ÌÎÄÓËßÖÈß ÄÅÉÑÒÂÈß ÌÈÒÎÕÎÍÄÐÈÀËÜÍÎÉ ÍÓÊËÅÀÇÛ L Ä.Å. Ñîáîëåâ , Á.Ô. Âàíþøèí

24
ÂÅÑÒÍ. ÌÎÑÊ. ÓÍ-ÒÀ. ÑÅÐ. 16. ÁÈÎËÎÃÈß. 2012. ¹ 4
ÓÄÊ 577.151.4
ÌÎÄÓËßÖÈß ÄÅÉÑÒÂÈß ÌÈÒÎÕÎÍÄÐÈÀËÜÍÎÉ ÍÓÊËÅÀÇÛ
ÊÐÎËÈÊÀ S-ÀÄÅÍÎÇÈË-L-ÌÅÒÈÎÍÈÍÎÌ
Ä.Å. Ñîáîëåâ1, Á.Ô. Âàíþøèí2
(êàôåäðà áèîõèìèè; e-mail: morang@list.ru)
 ýêñòðàêòå èç ìèòîõîíäðèé ïå÷åíè êðîëèêà îáíàðóæåíà ýíäîíóêëåàçíàÿ àêòèâíîñòü,
êîòîðàÿ ïî ñâîéñòâàì ñõîäíà ñ æèâîòíîé ýíäîíóêëåàçîé G. Ýòà àêòèâíîñòü âûÿâëåíà â áåëêîâîé ôðàêöèè ñ ìîëåêóëÿðíîé ìàññîé îêîëî 30 êÄà, îíà ñòèìóëèðóåòñÿ èîíàìè Mg2+ è
èíãèáèðóåòñÿ èîíàìè Zn2+.  îòëè÷èå îò ðàñòèòåëüíûõ ýíäîíóêëåàç WEN1 è WEN2 îíà
íå ÷óâñòâèòåëüíà ê ñòàòóñó ìåòèëèðîâàíèÿ ñóáñòðàòíûõ ÄÍÊ è èíãèáèðóåòñÿ S-àäåíîçèëL-ìåòèîíèíîì.
Êëþ÷åâûå ñëîâà: ìèòîõîíäðèè, ýíäîíóêëåàçà G, S-àäåíîçèë-L-ìåòèîíèí, ìåòèëèðîâàíèå.
Ýíäîíóêëåàçà G, èçíà÷àëüíî îáíàðóæåííàÿ â ÿäðàõ íåçðåëûõ êóðèíûõ ýðèòðîöèòîâ, ïîëó÷èëà ñâîå
íàçâàíèå çà ïðåäïî÷òèòåëüíîå ðàñùåïëåíèå ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé (dG)n · (dC)n ïðè n ³ 9 [1]. Ïîçæå
áûëî ïîêàçàíî, ÷òî ôåðìåíò ëîêàëèçîâàí â ìåæìåìáðàííîì ïðîñòðàíñòâå ìèòîõîíäðèé [2, 3]. Ýíäîíóêëåàçà G êîäèðóåòñÿ â ÿäðå è ñîäåðæèò íà N-êîíöå ñèãíàëüíóþ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü, îáåñïå÷èâàþùóþ
òðàíñïîðò ôåðìåíòà â ìèòîõîíäðèè [4]. Îíà íàéäåíà
ó æèâîòíûõ è ãðèáîâ, åñòü òàêæå óêàçàíèÿ íà âîçìîæíîå åå íàëè÷èå ó ðàñòåíèé [5].
Ýíäîíóêëåàçà G ïðèíàäëåæèò ê ñåìåéñòâó bbaÌå-finger ÄÍÊ/ÐÍÊ-íåñïåöèôè÷íûõ íóêëåàç. Îíà
ïðèñóòñòâóåò â êëåòêå â ôîðìå ãîìîäèìåðà ñ ìîëåêóëÿðíîé ìàññîé ñóáúåäèíèö îêîëî 29 êÄà [3, 6]. Àêòèâíîñòü ýíäîíóêëåàçû G çàâèñèìà îò èîíîâ Mg2+ è
Mn2+ è èíãèáèðóåòñÿ ÝÄÒÀ, èîíàìè Zn2+ è Fe2+ è
âûñîêîé èîííîé ñèëîé (ñâûøå 50—75 ìÌ KCl). Ôåðìåíò àêòèâåí â øèðîêîì äèàïàçîíå pH (îò 5 äî 9).
Ýíäîíóêëåàçà G ðàñùåïëÿåò ÐÍÊ, îäíî- è äâóõöåïî÷å÷íûå ÄÍÊ ñ îáðàçîâàíèåì 3´-OH è 5´-ôîñôàòíîé
ãðóïïû [1, 3, 7, 8].
Ïðåäïîëàãàåòñÿ, ÷òî ýíäîíóêëåàçà G ìîæåò ó÷àñòâîâàòü â ðåïëèêàöèè è ðåïàðàöèè ìòÄÍÊ [9—11].
Îíà ó÷àñòâóåò â äåãðàäàöèè ÿäåðíîé ÄÍÊ ïðè çàïðîãðàììèðîâàííîé ãèáåëè êëåòîê (ÇÃÊ). Âûñâîáîæäåíèå ýíäîíóêëåàçû G èç ìåæìåìáðàííîãî ïðîñòðàíñòâà ìèòîõîíäðèé (ñîâìåñòíî ñ öèòîõðîìîì c è
äðóãèìè áåëêàìè) ïðîèñõîäèò ïðè âîçäåéñòâèè ïðîäóöèðîâàííîãî êàñïàçîé-8 áåëêà tBID [12]. Âûñâîáîæäåííàÿ ýíäîíóêëåàçà G îñóùåñòâëÿåò ìåæíóêëåîñîìíóþ
ôðàãìåíòàöèþ ÿäåðíîé ÄÍÊ [13]. Ðîëü ýíäîíóêëåàçû G â ÇÃÊ ïîäòâåðæäàåòñÿ ôåíîòèïè÷åñêèìè
1 ÂÍÈÈ
èçìåíåíèÿìè ó íîêàóòíûõ ïî åå ãåíó îðãàíèçìîâ,
â òîì ÷èñëå íàðóøåíèÿìè ôðàãìåíòàöèè ÄÍÊ ïðè
ÇÃÊ [14, 15].
Ðàíåå ìû âûäåëèëè è îõàðàêòåðèçîâàëè ýíäîíóêëåàçû WEN1 è WEN2 èç ñîäåðæàùèõ ìèòîõîíäðèè âåçèêóë, îáðàçóþùèõñÿ â ãèáíóùèõ êëåòêàõ
êîëåîïòèëÿ ïøåíèöû Triticum aestivum L. [16, 17].
Ïðåäïîëîæèòåëüíî, îíè ìîãóò ïðèíèìàòü ó÷àñòèå
â çàïðîãðàììèðîâàííîé ãèáåëè êëåòîê êîëåîïòèëÿ.
Ìû ïîêàçàëè èõ ÷óâñòâèòåëüíîñòü ê ñòàòóñó ìåòèëèðîâàíèÿ ñóáñòðàòíîé ÄÍÊ è ðåãóëÿöèþ èõ àêòèâíîñòè S-àäåíîçèë-L-ìåòèîíèíîì è åãî àíàëîãàìè,
÷òî õàðàêòåðíî òàêæå äëÿ áàêòåðèàëüíûõ ýíäîíóêëåàç ðåñòðèêöèè [18]. Ïî íåêîòîðûì ñâîèì ñâîéñòâàì
(ìîëåêóëÿðíàÿ ìàññà, çàâèñèìîñòü ôåðìåíòàòèâíîé
àêòèâíîñòè îò èîíîâ äâóõâàëåíòíûõ ìåòàëëîâ, ïðåäïîëîæèòåëüíî ìèòîõîíäðèàëüíàÿ ëîêàëèçàöèÿ) ýíäîíóêëåàçà ïøåíèöû WEN1 ñõîäíà ñ ýíäîíóêëåàçîé G.
Äî ñèõ ïîð íå áûëî óáåäèòåëüíî äîêàçàíî íàëè÷èå
ýíäîíóêëåàçû G ó ðàñòåíèé, õîòÿ ñõîäíûé ïî ñâîéñòâàì ôåðìåíò áûë îáíàðóæåí â ìåæìåìáðàííîì ïðîñòðàíñòâå ìèòîõîíäðèé ðàñòåíèé Arabidopsis thaliana è
÷àñòè÷íî îõàðàêòåðèçîâàí [5].
Äî ñèõ ïîð î âîçìîæíîé ìîäóëÿöèè äåéñòâèÿ
ýíäîíóêëåàç æèâîòíûõ S-àäåíîçèë-L-ìåòèîíèíîì ñâåäåíèÿ â ëèòåðàòóðå îòñóòñòâóþò.
 íàñòîÿùåé ðàáîòå ìû èñëåäîâàëè âëèÿíèå S-àäåíîçèë-L-ìåòèîíèíà (SAM) è åãî ëèøåííîãî ìåòèëüíîé ãðóïïû àíàëîãà S-àäåíîçèë-L-ãîìîöèñòåèíà (SAH)
íà ýíäîíóêëåîëèòè÷åñêóþ àêòèâíîñòü, âûäåëåííóþ
èç ìèòîõîíäðèé ïå÷åíè êðîëèêà, à òàêæå èçó÷èëè
çàâèñèìîñòü ýòîé àêòèâíîñòè îò ñòàòóñà ìåòèëèðîâàíèÿ ðàñùåïëÿåìîé ÄÍÊ.
ñåëüñêîõîçÿéñòâåííîé áèîòåõíîëîãèè ÐÀÑÕÍ, 127550 Ìîñêâà, óë. Òèìèðÿçåâñêàÿ, 42.
ôèçèêî-õèìè÷åñêîé áèîëîãèè èì. À.Í. Áåëîçåðñêîãî ÌÃÓ èì. Ì.Â. Ëîìîíîñîâà, 119991, Ìîñêâà.
Ñîêðàùåíèÿ: ÁÑÀ — áû÷èé ñûâîðîòî÷íûé àëüáóìèí, ÄÒÒ — äèòèîòðåèòîë, ÇÃÊ — çàïðîãðàììèðîâàííàÿ ãèáåëü êëåòîê, TBE —
Òris-áîðàòíûé áóôåð, ñîäåðæàùèé ÝÄÒÀ, ÔÌÑÔ — ôåíèëìåòèëñóëüôîíèëôòîðèä, SAH — S-àäåíîçèë-L-ãîìîöèñòåèí, SAM — S-àäåíîçèë-L-ìåòèîíèí.
2 ÍÈÈ
ÂÅÑÒÍ. ÌÎÑÊ. ÓÍ-ÒÀ. ÑÅÐ. 16. ÁÈÎËÎÃÈß. 2012. ¹ 4
Ìàòåðèàëû è ìåòîäû
Âûäåëåíèå ìèòîõîíäðèé è ýêñòðàêöèÿ áåëêà
Âûäåëåíèå ìèòîõîíäðèé ïðîèçâîäèëè ïðè 4°Ñ.
Òêàíü ñâåæåèçâëå÷åííîé ïå÷åíè êðîëèêà Oryctolagus cuniculus L. ïîìåùàëè â áóôåð äëÿ ãîìîãåíèçàöèè (25 ìÌ HEPES-NaOH pH 7,5, 150 ìÌ NaCl,
300 ìÌ ñàõàðîçà, 5 ìÌ ÝÄÒÀ · Na, 2,5 ìÌ ÄÒÒ,
1 ìÌ ÔÌÑÔ), 5 ìë áóôåðà/ã òêàíè. Òêàíü ãîìîãåíèçèðîâàëè â íîæåâîì ãîìîãåíèçàòîðå è çàòåì â
ïîðøíåâîì ñòåêëÿííîì ãîìîãåíèçàòîðå. Ãîìîãåíàò
äâàæäû ôèëüòðîâàëè ÷åðåç 4 ñëîÿ ìàðëè.
Îòôèëüòðîâàííûé ãîìîãåíàò äâàæäû öåíòðèôóãèðîâàëè 10 ìèí ïðè 750 g äëÿ óäàëåíèÿ òÿæåëûõ
îðãàíåëë è íåäîðàçðóøèâøèõñÿ êëåòîê è ïîëó÷åííûå îñàäêè îòáðàñûâàëè. Ñóïåðíàòàíò ôèëüòðîâàëè
÷åðåç 2 ñëîÿ ìàðëè.
Ñóïåðíàòàíò öåíòðèôóãèðîâàëè 15 ìèí ïðè
17 500 g. Ïîëó÷åííûé ñóïåðíàòàíò îòáðàñûâàëè, ïðåäâàðèòåëüíî óäàëèâ ñ åãî ïîâåðõíîñòè îñòàòêè ëèïèäîâ. Âåðõíþþ êîðè÷íåâóþ ÷àñòü îñàäêà ðåñóñïåíäèðîâàëè â íåáîëüøîì îáúåìå áóôåðà äëÿ ãîìîãåíèçàöèè, ïåðåíîñèëè â ÷èñòûå öåíòðèôóæíûå ñòàêàíû
è äâàæäû ïðîìûâàëè áóôåðîì äëÿ ãîìîãåíèçàöèè.
Ïðîìûòûé îñàäîê ðåñóñïåíäèðîâàëè â áóôåðå õðàíåíèÿ (50 ìÌ HEPES-NaOH pH 7,5, 100 ìÌ NaCl,
5 ìÌ ÝÄÒÀ · Na, 2,5 ìÌ ÄÒÒ, 1 ìÌ ÔÌÑÔ, 15%
ãëèöåðèí), 0,1 ìë áóôåðà/ã èñõîäíîé òêàíè ïå÷åíè.
Äëÿ ýêñòðàêöèè áåëêîâ èç ïîëó÷åííîé ñóñïåíçèè ìèòîõîíäðèé ê íåé äîáàâëÿëè 1 îáúåì áóôåðà ëèçèñà (50 ìÌ HEPES-NaOH pH 7,5, 500 ìÌ
NaCl, 5 ìÌ ÝÄÒÀ · Na, 2,5 ìÌ ÄÒÒ, 1 ìÌ ÔÌÑÔ,
1%-é Òðèòîí X-100). Ñìåñü ãîìîãåíèçèðîâàëè â
ñòåêëÿííîì ïîðøíåâîì ãîìîãåíèçàòîðå è èíêóáèðîâàëè ïðè 4°Ñ â òå÷åíèå 20 ìèí ïðè ïîìåøèâàíèè.
Ïîëó÷åííûé ëèçàò öåíòðèôóãèðîâàëè 120 ìèí ïðè
48 400g è îòáèðàëè ñóïåðíàòàíò — ñóììàðíûé ýêñòðàêò ìèòîõîíäðèé.
Îïðåäåëåíèå ýíäîíóêëåàçíîé àêòèâíîñòè
 êà÷åñòâå ñóáñòðàòà äëÿ îïðåäåëåíèÿ ýíäîíóêëåàçíîé àêòèâíîñòè èñïîëüçîâàëè dam, dcm-ìåòèëèðîâàííóþ (+) è íåìåòèëèðîâàííóþ (–) ÄÍÊ ôàãà l
(Fermentas) èëè èõ ñìåñü â ïðîïîðöèè 1:1 (â îïûòàõ,
ãäå ñòàòóñ ìåòèëèðîâàíèÿ ñóáñòðàòíîé ÄÍÊ íå óêàçàí). Ìåòèëèðîâàííàÿ ôàãîâàÿ ÄÍÊ ñîäåðæèò îñòàòêè 5-ìåòèëöèòîçèíà â ïîñëåäîâàòåëüíîñòÿõ Cm5CWGG
è N6-ìåòèëàäåíèíà â ïîñëåäîâàòåëüíîñòÿõ Gm6ATC.
Ðåàêöèîííàÿ ñìåñü îáúåìîì 10 ìêë ñîäåðæàëà 0,6 ìêã
ÄÍÊ, 10 ìÌ HEPES-NaOH pH 7,5, 0,5 ìêë ìèòîõîíäðèàëüíîãî ýêñòðàêòà (êîíòðîëü), à òàêæå, ãäå ýòî
óêàçàíî, S-àäåíîçèë-L-ìåòèîíèíõëîðèä, S-àäåíîçèëL-ãîìîöèñòåèí, MgCl2 è ZnSO4 (îïûò). Ñìåñè èíêóáèðîâàëè ïðè 37°Ñ â òå÷åíèå 2 ÷, äîáàâëÿëè 2 ìêë
6½ áóôåðà äëÿ íàíåñåíèÿ íà ãåëü (10 ìÌ Òðèñ-HCl
pH 7,6, 0,03% áðîìôåíîëîâûé ñèíèé, 0,03% êñèëåíöèàíîë, 60% ãëèöåðèí, 60 ìÌ ÝÄÒÀ) (Fermentas)
è íàíîñèëè íà 0,75%-é àãàðîçíûé ãåëü â òðèñ-áîðàò-
25
íîì áóôåðå pH 8,3, ñîäåðæàùåì 0,0005%-é áðîìèñòûé ýòèäèé. Ýëåêòðîôîðåç ïðîâîäèëè ïðè íàïðÿæåíèè 7,5 Â/ñì äî ïðîáåãà áðîìôåíîëîâîãî ñèíåãî
7 ñì â ãåëå è ïðîäóêòû ãèäðîëèçà ÄÍÊ âèçóàëèçèðîâàëè â ÓÔ-ñâåòå.
Ýëåêòðîôîðåç áåëêîâ â ïîëèàêðèëàìèäíîì ãåëå.
Ðàçäåëåíèå áåëêîâ ïðîèçâîäèëè ïî ìåòîäèêå Laemmli
(Laemmli 70) â 4%-ì êîíöåíòðèðóþùåì è 12%-ì ðàçäåëÿþùåì ãåëÿõ. Ãåëè îêðàøèâàëè íèòðàòîì ñåðåáðà
ïî ìåòîäèêå [20].
Îïðåäåëåíèå ýíäîíóêëåàçíîé àêòèâíîñòè â ãåëå.
 ðàçäåëÿþùèé ïîëèàêðèëàìèäíûé ãåëü äëÿ âåðòèêàëüíîãî ýëåêòðîôîðåçà áåëêîâ ïðè åãî ïðèãîòîâëåíèè äîáàâëÿëè ÄÍÊ èç òèìóñà òåëåíêà äî êîíå÷íîé êîíöåíòðàöèè 40 ìêã/ìë. Ïîñëå ýëåêòðîôîðåçà ãåëü äëÿ óäàëåíèÿ SDS îäíîêðàòíî ïðîìûâàëè
â 0,5%-ì ðàñòâîðå Òðèòîí X-100 â òå÷åíèå 20 ìèí è
÷åòûðåõêðàòíî â äèñòèëëèðîâàííîé âîäå â òå÷åíèå
20 ìèí. Çàòåì ãåëü ïåðåíîñèëè â áóôåð, ñîäåðæàùèé 25 ìÌ Òðèñ-HCl pH 7,5, 10 ìÌ MgCl2, 10 ìÌ
CaCl2, è èíêóáèðîâàëè â òå÷åíèå íî÷è â çàêðûòîé
÷àøêå Ïåòðè ïðè 37°Ñ. Çàòåì â áóôåð ñ ãåëåì äîáàâëÿëè áðîìèñòûé ýòèäèé äî êîíöåíòðàöèè 0,0025%
è ïîñëå 15 ìèí èíêóáàöèè çîíû ãèäðîëèçà ÄÍÊ â âèçóàëèçèðîâàëè â ÓÔ-ñâåòå.
Îïðåäåëåíèå êîíöåíòðàöèè áåëêà ïðîèçâîäèëè
ïî ìèêðîâàðèàíòó ìåòîäà Bradford [21] ñ èñïîëüçîâàíèåì ÁÑÀ â êà÷åñòâå ñòàíäàðòà.
Ðåçóëüòàòû è èõ îáñóæäåíèå
Ìèòîõîíäðèè ïå÷åíè êðîëèêà áûëè âûäåëåíû
ïðè ïîìîùè äèôôåðåíöèàëüíîãî öåíòðèôóãèðîâàíèÿ
íà îñíîâå îïèñàííûõ â ëèòåðàòóðå ìåòîäèê [22, 23].
 ýêñòðàêòå èç íèõ áûëà îáíàðóæåíà íóêëåàçíàÿ àêòèâíîñòü ñ êàæóùåéñÿ ìîëåêóëÿðíîé ìàññîé îêîëî
30 êÄà (ðèñ. 1), ÷òî ñîîòâåòñòâóåò ìàññå ìîíîìåðà
ýíäîíóêëåàçû G [3]. Ýíäîíóêëåàçíàÿ àêòèâíîñòü, ïðèñóòñòâóþùàÿ â ìèòîõîíäðèàëüíîì ýêñòðàêòå, ñòèìóëèðóåòñÿ èîíàìè Mg2+ è èíãèáèðóåòñÿ èîíàìè Zn2+
(ðèñ. 1), ÷òî òîæå õàðàêòåðíî äëÿ ýíäîíóêëåàçû G [7].
Èññëåäîâàíà çàâèñèìîñòü äåéñòâèÿ ýíäîíóêëåàçíîé àêòèâíîñòè ìèòîõîíäðèàëüíîãî ýêñòðàêòà íà
ñóáñòðàòíûå ÄÍÊ îò ñòàòóñà èõ ìåòèëèðîâàíèÿ è
îò S-àäåíîçèë-L-ìåòèîíèíà è S-àäåíîçèë-L-ãîìîöèñòåèíà.  êà÷åñòâå ñóáñòðàòà èñïîëüçîâàíû íåìåòèëèðîâàííàÿ (dam–, dcm–) è ìåòèëèðîâàííàÿ
ïî ñàéòàì Gm6ATC è Cm5CWGG (dam+, dcm+)
ÄÍÊ ôàãà l. Ýòè ÄÍÊ èäåíòè÷íû ïî äëèíå, íóêëåîòèäíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè è êîíöåíòðàöèè â ðåàêöèîííîé ñìåñè. Íàéäåííàÿ ýíäîíóêëåàçà ðàñùåïëÿåò
îáà ýòè ñóáñòðàòà ïðèìåðíî îäèíàêîâî (ðèñ. 2), ÷òî
îòëè÷àåò åå îò ýíäîíóêëåàç ïøåíèöû WEN1 è WEN2,
ïðåäïî÷òèòåëüíî ðàñùåïëÿþùèõ ñîîòâåòñòâåííî ìåòèëèðîâàííóþ è íåìåòèëèðîâàííóþ ÄÍÊ [16, 17].
S-àäåíîçèë-L-ìåòèîíèí çàìåòíî ïîäàâëÿåò ðàñùåïëåíèå ñóáñòðàòíûõ ÄÍÊ â ïðèñóòñòâèè èîíîâ
Mg2+. S-àäåíîçèë-L-ãîìîöèñòåèí, êîòîðûé ïî ñðàâíåíèþ ñ SAM íå èìååò ìåòèëüíîé ãðóïïû, íå âëèÿåò
26
ÂÅÑÒÍ. ÌÎÑÊ. ÓÍ-ÒÀ. ÑÅÐ. 16. ÁÈÎËÎÃÈß. 2012. ¹ 4
Ðèñ. 1. À — ýíäîíóêëåàçíàÿ àêòèâíîñòü ñóììàðíîãî áåëêîâîãî ýêñòðàêòà ìèòîõîíäðèé â 12% ÏÀÀÃ ñ âïëàâëåííîé â ãåëü
òèìóñíîé ÄÍÊ; Á — çàâèñèìîñòü ýíäîíóêëåàçíîé àêòèâíîñòè ñóììàðíîãî áåëêîâîãî ýêñòðàêòà ìèòîõîíäðèé (800 íã áåëêà)
îò èîíîâ Mg2+ è Zn2+ (5 ìÌ). K — êîíòðîëü, E — èîíû ìåòàëëîâ íå äîáàâëÿëèñü
íà ýíäîíóêëåàçíóþ àêòèâíîñòü (ðèñ. 2). Ýòî îòëè÷àåò èçó÷åííóþ æèâîòíóþ ìèòîõîíäðèàëüíóþ ýíäîíóêëåàçíóþ àêòèâíîñòü îò ïøåíè÷íîé ýíäîíóêëåàçû WEN1, êîòîðàÿ, íàïðîòèâ, àêòèâèðóåòñÿ SAM,
SAH è SiBA [16].
Òàêèì îáðàçîì, ýíäîíóêëåàçíàÿ àêòèâíîñòü èç
ýêñòðàêòà ìèòîõîíäðèé êðîëèêà, ñîîòâåòñòâóþùàÿ
ïî ñâîéñòâàì ýíäîíóêëåàçå G, íå ðàçëè÷àåò ñóáñòðàòíûå ÄÍÊ ïî ñòàòóñó èõ ìåòèëèðîâàíèÿ. ×óâñòâèòåëüíîñòü ê ñòàòóñó ìåòèëèðîâàíèÿ ñóáñòðàòíîé ÄÍÊ
èçâåñòíà äëÿ îõàðàêòåðèçîâàííûõ íàìè ýíäîíóêëåàç ïðîðîñòêîâ ïøåíèöû WEN1 è WEN2 [16, 17]
Ðèñ. 2. Çàâèñèìîñòü ýíäîíóêëåàçíîé àêòèâíîñòè ñóììàðíîãî áåëêîâîãî ýêñòðàêòà ìèòîõîíäðèé (800 íã áåëêà) îò SAM è SAH
(2 ìÌ) è ñòàòóñà ìåòèëèðîâàíèÿ ñóáñòðàòíîé ÄÍÊ (–, dam,
dcm-íåìåòèëèðîâàííàÿ ÄÍÊ; +, dam, dcm-ìåòèëèðîâàííàÿ ÄÍÊ)
â ïðèñóòñòâèè Mg2+ (5 ìÌ). Ê — êîíòðîëü
è íåêîòîðûõ áàêòåðèàëüíûõ ýíäîíóêëåàç ðåñòðèêöèè (â òîì ÷èñëå ïðèíàäëåæàùèõ, êàê è ýíäîíóêëåàçà G, ê bba-Ìå-finger-ñåìåéñòâó) [24, 25]. Ðåàêöèÿ ìèòîõîíäðèàëüíîãî ôåðìåíòà æèâîòíûõ íà SAM
(èíãèáèðîâàíèå àêòèâíîñòè) ïðîòèâîïîëîæíà õàðàêòåðíîé äëÿ SAM-çàâèñèìûõ ýíäîíóêëåàç ðåñòðèêöèè
è WEN1 àêòèâàöèè ïîä äåéñòâèåì SAM. Ïîýòîìó,
â îòëè÷èå îò èçâåñòíûõ ðàñòèòåëüíûõ è áàêòåðèàëüíûõ ýíäîíóêëåàç, SAM íå ÿâëÿåòñÿ ïîçèòèâíûì àëëîñòåðè÷åñêèì ýôôåêòîðîì äëÿ æèâîòíîé ìèòîõîíäðèàëüíîé ýíäîíóêëåàçû.
ÑÏÈÑÎÊ ËÈÒÅÐÀÒÓÐÛ
1. Ruiz-Carrillo A., Renaud J. Endonuclease G:
a (dG)n · (dC)n-specific DNase from higher eukaryotes //
EMBO Journal. 1987. Vol. 6. N 2. P. 401—407.
2. Ohsato T., Ishihara N., Muta T., Umeda S., Ikeda S.,
Mihara K., Hamasaki N., Kang D. Mammalian mitochondrial endonuclease G. Digestion of R-loops and localization
in intermembrane space // Eur. J. Biochem. 2002. N 269.
P. 5765—5770.
3. Davies A.M., Hershman S., Stabley G.J., Hoek J.B.,
Peterson J., Cahill A. A Ca2+-induced mitochondrial permeability transition causes complete release of rat liver endonuclease G activity from its exclusive location within the mitochondrial intermembrane space. Identification of a novel
endo-exonuclease activity residing within the mitochondrial
matrix // Nucleic Acids Res. 2003. Vol. 31. N 4. P. 1364—1373.
ÂÅÑÒÍ. ÌÎÑÊ. ÓÍ-ÒÀ. ÑÅÐ. 16. ÁÈÎËÎÃÈß. 2012. ¹ 4
4. Oda K., Kawasaki N., Fukuyama M., Ikeda S. Ectopic
expression of mitochondria endonuclease Pnu1p from Schizosaccharomyces Pombe induces cell death of the yeast // J. Biochem. and Mol. Biol. 2007. Vol. 40. N 6. P. 1095—1099.
5. Balk J., Chew S.K., Leaver C.J., McCabe P.F. The intermembrane space of plant mitochondria contains a DNase
activity that may be involved in programmed cell death //
Plant J. 2003. N 34. P. 573—583.
6. Loll B., Gebhardt M., Wahle E., Meinhart A. Crystal structure of the EndoG/EndoGI complex: mechanism of
EndoG inhibition // Nucleic Acids Res. 2009. Vol. 37. N 21.
P. 7312—7320.
7. Widlak P., Li L.Y., Wang X., Garrard W.T. Action
of recombinant human apoptotic endonuclease G on naked
DNA and chromatin substrates: cooperation with exonuclease and DNase I // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276. N 51.
P. 48404—48409.
8. Widlak P., Garrard W.T. Discovery, regulation, and
action of the major apoptotic nucleases DFF40/CAD and endonuclease G // J. Cell. Biochem. 2005. N 94. P. 1078—1087.
9. Côté J., Ruiz-Carrillo A. Primers for mitochondrial
DNA replication generated by endonuclease G // Science.
1993. Vol. 261. N 5122. P. 765—769.
10. Zassenhaus H.P., Denniger G. Analysis of the role
of the NUC1 endo/exonuclease in yeast mitochondrial
DNA recombination // Current Genetics. 1994. Vol. 25. N 2.
P. 142—149.
11. Ikeda S., Ozaki K. Action of mitochondrial endonuclease G on DNA damaged by L-ascorbic acid, peplomycin, and cis-diamminedichloroplatinum (II) // Biochem. and
Biophys. Res. Comm. 1997. Vol. 235. N 2. P. 291—294.
12. van Loo G., Schotte P., van Gurp M., Demol H., Hoorelbeke B., Gevaert K., Rodriguez I., Ruiz-Carrillo A., Vandekerckhove J., Declercq W., Beyaert R., Vandenabeele P.
Endonuclease G: a mitochondrial protein released in apoptosis and involved in caspase-independent DNA degradation // Cell Death and Differentiation. 2001. Vol. 8. N 12.
P. 1136—1142.
13. Li L.Y., Luo X., Wang X. Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria // Nature.
2001. Vol. 412. N 6842. P. 95—99.
27
14. Parrish J., Li L., Klotz K., Ledwich D., Wang X.,
Xue D. Mitochondrial endonuclease G is important for apoptosis in C. elegans // Nature. 2001. Vol. 412. N 6842. P. 90—94.
15. Büttner S., Eisenberg T., Carmona-Gutierrez D.,
Ruli D., Knauer H., Ruckenstuhl C., Sigrist C., Wissing S.,
Kollroser M., Fröhlich K.U., Sigrist S., Madeo F. Endonuclease G regulates budding yeast life and death // Mol. Cell.
2007. Vol. 25. N 2. P. 233—246.
16. Fedoreyeva L.I., Sobolev D.E., Vanyushin B.F. Wheat
endonuclease WEN1 dependent on S-adenosyl-L-methionine
and sensitive to DNA methylation status // Epigenetics. 2007.
Vol. 2. N 1. P. 50—53.
17. Ôåäîðååâà Ë.È., Ñîáîëåâ Ä.Å., Âàíþøèí Á.Ô.
S-Àäåíîçèë-L-ìåòèîíèíçàâèñèìàÿ è ÷óâñòâèòåëüíàÿ ê ñòàòóñó ìåòèëèðîâàíèÿ ÄÍÊ ýíäîíóêëåàçà WEN2 èç êîëåîïòèëåé ïøåíèöû // Áèîõèìèÿ. 2008. Ò. 73. ¹ 9. Ñ. 1243—1251.
18. Sistla S., Rao D.N. S-Adenosyl-L-methionine-dependent restriction enzymes // Critical reviews in biochemistry
and molecular biology. 2004. Vol. 39. N 1. P. 1—19.
19. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during
the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature.
1970. Vol. 227. N 5259. P. 680—685.
20. Merril C.R., Goldman D., Sedman S.A., Ebert M.H.
Ultrasensitive stain for proteins in polyacrylamide gels shows
regional variation in cerebrospinal fluid proteins // Science.
1981. Vol. 211. N 4489. P. 1437—1438.
21. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for
the quantitation of microgram quantities of protein utilizing
the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976.
Vol. 72. P. 248—254.
22. Cummings O.W., King T.C., Holden J.A., Low R.L.
Purification and characterization of the potent endonuclease
in extracts of bovine heart mitochondria // J. Biol. Chem.
1987. Vol. 262. N 5. P. 2005—2015.
23. Low R.L., Gerschenson M. Endonuclease G isolation
and assays // Methods in Molecular Biology. 2002. Vol. 197.
P. 331—349.
24. Yang W. Nucleases: diversity of structure, function and
mechanism // Quarterly Rev. of Biophys. 2011. Vol. 44. N 1. P. 1—93.
25. Sir Richard J. Roberts. REBASE — The Restriction
Enzyme Database. (URL: http://rebase.neb.com 01.12.2011).
Ïîñòóïèëà â ðåäàêöèþ
15.05.12
MODULATION OF THE RABBIT MITOCHONDRIAL ENDONUCLEASE ACTION
BY S-ADENOSYL-L-METHIONINE
D.E. Sobolev, B.F. Vanyushin
Endonuclease activity found in rabbit liver mitochondrial extract is similar to known endonuclease G: it has an apparent molecular mass value of about 30 kDa, it depends on Mg2+ and is
inhibited with Zn2+. Unlike WEN1 and WEN2 plant endonucleases it is unsensitive to DNA methylation status and inhibited with S-adenosyl-L-methionine.
Key words: mitochondria, endonuclease G, S-adenosyl-L-methionine, methylation.
Ñâåäåíèÿ îá àâòîðàõ
Ñîáîëåâ Äìèòðèé Åâãåíüåâè÷ — ñïåöèàëèñò, íàó÷. ñîòð. ÃÍÓ ÂÍÈÈÑÁ Ðîññåëüõîçàêàäåìèè.
Òåë.: 8-495-939-54-12, +7-903-204-48-27; e-mail: morang@list.ru
Âàíþøèí Áîðèñ Ôåäîðîâè÷ — äîêò. áèîë. íàóê, ïðîô., ÷ë.-êîðð. ÐÀÍ, çàâ. îòäåëîì ìîëåêóëÿðíûõ îñíîâ
îíòîãåíåçà, Èíñòèòóò ôèçèêî-õèìè÷åñêîé áèîëîãèè èì. À.Í. Áåëîçåðñêîãî ÌÃÓ. Òåë.: 8-495-939 54-12,
e-mail: vanyush@belozersky.msu.ru