ÌÈÍÈÑÒÅÐÑÒÂÎ ÇÄÐÀÂÎÎÕÐÀÍÅÍÈß ÐÅÑÏÓÁËÈÊÈ ÁÅËÀÐÓÑÜ Ðàçðåøåíî Ìèíçäðàâîì Ðåñïóáëèêè Áåëàðóñü äëÿ ïðàêòè÷åñêîãî èñïîëüçîâàíèÿ Ïåðâûé çàìåñòèòåëü ìèíèñòðà çäðàâîîõðàíåíèÿ, ïðåäñåäàòåëü êîìèññèè ïî ñïîñîáàì ïðîôèëàêòèêè, äèàãíîñòèêè, ëå÷åíèÿ è îðãàíèçàöèîííûì ôîðìàì ðàáîòû ÌÇ ÐÁ __________________ Â.Ì. Îðåõîâñêèé 12 èþíÿ 2000 ã. Ðåãèñòðàöèîííûé íîìåð ¹ 1219911 ÎÏÐÅÄÅËÅÍÈÅ ÄÍÊÀÇÍÎÉ ÀÊÒÈÂÍÎÑÒÈ ÏÐÅÏÀÐÀÒΠÑÛÂÎÐÎÒÎ×ÍÛÕ IgG ÄËß ÈÌÌÓÍÎËÎÃÈ×ÅÑÊÎÉ ÄÈÀÃÍÎÑÒÈÊÈ ÇÀÁÎËÅÂÀÍÈÉ ÙÈÒÎÂÈÄÍÎÉ ÆÅËÅÇÛ (èíñòðóêöèÿ ïî ïðèìåíåíèþ) Ó÷ðåæäåíèå-ðàçðàáîò÷èê: Âèòåáñêèé ãîñóäàðñòâåííûé ìåäèöèíñêèé óíèâåðñèòåò Àâòîðû: Å.Â. Êóíäåð (Ñèäîðñêàÿ), È.È. Ãåíåðàëîâ, ïðîô. À.Í. Îêîðîêîâ 1 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ðåàáèëèòàöèîííûå èíäèâèäóàëüíûå ïðîãðàììû äëÿ áîëüíûõ è èíâàëèäîâ âñëåäñòâèå õðîíè÷åñêîãî îáñòðóêòèâíîãî áðîíõèòà Îãëàâëåíèå ÏÎÊÀÇÀÍÈß Ê ÏÐÈÌÅÍÅÍÈÞ ............................................................................................................ 3 ÏÅÐÅ×ÅÍÜ ÍÅÎÁÕÎÄÈÌÎÃÎ ÌÅÄÈÖÈÍÑÊÎÃÎ ÎÁÎÐÓÄÎÂÀÍÈß, ÌÅÄÈÖÈÍÑÊÈÕ ÏÐÅÏÀÐÀÒÎÂ, ÈÍÑÒÐÓÌÅÍÒÀÐÈß .................................................................. 4 ÎÏÈÑÀÍÈÅ ÒÅÕÍÎËÎÃÈÈ ÈÑÏÎËÜÇÎÂÀÍÈß ÌÅÒÎÄÀ ........................................................... 6 ÂÎÇÌÎÆÍÛÅ ÎÑËÎÆÍÅÍÈß È ÎØÈÁÊÈ.................................................................................... 13 2 Ðåàáèëèòàöèîííûå èíäèâèäóàëüíûå ïðîãðàììû äëÿ áîëüíûõ è èíâàëèäîâ âñëåäñòâèå õðîíè÷åñêîãî îáñòðóêòèâíîãî áðîíõèòà ÏÎÊÀÇÀÍÈß Ê ÏÐÈÌÅÍÅÍÈÞ Îïðåäåëåíèå êàòàëèòè÷åñêîé àêòèâíîñòè ïðåïàðàòîâ èììóíîãëîáóëèíîâ êëàññà G ñûâîðîòêè êðîâè èñïîëüçóåòñÿ äëÿ èììóíîëîãè÷åñêîé äèàãíîñòèêè çàáîëåâàíèé ùèòîâèäíîé æåëåçû (äèôôóçíîãî òîêñè÷åñêîãî çîáà, àóòîèììóííîãî òèðåîèäèòà è ïîäîñòðîãî òèðåîèäèòà).  êà÷åñòâå äèàãíîñòè÷åñêîãî êðèòåðèÿ ïðåäëàãàåòñÿ îöåíêà óðîâíåé ýíäîíóêëåàçíîé (ÄÍÊàçíîé) àêòèâíîñòè ïðåïàðàòîâ ñûâîðîòî÷íûõ IgG. Ýòîò òåñò äîïîëíÿåò ëàáîðàòîðíóþ äèàãíîñòèêó âûøåïåðå÷èñëåííûõ ïàòîëîãè÷åñêèõ ñîñòîÿíèé. Åãî ìîæíî èñïîëüçîâàòü êàê óòî÷íÿþùèé êðèòåðèé â ñëó÷àå íåâîçìîæíîñòè âûïîëíåíèÿ áèîïñèè òêàíè ùèòîâèäíîé æåëåçû, à òàêæå ïðè ðàçíîðå÷èâîñòè äðóãèõ ðåçóëüòàòîâ ëàáîðàòîðíûõ è èíñòðóìåíòàëüíûõ èññëåäîâàíèé. 3 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ðåàáèëèòàöèîííûå èíäèâèäóàëüíûå ïðîãðàììû äëÿ áîëüíûõ è èíâàëèäîâ âñëåäñòâèå õðîíè÷åñêîãî îáñòðóêòèâíîãî áðîíõèòà ÏÅÐÅ×ÅÍÜ ÍÅÎÁÕÎÄÈÌÎÃÎ ÌÅÄÈÖÈÍÑÊÎÃÎ ÎÁÎÐÓÄÎÂÀÍÈß, ÌÅÄÈÖÈÍÑÊÈÕ ÏÐÅÏÀÐÀÒÎÂ, ÈÍÑÒÐÓÌÅÍÒÀÐÈß Âåñû ðàâíîïëå÷èå ðó÷íûå ÂÐ-100 ïî ÃÎÑÒ 395-54. Âåñû ëàáîðàòîðíûå ïî ÃÎÑÒ 19491-74. Âîðîíêè ñòåêëÿííûå ëàáîðàòîðíûå ïî ÃÎÑÒ 86-13-64. Êîëáû ñòåêëÿííûå ëàáîðàòîðíûå ïî ÃÎÑÒ 10394-72. Ìàãíèòíûé ñìåñèòåëü ñ ìàãíèòîì öèëèíäðè÷åñêèì ÌÌÇ-94-5245. Íîæíèöû ìåäèöèíñêèå ïî ÃÎÑÒ 21239-77. Ïðîáêè êîíóñíûå ïî ÃÎÑÒ 7852-76. Ïðîáèðêè öåíòðèôóæíûå ñòåêëÿííûå. Ñòàêàíû ñòåêëÿííûå ëàáîðàòîðíûå ïî ÃÎÑÒ 10973-75. Òåðìîñòàò ýëåêòðè÷åñêèé ñ àâòîìàòè÷åñêèì òåðìîðåãóëÿòîðîì äî òåìïåðàòóðû 50°Ñ ñ öåíîé äåëåíèÿ 0,2°Ñ. Õîëîäèëüíèê áûòîâîé ýëåêòðè÷åñêèé ñ òåìïåðàòóðîé â êàìåðå 46°Ñ. Öåíòðèôóãà ñ óãëîâûì ðîòîðîì ÖËÊ-2. Öåíòðèôóãà ñ áàêåòíûì ðîòîðîì ÎÏÍ-ÇÓ4.2 Ñïåêòðîôîòîìåòð ÑÔ-26 èëè ÑÔ-46 (ïðîèçâîäñòâà ËÎÌÎ, Ðîññèÿ). ðÍ-ìåòð «ðÍ-121». Óñòðîéñòâî äëÿ äèàëèçà. Âîäà äèñòèëëèðîâàííàÿ ïî ÃÎÑÒ 7609-72. Ãèäðîôîñôàò íàòðèÿ äâóõâîäíûé ïî ÃÎÑÒ 245-76. Äèãèäðîôîñôàò íàòðèÿ äâåíàäöàòèâîäíûé ïî ÃÎÑÒ 4172-76. Òðèòîí Õ-305 (Merck) èëè Òðèòîí Õ-100 (Ferak). Ãëèöèí (Reanal) èëè êèñëîòà àìèíîóêñóñíàÿ (íàòðèåâàÿ ñîëü) ïðîèçâîäñòâà «Ðåàõèì». 4 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ðåàáèëèòàöèîííûå èíäèâèäóàëüíûå ïðîãðàììû äëÿ áîëüíûõ è èíâàëèäîâ âñëåäñòâèå õðîíè÷åñêîãî îáñòðóêòèâíîãî áðîíõèòà Òðèñ-(ãèäðîêñèìåòèë)-àìèíîìåòàí (ïðîèçâîäñòâà Reanal èëè «Îëàéíáèîôàðì»). Ýòàêðèäèíà ëàêòàò (ðèâàíîë). Àêòèâèðîâàííûé óãîëü. Àììîíèÿ ñóëüôàò (Ðåàõèì) ïî ÃÎÑÒ3769-78. Õëîðèä íàòðèÿ (Ðåàõèì). Àãàðîçà, êîíúþãèðîâàííàÿ ñ áåëêîì À çîëîòèñòîãî ñòàôèëîêîêêà (ïðîèçâîäñòâà èíñòèòóòà èì. Ïàñòåðà, Ñàíêò-Ïåòåðáóðã, Ðîññèÿ). Äåçîêñèðèáîíóêëåèíîâàÿ êèñëîòà (Sigma). Ñîëÿíàÿ êèñëîòà 0,1í è 1í (ôèêñàíàë). Ìàòðèöû äëÿ DEAE-õðîìàòîãðàôèè Toyopearl 650M («Toyosoda», Japan) èëè Ìîëñåëåêò DEAE À50 (Reanal). Íàáîð ïèïåòîê àâòîìàòè÷åñêèõ îò 0,02 äî 1,0 ìë. Óíèâåðñàëüíàÿ èíäèêàòîðíàÿ áóìàãà ðÍ 012 (ïðîèçâîäñòâà «Lachema» èëè «Ðåàõèì»). Áóìàæíûå ôèëüòðû (ïðîèçâîäñòâà «Filtrak»). 5 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ðåàáèëèòàöèîííûå èíäèâèäóàëüíûå ïðîãðàììû äëÿ áîëüíûõ è èíâàëèäîâ âñëåäñòâèå õðîíè÷åñêîãî îáñòðóêòèâíîãî áðîíõèòà ÎÏÈÑÀÍÈÅ ÒÅÕÍÎËÎÃÈÈ ÈÑÏÎËÜÇÎÂÀÍÈß ÌÅÒÎÄÀ 1. Âûäåëåíèå IgG èç ñûâîðîòêè êðîâè áîëüíûõ çàáîëåâàíèÿìè ùèòîâèäíîé æåëåçû, à òàêæå çäîðîâûõ ëèö (äîíîðîâ êðîâè) À. Ïðèãîòîâëåíèå èñõîäíûõ ðàñòâîðîâ è îáîðóäîâàíèÿ äëÿ âûäåëåíèÿ ñûâîðîòî÷íûõ èììóíîãëîáóëèíîâ Ïðèãîòîâëåíèå 0,4 ìîëü ôîñôàòíîãî áóôåðà (ÔÁÐ) ðÍ 7,4. 57,2 ã Na2HPO4 äîâåñòè äî 450 ìë äèñòèëëèðîâàííîé âîäîé (ðàñòâîð ¹1). Îòäåëüíî 6 ã NaH2PO4 äîâåñòè äî 100 ìë äèñòèëëèðîâàííîé âîäîé (ðàñòâîð ¹2). 400 ìë ðàñòâîðà ¹1 ñìåøàòü ñ 100 ìë ðàñòâîðà ¹2. Êîíòðîëü ðÍ îñóùåñòâëÿåòñÿ íà ðÍ-ìåòðå. Ïðèãîòîâëåíèå 0,1 ìîëü ôîñôàòíîãî áóôåðíîãî ðàñòâîðà ðÍ 7,4. 100 ìë 0,4 ìîëü ôîñôàòíîãî áóôåðà ðÍ 7,4 äîâåñòè äî 400 ìë äèñòèëëèðîâàííîé âîäîé. Òùàòåëüíî ïåðåìåøàòü. Ïðèãîòîâëåíèå 0,1 ìîëü ôîñôàòíîãî áóôåðà ðÍ 7,4 ñ 1% ðàñòâîðîì òðèòîíà Õ-305. 4 ã òðèòîíà Õ-305 ðàñòâîðèòü â 400 ìë 0,1 ìîëü ôîñôàòíîãî áóôåðà ðÍ 7,4. Ïðèãîòîâëåíèå ãëèöèí-HCl áóôåðà ðÍ 2,8. 2,28 ãðàììà ãëèöèíà ðàñòâîðèòü â 280 ìë äèñòèëëèðîâàííîé âîäû. Çàòåì ê 280 ìë ïîëó÷åííîãî ðàñòâîðà äîáàâèòü 120 ìë 0,1Í HCl. Îáùèé îáúåì äîëæåí ñîñòàâèòü 400 ìë. Êîíòðîëü ðÍ îñóùåñòâëÿåòñÿ íà ðÍ-ìåòðå. Íàáèâêà êîëîíêè, ñîäåðæàùåé àêòèâèðîâàííûé óãîëü. Ìåëêîäèñïåðñíûé óãîëü îáúåìîì 5 ìë àêêóðàòíî ââîäÿò â êîëîíêó, ïåðèîäè÷åñêè ïîòðÿõèâàÿ åå äëÿ ëó÷øåãî çàïîëíåíèÿ. Óðàâíîâåøèâàþò 0,01 ìîëü ôîñôàòíûì áóôåðîì ðÍ 7,4, êîòîðûé ïðîïóñêàþò ÷åðåç êîëîíêó. Íàáèâêà êîëîíêè, ñîäåðæàùåé ÄÝÀÝ-ñîðáåíò. 6 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ðåàáèëèòàöèîííûå èíäèâèäóàëüíûå ïðîãðàììû äëÿ áîëüíûõ è èíâàëèäîâ âñëåäñòâèå õðîíè÷åñêîãî îáñòðóêòèâíîãî áðîíõèòà ÄÝÀÝ-ìàòðèöó, õðàíÿùóþñÿ â 0,01 ìîëü ôîñôàòíîì áóôåðå ðÍ 7,4, àêêóðàòíî ââîäÿò â êîëîíêó â îáúåìå 56 ìë. Íàáèâêà êîëîíêè äëÿ àôôèííîé õðîìàòîãðàôèè, ñîäåðæàùåé àãàðîçó, êîíúþãèðîâàííóþ ñ ïðîòåèíîì À çîëîòèñòîãî ñòàôèëîêêîêà Àãàðîçó, êîíúþãèðîâàííóþ ñ ïðîòåèíîì À çîëîòèñòîãî ñòàôèëîêîêêà, àêêóðàòíî íàñëàèâàþò íà áóìàæíûé ôèëüòð è çàïîëíÿþò êîëîíêó äî 34 ìë îáúìà ãðàíóë àãàðîçû. Ïðîìûâàþò êîëîíêó 0,01 ìîëü áóôåðîì ðÍ 7,4 è óðàâíîâåøèâàþò 0,1ìîëü áóôåðîì ðÍ 7,4. Äëÿ õðàíåíèÿ êîëîíîê äëÿ àôôèííîé õðîìàòîãðàôèè äîáàâëÿþò 0,5 ìë 1% ðàñòâîðà àçèäà Na 5 ìë îáúåìà êîëîíêè (äëÿ ïðèãîòîâëåíèÿ 1% ðàñòâîðà 1ã àçèäà Na äîâîäÿò äî 100 ìë äèñòèëëèðîâàííîé âîäîé) è õðàíÿò â õîëîäèëüíèêå ïðè òåìïåðàòóðå 4°C. Â. Âûäåëåíèå ñûâîðîòî÷íûõ èììóíîãëîáóëèíîâ G 7 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ðåàáèëèòàöèîííûå èíäèâèäóàëüíûå ïðîãðàììû äëÿ áîëüíûõ è èíâàëèäîâ âñëåäñòâèå õðîíè÷åñêîãî îáñòðóêòèâíîãî áðîíõèòà Íåãåïàðèíèçèðîâàííóþ ÷åëîâå÷åñêóþ êðîâü ( íå ìåíåå 1020 ìë) èíêóáèðóþò â òå÷åíèå 2 ÷àñîâ ïðè òåìïåðàòóðå 4°C äî îáðàçîâàíèÿ ñãóñòêà. Çàòåì öåíòðèôóãèðóþò 1015 ìèí â öåíòðèôóæíûõ ïðîáèðêàõ â öåíòðèôóãå ñ áàêåòíûì ðîòîðîì (1500 îá./ìèí). Àêêóðàòíî çàáèðàþò ÷èñòóþ ñûâîðîòêó. Ê íåé ïðèáàâëÿþò îõëàæäåííûé äî 4°C 0,75% ðàñòâîð ðèâàíîëà â ñîîòíîøåíèè 1 îáúì ðèâàíîëà ê 2 îáúåìàì ñûâîðîòêè. Ñìåñü èíêóáèðóþò ïðè òåìïåðàòóðå 4°C íå ìåíåå 2 ÷. Îñàäîê îòáðàñûâàþò, íàäîñàäî÷íóþ æèäêîñòü ïðîïóñêàþò ÷åðåç êîëîíêó, çàïîëíåííóþ àêòèâèðîâàííûì óãëåì. Ïîëó÷åííûé ïîñëå ýòîãî ïðåïàðàò ïîäâåðãàþò DEAEõðîìàòîãðàôèè íà ìàòðèöå Ìîëñåëåêò DEAE À50, óðàâíîâåøåííîé 0,01ìîëü ôîñôàòíûì áóôåðîì ðÍ 7,4 ñî ñêîðîñòüþ 0,3 ìë/ìèí. Ñîáèðàþò ïðîõîäÿùèé ÷åðåç êîëîíêó îáúåì. Äîïîëíèòåëüíî êîëîíêó ïðîìûâàþò ýòèì æå áóôåðîì â îáúåìå, ðàâíîì îáúåìó êîëîíêè. Ýëþàòû îáúåäèíÿþò. Äàëåå ïðîâîäÿò àôôèííóþ õðîìàòîãðàôèþ, ïðîïóñêàÿ ïðåïàðàò ÷åðåç êîëîíêó ñ àãàðîçîé, êîíúþãèðîâàííîé ñ ïðîòåèíîì À çîëîòèñòîãî ñòàôèëîêîêêà, óðàâíîâåøåííóþ 0,1 ìîëü ôîñôàòíûì áóôåðîì ñî ñêîðîñòüþ 67 êàïåëü â ìèí. Ïîñëå ýòîãî êîëîíêó ïîñëåäîâàòåëüíî ïðîìûâàþò 0,1 ìîëü ôîñôàòíûì áóôåðîì ðÍ 7,4 áåç äåòåðãåíòà, à çàòåì ñ 1% ðàñòâîðîì òðèòîíà Õ-305 â êîëè÷åñòâå 56 îáúåìîâ êîëîíêè äî èñ÷åçíîâåíèÿ áåëêà â ýëþåíòå. Ýëþöèþ ñâÿçàâøèõñÿ èììóíîãëîáóëèíîâ êëàññà G (G1, G2, G4) âåäóò 0,1 ìîëü ãëèöèí-HCl áóôåðîì ðÍ 2,8 äî èñ÷åçíîâåíèÿ áåëêà â ïðîáå (îòáèðàþò îòäåëüíî ôðàêöèè ïî 1,52 ìë). Ôðàêöèè, ñîäåðæàùèå íàèáîëåå âûñîêèå êîíöåíòðàöèè áåëêà, îáúåäèíÿþò. Êîëîíêó ïîñëå ýëþöèè ïðîìûâàþò 0,1 ôîñôàòíûì áóôåðîì ñ 1% ðàñòâîðîì òðèòîíà Õ-305 ðÍ 7,4 â êîëè÷åñòâå, ðàâíîì 1015 îáúåìàì êîëîíêè, à çàòåì 0,01 ìîëü ôîñôàòíûì áóôåðîì áåç äåòåðãåíòà ñ ðÍ 7,4 â êîëè÷åñòâå, ðàâíîì 2030 îáúåìàì êîëîíêè, äî èñ÷åçíîâåíèÿ áåëêà â ýëþåíòå (îïðåäåëÿþò ïî ìåòîäó Áðåäôîðä). Äàëåå èììóíîãëîáóëèíû âûäåëÿþò ïåðåîñàæäåíèåì â 40% ðàñòâîðå ñóëüôàòà àììîíèÿ. Ïðåöèïèòèðîâàâøèå èììóíîãëîáóëèíû îñàæäàþò â öåíòðèôóãå ñ óãëîâûì ðîòîðîì ïðè 6000 îá./ìèí â òå÷åíèå 15 ìèí. Íàäîñàäî÷íóþ 8 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ðåàáèëèòàöèîííûå èíäèâèäóàëüíûå ïðîãðàììû äëÿ áîëüíûõ è èíâàëèäîâ âñëåäñòâèå õðîíè÷åñêîãî îáñòðóêòèâíîãî áðîíõèòà æèäêîñòü ñëèâàþò. Îñàäîê ðàñòâîðÿþò â ìèíèìàëüíîì îáúåìå äèñòèëëèðîâàííîé âîäû è ÷åòûðåõêðàòíî äèàëèçóþò ïðîòèâ èçîòîíè÷åñêîãî ðàñòâîðà õëîðèäà íàòðèÿ. Ïîëó÷åííûé ïðåïàðàò ïîñëå äèàëèçà îñâåòëÿþò, öåíòðèôóãèðóÿ â öåíòðèôóãå ñ áàêåòíûì ðîòîðîì ïðè 1500 îá./ìèí â òå÷åíèå 10 ìèí. Êîíöåíòðàöèþ áåëêà â ïðåïàðàòå îïðåäåëÿþò ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêè íà äëèíå âîëíû 280 íì. Õðàíÿò ïðåïàðàòû èììóíîãëîáóëèíîâ â ïëàñòèêîâûõ ïðîáèðêàõ â ìîðîçèëüíèêå ïðè -20°Ñ. Ñ. Êîíòðîëü ÷èñòîòû ïîëó÷åííûõ ïðåïàðàòîâ Ïîëó÷åííûé ïðåïàðàò IgG ñëåäóåò òåñòèðîâàòü íà ÷èñòîòó ñ ïîìîùüþ ýëåêòðîôîðåçà â ïîëèàêðèëàìèäíîì ãåëå â äèññîöèèðóþùèõ óñëîâèÿõ ñ îêðàñêîé íèòðàòîì ñåðåáðà. Ýëåêòðîôîðåç ïðîâîäÿò â ïðèáîðå äëÿ âåðòèêàëüíîãî ýëåêòðîôîðåçà â ïëàñòèíàõ â ãðàäèåíòíîì 420% ïîëèàêðèëàìèäíîì ãåëå íà 0,025 ìîëü òðèñ-HCl-áóôåðå, pH 8,3, ñîäåðæàùåì 0,1% äîäåöèëñóëüôàò íàòðèÿ (ÄÄÑ-Na) è 0,1% ìåðêàïòîýòàíîë ïðè íàïðÿæåíèè 200 Â. Ïðîáû Èà ïðåäâàðèòåëüíî äèññîöèèðóþò êèïÿ÷åíèåì â òå÷åíèå 3 ìèí â ïðèñóòñòâèè 1% ÄÄÑ-Na è 2% ìåðêàïòîýòàíîëà. Íà êàæäûé òðåê íàíîñÿò 5 ìêë ïðåïàðàòà â êîíöåíòðàöèè 2 ìã/ìë. 9 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ðåàáèëèòàöèîííûå èíäèâèäóàëüíûå ïðîãðàììû äëÿ áîëüíûõ è èíâàëèäîâ âñëåäñòâèå õðîíè÷åñêîãî îáñòðóêòèâíîãî áðîíõèòà Ïî îêîí÷àíèè ýëåêòðîôîðåçà èõ ôèêñèðóþò è îäíîâðåìåííî âûìûâàþò ÄÄÑ-Na ñíà÷àëà ðàñòâîðîì, ñîäåðæàùèì 12% ÑÍ3ÑÎÎÍ è 50% ýòàíîëà (10 ìèí), ïîòîì äâàæäû ïî 5 ìèí 5% ÑÍ3ÑÎÎÍ ñ 10% ýòàíîëà. Äàëåå äëÿ óëó÷øåíèÿ ðàâíîìåðíîñòè îêðàñêè ãåëü âûìà÷èâàþò 5 ìèí â 0,5% ðàñòâîðå æåëåçîñèíåðîäèñòîãî êàëèÿ (êðàñíîé êðîâÿíîé ñîëè). Ïîñëå òðåõêðàòíîãî îïîëàñêèâàíèÿ â âîäå ãåëü çàëèâàþò ðàñòâîðîì, ñîäåðæàùèì 0,2 ã íèòðàòà ñåðåáðà, 0,2 ã íèòðàòà àììîíèÿ 0,5 ìë 37% ôîðìàëüäåãèäà è 0,06 ìã áåíçîòðèàçîëà (àíòèâóàëèðóþùåãî ñðåäñòâà äëÿ ôîòîãðàôèè) â 100 ìë âîäû. Ãåëü â ðàñòâîðå îñâåùàþò ëàìïîé íàêàëèâàíèÿ ìîùíîñòüþ 500 Âò â òå÷åíèå 30 ìèí. Çàòåì ðàñòâîð ñëèâàþò è ãåëü, íå ñïîëàñêèâàÿ, çàëèâàþò 200 ìë 3% ðàñòâîðà Na2ÑÎ3, ñîäåðæàùåãî 0,1 ìë ôîðìàëüäåãèäà è 0,12 ìã áåíçîòðèàçîëà. Íå ïðåêðàùàÿ îñâåùåíèÿ, ðàñòâîð ñìåíÿþò 23 ðàçà äî äîñòèæåíèÿ æåëàåìîé èíòåíñèâíîñòè îêðàñêè áåëêîâ. Ïðîöåññ îêðàøèâàíèÿ ïðåðûâàþò ïîãðóæåíèåì ãåëÿ íà 5 ìèí â 1% ðàñòâîð ÑÍ3ÑÎÎÍ, à çàòåì ïðîìûâàþò åãî âîäîé.  ðåçóëüòàòå â ïðåïàðàòå äîëæíû áûòü îáíàðóæåíû 2 ïîëîñû, ñîîòâåòñòâóþùèå ëåãêîé è òÿæåëîé öåïÿì IgG. Ïðè ïîñëåäóþùåé îöåíêå àáçèìíîé àêòèâíîñòè ïîëó÷åííûõ ïðåïàðàòîâ IgG ðåêîìåíäóåòñÿ ïðîâåñòè ãåëü-ôèëüòðàöèþ êàòàëèòè÷åñêè àêòèâíûõ èììóíîãëîáóëèíîâ â äèññîöèèðóþùèõ óñëîâèÿõ (â ïðèñóòñòâèè 0,1 ìîëü ãëèöèí-HCl-áóôåðà ñ ðÍ 2,52,8) íà ìàòðèöå Toyopearl HW 55 (Toyosoda, ßïîíèÿ).  ñëó÷àå ïðèíàäëåæíîñòè êàòàëèòè÷åñêîé àêòèâíîñòè âûäåëåííîìó èììóíîãëîáóëèíîâîìó ïðåïàðàòó ìàêñèìóì ôåðìåíòàòèâíîé àêòèâíîñòè áóäåò ñîâïàäàòü ñ âåðøèíîé õðîìàòîãðàôè÷åñêîãî ïèêà, ñîîòâåòñòâóþùåãî IgG. 10 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ðåàáèëèòàöèîííûå èíäèâèäóàëüíûå ïðîãðàììû äëÿ áîëüíûõ è èíâàëèäîâ âñëåäñòâèå õðîíè÷åñêîãî îáñòðóêòèâíîãî áðîíõèòà 2. ÎÏÐÅÄÅËÅÍÈÅ ÝÍÄÎÍÓÊËÅÀÇÍÎÉ (ÄÍÊÀÇÍÎÉ) ÀÊÒÈÂÍÎÑÒÈ IGG À. Ïðèãîòîâëåíèå èñõîäíûõ ðàñòâîðîâ Ïðèãîòîâëåíèå 0,02 ìîëü òðèñ-HCl áóôåðà ðÍ 7,4 ñ 0,0004 ìîëü MgCl2. Òðèñ â êîëè÷åñòâå 0,6 ã ðàñòâîðÿþò â 25 ìë äèñòèëëèðîâàííîé âîäû. Ïîëó÷åííûå 25 ìë ðàñòâîðà òðèñ ñìåøèâàþò ñ 37 ìë 0,1í HCl è äîâîäÿò îáùèé îáúåì äèñòèëëèðîâàííîé âîäîé äî 200 ìë. Íà 100 ìë ïðèãîòîâëåííîãî áóôåðà áåðóò 203 ìêë 1Ì ðàñòâîðà MgCl2. Êîíòðîëü ðÍ îñóùåñòâëÿåòñÿ íà ðÍ-ìåòðå. Ïðèãîòîâëåíèå ðàñòâîðà ÄÍÊ. 1ìã ÄÍÊ îñòîðîæíûì ïèïåòèðîâàíèåì ðàñòâîðÿþò â 1ìë äèñòèëëèðîâàííîé âîäû. 1 ìë ïîëó÷åííîãî ðàñòâîðà ñìåøèâàþò ñ 2 ìë äèñòèëëèðîâàííîé âîäû. Ïðèãîòîâëåíèå ðàñòâîðà ðèâàíîëà 750 ìã ýòàêðèäèíà ëàêòàòà ðàñòâîðÿþò ïðè íàãðåâàíèè â 100 ìë äèñòèëëèðîâàííîé âîäû. Õðàíÿò â õîëîäèëüíèêå ïðè òåìïåðàòóðå 4°Ñ. Á. Ïîñòàíîâêà è îöåíêà ðåàêöèè Ðåàêöèÿ ñòàâèòñÿ â äóáëÿõ. Ê 0,2 ìë ðàñòâîðà ÄÍÊ (300350 ìêã/ìë) äîáàâëÿþò 0,1 ìë ïðåïàðàòà IgG (1 ìã/ìë) è 0,1 ìë 0,02 ìîëü òðèñ-HCl áóôåðà ðÍ 7,4 ñ 0,0004 ìîëü MgCl2. 11 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ðåàáèëèòàöèîííûå èíäèâèäóàëüíûå ïðîãðàììû äëÿ áîëüíûõ è èíâàëèäîâ âñëåäñòâèå õðîíè÷åñêîãî îáñòðóêòèâíîãî áðîíõèòà  êîíòðîëå âìåñòî 0,1ìë èììóíîãëîáóëèíîâ èñïîëüçóþò 0,1 ìë 0,9% NaCl. Ïîñòàíîâêà ðåàêöèè îñóùåñòâëÿåòñÿ â öåíòðèôóæíûõ ïðîáèðêàõ. Ïîñëå èíêóáàöèè â òå÷åíèå 20 ÷àñîâ ïðè 37°Ñ íà ïîâåðõíîñòü ïðîá íàñëàèâàåòñÿ 20 ìêë 0,75% ðàñòâîðà ðèâàíîëà, âñå âñòðÿõèâàþò äî ïîëó÷åíèÿ ñãóñòêà. Çàòåì ñãóñòîê äâóêðàòíî îòìûâàþò äèñòèëëèðîâàííîé âîäîé è ðàñòâîðÿþò ïðè íàãðåâàíèè â 0,5 ìë 1í HCl, ïîñëå ÷åãî îáúåì äîâîäÿò äî 2 ìë äèñòèëëèðîâàííîé âîäîé. Ïðîâîäÿò ñïåêòðîôîòîìåòðèþ ïðè 410 íì. Èç ñðåäíåãî çíà÷åíèÿ îïòè÷åñêîé ïëîòíîñòè êîíòðîëüíûõ ïðîá âû÷èòàþò ñðåäíåå çíà÷åíèå îïûòíûõ ïðîá è äåëÿò ýòîò ïîêàçàòåëü íà ñðåäíåå çíà÷åíèå êîíòðîëåé. Ïîëó÷åííîå çíà÷åíèå (â ïðîöåíòàõ) ïåðåâîäÿò â åäèíèöû àêòèâíîñòè ôåðìåíòà. Äëÿ ýòîãî åãî ñðàâíèâàþò ñ êàëèáðîâî÷íîé êðèâîé, ïîñòðîåííîé ïî ñòàíäàðòíîìó ïðåïàðàòó ÄÍÊàçû ëèáî äàííîå çíà÷åíèå (DNASE) ïîäñòàâëÿþò â óðàâíåíèå ðåãðåññèè âèäà Åä=0,0181(DNASE)0,2644 è îïðåäåëÿþò åäèíèöû àêòèâíîñòè ñ ïîìîùüþ êîìïüþòåðà. Îáíàðóæåíèå ÄÍÊàçíîé àêòèâíîñòè IgG ñâûøå 0,045 åä. ïîäòâåðæäàåò íàëè÷èå â òèðåîèäíîé ïàòîëîãèè àóòîèììóííîãî êîìïîíåíòà, à óðîâåíü àêòèâíîñòè ñâûøå 0,0490,05 åä. ïîçâîëÿåò äèôôåðåíöèðîâàòü àóòîèììóííûé òèðåîèäèò îò äðóãèõ çàáîëåâàíèé ùèòîâèäíîé æåëåçû. 12 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ðåàáèëèòàöèîííûå èíäèâèäóàëüíûå ïðîãðàììû äëÿ áîëüíûõ è èíâàëèäîâ âñëåäñòâèå õðîíè÷åñêîãî îáñòðóêòèâíîãî áðîíõèòà ÂÎÇÌÎÆÍÛÅ ÎÑËÎÆÍÅÍÈß È ÎØÈÁÊÈ Ïðè î÷èñòêå ñûâîðîòî÷íûõ èììóíîãëîáóëèíîâ âîçìîæíû ñëåäóþùèå îøèáêè è çàòðóäíåíèÿ. Íåëüçÿ èñïîëüçîâàòü õèëåçíóþ ñûâîðîòêó èëè ñûâîðîòêó ïîñëå ãåìîëèçà. Âîçìîæíà íåêà÷åñòâåííàÿ ôèëüòðàöèÿ ÷åðåç àêòèâèðîâàííûé óãîëü (ïðèìåñü ÷àñòè÷åê óãëÿ â ïðåïàðàòå). Ðåêîìåíäóåòñÿ àêêóðàòíî óëîæèòü ôèëüòð íà äíî êîëîíêè è ïðîâåðèòü êà÷åñòâî ôèëüòðàöèè, ïðåäâàðèòåëüíî ïðîïóñòèâ ÷åðåç êîëîíêó äèñòèëëèðîâàííóþ âîäó. ×àñòè÷êè óãëÿ ïîñëå íåêà÷åñòâåííîé ôèëüòðàöèè ìîæíî çàäåðæàòü ïðè ÄÝÀÝ õðîìàòîãðàôèè â âåðõíåì ñëîå àíèîíîîáìåííèêà, êîòîðûé çàòåì ñëåäóåò óäàëèòü. Ïðè îïðåäåëåíèè ÄÍÊàçíîé àêòèâíîñòè âîçìîæíû ñëåäóþùèå îñëîæíåíèÿ.  êîíòðîëüíûõ ïðîáàõ ÷åðåç 24 ÷ íå îáðàçóåòñÿ ñãóñòîê ÄÍÊ. Ðåêîìåíäóåòñÿ ïðîâåðÿòü ñãóñòêîîáðàçîâàíèå â êîíòðîëüíûõ ïðîáàõ ïåðåä ïîñòàíîâêîé ðåàêöèè. Çíà÷åíèå îïòè÷åñêîé ïëîòíîñòè êîíòðîëüíûõ ñãóñòêîâ äîëæíî íàõîäèòüñÿ â ïðåäåëàõ 0,30,45 åä. îïòè÷åñêîé ïëîòíîñòè ïðè äëèíå âîëíû 410 íì. 13 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ