíîêèñëîò
Íîìåð
Êëîí
äåïîíèðîâàíèÿ
Lys-1
HM072087
Äëèíà,
ï. í.
584
Áëèæàéøèé ðîäñòâåííèê
Uncultured Burkholderiaceae bacterium
Ñõîäñòâî,
%
100
clone Gap-2-60 (EU642211)
Ãðóïïà
Betaproteobacteria;
Burkholderiales;
Burkholderiaceae
Lys-2
HM072086
585
Limnobacter thioxidans strain TSWCSN35
99
(GQ284439)
Betaproteobacteria;
Burkholderiales;
Burkholderiaceae
Gly-1
FN773496
562
Gly-2
FN773497
585
Uncultured bacterium clone 5C231722
100
Chloroflexi ?
99
Betaproteobacteria;
(EU804038)
Uncultured bacterium clone H5M13F
(EU796063)
Burkholderiales;
Comamon adaceae
Gly-4
FN773498
585
Uncultured Comamonàs sp. clone K11
98
(FN434426)
Betaproteobacteria;
Burkholderiales;
Comamon adaceae
Gly-5
FN773499
585
Uncultured Comamonàs sp. clone K7
(FN434424)
96
Betaproteobacteria;
Burkholderiales;
Comamon adaceae
Gly4 è Gly5 ïîòðåáëÿþò íå ñàìó àìèíîêèñëîòó, à îðãàíè÷åñêèå âåùåñòâà ìåðòâûõ êëåòîê êëîíîâ Gly1 è Gly2.
Ôèëîãåíåòè÷åñêèé àíàëèç èññëåäîâàííûõ
êëîíîâ âûÿâèë ñëåäóþùåå. Gly1 èìåë 100%-þ
èäåíòè÷íîñòü àíàëèçèðóåìîãî ó÷àñòêà ãåíà
16S ðÐÍÊ ñ íåêóëüòèâèðóåìûì áàêòåðèàëüíûì êëîíîì, íàèáîëåå áëèçêèì ê îòäåëó
Chloroflexi (ñì. ðèñ. 2, òàáëèöó). Äàííûé êëîí
îáíàðóæåí â âîäå îçåð Êèòàÿ, Ãðåöèè, Ñåâåðíîé, Öåíòðàëüíîé è Þæíîé Àìåðèêè
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Gly2
îêàçàëñÿ íà 99 % ñõîäåí ñ íåêóëüòèâèðóåìûì êëîíîì èç ñåìåéñòâà Comamonàdaceae
êëàññà -ïðîòåîáàêòåðèé, îáíàðóæåííûì â
ñòî÷íûõ âîäàõ. Gly4 èìåë 98%-å ñõîäñòâî ñî
øòàììàìè Comamonàs testosteroni, âûäåëåííûìè èç ñòî÷íûõ âîä ôàáðèêè, ïðîèçâîäÿùåé òåòðàöèêëèí. Ïîñëåäîâàòåëüíîñòü íóêëåîòèäîâ ïðîàíàëèçèðîâàííîãî ó÷àñòêà ãåíà
16S rRNA êëîíà Gly5 èìåëà ëèøü 96%-å
ñõîäñòâî ñ áëèæàéøèìè ðîäñòâåííèêàìè ñåìåéñòâà Comamonàdaceae. Òàêèì îáðàçîì, ñîãëàñíî îáùåïðèíÿòîìó “ïðàâèëó 97 %” [25],
Gly5 ÿâëÿåòñÿ íîâûì, ðàíåå íå îïèñàííûì
âèäîì.
Ïîñëåäîâàòåëüíîñòü íóêëåîòèäîâ èññëåäîâàííîãî ó÷àñòêà 16S ðÐÍÊ êëîíà Lys1 îêàçàëàñü íà 100 % èäåíòè÷íà íåêóëüòèâèðóåìîìó áàêòåðèàëüíîìó êëîíó ñåìåéñòâà Burkholderiaceae (Polynucleobacter sp.). Ýòîò êëîí
îáíàðóæåí â âîäàõ âûñîêîãîðíîãî îçåðà, â
îç. Ìè÷èãàí è â ×åñàïèêñêîì çàëèâå (http://
blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Lys2 íà 99 %
áûë èäåíòè÷åí øòàììó Limnobacter thioxidans, îáíàðóæèâàåìîìó â îñàäî÷íûõ îáðàçöàõ ïðåñíîâîäíîãî ðîäíèêà. Àíàëîãè÷íûå
íåêóëüòèâèðóåìûå êëîíû îáíàðóæåíû â ïðîáå àýðîçîëÿ ñ áåðåãîâîé àíòàðêòè÷åñêîé ñòàíöèè Äþìîíò ä’Óðâèëëü, íà ïîâåðõíîñòè
ñíåæíûõ ãëûá â Àíäàõ íà âûñîòå 6350 ì,
âî ôüîðäå Àðêòè÷åñêîãî îêåàíà, íàä ìåñòîì âûõîäà ìåòàíà âäîëü êðàÿ Ñåâåðîàìåðèêàíñêîãî êîíòèíåíòà (http://blast.ncbi.nlm.
nih.gov/Blast.cgi).
Èäåíòèôèêàöèÿ âèäîâ áàêòåðèîïëàíêòîíà âàæíà íå òîëüêî äëÿ ôèëîãåíèè, íî è
äëÿ ýêîëîãèè. Ïî îáðàçíîìó âûðàæåíèþ
Â. È. Âåðíàäñêîãî [26], êàæäûé áèîëîãè÷åñêèé âèä â ïðèðîäå âûïîëíÿåò óíèêàëüíóþ,
òîëüêî åìó ïðèñóùóþ “ãåîõèìè÷åñêóþ ðàáîòó”, ò. å. ïîòðåáëÿåò îïðåäåëåííûå âèäû
'
âåùåñòâà è ýíåðãèè è ñèíòåçèðóåò èç íèõ
äðóãèå ñïåöèôè÷åñêèå âåùåñòâà, âêëþ÷àÿ
ñîáñòâåííóþ áèîìàññó. Çíàíèÿ î êîíêðåòíûõ
âèäàõ è ïîòðåáëÿåìûõ èìè ñóáñòðàòàõ â íàñòîÿùåå âðåìÿ ìîãóò áûòü ôîðìàëèçîâàíû
â ìàòåìàòè÷åñêèõ ìîäåëÿõ âîäíûõ ýêîñèñòåì, ïðåäíàçíà÷åííûõ äëÿ ïðîãíîçà è óïðàâëåíèÿ êà÷åñòâîì ïðèðîäíûõ âîä [2, 27]. Òî÷íîñòü ïðîãíîçà è óñïåøíîñòü óïðàâëåíèÿ, íåñîìíåííî, ïîâûñÿòñÿ â ñëó÷àå çàìåíû â ìîäåëÿõ àãðåãèðîâàííîãî áàêòåðèîïëàíêòîíà è
àãðåãèðîâàííîãî “îðãàíè÷åñêîãî âåùåñòâà”
íà êîíêðåòíûå âèäû áàêòåðèé è êîíêðåòíûå
âèäû óòèëèçèðóåìûõ èìè âåùåñòâ [28].
Ðàáîòà âûïîëíåíà ïðè ôèíàíñîâîé ïîääåðæêå ÐÔÔÈ, ãðàíò ¹ 09-04-01748.
ËÈÒÅÐÀÒÓÐÀ
1. Àäàìîâè÷ Â. Â. Ýêñïåðèìåíòàëüíîå îïðåäåëåíèå
ïàðàìåòðîâ ôóíêöèîíèðîâàíèÿ ìèêðîôëîðû Êðàñíîÿðñêîãî âîäîõðàíèëèùà // Âîäíûå ðåñóðñû. 1992.
¹ 2. Ñ. 106–114.
2. Ãëàäûøåâ Ì. È. Îñíîâû ýêîëîãè÷åñêîé áèîôèçèêè
âîäíûõ ñèñòåì. Íîâîñèáèðñê: Íàóêà. Ñèá. îòä-íèå,
1999. 113 ñ.
3. Ãîðëåíêî Â. Ì., Äóáèíèíà Ã. À., Êóçíåöîâ Ñ. È. Ýêîëîãèÿ âîäíûõ ìèêðîîðãàíèçìîâ. Ì.: Íàóêà, 1977.
288 ñ.
4. Cole J. J. Interactions between bacteria and algae in
aquatic ecosystems // Ann. Rev. Ecol. Syst. 1982.
Vol. 13. P. 291–314.
5. Amann R., Ludwig W., Schleifer K. H. Phylogenetic
identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation // Microbiol. Rev. 1995.
Vol. 59, N 1. P. 143–169.
6. Weiss M., Simon M. Consumption of labile dissolved
organic matter by limnetic bacterioplankton: the
relative significance of amino acids and carbohydrates // Aquatic Microbial Ecology. 1999. Vol. 17. P. 1–
12.
7. Grover J. P., Chrzanowski T. H. Season al patterns of
substrate utilization by bacterioplankton: case studies
in four temperate lakes of different latitudes // Ibid.
2000. Vol. 23. P. 41–54.
8. Rosenstock B., Simon M. Sources and sinks of dissolved free amino acids and protein in a large and
deep mesotrophic lake // Limnol. Oceanogr. 2001.
Vol. 46(3). P. 644–654.
9. Pérez M. T., Pausz C., Herndl G. J. Major shift in
bacterioplankton utilization of en antiomeric amino
acids between surface waters and the ocean’s interior //
Ibid. 2003. Vol. 48(2). P. 755–763.
10. Zubkov M. V., Tarran G. A., Mary I., Fuchs B. M.
Differential microbial uptake of dissolved amino acids
and amino sugars in surface waters of the Atlantic
Ocean // J. îf Plankton Research. 2008. Vol. 30, N 2.
P. 211–220.
11. Kalachova G. S., Kolmakova A. A., Gladyshev M. I.,
Kravchuk E. S., Ivanova E. A. Season al dyn amics of
amino acids in two small Siberian reservoirs domin ated
by prokaryotic and eukaryotic phytoplankton //
Aquat. Ecol. 2004. Vol. 38. P. 3–15.
12. Gladyshev M. I., Sushchik N. N., Kolmakova, A. A.,
Kalachova G. S., Kravchuk E. S., Ivanova E. A., Makhutova O. N. Season al correlations of elemental and
3 PUFA composition of seston and domin ant phytoplankton species in a eutrophic Siberian Reservoir
// Ibid. 2007. Vol. 41. P. 9–23.
13. Gladyshev M. I., Sushchik N., Kalachova G. S., Shchur
L. A. The effect of algal blooms on the disappearance
of phenol in a small forest pond // Water Research.
1998. Vol. 32, N 9. P. 2769–2775.
14. Ñóùèê Í. Í., Ãëàäûøåâ Ì. È., Êàëà÷åâà Ã. Ñ., Ïëàêñèíà È. Â. Äèíàìèêà áèîìàññû ìèêðîâîäîðîñëåé è
ñîñòàâà âíåêëåòî÷íûõ ñâîáîäíûõ æèðíûõ êèñëîò â
ýêñïåðèìåíòàëüíûõ ìèêðîýêîñèñòåìàõ // Èçâ. ÐÀÍ.
Ñåð. áèîë. íàóê. 1998. ¹ 6. Ñ. 738–744.
15. Ãëàäûøåâ Ì. È. Ýêñïåðèìåíòàëüíûå ýêîñèñòåìû è
èõ ïðèìåíåíèå äëÿ èçó÷åíèÿ áèîäåãðàäàöèè ëåãêîîêèñëÿåìûõ òîêñèêàíòîâ â ïåëàãèàëè (îáçîð) //
Ãèäðîáèîë. æóðí. 1992. Ò. 28, ¹ 5. Ñ. 68–77.
16. Bostrom K. H., Simu K., Hagstrom A., Riemann L.
Optimization of DNA extraction for quantitative marine bacterioplankton community an alysis // Limnol.
Oceanogr.: Methods. 2004. Vol. 2. P. 365–373.
17. Schauer M., Massanà R., Pedros-Alio C. Spatial
differences in bacterioplankton composition along the
Catalan coast (NW Mediterranean) assessed by molecular fingerprinting // FEMS Microbiol. Ecol. 2000.
Vol. 33. P. 51–59.
18. Ïðèãîòîâëåíèå Ò-âåêòîðà [Ýëåêòðîííûé ðåñóðñ] //
Äàòà ïîñëåäíåé ìîäèôèêàöèè: 14/01/06. Ðåæèì äîñòóïà: http://molbiol.ru/protocol/12_05 (äàòà îáðàùåíèÿ 28.06.2010).
19. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. Molecular Cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Vol. 2.
20. Òðóñîâà Ì. Þ., Ãëàäûøåâ Ì. È. Ýêñïåðèìåíòàëüíîå
îïðåäåëåíèå îðãàíè÷åñêèõ ñóáñòðàòîâ, óòèëèçèðóåìûõ íåêóëüòèâèðóåìûì áàêòåðèîïëàíêòîíîì ýâòðîôíîãî âîäîõðàíèëèùà // Äîêë. ÀÍ. 2006. Ò. 409,
¹ 1. Ñ. 136–138.
21. Trusova M. Yu., Gladyshev M. I. Phylogenetic diversity
of winter bacterioplankton of eutrophic Siberian reservoirs as revealed by 16S rRNA gene sequences //
Microb. Ecol. 2002. Vol. 44. P. 252–259.
22. Glöckner F. O., Zaichikov E., Belkova N., Denissova L.,
Pernthaler J., Pernthaler A., Amann R. Comparative
16S rRNA an alysis of lake bacterioplankton reveals
globally distributed phylogenetic clusters including an
abundant group of actinobacteria //Appl. Environ.
Microbiol. 2000. Vol. 66, N 11. P. 5053–5065.
23. Pommier T., Canbäck B., Riemann L., Boström K. H.,
Simu K., Lundberg P., Tunlid A., Hagström A. Global
patterns of diversity and community structure in
marine bacterioplankton // Mol. Ecol. 2007. Vol. 16,
N 4. P. 867–880.
24. Muyzer G., de Waal E. C., Uitterlinden A. G. Profiling
of complex microbial populations by den aturing gradient gel electrophoresis an alysis of polymerase chain
reaction-amplified genes coding for 16S rRNA //
Appl. Environ. Microbiol. 1993. Vol. 59, N 3. P. 695–
700.
25. Giovannoni S. J., Stingl U. Molecular diversity and
ecology of microbial plankton // Nature. 2005. Vol. 437.
P. 343–348.
26. Âåðíàäñêèé Â. È. Æèâîå âåùåñòâî. Ì.: Íàóêà, 1978.
358 ñ.
27. Äåãåðìåíäæè À. Ã., Ãëàäûøåâ Ì. È. Ïðèðîäíûå
âîäû, ìàòåìàòè÷åñêèå ìîäåëè // Âåñòí. ÐÀÍ. 1995.
Ò. 65, ¹ 9. Ñ. 807–810.
28. Degermendzhi A. G. // Aquatic Ecology. 2010 (in press).
Consumption of Amino Acids by Non-Cultivated Bacterioplankton
of an Eutrophic Water Reservoir
O. V. KOLMAKOVA, M. Yu. TRUSOVA*
Siberian Federal University
660041, Krasnoyarsk, Svobodny ave., 79
*Institute of Biophysics of Siberian Branch RAS
660036, Krasnoyarsk, Akademgorodok
E-mail: mtrusova@ibp.krasn.ru
Species (clones) of the water-reservoir bacterioplankton living on lysine and glycine were revealed in
the experimental microsystems using unsterile cultivation. The structure of the community was anàlyzed
using the separation of amplificated fragments of the 16S ðRNA gene of the bacteria under the conditions
of denàturating gradient gel electrophoresis. Identification of the domin ant species (clones) of bacterioplankton was carried out using molecular cloning and determin ation of the nucleotide sequence of the
region of 16S gene of ribosomal RNA. It was discovered that glycine, one of the prevailing amino acids
of an eutrophic water reservoir, and lysine, with its lower content in n atural water, served as nutrition
substrates for different subdomin ant species (clones) of bacterioplankton. So, it was established that the
species of free-living bacterioplankton are n arrow-specialized with respect to the consumption of separate
amino acids.
Key words: free-living non-cultivated bacterioplankton, amino acids, PCR-DGGE, microecosystems,
16S ribosomal RNA.
Скачать