ÌÎÄÓËßÖÈß ÄÅÉÑÒÂÈß ÌÈÒÎÕÎÍÄÐÈÀËÜÍÎÉ ÍÓÊËÅÀÇÛ L Ä.Å. Ñîáîëåâ , Á.Ô. Âàíþøèí
реклама
24 ÂÅÑÒÍ. ÌÎÑÊ. ÓÍ-ÒÀ. ÑÅÐ. 16. ÁÈÎËÎÃÈß. 2012. ¹ 4 ÓÄÊ 577.151.4 ÌÎÄÓËßÖÈß ÄÅÉÑÒÂÈß ÌÈÒÎÕÎÍÄÐÈÀËÜÍÎÉ ÍÓÊËÅÀÇÛ ÊÐÎËÈÊÀ S-ÀÄÅÍÎÇÈË-L-ÌÅÒÈÎÍÈÍÎÌ Ä.Å. Ñîáîëåâ1, Á.Ô. Âàíþøèí2 (êàôåäðà áèîõèìèè; e-mail: morang@list.ru)  ýêñòðàêòå èç ìèòîõîíäðèé ïå÷åíè êðîëèêà îáíàðóæåíà ýíäîíóêëåàçíàÿ àêòèâíîñòü, êîòîðàÿ ïî ñâîéñòâàì ñõîäíà ñ æèâîòíîé ýíäîíóêëåàçîé G. Ýòà àêòèâíîñòü âûÿâëåíà â áåëêîâîé ôðàêöèè ñ ìîëåêóëÿðíîé ìàññîé îêîëî 30 êÄà, îíà ñòèìóëèðóåòñÿ èîíàìè Mg2+ è èíãèáèðóåòñÿ èîíàìè Zn2+.  îòëè÷èå îò ðàñòèòåëüíûõ ýíäîíóêëåàç WEN1 è WEN2 îíà íå ÷óâñòâèòåëüíà ê ñòàòóñó ìåòèëèðîâàíèÿ ñóáñòðàòíûõ ÄÍÊ è èíãèáèðóåòñÿ S-àäåíîçèëL-ìåòèîíèíîì. Êëþ÷åâûå ñëîâà: ìèòîõîíäðèè, ýíäîíóêëåàçà G, S-àäåíîçèë-L-ìåòèîíèí, ìåòèëèðîâàíèå. Ýíäîíóêëåàçà G, èçíà÷àëüíî îáíàðóæåííàÿ â ÿäðàõ íåçðåëûõ êóðèíûõ ýðèòðîöèòîâ, ïîëó÷èëà ñâîå íàçâàíèå çà ïðåäïî÷òèòåëüíîå ðàñùåïëåíèå ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé (dG)n · (dC)n ïðè n ³ 9 [1]. Ïîçæå áûëî ïîêàçàíî, ÷òî ôåðìåíò ëîêàëèçîâàí â ìåæìåìáðàííîì ïðîñòðàíñòâå ìèòîõîíäðèé [2, 3]. Ýíäîíóêëåàçà G êîäèðóåòñÿ â ÿäðå è ñîäåðæèò íà N-êîíöå ñèãíàëüíóþ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü, îáåñïå÷èâàþùóþ òðàíñïîðò ôåðìåíòà â ìèòîõîíäðèè [4]. Îíà íàéäåíà ó æèâîòíûõ è ãðèáîâ, åñòü òàêæå óêàçàíèÿ íà âîçìîæíîå åå íàëè÷èå ó ðàñòåíèé [5]. Ýíäîíóêëåàçà G ïðèíàäëåæèò ê ñåìåéñòâó bbaÌå-finger ÄÍÊ/ÐÍÊ-íåñïåöèôè÷íûõ íóêëåàç. Îíà ïðèñóòñòâóåò â êëåòêå â ôîðìå ãîìîäèìåðà ñ ìîëåêóëÿðíîé ìàññîé ñóáúåäèíèö îêîëî 29 êÄà [3, 6]. Àêòèâíîñòü ýíäîíóêëåàçû G çàâèñèìà îò èîíîâ Mg2+ è Mn2+ è èíãèáèðóåòñÿ ÝÄÒÀ, èîíàìè Zn2+ è Fe2+ è âûñîêîé èîííîé ñèëîé (ñâûøå 50—75 ìÌ KCl). Ôåðìåíò àêòèâåí â øèðîêîì äèàïàçîíå pH (îò 5 äî 9). Ýíäîíóêëåàçà G ðàñùåïëÿåò ÐÍÊ, îäíî- è äâóõöåïî÷å÷íûå ÄÍÊ ñ îáðàçîâàíèåì 3´-OH è 5´-ôîñôàòíîé ãðóïïû [1, 3, 7, 8]. Ïðåäïîëàãàåòñÿ, ÷òî ýíäîíóêëåàçà G ìîæåò ó÷àñòâîâàòü â ðåïëèêàöèè è ðåïàðàöèè ìòÄÍÊ [9—11]. Îíà ó÷àñòâóåò â äåãðàäàöèè ÿäåðíîé ÄÍÊ ïðè çàïðîãðàììèðîâàííîé ãèáåëè êëåòîê (ÇÃÊ). Âûñâîáîæäåíèå ýíäîíóêëåàçû G èç ìåæìåìáðàííîãî ïðîñòðàíñòâà ìèòîõîíäðèé (ñîâìåñòíî ñ öèòîõðîìîì c è äðóãèìè áåëêàìè) ïðîèñõîäèò ïðè âîçäåéñòâèè ïðîäóöèðîâàííîãî êàñïàçîé-8 áåëêà tBID [12]. Âûñâîáîæäåííàÿ ýíäîíóêëåàçà G îñóùåñòâëÿåò ìåæíóêëåîñîìíóþ ôðàãìåíòàöèþ ÿäåðíîé ÄÍÊ [13]. Ðîëü ýíäîíóêëåàçû G â ÇÃÊ ïîäòâåðæäàåòñÿ ôåíîòèïè÷åñêèìè 1 ÂÍÈÈ èçìåíåíèÿìè ó íîêàóòíûõ ïî åå ãåíó îðãàíèçìîâ, â òîì ÷èñëå íàðóøåíèÿìè ôðàãìåíòàöèè ÄÍÊ ïðè ÇÃÊ [14, 15]. Ðàíåå ìû âûäåëèëè è îõàðàêòåðèçîâàëè ýíäîíóêëåàçû WEN1 è WEN2 èç ñîäåðæàùèõ ìèòîõîíäðèè âåçèêóë, îáðàçóþùèõñÿ â ãèáíóùèõ êëåòêàõ êîëåîïòèëÿ ïøåíèöû Triticum aestivum L. [16, 17]. Ïðåäïîëîæèòåëüíî, îíè ìîãóò ïðèíèìàòü ó÷àñòèå â çàïðîãðàììèðîâàííîé ãèáåëè êëåòîê êîëåîïòèëÿ. Ìû ïîêàçàëè èõ ÷óâñòâèòåëüíîñòü ê ñòàòóñó ìåòèëèðîâàíèÿ ñóáñòðàòíîé ÄÍÊ è ðåãóëÿöèþ èõ àêòèâíîñòè S-àäåíîçèë-L-ìåòèîíèíîì è åãî àíàëîãàìè, ÷òî õàðàêòåðíî òàêæå äëÿ áàêòåðèàëüíûõ ýíäîíóêëåàç ðåñòðèêöèè [18]. Ïî íåêîòîðûì ñâîèì ñâîéñòâàì (ìîëåêóëÿðíàÿ ìàññà, çàâèñèìîñòü ôåðìåíòàòèâíîé àêòèâíîñòè îò èîíîâ äâóõâàëåíòíûõ ìåòàëëîâ, ïðåäïîëîæèòåëüíî ìèòîõîíäðèàëüíàÿ ëîêàëèçàöèÿ) ýíäîíóêëåàçà ïøåíèöû WEN1 ñõîäíà ñ ýíäîíóêëåàçîé G. Äî ñèõ ïîð íå áûëî óáåäèòåëüíî äîêàçàíî íàëè÷èå ýíäîíóêëåàçû G ó ðàñòåíèé, õîòÿ ñõîäíûé ïî ñâîéñòâàì ôåðìåíò áûë îáíàðóæåí â ìåæìåìáðàííîì ïðîñòðàíñòâå ìèòîõîíäðèé ðàñòåíèé Arabidopsis thaliana è ÷àñòè÷íî îõàðàêòåðèçîâàí [5]. Äî ñèõ ïîð î âîçìîæíîé ìîäóëÿöèè äåéñòâèÿ ýíäîíóêëåàç æèâîòíûõ S-àäåíîçèë-L-ìåòèîíèíîì ñâåäåíèÿ â ëèòåðàòóðå îòñóòñòâóþò.  íàñòîÿùåé ðàáîòå ìû èñëåäîâàëè âëèÿíèå S-àäåíîçèë-L-ìåòèîíèíà (SAM) è åãî ëèøåííîãî ìåòèëüíîé ãðóïïû àíàëîãà S-àäåíîçèë-L-ãîìîöèñòåèíà (SAH) íà ýíäîíóêëåîëèòè÷åñêóþ àêòèâíîñòü, âûäåëåííóþ èç ìèòîõîíäðèé ïå÷åíè êðîëèêà, à òàêæå èçó÷èëè çàâèñèìîñòü ýòîé àêòèâíîñòè îò ñòàòóñà ìåòèëèðîâàíèÿ ðàñùåïëÿåìîé ÄÍÊ. ñåëüñêîõîçÿéñòâåííîé áèîòåõíîëîãèè ÐÀÑÕÍ, 127550 Ìîñêâà, óë. Òèìèðÿçåâñêàÿ, 42. ôèçèêî-õèìè÷åñêîé áèîëîãèè èì. À.Í. Áåëîçåðñêîãî ÌÃÓ èì. Ì.Â. Ëîìîíîñîâà, 119991, Ìîñêâà. Ñîêðàùåíèÿ: ÁÑÀ — áû÷èé ñûâîðîòî÷íûé àëüáóìèí, ÄÒÒ — äèòèîòðåèòîë, ÇÃÊ — çàïðîãðàììèðîâàííàÿ ãèáåëü êëåòîê, TBE — Òris-áîðàòíûé áóôåð, ñîäåðæàùèé ÝÄÒÀ, ÔÌÑÔ — ôåíèëìåòèëñóëüôîíèëôòîðèä, SAH — S-àäåíîçèë-L-ãîìîöèñòåèí, SAM — S-àäåíîçèë-L-ìåòèîíèí. 2 ÍÈÈ ÂÅÑÒÍ. ÌÎÑÊ. ÓÍ-ÒÀ. ÑÅÐ. 16. ÁÈÎËÎÃÈß. 2012. ¹ 4 Ìàòåðèàëû è ìåòîäû Âûäåëåíèå ìèòîõîíäðèé è ýêñòðàêöèÿ áåëêà Âûäåëåíèå ìèòîõîíäðèé ïðîèçâîäèëè ïðè 4°Ñ. Òêàíü ñâåæåèçâëå÷åííîé ïå÷åíè êðîëèêà Oryctolagus cuniculus L. ïîìåùàëè â áóôåð äëÿ ãîìîãåíèçàöèè (25 ìÌ HEPES-NaOH pH 7,5, 150 ìÌ NaCl, 300 ìÌ ñàõàðîçà, 5 ìÌ ÝÄÒÀ · Na, 2,5 ìÌ ÄÒÒ, 1 ìÌ ÔÌÑÔ), 5 ìë áóôåðà/ã òêàíè. Òêàíü ãîìîãåíèçèðîâàëè â íîæåâîì ãîìîãåíèçàòîðå è çàòåì â ïîðøíåâîì ñòåêëÿííîì ãîìîãåíèçàòîðå. Ãîìîãåíàò äâàæäû ôèëüòðîâàëè ÷åðåç 4 ñëîÿ ìàðëè. Îòôèëüòðîâàííûé ãîìîãåíàò äâàæäû öåíòðèôóãèðîâàëè 10 ìèí ïðè 750 g äëÿ óäàëåíèÿ òÿæåëûõ îðãàíåëë è íåäîðàçðóøèâøèõñÿ êëåòîê è ïîëó÷åííûå îñàäêè îòáðàñûâàëè. Ñóïåðíàòàíò ôèëüòðîâàëè ÷åðåç 2 ñëîÿ ìàðëè. Ñóïåðíàòàíò öåíòðèôóãèðîâàëè 15 ìèí ïðè 17 500 g. Ïîëó÷åííûé ñóïåðíàòàíò îòáðàñûâàëè, ïðåäâàðèòåëüíî óäàëèâ ñ åãî ïîâåðõíîñòè îñòàòêè ëèïèäîâ. Âåðõíþþ êîðè÷íåâóþ ÷àñòü îñàäêà ðåñóñïåíäèðîâàëè â íåáîëüøîì îáúåìå áóôåðà äëÿ ãîìîãåíèçàöèè, ïåðåíîñèëè â ÷èñòûå öåíòðèôóæíûå ñòàêàíû è äâàæäû ïðîìûâàëè áóôåðîì äëÿ ãîìîãåíèçàöèè. Ïðîìûòûé îñàäîê ðåñóñïåíäèðîâàëè â áóôåðå õðàíåíèÿ (50 ìÌ HEPES-NaOH pH 7,5, 100 ìÌ NaCl, 5 ìÌ ÝÄÒÀ · Na, 2,5 ìÌ ÄÒÒ, 1 ìÌ ÔÌÑÔ, 15% ãëèöåðèí), 0,1 ìë áóôåðà/ã èñõîäíîé òêàíè ïå÷åíè. Äëÿ ýêñòðàêöèè áåëêîâ èç ïîëó÷åííîé ñóñïåíçèè ìèòîõîíäðèé ê íåé äîáàâëÿëè 1 îáúåì áóôåðà ëèçèñà (50 ìÌ HEPES-NaOH pH 7,5, 500 ìÌ NaCl, 5 ìÌ ÝÄÒÀ · Na, 2,5 ìÌ ÄÒÒ, 1 ìÌ ÔÌÑÔ, 1%-é Òðèòîí X-100). Ñìåñü ãîìîãåíèçèðîâàëè â ñòåêëÿííîì ïîðøíåâîì ãîìîãåíèçàòîðå è èíêóáèðîâàëè ïðè 4°Ñ â òå÷åíèå 20 ìèí ïðè ïîìåøèâàíèè. Ïîëó÷åííûé ëèçàò öåíòðèôóãèðîâàëè 120 ìèí ïðè 48 400g è îòáèðàëè ñóïåðíàòàíò — ñóììàðíûé ýêñòðàêò ìèòîõîíäðèé. Îïðåäåëåíèå ýíäîíóêëåàçíîé àêòèâíîñòè  êà÷åñòâå ñóáñòðàòà äëÿ îïðåäåëåíèÿ ýíäîíóêëåàçíîé àêòèâíîñòè èñïîëüçîâàëè dam, dcm-ìåòèëèðîâàííóþ (+) è íåìåòèëèðîâàííóþ (–) ÄÍÊ ôàãà l (Fermentas) èëè èõ ñìåñü â ïðîïîðöèè 1:1 (â îïûòàõ, ãäå ñòàòóñ ìåòèëèðîâàíèÿ ñóáñòðàòíîé ÄÍÊ íå óêàçàí). Ìåòèëèðîâàííàÿ ôàãîâàÿ ÄÍÊ ñîäåðæèò îñòàòêè 5-ìåòèëöèòîçèíà â ïîñëåäîâàòåëüíîñòÿõ Cm5CWGG è N6-ìåòèëàäåíèíà â ïîñëåäîâàòåëüíîñòÿõ Gm6ATC. Ðåàêöèîííàÿ ñìåñü îáúåìîì 10 ìêë ñîäåðæàëà 0,6 ìêã ÄÍÊ, 10 ìÌ HEPES-NaOH pH 7,5, 0,5 ìêë ìèòîõîíäðèàëüíîãî ýêñòðàêòà (êîíòðîëü), à òàêæå, ãäå ýòî óêàçàíî, S-àäåíîçèë-L-ìåòèîíèíõëîðèä, S-àäåíîçèëL-ãîìîöèñòåèí, MgCl2 è ZnSO4 (îïûò). Ñìåñè èíêóáèðîâàëè ïðè 37°Ñ â òå÷åíèå 2 ÷, äîáàâëÿëè 2 ìêë 6½ áóôåðà äëÿ íàíåñåíèÿ íà ãåëü (10 ìÌ Òðèñ-HCl pH 7,6, 0,03% áðîìôåíîëîâûé ñèíèé, 0,03% êñèëåíöèàíîë, 60% ãëèöåðèí, 60 ìÌ ÝÄÒÀ) (Fermentas) è íàíîñèëè íà 0,75%-é àãàðîçíûé ãåëü â òðèñ-áîðàò- 25 íîì áóôåðå pH 8,3, ñîäåðæàùåì 0,0005%-é áðîìèñòûé ýòèäèé. Ýëåêòðîôîðåç ïðîâîäèëè ïðè íàïðÿæåíèè 7,5 Â/ñì äî ïðîáåãà áðîìôåíîëîâîãî ñèíåãî 7 ñì â ãåëå è ïðîäóêòû ãèäðîëèçà ÄÍÊ âèçóàëèçèðîâàëè â ÓÔ-ñâåòå. Ýëåêòðîôîðåç áåëêîâ â ïîëèàêðèëàìèäíîì ãåëå. Ðàçäåëåíèå áåëêîâ ïðîèçâîäèëè ïî ìåòîäèêå Laemmli (Laemmli 70) â 4%-ì êîíöåíòðèðóþùåì è 12%-ì ðàçäåëÿþùåì ãåëÿõ. Ãåëè îêðàøèâàëè íèòðàòîì ñåðåáðà ïî ìåòîäèêå [20]. Îïðåäåëåíèå ýíäîíóêëåàçíîé àêòèâíîñòè â ãåëå.  ðàçäåëÿþùèé ïîëèàêðèëàìèäíûé ãåëü äëÿ âåðòèêàëüíîãî ýëåêòðîôîðåçà áåëêîâ ïðè åãî ïðèãîòîâëåíèè äîáàâëÿëè ÄÍÊ èç òèìóñà òåëåíêà äî êîíå÷íîé êîíöåíòðàöèè 40 ìêã/ìë. Ïîñëå ýëåêòðîôîðåçà ãåëü äëÿ óäàëåíèÿ SDS îäíîêðàòíî ïðîìûâàëè â 0,5%-ì ðàñòâîðå Òðèòîí X-100 â òå÷åíèå 20 ìèí è ÷åòûðåõêðàòíî â äèñòèëëèðîâàííîé âîäå â òå÷åíèå 20 ìèí. Çàòåì ãåëü ïåðåíîñèëè â áóôåð, ñîäåðæàùèé 25 ìÌ Òðèñ-HCl pH 7,5, 10 ìÌ MgCl2, 10 ìÌ CaCl2, è èíêóáèðîâàëè â òå÷åíèå íî÷è â çàêðûòîé ÷àøêå Ïåòðè ïðè 37°Ñ. Çàòåì â áóôåð ñ ãåëåì äîáàâëÿëè áðîìèñòûé ýòèäèé äî êîíöåíòðàöèè 0,0025% è ïîñëå 15 ìèí èíêóáàöèè çîíû ãèäðîëèçà ÄÍÊ â âèçóàëèçèðîâàëè â ÓÔ-ñâåòå. Îïðåäåëåíèå êîíöåíòðàöèè áåëêà ïðîèçâîäèëè ïî ìèêðîâàðèàíòó ìåòîäà Bradford [21] ñ èñïîëüçîâàíèåì ÁÑÀ â êà÷åñòâå ñòàíäàðòà. Ðåçóëüòàòû è èõ îáñóæäåíèå Ìèòîõîíäðèè ïå÷åíè êðîëèêà áûëè âûäåëåíû ïðè ïîìîùè äèôôåðåíöèàëüíîãî öåíòðèôóãèðîâàíèÿ íà îñíîâå îïèñàííûõ â ëèòåðàòóðå ìåòîäèê [22, 23].  ýêñòðàêòå èç íèõ áûëà îáíàðóæåíà íóêëåàçíàÿ àêòèâíîñòü ñ êàæóùåéñÿ ìîëåêóëÿðíîé ìàññîé îêîëî 30 êÄà (ðèñ. 1), ÷òî ñîîòâåòñòâóåò ìàññå ìîíîìåðà ýíäîíóêëåàçû G [3]. Ýíäîíóêëåàçíàÿ àêòèâíîñòü, ïðèñóòñòâóþùàÿ â ìèòîõîíäðèàëüíîì ýêñòðàêòå, ñòèìóëèðóåòñÿ èîíàìè Mg2+ è èíãèáèðóåòñÿ èîíàìè Zn2+ (ðèñ. 1), ÷òî òîæå õàðàêòåðíî äëÿ ýíäîíóêëåàçû G [7]. Èññëåäîâàíà çàâèñèìîñòü äåéñòâèÿ ýíäîíóêëåàçíîé àêòèâíîñòè ìèòîõîíäðèàëüíîãî ýêñòðàêòà íà ñóáñòðàòíûå ÄÍÊ îò ñòàòóñà èõ ìåòèëèðîâàíèÿ è îò S-àäåíîçèë-L-ìåòèîíèíà è S-àäåíîçèë-L-ãîìîöèñòåèíà.  êà÷åñòâå ñóáñòðàòà èñïîëüçîâàíû íåìåòèëèðîâàííàÿ (dam–, dcm–) è ìåòèëèðîâàííàÿ ïî ñàéòàì Gm6ATC è Cm5CWGG (dam+, dcm+) ÄÍÊ ôàãà l. Ýòè ÄÍÊ èäåíòè÷íû ïî äëèíå, íóêëåîòèäíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè è êîíöåíòðàöèè â ðåàêöèîííîé ñìåñè. Íàéäåííàÿ ýíäîíóêëåàçà ðàñùåïëÿåò îáà ýòè ñóáñòðàòà ïðèìåðíî îäèíàêîâî (ðèñ. 2), ÷òî îòëè÷àåò åå îò ýíäîíóêëåàç ïøåíèöû WEN1 è WEN2, ïðåäïî÷òèòåëüíî ðàñùåïëÿþùèõ ñîîòâåòñòâåííî ìåòèëèðîâàííóþ è íåìåòèëèðîâàííóþ ÄÍÊ [16, 17]. S-àäåíîçèë-L-ìåòèîíèí çàìåòíî ïîäàâëÿåò ðàñùåïëåíèå ñóáñòðàòíûõ ÄÍÊ â ïðèñóòñòâèè èîíîâ Mg2+. S-àäåíîçèë-L-ãîìîöèñòåèí, êîòîðûé ïî ñðàâíåíèþ ñ SAM íå èìååò ìåòèëüíîé ãðóïïû, íå âëèÿåò 26 ÂÅÑÒÍ. ÌÎÑÊ. ÓÍ-ÒÀ. ÑÅÐ. 16. ÁÈÎËÎÃÈß. 2012. ¹ 4 Ðèñ. 1. À — ýíäîíóêëåàçíàÿ àêòèâíîñòü ñóììàðíîãî áåëêîâîãî ýêñòðàêòà ìèòîõîíäðèé â 12% ÏÀÀà ñ âïëàâëåííîé â ãåëü òèìóñíîé ÄÍÊ; Á — çàâèñèìîñòü ýíäîíóêëåàçíîé àêòèâíîñòè ñóììàðíîãî áåëêîâîãî ýêñòðàêòà ìèòîõîíäðèé (800 íã áåëêà) îò èîíîâ Mg2+ è Zn2+ (5 ìÌ). K — êîíòðîëü, E — èîíû ìåòàëëîâ íå äîáàâëÿëèñü íà ýíäîíóêëåàçíóþ àêòèâíîñòü (ðèñ. 2). Ýòî îòëè÷àåò èçó÷åííóþ æèâîòíóþ ìèòîõîíäðèàëüíóþ ýíäîíóêëåàçíóþ àêòèâíîñòü îò ïøåíè÷íîé ýíäîíóêëåàçû WEN1, êîòîðàÿ, íàïðîòèâ, àêòèâèðóåòñÿ SAM, SAH è SiBA [16]. Òàêèì îáðàçîì, ýíäîíóêëåàçíàÿ àêòèâíîñòü èç ýêñòðàêòà ìèòîõîíäðèé êðîëèêà, ñîîòâåòñòâóþùàÿ ïî ñâîéñòâàì ýíäîíóêëåàçå G, íå ðàçëè÷àåò ñóáñòðàòíûå ÄÍÊ ïî ñòàòóñó èõ ìåòèëèðîâàíèÿ. ×óâñòâèòåëüíîñòü ê ñòàòóñó ìåòèëèðîâàíèÿ ñóáñòðàòíîé ÄÍÊ èçâåñòíà äëÿ îõàðàêòåðèçîâàííûõ íàìè ýíäîíóêëåàç ïðîðîñòêîâ ïøåíèöû WEN1 è WEN2 [16, 17] Ðèñ. 2. Çàâèñèìîñòü ýíäîíóêëåàçíîé àêòèâíîñòè ñóììàðíîãî áåëêîâîãî ýêñòðàêòà ìèòîõîíäðèé (800 íã áåëêà) îò SAM è SAH (2 ìÌ) è ñòàòóñà ìåòèëèðîâàíèÿ ñóáñòðàòíîé ÄÍÊ (–, dam, dcm-íåìåòèëèðîâàííàÿ ÄÍÊ; +, dam, dcm-ìåòèëèðîâàííàÿ ÄÍÊ) â ïðèñóòñòâèè Mg2+ (5 ìÌ). Ê — êîíòðîëü è íåêîòîðûõ áàêòåðèàëüíûõ ýíäîíóêëåàç ðåñòðèêöèè (â òîì ÷èñëå ïðèíàäëåæàùèõ, êàê è ýíäîíóêëåàçà G, ê bba-Ìå-finger-ñåìåéñòâó) [24, 25]. Ðåàêöèÿ ìèòîõîíäðèàëüíîãî ôåðìåíòà æèâîòíûõ íà SAM (èíãèáèðîâàíèå àêòèâíîñòè) ïðîòèâîïîëîæíà õàðàêòåðíîé äëÿ SAM-çàâèñèìûõ ýíäîíóêëåàç ðåñòðèêöèè è WEN1 àêòèâàöèè ïîä äåéñòâèåì SAM. Ïîýòîìó, â îòëè÷èå îò èçâåñòíûõ ðàñòèòåëüíûõ è áàêòåðèàëüíûõ ýíäîíóêëåàç, SAM íå ÿâëÿåòñÿ ïîçèòèâíûì àëëîñòåðè÷åñêèì ýôôåêòîðîì äëÿ æèâîòíîé ìèòîõîíäðèàëüíîé ýíäîíóêëåàçû. ÑÏÈÑÎÊ ËÈÒÅÐÀÒÓÐÛ 1. Ruiz-Carrillo A., Renaud J. Endonuclease G: a (dG)n · (dC)n-specific DNase from higher eukaryotes // EMBO Journal. 1987. Vol. 6. N 2. P. 401—407. 2. Ohsato T., Ishihara N., Muta T., Umeda S., Ikeda S., Mihara K., Hamasaki N., Kang D. Mammalian mitochondrial endonuclease G. Digestion of R-loops and localization in intermembrane space // Eur. J. Biochem. 2002. N 269. P. 5765—5770. 3. Davies A.M., Hershman S., Stabley G.J., Hoek J.B., Peterson J., Cahill A. A Ca2+-induced mitochondrial permeability transition causes complete release of rat liver endonuclease G activity from its exclusive location within the mitochondrial intermembrane space. Identification of a novel endo-exonuclease activity residing within the mitochondrial matrix // Nucleic Acids Res. 2003. Vol. 31. N 4. P. 1364—1373. ÂÅÑÒÍ. ÌÎÑÊ. ÓÍ-ÒÀ. ÑÅÐ. 16. ÁÈÎËÎÃÈß. 2012. ¹ 4 4. Oda K., Kawasaki N., Fukuyama M., Ikeda S. Ectopic expression of mitochondria endonuclease Pnu1p from Schizosaccharomyces Pombe induces cell death of the yeast // J. Biochem. and Mol. Biol. 2007. Vol. 40. N 6. P. 1095—1099. 5. Balk J., Chew S.K., Leaver C.J., McCabe P.F. The intermembrane space of plant mitochondria contains a DNase activity that may be involved in programmed cell death // Plant J. 2003. N 34. P. 573—583. 6. Loll B., Gebhardt M., Wahle E., Meinhart A. Crystal structure of the EndoG/EndoGI complex: mechanism of EndoG inhibition // Nucleic Acids Res. 2009. Vol. 37. N 21. P. 7312—7320. 7. Widlak P., Li L.Y., Wang X., Garrard W.T. Action of recombinant human apoptotic endonuclease G on naked DNA and chromatin substrates: cooperation with exonuclease and DNase I // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276. N 51. P. 48404—48409. 8. Widlak P., Garrard W.T. Discovery, regulation, and action of the major apoptotic nucleases DFF40/CAD and endonuclease G // J. Cell. Biochem. 2005. N 94. P. 1078—1087. 9. Côté J., Ruiz-Carrillo A. Primers for mitochondrial DNA replication generated by endonuclease G // Science. 1993. Vol. 261. N 5122. P. 765—769. 10. Zassenhaus H.P., Denniger G. Analysis of the role of the NUC1 endo/exonuclease in yeast mitochondrial DNA recombination // Current Genetics. 1994. Vol. 25. N 2. P. 142—149. 11. Ikeda S., Ozaki K. Action of mitochondrial endonuclease G on DNA damaged by L-ascorbic acid, peplomycin, and cis-diamminedichloroplatinum (II) // Biochem. and Biophys. Res. Comm. 1997. Vol. 235. N 2. P. 291—294. 12. van Loo G., Schotte P., van Gurp M., Demol H., Hoorelbeke B., Gevaert K., Rodriguez I., Ruiz-Carrillo A., Vandekerckhove J., Declercq W., Beyaert R., Vandenabeele P. Endonuclease G: a mitochondrial protein released in apoptosis and involved in caspase-independent DNA degradation // Cell Death and Differentiation. 2001. Vol. 8. N 12. P. 1136—1142. 13. Li L.Y., Luo X., Wang X. Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria // Nature. 2001. Vol. 412. N 6842. P. 95—99. 27 14. Parrish J., Li L., Klotz K., Ledwich D., Wang X., Xue D. Mitochondrial endonuclease G is important for apoptosis in C. elegans // Nature. 2001. Vol. 412. N 6842. P. 90—94. 15. Büttner S., Eisenberg T., Carmona-Gutierrez D., Ruli D., Knauer H., Ruckenstuhl C., Sigrist C., Wissing S., Kollroser M., Fröhlich K.U., Sigrist S., Madeo F. Endonuclease G regulates budding yeast life and death // Mol. Cell. 2007. Vol. 25. N 2. P. 233—246. 16. Fedoreyeva L.I., Sobolev D.E., Vanyushin B.F. Wheat endonuclease WEN1 dependent on S-adenosyl-L-methionine and sensitive to DNA methylation status // Epigenetics. 2007. Vol. 2. N 1. P. 50—53. 17. Ôåäîðååâà Ë.È., Ñîáîëåâ Ä.Å., Âàíþøèí Á.Ô. S-Àäåíîçèë-L-ìåòèîíèíçàâèñèìàÿ è ÷óâñòâèòåëüíàÿ ê ñòàòóñó ìåòèëèðîâàíèÿ ÄÍÊ ýíäîíóêëåàçà WEN2 èç êîëåîïòèëåé ïøåíèöû // Áèîõèìèÿ. 2008. Ò. 73. ¹ 9. Ñ. 1243—1251. 18. Sistla S., Rao D.N. S-Adenosyl-L-methionine-dependent restriction enzymes // Critical reviews in biochemistry and molecular biology. 2004. Vol. 39. N 1. P. 1—19. 19. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 227. N 5259. P. 680—685. 20. Merril C.R., Goldman D., Sedman S.A., Ebert M.H. Ultrasensitive stain for proteins in polyacrylamide gels shows regional variation in cerebrospinal fluid proteins // Science. 1981. Vol. 211. N 4489. P. 1437—1438. 21. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. Vol. 72. P. 248—254. 22. Cummings O.W., King T.C., Holden J.A., Low R.L. Purification and characterization of the potent endonuclease in extracts of bovine heart mitochondria // J. Biol. Chem. 1987. Vol. 262. N 5. P. 2005—2015. 23. Low R.L., Gerschenson M. Endonuclease G isolation and assays // Methods in Molecular Biology. 2002. Vol. 197. P. 331—349. 24. Yang W. Nucleases: diversity of structure, function and mechanism // Quarterly Rev. of Biophys. 2011. Vol. 44. N 1. P. 1—93. 25. Sir Richard J. Roberts. REBASE — The Restriction Enzyme Database. (URL: http://rebase.neb.com 01.12.2011). Ïîñòóïèëà â ðåäàêöèþ 15.05.12 MODULATION OF THE RABBIT MITOCHONDRIAL ENDONUCLEASE ACTION BY S-ADENOSYL-L-METHIONINE D.E. Sobolev, B.F. Vanyushin Endonuclease activity found in rabbit liver mitochondrial extract is similar to known endonuclease G: it has an apparent molecular mass value of about 30 kDa, it depends on Mg2+ and is inhibited with Zn2+. Unlike WEN1 and WEN2 plant endonucleases it is unsensitive to DNA methylation status and inhibited with S-adenosyl-L-methionine. Key words: mitochondria, endonuclease G, S-adenosyl-L-methionine, methylation. Ñâåäåíèÿ îá àâòîðàõ Ñîáîëåâ Äìèòðèé Åâãåíüåâè÷ — ñïåöèàëèñò, íàó÷. ñîòð. ÃÍÓ ÂÍÈÈÑÁ Ðîññåëüõîçàêàäåìèè. Òåë.: 8-495-939-54-12, +7-903-204-48-27; e-mail: morang@list.ru Âàíþøèí Áîðèñ Ôåäîðîâè÷ — äîêò. áèîë. íàóê, ïðîô., ÷ë.-êîðð. ÐÀÍ, çàâ. îòäåëîì ìîëåêóëÿðíûõ îñíîâ îíòîãåíåçà, Èíñòèòóò ôèçèêî-õèìè÷åñêîé áèîëîãèè èì. À.Í. Áåëîçåðñêîãî ÌÃÓ. Òåë.: 8-495-939 54-12, e-mail: vanyush@belozersky.msu.ru
