Документ 2342263

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
«ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ»
На правах рукописи
Соколов Алексей Викторович
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КОМПЛЕКСОВ
ЦЕРУЛОПЛАЗМИНА С БЕЛКАМИ ЛЕЙКОЦИТОВ И ИХ РОЛЬ ПРИ
ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССАХ
03.01.04 – Биохимия
Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук
Научные консультанты:
Васильев Вадим Борисович,
доктор медицинских наук, профессор,
заведующий Отделом молекулярной генетики
ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»
Панасенко Олег Михайлович,
доктор биологических наук, профессор,
заведующий Лабораторией физико-химических методов
исследования и анализа Отдела биофизики
ФГБУН НИИ физико-химической медицины ФМБА России
Санкт-Петербург – 2015 г.
2
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ ................................................................................................................................... 5
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .......................................................................................................... 12
1.1. Структура и функции церулоплазмина ............................................................................. 12
1.2. Участие белковых факторов нейтрофилов и эозинофилов в воспалительных реакциях
...................................................................................................................................................... 27
1.2.1. Участники респираторного взрыва нейтрофилов и эозинофилов: оксидазы и
пероксидазы ................................................................................................................................ 29
1.2.2. Протеолитические ферменты лейкоцитов ..................................................................... 40
1.2.3. Железо-связывающие белки лейкоцитов ....................................................................... 44
1.2.4. Белки лейкоцитов, влияющие на стабильность мембраны микроорганизмов ........... 48
1.2.5. Окислительная модификация липопротеинов, сопровождающая воспаление .......... 49
1.3. Заключение по обзору литературы .................................................................................... 55
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ................................................................ 57
2.1. Реактивы, использованные в работе .................................................................................. 57
2.1.1. Получение опсонизированного зимозана ...................................................................... 58
2.1.2. Получение бромциана ...................................................................................................... 58
2.2. Клеточные методы............................................................................................................... 59
2.2.1. Выделение нейтрофилов .................................................................................................. 59
2.2.2. Измерение индекса фагоцитоза нейтрофилов ............................................................... 59
2.2.3. Измерениe продукции супероксидных анион-радикалов нейтрофилами................... 59
2.2.4. Измерениe продукции пероксида водорода нейтрофилами ......................................... 60
2.2.5. Анализ проатерогенности липопротеинов низкой плотности при культивировании с
моноцитами ................................................................................................................................. 60
2.3. Хроматографические методы ............................................................................................. 61
2.3.1. Синтез сорбентов .............................................................................................................. 61
2.3.1.1 Иммобилизация соединений, содержащих NH2-группу, на BrCN-активированной
Сефарозе и агарозе ..................................................................................................................... 61
2.3.1.2. Получение аминоэтил-(АЕ)-агарозы ........................................................................... 62
2.3.2. Гель-фильтрация ............................................................................................................... 62
2.3.3. Аффинная хроматография ............................................................................................... 62
2.3.3.1. Аффинная хроматография экстракта лейкоцитов на иммобилизованном
церулоплазмине .......................................................................................................................... 62
2.3.3.2. Аффинная хроматография пероксидазы эозинофилов на иммобилизованном
церулоплазмине .......................................................................................................................... 62
2.3.3.3. Измерение константы диссоциации комплекса церулоплазмин-азуроцидин ......... 63
2.3.3.4.
Аффинная
хроматография
липопротеинов
низкой
плотности
на
иммобилизованной миелопероксидазе..................................................................................... 63
2.4. Спектральные методы исследования ................................................................................. 63
2.4.1. Спектрофотометрия ......................................................................................................... 63
2.4.2. Фотонная корреляционная спектроскопия .................................................................... 64
2.4.3. Электронный парамагнитный резонанс ......................................................................... 65
2.4.4. Хемилюминесценция ....................................................................................................... 65
2.5. Измерение активности ферментов ..................................................................................... 66
2.5.1. Измерение активности миелопероксидазы и пероксидазы эозинофилов ................... 66
2.5.1.1. Измерение пероксидазной активности ........................................................................ 66
2.5.1.2. Кинетика пероксидазной активности миелопероксидазы ......................................... 67
2.5.1.3. Кинетика пероксидазной активности пероксидазы эозинофилов ............................ 67
2.5.1.4. (Псевдо)галогенирующая активность миелопероксидазы и пероксидазы
эозинофилов ................................................................................................................................ 67
2.5.1.5. Измерение утилизации пероксида водорода миелопероксидазой с помощью
сенсора на основе пленок берлинской лазури ......................................................................... 68
2.5.2. Измерение оксидазной активности церулоплазмина .................................................... 68
3
2.5.2.1. Пара-фенилендиамин-оксидазная активность церулоплазмина ............................... 68
2.5.2.2. Кинетика пара-фенилендиамин-оксидазной активности церулоплазмина ............. 69
2.5.2.3. Кинетика ферроксидазной активности церулоплазмина ........................................... 69
2.5.2.4. Измерение супероксиддисмутазной активности церулоплазмина ........................... 69
2.5.3. Измерение активности эластазы и протеиназы 3 .......................................................... 70
2.5.3.1. Кинетика активности эластазы и протеиназы 3 ......................................................... 70
2.5.4. Измерение активности катепсина G ............................................................................... 70
2.5.4.1. Кинетика активности катепсина G .............................................................................. 70
2.5.5. Измерение активности тромбина .................................................................................... 70
2.5.6. Измерение активности 5-липоксигеназы ....................................................................... 71
2.6. Электрофоретические методы............................................................................................ 71
2.6.1. Диск-электрофорез в щелочной системе........................................................................ 71
2.6.1.1. Выявление о-дианизидин-оксидазной активности после электрофореза ................ 72
2.6.2. Диск-электрофорез в кислой системе ............................................................................. 72
2.6.2.1. Выявление пероксидазной активности после электрофореза ................................... 72
2.6.3. Электрофорез в кислой системе в присутствии мочевины .......................................... 73
2.6.4. Диск-электрофорез в нейтральной системе ................................................................... 73
2.6.5. Электрофорез в щелочной системе в присутствии SDS ............................................... 73
2.6.5.1. Выявление желатиназной активности in situ .............................................................. 74
2.6.5.2. Выявление пероксидазной активности in situ ............................................................. 74
2.6.6. Электрофорез в присутствии SDS в высокомолярной Tris-буферной системе.......... 74
2.6.7. Электрофорез в четырехслойном полиакриламидном геле ......................................... 75
2.6.8. Масс-спектрометрия фрагментов трипсинолиза после электрофореза ...................... 75
2.6.9. Анализ N-концевой аминокислотной последовательности ......................................... 76
2.7. Получение белковых препаратов ....................................................................................... 76
2.7.1. Выделение церулоплазмина плазмы крови ................................................................... 76
2.7.1.1. Выделение церулоплазмина с помощью протамин-Сефарозы ................................. 76
2.7.1.2. Выделение церулоплазмина с помощью неомицин-агарозы .................................... 77
2.7.1.3. Выделение церулоплазмина на АЕ-агарозе ................................................................ 78
2.7.2. Выделение лактоферрина грудного молока................................................................... 79
2.7.3. Выделение белков нейтрофильных лейкоцитов............................................................ 79
2.7.3.1. Выделение миелопероксидазы ..................................................................................... 80
2.7.3.2. Выделение серпроцидинов ........................................................................................... 80
2.7.3.3. Выделение СТАВ-миелопероксидазы и СТАВ-пероксидазы эозинофилов............ 81
2.7.4. Выделение липопротеинов плазмы крови ..................................................................... 81
2.8. Иммунохимические методы ............................................................................................... 82
2.8.1. Подготовка антигенов для иммунизации ....................................................................... 82
2.8.2. Иммунизация кроликов и крыс ....................................................................................... 82
2.8.3. Выделение иммуноглобулинов G сыворотки ................................................................ 82
2.8.4. Двойная радиальная иммунодиффузия .......................................................................... 83
2.8.5. Ракетный иммуноэлектрофорез ...................................................................................... 83
2.8.6. Вестерн-блоттинг ............................................................................................................. 84
2.8.7. Твердофазный иммуноферментный анализ ................................................................... 85
2.8.7.1. Сэндвич иммуноферментный анализ миелопероксидазы ......................................... 85
2.8.7.2. Конкурентный иммуноферментный анализ церулоплазмина .................................. 86
2.8.7.3. Иммуноферментный анализ азуроцидина .................................................................. 86
2.8.8. Иммунопреципитация церулоплазмина из плазмы крови............................................ 87
2.9. Антимикробная активность лактоферрина и миелопероксидазы................................... 87
2.10. Модификация белков и липопротеинов низкой плотности .......................................... 87
2.10.1. Получение апо-формы церулоплазмина ...................................................................... 87
2.10.2. Получение протеолизованного церулоплазмина ........................................................ 88
2.10.3. Получение лактоферрина, насыщенного железом и медью ....................................... 88
2.10.4. Модификация церулоплазмина окислителями ............................................................ 88
2.10.5. Модификация липопротеинов низкой плотности окислителями .............................. 89
4
2.11. Анализ трехмерной структуры белков и их комплексов ............................................... 89
2.12. Статистическая обработка результатов ........................................................................... 89
2.13. Получение образцов от здоровых доноров, пациентов с воспалительными
заболеваниями и лабораторных животных .............................................................................. 90
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ........................................................................................................................ 91
3.1. Структура комплексов, формируемых при взаимодействии церулоплазмина с
лактоферрином и миелопероксидазой...................................................................................... 91
3.1.1. Исследование методом гель-фильтрации ...................................................................... 91
3.1.2. Исследование методом фотонной корреляционной спектроскопии ........................... 93
3.2. Идентификация белков лейкоцитов, взаимодействующих с церулоплазмином .......... 95
3.2.1. Анализ белков экстракта лейкоцитов, сорбирующихся на иммобилизованном
церулоплазмине .......................................................................................................................... 96
3.2.2. Анализ комплексов церулоплазмина, выделяемых при очистке его препаратов ...... 97
3.2.3. Идентификация компонентов комплексов, обнаруживаемых у пациентов при
воспалительных процессах ...................................................................................................... 100
3.2.3.1. Идентификация компонентов комплексов ЦП, содержащих МПО и апоВ-100содержащие липопротеины ..................................................................................................... 101
3.3. Изучение взаимодействия церулоплазмина с серпроцидинами и пероксидазой
эозинофилов .............................................................................................................................. 102
3.3.1. Изучение взаимодействия церулоплазмина с серпроцидинами ................................ 102
3.3.2. Изучение взаимодействия церулоплазмина и пероксидазы эозинофилов ............... 105
3.4. Изучение взаимного влияния церулоплазмина и белков лейкоцитов на их
ферментативные свойства ....................................................................................................... 108
3.4.1. Влияние серпроцидинов и пероксидазы эозинофилов на ферментативные свойства
церулоплазмина ........................................................................................................................ 109
3.4.2. Изучение механизма ингибирования церулоплазмином миелопероксидазы,
пероксидазы эозинофилов и 5-липоксигеназы ...................................................................... 110
3.4.3. Влияние церулоплазмина на активность серпроцидинов .......................................... 127
3.4.4. Влияние апо-лактоферрина на деструкцию церулоплазмина индуцированную
пероксидом водорода ............................................................................................................... 130
3.5. Изучение протеолитической деградации церулоплазмина in vivo и in vitro ............... 140
3.5.1. Протеолитическая деградация церулоплазмина в биологических жидкостях при
воспалении ................................................................................................................................ 142
3.5.2. Идентификация протеиназ, деградирующих препараты церулоплазмина ............... 144
3.6. Многокомпонентные комплексы церулоплазмина ........................................................ 152
3.6.1. Свойства комплексов церулоплазмина, миелопероксидазы и апоВ-100-содержащих
липопротеинов .......................................................................................................................... 153
3.6.2. Проатерогенное действие миелопероксидазы при связывании с липопротеинами 165
3.6.2.1. Сродство миелопероксидазы к модифицированным липопротеинам ................... 165
3.6.2.2. Проатерогенные свойства модифицированных липопротеинов ............................ 166
3.7. Антиоксидантные свойства ЦП, модифицированного окислителями ......................... 172
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ........................................................................................ 177
5. ВЫВОДЫ .............................................................................................................................. 203
6. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ .................................................................................................. 204
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ .................................................................................................... 206
8. ПРИЛОЖЕНИЕ .................................................................................................................... 231
5
Вся моя мысль в том, что ежели люди порочные
связаны между собой и составляют силу, то
людям честным надо сделать только то же
самое. Ведь как просто.
Л.Н. Толстой
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность
темы
исследования.
Повреждение
клеток
или
присутствие
инфекционного раздражителя вызывает в организме человека развитие воспалительного
процесса, который способствует элиминации продуктов повреждения и раздражающих
агентов, что в конечном итоге приводит к восстановлению зоны повреждения.
Воспаление является неотъемлемой частью большинства патологических процессов и
сопровождается определенными паттернами реакций: покраснение, боль, отек, жар и
нарушение функции. Воспалительная реакция реализуется в основном за счет механизмов
врожденного иммунитета, ассоциированных с активностью нейтрофилов (НФ), которые
могут приводить к повреждению собственных биополимеров организма в случае
избыточного развития воспаления [Scapini and Cassatella, 2014; Hazeldine et al., 2014].
Изучение молекулярных механизмов взаимодействия участников воспалительных
реакций
может
быть
полезно
для
разработки
методов
диагностики
тяжести
воспалительного процесса, оценки адекватности применяемой противовоспалительной
терапии, а также для создания новых противовоспалительных препаратов.
В настоящее время известно, что при развитии воспаления происходит индукция
синтеза ряда белков, называемых положительными белками острой фазы воспаления.
Концентрация в плазме крови некоторых из них, например C-реактивного белка и
сывороточного амилоида P, возрастает в первые дни воспалительной реакции в 300 раз,
достигая значений 0,03 мкМ. Одним из превалирующих белков острой фазы воспаления
является церулоплазмин (ЦП, ферро:O2-оксидоредуктаза). Его концентрация достигает 10
мкМ [Gitlin, 1988], что сравнимо с увеличением концентрации таких мажорных белков
острой фазы воспаления, как фибриноген и гаптоглобин [Jain et al., 2011]. Исследования
ЦП в Институте экспериментальной медицины (Санкт-Петербург) продолжаются уже
более 40 лет [Шапошников и соавт., 1967]. Однако в течение этого времени так и не
сформированы ясные представления о (пато)физиологической роли данной медьсодержащей ферроксидазы [Gutteridge and Stocks 1981; Floris et al., 2000; Musci et al.,
2014].
6
Особенности наследственных заболеваний, связанных с нарушением синтеза ЦП:
ацерулоплазминемии (функциональные дефекты гена ЦП) и болезни Вильсона–
Коновалова (дефекты гена медь-транспортной АТФазы 7В), с одной стороны,
раскрывают часть функций данного белка, с другой – демонстрируют наличие систем,
способных компенсировать функции ЦП [Vassiliev et al., 2005; Vashchenko and
MacGillivray, 2013]. Так, при ацерулоплазминемии отмечены массивные отложения
закисного железа в тканях, провоцирующие окислительный стресс, который поражает в
первую очередь нервную систему и поджелудочную железу, приводя к нейродегенерации
и сахарному диабету. Однако, несмотря на то, что на долю ЦП приходится около 90–95 %
меди, обнаруживаемой в сыворотке крови, метаболизм меди не нарушен ни у людей,
больных ацерулоплазминемией, ни у мышей в экспериментах с выключенным геном ЦП
[Meyer et al., 2001; Kono, 2013]. Доля несвязанной с ЦП меди в плазме крови может быть
больше, чем предполагали раньше [Twomey et al., 2007]. Болезнь Вильсона–Коновалова,
приводящая к накоплению меди в нервной ткани, печени и других органах,
характеризуется пониженным содержанием активного ЦП в плазме крови пациентов.
Однако до сих пор не отмечено каких-либо значительных нарушений метаболизма железа
у таких больных, что можно объяснить наличием альтернативной ферроксидазы II,
ассоциированной с медь-содержащими липопротеинами низкой плотности. Кроме того,
мембраносвязанный гомолог ЦП, гефестин, дополняет функции ЦП [Fox, 2003].
Степень разработанности темы исследования. Возвращаясь к возможным функциям
ЦП при воспалительных реакциях, следует отметить роль функционирования гена ЦП в
выживании нейронов при воспалении. Так, у мышей с выключенным геном ЦП в ответ на
введение бактериального липополисахарида (ЛПС) происходят накопление закисного
железа, значительная демиелинизация и гибель нейронов по сравнению с контрольными
животными. Заражение контрольных мышей S. pneumonia приводит к увеличению
синтеза ЦП клетками, выстилающими сосудистую стенку, а у нокаутированных по гену
ЦП мышей в тех же клетках увеличивается синтез P-селектина. Это указывает на участие
ЦП в регуляции проницаемости барьера между кровеносной и нервной системами.
Вероятно, ЦП защищает нервную систему от токсических факторов микробной инфекции
[Glezer et al., 2007]. Наконец, мыши, нокаутированные по гену ЦП, не выживают при
развитии экспериментального колита, что, как считают авторы исследования, связано с
отсутствием защитного противовоспалительного действия ЦП [Bakhautdin et al., 2013].
Одним из способов модуляции функций ЦП при воспалении может быть его участие в
белок-белковых взаимодействиях. В 90-х годах прошлого века и в начале нынешнего
столетия были описаны комплексы ЦП с протеином C [Walker and Fay, 1990],
7
плацентарной щелочной фосфатазой [Hilton et al., 1995], миелопероксидазой [Segelmark et
al., 1997], ферритином [Juan and Aust, 1998], нейропептидом PACAP38 [Tams et al., 1999],
ферропортином 1 [Jeong and David, 2003] и фактором, ингибирующим миграцию
макрофагов [Meyer-Siegler et al., 2006].
Исследования,
проведенные
в
нашей
лаборатории
за
последние
15
лет,
продемонстрировали способность ЦП образовывать комплексы с белками НФ [Vasilyev,
2010]. В частности, нами были обнаружены in vivo комплексы ЦП с лактоферрином (ЛФ)
и миелопероксидазой (МПО) – основными белками, секретируемыми НФ при воспалении
из секреторных и азурофильных гранул соответственно. Оказалось, что образование
комплексов катионных белков с анионным ЦП довольно стереотипно. Вместе с тем
описанные нами взаимодействия специфичны, и в настоящее время из множества
обнаруженных in vitro комплексов ЦП только его комплексы с ЛФ и МПО обнаружены in
vivo [Соколов и соавт., 2007].
Цель.
Цель
работы
состояла
в
изучении
структурно-функциональных
взаимоотношений компонентов в комплексах, образуемых церулоплазмином с белками
лейкоцитов и плазмы крови, участвующих в воспалительных реакциях.
Задачи. Для достижения указанной цели поставлены следующие задачи:
1.
Идентифицировать белки, формирующие комплексы с церулоплазмином при
воспалительных процессах.
2.
Исследовать сайты взаимодействия церулоплазмина с белками лейкоцитов и
охарактеризовать сродство компонентов в комплексах.
3.
Уточнить стехиометрию компонентов в комплексах церулоплазмина с
миелопероксидазой и лактоферрином.
4.
Изучить протеолитические системы, регулирующие активность церулоплазмина
при воспалительных состояниях.
5.
Исследовать механизмы влияния церулоплазмина на провоспалительные
функции
катионных
белков
лейкоцитов:
миелопероксидазы,
пероксидазы
эозинофилов, 5-липоксигеназы и белков серпроцидинового семейства.
6.
Осуществить моделирование окислительной деструкции церулоплазмина под
действием пероксида водорода и HOCl/HOBr и поиск протективных механизмов,
препятствующих его повреждению. Изучить влияние модификации церулоплазмина на
его антиоксидантные свойства.
7.
Изучить избирательность взаимодействия церулоплазмина в плазме крови с
белками лейкоцитов и возможность образования многокомпонентных комплексов.
Научная новизна:
8
1.
Охарактеризована стехиометрия комплексов церулоплазмина с лактоферрином и
миелопероксидазой.
2.
Впервые
описаны
серпроцидинов,
комплексы
пероксидазой
церулоплазмина
эозинофилов,
с
белками
семейства
матриксными
5-липоксигеназой,
металлопротеиназами 2 и 12, а также с тромбином.
3.
Впервые
выявлены
мультикомпонентные
комплексы
церулоплазмина
с
миелопероксидазой и липопротеинами плазмы кровы у пациентов с атеросклерозом.
Показано
антиатерогенное
липопротеинов
низкой
действие
интактного
плотности,
церулоплазмина
в
модифицированных
отношении
хлорирующей
миелопероксидазой.
4.
Впервые исследованы изменения свойств церулоплазмина в комплексах с белками
лейкоцитов, охарактеризованы специфичность образуемых комплексов и сродство их
компонентов.
5.
Выявлены конкурентные механизмы ингибирования интактным церулоплазмином
провоспалительных свойств пероксидазы эозинофилов и 5-липоксигеназы.
6.
Прояснен механизм защитного действия апо-лактоферрина при деструкции
церулоплазмина
пероксидом
водорода,
а
также
тиоцианата
при
повреждении
церулоплазмина системой миелопероксидаза/пероксид водорода/хлорид (бромид).
7.
Показано, что церулоплазмин, модифицированный HOCl, HOBr или HOSCN,
сохраняет способность снижать продукцию активных форм кислорода активированными
нейтрофилами.
8.
Впервые охарактеризованы системы протеиназ, разрушающих церулоплазмин in
vivo. Тромбин идентифицирован как протеиназа, вызывающая ограниченный протеолиз
церулоплазмина при получении и хранении его препаратов. Показано образование
комплекса между церулоплазмином и тромбином.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты проведенного
исследования
позволяют
уточнить
молекулярные
механизмы
регуляции
церулоплазмином воспалительных процессов, сопровождающих многие патологические
состояния. Полученные в ходе исследования характеристики компонентов комплексов,
образуемых с участием церулоплазмина,
позволяют дополнить сведения об общих
механизмах образования и о свойствах белок-белковых комплексов. Показано, что
идентифицированные
комплексы
церулоплазмина
могут
быть
дополнительными
маркерами течения воспалительного процесса, а характеристика протеолитической
деградации церулоплазмина в биологических жидкостях может быть одним из маркеров
осложнения
воспаления.
Изученные
в
ходе
исследования
механизмы
противовоспалительного действия церулоплазмина могут быть полезными для отработки
9
стратегии лечения осложнений воспалительных заболеваний. Разработанные в ходе
исследования методы выделения недеградированного церулоплазмина могут составить
основу новых технологий промышленного получения церулоплазмина с целью создания
диагностических и лекарственных препаратов на его основе. Полученные данные могут
быть использованы при преподавании курсов биохимии, иммунологии и цитологии в
ВУЗах биологического и медицинского профиля.
Методология и методы исследования. Исследование структурно-функциональных
характеристик комплексов ЦП с белками, участвующими в воспалительных процессах,
выполнено
с
использованием
высокоочищенных
препаратов
белков,
а
также
биологических жидкостей, полученных от пациентов с воспалительными заболеваниями.
С
помощью
биохимических,
биофизических
охарактеризованы структурная организация и
и
иммунохимических
методов
изменения функций компонентов
комплексов, состоящих из ЦП и белков-партнеров. Изучено действие ЦП на
провоспалительные функции НФ и моноцитов/макрофагов. Для очистки белков и
антител, идентификации белков и комплексов, характеристики изменения свойств белков
и клеток было использовано более 50 методов.
Основные положения, выносимые на защиту:
1.
Взаимодействие церулоплазмина с лактоферрином и миелопероксидазой приводит
к образованию пентамера: 2ЛФ-2ЦП-МПО.
2.
Ингибирование церулоплазмином миелопероксидазы, пероксидазы эозинофилов и
5-липоксигеназы эффективно в случае интактности связи, соединяющей 5-й и 6-й домены
церулоплазмина.
3.
Среди представителей семейства серпроцидинов наибольшим сродством к
церулоплазмину обладает азуроцидин (Kd ~ 13 нМ).
4.
Тромбин гидролизует церулоплазмин по сайтам K887–V888 и R481–S482, приводя
к нарушению противовоспалительных функций белка.
5.
В плазме крови миелопероксидаза образует многокомпонентные комплексы с
церулоплазмином и апоВ-100-содержащими липопротеинами. Интактный церулоплазмин
снижает проатерогенное действие хлорирующей миелопероксидазы на липопротеины
низкой плотности.
Степень достоверности и апробации результатов. Результаты получены с помощью
современных методов. Объем выборок и число независимых экспериментов позволил
оценить значимость результатов после обработки с помощью адекватных методов
статистического анализа. Материалы работы докладывались на следующих конференциях:
V, VI и VII национальных научно-практических конференциях с международным
10
участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека»
(Смоленск, 2007, 2009, 2011), VIIIth, Xth, XIth International Conference on Lactoferrin
“Structure, Function & Applications” (Франция, Ницца, 2007; Мексика, Масатлан, 2011;
Италия, Рим 2013), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных
биологов
(Новосибирск,
2008),
Международных
конференциях
«Молекулярные,
мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (2008, 2012, 2014,
Минск, Беларусь), IV, V, VI, VII, VIII и IX крымских конференциях «Окислительный
стресс и свободнорадикальные патологии» (Украина, Судак, 2008–2013), Biochemical
Society London Conference “Experimental approaches to protein:protein interactions”
(Великобритания, Шеффилд, 2010), Международной конференции «Фундаментальные и
прикладные аспекты воспаления» (Беларусь, Минск, 2011), IV Съезде биофизиков России
(Нижний Новгород, 2012), IV Международном симпозиуме «Взаимодействие нервной и
иммунной систем в норме и патологии» (Санкт-Петербург, 2013), 38th FEBS Congress
(Санкт-Петербург, 2013), XXVI Congress of International Society of Thrombosis and
Haemostasis (Нидерланды, Амстердам, 2013), 11th International Conference Biology and
Synchrotron Radiation (Германия, Гамбург, 2013), 8th International Human Peroxidase
Meeting (Австралия, Сидней, 2013), Biochemical Society London Conference “The Biological
and Biomedical Consequences of Protein Moonlighting” (Великобритания, Лондон, 2014).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 23 статьи в рецензируемых
журналах, из них 19 – в журналах, рекомендованных ВАК РФ, представленных в
“PubMed”; получен патент РФ.
Личный вклад соискателя. Автор проанализировал литературу по проблеме
исследования, осуществил планирование экспериментов и получил основную часть
результатов, которые представил в докладах на конференциях и опубликовал в научных
статьях. Соискателем были разработаны методы очистки белков; оптимизированы
методы определения их ферментативной активности; получены аффинные сорбенты, с
использованием которых выделены белковые препараты и получены моноспецифические
поликлональные антитела к ним; проведена биохимическая оценка свойств изучаемых
белковых
комплексов;
отработаны
методы
определения
белков
с
помощью
иммуноферментного анализа; выявлены комплексы в образцах биологических жидкостей;
подготовлены образцы для масс-спектрометрического анализа; проведена статистическая
обработка полученных данных. Рентгеноструктурные исследования ЦП и его комплексов
проведены к. ф–м. н. В.Р. Самыгиной (Институт Кристаллографии РАН, г. Москва) на
станции синхротронного излучения BW6, DESY в сотрудничестве с Г. Бартуником и Д.И.
Свергуном (Гамбург, Германия). Исследования деструкции ЦП под действием пероксида
водорода проведены к. б. н. К.В. Соловьѐвым и к. б. н. М.О. Пулиной (ФГБНУ «ИЭМ»,
11
Санкт-Петербург). Опыты по влиянию ЦП на активность 5-липоксигеназы выполнены
асп. Е.А. Голенкиной и д. б. н. Г.Ф. Судьиной (НИИ Физико-химической биологии им.
Белозерского, МГУ, г. Москва). Опыты по исследованию продукции пероксида водорода
нейтрофилами выполнены асп. Д.В. Григорьевой и к. б. н. И.В. Горудко (Белорусский
государственный университет, г. Минск).
Структура диссертации. Диссертация построена по традиционной схеме и содержит
разделы «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты»,
«Обсуждение результатов», «Выводы», «Список сокращений» «Список литературы»,
включающий 448 источников, из них 44 – отечественных, и «Приложение». Диссертация
изложена на 232 страницах. Результаты и обсуждение представлены в 23 таблицах и
иллюстрированы 67 рисунками.
Финансовая поддержка и благодарности. Работа выполнена при поддержке грантов
РФФИ: №№ 05-04-48765, 06-04-48602, 08-04-00905, 09-04-00742, 09-04-01059, 10-0400820, 11-04-01262, 12-04-00301, 13-04-01186, 14-04-00807, грантов президента РФ: МК1484.2012.4, МК-6062.2014.4, а также программы РАМН «Протеом человека».
Автор глубоко признателен научным консультантам диссертационной работы
профессору Вадиму Борисовичу Васильеву и профессору Олегу Михайловичу Панасенко.
Автор благодарит за всестороннюю помощь – Валерию Александровну Костевич,
Елену Тихоновну Захарову, Кирилла Владимировича Соловьѐва, Марию Олеговну
Пулину, Михаила Николаевича Берлова, Ольгу Леонидовну Рунову, Валерию Ролановну
Самыгину, Галину Фѐдоровну Судьину, Дарью Владимировну Григорьеву, Ирину
Владимировну Горудко, Марину Николаевну Карпенко, Ирину Ивановну Власову,
Андрея Васильевича Чеканова, Владимира Николаевича Прозоровского, Владимира
Валерьевича Егорова, Наталью Андреевну Грудинину.
Автор благодарит за бесценный опыт профессора Михаила Михайловича Шавловского
и профессора Владимира Николаевича Кокрякова.
Глубочайшую
признательность
автор
выражает
Владимировне и Виктору Николаевичу Соколовым.
своим
родителям
–
Нине
12
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Структура и функции церулоплазмина
Церулоплазмин (ЦП) был впервые выделен из сыворотки крови человека и свиней
шведскими учеными Холмбергом и Лауреллом в 1944 году. В течение последующих лет
ЦП был охарактеризован как медь-содержащий белок и получил название, которое в
переводе с греческого означает «небесно-голубой белок плазмы» [Holmberg, 1944;
Holmberg and Laurell, 1948; Holmberg and Laurell, 1951]. ЦП относится к
2-глобулиновой
фракции белков плазмы крови и является гликопротеином. С аминокислотными
остатками (а. о.) молекулы ЦП прочно связаны 6 ионов меди и ион кальция [Zaitseva et
al., 1996; Bento et al., 2007]. ЦП человека состоит из одной полипептидной цепи [Ryden,
1971]. Ее длина, как показало определение первичной структуры белка, составляет 1046 а.
о., и молекула может быть разделена на три гомологичных купредоксиновых домена
[Ortel et al., 1984]. Однако традиционно каждый из купредоксиновых доменов разделяют
на два – таким образом, молекула ЦП состоит из 6 гомологичных доменов (рис. 1.1).
Суммарная молекулярная масса (М) а.о. ЦП – 120085 Да, а М молекулы в целом, с учетом
углеводных цепей и ионов меди, – около 132 кДа. По данным исследования кристаллов М
(ЦП) ~ 132 4 кДа [Magdoff-Fairchild et al., 1969].
Согласно данным рентгеноструктурного анализа, молекула ЦП содержит 6 прочно
связанных ионов меди трех типов, классифицируемых на основании их спектральных
характеристик [Zaitseva et al., 1996]. Три из них - ионы «голубой» меди (I типа), один –
Cu2+ II типа, оставшиеся два составляют диамагнитный центр III типа (таблица 1.1).
Распределение их по доменам показано на рис. 1.1, в, г. Диамагнитная пара ионов меди III
типа обеспечивает сохранение стабильной структуры молекулы ЦП [Vachette et al., 2002],
играя роль «застежки» в холо-ЦП (рис. 1.1, а, б). Низкоаффинное связывание седьмого
иона меди, экспонированного на молекуле ЦП, обеспечивает H426 [Mukhopadhyay et al.,
1997]; этому иону приписывают прооксидантные свойства. В четвертом и шестом
доменах ЦП расположены лабильные сайты связывания катионов (Cu2+, Co2+, Fe2+),
необходимые для проявления ферроксидазной активности фермента [Lindley et al., 1997].
В первом домене молекулы ЦП расположен сайт для связывания иона Ca2+ (K109, N124,
D127, D128), который гомологичен сайту связывания Ca2+ в V факторе свертывания
крови. Три иона Na+ связываются с молекулой ЦП в участках между 1 и 2, 3 и 4, а также 5
и 6 доменами; их роль, вероятно, заключается в поддержании структуры трех
протуберанцев, выступающих на вершине «пирамидальной» молекулы ЦП [Bento et al.,
2007].
13
При хроматографии на гидроксилапатите разделяются две изоформы ЦП [Broman,
1958]. В преобладающей изоформе I присутствуют четыре, а в изоформе II – три
углеводные цепи. Углеводы присоединены к белковой цепи N-гликозидной связью с
остатками аспарагина 179, 339 (только в изоформе I), 378 и 743 [Takahashi, 1984].
Рис. 1.1. а, б. Модели холо-ЦП (а) и апо-ЦП (б) [Vachette et al., 2002]. Представлена
изоформа II, в которой домены выделены цветами: 1 и 2 – оранжевым, 3 и 4 –
желтым, 5 и 6 – синим. в, г. Схема распределения ионов меди I (синие), II (голубой)
и III типа (желтые) и иона кальция (зеленый) между доменами в проекции на
молекулу ЦП (в) и по длине полипептидной цепи (г) [Ortel et al., 1984; Farver et al.,
1999; Bento et al., 2007]. Углеводные цепи обозначены зигзагами, в изоформе II
отсутствует углеводная цепь в конце 2 домена.
Полипептидная цепь ЦП человека легко фрагментируется в реакции ограниченного
протеолиза при хранении препарата, загрязненного примесями протеиназ, либо при
ограниченном гидролизе протеиназами [Ryden, 1971; Sang, 1995]. В случае так
называемого
«спонтанного
протеолиза»
при
хранении
препаратов
ЦП
разрыв
полипептидной цепи происходит всегда по определенным пептидным связям, что
приводит к образованию одних и тех же фрагментов (рис. 1.2). С помощью сайтнаправленного мутагенеза по K887, R701 и R481 был получен ЦП человека, устойчивый к
протеолизу [Bielli et al., 2001]. Следует отметить, что разрыв полипептидной цепи ЦП
вовсе не означает, что протеолитические фрагменты легко отделяются от молекулы ЦП:
для
выявления
фрагментов
при
SDS-ЭФ
в
ПААГ
необходимо
восстановить
дисульфидные связи, а для препаративного разделения – обработать мочевиной или
гуанидином [Prozorovski et al., 1982].
14
Рис. 1.2. Схема протеолитического расщепления полипептидной цепи ЦП человека на
фрагменты при «спонтанном протеолизе» [Ortel et al., 1984].
Ионы меди в составе медь-содержащих белков по спектральным свойствам
подразделяют на три группы. Ионы меди I типа характеризуются сильным поглощением в
области около 600 нм (максимум поглощения ЦП регистрируется при 610 нм), в
результате содержащие их белки приобретают интенсивную голубую окраску. Ион меди I
типа имеет в качестве обязательных лигандов два атома азота имидазолов гистидина и
атом серы цистеина. Как правило, в качестве четвертого лиганда выступает еще один
атом серы метионина. Весь центр связывания Cu2+ I типа имеет форму неправильного
тетраэдра, что, вероятно, является компромиссом между формой полноценного тетраэдра,
характерной для Cu+, и квадратно-плоскостной координацией Cu2+ в составе
низкомолекулярных комплексов меди или неголубых медьпротеидов [Lu et al., 1993].
Скорее всего, требуя наименьших энергетических затрат на реорганизацию центра, такая
форма обеспечивает необычайно быстрые переходы иона меди I типа из одного
состояния окисления в другое и обратно, что, в свою очередь, дает голубым белкам
возможность эффективно участвовать в реакциях переноса электронов. Спектральные
характеристики ионов Cu2+ II типа, входящих в состав белков, близки к таковым у
низкомолекулярных комплексов меди, имеющих бледно-голубое окрашивание благодаря
d-d переходам в области 600–800 нм спектра поглощения Cu2+. После получения четкого
сигнала ЭПР стало ясно, что в роли лигандов иона меди II типа в белках выступают
четыре атома азота имидазольных колец гистидинов [Dawson et al., 1979]. В отличие от
Cu2+ II типа, ионы меди III типа имеют ряд специфических спектральных характеристик,
что вызвано особенностями их лигандирования. Эти ионы существуют в виде пар;
расстояние между ионами обычно находится в пределах 0,34–0,45 нм [Brown et al., 1980],
15
так что неспаренные электроны внешнего уровня имеют взаимно компенсированные
спины. Поэтому в своем обычном состоянии Cu2+ III типа не дают вклада в спектр ЭПР и
имеют характерную полосу с максимумом поглощения при 330–340 нм [Beltramini et al.,
1990]. Как и Cu2+ II типа, ионы меди III типа лигандируются атомами азота имидазолов
гистидина. Для образования центра связывания ионов меди III типа белковая глобула
должна иметь своеобразный гистидиновый кластер, в котором неоднократно встречается
последовательность H-X-H [Messerschmidt and Huber, 1990].
Таблица 1.1
Расположение ионов меди в молекуле церулоплазмина
Ион меди
Лигандирующие а. о.
Исследованные мутации
[Hellman et al., 2002]
Тип I (домен 2)
H276, C319, H324
H276Q
Тип I (домен 4)
H637, C680, H85, M690
H637Q, C680S
Тип I (домен 6)
H975, C1021, H1026, M1031
H1026Q
Тип II (домен 6)
H101, H978
H101Q
Тип III (домен 6)
H163, H980, H1020
H163Q
Тип III (домен 1)
H103, H161, H1022
H103Q
Ген ЦП протяженностью в 65 т. п. н. локализован на хромосоме 3.q23–q24 и содержит
20 экзонов [Diamon et al., 1995]. Анализ 5`-фланкирующего региона гена ЦП крысы
показал наличие сайтов TATAAA (–30) и AACCAATCT (–102) [Fleming and Gitlin, 1992].
В гепатоцитах в результате альтернативного сплайсинга образуется два вида иРНК
размером 4,2 и 3,7 т. н., различающихся длиной полиаденилового кластера [Yang et al.,
1986]. Синтез ЦП усиливается в ответ на гипоксию, дефицит железа [Mukhopadhyay et al.,
2000], избыток меди [Martin et al., 2005]. Его усиливают также инсулин [Seshadri et al.,
2002], тромбин [Yang et al., 2006], эстрадиол [Воронина и Монахов, 1980] и
провоспалительные цитокины [Mazumder et al., 1997]. Напротив, в присутствии
пероксида водорода гепатоциты и астроциты демонстрируют снижение экспрессии гена
ЦП на уровне иРНК [Tapryal et al., 2009].
Регуляция синтеза ЦП осуществляется на уровне иРНК (рис. 1.3) белковым фактором,
связывающимся с полиаденилированным концом (PABP), и эукариотическим фактором
инициации трансляции eIF4G [Mazumder et al., 2001].
16
Рис. 1.3. Регуляция синтеза ЦП на уровне иРНК [Mazumder et al., 2001].
3`-UTR – 3`-нетранслируемый регион, 5`-UTR – 5`-нетранслируемый регион, Cp-TI
– ингибитор трансляции ЦП, eIF – эукариотические факторы инициации трансляции,
PABP – белок, связывающийся с полиаденилированной последовательностью
(poly(A)). а – «замкнутая петля»: PABP связан с poly(A) и eIF4G, б – ингибирование
синтеза ЦП: Cp-TI нарушает связывание PABP с poly(A) (1) и eIF4G (2), в –
ингибирование синтеза ЦП: Cp-TI нарушает инициальный комплекс (3).
Концентрация ЦП в крови повышается во время воспаления, инфекции и
продолжительных травматических состояний в результате активации транскрипции гена
ЦП, индуцированной -интерфероном [Mazumder et al., 1997] и цитокинами [Gitlin, 1988].
При дефиците железа происходит активация транскрипции гена ЦП гипоксияиндуцибельным фактором (HIF-1), который также активирует гены эритропоэтина, гемоксигеназы-1, трансферрина и его рецептора [Mukhopadhyay et al., 2000].
Рис. 1.4. Регуляция синтеза ЦП -интерфероном [Sampath et al., 2004]. P-GluProRS –
фосфорилированная глутамил-пролил-тРНК-синтетаза, GAIT –
-интерферон
активируемый ингибитор трансляции, GAPDH – глицеральдегид-3-фосфат
дегидрогеназа, L13a – белок рибосомы, NSAP 1 – рибонуклеарный белок Q1.
17
Интересно, что
-интерферон после активации транскрипции гена ЦП снижает
активность трансляции его иРНК с помощью неканонической функции глутамил-пролилтРНК-синтетазы (рис. 1.4) [Sampath et al., 2003, Sampath et al., 2004]. При действии интерферона за первые 4 часа глутамил-пролил-тРНК-синтетаза фосфорилируется,
выходит из мультикомпонентного комплекса аминоацил-тРНК-синтетаз и соединяется с
рибонуклеарным
белком
Q1.
Через
12
часов
происходит
связывание
с
фосфорилированным рибосомальным белком L13a и с глицеральдегид-3-фосфат
дегидрогеназой. Такой комплекс, называемый -интерферон активируемым ингибитором
трансляции, угнетает трансляцию ЦП, связываясь с 3`-концом иРНК ЦП.
Продемонстрировано также наличие в промоторной зоне гена ЦП двух сайтов (с –248
по –240, с –3684 по –3677) для активирующего белка-1 (AP-1). Первый сайт
конститутивно функционирует в клетках яичника, но неактивен в гепатоцитах [Lee et al.,
2004], а второй активируется в гепатоцитах в присутствии редокс-активной меди,
например в комплексе с пирролидин дитиокарбаматом [Das et al., 2007]. В случае
умеренного дефицита глутатиона экспрессия ЦП гепатоцитами увеличивается за счет
активации второго AP-1 сайта, однако при существенном снижении уровня глутатиона
(более чем на 40 %) синтез ЦП снижается за счет влияния активных форм кислорода на
иРНК ЦП [Tapryal et al., 2010]. Рядом с AP-1 сайтом расположен гипоксия-респонсивный
элемент (с –3639 по –3429), который отвечает за экспрессию гена ЦП под действием HIF1 [Martin et al., 2005].
Рис. 1.5. Изменение С-концевой последовательности ЦП в результате альтернативного
сплайсинга [Patel et al., 2002]. Подчеркнута сигнальная последовательность
присоединения GPI-якоря.
На мембране клеток центральной нервной системы (астроцитов, лептоменингеальных
клеток) и клеток Сертоли находится ЦП с глицеролфосфоинозидным-(GPI)-якорем на Сконце, образовавшийся в результате альтернативного сплайсинга между 19-м и 20-м
экзонами (рис.1.5). Наличие альтернативной формы ЦП традиционно связывали с
необходимостью осуществления функций, присущих ЦП, в районах, куда поступлению
18
ЦП крови препятствуют гематоэнцефалический и гематотестикулярный барьеры [Patel
and David, 1997; Mittal et al., 2003; Fornta et al., 1999]. Однако позже GPI-форма ЦП была
обнаружена на лимфоцитах периферической крови и гепатоцитах [Marques et al., 2012].
Экспрессия гена ЦП в центральной нервной системе продемонстрирована в основных
структурах мозга, в т.ч. и в сетчатке глаза [Klomp et al., 1996; Klomp and Gitlin, 1996].
GPI-форма ЦП сетчатки, вероятно, противостоит вызванному квантами света
окислительному стрессу: в экспериментах на мышах уровень ЦП-иРНК возрастал в 8 раз
после освещения сетчатки животных. ЦП был выявлен во всех типах клеток сетчатки, где
его концентрация выше, чем в остальных структурах мозга [Chen et al., 2003]. При
травмах мозга у мышей уровень GPI-ЦП на астроцитах увеличивается под действием
интерлейкина 1
IL-1 ), причем даже у животных с дефицитом рецепторов IL-1 [Kuhlov
et al., 2003]. Синтез ЦП увеличивается после кровоизлияния в головной мозг посредством
активации рецептора тромбина [Yang et al., 2006]. В эндоплазматическом ретикулуме
происходит N-гликозилирование ЦП. Встраивание в ЦП ионов меди, вероятно,
происходит в транс-сети аппарата Гольджи.
Уже 80 лет назад впервые было отмечено, что при недостаточном поступлении меди в
организм животные страдали анемией [Hart et al., 1928]. У животных, содержавшихся на
медьдефицитной диете, через некоторое время наступало уменьшение концентрации
сывороточного железа и меди эритроцитов, а затем резко снижалось количество
эритроцитов в крови [Lahey et al., 1952].
С момента открытия ЦП было установлено, что он является оксидазой, способной
окислять синтетические ароматические амины и фенолы [Holmberg and Laurell, 1951].
Позже была изучена способность ЦП окислять Fe2+ до Fe3+ и доказано физиологическое
значение этой реакции [Osaki, 1966; Osaki et al., 1969]. ЦП получил систематическое
название
согласно
Международной
Классификации
Ферментов
-
«ферро:О2-
оксидоредуктаза, КФ 1.16.3.1». Часто используется более короткое название –
ферроксидаза I. Обнаружение ферроксидазной активности ЦП позволило предположить,
что этот фермент является связующим звеном между обменом железа и меди. Среди всех
субстратов ЦП минимальные значения KM ~ 0,65 и 50 мкМ найдены для Fe2+ [Osaki,
1966]. Было показано, что измерение скорости встраивания Fe3+ в апо-ТФ может быть
использовано для количественной оценки оксидазной активности ЦП. Кроме того, если
использовать Fe2+, то в сыворотке крови человека при рН 7,4 формируется Fe3+-ТФ,
однако без участия ЦП за сутки в ТФ встраивается 3–5 мг Fe3+ против 60 мг в
присутствии ЦП [Frieden and Hsieh, 1976]. Учитывая суточную потребность в железе для
19
человека (35–40 мг), можно сделать вывод, что ЦП необходим для поддержания
нормального уровня окисленного железа в плазме крови (рис. 1.6, а).
Железо, присутствующее в пищевых продуктах в закисной (Fe2+) и окисной (Fe3+)
формах, для поглощения мембраной энтероцита должно восстановиться до Fe2+ [Зайчик и
Чурилов, 2001]. В щеточной каемке энтероцита присутствуют апикальная мембранная
редуктаза (FeR) и связанный с ней транспортер двухвалентных металлов DMT1 (Nramp2,
DCT1, SLC11A2), которые осуществляют абсорбцию железа в тонком кишечнике. На
базолатеральной мембране энтероцита присутствует другой транспортер железа – IREG1
(MTP1, ферропортин 1, SLC11A3), способствующий переносу Fe2+, которое затем
окисляется гомологом ЦП – гефестином, встроенным в мембрану. Мутация в гене IREG1
(локализация - 2q32) ведет к гемохроматозу [Roy and Andrews, 2001].
Гефестин (локализация - Xq11-q12) принадлежит вместе с ЦП к купредоксиновому
суперсемейству. Структура гефестина (1158 а. о.), смоделированная по третичной
структуре ЦП и данным о последовательности кДНК, содержит гомологичный ЦП
активный центр и участки связывания меди [Syed et al., 2002]. В отличие от ЦП, в
молекуле гефестина один из доменов является трансмембранным [Anderson et al., 2002].
У мышей сцепленная с полом мутация в гене гефестина (sla) приводит к дефициту железа
и анемии. Эксперименты на мышах с мутациями белков абсорбции железа и мышах,
содержавшихся на железодефицитной диете, показали, что DMT1 модулирует ответ
энтероцитов на местные сигналы содержания железа, тогда как экспрессия генов IREG1 и
гефестина увеличивается в ответ на системные изменения уровня железа [Chen et al.,
2003]. Таким образом, потребность организма в железе в первую очередь отражается на
апикальных
белках
энтероцита,
а
затем
детерминирует
экспрессию
белков
базолатеральной мембраны. Содержание железа в цитоплазме энтероцита контролирует
активность DMT1 и экспрессию его гена [Anderson et al., 2002]. Эксперименты по
передаче микроэлементов плоду от матери, находившейся на железо- и медьдефицитной
диете, показали, что материнский организм минимизирует дефицит за счет усиления
экспрессии таких белков, как рецептор трансферрина и гефестин, а также повышая
содержание меди в печени, сыворотке и плаценте матери [Gambling et al., 2003]. У крыс,
содержавшихся на железодефицитной диете, показано увеличение синтеза иРНК
гефестина [Sakakibara and Aoyama, 2002].
GPI-заякоренный ЦП астроцитов физически связан с ферропортином (IREG1),
который не способен в отсутствие ЦП транспортировать железо из астроцита (рис. 1.6, б).
Другой транспортер Fe2+, DMT1, в нервной ткани опосредует отток железа в глиальные
клетки от астроцитов [Jeong and David, 2003].
20
Рис. 1.6. Участие ЦП в метаболизме железа в крови (а) и нервной системе (б) [Harris et
al., 1998]. ГБ – гемоглобин, ТФ – трансферрин, ТФR – рецептор трансферрина, ФРТ –
ферритин, NO-С – NO-синтаза.
Подтверждением тесной зависимости обмена железа от ЦП у человека является
ацерулоплазминемия – заболевание, вызванное мутацией в гене ЦП, приводящей к утрате
ферментативной активности ЦП. При этой мутации резко снижена оксидазная активность
фермента, что вызывает гемосидероз с обширными отложениями железа в тканях
различных органов [Yosida et al., 1995; Bosio et al., 2002]. Экспериментально получены
мыши,
гомозиготные
по
утрате
гена
ЦП,
у
которых
развивается
картина
21
ацерулоплазминемии с выявлением нарушения обмена железа на гистологических
препаратах [Harris et al., 1995; Harris et al., 1999].
ЦП препятствует накоплению и действию токсических окисляющих радикалов в
плазме крови за счет ферроксидазной активности:
4Cu(II) + 4Fe2+
4Cu(I) + 4Fe3+;
4Cu(I) + O2 + 4H+
4Cu(II) + 2H2O.
Катализируя окисление Fe2+ до Fe3+, фермент поддерживает соотношение Fe2+:О2
равным 4:1, обеспечивая четырехэлектронный перенос на О2 с образованием воды,
предотвращая неферментативную реакцию, в результате которой образуется О2 :
Fe2+ + О2
Fe3+ + О2 .
Окисляя Fe2+ до Fe3+, ЦП может препятствовать реакции Фентона – образованию OH
радикалов при взаимодействии Fe2+ c H2O2:
Fe2+ + H2O2
Fe3+ + OH- + OH .
С помощью сайт-направленного мутагенеза для ферроксидазной реакции доказана
важность а. о.: E633, E567, H602, E935 и H940 [Brown et al., 2002]. По механизму
ферроксидазной
реакции
ЦП
может
осуществлять
купрооксидазную
реакцию,
+
препятствуя токсическому действию прооксидантных ионов Cu [Stoj and Kosman, 2003].
Рис. 1.7. Модель переноса электрона с двухвалентного железа (Fe2+) в лабильном сайте
на ион Cu I типа в ЦП [Quintanar et al., 2004].
22
Связывание ионов Fe2+ в лабильном сайте ЦП и перенос электрона на ион меди I типа
являются критическим этапом осуществления ферроксидазной реакции (рис. 1.7). С
помощью метода спектроскопии кругового дихроизма с переменными температурой и
магнитным полем были изучены электронная структура и геометрия сайта для
связывания Fe2+ в ЦП, его гомологе Fet3 (Saccharomyces cerevisiae) и мутантных формах
белка с аминокислотными заменами в лабильном сайте, что позволило построить модель
переноса электрона с Fe2+ на ион Cu I типа [Quintanar et al., 2004].
В конце 70-х годов появились первые сообщения о способности ЦП играть роль
скавенджера супероксидных анион-радикалов (О2 ) [Goldstein et al., 1979]. При этом
действие фермента, как выяснилось, зависит не от его взаимодействия с веществами,
предварительно восстановленными О2 , а скорее от взаимодействия с самим О2 , которое
сходно по ряду параметров с действием супероксиддисмутазы. Позже Bannister и
соавторы [Bannister et al., 1980] сделали вывод, что они наблюдали в экспериментах
обычную реакцию окисления О2 ферментом-оксидазой (ЦП), описываемую следующим
уравнением:
4O2 + 4H+ + O2
4O2 + 2H2O.
Общая схема окисления субстратов с четырехэлектронным переносом описывает
осуществляемое ЦП окисление ионов железа, меди, супероксидного анион-радикала, NO,
а также реакцию образования нитротиолов (рис. 1.8).
Способствуя встраиванию в ферритин окисленного Fe3+, ЦП ингибирует супероксид- и
ферритин-зависимое перекисное окисление липидов (ПОЛ) [Samokyszyn et al., 1989].
Описанные
выше
свойства
ЦП
послужили
основой
для
объяснения
его
противовоспалительной активности, что вместе с быстрым возрастанием концентрации
ЦП (в 2–3 раза) в русле крови уже в начале воспалительной реакции позволяет
причислить его к белкам «острой фазы» [Rice, 1961]. Показано, что благодаря
антиоксидантным свойствам ЦП может выступать как фактор роста клеток [Alcain et al.,
1991].
Пептиды – карнозин, гомокарнозин и ансерин – способны препятствовать свободнорадикальному образованию дитирозиновых сшивок в ЦП [Kang et al., 2002]. Эти пептиды
также препятствуют образованию под действием системы ЦП/H2O2 агрегатов
-
синуклеина, ключевого компонента телец Леви – патогномоничного признака болезни
Паркинсона [Kim et al., 2002]. В присутствии гомоцистеина ЦП способен ускорять
окисление липопротеинов низкой плотности (ЛНП) за счет восстановления ионов Cu2+ в
23
ЦП до Сu+ [Exner et al., 2002]. Альдегидная группа глюкозы также способна усилить
действие ЦП в процессе окисления ЛНП [Leoni et al., 2002]. Окисление ЛНП зависит от
целостности молекулы ЦП и количества связанных с ней ионов меди [Mukhopadhyay et
al.,
1996].
С
помощью
сайт-направленного
мутагенеза,
в
процессе
которого
осуществлялась замена лигандирующих медь гистидинов, был определен участок
молекулы в районе H426, ответственный за прооксидантные свойства ЦП [Mukhopadhyay
et al., 1997].
Рис. 1.8. Схема окисления субстрата (S) в активном центре ЦП при
четырехэлектронном переносе на O2 с образованием H2O [Ryden and Bjork, 1976].
In vivo было продемонстрировано защитное действие ЦП при действии на клетки
HepG2 концентраций NO, превышающих физиологические.
ЦП катализирует образование нитротиолов, при реакции GSH с NO происходит
перенос электрона из NO на ион меди I типа, затем на кластер ионов меди II и III типа с
последующим четырехэлектронным переносом на кислород и образованием воды [Inoue
et al., 1999]:
4GSH + 4NO + O2
4GSNO + 2H2O.
Неожиданным оказалось открытие способности ЦП осуществлять окисление NO до
NO+. Образующийся NO+ под действием воды превращается в нитрит. NO-оксидазная
24
активность плазмы значительно уменьшается после иммунопреципитации ЦП, а
концентрация нитрита у пациентов с наследственным дефектом гена ЦП снижена в 2
раза. Таким образом, ЦП является одним из регуляторов NO-сигнального пути [Shiva et
al., 2006].
К числу антиоксидантных активностей ЦП также относится его глутатион-зависимая
пероксидазная активность [Kim et al., 1998a], выраженная у не деградированного
протеиназами ЦП [Kim et al., 1998b]. Позже было показано, что способность ЦП
восстанавливать пероксиды, в том числе алкилгидропероксиды, не зависит от его медьсвязывающих центров, а опосредована остатком C699, модификация которого лишает ЦП
тиол-зависимой пероксидазной активности [Cha and Kim, 1999].
Сайт связывания синтетического субстрата ЦП, пара-фенилендиамина (p-PD), который
традиционно используется для оценки оксидазной активности ЦП в плазме и сыворотке
крови при рутинном клиническом анализе [Ravin, 1961], отличается от сайта связывания
ионов железа и расположен вблизи иона меди I типа в 4 домене ЦП: H667, M668, W669
[Zaitsev et al., 1999].
В 90-х годах в свете обнаружения белковых комплексов ЦП стало возможно говорить
о его новых функциях. В процессе свертывания крови в результате протеолиза
церулоплазминоподобные кофакторы – FV и FVIII – активируются и принимают
конформацию, благоприятную для образования комплексов с протеазами FIXa и FXa,
активирующими FII и FX. Антикоагулянт – протеин С – в результате ограниченного
протеолиза FVa и FVIIIa способен ингибировать протеолитический каскад свертывания
крови. Находясь в конкурентных отношениях с факторами свертывания крови за
связывание с протеином C, ЦП мог бы участвовать в регуляции коагуляции. Декапептид
ЦП (1028HAGMETTYTV1037) разобщает комплекс ЦП с протеином С и снимает эффект 5кратного увеличения активности ЦП в комплексе [Walker and Fay, 1990]. Однако после
сообщения о взаимодействии ЦП с протеином С ряд гематологов поставили под
сомнение гипотезу о способности ЦП усиливать коагуляцию in vivo, что было
подтверждено исследованиями показателей гемостаза у здоровых людей и у пациентов с
дефектами FV [De Visser et al., 2002].
Взаимодействуя с миелопероксидазой [Segelmark et al., 1997], ЦП ингибирует ее
галогенирующую активность:
H2O2 + Cl-
ClO- + H2O.
25
Вероятно, это имеет значение при чрезмерной активации респираторного взрыва в
очаге воспаления и распространении его по руслу крови, в том числе при развитии
системных васкулитов [Griffin et al., 1999]. Однако взаимодействие с миелопероксидазой
не влияет на оксидазные, пероксидазные и иммунореактивные свойства ЦП [Park et al.,
2000].
Группа Aust показала, что для полноценного встраивания Fe3+ в ферритин важна не
только ферроксидазная активность ЦП, но также взаимодействие целостной молекулы
ЦП с ферритином [Juan and Aust, 1998; Reilly et al., 1998; Van Eden and Aust, 2000].
Взаимодействие ЦП с нейропептидом PACAP 38 [Tams et al., 1999], возможно, играет
определенную роль в нейрорегуляторных процессах и особенно интересно в свете
обнаружения
в
астроцитах
мембраносвязанного
ЦП,
который
участвует
в
предотвращении свободно-радикальных реакций и в регуляции уровня железа в
центральной нервной системе [Patel and David, 1997; Patel et al., 2002].
Было
продемонстрировано, что среди всех белков плазмы крови именно ЦП связывается
PACAP 38, причем для этого взаимодействия достаточно С-концевого декапептида (29–
38) [Tams et al., 1999].
Взаимодействие ЦП с ЛФ [Zakharova et al., 2000], бактерицидным белком
нейтрофилов, а также молока и других секретов, интересно в свете бактерицидного
действия ЦП в присутствии Fe2+ и фосфатов [Klebanoff, 1992]. В экспериментах in vivo
была показана циркуляция комплекса ЦП крысы – ЛФ человека в течение 5 часов после
введения
крысе
10
мг
ЛФ
[Zakharova
et
al.,
2000].
Продемонстрирована
электростатическая природа этого взаимодействия, а также увеличение аффинности
комплекса при протеолизе ЦП [Pulina et al., 2002]. Комплекс ЦП-ЛФ был выделен из
грудного молока [Соколов и соавт., 2006]. Исследование взаимодействия ЦП с ЛФ и ТФ с
помощью
флуоресцентной
эмиссионной
спектроскопии
показало
возможность
образования комплексов с соотношением 1:1 [Ha-Duong et al., 2010]. Однако такие
методы исследования белок-белковых комплексов, как электрофорез, кросс-сшивка
белков и поверхностный плазмонный резонанс, не подтвердили взаимодействия ТФ с ЦП
и гефестином [Hudson et al., 2008].
Физическое взаимодействие ЦП астроцитов с IREG1, способствующее оттоку Fe3+ из
астроцитов, доказано с помощью коиммунопреципитации и колокализации на мембране
астроцита при двойной метке флуоресцентными антителами к ЦП и IREG1 [Jeong and
David, 2003]. В отсутствие активного ЦП Fe2+ не окисляется на выходе из канала IREG1,
что служит сигналом для деградации IREG1 [De Domenico et al., 2007]. Деградацию
IREG1 также вызывает пептидный гормон гепцидин, синтезируемый печенью в ответ на
26
избыток железа или воспалительные цитокины (IL-6). Нельзя исключить, что в основе
действия гепцидина лежит контакт не с IREG1, а с ЦП [Leong and Lonnerdal., 2004; Musci
et al., 2014].
Последним из обнаруженных на настоящий момент белков, взаимодействующих с ЦП,
является фактор, ингибирующий миграцию макрофагов (MIF), – один из ключевых
цитокинов воспаления [Meyer-Siegler et al., 2006].
В ряде работ было показано антиоксидантное действие ЦП in vitro в системе,
содержащей активированные НФ [Krsek-Staples and Webster, 1993] и моноциты [Betten et
al., 2004]. Известно о повреждении ЦП оксидантами, которые образуются при
функционировании активированных фагоцитов [Sharonov et al., 1988; Winyard et al.,
1989]. С другой стороны, ЦП способен стимулировать фагоцитоз НФ [Saenko et al., 1994].
У пациентов с локализованными агрессивными периодонтитами,
НФ которых
синтезировали ЦП, окислявший железо, ионы Fe3+ вызывали увеличение продукции
супероксидных анион-радикалов [Iwata et al., 2009].
27
1.2. Участие белковых факторов нейтрофилов и эозинофилов в воспалительных
реакциях
Нейтрофилы (НФ) и эозинофилы (ЭОФ) относятся к клеткам миелоцитарного ряда и
являются важнейшими участниками воспалительной реакции врожденного иммунитета.
Они отвечают за быструю реакцию организма на появление инфекции. В процессе
деления
и
последующего
колониестимулирующих
созревания
факторов
и
в
костном
цитокинов
в
мозге
под
лейкоцитах
контролем
синтезируются
специфические цитотоксические белки, локализующиеся в гранулах. Зрелые НФ
циркулируют в кровотоке всего 6–8 часов [Dancey et al., 1976]. В случае появления
воспалительного и хемотаксического стимула эти клетки могут мигрировать из кровотока
в очаг воспаления, где в процессе распознавания инфекционного агента осуществляют
его фагоцитоз, сопровождаемый респираторным взрывом, слиянием различных типов
гранул и частичной секрецией их содержимого во внеклеточное пространство. Зрелый
НФ содержит четыре типа гранул (таблица 1.2) [Borregaard and Cowland, 1997].
Количество ЭОФ (120–350 клеток в 1 мкл крови) в кровотоке значительно уступает
количеству НФ (1500–7000 клеток в 1 мкл крови), однако может повышаться при
паразитарной инфекции либо развитии аллергической реакции. Несмотря на наличие
общих свойств НФ и ЭОФ (способность к хемотаксису, проникновение в ткани через
стенку кровеносного сосуда, фагоцитоз, респираторный взрыв), последние являются
эффективными
регуляторами
аллергических
процессов
благодаря
наличию
специфических к IgE рецепторов, а также способности поглощать гистамин и другие
медиаторы воспаления. Гранулы ЭОФ содержат: пероксидазу эозинофилов (ЭПО),
мажорный
катионный
белок,
эозинофильный
катионный
белок,
нейротоксин
эозинофилов, кристаллический белок Херкода-Лейдена, а также множество регуляторных
цитокинов [Muniz et al., 2012; Shenoy et al., 2003]. Краткий обзор свойств и функций
основных белков гранул ЭОФ приведен в таблице 1.3 [Acharya and Ackerman, 2014].
Антимикробное действие НФ реализуется с помощью различных механизмов: 1)
непосредственное повреждение мембраны микроорганизма (дефенсины, лизоцим, ЛФ,
бактерицидный проницаемость увеличивающий белок); 2) влияние на метаболизм железа
(ЛФ, N-GAL); 3) протеолитическое расщепление микробных белков (серпроцидины,
металл-зависимые матриксные протеиназы); 4) образование активных форм кислорода и
галогенов (МПО, NADPH-оксидаза); 5) привлечение в очаг воспаления других типов
иммунных клеток (дефенсины, продукты катализа 5-липоксигеназы). Содержимое
специфических гранул НФ поддерживает начальную фазу воспаления [Segal, 2005]. В
этих гранулах находится ряд растворимых медиаторов, участвующих в регуляции
28
воспаления: VEGF (эндотелиальный фактор роста сосудов), PAF (фактор активации
тромбоцитов), HGF (фактор роста гепатоцитов) и IL-8 [Benelli et al., 2003].
Таблица 1.2
Компоненты гранул нейтрофилов [Borregaard and Cowland, 1997]
Азурофильные
Специфические
(первичные) гранулы
(вторичные) гранулы
Желатиназные
Секреторные
везикулы
Мембранные маркеры
CD63, CD68,
CD11b, CD66, CD67,
CD11b,
Щелочная
протонная АТФаза V-
цитохром b558,
цитохром b558,
фосфатаза,
типа
рецепторы к fMLP,
рецептор к
цитохром b558,
фибронектину,
fMLP,
CD11b, CD14,
витронектину,
протонная
CD16, CD10, CD13,
ламинину,
АТФаза V-типа
CD45, рецепторы к
тромбоспондину, TNF
fMLP и к C1q,
протонная АТФаза
V-типа
Содержимое матрикса
Азуроцидин,
β2-микроглобулин,
Ацетил-
Белки плазмы,
катепсины, дефенсины,
коллагеназа,
трансфераза, β2-
включая альбумин
NE, лизоцим, МПО,
желатиназа,
микроглобулин,
и тетранектин
PR3, сиалидаза,
гистаминаза,
желатиназа,
бактерицидный
гепариназа, ЛФ, N-
лизоцим
проницаемость
GAL, лизоцим,
увеличивающий белок
сиалидаза
Различие во времени синтеза белков гранул и образования самих гранул в костном
мозге позволяет обеспечивать правильную локализацию различных соединений и
препятствовать смешиванию компонентов различных компартментов. Это в дальнейшем
способствует выполнению функций НФ за счет точечного слияния определенных типов
гранул с мембраной клетки либо с фагосомой. Например, секреторные пузырьки
выбрасывают свое содержимое в кровь еще во время миграции НФ по сосудам, тогда как
азурофильные и специфические гранулы могут оставаться нетронутыми вплоть до
прихода клетки в очаг воспаления. Белковые компоненты гранул НФ и ЭОФ до
определенной степени специфичны для данных клеток, однако ЛФ, дефенсины и
29
лактопероксидаза (гомолог МПО и ЭПО) могут присутствовать в экзокринных секретах
(молоко, слюна и др.), где выполняют антимикробную функцию. Локализация ряда
белков в гранулярном аппарате НФ и ЭОФ предохраняет организм от их действия на
собственные молекулы тканей, которое проявляется при воспалении. Так, например,
увеличение секреции ЛФ частично отвечает за гипоферремию при сепсисе [Van Snick et
al., 1974; Klempner et al., 1978], а продукты катализа МПО и ЭПО – хлорноватистая и
бромноватистая кислоты – способствуют развитию галогенирующего стресса при
воспалении [Klebanoff, 2005]. Условно антимикробные реакции НФ и ЭОФ разделяют на
кислород-зависимые и кислород-независимые. Хотя, как будет описано ниже, кислородзависимые участники воспалительного ответа могут модулировать функции остальных
участников реакций врожденного иммунитета.
Таблица 1.3
Физико-химические свойства и функции белков гранул эозинофилов
Белок
M,
Функция
pI
кДа
Пероксидаза
66
Продукция HOSCN и HOBr, окисление липидов
10,8
эозинофилов
Мажорный
и белков
14
Дестабилизация мембран, активация
11,4
катионный белок
Эозинофильный
респираторного взрыва НФ
18–22
Слабая РНКаза, нейротоксичность, индукция
10,8
катионный белок
Нейротоксин
апоптоза
15
Слабая РНКаза, нейротоксичность,
8,9
эозинофилов
Кристаллический
белок
цитотоксичность
17
5,1–5,7
Взаимодействие с катионными белками
Херкода–
эозинофилов в гранулах
Лейдена
1.2.1. Участники респираторного взрыва нейтрофилов и эозинофилов: оксидазы и
пероксидазы
НФ и ЭОФ, будучи микрофагоцитами, способны к активации поглощения
молекулярного кислорода во время фагоцитоза в ответ на инфекционные агенты и
медиаторы воспаления. Ферментным комплексом, ответственным за восстановление
молекулярного кислорода до супероксидного анион-радикала (O2•), является NADPHоксидаза. В неактивных фагоцитах цитоплазматические компоненты NADPH-оксидазы
30
(p47phox, p67phox , p40phox и малая GTPаза Rac) отделены от двух мембранных компонентов
(gp91phox/Nox2 и p22phox), которые составляют так называемый флавоцитохром-b, или
цитохром b558 [Nauseef, 2004] (рис. 1.9).
Рис. 1.9. Строение комплекса NADPH-оксидазы [Dahan and Pick, 2012]. AD – домен
активации, PRR – пролин-обогащенный участок, PX – фагоцитооксидазный домен, SH3 –
участок с Src-гомологией,TPR – тетратрикопептидный повтор.
Основная часть (80–85 %) NADPH-оксидазы, gp91phox/Nox2 (570 а. о.) сосредоточена в
мембране специфических гранул [Borregaard et al., 1983]. gp91phox/Nox2 состоит из двух
примерно равных частей: N-концевая трансмембранная часть, представленная 6 альфаспиральными трансмембранными сегментами, два из которых участвуют в связывании
двух гемов, и C-концевая цитоплазматическая часть, содержащая NADPH-связывающий
и FAD-связывающий сайты. Третий и пятый трансмембранные сегменты содержат по 2
остатка гистидина (101, 209, 115 и 222), которые являются аксиальными и дистальными
лигандами
для
ионов
железа
в
двух
неидентичных
гемах,
ориентированных
перпендикулярно к поверхности мембраны. В процессе функционирования NADPHоксидазы происходит транспорт электрона с NADPH через FAD и гемы на молекулярный
кислород, что приводит к образованию O2•. Во время фагоцитоза цитоплазматические и
мембранные компоненты соединяются с образованием функционирующей электрон-
31
транспортной цепи, переводящей молекулярный кислород в форму O2 . Радикал
преобразуется
в
пероксид
водорода
с
участием
супероксиддисмутазы
либо
неферментативно:
O2• + O2• + 2H+ → H2O2 + O2.
Сборка NADPH-оксидазы приводит к выходу и накоплению упомянутых выше
окислителей как во внеклеточной среде, так и внутри фагосом [Karlsson and Dahlgren,
2002]. Для активации gp91phox/Nox2 требуется индуцированная провоспалительным
стимулом мембранная транслокация компонентов p47phox, p67phox, p40phox и малой GTPазы
Rac, что доказано возможностью реконструкции активной NADPH-оксидазы в
бесклеточной системе с перечисленными выше компонентами, амбифильным агентом и
арахидоновой кислотой (AA) в качестве стимулятора in vitro. Защитная роль каждого
участника NADPH-оксидазного комплекса подкрепляется тем, что дефект в любом из
gp91phox, p47phox, p67phox, p40phox, сопровождается развитием
генов, кодирующих
первичного иммунодефицита при хроническом грануломатозе [Roos et al., 1998; Heyworth
et al., 2003].
В цитоплазме покоящихся НФ p47phox, p67phox и p40phox формируют тройной комплекс,
тогда как малая GTPаза Rac находится в комплексе с Rho-ингибитором диссоциации
GDP. При стимуляции клеток тройной комплекс и малая GTPаза Rac независимо
достигают мембраны, а Rho-ингибитор диссоциации GDP остается в цитоплазме [Freeman
and Lambeth, 1996; Koshkin et al., 1996]. Организатор оксидазы p47phox (390 а. о.) состоит
из N-концевого фагоцитооксидазного домена (PX), тандема SH3 доменов и С-концевого
пролин-обогащенного участка (PRR). Два SH3 домена кооперативно взаимодействуют с
PRR С-концевого цитоплазматического участка p22phox, что необходимо как для
мембранной транслокации p47phox, так и для активации оксидазы [Sumimoto et al., 1994;
Leto et al., 1994]. В неактивном состоянии оба SH3 домена p47phox маскированы
внутримолекулярным контактом с С-концевым аутоингибирующим участком (AIR)
[Groemping et al., 2003]. Однако в процессе фагоцитоза микробов, при стимуляции Nформильными хемотаксическими пептидами или PMA происходит фосфорилирование
множества остатков серина (303, 304, 328) в регионе AIR p47phox, что в кооперации с
другими агонистами (например, AA) вызывает демаскирование SH3 доменов p47phox и их
взаимодействие с PRR в p22phox [El Benna et al., 1994; Inanami et al., 1998]. Домен PX в
p47phox
способен
взаимодействовать
фосфатидилинозитол-3,4-бисфосфатом,
стимулированных
НФ
из
фосфатидилинозитол-3-киназы
с
фосфоинозитидами,
который
преимущественно
фосфатидилтрифосфата
как
(PI3K)
2001;
[Kanai
et
al.,
например
с
образуется
в
результат
Ago
et
активации
al.,
2001].
32
Взаимодействие PX p47phox с липидами усиливается после фосфорилирования, что в
кооперации со связыванием p22phox индуцирует контакт с флавоцитохромом b558,
критичным для активации оксидазы [Ago et al., 2003]. Кроме того, PX может связывать
кислые фосфолипиды (фосфатидную кислоту и фосфатидилсерин), что объясняет
возможность активации NAPDH-оксидазы в отсутствие фосфатидилинозитол-3,4бисфосфата [Karathanassis et al., 2002].
Активатор оксидазы p67phox (526 а. о.) транслоцируется при стимуляции НФ сходным с
p47phox образом, поскольку также содержит два SH3 домена, важных для активации
NADPH-оксидазы фагоцитов. Так, C-концевой SH3 домен p67phox с высокой аффинностью
взаимодействует с C-концевым PRR в составе p47phox [Finan et al., 1994; Leusen et al.,
1995; Kami et al., 2002].
Представитель Rho-семейства малых GTPаз, Rac, играет важную роль в активации
gp91phox/Nox2, поскольку мутации в гене Rac2 (преимущественно экспрессируется в НФ)
наблюдаются у пациентов с наследственными дефектами функций НФ [Knaus et al., 1991;
Williams et al., 2000]. При активации НФ мембранная транслокация Rac обеспечивается за
счет геранилгеранилирования остатка C189 на C-конце GTPазы. Находясь у мембраны,
Rac переходит в активную связанную с GTP форму, что обеспечивает ее взаимодействие
с N-концевым участком p67phox, необходимым для активации gp91phox/Nox2. В связывании
Rac с p67phox участвует бета-антипараллельная шпилька из 19 а. о. между 3 и 4 альфаспиральными
участками
в
составе
TRP-домена
p67phox
(содержащего
четыре
тетратрикопептидных (TRP) повтора). Между ним и SH3 доменом p67phox расположен
PRR (227PPPRPKTP234), важный для взаимодействия с p47phox [Diekmann et al., 1994; Koga
et al., 1999]. Хотя детали структурных перестроек после взаимодействия Rac с p67phox и
действия активирующего домена (AD) p67phox на gp91phox/Nox2 еще не изучены,
существуют данные о том, что он способствует образованию комплекса между
gp91phox/Nox2 и p22phox, а также транспорту электрона от NADPH [Diebold and Bokoch,
2001]. Домен PB1, расположенный между двумя SH3 доменами в p67phox, способствует
взаимодействию с p40phox путем гетеродимеризации [Kuribayashi et al., 2002].
Содержащий PX, SH3 и PB1 домены p40phox (339 а. о.) усиливает мембранную
транслокацию p67phox и p47phox, особенно в фагосоме. Сам p40phox транслоцируется в
фагосому за счет N-концевого PX домена, который с высокой аффинностью связывает
фостатидилинозитол-3-фосфат, образующийся при катализе представленной в мембране
фагосом PI3K III типа [Sumimoto, 2008].
33
Рис. 1.10. Взаимодействия между доменами компонентов NADPH-оксидазы до и после
активации. Взаимодействия в стадии покоя обозначены синими стрелками,
активирующие взаимодействия – розовыми, конститутивные взаимодействия – зелеными
[Sumimoto, 2008].
Активация двух различных пулов NADPH-оксидазы (связанных с плазматической
мембраной и с мембраной гранул) происходит разными путями. В частности, p40 phox
необходим только для продукции внутриклеточных оксидантов [Matute et al., 2009], что
связано с активацией различных типов PI3K.
NADPH-оксидаза находится в неактивном состоянии в циркулирующих НФ и ЭОФ.
Различные провоспалительные агенты (цитокины, ЛПС и другие молекулярные патогенассоциированные паттерны) могут усиливать активность оксидазы, или «праймировать»
лейкоциты. Такое «сверхактивированное» состояние клетки, с одной стороны,
обеспечивает быструю элиминацию размножающегося патогена, но с другой – приводит
к накоплению высоких концентраций оксидантов, что может провоцировать повреждение
собственных тканей организма. Главным элементом в
процессе сборки комплекса
NADPH-оксидазы является фосфорилирование p47phox по нескольким остаткам серина
[El-Benna et al., 2009]. Провоспалительные цитокины (GM-CSF, TNF-α, IL-8) и агонисты
toll-like рецепторов (ЛПС, CL097) вызывают слабое увеличение продукции O2 [Hallett
and Lloyds, 1995; Boussetta et al., 2010], однако после предъявления клетке второго
стимула, например fMLP, продукция окислителей усиливается. Это связано с тем, что
fMLP и PMA инициируют фосфорилирование остатков серина между 303 и 379 а. о.,
тогда как предъявление цитокинов или агонистов Toll-lile-рецепторов вызывает
специфическое фосфорилирование S345 [Nurcombe et al., 1991; Makni-Maalej et al., 2012].
При стимуляции НФ в процессе фагоцитоза наряду с активацией NADPH-оксидазы
происходит также повышение уровня свободной AA в клетках, сопровождаемое синтезом
34
лейкотриенов
[Rådmark
and
Samuelsson,
2010].
Ключевым
ферментом
синтеза
лейкотриенов является 5-липоксигеназа (5-LO), которая катализирует первые две реакции
в цепи превращений AA (5,8,11,14-цис-эйкозатетраеновой кислоты) в ходе синтеза
лейкотриенов: 5-LO катализирует внедрение молекулы кислорода в положение 5
молекулы AA (оксигеназная активность, обеспечиваемая Fe3+ в активном центре
фермента) с образованием сначала гидропероксикислоты 5-HPETE, а на следующей
стадии – нестабильного эпоксида LTA4 (LTA4-синтазная активность). Лейкотриен А4
является субстратом для лейкотриен А4-гидролазы НФ, приводящей к образованию
сильнейшего хемоаттрактанта лейкотриена В4 (LTB4) (рис. 1.11).
Рис. 1.11. Участие 5-LO в превращении арахидоновой кислоты (AA) в лейкотриены (LT)
[Rådmark and Samuelsson, 2010].
Будучи мономером, 5-LO состоит из N-концевого бета-сэндвич домена (1–114) и Cконцевого каталитического домена (121–673), состоящего в основном из альфа-спиралей
и содержащего остатки H367, H372, H550, N554, I637, лигандирующие ион железа. В
липоксигеназной реакции ион железа действует как акцептор и донор электронов при
присоединении водорода и образовании пероксида [Allard and Brock, 2005]. Увеличение
35
концентрации AA в клетке опосредовано действием цитозольной фосфолипазы A2
(cPLA2) на глицерофосфолипиды плазматической и ядерной мембраны. В активации 5-LO
и cPLA2 участвуют ионы кальция и протеинкиназы [Hammarberg et al., 2000]. В
активированных лейкоцитах оба фермента локализуются у ядерной мембраны, 5-LO
связывается с мембраносвязанным белком (FLAP), который участвует в передаче AA для
катализа 5-LO. При этом, однако, не исключается возможность катализа цитозольной 5LO при поступлении экзогенной AA из соседних клеток. 5-LO может фосфорилироваться
MAP-KAP киназами по S271 [Flamand et al., 2009], ERK2 по S663 [Werz et al., 2002] и
каталитической субъединицей PKA по S523 [Luo et al., 2005]. Различные виды
стрессорного воздействия (арсенит натрия, осмотический или термический стресс),
увеличение концентрации ненасыщенных жирных кислот (AA или олеиновой) и
провоспалительные
цитокины
приводят
к
активации
p38
MAP-киназы,
фосфорилирующей MAP-KAP-киназы. В НФ для активации 5-LO важно участие как p38
MAP-киназы, так и ERK2 [Rådmark and Samuelsson, 2010]. Образующийся в результате
каталитической активности 5-LO лейкотриен LTB4 является одним из сильнейших
провоспалительных медиаторов, увеличивающих хемотаксис и продукцию оксидантов
НФ и ЭОФ. Активация NADPH-оксидазы под действием LTB4 опосредована
фосфорилированием цитозольного компонента p47phox при активации PKC- Так, агонист
(CP105696) рецептора LTB4 (BTL1) НФ уменьшает фосфорилирование p47phox при
активации AA [Serezani et al., 2005].
В конечном итоге как активация NADPH-оксидазы, так и усиливающая ее активность
5-LO приводят к продукции O2 в фагосоме. Данные о количествах O2 , продуцируемых
активированными НФ, сильно различаются. Так, например, сообщается о локальной
концентрации O2 в фагосоме 4 моль/л [Reeves et al., 2002], однако, учитывая высокую
скорость дисмутирования радикала до H2O2, более реалистичными кажутся концентрации
в пределах нескольких мкМ [Hampton et al., 1998]. В литературе также обсуждается
возможность участия хлора (Cl2) [Hazen et al., 1996], озона (O3) и гидроксильного
радикала (OH в антимикробной активности НФ. Предполагается, что последний может
образоваться в результате реакций Фентона, Габера–Вейса либо при взаимодействии
HOCl с Fe2+ или O2 [Segal, 2005]. Также известно об индукции NO-синтазы в НФ при
сепсисе [Wheeler et al., 1997], хотя функция NO в НФ связана скорее с регуляцией
активности 5-LO, чем с антимикробным действием [Zagryazhskaya et al., 2010].
Пероксид
водорода
–
наиболее
стабильный
оксидант,
образующийся
при
респираторном взрыве НФ и ЭОФ, – является субстратом миелопероксидазы (МПО) и
пероксидазы эозинофилов (ЭПО), которые составляют до 5 % от массы общего белка
36
соответствующих лейкоцитов. МПО была выделена в 1941 году [Agner, 1941]. Гомология
МПО и ЭПО, объединенных в семейство гем-содержащих пероксидаз млекопитающих,
достигает 70 % [Sakamaki et al., 1989], что объясняет сходство их физико-химических
свойств (таблица 1.4).
Таблица 1.4
Физико-химические свойства миелопероксидазы и пероксидазы эозинофилов
МПО
ЭПО
M, кДа
(59+14)×2=146
50+16=66
Полоса Соре, нм
430
413
Ковалентная связь гема
D94, E242, M243
D232, E380
Проксимальные лиганды
H336, N421
H474, N559
Дистальные лиганды гема
H95, R239, Q91
H233, R377, Q229
Лиганды кальция
D96, T168, F170, D172, S174
D234, T306, F308, D310, S312
Окислительно-
1,16
1,10
2,5/110/720/960
0,31/1900/9300/10000
KM для бромида, мМ
2
0,5
KM для тиоцианата, мМ
0,5
0,15
гема
восстановительный
потенциал Соединение
I/нативный фермент, В
Константа скорости второго
порядка реакции между
Cоединением I и Cl-/Br-/I/SCN-, 104 М-1×сек-1 (pH 7)
Рентгеноструктурные исследования показали уникальные особенности связи гема с
а.о. МПО (рис.1.12). Модифицированные метильные группы пирроловых колец А и С
связаны эфирной связью с E242 и D94, порфирин также связан через ион серы М243 с
винильной группой кольца А [Blair-Jonnson et al., 2001]. Два гема находятся на
расстоянии 50 Å и расположены в расщелинах глубиной 20 Å и шириной 10 Å. Оба
гемовых центра функционально идентичны и действуют независимо в каталитических
реакциях. Ионы Ca2+ в МПО и других гем-содержащих пероксидазах важны для их
нормального биосинтеза. МПО и лактопероксидаза с заменой в а. о., лигандирующем Ca2+
(D96A), не секретировались из трансфецированных клеток и не проявляли пероксидазной
активности [Shin et al., 2001].
37
Рис. 1.12. а. Строение молекулы МПО. Синим и красным обозначены тяжелые цепи,
голубым и розовым – легкие цепи, зеленым – гемы, оранжевым – углеводные остатки,
желтым – Cl-, малиновым – Ca2+ [Fiedler et al., 2000]. б. Схема строения гема МПО.
Обозначены кольца А, В, С и D, а также связь пяти молекул воды (w) с а. о. МПО
[Blair-Jonnson et al., 2001].
В отличие от ЭПО, МПО представляет собой димер, в котором тяжелые альфа-цепи
связаны дисульфидной связью. Колоние-стимулирующий фактор гранулоцитов (G-CSF)
индуцирует дифференцировку полипотентной клетки-предшественницы, что ведет к
активации белков Pu1 (Spi-1) и C/EBP (CCAAT/enhancer binding protein), их миграции в
ядро и связыванию с дистальным энхансером гена МПО [Ford et al., 1996]. Промотор
МПО содержит также Alu элемент с сайтами связывания для ретиноевой кислоты и
рецептора тиреоидных гормонов [Austin et al., 1995]. Кроме того, экспрессия гена МПО
регулируется проксимальными энхансерами с помощью c-myb и ALT-1 [Britos-Bray and
Friedman, 1997]. ЭПО и МПО синтезируются в виде полипептида-предшественника,
который последовательно претерпевает отщепление сигнальной последовательности и
котрансляционное N-гликозилирование. После ограниченного дегликозилирования в
эндоплазматическом ретикулуме образуется неактивный предшественник. Эта форма
взаимодействует с кальций-связывающими белками кальретикулином и кальнексином,
действующими как молекулярные шапероны для превращения в форму, подходящую для
включения гема [Nauseff et al., 1995]. Включение гема образует каталитически активную
про-форму и готовит фермент к последовательному протеолитическому процессингу,
ведущему к образованию зрелой пероксидазы. Гидролиз про-формы в кислом
прелизосомальном компартменте приводит к образованию белка, содержащего две
субъединицы в одной полипептидной цепи. Следующее за этим протеолитическое
38
разделение тяжелых и легких цепей (и в случае МПО – димеризация) ведет к
образованию зрелой пероксидазы [Andersson et al., 1998].
Под действием H2O2 ион Fe3+, находящийся в составе гема МПО и ЭПО, быстро
окисляется до Соединения I (рис. 1.13, 1), образуется феррил p-катион радикал с
формальной степенью окисления железа (+5). Этот интермедиат имеет окислительновосстановительный потенциал, подходящий для окисления широкого круга субстратов с
одно-
и
двухэлектронным
переносом.
Галогенид-
и
тиоцианат-ионы
являются
первичными субстратами для окисления МПО и ЭПО. Тиоцианат имеет самый низкий
окислительный потенциал и может избирательно окисляться МПО и ЭПО. В отличие от
МПО, ЭПО эффективно окисляет хлорид только при кислых значениях рН среды. При
физиологических концентрациях хлорида (100–140 мМ) и тиоцианата (20–120 мкМ) МПО
далека от насыщения. Добавление даже небольших доз тиоцианата в присутствии
физиологических концентраций хлорида увеличивает утилизацию H2O2 вплоть до
соотношения Cl-/SCN-=100/1 (моль/моль). При двухэлектронном переносе образуется
гипогалогенид (гипотиоцианат), а ион железа в пероксидазе восстанавливается до Fe3+.
Этот цикл принято называть галогенирующим (рис. 1.13, 2). Образующиеся при этом
соединения – HOCl, HOBr и HOSCN – являются мощными цитотоксическими агентами,
способными быстро реагировать с нуклеофильными группами типа аминов и тиолов,
которые, в свою очередь, сохраняют окислительный потенциал [Dalen et al., 1997].
К субстратам пероксидаз также относится широкий спектр органических соединений,
включая тирозин, серотонин, адреналин, аскорбат и множество ксенобиотиков
ароматической природы [Ghibaudi and Laurenti, 2003]. Окисление этих субстратов идет по
одноэлектронному
механизму
и
приводит
к
образованию
промежуточного
ароматического радикала и Соединения II (Fe(IV)=O). В этом соединении ион железа
имеет степень окисления (+4), и окислительно-восстановительный потенциал ниже, чем у
Соединения I (рис. 1.13, 3, 3’). Однако оно может быть восстановлено до исходного Fe3+
различными субстратами для завершения пероксидазного цикла (рис. 1.13). Под
действием O2• (k = 2×106 M–1×c1) образуется Соединение III (МПО-Fe(II)-O2), или оксиМПО. Основное количество МПО в фаголизосоме преобразуется в Соединение III во
время активации фагоцитов [Winterbourn and Kettle, 2004]. Субстратами для МПО могут
быть NO и его метаболиты. Изучение влияния NO на активность МПО показало, что в
низких концентрациях (менее 50 мкМ) NO активирует, а в высоких (более 100 мкМ) –
ингибирует МПО [Abu-Soud and Hazen, 2000].
39
Рис. 1.13. Обобщенная схема основных катализируемых МПО реакций [Ghibaudi and
Laurenti, 2003; Winterbourn and Kettle, 2004]. Реакции 1 и 2 – галогенирующий цикл,
реакции 1, 3 и 3’ – пероксидазный цикл. X=Cl, Br, I, SCN, R – субстрат пероксидазы.
Как было указано выше, МПО является единственной пероксидазой млекопитающих,
способной к образованию гипохлорита и N-хлораминов, которые существенно повышают
антимикробный потенциал фагоцитов [Klebanoff, 1970]. На такую роль МПО указывают
наблюдения о повышенной чувствительности к микробным инфекциям индивидуумов с
наследственной или приобретенной недостаточностью МПО [Kutter et al., 2000].
Наследственная недостаточность МПО (1/2000–4000), как правило, связана с мутациями,
влияющими на процессинг белка и связывание с ним гема, при этом уровень синтеза
МПО может не отличаться от нормы. Приобретенный дефект связан с нейтрофильной
недостаточностью различной этиологии. Пациенты с недостаточностью МПО особенно
чувствительны к патогенным грибкам Candida albicans, и у них гораздо чаще
наблюдаются злокачественные опухолевые перерождения [Lanza, 1998]. Исследования на
мышах с наследственным дефицитом МПО показали их невосприимчивость к
Staphylococcus aureus и гиперчувствительность к Candida albicans [Aratani et al., 1999].
40
Действие HOCl, функционирующей МПО или активированных НФ, как правило,
вызывает инактивацию ферментов. Исключение составляют коллагеназа и желатиназа
гранул НФ, которые, наоборот, активируются в присутствии как HOCl, так и
стимулированных НФ по HOCl-зависимому пути [Chatham et al., 1992; Saari et al., 1992;
Peppin et al., 1986; Michaelis et al., 1992; Weiss et al., 1985]. В ряде случаев белки,
обработанные HOCl, становятся более чувствительными к протеолитическим ферментам.
Так, предварительная инкубация фибронектина и коллагена в присутствии HOCl
увеличивает протеолитическую активность эластазы и коллагеназы в отношении
указанных белков соответственно [Vissers and Winterbourn, 1991; Davies et al., 1993].
Интересно сообщение об ингибировании МПО активности триптазы (IC50 16 нМ после 1
часа инкубации). Ингибирование снимается гепарином и зависит от времени
инкубирования МПО с триптазой, в ходе которого МПО способствует мономеризации
активных тетрамеров триптазы [Cregar et al., 1999]. Следует также отметить, что другие
сериновые протеазы: трипсин, тромбин, плазмин, катепсин G, эластаза и F Xa – не
ингибируются МПО [Cregar et al., 1999]. По сходному механизму триптазу ингибирует
ЛФ, который также обладает аффинностью к гепарину [He et al., 2003; Elrod et al., 1997].
Особенностью каталитической активности ЭПО является предпочтительное окисление
ионов бромида, что обусловливает обнаружение биомаркеров бромирования, например,
3-бромтирозина, при развитии в организме паразитарных инфекций и аллергических
реакций, для которых характерно увеличение содержания в крови ЭОФ и повышение
активности ЭПО in vivo [Hawkins and Davies, 2005].
Несмотря на то, что оксиданты, образующиеся при респираторном взрыве, являются
эффективными антимикробными агентами, сам по себе респираторный взрыв кажется
недостаточным для антимикробной активности лейкоцитов, о чѐм свидетельствуют
эксперименты с мышами, нокаутированными по генам нейтрофильной эластазы и
катепсина G [Reeves et al., 2002]. При нормальных показателях респираторного взрыва
фагоцитов такие животные страдали от бактериальных и грибковых инфекций. Таким
образом, хотя генетические дефекты NADPH-оксидазы и МПО сопряжены с развитием
инфекций, помимо механизмов, основанных на действии оксидантов, для эффективного
антимикробного действия фагоцитов необходимы белковые компоненты, антимикробные
функции которых напрямую не связаны с оксидантами.
1.2.2. Протеолитические ферменты лейкоцитов
В азурофильных, специфических и желатиназных гранулах НФ содержатся сериновые
протеиназы и металл-зависимые матриксные протеиназы (желатиназа и коллагеназа). В
неактивированных фагоцитах протеиназы находятся в неактивном состоянии, чему
сопособствуют низкие значения рН внутри гранул и образование комплексов с
41
полианионными протеогликанами (гепарин и хондроитин сульфатами) [Kolset and
Gallagher, 1990]. При активации фагоцитоза в гранулах повышаются pH и концентрация
ионов калия, что приближает условия в фагосоме к оптимуму активности протеиназ и
разобщает их комплексы с кислыми протеогликанами. Как в случае использования
валиномицина – ионофора K+, – так и при блокировании кальций-активируемых
калиевых каналов ибериотоксином либо паксиллином, несмотря на достаточный уровень
продукции оксидантов, не наблюдалось эффективного антимикробного эффекта НФ
[Reeves et al., 2002; Ahluwalia et al., 2004].
В азурофильных гранулах НФ выявлены четыре белка из семейства серпроцидинов, в
которое на основе гомологии первичной последовательности и антимикробных свойств
входят азуроцидин (CAP37), эластаза (NE), катепсин G (CG) и протеиназа 3 (PR3).
Основные физико-химические свойства протеолитически активных серпроцидинов
указаны в таблице 1.5. В экспериментах in vitro была продемонстрирована активность
серпроцидинов против грамотрицательных и грамположительных бактерий, низших
грибов, простейших и клеток высших эукариот. Цитотоксический эффект этих белков
подавляется умеренными концентрациями NaCl (0,1–0,2 М), катионами Ca2+, Mg2+, а
также
сывороткой
крови,
что
говорит
о
качественном
сходстве
механизмов
антимикробного действия серпроцидинов [Gabay and Ameida, 1993]. Следует также
отметить, что для антимикробного действия не критично наличие у серпроцидинов
протеиназной
активности,
поскольку
заингибированные
ферменты
не
теряют
антимикробных свойств. Так, CAP37, несмотря на высокий процент гомологии с
протеиназами серпроцидинового семейства, утратил два а. о., формирующих триаду
активного центра сериновой протеиназы (S41 вместо H и G175 вместо S), однако его
антимикробная активность не уступает активности NE, CG и PR3 [Almeida et al., 1991;
Morgan et al., 1991].
Помимо непосредственного участия в реализации механизмов антимикробной
активности НФ: расщепление бактериального флагеллина NE лишает бактерии
вирулентности [Lopez-Boado et al., 2004], участие в процессинге антимикробных
пептидов кателецидинов активной NE [Cole et al., 2001], – серпроцидины обладают рядом
регуляторных свойств в отношении участников воспалительного процесса. Показано, что
NE и другие серпроцидины ингибируют вызванную FIIa активацию эндотелиальных
клеток и агрегацию тромбоцитов за счет расщепления N-концевого домена тромбинового
рецептора [Renesto et al., 1997]. Расщепляя FIX, NE лишает его коагуляционной
активности [Takaki et al., 1983]. Протеолитическая регуляция NE и CG рецептора
урокиназы/CD 87 на моноцитах приводит к освобождению хемотаксических производных
данного белка и уменьшает интесивность приклеточного протеолитического каскада
42
[Beaufort et al., 2004]. Путем протеолитической активации рецептора 2-го типа на
фибробластах NE вызывает продукцию цитокинов: IL-8 и хемотаксического белка 1
моноцитов [Uehara et al., 2003]. Расщепляя G-CSF, NE способна регулировать
гранулопоэз по механизму отрицательной обратной связи [El Ouriaghli et al., 2003].
Обработка НФ NE или CG лишает их способности связываться с P-селектином
эндотелиальных клеток и препятствует адгезии [Gardiner et al., 2001].
Таблица 1.5
Основные свойства протеиназ серпроцидинового семейства [Bank and Ansorge, 2001]
Нейтрофильная
Катепсин G (CG)
Протеиназа 3 (PR3)
эластаза (NE)
К.Ф.
3.4.21.37
Синонимы
Медуллазин
3.4.21.20
3.4.21.76
Миелобластин,
AGP7, p29
Количество а. о.
218
235
222
M, кДа
30
28,5
29
pI
>9
~12
>9
pH-оптимум
8,0–8,5
8,0
7,5
Триада а. о.
H70, D117, S202
H64, D108, S201
H71, D118, S203
Субстратная
Гидролиз связей за
Гидролиз связей
Аналогично NE, за
специфичность
а. о. V и A
перед
исключением связей
ароматическими а. о.
перед основными а.
активного центра
о.
Основные функции
Протеолиз в
Протеолиз в
Протеолиз в
лизосоме, гидролиз
лизосоме,
лизосоме,
внеклеточных и
антимикробная,
антимикробная,
биоактивных
активация
контроль
белков,
тромбоцитов,
миелоидной
антимикробная
деградация факторов
дифференцировки
свертывания крови
Эндогенные
ингибиторы
2-макроглобулин,
элафин
1-антихимотрипсин
2-макроглобулин,
элафин
Матриксные металл-зависимые протеиназы (ММП-7, ММП-8, ММП-9 и ММП-12),
содержащиеся в НФ, участвуют в расщеплении компонентов внеклеточного матрикса,
главным образом коллагена, эластина и желатина [Murphy et al., 1980; Ilumets et al., 2007;
43
Rijken et al., 2005]. Активность ММП обусловлена наличием иона цинка в их активном
центре [Grasso and Bonnet, 2014]. При избыточной активации НФ, вызванной курением
или избыточной инсоляцией, данные компоненты вызывают деструкцию соединительной
ткани в легких и коже. Основные свойства ММП, содержащихся в НФ, указаны в таблице
1.6.
Таблица 1.6
Основные физико-химические свойства матриксных металлопротеиназ НФ
ММП-7
Синонимы
Матрилизин-
ММП-8
Коллагеназа-2
ММП-9
ММП-12
Желатиназа В
I, коллагеназа
Металлоэластаза
макрофагов
нейтрофилов
M, кДа
28
(активная 75
19)
Лиганды
для
(активная 92 (активная 86)
58)
2 (H163, D165, (H167,
ионов Zn2+
H178, H191)
H224)
(активная
45/22)
D169, (H175,
H182, H195)
(H214, H218, (H217,
54
D177, (H168,
H190, H203)
H183, H196)
H221, (H401,
H405, (H218,
H411)
H228)
H227)
D170,
H222,
Тип
I, II, III, IV, V, I, II, III, V, VIII, IV, V, VII, XIV
расщепляемого
X
X
Дополнительные
Аггрекан,
Аггрекан,
Аггрекан,
Эластин,
субстраты
эластин,
фибронектин,
эластин,
фибронектин,
дефенсины,
желатин,
фибронектин,
плазминоген,
Е-кадгерин,
ламинин,
плазминоген,
желатин,
ламинин,
субстанция P
proTGF- ,
ламинин,
I, IV
коллагена
плазминоген,
proTNF- ,
proTNF- , ТФ
1 ,
IL- proTNF-
IL-2R ,
субстанция P
Помимо расщепления компонентов внеклеточного маткрикса, ММП-7 участвует в
процессинге альфа-дефенсинов, продуцируемых клетками Панетта в тонком кишечнике
[Yang et al., 2001].
Помимо прямого антимикробного эффекта как сериновые, так и ММП расщепляют
цитокины и их рецепторы, что является частью регуляции воспалительного ответа.
Примеры эффектов действия серпроцидинов приведены в таблице 1.7 [Bank and Ansorge,
2001].
44
Таблица 1.7
Регуляция серпроцидинами различных компонентов цитокиновых сетей
Эффект от протеолиза
Инактивация цитокина
Протеиназа
NE, KG, PR3
Цитокин
IL-2, Ограничение
TNF- ,
провоспалительного ответа
IL-6
Активация цитокина
Усиление
PR3
активности PR3, KG
хемокина
Шеддинг
IL-1 , TNF- , Усиление
рецептора
локального
IL-18
воспаления за счет Th1-ответа
IL-8,
NAP-2, Усиление хемотаксиса, но не
инфильтрованных НФ
ENA-78
цитокинового NE, KG
Биологический эффект
IL-2R , TNF- Уменьшение
RII, IL-6R
ответа
на
цитокин и увеличение его
T1/2
Процессинг
связывающих
Увеличение
NE, PR3, KG TGFцитокин
белков
связывающий
белок,
доступности
ростового фактора
IGIF
связывающий
белок
1.2.3. Железо-связывающие белки лейкоцитов
Одним из механизмов ограничения роста микроорганизмов является секвестрирование
ионов железа из среды. Для этого в гранулах лейкоцитов содержатся высокоаффинный
хелатор железа – лактоферрин (ЛФ) – и белок, связывающий бактериальные сидерофоры
– желатиназо-ассоциированный липокалин нейтрофилов (N-GAL) [Arnold et al., 1980].
Желатиназо-ассоциированный липокалин нейтрофилов (N-GAL) содержащийся в
специфических гранулах НФ, с высокой аффинностью связывает бактериальные
сидерофоры катехолатного типа, лишая таким образом бактерии железа [Borregaard and
Cowland, 2006]. Чувствительность мышей, нокаутированных по гену N-GAL, к
внутрибрюшинной инфекции E. coli подтверждает роль этого белка НФ в антимикробной
защите организма.
45
Впервые ЛФ был описан в 1939 году как красный железо-связывающий белок,
выделенный из молока [Sorensen and Sorensen, 1939]. В 1969 году ЛФ был
идентифицирован иммунологически в гранулярном аппарате НФ человека и морской
свинки, была продемонстрирована иммунологическая идентичность ЛФ, выделенных из
грудного молока и из НФ [Masson et al., 1969; Masson, 1970]. ЛФ является маркерным
белком специфических гранул НФ. Он входит в семейство трансферринов и подобно
другим представителям этого семейства – трансферрину (ТФ) сыворотки крови и
овотрансферрину – ЛФ состоит из двух гомологичных долей: N- и C-доли, названных
соответственно концам его полипептидной цепи. Гомология ЛФ и ТФ составляет около
60 %, а N- и С-доли гомологичны между собой на 40 %, что позволяет предположить
происхождение трансферринов посредством дупликации предкового гена около 300–500
млн. лет назад [Metz-Boutigue et al., 1984].
Рис. 1.14. а. Пространственная структура молекулы ЛФ, насыщенного железом
(обозначены: слева N-доля: N1-домен темно-синий, N2-домен малахитовый, а справа
С-доля: С1-домен темно-синий, С2-домен малахитовый, верхняя фиолетовая спираль
соединяет N- и C-доли, а нижняя С-концевая спираль участвует в нековалентной связи
долей, красный – ион железа; зеленый и оранжевый – положение карбонат-аниона); б.
Строение Fe3+-связывающего сайта в N-доле ЛФ человека [Baker and Baker, 2005].
Полипептидная цепь ЛФ состоит из 691 а. о. (M ~ 78 кДа). Две его глобулярные доли:
N- (1–333) и С-концевая (345–361), соединены между собой альфа-спиралью (334–344).
Данный участок у ТФ имеет нерегулярную структуру и более подвижен [Anderson et al.,
1984; Baker et al., 1987]. N- и C-доли в ЛФ нековалентно связаны, главным образом за
счет гидрофобных взаимодействий, и не разделяются в неденатурирующих условиях
после протеолитического расщепления соединяющей их спирали [Legrand et al., 1986].
Каждая молекула ЛФ прочно связывает два иона Fe3+. Образование комплекса с ионами
Fe3+ идет в присутствии бикарбонатных ионов. Присоединение ионов железа к ЛФ меняет
46
его изоэлектрическую точку с 9,2 на 8,5 за счет одновременного присоединения
отрицательно заряженных бикарбонатных ионов. Связывающие сайты в N- и С-долях
устроены одинаково и приспособлены для связывания Fe3+ и HСО3-. Ион металла
взаимодействует с четырьмя а.о. в N-доле (D61, Y93, Y191, H252) и с таким же числом а.
о. в C-доле (D407, Y447, Y540, H609), а также с двумя атомами кислорода
карбоксильного аниона (рис. 1.14).
Анион, в свою очередь, укладывается в своеобразный «карман», образованный двумя
положительно заряженными группами R121 (R465) и N-концом одного из -спиральных
участков [Baker, 1994]. Несмотря на идентичность аминокислотных лигандов в
металлосвязывающих сайтах ЛФ и ТФ, связь ионов железа с белковой частью в ЛФ
человека устойчивее к снижению pH среды. Полагают, что одна из причин этого состоит
в том, что соединяющий N- и С-доли пептид в ЛФ принимает конформацию -спирали,
тогда как в ТФ этот участок содержит несколько пролинов и имеет менее упорядоченную
структуру. Еще одним фактором, влияющим на прочность связывания Fe 3+, является
взаимодействие между долями [Baker, 1994]. ЛФ способен создавать железодефицитную
среду и этим препятствует хронической инфекции легких патогеном Pseudomonas
aeruginosa [Singh et al., 2002], поскольку разобщается направленное движение
микроорганизмов, что препятствует образованию микроколоний. ЛФ также уменьшал
чувствительность к инфекции Mycobacterium tuberculosis у мышей, нокаутированных по
гену
2-микроглобулина
– генетическая модель перегрузки железом [Schaible et al., 2002].
Ген ЛФ протяженностью 35 т. п. н. был картирован на хромосоме 3p21.3 [Teng et al.,
1987]. В его состав входят 17 экзонов. Высококонсервативный сигнальный пептид ЛФ
состоит из 19 а. о. Многие авторы указывают на полиморфизм гена ЛФ и наличие
изоформ ЛФ [Liu et al., 2002; Furmanski et al., 1989]. Промотор гена ЛФ содержит
неканонический TATA-бокс, ААТААА, и расположенные выше Sp1, C/EBP и Ets
элементы (с –85 по –35), вовлеченные в экспрессию гена ЛФ в течение миелоидной
дифференцировки
[Khana-Gupta
высококонсервативный
эстрогено
et
al.,
2000].
чувствительный
Еще
выше
расположен
элемент
(ERE),
работающий
совместно с COUP-элементом (chicken ovalbumin upstream promotor) [Teng, 2002]. Другой
регуляторный элемент (с –850 по –820) связывает ССААТ замещающий белок (CDP/cup)
и ответственен за «сайленсинг» гена ЛФ [Khana-Gupta et al., 1997].
Наличие множества функций позволяет отнести ЛФ к группе “moonlighting proteins”
[Brock,
2002].
Антимикробная
функция
ЛФ,
особенно
важная
при
грудном
вскармливании [Brock et al., 1980], реализуется за счет нескольких молекулярных
механизмов. Взаимодействие ЛФ с полианионными молекулами – ДНК, липидом А в
составе ЛПС, гепарином, а также катионным белком лизоцимом – обусловлено N-
47
концевым аргининовым кластером ЛФ, 2RRRR5. При последовательной замене этих а. о.
аффинность ЛФ к перечисленным молекулам резко снижалась, на взаимодействие влияла
концентрация NaCl. Так при физиологической концентрации 0,15 M NaCl с ЛФ
связывалось только 40 % ЛПС и лизоцима, а при 0,4 M NaCl взаимодействие полностью
разобщалось [van Berkel et al., 1997]. Взаимодействие ЛФ с лизоцимом хорошо
согласуется с данными об их синергичном антимикробном действии [Ellison and Giehl,
1991], однако ряд авторов успешно разделяли ЛФ и лизоцим молока с помощью гельфильтрации [Boesman-Finkelstein and Finkelstein, 1982]. Взаимодействие с лизоцимом и
ЛПС не зависит от насыщения ЛФ ионами железа и от его гликозилирования [van Berkel
et al., 1995]. Тот факт, что ЛФ связывается с ДНК с Kd ~ 10–8 М, тогда как взаимодействие
ДНК с гистонами характеризуется Kd ~ 10–7 M, позволило предположить наличие у ЛФ
транскрипционной активности. В 1995 году была показана сиквенс-специфическая
активация транскрипции под действием ЛФ [He and Furmanski, 1995]. Позже было
показано, что для эффективной нейтрализации лактоферрином гепарина с целью
использования его как прокоагулянта необходимы также а. о. R25 и R28 в близко
расположенном сайте
28
сообщение
что
о
том,
RKVR32 [Wu and Church, 2003]. Неожиданным оказалось
синонимичный
полиморфизм
K/R29,
связанный
с
однонуклеотидной заменой в первом экзоне гена ЛФ, приводит к ювенильному
периодонтиту. Указанные варианты ЛФ не отличались по способности связывать ионы
железа и по антибактериальной активности в отношении грамотрицательной бактерии
Actinobacillus
actinomycetemcomitans.
Однако
ЛФ-R29
практически
не
проявлял
бактерицидной активности против грамположительных бактерий Streptococcus mutans и
S. mitis и не обладал транскрипционной активностью в отличие от ЛФ-К29
[Velliyagounder et al., 2003].
Влияние ЛФ на продукцию цитокинов позволяет считать его иммуномодулятором.
Однако существует еще несколько примеров ЛФ-опосредованной регуляции иммунного
ответа. Активность естественных киллеров (NK) увеличивается под действием ЛФ
[Shimizu et al., 1996].
Бактериальные неметилированные динуклеотиды CpG, связываясь с ЛФ, теряют
способность вызывать провоспалительную экспрессию CD86 на B-клетках [Britigan et al.,
2001].
К
сожалению,
авторы
не
проверили,
препятствует
ли
ЛФ
другим
иммуностимулирующим эффектам CpG олигонуклеотидов.
Действуя через сигнальный путь MAP-киназы, ЛФ активирует ген ММП-1, с которым
в AP-1 сайте связываются JNK (c-Jun NH2-terminal kinase) и p38 MAPK [Oh et al., 2001].
Активированные ЛФ макрофаги секретируют IL-8, TNF-a и NO [Sorimachi et al., 1997].
Однако ЛФ препятствует ЛПС-индуцированной продукции цитокинов моноцитами,
48
нарушая связывание NF-kB с промотором TNF-a; кроме того, уменьшается продукция IL1b, IL-6, IL-8 и IL-10 [Haversen et al., 2002].
ЛФ стимулирует синтез противовоспалительных цитокинов IL-4 и IL-10, смягчая
течение колита у крыс [Togawa et al., 2002]. ЛФ препятствует ряду провоспалительных
эффектов ЛПС: во-первых, N-концевой фрагмент ЛФ – лактоферрицин – нейтрализует
ЛПС [Bellamy et al., 1992; Zhang et al., 1999]; во-вторых, конкурируя с сывороточным
ЛПС-связывающим белком, ЛФ препятствует связыванию ЛПС c mCD14 на поверхности
макрофагов [Elass-Rochard et al., 1998]; в-третьих, ЛФ ингибирует продукцию активных
форм кислорода НФ, блокируя связывание ЛПС с L-селектином [Baveye et al., 2000];
наконец, препятствуя образованию комплекса растворимого CD14 с ЛПС, ЛФ ингибирует
секрецию IL-8 эндотелиальными клетками [Elass et al., 2002].
1.2.4. Белки лейкоцитов, влияющие на стабильность мембраны микроорганизмов
Одним
из
механизмов
антимикробной
активности
НФ
является
нарушение
целостности мембраны микроорганизмов. Такой активностью обладают лизоцим,
бактерицидный проницаемость увеличивающий белок, антимикробные катионные
пептиды, в том числе N-концевой фрагмент ЛФ, лактоферрицин.
Лизоцим (мурамидаза, К.Ф. 3.2.1.17) был открыт Флемингом в первую очередь как
бактерицидный фермент экзокринных секретов [Fleming, 1922]. Этот катионный белок
(pI>10) содержится также в гранулах НФ и вызывает ферментативный гидролиз 1,4 бетасвязи
между
остатками
N-ацетилмурамовой
кислоты
и
N-ацетилглюкозамина,
деполимеризуя один из ведущих компонентов клеточной оболочки бактерий – муреин
[Hindenburg et al., 1974].
Бактерицидный
проницаемость
увеличивающий
белок
(pI~9,5)
содержится
в
азурофильных гранулах НФ и обладает цитотоксическим действием в отношении
грамотрицательных бактерий. N-концевой домен белка обладает высокой аффинностью к
ЛПС (Kd ~ 5 нМ) и способностью нейтрализовать реакцию иммунной системы на ЛПС
[Gazzano-Santoro et al., 1992].
Катионные антимикробные пептиды НФ представлены двумя семействами: альфадефенсинами (HNP1-4) и кателицидинами (LL-37) [Yang et al., 2001]. Для всех семейств
дефенсинов характерно наличие трех дисульфидных мостиков; в альфа-дефенсинах эти
три связи образованы между остатками C1 и C6, C2 и C4, C3 и C5. Кателицидин
образуется путем протеолитического расщепления С-конца предшественника (hCAP18).
Название LL-37 обусловлено тем, что зрелый антимикробный пептид содержит 37 а. о. и
начинается с двух остатков лейцина. Антимикробная активность катионных пептидов
49
обусловлена их амфипатической структурой, которая позволяет им формировать поры в
мембране микроорганизмов. Кроме того, антимикробные пептиды нейтрализуют ЛПС и
обладают хемотаксической активностью в отношении различных клеток иммунной
системы [Yang et al., 2001].
1.2.5. Окислительная модификация липопротеинов, сопровождающая воспаление
Одно из основных клинических проявлений атеросклероза – накопление липидов,
главным образом эфиров холестерина, в стенке артерий. В настоящее время атеросклероз
относят к воспалительной патологии, связанной с реактивностью иммунной системы к
комплексному процессу нарушения метаболизма холестерина. Так, Steinberg называет
гиперхолестеринемию и воспаление партнерами одного преступления [Steinberg, 2002].
Важная роль в данном процессе принадлежит так называемым модифицированным
липопротеинам низкой плотности (ЛНП). В 80-х годах прошлого столетия сразу
нескольким группам ученых удалось обнаружить и выделить из крови больных
атеросклерозом подфракцию ЛНП, которая существенным образом отличалась по
физико-химическим свойствам от нативных ЛНП [Krauss and Burke, 1982; Avogaro et al.,
1988]. Такие модифицированные ЛНП способствовали накоплению внутриклеточного
холестерина и формированию ранних атеросклеротических поражений артериальной
интимы. Причина модификации ЛНП in vivo в настоящий момент до конца не выяснена.
На роль модификатора могут претендовать различные ферменты, обнаруженные в стенке
сосудов, пораженных атеросклерозом, прежде всего МПО [Brennan et al., 2003, Zhang et
al., 2001]. Образующиеся при действии МПО окислители, среди которых наибольшего
внимания
заслуживают
хлорноватистая
кислота/гипохлорит
(HOCl/OClˉ)
и
бромноватистая кислота/гипобромит (HOBr/OBrˉ), реагируют со всеми соединениями,
входящими в состав ЛНП: белком, фосфолипидами, холестерином, углеводами,
антиоксидантами (каротиноидами,
-токоферолом) [Panasenko et al., 1997; Панасенко и
соавт., 1997; Панасенко и соавт., 2002; Malle et al., 2006]. В различных тканях человека,
подвергнутых атеросклеротическому поражению, в частности в сосудах, был обнаружен
не только сам фермент [Daugherty et al., 1994; Baldus et al., 2003], но и достоверно
повышенное количество белка, модифицированного HOCl [Malle et al., 1995].
Гипогалоидные кислоты вступают в реакцию со всеми ненасыщенными связями,
входящими в состав жирнокислотной цепи [Панасенко и соавт., 2002; Панасенко и соавт.,
2004; Панасенко и соавт., 2006; Panasenko и соавт., 2003; Spalteholz et al., 2006]. В случае
взаимодействия полиненасыщенных фосфолипидов, содержащих остатки арахидоновой
или докозагексаеновой кислот, с гипогалоидными кислотами или с МПО + H2O2 +
Clˉ/Brˉ-системой
основным
продуктом
является
лизофосфолипид.
Чем
более
50
ненасыщенными являются ацильные цепи фосфолипидов, тем быстрее и в большем
количестве накапливаются в них лизофосфолипиды [Панасенко и соавт., 2004; Панасенко
и соавт., 2006; Panasenko et al., 2003]. Появление хлор- или бромгидринов на месте
двойной связи в 4-м (в случае остатка докозагексаеновой кислоты) или 5-м (в случае
остатка арахидоновой кислоты) положениях оказывается критическим для образования
лизофосфолипидов [Панасенко и соавт., 2004; Панасенко и соавт., 2006]. Таким образом,
МПО может в какой-то степени выполнять функцию фосфолипазы, вызывая посредством
каталитического синтеза HOCl/OClˉ и/или HOBr/OBrˉ образование соответственно хлори/или бромгидринов из ненасыщенных фосфолипидов с последующим спонтанным
гидролизом их эфирной связи и образованием лизофосфолипидов. Эта реакция может
иметь важное биологическое значение, поскольку известно, что лизофосфатидилхолин
играет роль регулятора различных патофизиологических процессов – например,
проявляет целый ряд свойств, позволяющих именовать его атеротромботической
молекулой. Он является хемоаттрактантом для моноцитов и Т-лимфоцитов, индуцирует
экспрессию фактора роста и адгезионных молекул в эндотелиальных клетках, является
митогеном по отношению к макрофагам и гладкомышечным клеткам, индуцирует
миграцию гладкомышечных клеток, ингибирует подвижность эндотелиальных клеток и
NO-зависимую релаксацию сосудов, стимулирует продукцию активных форм кислорода
сосудистыми клетками через активацию NADPH-оксидазы [Панасенко и соавт., 2004].
Способность HOCl проникать в липидную фазу липопротеинов крови приводит к
деградации липидорастворимых антиоксидантов [Панасенко и соавт., 1997; Панасенко и
соавт., 2002; Панасенко и соавт., 2003; Panasenko et al., 1997], снижает резистентность
липидной фазы к пероксидации [Панасенко и соавт., 1997], увеличивает содержание
первичных, вторичных
и
конечных
продуктов
окисления
липидов,
уменьшает
подвижность и увеличивает полярность ацильных цепей липидной фазы. Комплексная
модификация ЛНП, вызванная HOCl, нарушает их холестерин-транспортную функцию.
Они лучше захватываются макрофагальными клетками, что приводит к аккумуляции
холестерина в клетках и превращению их в так называемые пенистые клетки, дающие
начало развитию атеросклеротического поражения сосудов [Panasenko et al., 1997;
Панасенко и Сергиенко, 2001; Malle et al., 2006]. МПО, секретируемая при активации
фагоцитов во внеклеточную среду, способна взаимодействовать с белок-липидными
комплексами, в частности с липопротеинами крови [Carr et al., 2000]. Благодаря этому
фермент может локально осуществлять окислительные процессы в непосредственной
близости от липидной фазы липопротеинов, модифицируя их и придавая им
проатерогенные свойства.
51
Как отмечалось выше, МПО является ферментом, катализирующим окисление ЛНП
в естественных условиях посредством нескольких химических реакций (рис. 1.15),
преобразующих ЛНП в несколько проатерогенных форм в пределах стенки артерии.
Рис. 1.15. Участие МПО в модификации липопротеинов при атеросклерозе.
Обогащение ЛНП маркерами хлорирования, например 3-хлортирозином, позволяет
идентифицировать МПО как первичный катализатор специфического окислительного
пути в пределах атеросклеротической бляшки [Hazen and Heinecke, 1997]. Последующие
исследования расширили спектр окислителей, образование которых катализируется МПО
в артериальной стенке, включая образование окислителей – производных NO и
последующее нитрование ЛНП [Beckman et al., 1993; Podrez et al., 1999]. Обработка ЛНП
активированными моноцитами, продуцирующими МПО-зависимые реактивные формы
азота, приводит к пероксидации липидов, нитрованию белка и преобразованию ЛНП в
проатерогенную форму [Podrez et al., 1999], которая быстро поглощается макрофагами
через скавенджер-рецептор CD36 [Podrez et al., 2000]. Физиологическая природа этого
пути как начала пероксидации липидов была подтверждена исследованиями на мышах,
нокаутированных по гену МПО. У таких мышей продемонстрировано
сокращение
52
образования продуктов ПОЛ после активации НФ при воспалении [Zhang et al., 2002a;
Brennan et al., 2002]. Существуют также данные, что НФ, выделенные из крови людей с
дефицитом МПО, не инициируют перекисного окисления липидов при активации [Zhang
et al., 2002b]. Позже был идентифицирован МПО-зависимый путь, подвергающий
карбамилированию белок в ЛНП. Этот вид посттрансляционной модификации хорошо
охарактеризован на последней стадии уремии [Wang et al., 2007]. Тиоцианат как
предпочтительный субстрат для МПО, заметно повышенный в плазме курильщиков,
формирует реактивное промежуточное соединение, способное в очаге воспаления
карбамилировать нуклеофильные группы белков, такие как остатки лизина [Wang et al.,
2007]. Катализируемое МПО карбамилирование ЛНП преобразует их в лиганд для
скавенждер-рецептора SRA-1 макрофагов [Wang et al., 2007]. Таким образом, МПО может
быть причиной появления нескольких проатерогенных форм ЛНП, избирательно
захватывающихся макрофагами.
Роль карбамилирования в развитии атеросклероза в естественных условиях была
подтверждена следующими фактами: 1) антитела против карбамилированных ЛНП
локализуются с МПО в атероме; 2) MПО превращает ЛНП в форму, аффинную к SRA-1,
даже при незначительном уровне карбамилирования, наблюдаемом в плазме человека; 3)
клинические
исследования
показали,
что
системный
уровень
продукта
карбамилирования, связанный с белком гомоцитруллином (карбамиллизин), независимо
предсказывает риск сердечно-сосудистых заболеваний; и 4) у мышей, трансгенных по
МПО человека, отмечено увеличение частоты атеросклероза, а увеличение содержания
гомоцитруллина, связанного с белком, в ткани аорты было пропорционально уровню
отложения холестерина [Wang et al., 2007].
В последнее время повышается интерес к изучению функции ЛВП в патогенезе
атеросклероза. Причиной этому были наблюдения, что сердечно-сосудистые заболевания
развиваются даже при высоком уровне холестерина ЛВП, а также что ЛВП, выделенные
от пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями, обладают провоспалительной
активностью. В последнее время происходит отказ от терапевтических средств,
повышающих уровень ЛВП, а новые средства должны гарантировать отсутствие
отрицательного воздействия на функциональную активность ЛВП. Первые исследования
in vitro показали, что окислительная модификация ЛВП может быть общим механизмом
ухудшения их функциональных свойств, но потенциальные пути,
появлению
нефункциональных
ЛВП
in
vivo,
требуют
приводящие к
расшифровки.
Недавние
исследования предполагают, что катализируемая МПО сайт-специфическая модификация
апоА-I является механизмом, приводящим к подавлению функций ЛВП. Во-первых,
53
показано, что ЛВП, выделенные из атеросклеротической бляшки, содержат МПО и
продукты окисления [Zheng et al., 2004; Zheng et al., 2005], во-вторых, МПО
специфически связывается со спиралью 8 в апоА-I [Zheng et al., 2004]. АпоА-I,
выделенный из плазмы крови больных ишемической болезнью сердца, содержит большее
количество нитро- и хлортирозина по сравнению с апоА-I здоровых доноров [Zheng et al.,
2004; Bergt et al., 2004; Pennathur et al., 2004]. По данным амбулаторного исследования, у
людей с наивысшим содержанием нитротирозина и хлортирозина в апоА-I риск развития
сердечно-сосудистых заболеваний в 6 и 16 раз выше, чем у людей с наименьшим
содержанием окисленного апоА-I [Zheng et al., 2004]. Наблюдение 500-кратного
обогащения апоА-I хлортирозином в бляшке по сравнению с другими белками и апоА-I
плазмы при атеросклерозе поддерживает идею о том, что окислительная модификация
происходит предпочтительно в стенке артерии [Zheng et al., 2004]. Это согласуется с
колокализацией в бляшке апоА-I, МПО, хлорированного белка и гомоцитруллина [Hazell
et al., 1996; Malle et al., 2001]. Было обнаружено, что модификация апоА-I ухудшает
способность ЛВП захватывать холестерин макрофагов с помощью ABCA-1 и увеличивает
риск развития атеросклеротической бляшки [Zheng et al., 2004; Bergt et al., 2004;
Pennathur et al., 2004].
С помощью масс-спектрометрии были идентифицированы определенные участки на
апоA-I как предпочтительные мишени для МПО-зависимой окислительной модификации
[Zheng et al., 2004]. Было показано, что происходит предпочтительное окисление остатков
спирали 8 (Y192), которые сближены с участком предположительного связывания МПО с
апоА-I ЛВП [Zheng et al., 2004]. Последующие исследования показали, что МПОзависимая модификация апоA-I оказывает негативное влияние на путь обратного
транспорта
холестерина.
Например,
апоA-I
Y166,
являющийся
существенным
компонентом для связывания насцентных ЛВП с лецитин:холестерин-ацилтрансферазой
(LCAT), при выделении из атеросклеротической бляшки обычно модифицирован путем
хлорирования и нитрования [Wu et al., 2007]. Катализируемое МПО окисление
единственного метионина апоA-I около области активации LCAT (M148) приводит к
нарушению активности LCAT. Катализируемые МПО модификации апоA-I, которые
препятствуют связыванию и активации LCAT, вероятно, препятствуют обратному
транспорту холестерина.
Недавние исследования показали, что ЛВП, модифицированные системой МПО-H2O2-
Cl , конкурируют с нативными ЛВП как лиганд для BI скавенджер-рецептора (SRBI),
потенциально вмешиваясь в пути мобилизации холестерина от периферийных тканей в
печень [Nicolls and Hazen, 2009].
54
Хотя нет сомнения в том, что МПО катализирует окислительную модификацию апоA-I
и ослабляет его функцию, точные модификации, которые приводят к ухудшению
различных
функций
ЛВП,
требуют
дальнейших
исследований.
Структурные
исследования позволили представить соотношение функции и структуры ЛВП, чтобы
определить участки, вовлеченные в окислительную модификацию апоA-I. Обновленная
структурная модель ЛВП была недавно получена при исследовании водороднодейтериевого обмена с помощью масс-спектрометрии, позволяющей определить
количество амидов в полипептидной цепи апоА-I в ЛВП, доступных для обмена с
растворителем [Wu et al., 2007]. В данной модели две молекулы aпоA-I организованы в
антипараллельную двойную петлю, доступную для растворителя, соответствующую а. о.
159–170, которая вовлечена в присоединение и активацию LCAT. Эта петля содержит
одну из предпочтительных мишеней для окисления МПО – Y166, модифицированный в
aпoA-I, выделенном из атеросклеротических бляшек [Wu et al., 2007]. Недавние
исследования предполагают, что модификация тирозина не требуется для МПОзависимого нарушения пути оттока холестерина с помощью ABCA1, так как мутанты
aпoA-I с мутациями по всем остаткам тирозина были восприимчивы к окислительной
инактивации с помощью МПО [Peng et al., 2008]. Однако мутация Y166F привела к
потере большинства активностей LCAT [Wu et al., 2007]. Недавно были исследованы а. о.,
вовлеченные
в
окислительную
инактивацию
aпoA-I,
необходимые
для
оттока
холестерина по ABCA1 пути. В апоА-I было обнаружено четыре остатка триптофана,
доступных для окисления. Во-первых, сайт-направленный мутагенез с заменой данных
триптофанов на лейцины привел к тому, что полученные ЛВП были неспособны
осуществить отток холестерина, во-вторых, замена каждого из четырех остатков
триптофана на фенилаланин привела к тому, что полученные ЛВП были не только
функциональны в отношении оттока холестерина, но и заметно более устойчивы для
окислительной модификации. Эти данные предполагают, что модификация триптофанов существенный фактор, вовлеченный в утрату функции ЛВП для оттока холестерина с
помощью ABCA1 [Peng et al., 2005]. Как это ни парадоксально, другие исследователи не
сообщают ни о каком влиянии мутации триптофанов на функцию оттока холестерина и
вместо этого настаивают на ключевой роли тирозина и метионина в окислительной
инактивации ЛВП, несмотря на сообщения о том, что aпoA-I с полной заменой тирозинов
и метионинов сохраняет способность к оттоку холестерина, активации LCAT и
чувствительность к окислительной инактивации [Nicolls and Hazen, 2009].
Недавние исследования показали, что катализируемое МПО карбамилирование может
также играть важную роль в атеросклерозе посредством модификации ЛВП. Низкие
уровни
катализируемого
МПО
карбамилирования
ЛВП
препятствуют
апоптозу
55
эндотелиальных клеток и пролиферации гладко-мышечных клеток [Wang et al., 2007].
Учитывая, что МПО влияет на проатерогенность ЛНП и функциональные возможности
ЛВП по оттоку холестерина, можно предположить, что уменьшение активности МПО
способно обеспечить терапевтический подход к управлению про- и антиатерогенными
свойствами ЛНП и ЛВП. Тот факт, что статины частично снижают экспрессию гена МПО
[Kumar and Reynolds, 2005] и уменьшают системные уровни модификации белка
катализируемыми МПО путями [Shishehbor et al., 2003], предполагает, что как минимум
часть так называемого плейотропного эффекта статинов обеспечена их влиянием на
уровень и активность МПО.
Исследования влияния МПО на формирование атеросклеротических повреждений в
животных моделях атеросклероза привели к различным результатам. Модели на мышах
продемонстрировали роль МПО и продуктов ее катализа в остром воспалении,
пероксидации липидов, эндотелиальной дисфункции и неудачном ремоделировании
желудочков после инфаркта [Zhang et al., 2002; Brennan et al., 2002; Eiserich et al., 2002;
Askari et al., 2003]. Однако ранние исследования показали, что одновременное
нокаутирование по генам МПО и апо-Е у мышей не вызывало увеличения
атеросклеротических
повреждений,
а
пересадка
костного
мозга
от
мышей,
нокаутированных по гену МПО, облученным мышам, нокаутированным по гену
рецептора ЛНП, привело к неожиданно низкому уровню повреждений [Brennan et al.,
2001]. Последующие наблюдения указывают на непригодность мышиной модели для
исследования атерогенеза у человека: атеросклеротические повреждения аорты мышей
практически не содержали МПО и ее продуктов, в отличие от наблюдений на атероме
человека. Кроме того, мышиные лейкоциты содержат в 10-20 раз меньше МПО на клетку,
чем у человека [Brennan et al., 2001; Nauseef, 2001]. Несколько групп исследователей
предприняли попытки к созданию «гуманизированной» по МПО модели атеросклероза у
мышей. Оказалось, что мыши, трансгенные по МПО человека, страдают от атеросклероза
и развивающихся бляшек [Wang, et al., 2007; Castellani et al., 2006; McMillen et al., 2005].
Использование таких мышей, в организме которых обнаруживаются высокие уровни
каталитически
активной
МПО,
потенциальных
ингибиторов
МПО
является
как
перспективным
эффекторов,
для
исследования
препятствующих
развитию
атеросклероза.
1.3. Заключение по обзору литературы
В литературе существует достаточно большой массив данных, которые явились
предпосылкой для проведения исследования взаимодействия ЦП с
белковыми
компонентами лейкоцитов. Известно, что нокаутированные по гену ЦП животные
56
чувствительны к развитию воспаления [Glezer et al., 2007; Bakhautdin et al., 2013], среди
белков лейкоцитов и участников воспаления был обнаружен ряд партнеров ЦП [Соколов
и соавт., 2007; Vasilyev, 2010]. ЦП относят к физиологическим регуляторам активности
МПО [Segelmark et al., 1997; Sokolov et al., 2008; Champan et al., 2013], которая является
основным ферментом лейкоцитов, катализирующим синтез хлорноватистой кислоты –
важнейшего предшественника свободных радикалов при воспалении [Панасенко и соавт.,
2013]. Нами было показано, что протеолизованный ЦП не способен ингибировать
активность МПО [Соколов, 2007]. При этом ферментативные системы, вызывающие
протеолиз ЦП in vivo и при очистке его препаратов, до сих пор не были детально
охарактеризованы, хотя протеолизованный ЦП выявлен в сыворотке крови у пациентов с
болезнью Альцгеймера [Squitti et al., 2008] и гемофилией А и В [Алексанян, 2007].
Протеолиз препаратов ЦП при хранении независимо описан несколькими группами
исследователей [Ryden, 1971; Kingston et al., 1977; Kingston et al., 1979; Moshkov et al.,
1979; Prozorovski et al., 1982; Соколов и соавт., 2005]. Среди белков лейкоцитов,
взаимодействующих с ЦП, нами были выявлены три протеиназы, представители
семейства серпроцидинов: эластаза, катепсин G и протеиназа 3 [Соколов и соавт., 2007].
Тот факт, что при ряде патологий, связанных с избыточным воспалением, выявляются
признаки
повреждения
галогенирующего
собственных
стресса
и
тканей
организма,
модифицированные
например
проатерогенные
биомаркеры
липопротеины
[Панасенко и соавт., 2013], свидетельствует о том, что «буферная противовоспалительная
емкость» существующих в организме эндогенных регуляторов воспаления, в том числе
ЦП, конечна и молекулярная основа этих ограничений требует расшифровки.
57
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Реактивы, использованные в работе
В работе использовались следующие реактивы: конъюгат пероксидазы хрена с
антителами осла к IgG кролика (“Amersham”, Великобритания); моноклональные
антитела мыши против 5-LO человека (“BD Biosciences”, США); Bio-Gel A-1,5m, Chelex
100, Tween 20, UNO-sphere S и Q, сухое молоко, окрашенные маркеры молекулярной
массы (“BioRad”, США); 2,2'-диазинобис(3-этилбензотриазолин-6-сульфонат) натрия
(ABTS), пара-нитрофенол-t-BOC-Ala (NBA) (“ICN”, США); H2O2 (8М), бром (Br2),
дихлорэтан, тетраборгидрид натрия, триэтиламин, соль Мора (Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O),
цианид калия, ЭДТА (“Merck”, Германия); Сефароза 4B, Сефароза 6В, DEAE-Сефадекс A50, QAE-Сефадекс A-50, CM-Сефадекс С-50, фенил-Сефароза (“Pharmacia”, Швеция);
полный и неполный адъюванты Фрейнда, азид натрия, ацетонитрил, гваякол, глицерол,
Кумасси R-250, маннитол, 2-меркаптоэтанол, нитроцеллюлоза (NC-2), персульфат
аммония, сахароза, Tris, 2-хлорэтиламин, эпихлоргидрин (“Serva”, Германия);
-(4-
пиридил-1-оксил)-N-трет-бутилнитрон (4-ПОБН), -аланин, гидразид 4-аминобензойной
кислоты (ABAH), гипохлорит натрия (30%-ный), глицин, орто-дианизидин (o-DA),
дигидроксифенилаланин (DOPA), диметилсульфоксид (ДМСО), додецилсульфат натрия
(SDS), конго красный, метиловый зеленый, липополисахариды (ЛПС) Salmonella
typhimurium, нитрат серебра, пиронин G, протамин кеты (ПР), реагент Фолина-Чокальтеу,
3,3',5,5'-тетраметилбензидин
(TMB),
тирозин,
тромбин
человека
(FIIa),
пара-
фенилендиамина дигидрохлорид (p-PD), фенилметилсульфонилфторид (PMSF), 3-(2пиридил)-5,6-бис(4-фенилсульфоновая кислота)-1,2,4-триазин (феррозин), фоброл-12миристил-13-ацетат (PMA), 4-хлор-1-нафтол, холестерин оксидаза (Nocardia erythropolis),
холестерин эстераза (Pseudomonas fluorescens), этиловый эфир N-бензоил-L-тирозина
(BTEE) (“Sigma”, США); акриламид, аргинин, N,N'-метиленбисакриламид (МБА),
N,N,N'N'-тетраметилэтилендиамин
(ТЕМЕД)
(«Лаборатория
МЕДИГЕН»,
Россия);
ацетон, мочевина, хлороформ, HCl, HNO3, KOH, NaOH, NaCl, NaHCO3 («РЕАХИМ»,
Россия); гепарин («СПОФА», Польша). Растворы, содержащие NaOBr (NaOSCN)
получали перед опытом при реакции NaBr (NaSCN) c NaOCl. Измерение значений рН
буферных растворов производили на портативном рН-метре «Аквилон рН-410», точность
измерения 0,01 рН. Как ингибиторы металлозависимых и сериновых протеиназ
использовали стоковые растворы 0,5 М ЭДТА-NaOH (pH 8,0) и 0,1 M PMSF в этаноле.
Пептиды были синтезированы твердофазным методом («НПФ Верта», Санкт-Петербург),
чистота 99,5 % (по данным ВЭЖХ, масс-спектрометрии и аминокислотного анализа).
58
Для приготовления растворов использовали апирогенную деионизированную воду с
удельным сопротивлением 18,2 МОм×см (Медиана-Фильтр, Россия).
2.1.1. Получение опсонизированного зимозана
Аутологичную сыворотку для опсонизации частиц зимозана (OZ) получали из
отдельного образца крови, полученной от того же донора, из крови которого выделяли
НФ. Сыворотку отделяли от осадка после центрифугирования (800 g, 30 мин) образца
крови без антикоагулянта через ~ 2 часа после забора крови. Навеску частиц зимозана А
из Saccharomyces cerevisiae ресуспендировали в буферном растворе PBS (150 мМ NaCl,
10 мМ Na-фосфатный буфер, pH 7,4), кипятили на водяной бане в течение 5 минут и
охлаждали до комнатной температуры. Затем полученную суспензию центрифугировали
(800 g, 10 мин) и к осадку добавляли ~ 3 мл аутологичной сыворотки (на 200 мг
зимозана). Полученную суспензию частиц зимозана в сыворотке инкубировали в течение
30 мин при 37 ºС, затем промывали 3 раза в PBS и ресуспендировали в среде HBSS
(Среда Хэнкса: 1,27 мМ CaCl2, 5,405 мМ KCl, 0,441 мМ KH2PO4, 0,816 мМ MgSO4, 137,9
мМ NaCl, 0,338 мМ Na2HPO4, 5,55 мМ глюкозы, pH 7,4), содержащей 10 мМ Hepes
(HBSS/Hepes).
2.1.2. Получение бромциана
Все работы с цианидами и бромом проводились в мощном вытяжном шкафу с
использованием средств индивидуальной защиты. Непосредственно перед работой
употребляли раствор, содержащий, по крайней мере, 100 г сахарозы. Бромциан получали
бромированием цианида калия: KCN + Br2 → BrCN + KBr. Наиболее безопасным
является синтез в двухфазной системе: в плоскодонную колбу помещали 2,6 мл Br2 в 5 мл
дихлорэтана, приливали 20 мл водного раствора 2,8 M KCN при охлаждении льдом и
встряхивали колбу около 10 секунд до обесцвечивания эмульсии. После разделения фаз
слой дихлорэтана отбирали, к водной фазе добавляли 10 мл дихлорэтана и производили
повторную экстракцию BrCN, органические фазы объединяли и определяли в них
содержание BrCN аргентометрическим титрованием. К 20 мл 5%-ного раствора
маннитола (С6H10O6) в 50%-ном этаноле на 10 мМ NaOH прибавляли аликвоту раствора
BrCN, тщательно перемешивали и через 10 минут титровали 0,1 М HNO3 до рН 6,0. Затем
раствор титровали 0,1 М AgNO3 по конго красному, тщательно перемешивая раствор с
выпадающим AgBr, до перехода красной окраски в синюю, свидетельствующую о
взаимодействии избытка ионов Ag+ с индикатором. По количеству AgNO3, затраченного
на титрование, рассчитывали количество Br--ионов и, соответственно, BrCN. Раствор
BrCN в дихлорэтане (120 мг/мл) хранили при –20ºС запаянным в стеклянные ампулы по 1
мл.
59
2.2. Клеточные методы
2.2.1. Выделение нейтрофилов
Полиморфноядерные лейкоциты (НФ) выделяли из свежеотобранной донорской крови
с 1,2 г/л ЭДТА (в качестве антикоагулянта). Эритроциты осаждали при комнатной
температуре 3%-ным раствором декстрана Т-500 в 0,85%-ном NaCl (40 мл раствора на
100 мл крови). Плазму, обогащенную лейкоцитами и тромбоцитами, наносили на слой
Ficoll-Paque (плотность 1,077 г/л) в центрифужной пробирке объемом 50 мл.
Интерфазную фракцию клеток, обогащенную моноцитами, использовали для анализа
проатерогенности липопротеинов низкой плотности (см. раздел 2.2.5). Фракцию
гранулоцитов с примесью эритроцитов получали в осадке после центрифугирования (500
g, 30 мин) в градиенте плотности. После гипотонического лизиса остатка эритроцитов в
лизирующем буфере (114 мM NH4Cl, 7,5 мM KHCO3, 100 мкМ ЭДТА) клетки промывали
2 раза в PBS (Буфер PBS: 1,058 мМ KH2PO4, 155,17 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 2,96 мМ
Na2HPO4, pH 7,4) и ресуспендировали в D-PBS (Буфер D-PBS: 0,489 мМ MgCl2, 2,7 мМ
KCl, 1,149 мМ K2HPO4, 137,9 мМ NaCl, 9,583 мМ NaH2PO4, pH 7,4) с глюкозой (1 г/л). Все
эксперименты с НФ проводили непосредственно в день отбора крови и проведения
эксперимента.
2.2.2. Измерение индекса фагоцитоза нейтрофилов
Суспензию клеток в HBSS/Hepes (5×106 клеток/мл) вносили в 6-луночные планшеты с
помещенными на дно лунок покровными стеклами, покрытыми коллагеном или
фибронектином, и инкубировали с ЦП в течение 30 мин. Затем к клеткам добавляли
суспензию OZ (0,25 мг/мл) и инкубировали в течение 10 мин. После этого клетки
аккуратно
промывали
в
PBS,
фиксировали
в
течение
30
мин
в
растворе
модифицированного HBSS, содержащего 10 мМ Hepes и 2,5 % глутарового альдегида.
Затем образцы промывали в PBS и анализировали ~ 100 клеток на каждом стекле методом
фазово-контрастной микроскопии. Под микроскопом производили подсчет частиц OZ
внутри клеток и определяли индекс фагоцитоза, умножая долю клеток, поглотивших
минимум одну частицу, на среднее число поглощенных клетками частиц OZ.
2.2.3. Измерениe продукции супероксидных анион-радикалов нейтрофилами
Инкубацию НФ проводили в 24-луночных планшетах, покрытых коллагеном. Для
измерения продукции супероксидного анион-радикала до добавления клеток в каждую
лунку вносили 50 мкМ цитохрома c и/или исследуемые агенты и 300 ед/мл
супероксиддисмутазы (Cu,Zn-SOD) в различных комбинациях. Планшеты инкубировали
в течение 30 мин при 37 ºС, затем добавляли OZ на 30 мин. Инкубацию останавливали,
60
охлаждая планшеты до 4 ºС, и измеряли степень восстановления цитохрома с по
возрастанию значения A550–A535 (разницы между величинами поглощения растворов
образцов при 550 и 535 нм). Восстановление 10 мкМ цитохрома с вызывает увеличение
значения A550–A535 на 0,18 оптической единицы.
2.2.4. Измерениe продукции пероксида водорода нейтрофилами
Продукцию H2O2 нейтрофилами оценивали с помощью флуоресцентного метода,
основанного на окислении скополетина, катализируемом пероксидазой из корней хрена
[Timoshenko et al., 1998]. К суспензии НФ (2 106 клеток/мл в PBS, содержащем 1 мМ
CaCl2, 0,5 мМ MgCl2) добавляли 1 мкМ скополетина, 20 мкг/мл пероксидазы, 1 мМ NaN3
(ингибитор каталазы и МПО) и 100 нМ fMLP (активатор NADPH-оксидазы). Для
изучения влияния ЦП (0-0,6 мг/мл) либо сыворотки крови доноров НФ в течение 5 минут
преинкубировали при 37°C, после чего добавляли ЦП (либо сыворотку) и инкубировали в
течение часа при комнатной температуре перед добавлением стимулирующего агента.
H2O2-опосредованное окисление скополетина регистрировали за счет снижения его
флуоресценции при длине волны 460 нм (возбуждение при 350 нм) в течение 20 минут
при 37 ºC на спектрофлюориметре LSF 1211A (SOLAR). Скорость рассчитывали по
линейному участку кинетической кривой, соответствующей начальной скорости
продукции клетками H2O2.
2.2.5. Анализ проатерогенности липопротеинов низкой плотности при
культивировании с моноцитами
Моноцитарную фракцию, полученную при фракционировании донорской крови (см.
раздел 2.2.1), дважды отмывали PBS, содержащим 5 мМ D-глюкозы и 1 мМ ЭДТА, от
Ficoll-Paque, суспензию клеток центрифугировали при 500g в течение 15 минут и
ресуспендировали в среде RPMI-1640, содержащей 10 % фетальной сыворотки коров, 1 %
L-глутамина, 50 U/мл пенициллина, 100 мкл/мл стрептомицина [Panasenko et al., 1991].
Клетки (2×106 клеток/мл) культивировали в CO2-инкубаторе (5 % CO2 при 37 ºС) в 12луночных планшетах, предварительно обработанных такой же средой для культивации в
течение 2 часов. Через 1 час неадгезировавшие клетки удаляли, добавляли новую порцию
среды и еще через 4 часа среду заменяли на среду, содержащую 50 нМ PMA и 40 нМ
липопротеинов низкой плотности, тестируемых на проатерогенность. Через 12 и 72 часа
отбирали образцы среды, примеси клеток удаляли центрифугированием (5 мин при 3000
g). В среде определяли общий белок в микрореакции с Кумасси G-250 [Bradford, 1976],
миелопероксидазу (см. раздел 2.8.7.1), холестерин и его эфиры. Эфиры холестерина и
холестерин определяли с помощью микрореакции с холестерин оксидазой, холестерин
эстеразой и пероксидазой из корней хрена с тетраметилбензидином [MacLachlan et al.,
61
2000]. 50 мкл образца (10–500 мкМ холестерина) добавляли к 200 мкл реакционной
смеси, содержавшей 0,01 U холестерин оксидазы (для определения холестерина и его
эфиров также 0,05 U холестерин эстеразы), 0,5 U пероксидазы из корней хрена и 500 мкМ
TMB в 50 мМ Na-фосфатном буфере (pH 6,5) c 0,01 % дезоксихолата натрия и 0,05 %
Тритона X-100. Спустя 30 минут инкубации при 37 ºС измеряли А630 и рассчитывали
концентрацию холестерина в образцах по калибровочной прямой, построенной для
образцов холестерина. Аккумуляцию холестерина и его эфиров клетками рассчитывали
по разнице концентрации холестерина в образцах, не содержащих клеток.
2.3. Хроматографические методы
Все хроматографические процедуры проводили при 4 ºС в термостатируемом
хроматографическом шкафу, в остальных случаях условия указаны дополнительно.
Регистрацию А280 производили в проточном спектрофотометре, фракции собирали с
помощью программируемого коллектора (“LKB”, Великобритания). Хроматографию при
комнатной температуре осуществляли на хроматографе DuoFlow (“Bio-Rad”, США).
2.3.1. Синтез сорбентов
2.3.1.1 Иммобилизация соединений, содержащих NH2-группу, на
BrCN-активированной Сефарозе и агарозе
Посредством BrCN-активации можно иммобилизовать на Сефарозе 4B или агарозе
(Bio-Gel A-1,5m fine) молекулы, содержащие NH2-группу [Cuatrecasas et al., 1968]. Этот
метод применялся для получения аффинных сорбентов, необходимых для выделения
белков и изучения свойств белковых комплексов. Для активации 5 мл смолы отмывали на
воронке с фильтром из пористого стекла 10 мл 30%-ного ацетона и 10 мл 60%-ного
ацетона, охлажденными до –20 ºС. Затем к смоле добавляли 5 мл 60%-ного ацетона, 1 мл
раствора (C2H5)3N в ацетоне (150 мг/мл) и 1 мл раствора BrCN в дихлорэтане (100 мг/мл).
После 5 мин активации при –20 ºС смолу последовательно отмывали на стеклянном
фильтре охлажденными до –20 ºС 10 мл 60%-ного ацетона, 10 мл 30%-ного ацетона и 50
мл дистиллированной воды, подкисленной HCl до pH 3,0 при 0 ºС. Для сшивки со смолой
к ней добавляли равный объем PBS, содержавший лиганд (10 мг на 1 мл смолы). Реакцию
проводили в течение 12 часов при перемешивании на шуттеле при 4 ºС. Сорбенты с
иммобилизованными апротинином, гепарином, аргинином, ЦП, МПО, неомицином после
синтеза обрабатывали 1 M NaCl и 0,2 M Tris-глицином pH 8,0. ПР-Сефарозу (до 3 мг ПР
на 1 мл Сефарозы) после синтеза обрабатывали 0,2 M Tris-глицином pH 8,0, 0,1 M
NaHCO3 и 0,1 M Na-ацетатным буфером pH 4,0. Полученные смолы хранили в PBS с
добавлением NaN3 до концентрации 0,02 %.
62
2.3.1.2. Получение аминоэтил-(АЕ)-агарозы
Для получения АЕ-агарозы Сефарозу 6В обрабатывали эпихлоргидрином и 2хлорэтиламином [Musci et al., 1993]. К 100 мл Сефарозы 6В и 70 мл 5 М NaOH добавляли
7 мл эпихлоргидрина и 0,5 г NaBH4. Суспензию инкубировали 1 час при 40 ºС и 2 часа
при 60ºС, периодически перемешивая. Затем смолу отмывали на воронке с фильтром из
пористого стекла водой до нейтральных значений рН оттекающего раствора. Осадок
ресуспендировали в 70 мл 2 М NaOH, содержавших 0,25 г NaBH4, и нагревали на водяной
бане в течение 45 минут. Смолу отмывали на фильтре 1 л 1 М NaOH, содержащим 5 г
NaBH4, и затем водой до нейтральных значений рН оттекающего раствора. Остатки
NaBH4 удаляли промыванием суспензии 500 мл 5%-ной CH3COOH и затем водой до
нейтральных значений рН оттекающего раствора. Такая обработка делает сорбент
устойчивым к длительному нагреванию на водяной бане в сильнощелочной среде. Смолу
ресуспендировали в 70 мл 10 M NaOH и 100 мл 2-хлорэтиламина. Суспензию нагревали
на водяной бане 4 часа, периодически подводя значение рН выше 10, добавляя 10 M
NaOH. Смолу отмывали на воронке водой и хранили в PBS с добавлением NaN3 до
концентрации 0,02 %. Ее применяли для выделения ЦП (см. раздел 2.7.1.2).
2.3.2. Гель-фильтрация
Гель-фильтрацию белков и их комплексов проводили на сорбентах Toyopearl HW-55
Fine (пределы разрешения 1–700 кДа), Сефакрил S-200 HR (пределы разрешения 5–250
кДа), Сефакрил S-300 HR (пределы разрешения 10–1500 кДа), Superose 6 (пределы
разрешения 5–5000 кДа).
2.3.3. Аффинная хроматография
2.3.3.1. Аффинная хроматография экстракта лейкоцитов на иммобилизованном
церулоплазмине
Получение экстракта лейкоцитов описано ниже (см. раздел 2.7.3). 10 мл экстракта
наносили на ЦП-Сефарозу (4 мл) и отмывали несвязавшиеся белки PBS до А280<0,002 в
элюате. Затем проводили элюцию 1 M NaCl с 10 мМ Tris-HCl рН 7,4 и анализировали
полученную фракцию.
2.3.3.2. Аффинная хроматография пероксидазы эозинофилов на иммобилизованном
церулоплазмине
Связывание ЭПО с иммобилизованным на агарозе ЦП оценивали с помощью
аффинной хроматографии на колонке с ЦП-агарозой (0,5×1 см), уравновешенной PBS.
Препарат ЭПО (1 мг) наносили на колонку и промывали ступенчатым градиентом по 1
63
мл, увеличивая ионную силу элюирующего раствора на 50 мМ NaCl. В независимом
опыте колонку после нанесения 1 мг EPO промывали буферными растворами,
содержащими 165–5 мМ Na2HPO4 и 17–95 мМ лимонной кислоты, уменьшая pH
ступенчатого градиента (по 1 мл) на 0,5 от pH 7,0 до 2,5. В полученных фракциях
анализировали A413.
2.3.3.3. Измерение константы диссоциации комплекса церулоплазмин-азуроцидин
Препарат ЦП иммобилизовали на BrCN-активированной Сефарозе (около 1 мг на 1 мл
влажного геля), дополнительную порцию активированной Сефарозы блокировали
аналогично ЦП-Сефарозе и использовали в качестве контроля на неспецифическую
сорбцию CAP37. Измерения проводили в системе, содержащей ЦП-Сефарозу (или
Сефарозу в контроле) и PBS, к которому добавляли порции CAP37 в диапазоне 50–200
нМ, после установления равновесия Сефарозу осаждали центрифугированием при 500 g в
течение 5 минут и определяли концентрацию свободного белка. По разнице
концентрации CAP37 определяли количество белка, специфически связавшегося с ЦП –
[B] и соотношение связанного и свободного CAP37 – [B]/[F], затем строили график в
координатах Скэтчарда. Процедуру повторяли троекратно, используя различное
количество ЦП-Сефарозы (около 0,5 и 1 мкМ иммобилизованного ЦП). Концентрацию
САР37 определяли с помощью ELISA (см. раздел 2.8.7.3).
2.3.3.4. Аффинная хроматография липопротеинов низкой плотности на
иммобилизованной миелопероксидазе
Аффинную хроматографию ЛНП (0,5 мг/мл в PBS) на МПО-Сефарозе проводили,
нанося 1 мг ЛНП на колонку (1×3 см). Элюцию проводили: 1) ступенчатым градиентом
NaCl на PBS, увеличивая на каждом шаге ионную силу на 50 мМ NaCl; 2) ступенчатым
градиентом рН, уменьшая на каждом шаге рН на 0,2. Содержание белка во фракциях
определяли
по
реакции
с
Кумасси
G-250
в
микроварианте
с
предельной
чувствительностью 0,5 мкг/мл [Bradford, 1975].
2.4. Спектральные методы исследования
2.4.1. Спектрофотометрия
Спектры поглощения в видимой и ультрафиолетовой области измеряли с помощью
спектрофотометра СФ-2000-02 («ОКБ-Спектр», Санкт-Петербург).
работе коэффициенты молярной экстинкции приведены в таблице 2.1.
Используемые в
64
Таблица 2.1
Коэффициенты молярной экстинкции веществ
Вещество (специальные условия)
, нм
, М–1×см–1 Источник
ЦП
610
10000
[Noyer et al., 1980]
ЛФ (апо-форма)
280
85700
[Gifford et al., 2012]
ЛФ (насыщенный Fe3+)
465
4267
[Masson, 1970]
ЛФ (насыщенный Cu2+)
435
4805
[Masson, 1970]
МПО
430
178000
[Bakkenist et al., 1978]
ЭПО
413
110000
[Bolscher et al.,1984]
ABTS•+
414
36000
[Reszka et al., 2001]
H2O2
240
43,6
[Beers and Sizer, 1952]
NaOCl (pH 12)
290
350
[Morris, 1966]
NaOBr (pH 12)
329
332
[Gazda and Margerum, 1994]
п-нитрофенол
400
8000
[Freinstein and Janoff, 1975]
N-бензоил-L-тирозин
256
964
[Atassi and Manshouri, 1993]
5-тио-2-нитробензойная кислота
412
14150
[Eyer et al., 2003]
2.4.2. Фотонная корреляционная спектроскопия
В субмикронном анализаторе N5 Beckman Coulter определение диаметра частиц
основано
на
технологии
фотонной
корреляционной
спектроскопии
(ФКС)
с
использованием программы Contin. В качестве источника света используется лазер с
длиной волны 632,8 нм, область измерений 3–3000 нм. Определение диаметра частиц в
образце с использованием анализатора основано на регистрации скорости диффузии
частиц в жидкости и определяется уравнением Стокса-Эйнштейна: D = kBT/3
1,38·10–16 (erg/K) – константа Больцмана, T – температура (K),
d, где kB =
– вязкость растворителя
(пуаз), d – диаметр частицы (см), для которой определяется коэффициент диффузии D.
Таким образом, определение D несет информацию о диаметре частиц. В качестве
референтных белков, для которых были определены диаметры частиц, использованы
белки с известными значениями молекулярной массы: миоглобин (19 кДа), альбумин (67
кДа), ЛФ (78 кДа), ЦП (132 кДа), МПО (145 кДа), альдолаза (158 кДа), ферритин (450
кДа). В экспериментах использовали воду и буфер TBS (150 мМ NaCl, 10 мМ Tris-HCl,
pH 7,4), профильтрованные через фильтр с порами 0,22 мкм. Концентрацию белков в
растворах варьировали эмпирически в пределах 1–10 мг/мл, поскольку интенсивность
65
рассеянного света, контролируемая до проведения измерений, должна быть в
определенных пределах согласно инструкции прибора.
2.4.3. Электронный парамагнитный резонанс
Спектры ЭПР регистрировали на радиоспектрометре Е-4 (“Varian”, США) при
комнатной температуре. Условия регистрации спектров: напряженность магнитного поля
0,33 Тл; мощность СВЧ-излучения 10 мВт; амплитуда модуляции 1 мТл; постоянная
времени 0,03 с. В работе в качестве спиновой ловушки радикалов использовали
пиридил-1-оксил)-N-трет-бутилнитрон
(4-ПОБН).
Для
параметров спиновых аддуктов использовали константы a
H
анализа
-(4-
спектральных
и aN, которые характеризуют
сверхтонкое расщепление на ядре β-атома водорода и азота соответственно.
Подготовку образцов для регистрации спектров ЭПР производили следующим
образом: в среду измерения (50 мМ Na-фосфатный буфер, рН 7,4) помещали спиновую
ловушку (120 мМ) и H2O2 (10 мкМ), добавляли ЦП (5,68 мкМ) или FeCl2 (10 мМ), смесь
быстро перемешивали и помещали в резонатор радиоспектрометра в плоской кварцевой
кювете (объем 100 мкл). Ряд измерений проводили в присутствии этанола или ДМСО,
которые добавляли в реакционную смесь до введения ЦП или Fe2+.
Для расчета констант сверхтонкого расщепления спектров ЭПР и идентификации
регистрируемых спиновых аддуктов использовали компьютерную программу и базу
данных параметров спектров ЭПР спиновых аддуктов, представленные в Интернете
(http://epr.niehs.nih.gov). Описание программы и детали ее применения для моделирования
спектров ЭПР приведены в работе [Duling, 1994]. Данная программа по эмпирически
измеренным параметрам экспериментального спектра ЭПР позволяет строить расчетный
спектр, оптимизировать его путем сравнения с экспериментальным спектром и таким
образом более точно определять значения констант сверхтонкого расщепления (по
сравнению со значениями констант, полученными эмпирическим путем).
2.4.4. Хемилюминесценция
Хемилюминесценцию, т. е. свечение, испускаемое люминолом под действием
активных форм кислорода (АФК), с максимумом при длине волны 425 нм измеряли на
автоматическом люминометре (LKB-Wallac Luminometer 1251). Измеряемую эмиссию
света прибор преобразовывал в напряжение и регистрировал в милливольтах (мВ). В
пробы, содержащие 2,7 мкМ ЦП и 10 мМ H2O2, добавляли 100 мкМ люминол (1 мМ
люминол растворяли в ДМСО). Измерения проводились при 37 ºС. Каждую пробу
измеряли через 5-минутные интервалы в течение 60 минут, вычерчивая кривую.
66
Для регистрации образования HOCl использовали хемилюминометр SMARTLUM 5773
(“Interoptika-S”, Россия) с постоянным перемешиванием образца. Стандартный образец
содержал: 10 мМ Na-фосфатный буфер (рН 7,4), 150 мМ NaCl, 0,2 нМ МПО, 10 мкМ
люминола. Реакцию запускали добавлением через диспенсер 5 мкМ H2O2. Результат
представляли в виде светосуммы за первые 10 секунд от момента добавления H2O2. При
изучении влияния белков и других реагентов на хемилюминесценцию МПО их добавляли
в реакционную смесь в необходимых количествах перед введением H2O2. Люминолзависимую хемилюминесценцию HOCl регистрировали аналогичным образом, добавляя
необходимое количество последнего через диспенсер к 10 мкМ раствору люминола в 10
мМ Na-фосфатном буфере (рН 7,4).
2.5. Измерение активности ферментов
2.5.1. Измерение активности миелопероксидазы и пероксидазы эозинофилов
2.5.1.1. Измерение пероксидазной активности
Пероксидазную активность миелопероксидазы (МПО) измеряли по окислению
хромогенного субстрата 2,2’-диазинобис(3-этилбензотриазолин-6-сульфоната) натрия
(ABTS) [Reszka et al., 2001]. В процессе окисления образуется стабильный радикал
ABTS•+, определяемый спектрофотометрически по поглощению при длине волны 414 нм.
Реакционная смесь содержала аликвоту МПО, 100 мкМ H2O2, 1 мМ ABTS в 0,1 М Naацетатном буфере, pH 5,5. После добавления к смеси H2O2 скорость измеряли в A414/мин
в режиме «Кинетика» на приборе СФ 2000-02 при комнатной температуре. Среднее
квадратичное отклонение при линейной регрессии экспериментальных данных не
превышало 3 %, различия в значениях между тремя параллельными пробами не
превышали 2 %. Активность выражали в U, принимая за 1U количество МПО,
приводящее к изменению поглощения на 1 единицу оптической плотности при 414 нм за
1 минуту с учетом разбавления аликвоты.
Влияние ЦП на пероксидазную активность ЭПО и МПО оценивали, используя
субстраты: гваякол, орцинол, o-DA, 4-хлор-1-нафтол, TMB и ABTS. Реакционная смесь
содержала 50 мкМ H2O2, 10 нМ ЭПО (МПО), 0-1 мкМ ЦП и 0,5 мМ субстрата в 50 мМ
Na-фосфатном буфере, pH 6,0. После добавления H2O2 в реакционную смесь
регистрировали скорость увеличения поглощения ΔAх/мин, где x для гваякола, орцинола
и o-DA – 450 нм, для 4-хлор-1-нафтола – 600 нм, для TMB – 650 нм и для ABTS – 414 нм.
Скорость увеличения поглощения без ЦП принимали за 1 и строили графики зависимости
относительной пероксидазной активности от логарифма концентрации ЦП в реакционной
смеси, по которым рассчитывали значение IC50.
67
2.5.1.2. Кинетика пероксидазной активности миелопероксидазы
Для изучения влияния ЦП и липопротеинов на KМ в отношении ABTS реакционная
смесь содержала 5 нМ МПО, 100 мкМ H2O2, ABTS (0,4-1,4 мМ) в 0,1 M Na-фосфатном
буфере, pH 6,0. После добавления к смеси H2O2 скорость измеряли в A414/мин в режиме
«Кинетика» на приборе СФ 2000-02 при комнатной температуре. Среднее квадратичное
отклонение при линейной регрессии экспериментальных данных не превышало 3 %,
различия в значениях между тремя параллельными пробами не превышали 2 %.
Для изучения влияния ЦП и липопротеинов на KМ в отношении 3,3',5,5'тетраметилбензидина (TMB) реакционная смесь содержала 10 нМ МПО, 100 мкМ H2O2,
TMB (100–500 мкМ) в 0,1 M Na-фосфатном буфере, pH 7,4. После добавления к смеси
H2O2 скорость измеряли в A650/мин в режиме «Кинетика» на приборе СФ 2000-02 при
комнатной температуре. Среднее квадратичное отклонение при линейной регрессии
экспериментальных данных не превышало 2 %, различия в значениях между тремя
параллельными пробами не превышали 2 %. Строили график в координатах Хейнса
(значение R2 для прямых было выше 0,99) и определяли KМ и Vmax для МПО в отсутствие
и в присутствии ЦП (0,5 мкМ) и липопротеинов (0,5 мкг/мл), что соответствовало
концентрации ЛОНП – 0,65 нМ, ЛНП – 0,68 нМ, ЛВП – 3,4 нМ.
2.5.1.3. Кинетика пероксидазной активности пероксидазы эозинофилов
Для оценки влияния ЦП и ЦПпр на сродство ЭПО к ABTS и H2O2 определяли KM и
Vmax. В первом случае смесь содержала 10 нМ EPO, 80 мкМ H2O2 и 50–400 мкМ ABTS в
100 мМ Na-ацетатном буфере, pH 6,0. Во втором случае, 10 нМ EPO, 1 мМ ABTS и 25–
100 мкМ H2O2 в том же буфере. Влияние ЦП либо ЦПпр оценивали, добавляя его в
концентрации 10 и 20 нМ. В процессе окисления образуется стабильный радикал ABTS•+,
определяемый спектрофотометрически. Реакцию инициировали добавлением H2O2 и
регистрировали
A414/мин.
Рассчитывали
скорость
реакции,
относя
изменение
концентрации ABTS к концентрации ЭПО за секунду. Строили графики в координатах
Хейнса–Вольфа (коэффициент детерминированности полученных прямых был не менее
0,98). Рассчитывали KМ и Vmax для ЭПО в отсутствие и в присутствии ЦП.
2.5.1.4. (Псевдо)галогенирующая активность миелопероксидазы и пероксидазы
эозинофилов
(Псевдо)галогенирующую активность МПО и ЭПО оценивали по обесцвечиванию 5тио-2-нитробензойной кислоты производными таурина с HOCl, HOBr либо HOSCN,
образующимися при катализе МПО и ЭПО. Реакционная смесь содержала 50–250 мМ
NaCl, или 0,25–5 мМ NaBr, или 0,05–0,25 мМ NaSCN, 50 мкМ H2O2, 10 нМ ЭПО (либо 5
68
нМ МПО), 10 мМ таурина, 0–3 мкМ ЦП в 10 мМ Na-фосфатном буфере, pH 7,4 – в случае
NaBr и NaSCN либо pH 5,6 – в случае NaCl. После добавления H2O2 реакционную смесь
инкубировали в течение 5 минут при 25°C, после чего реакцию останавливали, добавляя в
смесь 5 нМ каталазы, и через 2 минуты добавляли 4 мкМ NaN3. В полученную смесь
добавляли 1 мМ 5-тио-2-нитробензойной кислоты (в случае NaCl предварительно
добавляли 0,2 M Na-фосфатный буфер, рН 8,0 до конечной концентрации 40 мМ) и
регистрировали значение A412, обратно пропорциональное концентрации образующихся
HOCl, HOBr либо HOSCN. Рассчитывали скорость реакции, относя концентрацию
окисленной 5-тио-2-нитробензойной кислоты к концентрации МПО либо ЭПО за
секунду.
Строили
графики
в
координатах
Хейнса–Вольфа
(коэффициент
детерминированности полученных прямых был не менее 0,98).
2.5.1.5. Измерение утилизации пероксида водорода миелопероксидазой с помощью
сенсора на основе пленок берлинской лазури
Для изучения утилизации пероксида водорода МПО использовали электрохимический
сенсор на основе пленки берлинской лазури. Показания сенсора считывали с помощью
потенциостата «Элинс», позволяющего обрабатывать данные с помощью программного
обеспечения. В электрохимическую ячейку объемом 330 мкл помещали 0,1 М KCl, 10 мМ
K-фосфатный буфер, рН 7,2, вводили аликвоту 5 мкл пероксида водорода для достижения
конечной концентрации 10–50 мкМ. Затем вводили эффектор или МПО (3 нМ) и
регистрировали кинетику убыли силы тока. По прямолинейному участку рассчитывали
скорость утилизации пероксида водорода.
2.5.2. Измерение оксидазной активности церулоплазмина
2.5.2.1. Пара-фенилендиамин-оксидазная активность церулоплазмина
Пара-фенилендиамин (p-PD) окисляется ЦП с образованием окрашенного в
фиолетовый цвет продукта конденсации с субстратом [Ravin, 1961]. Реакционная смесь
включала 1,58 мл 0,5 М Na-ацетатного буфера, pH 5,5, 0,2 мл свежеприготовленного
раствора дигидрохлорида p-PD (0,5 %) и 0,02 мл пробы, содержащей ЦП. Реакцию
проводили при 37 C на водяной бане в течение 1 часа. Останавливали реакцию, добавляя
к пробе 0,2 мл 0,5%-ного NaN3. Контрольной пробой служила реакционная смесь с 0,2 мл
0,5%-ного NaN3, добавленного до инкубации. Метод применим как для определения pPD-оксидазной активности ЦП, так и для определения концентрации ЦП. Оптическая
плотность раствора при 530 нм (A530), измеренная против контрольной пробы, при
умножении на коэффициент 0,875 показывала концентрацию ЦП в тестируемом образце в
мг/мл.
69
2.5.2.2. Кинетика пара-фенилендиамин-оксидазной активности церулоплазмина
Влияние серпроцидинов и ЭПО (50–100 нМ) на окисление p-PD (0,25–1,25 мМ) под
действием 50 нМ ЦП оценивали, измеряя скорость образования окисленного субстрата
(A530/мин) в 0,1 M Na-ацетатном буфере, рН 5,0. Скорость измеряли в A530/мин в режиме
«Кинетика» на приборе СФ 2000-02 при комнатной температуре. Среднее квадратичное
отклонение при линейной регрессии экспериментальных данных не превышало 3 %,
различия в значениях между тремя параллельными пробами не превышали 2 %. Строили
график в координатах Хейнса–Вольфа (значение R2 для прямых было выше 0,98) и
определяли KM и Vmax для интактного ЦП и в присутствии различных эффекторов.
2.5.2.3. Кинетика ферроксидазной активности церулоплазмина
Кинетику ферроксидазной реакции, катализируемой ЦП, оценивали, измеряя скорость
образования
Fe3+.
В
основе
метода
лежит
спектрофотометрическое
измерение
окрашенного комплекса Fe3+ с диметилформамидом. В контрольных опытах мы
установили, что диметилформамид не препятствует проявлению ферроксидазной
активности ЦП. Реакционная смесь включала 50 мМ Na-ацетатный буфер, pH 5,5,
диметилформамид (конечная концентрация 1 %), 120 нМ ЦП и такое количество
взаимодействующего с ЦП белка, которое обеспечивало требуемый молярный избыток по
сравнению с ЦП, 80–200 мкМ раствор соли Мора (Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O) в 30 мкМ
тиомочевине. Скорость измеряли в A310/мин в режиме «Кинетика» на приборе СФ 2000-02
при комнатной температуре. Среднее квадратичное отклонение при линейной регрессии
экспериментальных данных не превышало 3%, различия в значениях между тремя
параллельными пробами не превышали 4%. Строили график в координатах Хейнса
(значение R2 для прямых было выше 0,99) и определяли KM и Vmax для интактного ЦП и в
присутствии белка, взаимодействующего с ЦП.
2.5.2.4. Измерение супероксиддисмутазной активности церулоплазмина
Супероксиддисмутазную
(SOD)
активность
ЦП
оценивали
по
торможению
восстановления ресазурина супероксидным анион-радикалом, который генерировали в
системе, содержащей 100 нМ ксантиноксидазы, 150 мкМ ксантина и 50 мкМ ресазурина в
50 мМ K-фосфатном буфере, рН 7,4. Измеряли скорость восстановления ресазурина
(A604/мин) супероксидным анион-радикалом в присутствии 100, 200 и 400 нМ ЦП. В
контрольных опытах регистрировали влияние ЦП на активность ксантиноксидазы по
образованию урата в такой же системе без ресазурина (A295/мин).
70
2.5.3. Измерение активности эластазы и протеиназы 3
Активность эластазы и протеиназы 3 измеряли по гидролизу п-нитрофенол-t-BOC-Ala
(NBA) [Freinstein and Janoff, 1975]. В процессе гидролиза образуется п-нитрофенол,
определяемый спектрофотометрически. Реакционная смесь содержала 100 мМ Naфосфатного буфера, рН 7,5, 200 мкМ NBA (стоковый раствор в ацетонитриле) и фермент
(4 % объема реакционной смеси). После добавления субстрата по
A400 определяли
скорость гидролиза в присутствии и отсутствие фермента в режиме «Кинетика» на
приборе СФ 2000-02 при комнатной температуре.
2.5.3.1. Кинетика активности эластазы и протеиназы 3
Влияние ЦП (0,75 мкМ) на активность NE и PR3 (30 нМ) в отношении NBA
оценивали,
измеряя
скорость
образования
п-нитрофенола
(A400)
при
разных
концентрациях субстрата (0,1–0,5 мМ) в 50 мМ Tris-HCl, pH 7,4. Строили график в
координатах Хейнса–Вольфа (S, S/V) в присутствии ЦП и без него. Рассчитывали KM, kcat
и Ki.
2.5.4. Измерение активности катепсина G
Активность катепсина G измеряли по гидролизу этилового эфира N-бензоил-Lтирозина (BTEE) [Atassi and Manshouri, 1993]. В процессе гидролиза образуется Nбензоил-L-тирозин, определяемый спектрофотометрически по A256. Реакционная смесь
содержала 80 мМ Tris-HCl, рН 7,8, 200 мкМ BTEE (стоковый раствор в 50% метаноле) и
1/25 раствора, содержащего фермент. После добавления субстрата по
A256 определяли
скорость гидролиза в присутствии и отсутствие фермента в режиме «Кинетика» на
приборе СФ 2000-02 при комнатной температуре.
2.5.4.1. Кинетика активности катепсина G
Влияние ЦП (0,75 мкМ) на активность CG (30 нМ) в отношении различных
концентраций (0,5–2,5 мМ) BTEE определяли, оценивая скорость образования N-бензоилL-тирозина (A256) в 50 мМ Na-фосфатном буфере, рН 7,4. Строили график в координатах
Хейнса–Вольфа (S, S/V) в присутствии ЦП и без него. Рассчитывали KM, Vmax и Ki.
2.5.5. Измерение активности тромбина
Активность тромбина (FIIa) измеряли по скорости гидролиза хромогенного субстрата
Z-Ala-Ala-Arg-pNA·HBr [Баркаган и соавт., 2004], смесь содержала PBS, 0,1 мкг/мл
субстрата и аликвоту синовиальной жидкости либо FIIa с известной активностью (2500
NIH/мг белка). Активность тромбина в синовиальной жидкости сравнивали с
активностью FIIa и выражали в NIH/мл.
71
2.5.6. Измерение активности 5-липоксигеназы
Активность 5-липоксигеназы (5-LO) в НФ оценивали по количеству липоксигеназных
продуктов. Суспензию НФ (2×107 клеток) инкубировали в 6 мл среды HBSS/Hepes при 37
ºC в присутствии или в отсутствие исследуемых агентов в течение 30 мин, затем клетки
стимулировали добавлением OZ (~ 10 мг) и инкубировали следующие 20 мин.
Инкубацию останавливали добавлением равного объема (6 мл) охлажденного до –20 ºC
метанола, содержащего известное количество простагландина В2 в качестве внутреннего
стандарта. Полученные образцы хранили при –20 ºC, затем центрифугировали (800 g, 10
мин) и отбирали супернатант, представляющий собой водно-метанольный экстракт.
Водно-метанольные экстракты очищали с помощью твердофазной экстракции на
микроколонке Sep-Pak C18, которую предварительно промывали метанолом, а затем
уравновешивали
бидистиллированной
водой.
Оптимальные
условия
очистки
и
концентрирования проб были предварительно подобраны экспериментально. После
нанесения пробы микроколонку промывали бидистиллированной водой (~ 10 мл) и 300
мкл метанола. Метаболиты 5-LO экстрагировали 1,4 мл метанола, упаривали досуха
полученные образцы, вновь растворяли в 35 мкл смеси метанол/вода (2:1, v/v) и
анализировали методом обращено-фазовой
жидкостной хроматографии
высокого
давления. Очищенные образцы наносили на колонку nucleosil C18 5 мкм (250×4,6 мм) и
элюировали продукты со скоростью 0,8 мл/мин в градиенте от 20 до 100% элюента В.
Элюенты
имели
следующий
состав:
метанол/ацетонитрил/вода/уксусная
кислота/триэтиламин в соотношениях (по объему): 25/25/50/0,05/0,075 (элюент А) и
50/50/0/0,05/0,04
(элюент
В).
Регистрацию
вели
с
помощью
детектора
в
ультрафиолетовом диапазоне с переменной длиной волны при 280 нм (максимум
поглощения LTB4) и 238 нм (максимум поглощения 5-HETE). В процессе анализа
регистрировали
следующие
метаболиты
5-LO:
лейкотриен
B4
(LTB4),
5-
гидроксиэйкозатетраеновая кислота (5-HETE), 20-гидрокси-LTB4 (ω-OH-LTB4) и изомеры
LTB4, которые идентифицировали по времени выхода соответствующего стандарта.
Количество продуктов 5-LO определяли по отношению площадей пиков продуктов к
площади пика внутреннего стандарта, учитывая соответствующие коэффициенты
экстинкции.
2.6. Электрофоретические методы
2.6.1. Диск-электрофорез в щелочной системе
ЭФ нативных белков с pI<7 проводили в 7,5%-ном разделяющем ПААГ, содержащем
375 мМ Tris-HCl буфер, рН 8,9 [Davis, 1964]. В качестве концентрирующего геля
использовали 5%-ный ПААГ, содержащий 125 мМ Tris-HCl буфер, рН 6,8. Для
72
полимеризации в смесь буфера и акриламида (акриламид/метиленбисакриламид = 30/0,8,
w/w) добавляли ТЕМЕД до 0,1 % и 25%-ный персульфат аммония до конечной
концентрации 0,1 %. В качестве электродного буфера использовали 4,94 мМ Tris, 38,4
мМ глициновый буфер, рН 8,3. Исследуемый образец (1–50 мкг белка) наносили в
соотношении 4:1 (v/v) с 62,5 мМ Tris-HCl-буфером, рН 6,8, содержащим
0,001 %
бромфенолового синего и 50 % глицерола. ЭФ проводили в течение 2,5–3 часов при
температуре +4 С при градиенте потенциала 15–20 В/см
(2–5 мА на 1 см геля) в
аппарате для вертикального ЭФ. В качестве маркера, позволяющего определить время
завершения ЭФ, использовали краситель бромфенол синий. После ЭФ гели окрашивали
на белок 0,5%-ным Кумасси бриллиантовым синим R-250 в 25%-ном этаноле и 10%-ной
CH3COOH в течение 30 мин. Для отмывки использовали тот же раствор без добавления
Кумасси R-250.
2.6.1.1. Выявление о-дианизидин-оксидазной активности после электрофореза
Специфическую оксидазную активность ЦП выявляли путем окрашивания гелей
раствором o-DA [Owen and Smith, 1961]. Для этого гели после ЭФ помещали на 10 минут
в 0,4 М Na-ацетатный буферный раствор, рН 4,7, для приведения геля к условиям,
необходимым для окраски (ЭФ проводился при рН 8,3), а затем добавляли 1%-ный
раствор дигидрохлорида o-DA в 1%-ном Тритоне Х-100 до конечной концентрации 0,05
% и инкубировали при 37 С в течение 1–2 часов (до развития окраски).
2.6.2. Диск-электрофорез в кислой системе
ЭФ нативных белков (pI>7) проводили в 7,5%-ном разделяющем ПААГ, содержащем
374 мМ CH3COOH-KOH буфер, рН 4,3 [Маурер, 1971]. В качестве концентрирующего
геля использовали 5%-ный ПААГ, содержащий 125 мМ CH3COOH-KOH буфер, рН 6,7.
Для полимеризации в раствор добавляли тиомочевину до 0,1 % и 30%-ный пероксид
водорода до 0,03 %. В качестве электродного буфера использовали 35 мМ -аланин, 14
мМ ацетатный буфер, рН 4,5. Исследуемый образец (1–50 мкг белка) наносили в
соотношении 4:1 (v/v) с 62,5 мМ CH3COOH-KOH, рН 6,7, содержащим 0,001 %
метилового зеленого и 50% глицерола. ЭФ проводили в течение 2,5–3 часов при
температуре +4 С при градиенте потенциала 15–20 В/см (2–5 мА на 1 см геля) в
аппарате для вертикального ЭФ.
2.6.2.1. Выявление пероксидазной активности после электрофореза
Пероксидазную активность МПО выявляли с помощью 4-хлор-1-нафтола. ПААГ
отмывали в течение 30 мин после электрофореза в 0,4 М Na-ацетатном буферном
растворе, pH 5,5, и окрашивали раствором, содержавшим 20 мг 4-хлор-1-нафтола в 10 мл
73
этанола, 5 мкл 10 М H2O2 и 90 мл 0,1 М Na-ацетатного буфера, pH 5,5. Через 20 минут на
прозрачном фоне выявлялись темно-фиолетовые зоны. Окрашенные гели хранили в
темноте.
2.6.3. Электрофорез в кислой системе в присутствии мочевины
Для разделения с высоким разрешением белков с pI>7 проводили электрофорез в 10%или 15%-ном ПААГ, содержащем 5%-ную CH3COOH и 6 М мочевины без
концентрирующего геля [Hurley, 1977]. В зависимости от требуемой концентрации ПААГ
22,5 г мочевины и 60 мг тиомочевины растворяли в 30 мл (15%-ный) или 20 мл (10%ный) 30%-ного акриламида и 0,2%-ного МБА, 7,5 мл 43,2%-ной CH3COOH и доводили до
59,6 мл воды. Для полимеризации в смеси добавляли 0,4 мл 30%-ного H2О2. В качестве
электродного буфера использовали 5%-ную CH3COOH. Исследуемый образец (30–50 мкг)
наносили в смеси в соотношении 4:1 (v/v) с буфером, содержащим 20%-ную CH3COOH,
40%-ный глицерол, 0,001%-ный метиловый зеленый, 1/10 насыщенного спиртового
раствора пиронина G. ЭФ проводили в течение 0,5-1,5 часов при температуре +4 С при
градиенте потенциала 30–40 В/см (4–10 мА на 1 см геля) в аппарате для вертикального
ЭФ. В качестве маркеров, позволяющих определить время завершения ЭФ, использовали
красители: пиронин G располагался в виде розовой полосы между синей и зеленой
полосами метилового зеленого, положение первой у нижнего края геля служило
признаком завершения ЭФ. Окрашивание геля на белок производили аналогично разделу
2.6.1.
2.6.4. Диск-электрофорез в нейтральной системе
ЭФ нативных белков (pI<7), нестабильных при щелочном рН, проводили в 7,5%-ном
разделяющем ПААГ, содержащем 71 мМ Tris-HCl буфер, рН 7,5
[Маурер, 1971]. В
качестве концентрирующего геля использовали 5%-ный ПААГ, содержащий 51 мМ TrisH3PO4
буфер,
рН
5,5.
Для
полимеризации
в
смесь
буфера
и
акриламида
(акриламид/метиленбисакриламид = 30/0,8, w/w) добавляли ТЕМЕД до 0,1 % и 25%-ный
персульфат аммония до конечной концентрации 0,1 %. В качестве электродного буфера
использовали 8,26 мМ Tris, 30 мМ диэтилбарбиталовый буфер, рН 7,5. Исследуемый
образец (1–50 мкг белка) наносили в соотношении 4:1 (v/v) с 62,5 мМ Tris-H3PO4
буфером, рН 5,5, содержащим 0,001 % бромфенолового синего и 50 % глицерола.
Проведение ЭФ и окрашивание геля проводили аналогично разделу 2.6.1.
2.6.5. Электрофорез в щелочной системе в присутствии SDS
Молекулярную массу, а также чистоту белка анализировали с помощью ЭФ в
присутствии SDS в ПААГ, содержащем 375 мМ Tris-HCl буфер, рН 8,9 [Laemmli, 1970]. В
74
качестве концентрирующего геля использовали 5%-ный ПААГ, содержащий 125 мМ TrisHCl буфер, рН 6,8. В гель добавляли глицерол до 0,5 % и SDS до 0,1 %. Для
полимеризации в смесь буфера и акриламида (акриламид/метиленбисакриламид = 30/0,8,
w/w) добавляли ТЕМЕД до 0,1 % и 25%-ный персульфат аммония до конечной
концентрации 0,1 %. Исследуемый образец (1–50 мкг белка) смешивали в соотношении
4:1 (v/v) с 125 мМ 1M Tris-HCl, pH 6,8, содержащим 2 % SDS, 0,1 % 2-меркаптоэтанола,
0,001 % бромфенолового синего и 50 % глицерола. Перед нанесением пробу нагревали на
водяной бане в течение 1 минуты. ЭФ проводили в течение 2,5-3 часов при температуре
+4
С и при градиенте потенциала 15–20 В/см. В качестве электродного буфера
использовали 16,5 мМ Tris, 128 мМ глициновый буфер, рН 8,3, содержащий 0,1 % SDS.
Перед окрашиванием гель отмывали от SDS в растворе 50%-ного этанола и 10%-ной
CH3COOH в течение ночи. Окраска на белок и отмывка те же, что и для ЭФ без
детергентов.
2.6.5.1. Выявление желатиназной активности in situ
Желатиназная активность in situ была выявлена после электрофореза проб в SDSПААГ, содержащем 0,1%-ный желатин [Cainelli et al., 2003]. Перед электрофорезом
пробы смешивали с буфером, содержащим SDS, но не подвергали нагреванию и не
обрабатывали агентами, восстанавливающими дисульфидные связи. После электрофореза
ПААГ отмывали 3 раза по 15 минут в 2,5%-ном Тритоне X-100 и инкубировали 18 ч при
37 ºС в растворе 200 мМ NaCl, 10 мМ CaCl2, 50 мМ Tris-HCl, pH 7,4. Затем гели
фиксировали и окрашивали Кумасси R-250. О наличии желатиназной активности судили
по отсутствию окраски фона.
2.6.5.2. Выявление пероксидазной активности in situ
Пероксидазная активность in situ была выявлена после электрофореза проб в SDSПААГ. Перед электрофорезом пробы смешивали с буфером, содержащим SDS, но не
подвергали
нагреванию
и
не
обрабатывали
агентами,
восстанавливающими
дисульфидные связи. После электрофореза ПААГ отмывали 3 раза по 15 мин в 2,5%-ном
Тритоне X-100, отмывали в течение 30 мин в 0,4 М Na-ацетатном буфере, pH 5,5, и
окрашивали раствором, содержавшим: 20 мг 4-хлор-1-нафтола в 10 мл этанола, 5 мкл 8 М
H2O2 и 90 мл 0,1 М Na-ацетатного буфера, pH 5,5. Через 2 часа на прозрачном фоне
выявлялись темно-фиолетовые зоны. Окрашенные гели хранили в темноте.
2.6.6. Электрофорез в присутствии SDS в высокомолярной Tris-буферной системе
Для разделения белков с улучшенным разрешением использовали электрофорез в
ПААГ с 750 мМ Tris-HCl буфером, рН 8,9 [Fling and Gregerson, 1986]. В качестве
75
концентрирующего геля использовали 5%-ный ПААГ, содержащий 125 мМ Tris-HCl
буфер, рН 6,8. В гель добавляли сахарозу до 10 % и SDS до 0,1 %. Для полимеризации в
смесь буфера и акриламида (акриламид/метиленбисакриламид = 30/0,8, w/w) добавляли
ТЕМЕД до 0,1 % и 25 %-ный персульфат аммония до конечной концентрации 0,1 %.
Приготовление образца, проведение ЭФ и окрашивание геля проводили аналогично
разделу 2.6.5.
2.6.7. Электрофорез в четырехслойном полиакриламидном геле
Для разделения липопротеинов и их комплексов использовали ЭФ в четырехслойном
ПААГ [Wada et al., 1973]. Последовательно полимеризовали четыре слоя ПААГ: 1) 7,5%ный акрилмид-0,2%-ный МБА в 375 мМ Tris-HCl буфере, рН 8,9; 2) 5%-ный акриламид0,13%-ный МБА в том же буфере; 3) 4%-ный акриламид-1%-ный МБА в том же буфере;
4) 4%-ный акриламид-1%-ный МБА в 125 мМ Tris-HCl буфере, рН 6,8. Для
полимеризации в смесь буфера и акриламида добавляли ТЕМЕД до 0,1 % и 25%-ный
персульфат аммония до конечной концентрации 0,1 %. Приготовление образца,
проведение ЭФ и окрашивание геля проводили аналогично разделу 2.6.1.
2.6.8. Масс-спектрометрия фрагментов трипсинолиза после электрофореза
Для приготовления образцов для масс-спектрометрического анализа белки разделяли
электрофорезом в ПААГ и вырезали из геля участки, содержащие белковые зоны.
Триптический гидролиз белка в ПААГ проводили следующим образом: фрагмент геля
размером 1 мм3 дважды промывали для удаления красителя инкубацией в 100 мкл 40%ного раствора ацетонитрила в 0,1 М NH4HCO3 в течение 30 минут при 37 С. После
удаления раствора для дегидратации геля добавляли 100 мкл ацетонитрила. Затем
ацетонитрил сливали, фрагмент геля высушивали на воздухе и приливали 4 мкл раствора
модифицированного трипсина с концентрацией 15 мкг/мл в 0,05 М NH4HCO3. Гидролиз
проводили в течение 18 ч при 37 С, затем к раствору добавляли 8 мкл 0,5%-ной
трифторуксусной кислоты в 10%-ном растворе ацетонитрила в воде и тщательно
перемешивали. Раствор над гелем использовали для получения MALDI-масс-спектров.
Подготовка образцов для масс-спектрометрии проводилась следующим образом: на
мишени смешивали 1 мкл раствора образца и 0,3 мкл раствора 2,5-дигидроксибензойной
кислоты (10 мг/мл в 20%-ном ацетонитриле в воде с 0,5%-ной трифторуксусной
кислотой), полученную смесь высушивали на воздухе. Масс-спектры снимали на
тандемном
MALDI-времяпролетно-времяпролетном
масс-спектрометре
Ultraflex
II
(“Bruker”, Германия), оснащенном УФ лазером (Nd). Масс-спектры получены в режиме
положительных ионов с использованием рефлектрона; точность измеренных масс после
докалибровки по пикам автолиза трипсина составляла 0,005 %. Полученные пептидные
76
фингерпринты белков анализировали online при помощи программы MASCOT
(http://www.matrixscience.com). Поиск по «пептидному фингерпринту» проводился в базе
данных NCBI среди белков человека с указанной точностью с учетом возможного
окисления метионинов кислородом воздуха и возможной модификации цистеинов
акриламидом.
2.6.9. Анализ N-концевой аминокислотной последовательности
N-концевую аминокислотную последовательность белков, перенесенных с помощью
полусухого электропереноса на мембрану Immobilon P (см. раздел 2.8.6), определяли с
помощью автоматического секвенатора Procise 491 cLC Protein Sequencing System
(“Applied Biosystems”, США).
2.7. Получение белковых препаратов
2.7.1. Выделение церулоплазмина плазмы крови
Для выделения ЦП из плазмы крови использовали три метода, различающихся по типу
аффинного сорбента для очистки ЦП: с использованием ПР-Сефарозы [Соколов и соавт.,
2005], неомицин-агарозы [Соколов и соавт., 2011; Соколов и соавт., 2012] и АЕ-агарозы
[Musci et al., 1993]. Первые два метода требуют предварительной очистки ЦП на
ионообменных смолах. В качестве источника ЦП человека использовали замороженную
плазму крови с добавлением цитрата натрия (конечная концентрация 13 мМ). Работу вели
в холодной комнате (4–8º С), плазму размораживали, в случае спонтанного образования
сгустков фибрина при размораживании их удаляли фильтрацией на флизелиновом
фильтре.
2.7.1.1. Выделение церулоплазмина с помощью протамин-Сефарозы
Для выделения с помощью ПР-Сефарозы к 2000 мл цитратной плазмы добавляли
ЭДТА (10 мМ) и PMSF (0,1 мМ), центрифугировали 30 минут при 450 g (4º С).
Супернатант разбавляли в 2 раза 0,05 M Na-ацетатным буфером, pH 5,5, добавляли к нему
10 г DEAE-Сефадекса А-50 и инкубировали 2 часа при 4 ºС при постоянном
перемешивании. Затем смолой, приобретавшей зеленую окраску, набивали колонку (5 15
см). ЦП элюировали линейным градиентом по 1000 мл 0,05 M и 0,5 М Na-ацетатного
буфера, pH 5,5. Фракции, содержавшие ЦП, объединяли, разбавляли в 2 раза 0,01 M Naфосфатным буфером, рН 7,4, и наносили на колонку с QAE-Сефадексом A-50 (5 10 см),
промывали 500 мл PBS и элюировали 0,4 M NaCl (pH 7,4). Фракции, содержавшие ЦП,
объединяли и подвергали спиртовому осаждению. При охлаждении на льду к раствору
ЦП добавляли смесь C2H5OH:CHCl3 (9:1, v/v) в соотношении 1:1 (v/v). Помутневший
77
вследствие осаждения примесей раствор центрифугировали 30 минут при 1000 g (4 ºС). К
супернатанту добавляли 1/2 смеси C2H5OH:CHCl3 (9:1, v/v) и центрифугировали 30 минут
при 1000 g (4 ºС). Осадок ЦП растворяли в 10 мл PBS, нерастворившиеся примеси
удаляли центрифугированием в течение 30 минут при 1000 g (4ºС). Синий супернатант
пропускали через колонку с аргинин-Сефарозой (3 10 см). Обработанный таким образом
ЦП наносили на колонку с ПР-Сефарозой (2 10 см), уравновешенную PBS. Промывали
200 мл 0,075 M NaCl (pH 7,4). Элюцию с колонки производили 0,33 M NaCl (pH 7,4) при
высокой скорости (3 мл/мин) и 1 M NaCl (pH 7,4) при низкой скорости (0,5 мл/мин).
Взаимодействие ЦП с ПР разобщалось 0,33 M NaCl (pH 7,4), небольшое количество ЦП
содержалось также во фракции 1 M NaCl (pH 7,4). Элюат 0,33 M NaCl диализовали
против PBS и пропускали через колонку с гепарин-Сефарозой (2 4 см). Данные о
постадийной очистке суммированы в таблице 2.2.
Таблица 2.2
Критерии чистоты ЦП при выделении из плазмы крови
Стадия и фракция
A610/
A280
ЦП1,
мг
Белок2, мг
ЦП/
белок,
мг/мг
Очистка
(раз)
Выход,
%
1. Цитратная
(2000 мл)
плазма
–
600
191000
0,003
–
100
2.
После
Сефадекса
DEAE-
0,006
450
2300
0,196
65
75
QAE-
0,020
350
690
0,507
169
58,3
Спиртовое
0,033
300
380
0,790
263
50
5.
Элюат
после
аргинин-Сефарозы
0,039
280
310
0,903
301
46,7
6. Фракция 0,33 M NaCl
с ПР-Сефарозы
0,052
260
261
0,996
332
43,3
7.
Элюат
после
гепарин-Сефарозы
0,052
250
251
0,996
332
41,7
3.
После
Сефадекса
4.
осаждение
1
см. раздел 2.5.2.1; 2по результатам измерения общего белка с использованием ЦП в
качестве стандарта [Bradford, 1976].
2.7.1.2. Выделение церулоплазмина с помощью неомицин-агарозы
К 1400 мл размороженной цитратной плазмы добавляли 0,5 мкМ ЭДТА и 2 мМ 6аминокапроновой кислоты и наносили ее со скоростью 10 мл/мин на колонку с UNO-
78
Sphere Q (30×2,5 см), предварительно уравновешенную PBS. Колонку последовательно
отмывали от балластных белков PBS и 40 мМ TEA-HCl (pH 7,4) до A280 < 0,005 в
оттекающем с колонки растворе. Отмытую колонку оставляли на ночь в холодной
комнате. На следующий день колонку соединяли с хроматографом Bio-Rad DuoFlow 20 и
использовали при хроматографии растворы, охлажденные на льду. Элюцию белков
проводили со скоростью 2 мл/мин линейным градиентом по 200 мл 0→0,5 M NaCl,
содержащих 40 мМ TEA-HCl (pH 7,4). Окрашенные в синий цвет фракции объединяли,
разбавляли в 10 раз 20 мМ TEA-HCl (pH 7,4) и наносили со скоростью 5 мл/мин на
колонку с неомицин-агарозой (12×2,5 см), уравновешенную 40 мМ TEA-HCl (pH 7,4).
Колонку промывали 40 мМ TEA-HCl (pH 7,4) до A280 < 0,005 в оттекающем с колонки
растворе. Элюцию белков проводили со скоростью 2 мл/мин с помощью линейного
градиента по 120 мл 0→100 мM CaCl2, содержащих 40 мМ TEA-HCl (pH 7,4).
Окрашенные в синий цвет фракции объединяли, концентрировали на ячейке VivaSpin 20,
дважды разбавляя сконцентрированный до 2 мл белок 18 мл 40 мМ TEA-HCl (pH 7,4).
Данные о постадийной очистке ЦП суммированы в таблице 2.3.
Таблица 2.3
Данные о постадийной очистке ЦП человека
Стадия/
Общий
Удельная Очистка, Удельная
1
белок , мг активность
раз
активность
ЦП2, мг/мг
FIIa3, NIH/г
Выход4,
%
Фракция
Объем,
мл
1. Цитратная плазма
1400
122821
0,00241
-
0,46
-
100
2. Фракции с UNOSphere Q
53
2401
0,0883
37
19,9
0,0065
72
3.
Фракции
с
неомицин-агарозы
40
350
0,994
412
<0,03
0,052
118
A610/
A280
1
по результатам измерения общего белка с использованием ЦП в качестве стандарта
[Bradford, 1976]; 2отношение количества ЦП (мг, см. раздел 2.5.2.1) к общему белку (мг);
3
см. раздел 2.5.5; 4по активности в отношении p-PD (см. раздел 2.5.2.1).
2.7.1.3. Выделение церулоплазмина на АЕ-агарозе
Для выделения из сыворотки крови человека ЦП, подвергающегося «спонтанному»
протеолизу, мы использовали хроматографию на АЕ-агарозе (см. раздел 2.3.1.2) [Musci et
al., 1993]. Смолу уравновешивали PBS, наносили сыворотку крови и промывали PBS до
A280 < 0,02 в оттекающем с колонки растворе. Колонку промывали 0,5 М NaCl (рН 7,4),
79
элюированный с колонки ЦП характеризовался соотношением A610/A280 ~ 0,047 и
подвергался постепенному «спонтанному» протеолизу при хранении препарата.
2.7.2. Выделение лактоферрина грудного молока
Двухэтапный метод получения лактоферрина (ЛФ) из грудного молока был применен в
нашей лаборатории [Zakharova et al., 2000]. Грудное молоко (2000 мл) делипидировали
центрифугированием в течение часа при 500 g и 30 минут при 10000 g, фильтровали на
воронке Бюхнера под давлением вакуумного насоса через 6 слоев марли и 2 слоя
фильтровальной бумаги. Фильтрат центрифугировали при 10000 g в течение 30 минут и
еще раз фильтровали на складчатом фильтре. Обезжиренное молоко наносили на колонку
(5 12 см) с CM-Сефадексом, затем отмывали несвязавшиеся белки 500 мл PBS. ЛФ,
задержавшийся на колонке, элюировали градиентом NaCl: по 300 мл 0,15 M – 1М NaCl,
содержавших 10 мМ Na-фосфатный буфер, pH 7,4. На следующем этапе ЛФ подвергали
гель-фильтрации на колонке с Сефакрилом S-200 HR.
2.7.3. Выделение белков нейтрофильных лейкоцитов
Выделение серпроцидинов и миелопероксидазы (МПО) из лейкоцитов человека
осуществляли с помощью последовательного отделения азуроцидина (CAP37) и МПО на
гепарин-Сефарозе, отделения эндогенных ингибиторов от протеиназ (нейтрофильной
эластазы (NE), катепсина G (CG) и протеиназы 3 (PR3)) при гель-фильтрации на
Сефадексе G-75, отделения PR3 на апротинин-Сефарозе и очистки белков на CMToyopearl. Дополнительные порции МПО и пероксидазы эозинофилов (ЭПО) получали
после экстракции белков катионным детергентом СТАВ [Olsen and Little, 1983]. Осадок
лейкоцитов (40 г) суспензировали в 100 мл 100 мМ Na-ацетатного буфера, рН 4,7, и
подвергали замораживанию и оттаиванию с последующей трехкратной соникацией (44
кГц) по 30 секунд с перерывами 1 минута при охлаждении на льду. Полученный экстракт
лейкоцитов центрифугировали в течение 30 минут при 15000 g (4 ºC). Супернатант
использовали для выделения МПО (см. раздел 2.7.3.1). К осадку добавляли 3 объема 0,5
% CTAB в 0,1 М Na-ацетатном буфере, рН 4,7 и подвергали замораживанию и
оттаиванию с последующей трехкратной соникацией (44 кГц) по 30 секунд с перерывами
1
минута
при
охлаждении
на
льду.
Полученный
CTAB-экстракт
лейкоцитов
центрифугировали в течение 30 минут при 15000 g (4º C) и использовали для выделения
CTAB-МПО и CTAB-ЭПО (см. раздел 2.7.3.3).
80
2.7.3.1. Выделение миелопероксидазы
Супернатант, полученный на предыдущем этапе, подвергали хроматографии на
колонке с гепарин-Сефарозой (5×15 см), уравновешенной 0,1 М Na-ацетатным буфером,
рН 4,7. Колонку с гепарин-Сефарозой промывали градиентом по 100 мл 0→2 M NaCl на
0,1 М Na-ацетатном буфере, рН 4,7. МПО, которая элюировалась в начале градиента, в
значительной мере была загрязнена ЛФ из НФ и в дальнейшем очищалась с помощью
хроматографии на фенил-Сефарозе. На колонку с фенил-Сефарозой (1×5 см) наносили
МПО с добавлением NaCl до 1 M, промывали колонку 50 мМ Na-ацетатным буфером, рН
5,5 до A280 < 0,002, а затем элюировали практически чистую МПО 5 мМ CaCl 2 в 50 мМ
Na-ацетатном буфере, рН 5,5, содержащем 25 % глицерола (v/v). Белок подвергали
дополнительной очистке на колонке с Сефакрилом S-200 HR (2,5×150 см). Было получено
215 мг МПО, которая характеризовалась RZ(A430/A280) > 0,85. Данные о постадийной
очистке МПО суммированы в таблице 2.4.
Таблица 2.4
Критерии чистоты МПО при выделении из лейкоцитов
Общий
белок,
мг
Общая
активность1,
U
Удельная
активность,
U/мг
RZ
Выход,
%
Экстракт лейкоцитов
4200
156000
37,1
-
100
После гепарин-Сефарозы
430
136000
316,3
0,36
87,2
После фенил-Сефарозы
229
125600
548,5
0,77
80,5
После Сефакрила S-200 HR
215
119800
557,2
0,85
76,8
Стадия
1
см. раздел 2.5.1.1
2.7.3.2. Выделение серпроцидинов
При элюции белков с гепарин-Сефарозы на предыдущем этапе CAP37 элюировался с
колонки в конце градиента, его разводили в 20 раз водой и наносили на колонку с CMToyoperal (1,5×10 см), уравновешенную 100 мМ Na-ацетатным буфером, рН 4,7, белки
элюировали линейным градиентом по 75 мл 0→0,5 M NaCl в 100 мМ Na-ацетатном
буфере, рН 4,7. Белки, элюированные с колонки с гепарин-Сефарозой в свободном
объеме на предыдущем этапе, использовали для выделения NE, CG и PR3, фракцию
лиофильно высушивали и растворяли в 25 мл 1 M NaCl, 50 мМ Na-ацетатного буфера, рН
4,7. Нерастворенные примеси удаляли центрифугированием в течение 30 минут при
15000 g (4 ºC). Белки подвергали гель-фильтрации на колонке с Сефадексом G-75
Superfine (5×100 см), уравновешенной 1 M NaCl, 50 мМ Na-ацетатного буфера, рН 4,7. Во
81
фракциях анализировали активность NE, PR3 и CG (см. разделы 2.5.3 и 2.5.4). Все три
протеиназы элюировались с колонки совместно, в этой фракции с помощью 1 М Tris
подводили рН до 7,0 и наносили фракцию на колонку с Апротинин-Сефарозой (5×10 см).
Колонку отмывали 1 M NaCl, 50 мМ Tris-HCl, pH 7,4 до A280 < 0,005 в оттекающем
буфере. При этом элюировалась PR3, которую дополнительно очищали, как и CAP37, на
колонке с CM-Toyopearl. Элюцию NE и CG проводили 200 мМ Na-ацетатным буфером,
рН 4,3 и затем разделяли белки с помощью ионообменной хроматографии на колонке с
СМ-Toyopearl, уравновешенной 50 мМ Na-ацетатным буфером, рН 4,7. На колонку
наносили белок, разбавленный до конечной концентрации буфера 50 мМ, NE и CG
элюировали линейным градиентом по 50 мл 0
1 М NaCl (0,05 M Na-ацетатный буфер,
рН 4,7). Препараты протеиназ и CAP37 были на 99 % представлены 30 кДа зонами по
данным SDS-электрофореза в ПААГ, не содержали примесных протеолитических
активностей и фрагментов гомологов по данным масс-спектрометрии фрагментов
трипсинолиза. Было получено 32 мг CAP37, 28 мг NE, 24 мг CG и 12 мг PR3.
2.7.3.3. Выделение СТАВ-миелопероксидазы и СТАВ-пероксидазы эозинофилов
Полученную надосадочную жидкость наносили на колонку с Гепарин-Сефарозой
(2,5×7 см), промывали 50 мМ Na-ацетатным буфером, pH 4,7 до A280 < 0,01 в оттекающем
буфере. СТАВ-ЭПО и CTAB-МПО
0
элюировали линейным градиентом по 60 мл
3 M NaCl (50 мМ Na-ацетатный буфер, pH 4,7). Фракции, содержавшие ЭПО и МПО,
концентрировали по отдельности до объема 2 мл на ячейке VivaSpin20, удерживающей
белки с M выше 30 кДа, и очищали с помощью гель-фильтрации на колонке с
Сефакрилом S-200 HR (2,5×100 см). Было получено 6 мг CTAB-ЭПО, критерий чистоты
препарата A413/A280 (RZ) составил 1,09, при электрофорезе в SDS-ПААГ ЭПО мигрировала
как 53 кДа- и 15 кДа-цепи (при обработке 2-меркаптоэтанолом). Также было получено 20
мг CTAB-МПО, критерий чистоты A413/A280 (RZ) составил 0,83.
2.7.4. Выделение липопротеинов плазмы крови
Липопротеины
выделяли
методом
ультрацентрифугирования
плазмы
крови,
последовательно наслаивая на плазму растворы с плотностью 1,0055 г/мл для ЛОНП,
1,063 г/мл для ЛНП и 1,21 г/мл для ЛВП с отделением соответствующей флотирующей
фракции липопротеинов. Отобранные липопротеины диализовали против PBS. Для
быстрого выделения ЛНП использовали гель-фильтрацию на колонке с BioGel A-1,5m
(2,5×150 см), позволявшую получить фракции ЛОНП и ЛНП при элюции образца 5 мл
плазмы с ЭДТА 0,3 М NaCl в 20 мМ триэтаноламин-HCl, pH 7,20. Фракции
концентрировали на ячейке VivaSpin 20 с пределом исключения 1 МДа. Чистоту
липопротеинов контролировали с помощью электрофореза в четырехслойном ПААГ (см.
82
раздел 2.6.7). Фракции липопротеинов хранили при 4 ºC и использовали в течение 3–4
дней после выделения.
2.8. Иммунохимические методы
2.8.1. Подготовка антигенов для иммунизации
Для увеличения иммунного ответа антигены перед иммунизацией подвергали
электрофорезу в ПААГ, после электрофореза края геля отрезали и окрашивали на
Кумасси R-250. Неокрашенную полоску ПААГ с основным количеством белка разделяли
на части, содержащие около 100 мкг белка. Части ПААГ замораживали при –70 ºС и
хранили до иммунизации. ЦП перед иммунизацией подвергали электрофорезу согласно
разделу 2.6.1, а МПО, лактоферрин, катепсин G, протеиназу 3, азуроцидин и эластазу
подвергали электрофорезу согласно разделу 2.6.2.
2.8.2. Иммунизация кроликов и крыс
Для иммунизации кроликов и крыс фрагменты ПААГ с белком (при расчете 100 мкг
на кролика)
измельчали в гомогенизаторе с PBS и полным (неполным для 2 и 3
иммунизации) адъювантом
Фрейнда (1/10 от объема смеси). Суспензии
вводили
кроликам внутрикожно в парапозвоночную область с интервалами в две недели, и через
10–12 суток после третьей иммунизации из ушной вены у кроликов забирали кровь (по 50
мл). После свертывания крови полученную сыворотку замораживали и использовали как
антисыворотку для иммуноэлектрофореза.
Для иммунизации крыс суспензии ПААГ с белком (при расчете 100 мкг на животное)
измельчали в гомогенизаторе с PBS и полным (неполным для следующих 3-х
иммунизаций) адъювантом
Фрейнда (1/10 от объема смеси). Суспензии
вводили
взрослым крысам (500–600 г) внутрикожно в парапозвоночную область с интервалами в
10 дней и через 10–12 суток после четвертой иммунизации крыс наркотизировали эфиром
и забирали кровь (по 25 мл).
После свертывания крови полученную сыворотку
использовали для выделения аффинных IgG.
2.8.3. Выделение иммуноглобулинов G сыворотки
После свертывания крови полученную сыворотку использовали для выделения IgG.
Белки высаливали путем насыщения (NH4)2SO4 до 1,75 М. Осадок, содержащий IgG,
промывали три раза 1,75 М (NH4)2SO4, растворяли в PBS и диализовали против 0,0175 M
Na-фосфатного буфера, pH 6,3. Полученный раствор пропускали через колонку с DEAEСефадексом A-50. Антитела выходили с колонки в свободном объеме буфера. Вторую
фракцию IgG элюировали 0,035 M Na-фосфатным буфером, pH 7,6. Эти фракции,
83
которые, согласно ЭФ в ПААГ с SDS, содержали единственный белок с М 160 кДа (при
разрыве S-S связей – 60 и 20 кДа-зоны), были объединены. IgG диализовали против
дистиллированной воды до исчезновения осадка при использовании пробы с солями Ba2+
на присутствие фосфатов и затем лиофилизировали.
Для выделения аффинных антител на колонку с белком, иммобилизованным на BrCNактивированной Сефарозе, предварительно уравновешенную PBS, наносили 150 мл
сыворотки, промывали PBS c 1М NaCl и затем элюировали аффинные IgG 0,2 М Gly-HCl,
pH 2,4. Фракции собирали в пробирки, содержащие 0,5 объема 0,4 М Tris-HCl, рН 8,0.
Фракции, которые, согласно ЭФ в ПААГ с SDS, содержали единственный белок с М 160
кДа (при разрыве S-S связей – 60 и 20 кДа-зоны), были объединены и после диализа
против 10 мМ Na-фосфатного буфера, рН 7,4, заморожены при –70 ºС.
2.8.4. Двойная радиальная иммунодиффузия
Титр антител в антисыворотке устанавливали с помощью двойной радиальной
иммунодиффузии в 1%-ной агарозе [Ouchterlony, 1949]. 10 мл 1%-ной агарозы на PBS
наливали в уравновешенные чашки Петри и оставляли при комнатной температуре до
застывания. При помощи трафарета делали лунки диаметром 2 мм. В центральную лунку
помещали раствор антител, а в периферические – растворы белков разного разведения.
После инкубации в течение ночи при 37 ºС развивались полосы преципитации. Полоса
минимальной интенсивности, располагавшаяся между лунками белка и антител,
соответствовала титру, а наиболее резкая полоса, располагавшаяся посередине, –
эквивалентному соотношению.
2.8.5. Ракетный иммуноэлектрофорез
Ракетный иммуноэлектрофорез белков производили [Laurell, 1967], используя
буферный раствор барбитал-глицин-Tris: буфер 1 содержал 65 г барбитала натрия и 10,35
г барбитала в 5 л; буфер 2 содержал 281 г глицина и 226 г Tris в 5 л. Барбиталы
растворяли в 1 л доведенной до кипения дистиллированной воды при перемешивании.
Смешиванием равных объемов буферов 1 и 2 получали буферный раствор с pH 8,8.
Иммуноэлектрофорез проводили в 1 %-ной агарозе, растворенной в этом буфере, из
расчета 0,19 мл агарозы на 1 см2 стеклянной пластины (чаще всего использовали
пластину размером 60 90 1 мм и 10 мл агарозы), оптимальную концентрацию антител в
геле устанавливали экспериментально. Соответствующее количество расплавленной 1%ной агарозы охлаждали до 60 ºС, добавляли антисыворотку, выливали на уравновешенное
стекло и проводили электрофорез в течение 17 часов при напряжении 10 В/см, нанося на
пробу 1–10 мкг белка. После электрофореза гель отжимали при помощи фильтровальной
84
бумаги слоем 2–3 см, на которую помещали груз (10 г/см2) на 10 мин. Для окрашивания
иммунопреципитатов Кумасси бриллиантовым синим слой геля, превращенный в тонкую
пленку, плотно прилегающую к стеклу, отмывали в физиологическом растворе,
высушивали, а затем окрашивали подобно ПААГ после ЭФ.
2.8.6. Вестерн-блоттинг
Для
выявления
специфических
электрофоретического
переноса
зон
на
в ПААГ
после
нитроцеллюлозный
ЭФ
применяли
фильтр
и
метод
детекцию
специфических зон с помощью иммуноферментного анализа – Вестерн-блоттинг
[Anderson et al., 1982]. Для переноса использовали аппарат, состоящий из двух плоских
электродов. Все действия с нитроцеллюлозным фильтром проводили в перчатках, посуду
для смачивания фильтра в буферах и для дальнейшей детекции антигенов тщательно
отмывали от жировых и белковых загрязнений. На горизонтальную поверхность анода
последовательно помещали систему из нитроцеллюлозного фильтра, ПААГ и бумажных
фильтров, смоченных специальными буферами для переноса, мягко прокатывая по
поверхности бумажных фильтров толстой стеклянной трубкой для удаления пузырьков
воздуха между ними, по следующей схеме:
Анод (низ)
Буфер I
34 мл
1 M Tris-HCl, pH 10,4
6 фильтров в буфере I
Этанол
H2O
3 фильтра в буфере II
нитроцеллюлозный фильтр
в буфере II
До 100 мл
1 M Tris-HCl, pH 10,4
2,5 мл
ПААГ
Этанол
20 мл
3 фильтра в буфере III
H2O
Целлофан
Буфер II
20 мл
Буфер III
До 100 мл
1 M Tris-HCl, pH 9,4
2,5 мл
6 фильтров в буфере III
Этанол
20 мл
Катод (верх)
H2O
До 100 мл
Перенос белков на нитроцеллюлозный фильтр проводили при 90–100 мА в течение 1
часа. После переноса фильтр обрабатывали по следующей схеме:
1) отмывка в H2O (10 минут);
2) инкубация в BLOTTO-T (30 минут при 37 С или 15 часов при 4 С);
85
3) инкубация с антителами против исследуемого белка (1 час при 37 С или 15 часов
при 4 С), разведение антител определяется эмпирически;
4) промывание BLOTTO-T (3 5 минут);
5) инкубация с конъюгатом «антитела осла к IgG кролика – пероксидаза хрена» (1 час
при 37 С), разведение конъюгата – 1:10000;
6) промывание PBS (3 5 минут);
7) выявление конъюгата при добавлении 12 мл раствора субстрата.
BLOTTO-T: 3%-ное обезжиренное молоко в PBS с 0,05 % Tween 20.
Субстрат: 6 мг 4-хлор-1-нафтола, 2 мл метанола, 6 мкл 30%-ного H2O2, до 12 мл TBS
(150 мМ NaCl, 20 мМ Tris-HCl, pH 7,4).
Нитроцеллюлозный фильтр с проявившимися фиолетовыми зонами хранили в темноте.
2.8.7. Твердофазный иммуноферментный анализ
2.8.7.1. Сэндвич иммуноферментный анализ миелопероксидазы
На 12 часов в лунки планшета помещали по 100 мкл раствора антител крысы к МПО (5
мкг/мл) в Na-карбонатном буфере, рН 9,4, планшет оставляли герметично закрытым при 4
ºС, на следующий день из лунок отбирали антитела и добавляли в лунки по 200 мкл 3%ного сухого молока в PBS, содержащего 0,05 % Tween 20 (BLOTTO-T) [Горудко и соавт.,
2009]. Планшет инкубировали на термошейкере при 37 ºС в течение 1 часа. Затем
отбирали из лунок молоко и промывали лунки 3 раза по 200 мкл BLOTTO-T. В лунки
заливали по 100 мкл BLOTTO-T, при этом в столбцах титровали стандартный раствор
МПО и пробы сыворотки. Планшет инкубировали на термошейкере при 37 ºС в течение
1 часа. Затем отбирали из лунок молоко и промывали лунки 3 раза по 200 мкл BLOTTOT. В лунки заливали по 100 мкл BLOTTO-T и антитела кролика к МПО. Планшет
инкубировали на термошейкере при 37 ºС в течение 1 часа. Затем отбирали из лунок
молоко и промывали лунки 3 раза по 200 мкл BLOTTO-T. В лунки заливали по 100 мкл
BLOTTO-T и антитела осла к антителам кролика, конъюгированные с пероксидазой
хрена. Планшет инкубировали на термошейкере при 37 ºС в течение 1 часа. Затем
отбирали из лунок молоко и промывали лунки 3 раза по 200 мкл BLOTTO-T. В лунки
заливали по 100 мкл раствора о-фенилендиамина (10 мг о-фенилендиамина растворяли в
1 мл этанола с 11 мл 0,1 М Na-цитратного буфера, рН 4,0 и 5 мМ H2O2) и наблюдали за
развитием окраски. Окраску останавливали, добавляя в лунки по 50 мкл 6М серной
86
кислоты. Окраску измеряли в планшетном фотометре (A492). Зависимость A492 от lg[МПО]
аппроксимировали
прямой
по
методу
наименьших
квадратов,
коэффициент
детерминированности (R2) составлял не менее 0,99 (Microsoft Excel 2002). С помощью
полученного уравнения A492 = k lg[МПО]+b рассчитывали содержание МПО в образцах.
2.8.7.2. Конкурентный иммуноферментный анализ церулоплазмина
Полистирольные планшеты активировали путем инкубации в течение ночи с 0,1 мл
0,5%-ного глутарового альдегида в PBS [Sokolov et al., 2010]. После трехкратной отмывки
PBS в лунки планшета на 1 час помешали по 0,1 мл антител кролика против ЦП (50
мкг/мл). Затем в лунки на 1 час вносили по 0,2 мл BLOTTO-T, 0,1 мл растворов
содержащих ЦП (диапазон стандарта 10–150 нг/мл) и 0,05 мл конъюгата ЦП с
пероксидазой хрена. После каждого из растворов планшет троекратно промывали PBS.
Пероксидазную реакцию проявляли смесью 10 мг о-фенилендиамина в 1 мл этанола с 11
мл 0,1 М Na-цитратного буфера, рН 4,0 и 5 мМ H2O2. После остановки хромогенной
реакции 0,05 мл 6 М H2SO4 измеряли А492 содержимого лунок на планшетном фотометре
StatFax (США). Зависимость A492 от lg[ЦП] аппроксимировали прямой по методу
наименьших квадратов, коэффициент детерминированности (R2) составлял не менее 0,97
(Microsoft Excel 2002). С помощью полученного уравнения A492 = k lg[ЦП]+b
рассчитывали содержание ЦП в образцах.
2.8.7.3. Иммуноферментный анализ азуроцидина
Полистирольные планшеты активировали путем инкубации в течение ночи с 0,1 мл
0,5%-ного глутарового альдегида в PBS [Соколов и соавт., 2010]. После трехкратной
отмывки PBS в лунки планшета на 1 час помешали по 0,1 мл исследуемых образцов и
стандартные растворы CAP37 (0,8–120 нМ). Затем в лунки на 1 час вносили по 0,2 мл
BLOTTO-T, 0,1 мл раствора IgG кролика против CAP37 (250 мкг/мл), 0,1 мл антител
козла против антител кролика, меченых пероксидазой хрена (1:1000). После каждого из
растворов планшет троекратно промывали PBS. Пероксидазную реакцию проявляли
смесью 10 мг о-фенилендиамина в 1 мл этанола с 11 мл 0,1 М Na-цитратного буфера, рН
4,0 и 5 мМ H2O2. После остановки хромогенной реакции 0,05 мл 6 М H2SO4 измеряли А492
содержимого лунок на планшетном фотометре StatFax (США). Зависимость A492 от
lg[CAP37] аппроксимировали прямой по методу наименьших квадратов, коэффициент
детерминированности (R2) составлял не менее 0,99 (Microsoft Excel 2002). С помощью
полученного уравнения A492 = k lg[CAP37]+b рассчитывали содержание CAP37 в
образцах.
87
2.8.8. Иммунопреципитация церулоплазмина из плазмы крови
Для иммунопреципитации ЦП из плазмы крови использовали аффинные антитела
кроликов против ЦП человека (раздел 2.8.3), для усиления преципитации к ним
добавляли антитела козла против IgG кролика. Плазму инкубировали 30 минут с
аффинными антителами кроликов против ЦП (0,1–2 мг/мл), после этого в плазму
добавляли антитела козла против IgG кролика (2 мг/мл) и инкубировали еще 30 минут.
Образцы центрифугировали 10 минут при 15000 g (4 ºС). В надосадочной жидкости
определяли концентрацию ЦП и ЛФ.
2.9. Антимикробная активность лактоферрина и миелопероксидазы
Антимикробную активность апо-ЛФ и системы «МПО-H2O2-хлорид/тиоцианат»
оценивали
по
замедлению
спектрофотометрическим
роста
методом
в
Escherichia
присутствии
coli
(штамм
метаболического
ML-35p)
индикатора
ресазурина [Cooper et al., 2013]. Клетки культивировали в течение ночи при температуре
37 °С в 3%-ном триптическом гидролизате сои. Суспензию ночной культуры E. coli
центрифугировали при 6000 g в течение 5 минут, затем промывали охлажденным (4 °С)
PBS и центрифугировали при тех же условиях. Осадок клеток ресуспендировали в PBS и
определяли концентрацию клеток измерением A620, исходя из того, что одной единице
оптической
плотности
2,5×108
соответствует
КОЕ/мл.
В
лунки
96-луночного
плоскодонного планшета вносили исследуемые вещества в PBS; бактериальную
суспензию (конечная концентрация в лунке – 4×104 КОЕ/мл); триптический гидролизат
сои (конечная концентрация – 0,18 %); 30 мкМ ресазурин. В качестве антимикробных
веществ использовали апо-ЛФ, МПО в присутствии постоянной концентрации H2O2 (10
мкМ), тиоцианата натрия (10 мкМ). Белки (ЦП, апо-ЛФ и МПО) добавляли в
соотношении 2ЛФ:2ЦП:1МПО. Планшет инкубировали на шейкере при температуре 37
°С. Метаболическую активность бактерий оценивали по возрастанию показателя (А530–
А630).
Измерение
спектрофотометра
проводили
StatFax
каждые
(США).
30
минут
с
Антимикробную
помощью
активность
многоканального
выражали
как
концентрацию белка, которая вызывала снижение в 2 раза величины (А530–А630) по
сравнению с контрольными клетками (MIC50).
2.10. Модификация белков и липопротеинов низкой плотности
2.10.1. Получение апо-формы церулоплазмина
Апо-форму нефрагментированного ЦП получали путем добавления к 20 мкМ ЦП
аскорбиновой кислоты (0,1 М), азида натрия (0,1 М) и ЭДТА (0,5 M). Бесцветный белок
диализовали 24 часа против 0,1 М ЭДТА, рН 8,0 и затем трижды по 12 часов против PBS
88
(4ºС). Препарат содержал менее 0,05 атомов меди на молекулу ЦП по данным атомноадсорбционной спектрометрии. В контрольных опытах доказывали отсутствие в
препаратах следов хелатирующих агентов.
2.10.2. Получение протеолизованного церулоплазмина
Протеолизованный ЦП (ЦПпр) получали с помощью ограниченного протеолиза
плазмином интактного ЦП в течение 1 часа при 37 ºC (плазмин:ЦП = 1:500, w/w).
Гидролиз останавливали добавлением 10 мкМ 6-аминокапроновой кислоты. По данным
SDS ЭФ в ПААГ более 90 % белка после такой обработки было представлено
фрагментами с M 116 и 19 кДа.
2.10.3. Получение лактоферрина, насыщенного железом и медью
Насыщенный железом либо медью ЛФ получали добавлением 200 мкМ FeCl 3 либо
CuSO4 к 50 мкМ апо-ЛФ в 100 мМ Na-цитрат-гидрокарбонатном буфере, рН 8,0. Избыток
железа или меди удаляли с помощью диализа в течение 12 часов при 4 оС против 500кратного объема 100 мМ Na-цитрат-гидрокарбонатного буфера, рН 8,0, который затем
заменяли PBS и повторяли диализ. После диализа ЛФ наносили на колонку со смолой
Chelex 100 (1×3 см), уравновешенную PBS, и элюировали белок PBS.
2.10.4. Модификация церулоплазмина окислителями
Модификацию ЦП пероксидом водорода проводили при 37 °С, варьируя время
инкубации (до 5 часов), концентрацию H2O2 (0,1–15 мМ), pH (5,5–7,4) 10 мМ Naфосфатного буфера и добавки скавенджеров свободных радикалов, белков и хелаторов
(маннитол, азид натрия, ДМСО, Cu,Zn-SOD, гистидин, Chelex X-100, ЛФ, ЧСА, лизоцим).
Реакцию модификации ЦП останавливали, добавляя 10 нМ каталазы.
К раствору ЦП (50 мкМ) добавляли 100–3000 мкМ HOCl, HOBr, HOSCN в 50 мМ Naфосфатном буфере, pH 7,4, тем самым достигалось мольное соотношение HOX:ЦП = (2–
60):1. Через 30 минут инкубации при 37 °С анализировали изменение спектральных
характеристик ЦП, его оксидазных активностей и влияние на респираторный взрыв НФ.
Окислительное повреждение ЦП в системе in vitro исследовали по изменению его оDA-оксидазной активности в ПААГ после диск-электрофореза. Реакционная смесь
содержала 1 мкМ ЦП, 10 нМ глюкозоксидазы, 100 мкМ D-глюкозы и различные
комбинации 3 нМ МПО, 100 мМ NaCl, 1 мМ NaBr, 200 мкМ NaSCN в 0,1 М цитрат-Naфосфатном буфере, рН 6,8. После инкубации в течение 1 часа при 37 ºС в пробы для
остановки модификации добавляли 0,2 мМ таурина и 10 нМ каталазы.
89
2.10.5. Модификация липопротеинов низкой плотности окислителями
К ЛНП (0,5 мкМ по апоВ-100) добавляли окислители: HOCl (1:100, моль/моль), HOBr
(1:100, моль/моль) или смесь 5 нМ МПО с 50 мкМ H2O2 в PBS, без или с добавлением 5
мМ NaBr или 0,2 мМ NaSCN, также использовали добавки 5 мкМ ABAH, 6 мкМ ЦП либо
ЦПпр, 1мкМ пептидов P1–15 или P445–456. После 30 минут инкубации при 37 оС
модификацию останавливали, добавляя 50 мкМ цистеина. Модифицированные ЛНП
исследовали на проатерогенные свойства при инкубации с моноцитами (см. раздел 2.2.5).
Для оценки аффинности модифицированных ЛНП к МПО их диализовали в течение 12
часов при 4 оС против 500-кратного объема PBS.
2.11. Анализ трехмерной структуры белков и их комплексов
Рентгеноструктурные исследования очищенных нами ЦП и его комплексов проведены
к. ф-м. н. В.Р. Самыгиной (Институт кристаллографии РАН, г. Москва) на станции
синхротронного излучения BW6, DESY в сотрудничестве с Г. Бартуником и Д.И.
Свергуном (г. Гамбург, Германия). Трехмерные структуры ЦП с разрешением 2,6 Å (4enz)
и комплекса 2ЦП-МПО с разрешением 4,7 Å (4ejx) находятся в открытом доступе в базе
данных Protein Data Bank. Измерения рассеяния рентгеновских лучей под малыми углами
(SAXS) были проведены с использованием источника X33 на станции EMBL, DESY (г.
Гамбург, Германия). Образцы ЦП, ЛФ, МПО, комплексов ЦП-ЛФ, 2ЦП-2ЛФ-МПО
(предварительно подвергнутые гель-фильтрации) были использованы в нескольких
концентрациях (1–5 мг/мл). Условия кристаллизации белков, сбора дифракционных
данных, данных SAXS и получения трехмерных моделей белков и их комплексов
подробно описаны в нашей работе [Samygina et al., 2013].
2.12. Статистическая обработка результатов
Для статистической обработки экспериментальных данных использовали программу
Microsoft Excel 2002. Эксперименты повторяли три раза (n=3, если не указано иначе) и
среднее значение рассчитывали как Хm = (1/n)ΣXi, где Хi – значение, полученное в
каждом опыте. Расчет стандартного квадратичного отклонения измеренных значений от
n
_
( xi
среднего проводили по формуле:
i 1
n 1
x)
. Для проверки гипотезы, что
анализируемая выборка имеет нормальное распределение, использовали критерий
Колмогорова–Смирнова для α = 0,05. Для расчета коэффициентов a и b линейной
зависимости y = ax + b по экспериментальным данным использовали метод наименьших
квадратов. Для оценки степени соответствия фактических и расчетных значений y
90
вычисляли коэффициент детерминированности (нормированный от 0 до 1) по формуле:
R2
xy
(
x
) 2 . При R2 близком к 1 считали, что нет различия между фактическими и
y
расчетными значениями y, т. е. имеет место полное соответствие теоретической
линейной зависимости. Стандартное квадратичное отклонение для коэффициентов a и b
__
2
вычисляли по формулам:
2
a
__
и
_
2
b
2
a
x 2 . При расчете стандартного
n( x 2 ( x ) 2 )
квадратичного отклонения для с – координаты пересечения прямой с осью абсцисс
(c
b
)
a
использовали
формулу:
2
с
с (
2
a
2
a
2
b
2
b
2
).
Линейный
коэффициент
корреляции Пирсона (r) рассчитывали с помощью программы Microsoft Excel 2002.
Доверительные интервалы рассчитывали как
Xm±( /n1/2)tn–1,1–α/2, значения t (t-
критерий Стьюдента) были взяты из табличных значений при условии, что α = 0,05.
В случае сравнения экспериментальных данных с расчетным значением использовали
одновыборочный t-критерий, нулевую гипотезу принимали при р > 0,05.
В случае множественных сравнений использовали двухфакторный и трехфакторный
дисперсионный анализ с последующим применением критерия Тьюки, нулевую гипотезу
принимали при р < 0,05.
При изучении взаимовлияния компонентов комплекса на ферментативную активность
определение типа ингибирования или активации и выбор адекватной формулы для
расчета констант ингибирования (Ki) или активации (Ka) осуществляли с использованием
уточненных уравнений для двухпараметрических типов ингибирования и активации
[Крупянко, 2007].
2.13. Получение образцов от здоровых доноров, пациентов с воспалительными
заболеваниями и лабораторных животных
Протоколы получения образцов плазмы крови, грудного молока, лейкоцитарной массы
и цельной крови здоровых доноров, плазмы крови пациентов с атеросклерозом,
синовиальной жидкости больных ревматоидным артритом, а также протоколы
иммунизации кроликов и крыс с целью получения антисыворотки согласованы с
локальным этическим комитетом ФГБНУ «ИЭМ».
91
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Структура комплексов, формируемых при взаимодействии церулоплазмина с
лактоферрином и миелопероксидазой
Состояние проблемы на момент исследования. До начала исследований вопрос о
стехиометрии компонентов в комплексах, формируемых ЦП с ЛФ и МПО, не был
разрешен. Ряд опытов по разделению комплексов с помощью электрофореза и гельфильтрации убедительно свидетельствовал в пользу эквимолярного соотношения
компонентов [Zakharova et al., 2000; Соколов и соавт., 2006; Соколов и соавт., 2007]. В
частности, при добавлении к ЦП как ЛФ, так и МПО они элюировались при гельфильтрации в объемах, соответствовавших соотношению компонентов 1:1 по данным
калибровки колонки. С другой стороны, влияние компонентов на ферментативные
свойства
друг
друга
[Соколов,
2007]
и
особенности
строения
белков
(внутримолекулярная гомология, вызванная дупликацией/трипликацией предковых генов
ЛФ и ЦП; димерное строение МПО) свидетельствовали в пользу сложного строения
комплексов. В частности, для активации p-PD-оксидазной активности ЦП достаточно
было добавить 1 моль димерной МПО на 2 моля ЦП [Соколов, 2007]. Изучение влияния
ЛФ на ферментативную активность ЦП показало наличие двух центров связывания для
ЛФ: 1) связывание с высокоаффинным сайтом непосредственно усиливало сродство ЦП к
ионам Fe2+ и скорость их окисления; 2) связывание с низкоаффинным сайтом уменьшало
сродство ЦП к p-PD по механизму обратимого конкурентного ингибирования [Соколов,
2007]. Изучение комплексов таких лабильных и крупных белков, как ЦП, МПО и ЛФ,
методом рентгеноструктурного анализа осложнено. В литературе описаны единичные
примеры получения пригодных для анализа кристаллов крупных секреторных белков. В
нашей работе мы проверили полученные ранее данные о стехиометрическом
соотношении компонентов в комплексах, получаемых при смешивании ЦП, ЛФ и МПО, с
помощью хроматографических и спектральных методов. Полученные результаты
сравнили
с
трехмерными
моделями
комплексов
2ЦП-МПО
(по
данным
рентгеноструктурного анализа) и ЦП-ЛФ, 2ЦП-2ЛФ-МПО (по данным рассеяния
рентгеновских лучей под малыми углами – SAXS).
3.1.1. Исследование методом гель-фильтрации
Для
уточнения
стехиометрических
соотношений
компонентов
в
комплексах,
формируемых ЦП, ЛФ и МПО, мы использовали опыты с гель-фильтрацией на колонке с
Toyopearl HW-55 fine. Мы наблюдали совместную элюцию ЦП, ЛФ и МПО в виде
92
симметричных единичных пиков, молекулярная масса которых соответствовала
эквимолярному соотношению ЦП-ЛФ, ЦП-МПО и ЦП-ЛФ-МПО: 215 ± 5, 280 ± 6 и 350 ±
5 кДа, соответственно. Но при этом в случае комплекса ЦП-МПО и ЦП-ЛФ-МПО мы
наблюдали, что при равномолярном смешивании компонентов в ходе гель-фильтрации
вслед за комплексами, содержавшими МПО, элюировалась примерно половина
свободной
МПО.
Поскольку
в
опытах
мы
использовали
белки,
обладающие
хромофорными группами, измерение соотношения характерных для ЦП (A610) и для МПО
(A430) поглощений во фракциях, соответствовавших комплексам, позволило соотнести их
с теоретически возможными и сделать вывод о соотношении компонентов (таблица 3.1).
Таблица 3.1
Спектральные свойства белков и их смесей
Белки и их смеси
A280/A610
A280/A430
ЦП
22,0
> 100
МПО
14,4
1,3
Расчетные значения
1ЦП:1ЛФ
35,0
> 100
1ЦП:2ЛФ
47,8
> 100
1ЦП:1МПО
14,8
2,4
2ЦП:1МПО
16,5
3,5
1ЦП:1ЛФ:1МПО
18,7
3,0
2ЦП:2ЛФ:1МПО
22,6
4,7
Значения, полученные для комплексов после гель-фильтрации
ЦП+ЛФ
35,1 ± 0,2 (p = 0,48)
> 100
ЦП+МПО
16,3 ± 0,2 (p = 0,23)
3,4 ± 0,1 (p = 0,48)
ЦП+ЛФ+МПО
22,4 ± 0,2 (p = 0,23)
4,6 ± 0,1 (p = 0,23)
Оказалось, что при смешивании ЦП и МПО образуется комплекс 2ЦП:1МПО, а при
смешивании
ЦП
с
ЛФ
и
МПО
формируется
комплекс
со
стехиометрией:
2ЦП:2ЛФ:1МПО. В случае комплекса ЦП и ЛФ данные гель-фильтрации и изменения
спектральных характеристик однозначно свидетельствовали в пользу образования
комплекса 1ЦП:1ЛФ.
93
3.1.2. Исследование методом фотонной корреляционной спектроскопии
Метод
фотонной
корреляционной
спектроскопии
(ФКС)
удачно
объединяет
особенности хроматографических методов, т.е. позволяет оценить монодисперсность
системы, и в то же время, являясь спектральным методом, он не предполагает иного
воздействия на исследуемый образец, кроме измерения его взаимодействия со светом.
Это
исключает
артефактное
взаимодействие
компонентов
комплексов
с
хроматографическими сорбентами и позволяет избежать экстремальных условий
электрофоретического разделения (концентрирование образца при диск-электрофорезе,
перепады рН среды, низкая ионная сила, локальный перегрев). В ходе предварительных
опытов мы проверили соответствие полученных значений диаметра для ряда белков по
результатам ФКС, данным кристаллографических исследований и SAXS (таблица 3.2).
Таблица 3.2
Сравнение диаметров белковых частиц, определенных методом ФКС, с
литературными данными
Белок
N5 Beckman Coulter, нм
Данные литературы, нм
Миоглобин
3,1 ± 0,2
3,5
Альбумин
5,8 ± 1,8
6,0
Лактоферрин
5,9 ± 1,0
6,4
Церулоплазмин
7,4 ± 0,8
7,2
Альдолаза
7,5 ± 2,3
8
Миелопероксидаза
7,8 ± 1,2
7,6
Ферритин
10,2 ± 3,3
12,2
Коэффициент корреляции Пирсона между экспериментальными и описанными в
литературе значениями диаметра белковых частиц (d) составил 0,97. Калибровочная
прямая зависимости диаметра частиц (d, нм) от логарифма молекулярной массы (M, кДа)
(рис. 3.1) характеризовалась уравнением d = 5,19lgM – 3,66 и коэффициентом
детерминированности R2 = 0,99.
Значения диаметра частиц и соответствующие значения M комплексов ЦП с ЛФ и
МПО суммированы в таблице 3.3. Белки смешивали в различных соотношениях,
оценивали диаметр образующихся частиц, среднеквадратичное отклонение и индекс
полидисперсности, свидетельствовавший об однородности системы. При определении
диаметра частиц, образующихся при смешивании ЦП и ЛФ, значения с низким индексом
полидисперсности были получены только для смеси белков 1ЦП:1ЛФ. При добавлении к
ЦП количеств ЛФ, превышающих эквимолярное соотношение, значения диаметра частиц
94
уменьшались,
а
стандартное
квадратичное
отклонение
увеличивалось.
Это
свидетельствовало о накоплении в смеси частиц свободного ЛФ наряду с комплексом
1ЦП:1ЛФ, поскольку метод ФКС позволяет выявить в смеси частицы, диаметр которых
различается более чем в 2 раза – в противном случае происходит усреднение значений
диаметра и увеличение его стандартного отклонения. Полученное значение диаметра
комплекса ЦП-ЛФ – 8,4 нм близко к значению, полученному нами с помощью метода
SAXS – 8,6 нм [Sabatucci et al., 2007].
Рис. 3.1. Калибровочная зависимость молекулярной массы (логарифмическая шкала) от
диаметра белковых частиц (R2 = 0,99).
При добавлении ЦП к МПО значения диаметра частиц с низким индексом
полидисперсности были получены для смеси с молярным соотношением 1МПО:2ЦП.
Значение молекулярной массы этого комплекса (386 ± 55 кДа) подтверждает
правильность заключения о таком молярном соотношении. Добавление к комплексу
1МПО:2ЦП 2-х молярного количества ЛФ привело к увеличению размера комплекса. Это
подвергает
сомнению
возможность
образования
комплекса
со
стехиометрией
1МПО:1ЦП:1ЛФ, диаметр которого должен быть меньше, чем у комплекса 1МПО:2ЦП.
Судя по значению молекулярной массы полученного комплекса (585 ± 44 кДа), наиболее
вероятно образование пентамера: 1МПО:2ЦП:2ЛФ. Дальнейшее увеличение количества
добавленного ЛФ привело к уменьшению диаметра частиц и увеличению стандартного
квадратичного отклонения.
95
Таблица 3.3
Диаметры комплексов (d) по данным метода ФКС и значения молекулярной массы
(M), полученные при смешивании ЦП с ЛФ и МПО
Смесь
d, нм
(число определений)
M, кДа
Измерено
Рассчитано
1ЦП-1ЛФ (15)
8,4 ± 1,2
209 ± 30 (p = 0,98)
210
1МПО-2ЦП (12)
9,8 ± 1,4
386 ± 55 (p = 0,54)
409
1МПО-2ЦП-2ЛФ (16)
10,7 ± 0,8
585 ± 44 (p = 0,51)
565
Суммируя полученные данные, можно сделать вывод о наличии двух сайтов
связывания для ЦП на димерной молекуле МПО, что весьма вероятно, учитывая
необходимость взаимодействия ЦП как ингибитора с каждым из двух активных центров
МПО. Этот вывод также подтверждается исследованиями влияния МПО на активность
ЦП в отношении p-PD, в которых 1 моля МПО было достаточно для активации 2 молей
ЦП [Соколов, 2007]. При добавлении ЛФ к комплексу 1МПО-2ЦП каждая из молекул
ЦП, взаимодействующих с мономерами МПО, оказывается способной присоединить ЛФ.
В результате этого образуется пентамер следующего состава: ЛФ-ЦП-МПО-ЦП-ЛФ.
3.2. Идентификация белков лейкоцитов, взаимодействующих с церулоплазмином
Состояние проблемы на момент исследования. До начала наших исследований
вопрос о партнерах ЦП среди белков лейкоцитов практически не был разрешен. Нами
были впервые предприняты попытки идентификации белков экстракта лейкоцитов,
взаимодействующих с иммобилизованным ЦП. Были определены уже известные
партнеры ЛФ и МПО, идентифицированы новые партнеры: серпроцидины (эластаза,
катепсин G, протеиназа 3 и азуроцидин), а также основной белок эозинофилов [Соколов и
соавт., 2007]. Из плазмы крови больных воспалительными заболеваниями нами был
впервые выделен и идентифицирован с помощью масс-спектрометрии комплекс ЦПМПО [Соколов и соавт., 2007]. Более детальное исследование смеси белков лейкоцитов,
сорбирующихся при аффинной хроматографии на ЦП-Сефарозе, а также идентификация
комплексов, выделяемых совместно с ЦП при очистке его препаратов, позволили
идентифицировать еще несколько партнеров ЦП.
96
3.2.1. Анализ белков экстракта лейкоцитов, сорбирующихся на иммобилизованном
церулоплазмине
При анализе белков лейкоцитов, элюированных с ЦП-Сефарозы 1 M NaCl (см. раздел
2.3.3.1), Вестерн-блоттинг с антителами против 5-липоксигеназы (5-LO) выявил зону с M
~ 78 кДа (рис. 3.2).
Рис. 3.2. Анализ белков элюата 1 М NaCl (по 20 мкг белка на пробу) с ЦП-Сефарозы при
аффинной хроматографии экстракта лейкоцитов после SDS ЭФ в ПААГ (а – 10%
акриламид; б, в – 6 % акриламид, без восстановления 2-меркаптоэтанолом). а) Вестернблоттинг с антителами против 5-LO (1:1000), разведение вторичных антител, меченых
пероксидазой хрена, 1:10000 (окраска 4-хлор-1-нафтолом и H2O2); б) Вестерн-блоттинг с
антителами кролика против МПО человека (1:1000); в) выявление пероксидазной
активности in situ при окраске 4-хлор-1-нафтолом и H2O2. Стрелками указаны значения
M, кДа.
Именно такая молекулярная масса была определена при изучении 5-LO [Segal, 2005].
Поскольку ранее в этой же зоне нами был идентифицирован ЛФ с такой же молекулярной
массой [Соколов и соавт., 2007], были поставлены контрольные опыты, показавшие, что
ЛФ грудного молока при Вестерн-блоттинге не реагирует с антителами против 5-LO
(данные не приводятся). Масс-спектрометрия фрагментов трипсинолиза 78 кДа-зоны
также выявила пептиды, соответствующие 5-LO (таблица 3.4). В той же белковой зоне с
M ~ 78 кДа нами была идентифицирована активность пероксидазы эозинофилов (ЭПО)
при окраске геля на пероксидазную активность после SDS-ПААГ-электрофореза без
кипячения проб и восстановления дисульфидных связей (рис. 3.2, в). МПО в этом случае
была выявлена в зоне с M ~ 150 кДа по данным Вестерн-блоттинга (рис. 3.2, б).
97
Таким образом, среди лейкоцитарных белков нами было идентифицировано еще два
партнера ЦП – 5-липоксигеназа и ЭПО.
Таблица 3.4
Пептидный фингерпринт 78-кДа зоны
Начало
-конец
цепи
Mожид,
Mвычисл,
Да
Да
Δ, Да
Пептид
5-липоксигеназа (78 кДа, найдено 9 % последовательности)
145–162
2175,02
2175,03
-0,01
R.WMEWNPGFPLSIDAKCHK.D пропионамид (C)
256–269
1677,82
1677,81
0,01
K.LPVTTEMVECSLER.Q пропионамид (C)
298–320
2692,42
2692,33
0,09
K.TDPCTLQFLAAPICLLYKNLANK.I
473–483
1286,67
1286,70
-0,03
R.DDGLLVWEAIR.T
3.2.2. Анализ комплексов церулоплазмина, выделяемых при очистке его препаратов
При выделении ЦП на ПР-Сефарозе (см. раздел 2.7.1) нами были предприняты
попытки идентифицировать комплексы, выделявшиеся совместно с ЦП. Для этого в
качестве стартового материала использовали 1000 мл плазмы, исключили из схемы
хроматографию на QAE-Сефадексе и на стадии элюции с ПР-Сефарозы ЦП элюировали 1
M NaCl, рН 7,4. Выделенный практически чистый ЦП (А610/А280 = 0,050, чистота 99,7 %)
подвергали гель-фильтрации на колонке с Сефадексом G-200 Superfine (90×2,5 см),
уравновешенной PBS. Фракции (по 1 мл), соответствовавшие отдельным пикам,
объединяли и концентрировали центрифугированием при 2000 g (4 ºС) в ячейке Vivaspin
20 с фильтром, удерживающим белки с молекулярной массой выше 10 кДа. Таким
образом, при гель-фильтрации 300 мг практически чистого ЦП на колонке с Сефадексом
G-200 перед основным пиком ЦП (рис. 3.3, a; начало пика – с фракции 5) элюировался
пик (фракции 1–3), содержащий около 2 мг белка, т.е. менее 1 % от нанесенного
количества ЦП.
При ПААГ-электрофорезе в отсутствие SDS в опережающем пике были выявлены
зоны, которые окрашивались хромогенным субстратом ЦП – o-DA, однако отличались по
электрофоретической подвижности от основного пика ЦП (рис. 3.3, б). Ранее в
литературе были описаны так называемые димерные изоформы ЦП с молекулярной
массой ~ 200 кДа [Sato et al., 1990]. Если предположить, что в минорном пике содержатся
димеры ЦП, то их спектральные характеристики не должны значительно отличаться от
мономерного ЦП. Однако являющееся критерием чистоты ЦП соотношение поглощения
98
ионов меди I типа и остатков ароматических аминокислот (A610/A280) в данной ЦПсодержащей фракции оказалось равным 0,027 ± 0,001, что почти в два раза меньше, чем
соотношение, характерное для гомогенного ЦП в основном пике – 0,051 ± 0,001. Более
того,
димерное
строение
никак
не
объясняло
наличия
двух
близких
по
электрофоретической подвижности ЦП-содержащих зон (рис. 3.3, б*).
Рис. 3.3. а) Участок профиля элюции белков, полученный при гель-фильтрации препарата
ЦП на Сефадексе G-200. Фракция 5 – начало основного пика, содержащего 99,3 % белка,
нанесенного на колонку. Объем фракции – 1 мл. б, в) Электрофоретический анализ в
ПААГ фракций белков, полученных гель-фильтрацией препарата ЦП на Сефадексе G200; б) в отсутствие SDS (окрашивание o-DA), дорожки 1-7 – фракции 1-7 (20 мкл),
звездочкой отмечены зоны, подвергнутые масс-спектрометрическому анализу; в) анализ
желатиназной активности in situ фракции 2 (2 мкл) в присутствии SDS (окрашивание
Кумасси R-250).
Таким образом, мы предположили, что в данных фракциях содержатся два близких по
электрофоретической
спектрометрический
подвижности
анализ
белков
комплекса
в
ЦП.
ЦП-содержащих
Проведенный
зонах
с
масс-
уменьшенной
электрофоретической подвижностью (рис. 3.3, б*) показал, что в этих зонах, кроме
фрагментов трипсинолиза ЦП, содержатся фрагменты двух металлопротеиназ – ММП-2 и
ММП-12 (таблица 3.5).
99
Таблица 3.5
Пептидный фингерпринт компонентов комплексов ЦП
Начало-
Mожид,
Mвычисл,
конец цепи
Да
Да
Δ, Да
Пептид
Цепь А ММП-2 (желатиназа А, 71 кДа, найдено 19 % последовательности)
8–18
1173,57
1173,60
–0,03
K.FPGDVAPKTDK.E
16–33
2088,96
2089,02
–0,06
K.TDKELAVQYLNTFYGCPK.E
73–86
1612,78
1612,71
0,07
R.CGNPDVANYNFFPR.K
133–146
1586,75
1586,75
0
R.IHDGEADIMINFGR.W
242–263
2356,04
2356,01
0,03
K.YGFCPHEALFTMGGNAEGQPCK.F
300–330
3298,53
3298,48
0,05
K.YGFCPETAMSTVGGNSEGAPCVFPFTF
LGNK.Y пропионамид (C)
331–343
1430,66
1430,61
0,05
K.YESCTSAGRSDGK.M пропионамид (C)
Каталитический домен ММП-12 (22 кДа, найдено 23 % последовательности)
1–6
744,38
744,37
0,01
-.MGPVWR.K
7–13
979,51
979,52
–0,01
R.KHYITYR.I
8–13
851,41
851,43
–0,02
K.HYITYR.I
14–23
1252,53
1252,55
–0,02
R.INNYTPDMNR.E окисление (M)
48–61
1518,76
1518,82
–0,06
K.INTGMADILVVFAR.G
Выявление желатиназной активности in situ после электрофореза в SDS-ПААГ
подтвердило наличие ММП в выделенном препарате комплексов ЦП (рис. 3.3, в).
Оказалось, что зоны 72, 67 и 22 кДа проявляют желатиназную активность, что
выразилось в полном отсутствии окрашенного красителем желатина в указанных
участках геля. Согласно литературным данным, зоны 72 и 67 кДа соответствуют
проферменту и активной форме MMП-2, а зона 22 кДа соответствует активной форме
ММП-12 [Xie et al., 2005].
В
препаратах
выделенных
комплексов
ЦП
обнаруживалась
зона
19
кДа,
соответствующая первому фрагменту, образующемуся при спонтанном протеолизе ЦП
(фрагмент F5) [Kingston et al., 1979]. Соответствие этой зоны предполагаемому фрагменту
было доказано с помощью масс-спектрометрии фрагментов трипсинолиза (таблица 3.6).
Для двух обнаруженных пептидов c массами 1565,77 Да и 2668,23 Да были
проанализированы масс-спектры, подтвердившие их принадлежность к F5 фрагменту ЦП.
100
Однако следует отметить, что в препарате не выявлялись высокомолекулярные
фрагменты «спонтанного» протеолиза ЦП.
Таблица 3.6
Пептидный фингерпринт фрагмента ЦП с М 19 кДа
Началоконец
Mожид, Да
Mвычисл, Да
Δ, Да
Пептид
цепи
F5-фрагмент ЦП (19 кДа, найдено 27 % последовательности)
31–38
975,46
975,43
0,03
K.TYSDHPEK.V
39–51
1565,76
1565,72
0,04
K.VNKDDEEFIESNK.M
103–125
2668,23
2668,25
–0,02
R.GVYSSDVFDIFPGTYQTLEMFPR.T
103–125
2684,23
2684,25
–0,02
R.GVYSSDVFDIFPGTYQTLEMFPR.T
окисление (M)
3.2.3. Идентификация компонентов комплексов, обнаруживаемых у пациентов при
воспалительных процессах
Состояние проблемы на момент исследования. Ранее нами были обнаружены
комплексы ЦП с ЛФ и МПО в биологических жидкостях, полученных от больных с
различными воспалительными процессами. В частности, мы обнаружили комплексы в 9
пробах экссудатов, в 112 образцах сыворотки крови больных с гнойными поражениями
различной степени тяжести, в 2 образцах лаважа больных с абсцессом легкого, в 30 (из
40) образцах сыворотки крови больных атеросклерозом, в 65 пробах сыворотки крови и
плевральной жидкости больных плевритами различной этиологии, в 5 (из 5) образцах
сыворотки крови больных рассеянным склерозом, в 2-х (из 40) образцах вагинальных
секретов больных с микробными инфекциями. В 20 контрольных образцах сыворотки
крови здоровых доноров не было выявлено дополнительных оксидазо-положительных
зон, соответствующих комплексам ЦП с какими-либо белками [Соколов и соавт., 2007]. В
проведенных ранее исследованиях в нашем Отделе в образцах сыворотки крови 1330
здоровых доноров при электрофоретическом анализе также не было обнаружено
комплексов ЦП [Василец и соавт., 1974]. Однако при более детальном анализе оказалось,
что не во всех случаях добавление антител к ЛФ в пробу, содержащую комплекс ЦП-ЛФМПО (контроль на участие белка в комплексообразовании), вызывало разобщение
комплекса. Это указывало на то, что в комплексы, содержащие ЦП и МПО, включаются
101
дополнительные компоненты плазмы крови, уменьшающие электрофоретическую
подвижность таких комплексов.
3.2.3.1. Идентификация компонентов комплексов ЦП, содержащих МПО и апоВ-100содержащие липопротеины
При электрофорезе проб плазмы крови больных атеросклерозом в четырехслойном
ПААГ (см. раздел 2.6.7), позволяющем разделять основные классы липопротеинов,
которые задерживаются в процессе электрофореза на входе во второй (ЛОНП), третий
(ЛНП) и четвертый (ЛВП) слои ПААГ, нам удалось идентифицировать комплексы,
включающие апоВ-100-содержащие липопротеины (ЛНП и ЛОНП), МПО и ЦП (рис. 3.4).
Рис. 3.4. Идентификация комплексов ЛНП(ЛОНП)-МПО-ЦП после электрофореза
образцов плазмы крови (50 мкл) больных атеросклерозом в четырехслойном ПААГ. а)
окраска на активность МПО; б) окраска на активность ЦП; в) содержание МПО в
исследованных образцах в соответствии с обнаружением комплексов, содержащих ЛНП и
ЛОНП, только ЛНП либо отсутствием комплексов (н. о.).
Добавление к этим пробам моноклональных антител к апоВ-100 вызвало разобщение
комплексов с липопротеинами до комплекса ЦП-МПО. В итоге комплексы ЛНП-МПОЦП были выявлены нами в 44 из 100 проанализированных образцов плазмы крови, в 33 из
них были выявлены также комплексы ЛОНП-МПО-ЦП. Следует отметить, что в тех
образцах плазмы крови, где были выявлены комплексы, содержащие ЦП, МПО и
липопротеины, уровень МПО всегда превышал 800 нг/мл.
102
У здоровых доноров (65 человек) уровень МПО не превышал 200 нг/мл, и комплексов,
содержащих МПО, обнаружено не было. Эти результаты показали, что МПО может
взаимодействовать в кровотоке одновременно с ЦП и с апоВ-100-содержащими
липопротеинами.
Таким образом, нами были впервые идентифицированы новые партнеры ЦП: 5-LO,
ЭПО, ММП-2 и ММП-12, а также комплексы ЦП с МПО и апоВ-100-содержащими
липопротеинами, более подробные характеристики которых будут приведены в разделе
3.6.1.
3.3. Изучение взаимодействия церулоплазмина с серпроцидинами и пероксидазой
эозинофилов
Состояние проблемы на момент исследования. Ранее серпроцидины были
идентифицированы нами как белки, способные взаимодействовать с ЦП [Соколов и
соавт., 2007]. Гомология аминокислотных последовательностей МПО и ЭПО достигает
70% [Sakamaki et al., 1989], что объясняет сходство их функциональных и
ферментативных свойств [Furtmüller et al., 1998]. Вопрос о специфичности комплексов,
формируемых ЦП, ЭПО и серпроцидинами, оставался неразрешенным.
3.3.1. Изучение взаимодействия церулоплазмина с серпроцидинами
При
гель-фильтрации
на
колонке
с
Сефакрилом
S-200
HR
(1,5×150
см),
уравновешенной PBS, свободный ЦП элюировался с колонки раньше, чем его комплексы
с серпроцидинами. Это не позволило рассчитать напрямую молекулярную массу
образующихся комплексов по данным калибровки. Следует отметить, что на колонку
всегда наносили смесь 1 мг ЦП и 0,5 мг серпроцидина (что соответствует мольному
соотношению ЦП : серпроцидин = 1 : 2), а в ходе элюции всегда получали сначала
комплекс 1 : 1 (1 мг 132-кДа ЦП и 0,23 мг 30-кДа серпроцидина), а затем свободный
серпроцидин (0,27 мг). Это позволяет заключить, что в комплексах ЦП с серпроцидинами
соблюдается стехиометрия компонентов 1:1. Завышение объема элюции для комплексов
серпроцидинов с ЦП, по всей видимости, вызвано взаимодействием катионных
серпроцидинов с сорбентом. При проведении гель-фильтрации в присутствии 0,5 M NaCl
комплексы ЦП с катионными белками диссоциировали, и белки элюировались с колонки
по отдельности (рис. 3.5).
103
Рис. 3.5. Калибровочный график, построенный по результатам элюции белков с колонки
с Сефакрилом S-200 HR в 0,15 M NaCl (сплошная линия, кружки) и 0,5 M NaCl
(пунктирная линия, крестики) в 10 мМ Na-фосфатном буфере, рН 7,4: 1 – каталаза; 2 –
альдолаза; 3 – ЦП; 4 – трансферрин; 5 – альбумин; 6 – овальбумин; 7 – миоглобин; 8-11 –
комплексы ЦП с PR3, NE, CG и CAP37 соответственно; 12-15 – PR3, NE, CG и CAP37
соответственно.
Такое влияние ионной силы на взаимодействие ЦП с серпроцидинами согласуется с
данными об элюции серпроцидинов 0,5 M NaCl с ЦП-Сефарозы при аффинной
хроматографии [Соколов и соавт., 2007] и свидетельствует об электростатической
природе данных взаимодействий.
В контрольных опытах мы показали, что положительно заряженные серпроцидины без
ЦП не входят в ПААГ при диск-электрофорезе в щелочной системе, но при добавлении
NE, PR3, CG и CAP37 к ЦП его подвижность уменьшалась (рис. 3.6, а). Следует отметить,
что при смешивании ЦП с серпроцидинами в эквимолярном соотношении только с
CAP37 весь ЦП входил в комплекс. В случае добавления NE, PR3 и CG более половины
ЦП не вступало во взаимодействие. Предварительная инкубация серпроцидинов с
ингибитором PMSF не оказывала влияния на комплексообразование.
104
Рис. 3.6. Электрофоретический анализ взаимодействия ЦП с серпроцидинами. Окраска oDA. а) Взаимодействие ЦП (1 мкг) с серпроцидинами (0,25 мкг) в присутствии PMSF
(0,01 мкг): 1 – ЦП + NE + PMSF, 2 – ЦП + CG + PMSF, 3 – ЦП + PR3 + PMSF, 4 – ЦП, 5 –
ЦП + CAP37, 6 – ЦП + NE, 7 – ЦП + CG, 8 – ЦП + PR3. б) 1 – ЦП (1 мкг), 2 – ЦП (1 мкг) +
CAP37 (0,25 мкг) + RKARPRQFPRRR (0,1 мкг), 3 – ЦП (1 мкг) + CAP37 (0,25 мкг), 4 –
ЦП (1 мкг) + CAP37 (0,25 мкг) + гепарин (0,2 мкг), 5 – ЦП (1 мкг) + RKARPRQFPRRR
(0,1 мкг). в) Сыворотка крови: 1 – человека (2 мкл), 2 – мыши (10 мкл), 3 – дельфина (10
мкл), 4 – лошади (10 мкл), 5 – кролика (2 мкл), 6 – крысы (1 мкл), 7 – собаки (5 мкл). В
опытах 1'-7' добавлен CAP37 (0,1 мкг).
Синтетический пептид RKARPRQFPRRR (5–13, 61–63 CAP37), имитирующий
катионный мотив CAP37, необходимый для проявления антимикробных свойств CAP37 и
связывания с гепарином [McCabe et al., 2002], вытеснял CAP37 из комплекса с ЦП, а
добавление избытка гепарина вызывало диссоциацию комплекса ЦП–CAP37 с
образованием свободного ЦП (рис. 3.6, б). Добавление CAP37 к комплексу ЦП с ЛФ и
МПО либо к комплексу ЦП с МПО приводило к вытеснению из этих комплексов МПО с
образованием комплексов, включающих в себя соответственно ЦП, ЛФ и CAP37 либо ЦП
и CAP37 (данные не приводятся). Таким образом, CAP37 эффективно конкурирует с
МПО за общий сайт взаимодействия с ЦП. Добавление каждого из изучаемых
серпроцидинов к плазме крови человека, крысы, мыши, кролика, дельфина, собаки и
лошади
приводило
к
изменению
электрофоретической
подвижности
105
оксидазоположительных зон ЦП только в случае с CAP37 (рис. 3.6, в; приведены данные
только для CAP37). Вероятно, предпочтительными партнерами для серпроцидинов с
протеиназной активностью (NE, CG и PR3) в плазме являются серпины, концентрация
которых и сродство к протеиназам превышают таковые для ЦП. Образование
гетерологичных комплексов между САР37 и ЦП различных млекопитающих позволяет
предположить
эволюционную
консервативность
структурных
мотивов
в
ЦП,
взаимодействующих с САР37.
Для оценки сродства CAP37 к ЦП нами была предпринята попытка определить Kd
комплекса, формируемого CAP37 с иммобилизованным ЦП. Измерение концентрации
свободного CAP37 после инкубации с ЦП-Сефарозой и контрольной Сефарозой
позволило оценить специфическое связывание CAP37 с иммобилизованным ЦП. С
помощью графиков в координатах Скэтчарда по результатам добавления CAP37 к
аликвотам ЦП-Сефарозы 0,5 и 1 мкМ получены одинаковые значения Kd (рис. 3.7).
Участки аппроксимирующих прямых пересекли ось абсцисс в точках 53 и 111 нМ. Таким
образом, отношение концентраций центров связывания весьма близко к отношению
аликвот ЦП-Сефарозы (0,5/1 ~ 53/111), использованных в опытах.
Рис. 3.7. Графики в координатах Скэтчарда, отражающие связывание CAP37 c ЦПСефарозой (0,5 и 1 мкМ ЦП). 1 и 2 – Kd = 13,7 ± 0,4 и 12,8 ± 0,4 нМ соответственно.
3.3.2. Изучение взаимодействия церулоплазмина и пероксидазы эозинофилов
При аффинной хроматографии ЭПО сорбировалась на колонке с ЦП-Сефарозой при
использовании PBS в качестве элюента. Последующая элюция ступенчатым градиентом
NaCl либо буферными растворами с последовательным понижением pH приводила к
106
полной элюции ЭПО при ионной силе 450 мМ NaCl и выше, а также при рН 3,5 и ниже
(рис. 3.8, а, б).
Рис. 3.8. а) Профиль элюции ЭПО (1 мг) ступенчатым градиентом 150-600 мМ NaCl с
колонки c ЦП-Сефарозой; б) профиль элюции ЭПО (1 мг) ступенчатым градиентом pH
7,0–2,5 с колонки c ЦП-Сефарозой.
Это говорит об электростатической природе взаимодействия, учитывая, что ЦП
является кислым белком (pI 4,7), а ЭПО – катионным (pI 10,8) [Weiler et al., 1992]. Для
катионной МПО нами ранее наблюдалась элюция с ЦП-Сефарозы при ионной силе выше
300 мМ NaCl либо при pH ниже 3,9 [Соколов и соавт., 2007]. При гель-фильтрации смеси
ЦП и ЭПО (1:1, моль/моль) они элюировались совместно в виде единичного пика, в
котором соотношение A610/A280 и A413/A280 составило 0,032 и 0,30 соответственно, тогда
как для чистого ЦП соотношение A610/A280 составило 0,050, а для ЭПО соотношение
A413/A280 составило 1,09. Объем элюции (Ve) комплекса ЦП-ЭПО был больше, чем
свободный объем колонки, хотя расчетная молекулярная масса такого комплекса 210 кДа
предполагала его элюцию в свободном объеме при использовании колонки с Сефакрилом
S-200 HR в качестве сорбента.
Завышение Ve было характерно и при гель-фильтрации образца ЭПО. Завышение Ve
для ЭПО и ее комплекса с ЦП, по всей видимости, связано с взаимодействием катионной
ЭПО с сорбентом, поскольку этого эффекта удавалось избежать при проведении гельфильтрации с 0,5 M NaCl в качестве элюента (рис. 3.9). Однако в таких условиях
комплекс ЦП с ЭПО диссоциировал и белки элюировались с колонки по отдельности.
Такое влияние ионной силы на взаимодействие ЦП с ЭПО согласуется с данными об
элюции ЭПО 0,45 M NaCl с ЦП-Сефарозы при аффинной хроматографии и
свидетельствует
Взаимодействие
об
электростатической
катионных
белков
НФ,
природе
данного
МПО
представителей
и
взаимодействия.
семейства
107
серпроцидинов, с сорбентами, применяемыми для гель-фильтрации, мы наблюдали при
исследовании их комплексов с ЦП с помощью этого метода.
Рис. 3.9. Калибровочный график, построенный по результатам элюции белков на колонке
с Сефакрил S-200 HR в 0,15 M NaCl (пунктирная линия, кружки) и 0,5 M NaCl (сплошная
линия, крестики) в 10 мМ Na-фосфатном буфере, рН 7,4: 1 – каталаза; 2 – альдолаза; 3 –
ЦП; 4 – трансферрин; 5 – альбумин; 6 – овальбумин; 7 – миоглобин; 8 – комплекс ЦП с
ЭПО, 9 – ЭПО.
Взаимодействие ЦП и ЭПО также подтверждалось данными диск-электрофореза в
ПААГ без SDS (рис. 3.10). Электрофоретическая зона ЦП, окрашиваемая хромогенным
субстратом o-DA, смещалась при добавлении ЭПО и окрашивалась на пероксидазную
активность, в отличие от контрольного ЦП. Контрольная ЭПО в условиях дискэлектрофореза
практически
не
мигрировала
в
ПААГ.
Таким
образом,
комплексообразование между ЦП и ЭПО было подтверждено с помощью трех
независимых методов.
108
Рис. 3.10. Электрофореграмма после диск-электрофореза в ПААГ без SDS; а) окраска oDA, б) окраска 4-хлор-1-нафтолом: 1 – ЦП (0,5 мкг), 2 – ЦП+ЭПО (0,5 мкг + 0,15 мкг), 3 –
ЦП+ЭПО (0,5 мкг + 0,3 мкг), 4 – ЭПО (0,3 мкг).
Полученные результаты свидетельствуют в пользу образования специфических
комплексов
ЦП
с
серпроцидинами
и
ЭПО,
в
основе
взаимодействия
лежат
электостатические взаимодействия анионного ЦП с катионными белками лейкоцитов.
3.4. Изучение взаимного влияния церулоплазмина и белков лейкоцитов на их
ферментативные свойства
Состояние проблемы на момент исследования. Ранее нами было подробно изучено
влияние ЛФ на активность ЦП [Соколов, 2007]. В частности, было показано наличие двух
различных
сайтов
для
ЛФ
на
молекуле
ЦП:
высокоаффинного
(активация
ферроксидазной активности ЦП за счет увеличения сродства к субстрату и скорости его
окисления) и низкоаффинного (ингибирование окисления p-PD за счет конкуренции ЛФ с
субстратом за связывание с ЦП). В случае связывания ЦП с МПО мы выявили
исключительно активацию p-PD-оксидазной активности ЦП, связанную с увеличением
аффинности ЦП к субстрату в присутствии МПО [Соколов, 2007]. Следует также
отметить, что при исследовании кинетики ингибирования пероксидазной активности
МПО в присутствии ЦП мы, во-первых, показали конкуренцию ЦП с субстратами
пероксидазного цикла МПО – в частности, с увеличением размера субстрата
эффективность ЦП как ингибитора возрастала. Во-вторых, мы показали, что эффект ЦП
109
как ингибитора строго регулируется его протеолитической деградацией. В частности,
белок, протеолизованный по связи, соединяющей 5-й и 6-й домены, практически не
ингибировал ни пероксидазную, ни хлорирующую активность МПО [Соколов, 2007].
Следует отметить, что при комплексообразовании ЦП с МПО происходило изменение
положения полосы Соре (максимум спектра пероксидаз в области 400–500 нм),
отражающей конформационное состояние связанного с пероксидазой гема. Этот факт
нашел подтверждение при исследовании структуры комплекса ЦП-МПО, в котором вход
в гемовый карман МПО контактирует с петлей ЦП, соединяющей 5-й и 6-й домены белка.
3.4.1. Влияние серпроцидинов и пероксидазы эозинофилов на ферментативные
свойства церулоплазмина
Предварительные опыты по исследованию влияния серпроцидинов и ЭПО на
активность ЦП в отношении различных субстратов (Fe2+, синтетические и биогенные
амины) показали, что они оказывают влияние только на окисление p-PD. При этом
серпроцидины ингибировали окисление p-PD как обратимые конкурентные ингибиторы,
увеличивая KM и не изменяя Vmax (рис. 3.11). В присутствии ЭПО (1:1, моль/моль) p-PDактивность ЦП возрастала, при этом увеличивалось сродство к субстрату, что было видно
по уменьшению KM c 0,53 до 0,15 мМ, но практически не изменялась Vmax. Расчет
константы активации по формуле K a
[ЭПО ]
привел к значению 41 нМ.
KM
1
KM `
Наибольший эффект среди серпроцидинов проявлял CAP37, значение Ki составило 20
нМ (таблица 3.7).
Таблица 3.7
Влияние серпроцидинов на кинетические свойства ЦП
KМ, мМ
Vmax, A530/мин
Ki, нМ
ЦП
0,53 ± 0,01
0,33 ± 0,01
-
ЦП + NE
0,94 ± 0,02
0,33 ± 0,01
131 ± 8
ЦП + PR3
0,83 ± 0,01
0,34 ± 0,01
182 ± 9
ЦП + CG
1,34 ± 0,02
0,32 ± 0,01
67 ± 5
ЦП + CAP37
3,27 ± 0,02
0,34 ± 0,01
20 ± 3
110
Рис. 3.11. График в координатах Хейнса–Вольфа, иллюстрирующий ингибирование
серпроцидинами (100 нМ) активности 50 нМ ЦП в отношении p-PD (0,25–1,25 мМ) в 0,1
M Na-ацетатном буфере, рН 5,0.
Учитывая, что катализируемая ЦП реакция окисления p-PD происходит при pH 5,0,
ингибирующий эффект серпроцидинов на активность ЦП нельзя было объяснить его
протеолитической деградацией. Во-первых, CAP37, оказавший наибольшее влияние на
активность ЦП, в принципе не обладает протеолитической активностью. Во-вторых, то,
что серпроцидины не активны при таком значении pH, подтвердили контрольные опыты,
не выявившие протеолитической деградации ЦП за время инкубации с серпроцидинами
во время измерения скорости оксидазной реакции.
3.4.2. Изучение механизма ингибирования церулоплазмином миелопероксидазы,
пероксидазы эозинофилов и 5-липоксигеназы
Изучение механизма ингибирования ЦП активности МПО ранее ограничилось
измерением кинетики пероксидазной активности МПО в присутствии ЦП и изучением
влияния протеолитической деградации ЦП на его свойства как ингибитора [Соколов,
2007].
В присутствии ЭПО не происходило расщепления связи между 5-м и 6-м доменами ЦП
плазмином (рис. 3.12, а), тогда как в ее отсутствие ЦП в течение 1 часа практически
полностью расщеплялся на фрагменты с M 116 и 19 кДа. Защитный эффект от
ограниченного протеолиза ЦП сериновыми протеиназами в присутствии МПО ранее
111
наблюдался при исследовании взаимодействия ЦП и МПО [Соколов, 2007]. В спектре
поглощения смеси интактного ЦП и ЭПО максимум поглощения гема смещался с 413 до
408 нм и отличался от суммы спектров отдельных белков (рис. 3.12, б), в то же время
ЦПпр не вызывал смещения полосы Cope (рис. 3.12, в).
Рис. 3.12. а) Электрофореграмма после электрофореза в SDS-ПААГ. 1 – ЭПО (11 мкг), 2 –
ЦП (10 мкг), 3 – ЦП+ЭПО+плазмин (10 мкг + 11 мкг + 0,02 мкг, после 1 часа инкубации),
4 – ЦП+плазмин (10 мкг + 0,02 мкг, после 1 часа инкубации), стрелками указаны
положения маркеров молекулярной массы, кДа. б) Спектры поглощения ЦП (1 мкМ),
ЭПО (1 мкМ), смеси ЦП и ЭПО (1 мкМ+1 мкМ), арифметическая сумма спектров ЦП и
ЭПО. в) Спектры поглощения ЦПпр (1 мкМ), ЭПО (1 мкМ), смеси ЦПпр и ЭПО (1
мкМ+1 мкМ), арифметическая сумма спектров ЦПпр и ЭПО.
Для гем-содержащих пероксидаз – пероксидазы из корней хрена, лактопероксидазы и
МПО – полоса Соре регистрируется при 403, 413 и 430 нм соответственно. Эти различия
максимума поглощения обусловлены особенностями конформации гема в структуре
пероксидаз. Так, гем имеет плоскую конформацию в пероксидазе из корней хрена, слегка
выгнутую в лактопероксидазе, и наиболее выгнут в МПО [Furtmüller et al., 2006]. Ранее
мы показали, что ЦП не влияет на положение полосы Соре и на активность
лактопероксидазы и пероксидазы из корней хрена [Соколов, 2007]. В то же время
смещение полосы Соре МПО при взаимодействии c ЦП согласуется с ингибированием
активности МПО в присутствии ЦП и с данными рентгеноструктурного анализа о
взаимодействии уязвимой к протеолизу петли ЦП, соединяющей его 5-й и 6-й домены, с
входом в гемовый карман МПО. Обнаруженные изменения спектра ЭПО в присутствии
интактного ЦП были предпосылкой для исследования влияния ЦП на пероксидазную и
(псевдо)галогенирующую активность ЭПО.
При исследовании влияния ЦП и ЦПпр на сродство ЭПО к субстратам пероксидазного
цикла ABTS и H2O2 было показано, что только интактный ЦП снижает сродство ЭПО к
ABTS, увеличивая KМ и не изменяя Vmax (рис. 3.13, a, таблица 3.8). Напротив, ЦП не
112
влияет на сродство ЭПО к пероксиду водорода, поскольку в его присутствии снижается
Vmax, но не изменяется KМ (рис. 3.13, б, таблица 3.8).
Рис. 3.13. а) График в координатах Хейнса–Вольфа для ABTS (50–400 мкМ) в системах,
содержащих 10 нМ ЭПО, 80 мкМ H2O2 и 0, 10 и 20 нМ ЦП либо ЦПпр в 100 мМ Naацетатном буфере, pH 6,0. б) График в координатах Хейнса–Вольфа для H2O2 (25–100
мкМ) в системах, содержащих 10 нМ ЭПО, 1 мМ ABTS и 0, 10 и 20 нМ ЦП либо ЦПпр в
100 мМ Na-ацетатном буфере, pH 6,0.
113
Таблица 3.8
Влияние ЦП и ЦПпр на пероксидазную активность ЭПО
Субстрат/Ингибитор
KМ, мкМ
Vmax, 1/с
I, нМ
Ki, нМ
ABTS
281 ± 2
3,32 ± 0,02
0
–
ABTS/ЦП
359 ± 3
3,32 ± 0,01
10
35,9 ± 1,2
ABTS/ЦП
428 ± 2
3,31 ± 0,01
20
38,1 ± 1,1
ABTS/ЦПпр
281 ± 2
3,32 ± 0,01
10
–
ABTS/ЦПпр
284 ± 2
3,32 ± 0,02
20
–
H2O2
30,5 ± 0,4
5,34 ± 0,01
0
–
H2O2/ЦП
30,8 ± 0,3
4,26 ± 0,03
10
39,2 ± 1,6
H2O2/ЦП
30,6 ± 0,3
3,36 ± 0,01
20
33,8 ± 1,8
H2O2/ЦПпр
30,5 ± 0,4
5,33 ± 0,01
10
–
H2O2/ЦПпр
30,3 ± 0,2
5,32 ± 0,02
20
–
Таким образом, интактный ЦП является неконкурентным ингибитором в отношении
пероксида водорода, но конкурирует с донором электронов (ABTS). Расчет Ki,
отражающих сродство ингибитора и фермента (ЦП и ЭПО), по формулам: K i
Ki
[ ЦП ]
и
Vmax
1
Vmax `
[ ЦП ]
показал для двух использованных систем весьма близкие результаты: 34–39
KМ `
1
Kм
нМ (таблица 3.8).
В отличие от интактного ЦП, ЦПпр не ингибировал пероксидазную активность ЭПО.
Неэффективность ЦПпр как ингибитора активности МПО была показана нами ранее
[Соколов, 2007]. Исследование конкуренции ЦП с субстратами ЭПО, различающимися
по размеру, показало, что он наименее эффективен как ингибитор окисления малых
субстратов
(гваякола
и
орцинола),
однако
с
увеличением
размера
субстрата
эффективность конкуренции ЦП за активный центр ЭПО возрастает (рис. 3.14, а, б).
Зависимость эффективности ЦП как ингибитора пероксидазной активности от размера
пероксидазного субстрата была показана нами ранее для МПО [Соколов, 2007]. Это
наблюдение согласуется со стерическим барьером, создаваемым ЦП у входа в гемовый
карман МПО. Вероятно, таким же образом ЦП препятствует контакту больших
субстратов с гемовым карманом ЭПО.
114
Рис. 3.14. а) Относительная скорость окисления гваякола, орцинола, o-DA, 4-хлор-1нафтола, TMB и ABTS в зависимости от концентрации ЦП (логарифмическая шкала).
Реакционная смесь содержала 50 мкМ H2O2, 10 нМ ЭПО, 0–1 мкМ ЦП и 0,5 мМ субстрата
в 50 мМ Na-фосфатном буфере, pH 6,0. б) Зависимость IC50 (ЦП, нМ) от M (Да)
пероксидазного субстрата ЭПО (логарифмические шкалы, по данным графика а).
Значения IC50 (нМ) и структурные формулы субстратов указаны рядом с точками (R2 =
0,92).
Тем не менее, физиологическими субстратами МПО и ЭПО являются галогенид (Cl–,
Br–) и псевдогалогенид (SCN–) ионы, поскольку значения KM МПО и ЭПО для них
наиболее близки к их физиологическим концентрациям.
Исследование влияния ЦП на (псевдо)галогенирующую активность ЭПО и МПО
показало, что ЦП эффективно ингибирует хлорирующую активность ЭПО и МПО (рис.
3.15, а, б, таблица 3.9). Значительно хуже ЦП подавляет бромирующую активность МПО
и практически не влияет на таковую у ЭПО (рис. 3.15, в, таблица 3.9). Наконец, ЦП не
влияет на активность ЭПО и МПО в отношении тиоцианата (рис. 3.15, г, таблица 3.9).
Таким образом, несмотря на образование специфического комплекса с ЭПО и
ингибирование
ее
пероксидазной
активности
непротеолизованным
ЦП,
его
эффективность как ингибитора в отношении субстратов галогенирующего цикла МПО и
ЭПО драматически снижается по мере увеличения сродства пероксидаз к данным
субстратам. Из таблицы 3.9 видно, что ЦП не влияет на аффинность ЭПО и МПО к
субстратам галогенирующего цикла, и если он проявляет ингибирующий эффект, то
только за счет уменьшения Vmax.
Таблица 3.9
115
Влияние ЦП на (псевдо)галогенирующую активность МПО и ЭПО
Фермент/Субстрат/Ингибитор
KМ, мМ
Vmax, 1/с
I, мкМ
Ki, мкМ
ЭПО/NaCl
127 ± 3
5,1 ± 0,2
0
–
ЭПО/NaCl/ЦП
125 ± 3
1,4 ± 0,2
1
0,39 ± 0,02
ЭПО/NaCl/ЦП
124 ± 3
0,5 ± 0,1
3
0,34 ± 0,02
МПО/NaCl
51 ± 2
117 ± 1
0
–
МПО/NaCl/ЦП
49 ± 2
38 ± 1
1
0,49 ± 0,02
МПО/NaCl/ЦП
50 ± 2
16 ± 1
3
0,46 ± 0,02
ЭПО/NaBr
1,4 ± 0,1
4,5 ± 0,1
0
–
ЭПО/NaBr/ЦП
1,5 ± 0,1
4,4 ± 0,1
1
–
ЭПО/NaBr/ЦП
1,5± 0,1
4,5 ± 0,1
3
–
МПО/NaBr
2,1± 0,1
19,8 ± 0,2
0
–
МПО/NaBr/ЦП
2,0± 0,1
16,0 ± 0,2
1
4,1 ± 0,05
МПО/NaBr/ЦП
2,0± 0,1
11,4 ± 0,2
3
4,0 ± 0,05
ЭПО/NaSCN
0,094 ± 0,002
16,6 ± 0,5
0
–
ЭПО/NaSCN/ЦП
0,093 ± 0,002
16,5 ± 0,5
1
–
ЭПО/NaSCN/ЦП
0,094 ± 0,002
16,6 ± 0,5
3
–
МПО/NaSCN
0,072 ± 0,002
158 ± 4
0
–
МПО/NaSCN/ЦП
0,076 ± 0,002
162 ± 4
1
–
МПО/NaSCN/ЦП
0,072 ± 0,002
167 ± 4
3
–
Учитывая высокое сродство ЭПО и МПО к бромиду и тиоцианату, логично, что
неконкурентный ингибитор ЦП практически не влияет на их окисление. Низкая
эффективность ЦП как ингибитора бромирующей активности МПО и особенно ЭПО
согласуется с тем, что ЦП практически не препятствует проатерогенной модификации
ЛНП бромирующей МПО (см. раздел 3.6.2.2), а также объясняет удобство использования
бромированных производных тирозина в качестве биомаркеров галогенирующего стресса
[Hawkins and Davies, 2005]. С другой стороны, тот факт, что ЦП не подавлял активность
пероксидаз в отношении тиоцианата, окисление которого приводит к образованию
эффективного антимикробного агента, HOSCN, относительно безопасного для организма
человека, позволяет предположить, что ЦП не мешает проявлению антимикробной
активности ЭПО.
116
Рис. 3.15. Влияние ЦП на (псевдо)галогенирующую активность ЭПО и МПО. Графики в
координатах Хейнса–Вольфа для (псевдо)галогенирующей активности ЭПО (10 нМ) и
МПО (5 нМ) в системах, содержавших 50–250 мМ NaCl (а, б), 1–10 мМ NaBr (в), 0,05–
0,25 мкМ NaSCN (г), 50 мкМ H2O2, 10 мМ таурина, 0–3 мкМ ЦП в 10 мМ Na-фосфатном
буфере, pH 5,6 (а, б), pH 7,4 (в, г).
Для изучения влияния ЦП и ЛФ на хлорирующую активность МПО был применен
метод
хемилюминесценции
люминола.
Типичная
кинетическая
кривая
хемилюминесценции после введения Н2О2 в систему «МПО + Cl– + люминол» приведена
на рис. 3.16, а. Вспышка является интенсивной и быстрой. Основное свечение
происходило за первые 2–3 с, а через 10 секунд вспышка полностью гасла. Поскольку вид
кинетической кривой хемилюминесценции в наших экспериментах не изменялся (рис.
3.25), то в дальнейшем все результаты анализа хемилюминесценции были выражены в
виде светосуммы за первые 10 с от момента добавления H2O2.
С целью выяснения, чем именно обусловлено регистрируемое нами свечение, в
реакционную смесь добавляли ингибитор МПО – NaN3, перехватчики HOCl – метионин
или таурин, часть экспериментов проводили в отсутствие МПО или Cl‾ – субстрата цикла
галогенирования МПО. Результаты экспериментов приведены в таблице 3.10. Видно, что
отсутствие МПО или добавление ее ингибитора (NaN3) снижало свечение на 91–93 %.
117
Примерно такой же эффект наблюдался при введении в реакционную смесь
перехватчиков HOCl – метионина или таурина (см. также рис. 3.16, в).
Рис. 3.16. Типичные кинетические кривые хемилюминесценции, зарегистрированные в
системах: а – МПО + Cl‾ + люминол + Н2О2; б – МПО + Cl‾ + люминол + церулоплазмин
(0,1 нМ) + Н2О2; в – МПО + Cl‾ + люминол + таурин (1 мМ) + Н2О2. Измерения
проводились при комнатной температуре. Среда измерения: 10 мМ Na-фосфатный буфер,
рН 7,4, 150 мМ NaCl, 0,2 нМ МПО, 10 мкМ люминол. Стрелкой указан момент введения
5 мкМ Н2О2.
В значительной степени (на 75 %) снижено свечение и в том случае, если в
реакционной смеси отсутствовал субстрат цикла галогенирования – хлорид. Полученные
результаты убедительно свидетельствуют о том, что обнаруживаемое свечение связано с
функционированием галогенирующего цикла МПО, а именно с продукцией HOCl,
окисление люминола которым и сопровождается кратковременной интенсивной
вспышкой хемилюминесценции. Для подтверждения данного вывода в реакционную
смесь добавляли небольшие количества гваякола – субстрата пероксидазного цикла.
Ранее было установлено, что добавление гваякола к МПО при рН 7,4 даже в присутствии
физиологических
концентраций
хлорида (100–140
мМ)
практически
полностью
«переключает» фермент с галогенирующего на пероксидазный цикл [Власова и соавт.,
2006]. Из таблицы 3.10 видно, что добавление уже 2 мкМ гваякола предотвращало
хемилюминесценцию на 98 %, причем этот эффект не зависел от того, присутствовал в
реакционной смеси хлорид или нет. Увеличение концентрации гваякола до 50 мкМ не
приводило к заметному приросту свечения, свидетельствуя о том, что функционирование
118
пероксидазного цикла в нашем эксперименте не сопровождалось хемилюминесценцией
(см. таблицу 3.10).
Таблица 3.10
Влияние различных добавок на светосумму хемилюминесценции при введении
Н2О2 в систему «МПО + Cl‾ + люминол»
Состав смеси
Светосумма хемилюминесценции, % от контроля
МПО+Cl–+люминол (контроль)
100 ± 18
МПО + люминол
24,7 ± 5,3
Cl– + люминол
8,6 ± 0,9
Добавки к контролю:
Таурин (1 мМ)
8,0 ± 0,5
Метионин (1 мМ)
4,5 ± 0,4
NaN3 (1 мМ)
6,8 ± 0,2
Гваякол (2 мкМ)
2,4 ± 0,1
Гваякол (2 мкМ), без хлорида
2,6 ± 0,4
Гваякол (50 мкМ)
7,2 ± 0,6
Примечание. Хемилюминесценцию регистрировали при комнатной температуре в 10
мМ Na-фосфатном буфере (рН 7,4). Концентрации (мМ): МПО – 2×10–7, люминол –
0,01, NaCl – 150. Реакцию инициировали добавлением через диспенсер 5 мкМ H2O2.
Результат представляли в виде светосуммы (в % к контролю) за первые 10 секунд от
момента добавления H2O2. Во всех случаях разница с контролем статистически
значима (
0,05).
На рис. 3.17 приведена зависимость интеграла хемилюминесценции от концентрации
HOCl при добавлении последней к раствору люминола. Видно, что рост концентрации
HOCl сопровождался увеличением светосуммы с выходом на плато при концентрациях
HOCl, превышающих концентрацию люминола. Как видно из вставки на рис. 3.17, при
малых концентрациях HOCl зависимость носит линейный характер. Таким образом,
полученные результаты позволяют заключить, что хемилюминесценция, наблюдаемая
при
добавлении
Н2О2
в
систему
«МПО
+
Cl–
+люминол»,
обусловлена
функционированием цикла галогенирования МПО, а регистрируемая светосумма
является мерой хлорирующей активности фермента.
119
Рис. 3.17. Зависимость светосуммы хемилюминесценции после добавления HOCl к
люминолу от концентрации HOCl. На вставке приведен начальный участок зависимости
при малых концентрациях HOCl. Измерения проводились при комнатной температуре.
Среда измерения: 10 мМ Na-фосфатный буфер, рН 7,4, концентрация люминола – 10
мкМ. Данные представлены как среднее и доверительный интервал (
0,05).
Хлорирующую активность МПО оценивали методом хемилюминесценции после
введения Н2О2 в среду инкубации комплексов ЦП-МПО, содержащую хлорид и люминол.
Уже при мольном соотношении ЦП:МПО = 1:2 светосумма хемилюминесценции
уменьшалась на 25–30 % (рис. 3.18). Дальнейшее увеличение мольного соотношения
ЦП/МПО сопровождалось еще более значительным снижением хемилюминесценции,
свидетельствуя об угнетении хлорирующей активности МПО. Для сравнения на этом же
рисунке приведены результаты эксперимента, полученные с использованием ЦПпр (рис.
3.18, а, кривая 2): ЦПпр, не содержащий интактных молекул белка с M ~ 132 кДа, не
тушил вспышку хемилюминесценции в ответ на добавление Н2О2.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что ингибирующий эффект ЦП не
связан
с прямым перехватом
HOCl
(поскольку ЦПпр
не
менее эффективно
взаимодействует с HOCl), а обусловлен изменением конформации активного центра
МПО.
120
Рис. 3.18. а) Зависимость светосуммы хемилюминесценции, выраженной в % по
отношению к контролю, от мольного соотношения нативный ЦП/МПО (1) или
ЦПпр/МПО (2). Концентрация МПО 0,2 нМ. б) Зависимость светосуммы
хемилюминесценции, выраженной в % по отношению к контролю, от мольного
соотношения ЦП/МПО (1), ЛФ/МПО (2) или ЦП/МПО (3) в присутствии постоянной
концентрации ЛФ 0,34 нМ. Данные представлены как среднее и доверительный интервал
(
0,05).
Мы попытались выяснить, влияет ли на активность МПО свободный ЛФ в растворе, а
также вошедший в состав комплекса МПО-ЦП-ЛФ. Результаты экспериментов
приведены на рис. 3.18, б. ЛФ сам по себе не оказывал достоверного влияния на
активность МПО. Будучи встроенным в тройной комплекс МПО-ЦП-ЛФ, ЛФ не
препятствовал ингибирующему эффекту ЦП в отношении МПО (рис. 3.18, б). Используя
метод хемилюминесценции, нам удалось подтвердить тот факт, что ЦП, образуя
комплексы с МПО, ингибирует ее хлорирующую активность, а ЛФ не изменяет
активность МПО и не оказывает влияния на ингибирующий эффект ЦП в отношении
МПО в составе тройного комплекса МПО-ЦП-ЛФ.
Результаты определения антимикробной активности апо-ЛФ, систем «МПО-H2O2хлорид/тиоцианат», их совместного эффекта, а также влияния ЦП суммированы в
таблице 3.11. Видно, что в случае использования хлорида в качестве субстрата МПО, ЦП
препятствовал ее антимикробному эффекту, а также препятствовал синергизму такой
системы с апо-ЛФ. Эти результаты хорошо согласуются с данными об ингибировании
хлорирующей активности МПО при комплексообразовании белков по данным люминолзависимой хемилюминесценции. С другой стороны, ЦП не оказывал влияния на систему
«МПО-H2O2-тиоцианат» и не препятствовал синергизму МПО и апо-ЛФ в присутствии
тиоцианата в качестве субстрата (псевдо)галогенирующего цикла МПО. Этот результат
121
находится в полном соответствии с неспособностью ЦП ингибировать МПО-зависимую
продукцию гипотиоцианата. Таким образом, синергизм антимикробной системы
«лактоферрин-МПО-пероксид водорода-тиоцианат» не подавляется в присутствии ЦП
(таблица 3.11).
Таблица 3.11
Эффект ЦП на антимикробную активность ЛФ и системы «МПО-H2O2хлорид/тиоцианат» в отношении E. coli
Система
MIC50*, нМ
ЦП
–
Апо-ЛФ
980 ± 40
Апо-ЛФ:ЦП
990 ± 30
МПО(H2O2-NaCl)
45 ± 12
2ЦП:1МПО(H2O2-NaCl)
–
4±1
2апо-ЛФ:1МПО(H2O2-NaCl)
2ЦП:2апо-ЛФ:1МПО(H2O2-NaCl)
860 ± 30
МПО(H2O2-NaSCN)
38 ± 11
2ЦП:1МПО(H2O2-NaSCN)
42 ± 9
2апо-ЛФ:1МПО(H2O2-NaSCN)
7±2
2ЦП:2апо-ЛФ:1МПО(H2O2-NaSCN)
8±2
* – выражена как концентрация белка, находившегося в системе в меньшей концентрации
по сравнению с другими компонентами, приводившая к снижению показателя А530–А630 в
2 раза по сравнению с контролем. Данные представлены как среднее и доверительный
интервал (
0,05).
Учитывая,
что
гипотиоцианат
является
наименее
токсичным
из
продуктов,
образующихся в цикле галогенирования МПО, нами были проведены исследования по
защите ЦП от МПО-зависимой системы генерации HOCl и/или HOBr в присутствии SCN–
. Действительно, тиоцианат защищал ЦП от повреждения гипогалоидными кислотами
(HOCl и HOBr), образующимися при функционировании галогенирующего цикла МПО
(рис. 3.19).
122
Рис. 3.19. Защитный эффект тиоцианата при действии на ЦП системы МПО/H2O2/хлорид
и/или бромид. Реакционная смесь содержала 1 мкМ ЦП, 10 нМ глюкозоксидазы (ГО), 100
мкМ D-глюкозы (D-Glc) и различные комбинации 3 нМ МПО, 100 мМ NaCl, 1 мМ NaBr,
200 мкМ NaSCN в 0,1 М Na-цитрат-фосфатном буфере, рН 6,8. После инкубации в
течение 1 часа при 37 ºC в пробы добавляли 0,2 мМ таурина и 10 нМ каталазы. На
дорожку наносили по 20 мкл из пробы, подвергали диск-электрофорезу в ПААГ и
окрашивали o-DA.
С целью выяснения соотношения роли ЦП и тиоцианата как ингибиторов МПО в
плазме крови мы применили иммунопреципитацию ЦП из плазмы крови и наблюдали за
способностью такой плазмы ингибировать активности МПО. Мы исследовали влияние
иммунопреципитации ЦП из плазмы (с помощью добавления различных количеств
аффинных антител против ЦП) на ингибирование активности МПО такой плазмой. При
этом оказалось, что по мере преципитации ЦП происходила коиммунопреципитация ЛФ
(рис 3.20, а). С помощью такого подхода мы получили плазму с различным содержанием
ЦП. В каждом случае было определено разведение, которое соответствовало IC 50 для
пероксидазной активности МПО в отношении ABTS. Оказалось, что прямая,
аппроксимирующая
зависимость
разведения
плазмы
для
достижения
IC 50
от
концентрации ЦП, проходила через 0 (рис. 3.20, б), что свидетельствует в пользу того, что
ЦП является мажорным ингибитором пероксидазной активности МПО в плазме крови.
Однако изучение влияния добавления плазмы на скорость катализируемой МПО
утилизации пероксида водорода по данным электрохимического сенсора показало, что
скорость утилизации H2O2 не соответствовала ингибированию пероксидазной активности
МПО плазмой (рис. 3.21, а).
123
Рис. 3.20. а) Зависимость содержания ЛФ в плазме крови от степени
иммунопреципитации ЦП (R2 = 0,98). б) Зависимость кратности разведения плазмы
соответствующего IC50 пероксидазной активности МПО в отношении ABTS от
концентрации ЦП в образцах плазмы после различной степени иммунопреципитации ЦП
(R2 = 0,99).
124
Рис. 3.21. а) Зависимость скорости утилизации H2O2 от доли добавленной плазмы в
систему, содержащую 3 нМ МПО, 100 мМ KCl, 20 мМ K-фосфатного буфера, рН 7,4, 0,4
мМ таурина, 50 мкМ H2O2. Б) Влияние ЦП на обороты активного центра МПО при
окислении субстратов в системах, содержащих 100 мМ KCl (200 мкМ KSCN), 10 мМ Kфосфатный буфер, рН 6,2, 10 мМ таурина, 50 мкМ H2O2, 1–5 нМ МПО, 0–1,6 мкМ ЦП
(регистрация скорости реакции с помощью электрохимического сенсора на H2O2).
Данные представлены как среднее и доверительный интервал (
0,05).
125
Использование в этих же условиях плазмы с разной степенью иммунопреципитации
ЦП практически не повлияло на изменение скорости утилизации пероксида водорода
МПО (данные не приведены). Таким образом, добавка плазмы, ингибирующей
пероксидазную активность МПО (за счет взаимодействия с ЦП), не препятствовала в той
же степени утилизации пероксида водорода. Мы предположили, что ЦП не способен
препятствовать окислению одного из субстратов галогенирующего цикла МПО,
содержащихся в плазме, возможно, тиоцианата. Действительно, измерение утилизации
H2O2 хлорирующей МПО в присутствии ЦП и SCN– показало, что ЦП не препятствовал
утилизации пероксида водорода при катализируемом МПО окислении SCN– до HOSCN
(рис. 3.21, б).
Учитывая, что в основе ингибирования активности МПО лежит конкуренция петли ЦП
(883–892 а. о.) с субстратами за вход в активный центр МПО, можно предположить, что
SCN– специфичнее взаимодействует с активным центром МПО по сравнению с ЦП.
Рис. 3.22. Влияние ЦП на образование 5-липоксигеназных метаболитов в НФ человека.
НФ инкубировали 30 минут с различными концентрациями ЦП в безбелковой среде
(светлые столбики) или в среде с добавлением 0,3 мг/мл сывороточного альбумина
человека (ЧСА, серые и черные столбики), затем добавляли 2 мг/мл OZ на 20 минут.
Количество продуктов определяли методом обращенно-фазовой жидкостной
высокоэффективной хроматографии. Апо-ЦП – апо-форма ЦП, черные столбики –
протеолизованный ЦП (ЦПпр). Данные представлены как среднее и доверительный
интервал (
0,05).
126
Влияние ЦП на активность 5-липоксигеназы (5-LO) было изучено с помощью
количественного определения продуктов оксигенирования AA (см. раздел 2.5.6).
Действие ЦП на активность 5-LO с достоверностью проявляется после 30 минут
инкубации клеток с белком перед добавлением стимула – OZ. Влияние ЦП носит
дозозависимый характер (рис. 3.22) и, вероятно, связано не только с непосредственным
взаимодействием ЦП с 5-LO, но и с влиянием ЦП на эндогенные регуляторы активности
5-LO. Протеолизованный ЦП (p < 0,001) и его апо-форма (p < 0,001) не ингибировали
активность 5-LO. Известно, что LTB4 стимулирует фагоцитоз опсонизированных частиц
НФ [Mancuso et al., 2001], и двоякий эффект ЦП на продукцию лейкотриенов совпадал с
влиянием на фагоцитарный индекс (рис. 3.23). Так, ЦП в диапазоне концентраций 5-10
мкг/мл активировал синтез лейкотриенов (p < 0,001) и увеличивал индекс фагоцитоза (p <
0,002), а при концентрации выше 40 мкг/мл ингибировал активность 5-LO (p < 0,0002) и
фагоцитоз OZ нейтрофилами (p < 0,0002).
Рис. 3.23. Фагоцитоз OZ нейтрофилами, преинкубированными с различными
концентрациями ЦП. После 30 минут инкубации клеток в отсутствие или в присутствии
ЦП добавляли OZ (~ 12 частиц/клетку) на 3 минуты и определяли индекс фагоцитоза
методом фазово-контрастной микроскопии. Данные представлены как среднее и
доверительный интервал (
0,05).
127
В наших опытах продукция супероксидных анион-радикалов подавлялась (рис. 3.24),
начиная с дозы 2,5 мкг/мл (IC50 ~ 2 мкг/мл), что подтверждает роль ЦП как антиоксиданта
плазмы крови, обладающего активностью супероксиддисмутазы [Васильев и соавт., 1988]
либо подавляющего синтез супероксидного анион-радикала по альтернативному
механизму [Sergeev et al., 1993]. Действие ЦП концентрации 80 мкг/мл совпадало с
действием 300 ед./мл Cu,Zn-SOD. ЧСА не обладал способностью действовать на
продукцию супероксидных анион-радикалов НФ (данные не приведены).
Рис. 3.24. Зависимость продукции супероксидного анион-радикала НФ от концентрации
ЦП (R2 = 0,95). НФ инкубировали 30 минут с указанными концентрациями ЦП
(догарифмическая шкала), затем добавляли OZ на 30 минут; по степени восстановленного
цитохрома С (разность A550 и A535) измеряли долю О2 в пробах с ЦП относительно пробы,
которая не содержала ЦП (контроль). Данные представлены как среднее и доверительный
интервал (
0,05).
3.4.3. Влияние церулоплазмина на активность серпроцидинов
Мы исследовали влияние ЦП на активность NE и PR3 в отношении NBA (рис. 3.25, а)
и CG в отношении BTEE (рис. 3.25, б). В каждом случае ЦП не влиял на kcat, но повышал
значение KM, т.е. действовал как обратимый конкурентный ингибитор (таблица 3.12).
128
Рис. 3.25. Графики в координатах Хейнса–Вольфа, отражающие ингибирующее действие
0,75 мкМ ЦП на активность NE и PR3 (30 нМ) в отношении NBA (0,1–0,5 мМ) в 50 мМ
Tris-HCl, pH 7,4 (а) и активность CG (30 нМ) в отношении BTEE (0,5–2,5 мМ) в 50 мМ
Na-фосфатном буфере, рН 7,4 (б).
129
Таблица 3.12
Влияние ЦП на кинетические свойства серпроцидинов
KМ, мкМ
KМ(+ЦП), мкМ
kcat, с-1
kcat(+ЦП), с-1
Ki, мкМ
NE/NBA
178 ± 16
295 ± 17
11,6 ± 0,2
11,3 ± 0,2
1,14 ± 0,08
PR3/NBA
436 ± 24
691 ± 21
15,8 ± 0,2
15,6 ± 0,2
1,28 ± 0,09
CG/BTEE
1252 ± 80
2412 ± 80
2,1 ± 0,1
2,1 ± 0,1
0,81 ± 0,09
Протеиназа/
субстрат
В целом значения Ki для каждой из протеиназ составили около 1 мкM, что примерно в
3 раза меньше концентрации ЦП в плазме крови здоровых доноров. Однако, учитывая,
что концентрация классических серпинов и их сродство к данным протеиназам на
порядки выше, вряд ли ЦП является физиологическим ингибитором данных протеиназ,
принимая во внимание его чрезвычайную чувствительность к протеолитической
деградации. Изучение зависимости ингибирующего эффекта ЦП на активность
серпроцидинов при минимальной концентрации субстратов от ионной силы раствора
показало, что при концентрации NaCl более 300 мМ ингибирующий эффект ЦП
практически отсутствует (рис. 3.26).
Рис. 3.26. Зависимость ингибирования ЦП (3 мкМ) активности NE, PR3 и CG (30 нМ) в
отношении 0,1 мМ NBA или 0,5 мМ BTEE в 50 мМ Na-фосфатном буфере, рН 7,4, от
концентрации NaCl.
130
Это еще раз подтверждает заключение об ионной природе взаимодействия ЦП с
серпроцидинами.
3.4.4. Влияние апо-лактоферрина на деструкцию церулоплазмина индуцированную
пероксидом водорода
При добавлении ЦП к Н2О2 в присутствии спиновой ловушки 4-ПОБН нами был
зарегистрирован спектр ЭПР (рис. 3.27, 1), представляющий собой низкоинтенсивный, но
вполне различимый характерный для аддуктов данной ловушки триплет дублетов с
константами сверхтонкого расщепления аβΗ = 0,169 мТл и аΝ = 1,537 мТл, которые в
точности совпадают с соответствующими константами аддукта 4-ПОБН/●ОН [Панасенко
и соавт., 2002]. Данный факт позволяет предположить, что в системе Н2О2 + ЦП
образуется радикал ●ОН.
Для проверки этого предположения мы попытались зарегистрировать спиновый аддукт
в системе Фентона, в которой, как известно, образуется
●
ОН. Для этого к Н2О2 в
присутствии 4-ПОБН добавляли раствор FeCl2. Зарегистрированный спектр ЭПР
приведен на рис. 3.27, 3. Его спектральные параметры полностью соответствуют
описанным ранее параметрам аддукта 4-ПОБН/●ОН [Панасенко и соавт., 2002], а также
совпадают с параметрами аддукта, зарегистрированного в системе 4-ПОБН + Н2О2 + ЦП
(см. таблицу 3.13).
Таблица 3.13
Спектральные параметры спиновых аддуктов радикалов, образующихся в системе
Фентона и системе «ЦП + H2O2» в отсутствие и в присутствии ДМСО и этанола
Изучаемая система
Образующийся
аβΗ, мТл
аΝ, мТл
OH
0,173
1,547
ОН
0,169
1,537
радикал
4-ПОНБ + H2O2 + FeCl2
●
Параметры спиновых аддуктов
4-ПОНБ + H2O2 + ЦП
●
4-ПОНБ + ДМСО + H2O2 + FeCl2
●
СН3
0,285
1,660
4-ПОНБ + ДМСО + H2O2 + ЦП
●
СН3
0,285
1,662
4-ПОНБ + C2H5OH + H2O2 + FeCl2
CH3●CHOH
0,270
1,626
4-ПОНБ + C2H5OH + H2O2 + ЦП
CH3●CHOH
0,267
1,628
Время жизни радикала ●ОН очень мало и не превышает 10-9 секунды [Pryor, 1986], а
его спиновый аддукт 4-ПОБН/●ОН крайне нестабилен [Gunther et al., 1995]. Об этом
131
свидетельствуют слабая интенсивность сигнала на рис. 3.27, 3 и падение интенсивности
сигнала во время его регистрации.
Рис. 3.27. ЭПР сигналы спиновых аддуктов, образующихся в результате 2 мин.
инкубации при комнатной температуре в системах: (1) 120 мМ 4-ПОБН + 10 мкМ Н2О2 +
5,68 мкМ ЦП в 50 мМ фосфатном буфере, рН 7,4; (2) 120 мМ 4-ПОБН + 10 мкМ Н2О2 +
3,02 мкМ апо-ЦП в 50 мМ фосфатном буфере, рН 7,4; (3) 120 мМ 4-ПОБН + 10 мМ Н2О2
+ 10 мМ FeCl2 в 50 мМ фосфатном буфере, рН 7,4; (4) 120 мМ 4-ПОБН + 10 мкМ Н2О2 +
5,68 мкМ ЦП в 50 мМ фосфатном буфере, рН 7,4 в присутствии 5 % ДМСО; (5) 120 мМ
4-ПОБН + 10 мкМ Н2О2 + 3,02 мкМ апо-ЦП в 50 мМ фосфатном буфере, рН 7,4 в
присутствии 5 % ДМСО; (6) 120 мМ 4-ПОБН + 10 мМ Н2О2 + 10 мМ FeCl2 в 50 мМ
фосфатном буфере, рН 7,4 в присутствии 5 % ДМСО.
Наиболее вероятно, что радикал ●ОН образуется в результате взаимодействия Н2О2 с
ионами меди [Gunther et al., 1995]:
Cu+1 + Н2О2 → Cu2+ + ●OH + OH‾,
носителем которых является ЦП. Действительно, замена ЦП на апо-ЦП, который не
содержит ионов меди, приводит к невозможности регистрации сигнала ЭПР спинового
аддукта (см. рис. 3.27, 2).
132
Известно, что в силу своей высокой реакционной способности радикал ●ОН способен
оторвать атом водорода от молекулы этанола или ДМСО, в результате чего образуются
соответственно гидроксиэтильный радикал (CH3●CHOH) либо метильный радикал (●СН3),
которые могут быть «пойманы» ловушкой 4-ПОБН, а их спиновые аддукты довольно
устойчивы, что позволяет без особых усилий зарегистрировать их спектры ЭПР
[Панасенко и соавт., 2002, Gunther et al., 1995]. Если в системе Н2О2 + ЦП действительно
образуется радикал
регистрировать
●
ОН, то в присутствии этанола или ДМСО мы должны
соответственно
аддукты
4-ПОБН/CH3●CHOH
или
4-ПОБН/●CH3.
Проведенные нами эксперименты показали, что добавление ЦП к Н2О2 в присутствии 4ПОБН и этанола или ДМСО сопровождается регистрацией спектров ЭПР данных
аддуктов. Спектр с аналогичными параметрами был зарегистрирован и в том случае,
когда реакцию Фентона проводили в присутствии 4-ПОБН и этанола или ДМСО. На рис.
3.27
(4–6)
приведены
примеры
зарегистрированных
нами
использования ДМСО в качестве промежуточной ловушки
спектров
в
случае
●
ОН. Спектральные
параметры, рассчитанные после симуляции и компьютерной обработки спектров ЭПР,
приведены в таблице 3.13.
Видно, что в присутствии ДМСО в системе «4-ПОБН + H2O2 + ЦП» регистрируется
сигнал с параметрами аβΗ = 0,285 мТл и аΝ = 1,662 мТл, которые практически совпадают с
параметрами сигнала, зарегистрированного в системе Фентона в присутствии ДМСО (а βΗ
= 0,285 мТл и аΝ = 1,660 мТл), и очень похожи на спектральные параметры спинового
аддукта 4-ПОБН/●CH3, зарегистрированного ранее [Gunther et al., 1995, Augusto et al.,
1985, Augusto et al., 1986].
Аналогичные результаты были получены и при использовании этанола в качестве
промежуточной ловушки радикала
●
ОН (спектры ЭПР не приведены). Константы
сверхтонкого расщепления спектров ЭПР, зарегистрированных в системах «4-ПОБН +
H2O2 + ЦП» и «4-ПОБН + H2O2 + FeCl2» в присутствии этанола, практически совпадают
(таблица 3.13) и очень похожи на описанные ранее спектральные параметры спинового
аддукта 4-ПОБН/CH3●CHOH [Панасенко и соавт., 2002, Gunther et al., 1995]. Таким
образом, полученные данные позволяют заключить, что ЦП в присутствии H2O2
генерирует радикал ●ОН. Происходит это с участием ионов меди – вероятнее всего, по
приведенной выше реакции, поскольку, как видно из рис. 3.27 (2 и 5), апо-ЦП, не
содержащий медь, не способен восстанавливать H2O2 до радикала ●ОН.
В предварительных экспериментах нами было показано, что в ходе инкубации
препаратов ЦП с Н2О2 (рис. 3.28) происходит снижение оксидазной активности фермента
и исчезновение белковых зон, соответствующих ЦП, при электрофорезе в ПААГ. Этот
133
феномен был определен нами как деградация ЦП. При исследовании влияния различных
концентраций Н2О2 на ЦП (рис. 3.28, б) было установлено, что при концентрации Н2О2 10
мМ за 5 часов инкубации при 37 ºС оксидазная активность ЦП снижалась практически до
0. При этом, по данным диск-электрофореза в ПААГ без SDS, полностью исчезала
белковая зона, соответствующая исходному белку (рис. 3.28, а).
Рис. 3.28. Зависимость степени деструкции ЦП от концентрации пероксида водорода. а)
Электрофореграмма после ЭФ 2,7 мкМ ЦП в ПААГ без SDS (окрашивание o-DA): 1 –
ЦП; 2-7 – ЦП + H2O2 (0,1; 0,5; 1; 5; 10; 15 мМ); б) относительная p-PD-оксидазная
активность ЦП в зависимости от концентрации H2O2. Данные представлены как среднее и
доверительный интервал (
0,05).
В течение первых 3 часов инкубации с Н2О2 наблюдалась прямая зависимость
снижения активности ЦП от времени инкубации (рис. 3.29, б), а также постепенное
уменьшение интенсивности окраски зоны ЦП на электрофореграммах (рис. 3.29, а).
134
Рис. 3.29. Зависимость степени деструкции ЦП от времени инкубации с 10 мМ
пероксидом водорода. а) Электрофореграмма после ЭФ 2,7 мкМ ЦП в ПААГ без SDS
(окрашивание o-DA): 1 – ЦП; 2-6 – ЦП + H2O2 (1, 2, 3, 4 и 5 часов инкубации); б) p-PDоксидазная активность ЦП в зависимости от концентрации H2O2. Данные представлены
как среднее и доверительный интервал (
0,05).
Для стандартизации исследования во всех дальнейших экспериментах конечная
концентрация ЦП в пробе составляла 2,7 мкМ, концентрация Н2О2 составляла 10 мМ,
время инкубации – 5 часов.
С целью выяснения механизма деградации ЦП мы использовали набор различных
перехватчиков и ингибиторов образования АФК. В системе, содержащей ЦП и Н2О2, по
данным электрофореза и анализа оксидазной активности ЦП, такие скавенджеры ОН˙
радикалов, как маннитол в конечной концентрации 100 мМ, азид натрия (100 мМ) и
ДМСО (2 %), а также скавенджер супероксидных анион-радикалов – Cu,Zn-SOD (10
мкг/мл) не оказывали на ЦП защитного действия. В то же время гистидин (20 мМ), с
одной стороны являющийся «ловушкой» для АФК, а с другой стороны – достаточно
135
прочно связывающий ионы меди, существенно тормозил разрушение ЦП, сохраняя до 75
% исходной оксидазной активности (таблица 3.14).
Таблица 3.14
Эффекты различных веществ на продукцию АФК в растворе, содержащем 2,7 мкМ
ЦП и 10 мМ H2O2
Вещество
Относительная p-PD-
Хемилюминесценция
Концентрация
оксидазная активность
через 1 час после
в образце
ЦП, % от контроля без
инкубации, В
H2O2
Контроль
-
0
1,20 ± 0,05
Маннитол
100 мМ
0
1,20 ± 0,05
NaN3
100 мМ
0
-
2%
0
-
10 мкг/мл
0
-
Гистидин
20 мМ
75 ± 9
0,20 ± 0,02
ЭДТА
10 мМ
20 ± 5
0,01 ± 0,004
Chelex 100
20 мкл
80 ± 4
0,20 ± 0,02
Fe2-ЛФ
3 мкМ
60 ± 5
0,60 ± 0,04
Апо-ЛФ
3 мкМ
80 ± 5
0,20 ± 0,02
Апо-ЛФ
12 мкМ
80 ± 5
0,10 ± 0,01
ЧСА
12 мкМ
80 ± 5
0,10 ± 0,01
Лизоцим
12 мкМ
0
1,20 ± 0,05
ДМСО
Cu,Zn-SOD
Далее нами было показано, что выраженной способностью ингибировать процесс
деградации ЦП обладают хелаторы ионов металлов. Так, защитное действие ЭДТА
возрастало при увеличении его концентрации до 10 мМ, однако сохраняло не более 20 %
первоначальной активности ЦП (таблица 3.14). Дальнейшее повышение концентрации
ЭДТА не приводило к усилению защитного эффекта. Проведение реакции деградации
ЦП, где в качестве защитного агента выступала смола Chelex 100, способствовало
сохранению 80 % активности ЦП (таблица 3.14). Наряду с измерением оксидазной
активности, деструкцию ЦП и защитное действие ингибиторов деградации оценивали по
изменению интенсивности окраски белковых зон на электрофореграммах (данные не
представлены).
136
При добавлении ЛФ к системе «ЦП + Н2О2» (рис. 3.30) обнаруживалось выраженное
подавление процесса деградации ЦП. Оксидазная активность ЦП за 5 часов снижалась
только на 20 % (80 % защиты).
Рис. 3.30. Влияние рН 10 мМ Na-фосфатоного буфера и концентрации добавленных ЛФ,
ЧСА и лизоцима (ЛИЗ) на способность защищать 2,7 мкМ ЦП от деструкции 10 мМ H2O2
по p-PD-оксидазной активности после 5 часов инкубации при 37 ºС. Данные
представлены как среднее и доверительный интервал (
0,05).
Рис. 3.31, а демонстрирует данные электрофореза в денатурирующих условиях. Видно,
что после пятичасовой совместной инкубации ЦП, ЛФ и Н2О2 сохранялись зоны,
соответствующие как ЛФ, так и ЦП (дорожка 3), тогда как ЦП, инкубированный с Н 2О2
без ЛФ, был полностью разрушен (дорожка 2). Сходное с ЛФ защитное действие
оказывал сывороточный альбумин человека (ЧСА), который, как известно, содержит
высокоаффинный сайт связывания иона меди, в то время как лизоцим, не обладающий
способностью связывать медь, вообще не защищал ЦП (рис. 3.31). Сывороточный
альбумин собаки, не содержащий специфического сайта связывания иона меди, по
сравнению с ЛФ и ЧСА, подавлял деградацию ЦП слабее: 60 % защиты против 80 % в
присутствии ЧСА.
137
Рис. 3.31. Электрофореграмма после электрофореза в SDS-ПААГ (окраска Кумасси R250). а) 1 – интактный ЦП; 2 – ЦП, инкубированный с 10 мМ H2O2 при рН 7,4; 3 – 2 в
присутствии апо-ЛФ; б) 4,6 – ЛФ, ЧСА, инкубированные с 10 мМ H2O2 при рН 7,4; 5,7 –
4,6 в присутствии 50 мкМ CuSO4, соответственно. Стрелками указаны значения M, кДа.
Сами по себе ЛФ и ЧСА в концентрации 3 мкМ не разрушались в присутствии 10 мМ
Н2О2 (рис. 3.31, б, дорожки 4 и 6), однако при добавлении в реакционную смесь 50 мкМ
CuSO4 происходила деградация ЛФ и ЧСА, о чем говорят данные электрофореза (рис.
3.31, б, дорожки 5 и 7), где полностью исчезала окраска белковых зон.
Результаты ряда экспериментов по изучению реакции деградации ЦП при разных
значениях рН показали, что кривые снижения оксидазной активности ЦП в зависимости
от времени при рН 7,4 (рис. 3.29) и при рН 5,5 совпадают. Также совпадали кривые,
описывающие процесс разрушения ЦП в зависимости от концентрации Н 2О2 при рН 7,4
(рис. 3.28) и при рН 5,5. Данные электрофореза в ПААГ с SDS свидетельствовали о
полном исчезновении белковой зоны после 5 часов инкубации ЦП с Н 2О2 как при рН 7,4
(рис. 3.31), так и при рН 5,5 (данные не приводятся).
Защитное действие ЛФ и ЧСА с наибольшим эффектом проявлялось при рН 7,4. При
снижении рН среды защитный эффект этих белков снижался (рис. 3.30). Снижение рН до
6,5 приводило к падению защитного эффекта ЛФ на 50 % (рис. 3.32). Такое же снижение
защитного эффекта было обнаружено и для ЧСА. При снижении рН до 5,5 ни ЛФ, ни
ЧСА не защищали ЦП от деградации.
138
Рис. 3.32. Эффект рН среды и присутствия апо-ЛФ (12 мкМ, черные ромбы) на p-PDоксидазную активность 2,7 мкМ ЦП после деструкции 10 мМ H2O2 в течение 5 часов в 10
мМ Na-фосфатном буфере при 37 ºС (белые квадраты). Данные представлены как среднее
и доверительный интервал (
0,05).
Оказалось, что в отличие от связывания ионов железа, связывание ионов меди с апоЛФ гораздо чувствительнее к рН среды, в частности при рН 6,5 ЛФ терял около 50 %
связанной с ним меди, а при рН 6,0 практически не связывал Cu2+ (рис. 3.33).
Рис. 3.33. Влияние рН среды на насыщение ЛФ ионами Fe3+ и Cu2+. Данные представлены
как среднее и доверительный интервал (
0,05).
139
С целью выяснения наличия АФК в нашей системе было исследовано окисление
люминола, который в ходе подобных реакций преобразует химическую энергию
непосредственно в световую. Рис. 3.34 демонстрирует хемилюминесценцию люминола в
системе «ЦП + Н2О2». Видно, что после добавления Н2О2 в реакционную смесь
начиналась эмиссия света, которая монотонно возрастала с течением времени. Через 1 ч
после начала реакции уровень свечения составлял примерно 1000 мВ. Свечение
контрольной пробы, содержавшей 10 мМ пероксида водорода в PBS, составляло 1,3–1,6
мВ. Свечение в разной степени подавлялось антиоксидантами (таблица 3.14, рис. 3.34).
Добавление в реакционную смесь маннитола (концентрация в пробе 100 мМ) не
изменяло характера хемилюминесценции, тогда как добавление смолы Chelex 100
снижало свечение люминола до уровня 200 мВ, так же как и добавление гистидина до
конечной концентрации 20 мМ, а в присутствии ЭДТА (10 мМ) уровень свечения
оставался постоянным на уровне фонового в течение всего эксперимента (1 час) и
составлял ~ 10 мВ.
Рис. 3.34. Эффекты различных добавок на хемилюминесценцию раствора 2,7 мкМ ЦП, 10
мМ H2O2 и 100 мкM люминола. Добавки: 10 мМ ЭДТА, 100 мМ маннитол, 2,7 мкМ апоЛФ (ЦП:ЛФ = 1:1), 10,8 мкМ апо-ЛФ (ЦП:ЛФ = 1:4), 10,8 мкМ Fe2-ЛФ, 10,8 мкМ
лизоцим, 10,8 мкМ ЧСА, 10,8 мкМ гистидин, Chelex 100 (ad libitum). Данные
представлены как среднее и доверительный интервал (
0,05).
140
В присутствии 3 мкМ апо-ЛФ (мольное соотношение ЦП:апо-ЛФ = 1:1) уровень
свечения пробы составлял около 200 мВ. Апо-ЛФ в концентрации 12 мкМ (ЦП:апо-ЛФ =
1:4) снижал хемилюминесценцию до уровня 100 мВ, так же как и 12 мкМ ЧСА, в то время
как лизоцим не оказывал влияния на свечение люминола в системе «ЦП + Н2О2», и через
1 ч уровень хемилюминесценции составлял 1000 мВ. В пробе, содержащей 3 мкМ Fe2ЛФ, за 30 минут хемилюминесценция достигала 600 мВ и далее в ходе реакции
оставалась постоянной.
Полученные
результаты
свидетельсвуют
о
взаимном
влиянии
компонентов
комплексов: так, ЭПО и серпроцидины влияют на связывание с ЦП субстрата p-PD; в
свою очередь, ЦП конкурирует с субстратами протеиназ и ЭПО, а также направляет
антимикробную систему «ЛФ-МПО-пероксид водорода-хлорит/тиоцианат» на синтез
гипотиоцианата. Протеолитическая деградация ЦП влияет на его ингибирующие свойства
в отношении ЭПО и 5-LO. Наконец, ЛФ и тиоцианат защищают ЦП от действия
пероксида водорода и активных форм галогенов, HOCl и HOBr.
3.5. Изучение протеолитической деградации церулоплазмина in vivo и in vitro
Состояние проблемы на момент исследования. ЦП человека чрезвычайно легко
деградирует под действием протеиназ [Ryden, 1971]. Эта особенность и тот факт, что
белковая цепь ЦП включает в себя три гомологичные части, явились причиной того, что
более 30 лет с момента открытия ЦП в литературе дебатировался вопрос о том, состоит
ли молекула ЦП из одной полипептидной цепи или из гомологичных субъединиц [Poulik,
1968; Simons and Bearn, 1969; Ryden, 1972; McCombs and Bowman, 1976; Takahashi et al.,
1984]. При хранении препаратов ЦП, выделенных различными способами без добавления
ингибиторов протеиназ,
целостная
белковая
цепь
распадалась
на
характерные
протеолитические фрагменты (рис. 1.2): 116 кДа и 19 кДа (гидролиз связи K887–V888
между 5-м и 6-м доменами белка), фрагменты 72 кДа или 67 кДа и 52 кДа (гидролиз связи
R481–S482 между 3-м и 4-м доменами) [Ryden, 1971; Kingston et al., 1977; Kingston et al.,
1979; Moshkov et al., 1979; Prozorovski et al., 1982]. Выделение недеградированного и
стабильного ЦП до сих пор остается весьма трудной задачей [Соколов и соавт., 2005].
Многие авторы сообщают о присутствии в препаратах ЦП примеси протромбина
[Bianchini et al., 1999], неидентифицированной металлопротеиназы [Ehrenwald and Fox,
1994], а также рекомендовали использование ингибиторов протеиназ на всех стадиях
выделения ЦП [Moshkov et al., 1979]. При выделении ЦП в его препаратах нами были
идентифицированы примеси комплексов ЦП с матриксными металлопротеиназами 2 и 12;
кроме того, ЦП взаимодействует с представителями семейства серпроцидинов: эластазой,
141
катепсином G и протеиназой 3. Целостность молекулы ЦП имеет большое значение для
функций этого фермента. Такие его антиоксидантные свойства, как глутатион-зависимая
пероксидазная активность [Kim and Park, 1998], эффективная загрузка железа в ферритин
[Van Eden and Aust, 2000], ингибирование хлорирующей и пероксидазной активности
миелопероксидазы [Соколов, 2007], утрачиваются после протеолитической деградации
связи, соединяющей 5-й и 6-й домены белка. Протеолиз ЦП in vitro с применением целого
ряда протеиназ, например плазмина, эластазы, трипсина, катепсина G и др., не приводил к
появлению протеолитических фрагментов, характерных для «спонтанного» протеолиза
ЦП при хранении [Соколов, 2007]. Пептидные связи, уязвимые для таких протеиназ, как
трипсин, плазмин, эластаза, встречаются в полипептидной цепи ЦП достаточно часто, что
приводит к образованию большего числа фрагментов, отличающихся по молекулярному
весу от фрагментов «спонтанного» протеолиза [Kingston et al., 1977; Kingston et al., 1979;
Sang, 1995]. Следует отметить, что одним из ферментов, претендующих на роль
протеиназы, приводящей к деградации ЦП при хранении, является тромбин (FIIa). Вопервых, FIIa является «редкощепящей» протеиназой и мог бы привести к образованию
небольшого числа фрагментов, наблюдаемых при «спонтанном» протеолизе ЦП. Вовторых, протромбин сопутствует ЦП при выделении на большинстве применяемых для
очистки ЦП ионообменных смол (DEAE- и QAE-Сефадекс) и аффинных сорбентах (АЕагароза, ПР-Сефароза) [Musci et al., 1996; Соколов и соавт., 2005]. В-третьих, ЦП
гомологичен FV и FVIII (относящихся к суперсемейству купредоксинов, как и ЦП),
являющихся физиологическими субстратами FIIa [Church et al., 1984]. До сих пор в
литературе не было показано картины ограниченного протеолиза ЦП под действием FIIa,
а также не было предпринято попыток предотвратить протеолитическую деградацию ЦП
ингибиторами FIIa. Ранее мы показали, что добавление гепарина к свежевыделенному ЦП
полностью предотвращало протеолитическую деградацию при хранении белка в течение
месяца при 37 ºС, что косвенно указывало на участие факторов свертывания крови в
протеолизе
ЦП
[Соколов
и
соавт.,
2005].
Первым
примером
обнаружения
протеолизованного ЦП в биологических жидкостях было исследование образцов плазмы
крови больных гемофилией А и В с помощью Вестерн-блоттинга. Оказалось, что у таких
больных наряду с повышением общей протеолитической активности плазмы выявляются
фрагменты ЦП, которые не удается обнаружить при анализе образцов плазмы здоровых
доноров. Следует отметить, что у таких больных также отмечается снижение
антиоксидантного статуса плазмы крови, в частности снижение SOD-активности плазмы
крови [Алексанян, 2007].
142
3.5.1. Протеолитическая деградация церулоплазмина в биологических жидкостях
при воспалении
При анализе образцов синовиальной жидкости 24 больных ревматоидным артритом в
11 из них при Вестерн-блоттинге выявлялся ЦП в виде недеградированного 132-кДа
белка (рис. 3.35, а, дорожка 8), а в 13 образцах выявлялись его протеолитические
фрагменты (рис. 3.35, а, дорожки 1-7, 9-12). В качестве положительного контроля мы
использовали препарат недеградированного ЦП (рис. 3.35, а, дорожка к).
Рис. 3.35. а) Выявление ЦП при Вестерн-блоттинге синовиальной жидкости (5 мкл).
Вестерн-блоттинг с аффинными антителами кролика против ЦП (разведение 1:10000,
разведение пероксидазного конъюгата антител козла против антител кролика 1:5000): 8 –
образцы, содержавшие нефрагментированный 132-кДа ЦП, 1-7, 9-12 – образцы, не
содержавшие 132-кДа ЦП, к – образец нефрагментированного ЦП. Стрелками указаны
значения M, кДа, горизонтальная линия на уровне 125 кДа. б) Активность МПО и FIIa в
образцах синовиальной жидкости (цифры соответствуют дорожкам на панели а).
В 11 образцах с недеградированным 132-кДа ЦП в синовиальной жидкости
практически не выявлялась активность FIIa и МПО. Напротив, в 13 образцах,
143
содержавших деградированный ЦП, активность FIIa была в среднем в 17 раз выше, и
активность МПО – в 33 раза выше, чем в образцах с недеградированным ЦП (рис. 3.35, б).
Рис. 3.36. Анализ деградации ЦП в синовиальной жидкости по результатам
электрофореза в SDS-ПААГ (а, б) и ЭФ в ПААГ без SDS (в). Вестерн-блоттинг с
аффинными антителами кролика против ЦП (разведение 1:10000, разведение
пероксидазного конъюгата антител козла против антител кролика 1:5000). а) 1 –
недеградированный ЦП (20 мкг), 2-8 – ЦП (20 мкг) после инкубации с 0,5 мкл
синовиальной жидкости (образец на дорожке 12, рис. 3.35, а) после инкубации при 37°С
в течение 15, 30, 45, 60, 90, 120 и 240 минут. б) 1 – недеградированный ЦП (20 мкг), 2, 3 –
ЦП (20 мкг) после инкубации с 0,5 мкл синовиальной жидкости (образец на дорожке 12,
рис. 3.35, а) после инкубации при 37°С в течение 1 и 12 часов, 4 - ЦП (20 мкг) и гирудин
(2 мкг) после инкубации с 0,5 мкл синовиальной жидкости (образец на дорожке 12, рис.
3.35, а) после инкубации при 37°С в течение 12 часов, 5 – 20 мкл синовиальной жидкости
(образец на дорожке 12, рис. 3.35, а). в) 1 – апо-ЦП (1 мкг), 2 – ЦП (1 мкг), 3 - 5 мкл
синовиальной жидкости (образец на дорожке 12, рис. 3.35). Стрелками указаны значения
M, кДа.
144
Эти данные согласуются с нашим выводом о том, что протеолитическая деградация
ЦП приводит к отсутствию у него способности ингибировать МПО [Соколов, 2007].
Учитывая, что набор протеолитических фрагментов в образцах синовиальной жидкости
напоминал картину спонтанного протеолиза ЦП, и там же выявлялся активный FIIa, мы
исследовали динамику ограниченного протеолиза ЦП под действием синовиальной
жидкости и FIIa.
С целью первичной идентификации протеиназы, вызывающей протеолитическую
деградацию ЦП в синовиальной жидкости, был изучен протеолиз очищенного ЦП с
добавкой синовиальной жидкости в зависимости от времени инкубации и присутствия
специфического ингибитора FIIa, гирудина (рис. 3.36, а, б). Добавление образца
синовиальной жидкости, содержащей только 50 кДа-фрагмент ЦП (по данным Вестернблоттинга), к недеградированному ЦП привело к накоплению 50 кДа-фрагмента во
времени (рис. 3.36, а). Добавление ингибитора FIIa – гирудина – практически полностью
защитило ЦП от протеолитической деградации, вызванной протеиназой, присутствующей
в синовиальной жидкости (рис. 3.36, б).
Анализ синовиальной жидкости с помощью диск-электрофореза без SDS (рис. 3.36, в)
показал наличие в синовиальной жидкости апо-формы ЦП. Ультрафильтрация
синовиальной жидкости с помощью специальных ячеек, удерживающих молекулы с M
выше 3 кДа, и последующий атомно-адсорбционный анализ показали, что в
синовиальной жидкости около 1/3 меди не связано с высокомолекулярной фракцией.
3.5.2. Идентификация протеиназ, деградирующих препараты церулоплазмина
Хранение препаратов ЦП, выделенных без ингибиторов протеолиза (см. раздел
2.7.1.2), приводило к протеолитической деградации 132-кДа полипептида с образованием
электрофоретических зон с M ~ 116, 72, 67, 52 и 19 кДа, описанным ранее как фрагменты
спонтанного протеолиза [Kingston et al., 1977, Prozorovski et al., 1982]. Ограниченный
протеолиз ЦП с помощью FIIa приводил к образованию фрагментов с такими же
молекулярными массами (рис. 3.37).
Фрагменты, образовавшиеся при хранении препаратов ЦП, и фрагменты, полученные
при ограниченном протеолизе FIIa, были подвергнуты масс-спектрометрическому
анализу. Результаты суммированы в таблице 8.1 (см. раздел «Приложение»). Ни в одном
из сравниваемых фрагментов не было найдено отличий по масс-спектру пептидов,
которые бы свидетельствовали о различной локализации фрагментов, образуемых при
145
гидролизе FIIa, и фрагментов «спонтанного» протеолиза, описанных в литературе (рис.
1.2).
Рис. 3.37. Разделение фрагментов ЦП, полученных при ограниченном гидролизе FIIa, и
фрагментов «спонтанного» протеолиза, образовавшихся при хранении препаратов ЦП. 1 –
исходный препарат ЦП (50 мкг), 2-8 – протеолиз ЦП (ЦП:FIIa = 100:1, w/w) в течение 5,
10, 15, 30, 45, 60 и 120 минут, 9 - маркеры молекулярной массы, 10-12 – препарат ЦП
после спонтанного протеолиза (5, 10, 20 мкг), выделенный на ПР-Сефарозе, 13, 14 –
препарат ЦП после спонтанного протеолиза (10, 20 мкг) выделенный на АЕ-агарозе.
Известно, что FIIa относится к редкощепящим протеиназам [Gallwitz et al., 2012],
предпочитая наличие R в позиции P1, P или L в позиции P2, неполярный (не пролин)
алифатический а. о. ( al) в позиции P4, в то время как вид а. о. в позиции P3
неспецифичен (x). Сайт после расщепления полипептидной цепи (P1′–P4′), содержит
небольшие а. о. (G, A, S и T) в позиции P1′, ароматические а. о. ( ar) в позиции P2′, R в
позиции P3′ и алифатические а. о. ( al) в позиции P4′: P4( al)–P3(x)–P2(P)–P1(R)↓P1′(s)–
P2′( ar)–P3′(R)–P4′( al). Расщепление под действием FIIa связей в белках после остатка K
(P1) менее характерно, хотя и наблюдается в некоторых синтетических субстратах
протеиназ.
В таблице 3.15 приведены наиболее вероятные фрагменты ЦП для расщепления FIIa.
Интересно, что расщепляемые FIIa фрагменты ЦП, PQSR481↓S482VPP и PYLK887↓V888FNP,
146
лишь частично соответствуют консенсусу для FIIa, но характеризуются максимально
выступающим положением на глобуле (рис. 3.38, а) и максимальными значениями Bфактора (рис. 3.38, б).
Таблица 3.15
Аминокислотные последовательности ЦП, потенциально расщепляемые FIIa
Консенсус FIIa
P4
al
P3
P2
P1
P1’
X
P
R
s
L
K
Фрагмент ЦП
P2’
ar
P3’
R
P4’
al
21-28
G
D
K
K
L
I
S
V
223-230
E
P
E
K
V
D
K
D
226-233
K
V
D
K
D
N
E
D
337-344*
D
C*
N
K
S
S
S
K
478-485
P
Q
S
R
S
V
P
P
576-584
D
N
I
R
M
F
W
W
697-704*
N
Q
C*
R
R
Q
S
E
698-705*
Q
C*
R
R
Q
S
E
D
884-891
P
Y
L
K
V
F
N
P
Примечание. Отбор фрагментов был проведен на основе следующих критериев: 1)
наличие R или K в положении P1, 2) расположение на поверхности глобулы, 3)
высокая подвижность фрагмента, на основе данных о B-факторе (см. рис. 3.38, б).
По данным литературы и наших собственных исследований, 19-кДа фрагмент ЦП при
«спонтанном» протеолизе образуется при гидролизе связи K887–V888, соединяющей 5-й
и 6-й домены ЦП. Это заставило нас предполагать, что FIIa гидролизует полипептидную
цепь ЦП, расщепляя связь за остатком K. Действительно, определение N-концевой
аминокислотной последовательности 19-кДа фрагмента ЦП, образующегося при
гидролизе FIIa (выделена прямоугольной рамкой на рис. 3.37), однозначно показало
последовательность VFNPRRKLEF, идентичную последовательности этого фрагмента,
образующегося при «спонтанном» протеолизе ЦП [Kingston et al., 1977]. Таким образом,
мы показали, что FIIa гидролизует последовательность ЦП 884–891: связь K887–V888.
Следует отметить, что синтетический пептид ЦП 883–892, имитирующий петлю,
соединяющую 5-й и 6-й домены ЦП, и содержащий неканонический сайт, не
гидролизовался FIIa. Известно, что факторы свертывания крови V и VIII содержат
гомологичные ЦП купредоксиновые домены. Структурная гомология выражается также в
том, что FV и FVIII содержат по иону меди на молекулу. Было показано, что в FVIII ион
меди относится к I типу и способствует ассоциации полипептидных цепей и
147
поддержанию трехмерной структуры этого фактора [Mann et al., 1984; Tagliavacca et al.,
1997; Wakabayashi et al., 2001].
Рис. 3.38. Положение сайтов протеолитической деградации FIIa в ЦП. а) Трехмерная
структура ЦП (PDB: 4enz). Голубым выделены -слои, красным – -спирали, ион кальция
– зеленым, ионы меди – розовым, ион железа в ферроксидазном сайте – синим. б) График
зависимости В-фактора от номера а. о. в полипептидной цепи ЦП. Стрелками указаны
сайты расщепления FIIa в ЦП: K887–V888 и R481–S482.
В молекуле ЦП структура кальций-связывающего сайта гомологична аналогичному
сайту в FV быка [Bento et al., 2007]. Известно, что FV и FVIII содержат
последовательности, гомологичные последовательности гирудина, взаимодействующей с
экзосайтом
I для
фибриногена
в
FIIa
[Ofosu,
1991].
Сравнительный
анализ
аминокислотной последовательности ЦП, FV, FVIII и гирудина показал, что ЦП также
содержит последовательности, гомологичные последовательности гирудина (таблица
3.16).
Следует отметить, что в ЦП сайт расщепления 887–888 расположен раньше сайта 946–
954, гомологичного последовательности гирудина, взаимодействующей с экзосайтом I в
148
FIIa. С осторожностью можно предположить, что сродство ЦП к FIIa, связанное с
наличием гомологичной гирудину последовательности, приводит к расщеплению
вышележащего неканонического сайта, который, в отличие от N-концевого кора
гирудина, не ингибирует FIIa.
Таблица 3.16
Сравнение первичной последовательности гирудинов, ЦП, FV и FVIII
Белок
Сайт
Последовательность
Гирудин 1
55–63
DGDFEEIPE
Гирудин 2
62–70
NGDFEEIPE
Церулоплазмин
Фактор V
Фактор VIII
Гомология, %
247–255
DKDNEDFQE
67
608–616
DKEDEDFQE
56
946–954
NKDDEEFIE
67
689–677
DEDSYEIFE
56
961–969
IQDTDEDTA
44
1535–1543
EDDYAEIDY
67
358–366
NEEAEDYDD
77
738–746
YEDSYEDIS
56
Рекомбинантные ингибиторы FIIa, гирудин 2 (HM2) и его модифицированный
фрагмент (1–47, S2R), не только полностью блокировали деградацию препарата ЦП в
присутствии FIIa (данные не приводятся), но и препятствовали деградации ЦП в
сыворотке крови при ее хранении в стерильных условиях (рис. 3.39). До сих пор ни один
из традиционных ингибиторов протеиназ (ЭДТА,
-аминокапроновая кислота), кроме
гепарина, не ингибировал «спонтанный» протеолиз свежевыделенного ЦП.
Тот факт, что ЦП содержит последовательности, гомологичные ингибитору FIIa
гирудину, а также, выделенный с помощью различных методов, содержит примеси FIIa,
позволил предположить возможность комплексообразования между FIIa и ЦП. В
условиях диск-электрофореза в ПААГ без SDS мы не наблюдали образования комплекса
между ЦП и FIIa (данные не приводятся). Однако учитывая, что комплексы ЦП с NE, CG
и PR3 неэффективно формировались в условиях диск-электрофореза (рис. 3.6, а), а ЦП
выделяется с примесями FIIa при различных видах хроматографии, мы провели гельфильтрацию смеси ЦП и FIIa. В качестве элюента был выбран PBS/2, поскольку при
большинстве процедур выделения ЦП ионная сила редко превышает ионную силу PBS.
Действительно, в условиях гель-фильтрации ЦП и FIIa элюировались совместно (рис.
3.40). Молекулярная масса комплекса по данным калибровки соответствовала 171 ± 6
кДа, что говорит о стехиометрии ЦП:FIIa = 1:1 (моль/моль).
149
Рис. 3.39. Влияние гирудина (HM2) и его фрагмента (1–47, S2R) на протеолитическую
деградацию ЦП в сыворотке крови (2 мкл), хранившейся 2 недели в стерильных условиях.
Вестерн-блоттинг с аффинными антителами кролика против ЦП (разведение 1:10000,
разведение пероксидазного конъюгата антител козла против антител кролика 1:5000): 1 –
сыворотка крови; 2 – 1 + HM2; 3 – 1 + 1–47, S2R; 4 – свежая сыворотка (2 мкл); 5 – ЦП,
фрагментированный при хранении (0,2 мкг). Стрелками указаны значения M, кДа.
Поскольку гирудиноподобные участки ЦП, указанные в таблице 3.16, по данным
рентгеноструктурного анализа расположены на вершине пирамидальной молекулы ЦП,
рядом с сайтом взаимодействия с Fe2+, обеспечивающим взаимодействие ЦП с
субстратом ферроксидазной реакции, мы исследовали влияние FIIa на ферроксидазную
активность ЦП. Для того чтобы исключить влияние протеолитической деградации ЦП
под действием FIIa, был использован FIIa, инактивированный суицидным ингибитором
PMSF. Действительно, FIIa-PMSF ингибировал ферроксидазную активность ЦП,
увеличивая KM для Fe2+ c 57 до 138 мкМ, но не влиял на Vmax (рис. 3.41). Конкурентный
характер ингибирования ферроксидазной активности ЦП в присутствии FIIa находится в
соответствии с первоначальной гипотезой о том, что связывание с FIIa может повлиять на
связывание Fe2+ с ЦП. Значение Ki 220 ± 20 нМ свидетельствует о высоком сродстве
между FIIa и ЦП.
150
Рис. 3.40. Гель-фильтрации смеси ЦП-FIIa на колонке с Sephacryl S-200 HR. а) Профиль
элюции ЦП (18 мг, пунктирная линия с точками), FIIa (6 мг, пунктирная линия) и их
смеси (сплошная линия). б) Калибровочный график lgM маркерных белков от Ve (мл).
Черная точка – соответствует смеси ЦП-FIIa.
Рис. 3.41. Влияние FIIa-PMSF на ферроксидазную активность ЦП. График в координатах
Хейнса–Вольфа: зависимость [Fe2+]/V от [Fe2+] для ЦП и ЦП в присутствии 120 и 360 нМ
FIIa-PMSF.
151
В процессе ограниченного протеолиза ЦП под действием FIIa мы наблюдали
накопление ЦПпр по данным SDS-ЭФ в ПААГ (рис. 3.42, а).
Рис. 3.42. Влияние ограниченного протеолиза под действием FIIa на ферроксидазную
активность ЦП и его способность ингибировать пероксидазную активность МПО. а)
Электрофореграмма после SDS-ЭФ в ПААГ препарата ЦП, гидролизованного FIIa. 1 –
недеградированный препарат ЦП (50 мкг), 2-8 – препарат после ограниченного
протеолиза FIIa (ЦП:FIIa = 50:1, w/w) в течение 5, 10, 15, 30, 45, 60 и 120 минут. б)
Зависимость ферроксидазной активности ЦП (200 мкМ Fe2+, 120 нМ ЦП, 50 мМ Naацетатный буфер, рН 5,5) и активности МПО в отношении ABTS в присутствии ЦП (20
нМ МПО, 120 нМ ЦП, 100 мкМ H2O2, 1 мМ ABTS, 100 мМ Na-ацетатный буфер, рН 5,5,
за 100 % принимали активность МПО без добавления ЦП) от времени ограниченного
протеолиза, опосредованного FIIa. Данные представлены как среднее и доверительный
интервал (
0,05).
152
В определенные промежутки времени к ЦП был добавлен PMSF, а затем измерена его
ферроксидазная активность и способность ингибировать пероксидазную активность МПО
в отношении ABTS (рис. 3.42, б). По мере накопления ЦПпр ферроксидазная активность
практически не изменилась (количество FIIa в смеси с ЦП было недостаточно для
значительного ингибирования ферроксидазной активности), в то же время практически
исчезла способность ЦП ингибировать пероксидазную активность МПО в отношении
ABTS. Это находится в полном соответствии с нашими данными о неэффективности
ЦПпр как ингибитора активности МПО.
Полученные результаты свидетельствуют в пользу участия FIIa в протеолитической
деградации ЦП в биологических жидкостях (сыворотка крови, синовиальная жидкость
пациентов
с
ревматоидным
артритом)
и
его
препаратах.
Ингибирование
протеолитической деградации ЦП гирудином, специфическим ингибитором FIIa,
является наиболее веским доводом в пользу основного вклада FIIa в протеолиз ЦП.
Гомология ЦП с факторами свертывания крови V и VIII является структурнофункциональной предпосылкой для взаимодействия ЦП и FIIa. Последний влияет на
связывание ионов Fe2+ c ЦП, а также снижает способность ЦП ингибировать активность
МПО. Этот вывод подкрепляется обнаружением в синовиальной жидкости пациентов с
ревматоидным артритом одновременно активного FIIa, протеолизованного ЦП и
активной МПО.
3.6. Многокомпонентные комплексы церулоплазмина
Состояние проблемы на момент исследования. В последние годы большое внимание
уделяется изучению роли иммунологических факторов в атерогенезе. Атеросклероз стал
рассматриваться как хроническое иммунное воспаление. При этом не умаляется ключевая
роль накопления в интиме избыточных количеств холестерина. Образуемые МПО
окислители способны модифицировать как липидный компонент ЛНП, так и а. о. апоВ100, приводя к поглощению поврежденных ЛНП макрофагами с образованием пенистых
клеток – характерного признака атеросклероза [Panasenko et al., 1997a; Nicholls and Hazen,
2009]. Биомаркеры галогенирующего действия МПО (3-хлортирозин, 5-хлорурацил, αхлоральдегиды, хлоргидрины ацильных цепей липидов) и активный фермент обнаружены
в тканях, пораженных атеросклерозом [Daugherty et al., 1994; Hazell et al., 1996; Hazen and
Heinecke, 1997; Zheng et al., 2004; Messner et al., 2008].
Следует отметить, что вопрос о значении непосредственного связывания МПО с ЛНП
и роли ЦП как ингибитора МПО в развитии начальных стадий атерогенеза не был
исследован. Мы предположили, что именно связывание МПО с поверхностью ЛНП
153
является ключевым звеном в модификации ЛНП оксидантами, образующимися в МПОзависимых реакциях, их трансформации в проатерогенную форму, накоплении
холестерина в субэндотелиальных клетках и развитии атеросклеротических изменений в
артериальных сосудах. С помощью пептида, имитирующего сайт взаимодействия ЛНП с
МПО и способного разобщать комплекс ЛНП-МПО, а также веществ, ингибирующих и
модулирующих активность МПО, на модели моноцитов/макрофагов, поглощающих ЛНП,
мы продемонстрировали важность связывания МПО с поверхностью ЛНП в их
проатерогенной модификации и накоплении внутриклеточного холестерина.
3.6.1. Свойства комплексов церулоплазмина, миелопероксидазы и апоВ-100содержащих липопротеинов
Для изучения взаимодействия МПО с ЦП и липопротеинами различных классов мы
применяли метод диск-электрофореза (рис. 3.43) и гель-фильтрации (рис. 3.54). Ранее с
помощью диск-электрофореза в четырехслойном ПААГ мы обнаружили комплексы в
образцах сыворотки больных атеросклерозом (рис. 3.4). Аналогичные результаты
получены при исследовании взаимодействия очищенной МПО с липопротеинами и ЦП с
окраской на активности ЦП и МПО. При разделении в четырехслойном ПААГ ЛОНП,
ЛНП и ЛВП задерживаются на входе во второй, третий и четвертый слои соответственно
(рис. 3.43, а). ЦП в этом случае обладает наибольшей электрофоретической
подвижностью и выявляется в четвертом слое (рис. 3.43, б: 1), а катионная МПО не
входит в гель, и ее активность в геле не выявляется (рис. 3.43, в: 1). При смешивании ЦП
и МПО формируется комплекс, подвижность которого несколько ниже, чем у ЦП, но
выше, чем у МПО (рис. 3.43, б: 4, в: 2), при этом часть ЦП сохраняет исходную
подвижность. Когда МПО добавляли к ЛОНП или ЛНП, ее активность выявлялась в
зонах, соответствующих указанным липопротеинам (рис. 3.43, в: 4, 5), т.е. происходило
связывание МПО с липопротеинами. Взаимодействия ЛВП с МПО не наблюдали (рис.
3.43, в: 3). ЦП, добавленный к липопротеинам без МПО, с ними не связывался (рис. 3.43,
б: 2,3). В случае добавления к МПО и ЛНП (или ЛОНП) избытка ЦП, сравнивая
электрофореграммы, окрашенные на активность этих ферментов, можно увидеть, что
кроме свободного ЦП и комплекса ЦП-МПО данные пробы содержат комплексы ЛНПЦП-МПО (рис. 3.43, в: 6) и ЛОНП-МПО-ЦП (рис. 3.43, в: 7). Добавление антител против
апоВ-100 приводило к снижению интенсивности зоны, соответствующей комплексам
ЛОНП и ЛНП с ЦП и МПО (рис. 3.43, б, в: 8, 9), что свидетельствует об их диссоциации.
При этом заметно увеличивалась интенсивность зоны, соответствующей комплексу ЦПМПО. Эти эксперименты показали, что ЛНП и ЛОНП взаимодействуют с МПО, вероятно,
посредством апоВ-100, и при смешивании ЛНП/ЛОНП, МПО и ЦП происходит
154
формирование многокомпонентных комплексов, центральным звеном которых является
МПО.
Рис. 3.43. Электрофореграмма смеси ЦП (1 мкг), МПО (0,5 мкг), липопротеинов (4 мкг),
антител против апоВ-100 (5 мкг) после электрофореза в четырехслойном ПААГ. а).
окраска Кумасси R-250: 1 – ЛОНП, 2 – ЛНП, 3 – ЛВП; б) окраска o-DA: 1 – ЦП, 2 – ЦП +
ЛНП + ЛОНП, 3 – ЦП + ЛВП, 4 – ЦП + МПО, 5 – ЦП + МПО + ЛВП, 6 – ЦП + МПО +
ЛНП, 7 – ЦП + МПО + ЛОНП, 8 – ЦП + МПО + ЛНП + антитела против апоВ-100, 9 – ЦП
+ МПО + ЛОНП + антитела против апоВ-100; в) окраска 4-хлор-1-нафтолом и H2O2: 1 –
МПО, 2 – МПО + ЦП, 3 – МПО + ЛВП, 4 – МПО + ЛНП, 5 – МПО + ЛОНП, 6 – ЦП +
МПО + ЛНП, 7 – ЦП + МПО + ЛОНП, 8 – ЦП + МПО + ЛНП + антитела против апоВ100, 9 – ЦП + МПО + ЛОНП + антитела против апоВ-100.
155
В литературе имеются указания на то, что МПО связывается с частицами ЛВП
[Marsche et al., 2008]. Однако нам не удалось выявить этого взаимодействия методом
электрофореза. Коммерческие препараты МПО, которые использовались в большинстве
исследований, вследствие особенностей выделения могут содержать примесь катионного
детергента CTAB. Поэтому взаимодействие такой МПО с липопротеинами может быть
обусловлено именно CTAB. Мы проверили это предположение с помощью электрофореза
в агарозном геле. На рис. 3.44 видно, что очищенная МПО лишь немного смещается к
катоду, тогда как выделение МПО в присутствии CTAB (см. раздел 2.7.3.3) увеличивает
ее подвижность в направлении катода (дорожки 1 и 3). Присутствие в пробе ЛВП не
влияет на подвижность МПО, выделенной без применения СТАВ (дорожка 2). После
добавления
ЛВП
к
препарату
МПО,
содержащему
CTAB,
активность
МПО
обнаруживается в смещенной к аноду зоне (дорожка 4), подвижность которой характерна
для ЛВП (дорожка 5), т.е. формируется комплекс CTAB-МПО с ЛВП. Полученные
результаты свидетельствуют в пользу того, что с поверхностью нативных ЛВП не
связывается МПО, выделенная без применения СТАВ.
Рис. 3.44. Электрофореграмма после электрофореза смесей ЛВП с различными формами
МПО. Окраска на активность МПО (1-4) и на белок (5). 1 – МПО, 2 – МПО + ЛВП, 3 –
МПО-СТАВ, 4 – МПО-СТАВ + ЛВП, 5 – ЛВП.
В качестве альтернативного метода исследования взаимодействия МПО с ЦП и
липопротеинами мы использовали гель-фильтрацию на колонке с Сефакрилом S-300 (рис.
3.45).
156
Рис. 3.45. Содержание МПО (графики), ЦП (синие и голубые (без МПО) столбцы) и
общего белка во фракциях после гель-фильтрации смесей ЦП (10 мкг), МПО (0,5 мкг) без
липопротеинов (а) и с 20 мкг (ЛОПН – б, ЛНП – в, ЛВП – г) на колонке с Сефакрилом S300. Заштрихованный серый столбец и квадрат – общий белок и МПО (образец без ЦП),
светлый столбец и зеленый ромб – общий белок и МПО (образец содержал ЦП).
157
Результат разделения белков без добавления липопротеинов показан на первой панели
(рис. 3.45, а). По отдельности ЦП и МПО выходили в одинаковом объеме с
максимальным выходом во фракции 9. При совместном нанесении ЦП и МПО видно
достоверное смещение пиков, показывающих содержание МПО и ЦП, которое говорит о
формировании комплекса ЦП-МПО с меньшим объемом элюции. Данная смола не
позволяет полностью отделить комплекс ЦП-МПО от свободных белков. Нанесенная на
эту колонку вместе с ЛОНП или ЛНП (рис. 3.45, б, в), МПО делилась на два пика, первый
из которых содержал главным образом липопротеины (фракции 2–5), а второй
соответствовал свободной МПО (фракции 7–11). Связывания МПО с ЛВП этим методом
обнаружить не удалось (рис. 3.45, г). При гель-фильтрации смеси МПО с ЦП и
липопротеинами МПО также делилась на две части: происходило формирование
комплексов ЛОНП-МПО-ЦП (ЛНП-МПО-ЦП) и МПО-ЦП. Количество ЦП (синяя часть
столбцов) во фракциях, содержавших МПО и ЛНП (ЛОНП), было в 2 раза выше
количества МПО. ЦП, добавленный к липопротеинам без МПО, с ними не
взаимодействовал и элюировался с колонки во фракциях 8–10 (данные не приведены).
Рис. 3.46. Содержание ЦП и МПО во фракциях, полученных при гель-фильтрации 1 мл
плазмы крови с добавлением 5 мкг МПО на Суперозе 6. Во врезках – электрофореграммы
фракций (200 мкл), содержащих комплексы МПО, слева окраска на активность ЦП – oDA, справа окраска на активность МПО – 4-хлор-1-нафтолом и H2O2.
Мы
проверили,
препятствуют
ли
взаимодействию
МПО
с
липопротеинами
компоненты плазмы крови. При гель-фильтрации плазмы крови здорового донора на
158
Суперозе 6 нам не удалось выявить МПО во фракциях даже при помощи
высокочувствительного ELISA. Поэтому в образец плазмы (1 мл) была добавлена МПО (5
мкг). В результате гель-фильтрации МПО практически поровну разделилась между
высокомолекулярной фракцией 2 и фракциями 9–12, которые также содержали ЦП (рис.
3.46). По данным электрофореза с окраской на активности ЦП и МПО видно, что в
первом пике присутствуют комплексы ЛОНП-МПО-ЦП и ЛНП-МПО-ЦП, а во втором –
комплекс ЦП-МПО и несвязанный ЦП (рис. 3.46, врезки).
Таблица 3.17
Результаты определения диаметров (d, M± ) белков и их комплексов методом ФКС
Смесь/белок (число определений)
d, нм
d, нм (данные литературы)
ЦП (12)
7,4 ± 0,8
7,2
МПО (12)
7,8 ± 1,2
7,6
ЦП-МПО (12)
9,8 ± 1,4
–
ЛНП (15)
23,0 ± 1,4
25 ± 2,5
ЛНП+ЦП (10)
15,8 ± 5,8
–
ЛНП+МПО (15)
28,0 ± 1,9
–
ЛНП+МПО+ЦП (15)
29,0 ± 1,7
–
ЛВП (15)
10,7 ± 2,0
9 ± 1,5
ЛВП+ЦП (10)
8,8 ± 4,8
–
ЛВП+МПО (10)
9,0 ± 3,9
–
ЛВП+МПО+ЦП (10)
8,9 ± 4,7
–
ЛОНП (12)
46,5 ± 7,6
50 ± 10
7,5 ± 0,9 и 46,2 ± 8,3
–
ЛОНП+МПО (12)
85,9 ± 8,9
–
ЛОНП+МПО+ЦП (12)
129,0 ± 9,7
–
ЛОНП+ЦП (10)
С помощью ФКС мы определили диаметры отдельных белков (ЦП, МПО) и
липопротеинов
(ЛНП,
ЛВП,
ЛОНП),
а
также
составленных
ими
двух-
и
трехкомпонентных комплексов. Результаты измерения суммированы в таблице 3.17. Об
образовании комплекса можно было судить по увеличению регистрируемого диаметра
частиц при смешивании компонентов, например 9,8 ± 1,4 нм для ЦП-МПО, по сравнению
с 7,4 ± 0,8 нм для ЦП и 7,8 ± 1,2 нм для МПО. Если компоненты не взаимодействовали, то
измеряемые значения были близки к среднему между диаметрами белков, а значения
отклонения от среднего превышали 30 %, например 7,8 ± 1,2 нм для МПО, 10,7 ± 2,0 нм
159
для ЛВП и 9,0 ± 3,9 нм для смеси МПО и ЛВП. В случае значительного различия
диаметров невзаимодействующих частиц удавалось по отдельности зарегистрировать
значения (см. ЦП и ЛОНП). Таким образом, мы подтвердили взаимодействие МПО с ЦП
и апоВ-100-содержащими липопротеинами в растворе и определили диаметры
комплексов ЛОНП-МПО, ЛОНП-МПО-ЦП, ЛНП-МПО и ЛНП-МПО-ЦП.
Взаимодействуя с липопротеинами, МПО вызывает их окислительную модификацию.
Однако известно, что ЦП может ингибировать пероксидазную активность МПО. Мы
проверили, сохраняет ли ЦП способность ингибировать окисление под действием МПО
хромогенных субстратов (ABTS и TMB) в составе многокомпонентных комплексов с
липопротеинами. Результаты кинетических измерений, представленные в координатах
Хейнса, во всех случаях имели вид линейной зависимости с R2 > 0,99 (рис. 3.47 и 3.48).
Значения кинетических параметров (KМ и Vmax), вычисленные по полученным графикам,
суммированы в таблицах 3.18 и 3.19.
Скорость катализируемого МПО окисления ABTS и TMB не изменялась при
добавлении липопротеинов в реакционную смесь. Зеленые и красные пунктирные прямые
на рис. 3.47 и 3.48 практически совпадают. Это означает, что липопротеины в
использованной нами концентрации (0,65 нМ ЛОНП, 0,68 нМ ЛНП, 3,4 нМ ЛВП) не
влияли на пероксидазную активность МПО. Как мы показывали и ранее [Соколов, 2007],
ингибирование активности МПО в присутствии ЦП носит конкурентный характер (см.
зеленые и синие прямые на рис. 3.47 и 3.48), поскольку KM повышается, а Vmax остается
неизменной (см. таблицы 3.18 и 3.19). Однако в присутствии ЛОНП или ЛНП
ингибирующий
эффект
ЦП
изменялся:
фиолетовые
прямые
соответствуют
неассоциативному ингибированию активности МПО, которую описывают зеленые
прямые (рис. 3.47 и 3.48), поскольку уменьшаются и Vmax, и KM (см. таблицы 3.18 и 3.19).
Добавление ЛВП не влияло на осуществляемое ЦП ингибирование пероксидазной
активности МПО.
Сравнивая полученные значения кинетических параметров, можно заключить, что
апоВ-100-содержащие липопротеины главным образом повышают аффинность ЦП к
активному центру МПО. Действительно, в случае окисления ABTS системой,
содержащей МПО и ЦП, при добавлении ЛОНП происходило снижение KM в 3 раза (с
2,58 до 0,88 нМ), а при добавлении ЛНП – более чем в 5 раз (до 0,48 нМ). Одновременно
наблюдалось снижение Vmax в 2 и 3 раза в случае ЛОНП и ЛНП соответственно (таблица
3.18). Для другого субстрата, TMB, в присутствии липопротеинов KM и Vmax также
снижались (таблица 3.19).
160
Таблица 3.18
Изменение кинетических параметров катализируемого МПО окисления ABTS в
присутствии ЦП и липопротеинов
Смесь
КМ, мМ
Vmax,
A414/мин
Ki ЦП,
Ki липопротеинов, нМ
нМ
МПО
0,99 ± 0,06
1,32 ± 0,08
–
–
МПО + ЛОНП
1,09 ± 0,05
1,41 ± 0,07
–
–
МПО + ЛНП
1,12 ± 0,05
1,44 ± 0,07
–
–
МПО + ЛВП
1,06 ± 0,06
1,39 ± 0,08
–
–
МПО + ЦП
2,58 ± 0,06
1,44 ± 0,07
310 ± 30
–
МПО + ЦП + ЛОНП
0,88 ± 0,05
0,68 ± 0,07
530 ± 40
0,33 ± 0,03
МПО + ЦП + ЛНП
0,48 ± 0,05
0,45 ± 0,06
390 ± 30
0,15 ± 0,02
МПО + ЦП + ЛВП
2,58 ± 0,06
1,44 ± 0,07
–
–
Таблица 3.19
Изменение кинетических параметров катализируемого МПО окисления TMB в
присутствии ЦП и липопротеинов
Смесь
КМ, мкМ
Vmax,
A650/мин
Ki ЦП,
Ki липопротеинов, нМ
нМ
МПО
217 ± 15
0,636 ± 0,021
–
–
МПО + ЛОНП
232 ± 17
0,659 ± 0,031
–
–
МПО + ЛНП
199 ± 20
0,614 ± 0,039
–
–
МПО + ЛВП
237 ± 19
0,665 ± 0,043
–
–
МПО + ЦП
522 ± 16
0,636 ± 0,035
210 ± 20
–
МПО + ЦП + ЛОНП
159 ± 20
0,299 ± 0,029
770 ± 30
0,28 ± 0,03
МПО + ЦП + ЛНП
81 ± 25
0,232 ± 0,046
280 ± 20
0,12 ± 0,02
МПО + ЦП + ЛВП
491 ± 23
0,615 ± 0,028
–
–
Основным результатом этих измерений стал расчет констант ингибирования (Ki),
характеризующих снижение активности МПО в отношении двух субстратов под
действием ЦП в отсутствие липопротеинов и в присутствии ЛОНП и ЛНП. Добавление
липопротеинов приводит к повышению Ki (таблицы 3.18 и 3.19), показывая, что апоВ100-содержащие липопротеины снижают способность ЦП ингибировать МПО.
161
Рис. 3.47. Графики в координатах Хейнса–Вольфа влияния липопротеинов и ЦП на
кинетику катализируемого МПО окисления ABTS. Смесь: 5 нМ МПО, 100 мкМ H2O2,
ABTS (0,4–1,4 мМ) в 0,1 M Na-фосфатном буфере, pH 6,0, добавление 0,5 мкМ ЦП и/или
0,5 мкг/мл липопротеинов.
162
Рис. 3.48. Графики в координатах Хейнса–Вольфа влияния липопротеинов и ЦП на
кинетику катализируемого МПО окисления TMB. Смесь: 10 нМ МПО, 100 мкМ H2O2,
TMB (100–500 мкМ) в 0,1 M Na-фосфатном буфере, pH 7,4, добавление 0,5 мкМ ЦП и/или
0,5 мкг/мл липопротеинов.
163
Вычисленные нами также Ki для ЛОНП (0,3 нМ) и для ЛНП (0,14 нМ) описывают
влияние этих липопротеинов на ингибирующее действие ЦП и позволяют оценить
аффинность липопротеинов к МПО (таблицы 3.18 и 3.19).
Для выявления природы сил, ответственных за взаимодействие МПО с ЛНП, мы
использовали метод аффинной хроматографии. На Сефарозе иммобилизовали МПО и
проводили сорбцию ЛНП, используя PBS в качестве элюента. В этих условиях на колонку
с 5 мг иммобилизованной МПО сорбировалось около 0,5 мг апоВ-100. Далее проводили
элюцию ЛНП ступенчатым градиентом NaCl или рН, затем анализировали содержание
белка во фракциях. Профили элюции приведены на рис. 3.49. Видно, что практически
весь белок выходит при ионной силе 0,3 М NaCl и при рН ниже 3,6. Оба факта
свидетельствуют о том, что связывание МПО с ЛНП происходит главным образом за счет
электростатических взаимодействий.
Рис. 3.49. Профили содержания ЛНП (белок, мг/мл) при элюции ступенчатыми
градиентами (а) NaCl (150–450 мМ) и (б) pH (7,4–3,2) с МПО-Сефарозы.
164
Поверхностный заряд ЛНП определяется как фосфатидными группами фосфолипидов,
так и а. о. апоВ-100, экспонированными на поверхности частицы ЛНП. Поскольку ЛНП
вытеснялись из комплекса с МПО в присутствии антител против апоВ-100, было
выдвинуто предположение, что именно апоВ-100 образует контакт с МПО. На
поверхности каждой частицы ЛНП присутствует одна молекула апоВ-100. С целью
выявления возможного сайта на апоВ-100 для МПО был проведен скрининг анионных
кластеров в первичной последовательности апоВ-100. При скрининге учитывалось как
наличие нескольких карбоксиаминокислот (E, D), так и отсутствие в их окружении
положительно заряженных остатков (R, K). Было выбрано три участка (1EEEMLEN7,
53
VELEVPQ59 и
445
EQIQDDCTGDED456) и синтезированы соответствующие пептиды. В
условиях электрофореза при добавлении синтетических пептидов к комплексу ЛНП с
МПО только пептид 445–456 (P445–456) вытеснил МПО (рис. 3.50).
Рис. 3.50. Электрофореграмма после диск-электрофореза в ПААГ смесей ЛНП (4 мкг),
МПО (0,2 мкг), окраска 4-хлор-1-нафтолом и H2O2: 1 – ЛНП+МПО, 2 – 1 + 0,5 мкг
пептида EEEMLEN, 3 – 1 + 0,5 мкг пептида VELEVPQ, 4 – 1+ 0,3 мкг пептида
EQIQDDCTGDED (P445–456), 5 – 1 + 1 мкг антител против апоВ-100, 6 – МПО.
Дополнительные
исследования
показали,
что
данный
пептид
специфически
взаимодействует с МПО в условиях гель-фильтрации на колонке с Сефакрилом S-200 HR
(данные не приводятся), т.е. пептид конкурирует с ЛНП за счет связывания с МПО, а не с
ЛНП.
165
3.6.2. Проатерогенное действие миелопероксидазы при связывании с липопротеинами
3.6.2.1. Сродство миелопероксидазы к модифицированным липопротеинам
Для оценки сродства МПО к липопротеинам мы исследовали их влияние на
кинетические параметры ингибирования ЦП пероксидазной активности МПО в
отношении хромогенных субстратов. Данный подход не требует иммобилизации
взаимодействующих
компонентов
на
твердой
фазе
и
позволяет
исследовать
взаимодействие МПО с ЛНП в присутствии ее физиологического ингибитора. ЛНП
модифицировали, инкубируя их в присутствии HOCl, HOBr или функционирующей МПО
(системы МПО/Н2О2/Clˉ или Brˉ). В таблице 3.20 суммированы данные о влиянии ЛНП на
KM и Vmax МПО в присутствии ЦП.
Таблица 3.20
Кинетические параметры МПО-катализируемого окисления TMB в присутствии
ЦП и ЛНП
Смесь
KM,
Vmax,
Ki(ЦП),
мкМ
A650/мин
нМ
МПО
258 ± 12
0,833 ± 0,020
–
–
МПО + ЦП
479 ± 14
0,812 ± 0,017
233 ± 16
–
МПО + ЛНП
236 ± 16
0,808 ± 0,014
–
–
70 ± 3
0,353 ± 0,015
84 ± 7
0,21 ± 0,02
МПО + ЦП + ЛНП + P445-456
490 ± 15
0,822 ± 0,015
222 ± 14
–
МПО + ЛНП/HOCl
219 ± 12
0,795 ± 0,017
–
–
МПО + ЛНП/HOBr
234 ± 13
0,818 ± 0,016
–
–
МПО + ЛНП/МПО/H2O2/Clˉ
242 ± 11
0,825 ± 0,016
–
–
МПО + ЛНП/МПО/H2O2/Brˉ
235 ± 12
0,817 ± 0,016
–
–
МПО + ЦП + ЛНП/HOCl
69 ± 4
0,353 ± 0,012
84 ± 6
0,21 ± 0,02
МПО + ЦП + ЛНП/HOBr
70 ± 2
0,353 ± 0,012
84 ± 6
0,21 ± 0,01
МПО + ЦП + ЛНП/МПО/H2O2/Clˉ
68 ± 3
0,356 ± 0,011
84 ± 7
0,21 ± 0,02
МПО + ЦП + ЛНП/МПО/H2O2/Brˉ
70 ± 2
0,354 ± 0,012
84 ± 7
0,21 ± 0,02
МПО + ЦП + ЛНП
Ki(ЛНП), нМ
В контрольных опытах мы показали, что как немодифицированные ЛНП, так и все
виды модифицированных ЛНП не ингибировали активность МПО без ЦП. Эффект
нативных ЛНП и модифицированных ЛНП на ингибирование ЦП активности МПО также
не отличался, все они приводили к уменьшению KM и повышению Vmax. Для всех форм
ЛНП Ki была близка к 0,2 нМ. Таким образом, модификация ЛНП после инкубации с
HOCl и HOBr, а также системами МПО/H2O2/Clˉ(Brˉ) не влияла на их сродство к МПО.
166
Интересно, что пептид P445–456, разобщающий взаимодействие МПО с ЛНП, полностью
препятствовал влиянию ЛНП на ингибирование ЦП активности МПО, что подтверждает
адекватность оценки сродства ЛНП к МПО с помощью данного метода.
3.6.2.2. Проатерогенные свойства модифицированных липопротеинов
Моноциты,
выделенные
из
периферической
крови,
инкубировали
с
ЛНП,
модифицированными в различных условиях, и измеряли накопление холестерина и его
эфиров в клетках. Для оценки влияния взаимодействия МПО с ЛНП на накопление
внутриклеточного холестерина использовали параллельные пробы, содержащие пептид
P445–456 (EQIQDDCTGDED), разобщающий взаимодействие МПО с ЛНП. Несмотря на
то, что модифицированные и интактные ЛНП не отличались по сродству к МПО (таблица
3.20), можно было предположить, что влияние P445–456 на проатерогенные свойства
ЛНП, модифицированных окислителями, будет обусловлено перехватом HOCl с
помощью остатка C, являющегося наиболее предпочтительной мишенью среди
аминокислотных остатков в этом пептиде. Для проверки этой гипотезы мы выбрали
другой анионный цистеин-содержащий пептид из апоВ-100: 1EEEMLENVSLVCPKD15
(P1–15). В условиях электрофореза P445–456, как интактный, так и окисленный HOCl
(1:2, моль/моль), вытеснял МПО из комплекса с ЛНП. Напротив, P1–15 не обладал
способностью вытеснять МПО из комплекса с ЛНП (данные не приведены). В условиях
гель-фильтрации при элюции смеси пептидов и МПО вне зависимости от окисления
HOCl P445–456 взаимодействовал с МПО, а P1–15 элюировался с колонки с Сефакрилом
S-200 HR позже МПО (данные не приведены).
Мы
сравнили
зависимость
моноцитами/макрофагами
от
поглощения
концентрации
холестерина
интактных
P1–15
и
и
его
эфиров
P445–456
(и
предварительно модифицированных под действием HOCl), присутствующих в среде при
инкубировании ЛНП с системой МПО/H2O2/Cl- (рис. 3.51). Из графиков видно, что
поглощение холестерина и его эфиров не зависит от добавления P1–15, а пептид P445–
456 препятствует захвату холестерина дозозависимо. Окисление P445–456 с помощью
HOCl не повлияло на его способность препятствовать МПО-зависимой проатерогенной
модификации ЛНП. В дальнейшем для анализа влияния МПО, ЦП, ЦПпр и других
модуляторов активности МПО на проатерогенность ЛНП в качестве контрольного
образца, разобщающего взаимодействие с МПО, использовали 80 нМ пептида P445–456.
Немодифицированные ЛНП сами по себе, а также в присутствии МПО, ЦП или ЦПпр
(данные не приведены) не вызвали накопления холестерина и его эфиров. В то же время
ЛНП, модифицированные HOCl либо HOBr, приводили к достоверному накоплению
холестерина и его эфиров в клетках (рис. 3.52 и 3.53).
167
Рис. 3.51. Влияние нативных и HOCl-модифицированных пептидов P1–15 и P445–456 (0–
80 нМ) на накопление холестерина (а) и его эфиров (б) моноцитами/макрофагами,
инкубированными 12 и 72 часа с ЛНП, предварительно модифицированными системой
МПО/H2O2/Clˉ. Данные представлены как среднее и доверительный интервал (
0,05).
Однако ЛНП, модифицированные системами МПО/H2O2/Clˉ или МПО/H2O2/Brˉ,
вызывали в 4 и 7 раз большее накопление холестерина и его эфиров клетками
соответственно. Разобщение взаимодействия МПО с ЛНП (модификация в присутствии
P445–456) снимало эффект накопления холестерина клетками, так что, по сравнению с
ЛНП, модифицированными HOCl и HOBr, ЛНП, модифицированные функционирующей
168
МПО с разобщением взаимодействия, вызывали увеличение накопления холестерина
лишь в 2 и 1,5 раза соответственно.
Рис.
3.52.
Влияние
P445–456
(80
нМ)
на
накопление
холестерина
моноцитами/макрофагами, инкубированными 12 и 72 часа с нативными или
модифицированными ЛНП (40 нМ). ЛНП предварительно модифицировали, инкубируя
их в течение 30 мин в присутствии HOCl, HOBr, МПО/H2O2/Clˉ, МПО/H2O2/Brˉ или
МПО/H2O2/SCNˉ, добавляя в ряд проб ингибиторы или модуляторы активности МПО:
ABAH (5 мкМ), ЦП (6 мкМ), ЦПпр (6 мкМ), SCNˉ (200 мкМ). Контроль – инкубация
клеток без ЛНП. Данные представлены как среднее и доверительный интервал (
0,05).
Тиоцианат (SCNˉ) является субстратом галогенирующего цикла МПО. Фермент
катализирует его превращение в относительно слабый окислитель HOSCN [van Dalen et
al., 1997]. Видно, что ЛНП, модифицированные в присутствии системы МПО/H2O2/SCNˉ,
не приводили к накоплению клетками ни холестерина, ни его эфиров. Конкурируя с
Clˉ/Brˉ, SCNˉ способен изменять галогенирующую активность МПО, снижая или
предотвращая выход HOCl/HOBr. Действительно, ЛНП, модифицированные системами
МПО/H2O2/Clˉ(Brˉ) в присутствии SCNˉ, не вызывали накопления холестерина и его
эфиров моноцитами/макрофагами. Пептид P445–456, разобщающий взаимодействие
МПО и ЛНП, практически не влиял на антиатерогенные эффекты SCNˉ (рис. 3.52, 3.53).
Синтетический ингибитор активности МПО, ABAH, действовал аналогично SCNˉ, а
169
именно: ЛНП, обработанные системами МПО/H2O2/Clˉ(Brˉ) в присутствии ABAH, не
вызывали накопления холестерина и его эфиров клетками (рис. 3.52, 3.53).
Рис. 3.53. Влияние P445–456 (80 нМ) на накопление эфиров холестерина
моноцитами/макрофагами, инкубированными 12 и 72 часа с нативными или
модифицированными ЛНП (40 нМ). ЛНП предварительно модифицировали, инкубируя
их в течение 30 мин в присутствии HOCl, HOBr, МПО/H2O2/Clˉ, МПО/H2O2/Brˉ или
МПО/H2O2/SCNˉ, добавляя в ряд проб ингибиторы или модуляторы активности МПО:
ABAH (5 мкМ), ЦП (6 мкМ), ЦПпр (6 мкМ), SCNˉ (200 мкМ). Контроль – инкубация
клеток без ЛНП. Данные представлены как среднее и доверительный интервал (
0,05).
Добавление ЦП в концентрации 6 мкМ к ЛНП при модификации системой
МПО/H2O2/Clˉ снижало накопление внутриклеточного холестерина и его эфиров на 62 %,
но не снижало уровня накопления холестерина, если ЛНП были модифицированы
бромид-содержащей системой (МПО/H2O2/Brˉ) (рис. 3.52, 3.53). Добавление ЦПпр не
повлияло на проатерогенные свойства МПО, свидетельствуя в пользу того, что снижение
накопления холестерина и его эфиров в присутствии ЦП обусловлено ингибированием
активности МПО.
Известно, что ЛНП, модифицированные HOCl, стимулируют респираторный взрыв
моноцитоподобных линий клеток THP-1 и U937, дифференцируемых в макрофаги
[Nguyen-Khoa et al., 1999]. Мы предположили возможность секреции МПО моноцитами
170
крови человека, дифференцирующимися в макрофаги, в ответ на присутствие
модифицированных
ЛНП
с
последующим
ее
эндоцитозом
из
среды
моноцитами/макрофагами в комплексе ЛНП-МПО. Для проверки этого предположения
мы методом твердофазного иммуноферментного анализа измерили концентрацию МПО в
среде после инкубации ЛНП с клетками. Как видно из рис. 3.54, при инкубации
модифицированных ЛНП с моноцитами/макрофагами в течение первых 12 часов
происходит секреция МПО во внеклеточное пространство.
Однако через 72 часа концентрация МПО вне клетки снижается практически до уровня
контроля (рис. 3.54), что сопровождается накоплением холестерина и его эфиров в
клетках (рис. 3.52, 3.53). Учитывая этот факт, можно предположить, что исчезновение
МПО происходит вместе с захватом частиц ЛНП моноцитами/макрофагами. Более того,
тот факт, что P445–456 через 72 часа существенно препятствовал понижению уровня
МПО во внеклеточной среде, позволяет заключить, что хотя бы частично исчезновение
МПО из среды было связано с совместным захватом клетками ЛНП и МПО в составе
комплекса ЛНП-МПО.
Следует
отметить,
что
добавление
P445–456
к
ЛНП,
инкубированным
c
функционирующей МПО, приводило к тому, что такие ЛНП мало отличались от ЛНП,
модифицированных HOCl или HOBr, по способности стимулировать аккумуляцию
холестерина или секрецию МПО моноцитами/макрофагами. Таким образом, с одной
стороны, взаимодействие ЛНП с функционирующей МПО (образование комплекса ЛНПМПО) служило дополнительным стимулом к экзоцитозу МПО из клеток. С другой
стороны, через 72 часа уровень секретируемой МПО существенно снижался в случае
присутствия модифицированных ЛНП, в отличие от проб с P445–456. Таким образом,
разобщение взаимодействия МПО с ЛНП препятствовало эндоцитозу МПО.
Исследование влияния SCNˉ и ABAH на секрецию МПО и захват модифицированных
ЛНП моноцитами/макрофагами показало, что само присутствие ABAH и SCNˉ
практически не влияло на секрецию МПО (данные не приведены). Однако добавление
SCNˉ в среду в качестве субстрата в период модификации ЛНП системой
МПО/H2O2/SCNˉ или же присутствие SCNˉ при модификации ЛНП системами
МПО/H2O2/Clˉ/Brˉ практически не приводило к дополнительному выходу МПО (рис.
3.54) и захвату клетками холестерина и его эфиров (рис. 3.52, 3.53).
171
Рис. 3.54. Влияние P445–456 (80 нМ) на концентрацию МПО в среде с
моноцитами/макрофагами, инкубированными 12 и 72 часа с нативными или
модифицированными ЛНП (40 нМ). ЛНП предварительно модифицировали, инкубируя
их в течение 30 мин в присутствии HOCl, HOBr, МПО/H2O2/Clˉ, МПО/H2O2/Brˉ или
МПО/H2O2/SCNˉ, добавляя в ряд проб ингибиторы или модуляторы активности МПО:
ABAH (5 мкМ), ЦП (6 мкМ), ЦПпр (6 мкМ), SCNˉ (200 мкМ). Контроль – инкубация
клеток без ЛНП. Данные представлены как среднее и доверительный интервал (
0,05).
Примечательно, что интактный ЦП, в отличие от ЦПпр, который не ингибирует
активность МПО, снижал выход МПО в случае ЛНП, модифицированных хлорирующей
МПО. В случае бромирования неэффективными были обе формы ЦП, что согласуется с
данными о неэффективности ЦП как ингибитора бромирующей активности МПО (рис.
3.15, в, таблица 3.9).
Полученные результаты свидетельствуют в пользу возможности образования in vivo
комплексов, содержащих ЦП, МПО и ЛНП/ЛОНП. Ингибирование галогенирующей
активности МПО с помощью ЦП, ABAH и тиоцианата, а также разобщение ее
взаимодействия с ЛНП с помощью P445–456 снижают проатерогенные свойства МПО в
отношении ЛНП.
172
3.7. Антиоксидантные свойства ЦП, модифицированного окислителями
Мы обнаружили, что ЦП является неэффективным ингибитором активности МПО и
ЭПО в отношении бромида и тиоцианата, хотя последний показал себя как эффективный
протектор ЦП (рис. 3.19). Поскольку нельзя однозначно исключить возможность реакции
ЦП с окислителями, образующимися в очаге воспаления в ходе функционирования MПO,
а именно: HOCl, HOBr и HOSCN, было решено исследовать влияние этих окислителей на
антиоксидантные свойства ЦП.
При взаимодействии ЦП с HOCl, HOBr и HOSCN происходило постепенное снижение
поглощения при 610 нм, характерного для ионов меди I типа (рис. 3.55).
Рис. 3.55. Спектры поглощения ЦП (50 мкМ) после добавления HOCl, HOBr и HOSCN
(0–600 мкМ). Длина оптического пути 1 см.
Активность ЦП в отношении Fe2+ и p-PD снизилась по мере увеличения избытка HOCl
и HOBr, но не HOSCN, однако, SOD активность модифицированного ЦП даже несколько
выросла по сравнению с немодифицированным белком (рис. 3.56).
В
целом
изменение
оксидазных
свойств
ЦП
можно
объяснить
тем,
что
предпочтительной мишенью для использованных окислителей являются остатки
цистеина и метионина. Именно они участвуют в координации ионов меди I типа,
необходимых для окисления Fe2+ и p-PD. Часть дисульфидных связей ЦП была окислена,
что вызывало изменение его электрофоретической подвижности (рис. 3.19). В то же
время для проявления SOD активности ЦП достаточно лишь части его каталитического
центра, а именно ионов меди II и III типа, лигандами для которых являются остатки
гистидина.
173
Рис. 3.56. Влияние модификации ЦП (50 мкМ) HOCl, HOBr и HOSCN на его (а)
ферроксидазную, (б) p-PD-оксидазную и (в) SOD активности. Данные представлены как
среднее и доверительный интервал ( = 0,05).
174
Не исключено, что увеличение SOD активности окисленного ЦП вызвано тем, что
свойства ионов меди I типа после окисления остатков цистеина и метионина становятся
близки к ионам меди II и III типа. Ингибирование пероксидазной активности МПО
модифицированными формами ЦП показало, что обработка HOCl и HOSCN не влияет на
ингибирующую активность ЦП, тогда как модификация HOBr снижает этот вид
антиоксидантной активности ЦП (таблица 3.21).
Учитывая,
что
способность
пептида
ЦП
(883RPYLKVFNPR892)
ингибировать
пероксидазную активность МПО снижалась при обработке HOBr и HOCl, но не HOSCN,
можно предположить, что бромирование и хлорирование затрагивает значимый для
взаимодействия с активным центром МПО аминокислотный остаток. На роль такого
остатка претендует Y885.
Таблица 3.21
Значения IC50 (нМ) для ингибирования пероксидазной активности МПО в
отношении ABTS пептидом ЦП (883–892) и ЦП, в том числе после модификации
пептида 4-молярным и ЦП 20-молярным избытком HOCl, HOBr либо HOSCN
Ингибитор МПО
Без модификации
HOCl
HOBr
HOSCN
ЦП
Пептид ЦП (883–892)
38 ± 6
650 ± 40
840 ± 60
49 ± 13
158 ± 14
920 ± 60
1260 ± 80
186 ± 18
При оценке продукции АФК – супероксидного анион-радикала и пероксида водорода –
активированными НФ оказалось, что вне зависимости от типа окислителя ЦП сохраняет
способность ингибировать респираторный взрыв НФ (таблица 3.22).
Таблица 3.22
Значения IC50 (мкг/мл) для ингибирования церулоплазмином продукции
нейтрофилами АФК, в том числе после модификации 20-молярным избытком HOCl,
HOBr либо HOSCN
Продуцируемый АФК
Без модификации
HOCl
HOBr
HOSCN
Супероксидный анион-
2,24 ± 0,09
1,61 ± 0,07
1,73 ± 0,06
1,29 ± 0,11
124 ± 19
88 ± 11
72 ± 9
64 ± 8
радикал
Пероксид водорода
Для доказательства того, что ЦП влияет на продукцию пероксида водорода только
снаружи клеток, мы отмывали PBS суспензию НФ от внесенного в нее ЦП, после чего
добавляли активатор fMLP. Достоверных различий в графиках снижения уровня
флуоресценции скополетина контрольной и «отмытой» суспензий НФ не наблюдалось
(рис. 3.57, в), что позволяет говорить о том, что ЦП влиял только на внеклеточную
продукцию пероксида водорода. Была обнаружена отрицательная корреляционная связь
175
(r = –0,92) между концентрацией ЦП в образцах сыворотки, полученной от здоровых
доноров и пациентов с болезнью Вильсона–Коновалова, и скоростью продукции
пероксида водорода НФ, полученных из крови здоровых доноров, при добавке этих
образцов сыворотки к клеткам до активации (рис. 3.57, г).
Рис. 3.57. Исследование влияния ЦП на продукцию НФ пероксида водорода. а) Уровень
флуоресценции скополетина до и после внесения в суспензию НФ 100 нМ fMLP в
присутствии 2 мкМ ЦП и без него (контроль). б) Уровень продукции H2O2 в суспензии
клеток в отсутствие ЦП и при различных его концентрациях в системе. Данные
представлены как среднее и доверительный интервал (
0,05). в) Уровень
флуоресценции скополетина после «отмывки» суспензии НФ от предварительно
внесенного в нее ЦП с помощью PBS c последующей активацией 100 нМ fMLP. г)
Зависимость скорости продукции нейтрофилами H2O2 при добавлении сыворотки от
концентрации ЦП (мкМ) в этой сыворотке.
При добавлении Cu,Zn-SOD к суспензии НФ вместе с fMLP наблюдалось значительное
увеличение скорости
окисления скополетина (рис. 3.58). Это может служить
подтверждением того, что при добавлении fMLP запускается респираторный взрыв НФ и
176
образуется O2•, который в дальнейшем дисмутирует в H2O2. Этот процесс практически
полностью ингибировался ЦП в дозе 300 мкг/мл (2 мкМ).
Рис. 3.58. Сравнение влияния ЦП (300 мкг/мл) и Cu,Zn-SOD (25 мкг/мл) на продукцию
пероксида водорода НФ, активированными fMLP (100 нМ). Показаны результаты для
двух независимых опытов выделения клеток.
Необходимо отметить, что, в отличие от действия Cu,Zn-SOD, при добавлении ЦП
пероксид водорода в системе практически не образовывался, что свидетельствует о том,
что в основе SOD активности ЦП лежит не дисмутирование O2• до пероксида водорода, а
его окисление до воды.
Полученные результаты свидетельствуют в пользу способности ЦП снижать
образование O2• и H2O2 активированными НФ. В основе этого эффекта лежит SODподобная активность ЦП, которая не снижается при действии активных форм галогенов,
продуцируемых МПО. Хотя ЦП и его пептид (883–892) теряют способность
ингибировать активность МПО после обработки HOCl и HOBr, влияние ЦП на
продукцию субстратов МПО активированными НФ препятствует проявлению ее
активности. Наконец, корреляция между концентрацией ЦП в образцах сыворотки крови
и скоростью продукции НФ пероксида водорода в присутствии образцов сыворотки
свидетельствует в пользу участия ЦП в сдерживании респираторного взрыва НФ в
кровяном русле.
177
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Проведенные
исследования
прояснили
общие
закономерности
образования
комплексов ЦП с белками лейкоцитов. Кроме обнаруженных нами ранее партнеров ЦП:
лактоферрина (ЛФ), миелопероксидазы (МПО), серпроцидинов (эластаза (NE), катепсин
G (CG), протеиназа 3 (PR3) и азуроцидин (CAP37)), впервые было обнаружено
взаимодействие ЦП с 5-липоксигеназой (5-LO) и пероксидазой эозинофилов (ЭПО).
Независимо были обнаружены комплексы ЦП с матриксными металлопротеиназами
(ММП-2 и ММП-12) и тромбином (FIIa). При аффинной хроматографии экстракта
лейкоцитов на ЦП-Сефарозе партнеры ЦП элюировались при повышении ионной силы
элюирующего раствора (1 M NaCl). Таким образом, комплексообразование ЦП с данными
белками обеспечивается электростатическими взаимодействиями. Тот факт, что с одной
молекулой ЦП связывается 6–7 молекул нейропептида PACAP 38 [Tams et al., 1999] и 6
молекул
ПР
[Соколов
и
соавт.,
2005],
говорит
о
возможности
образования
многокомпонентных комплексов ЦП с катионными белками лейкоцитов. Действительно,
нами были обнаружены комплексы, включающие ЦП, ЛФ и МПО, показано образование
комплекса ЦП-ЛФ-CAP37 [Соколов и соавт., 2010]. За счет поливалентности МПО
формируются комплексы, содержащие ЦП, МПО и апоВ-100-содержащие липопротеины
(ЛНП и ЛОНП) [Sokolov et al., 2010]. Несмотря на определенную стереотипность
образования комплексов ЦП с катионными белками лейкоцитов, использование ряда
методов (анализ влияния партнеров на кинетические параметры реакций, катализируемых
ЦП; использование конкурентных пептидов; исследование трехмерной структуры
комплексов) позволило различить, по крайней мере, два центра связывания ЦП с
катионными белками. Связывание ЦП с ЛФ (и с ПР) в области 1-го и 6-го доменов влияет
на трехъядерный центр ЦП и активирует окисление Fe2+ [Соколов, 2007]. FIIa,
связывающийся вблизи сайта связывания Fe2+, ингибирует ферроксидазную активность
ЦП, конкурируя с субстратом.
Связывание МПО, ЭПО и серпроцидинов (либо
низкоаффинное связывание второй молекулы ЛФ) в области 4-го домена ЦП влияет на
окисление p-PD из-за близости к сайту связывания этого субстрата, при этом
серпроцидины ингибируют p-PD-оксидазную активность ЦП, а МПО и ЭПО ее
активируют. Следует отметить, что аффинность связывания ЛФ и CAP37 в различных
сайтах на ЦП характеризуется практически одинаковыми значениями Kd ~ 13 нМ
[Sokolov et al., 2009; Соколов и соавт., 2010].
Нами были установлены стехиометрические соотношения компонентов в комплексах,
формируемых ЦП, ЛФ и МПО, которые согласуются с трехмерными моделями данных
комплексов, полученных на основании рентгеноструктурного анализа (2ЦП-МПО) и
178
метода SAXS (ЦП-ЛФ, 2ЦП-2ЛФ-МПО). Структурные исследования комплексов ЦП с
ЛФ и МПО показывают, что данные белки взаимодействуют в соотношении
2ЦП:2ЛФ:МПО (рис. 4.1).
Рис. 4.1. Общий вид комплекса 2ЦП-2ЛФ-МПО по данным SAXS [Samygina et al., 2013].
а) Модель твердого тела, в которой димер МПО выделен зеленым, ЦП – красным, ЛФ –
синим, места присоединения углеводов обозначены цветными сферами. Нижняя часть
рисунка – результат поворота на 90° вдоль горизонтальной оси. Серыми
полупрозрачными сферами ab initio показан тройной комплекс сверху и комплекс ЦП-ЛФ
снизу справа. б) Вид комплекса 2ЦП-2ЛФ-МПО, в котором поверхность глобул МПО
выделена зеленым, ЦП – голубым, ЛФ – серым.
В модели пентамерного комплекса 2ЛФ-2ЦП-МПО контакты ЦП с ЛФ и МПО не
отличаются
от
контактов
в
комплексах
ЦП-ЛФ
и
2ЦП-МПО.
Исследование
взаимодействия ЦП и ЛФ с помощью методов SAXS [Sabatucci et al., 2007; Samygina et
al., 2013] согласуется с данными метода ФКС [Соколов и соавт., 2009], которые
показывают, что данные белки образуют в растворе комплекс 1:1 (таблица 3.3). По
данным SAXS ЛФ и МПО не контактируют в пентамерном комплексе, что с одной
стороны подкрепляет данные об отсутствии влияния ЛФ на активность МПО, а с другой –
показывает, что ингибирование активности МПО N-концевым пептидом ЛФ (1–11),
вероятно, реализуется только в случае протеолизованного, но не интактного ЛФ [van der
Does et al., 2012]. Размеры пентамерного комплекса, полученные методом рассеяния
рентгеновских лучей под малыми углами [Samygina et al., 2013], согласуются с
179
размерами, установленными методом ФКС. Присутствие катионной МПО в комплексах
приводило
к
артефактным
объемам
элюции
при
гель-фильтрации,
которые
свидетельствовали о соотношении компонентов, отличном от значений, полученных по
данным ФКС. Тем не менее, измерение спектральных свойств комплексов, полученных
при гель-фильтрации, однозначно совпало с данными ФКС. Завышение объема элюции
при гель-фильтрации комплексов ЦП с катионными белками наблюдалось нами не только
в случае с МПО, но и в случае с ЭПО и серпроцидинами (рис. 3.5, 3.9). Таким образом,
только при сопоставлении данных ФКС и влияния белков на каталитические свойства
партнеров, а также количественное определение соотношения белков, получаемых с
колонки при гель-фильтрации, позволило однозначно сделать вывод о стехиометрии ЦП с
его партнерами в изучаемых комплексах.
Рентгеноструктурное исследование кристаллов комплекса 2ЦП-МПО подвердило
механизм ингибирования МПО при взаимодействии с ЦП, а также объяснило причину
активации p-PD-оксидазной активности ЦП при взаимодействии с МПО [Sokolov et al.,
2008].
Полученная модель предполагает взаимодействие ЦП с мономером МПО, независимая
часть ячейки содержала одну из субъединиц димерной МПО и ЦП (рис. 4.2).
Рис. 4.2. а) Участок карты электронной плотности комплекса мономер МПО-ЦП на
уровне 1σ (золотая сетка), полипептидная цепь ЦП – синяя, МПО – зеленая. б) Участки
полипептидной цепи ЦП, участвующие в контакте, выделены красным, гем МПО –
синим, ионы меди в ЦП – желтым [Samygina et al., 2013].
180
Рис. 4.3. Структура комплекса димер МПО-2ЦП [Samygina et al., 2013]. ЦП показан
синим, димер МПО: тяжелая цепь – зеленым, легкая цепь – пурпурным. Внизу показан
вид после поворота на 90º вдоль горизонтальной оси.
Участки контакта белков определены достаточно точно, несмотря на невысокое
разрешение структуры (рис. 4.3). ЦП и МПО образуют несколько зон контакта (рис. 4.2,
б). При формировании комплекса вход в гемовый карман МПО контактирует с петлей
ЦП, соединяющей 5-й и 6-й домены (а. о. 885–892) (рис. 4.4).
181
Рис. 4.4. Зона контакта петли ЦП с гемовым карманом МПО (а, в – общий вид комплекса,
б, г – увеличенная область). а, б. Петля ЦП (881–882) выделена красным, ЦП – синим,
цепи МПО – полупрозрачным зеленым. в, г. Поверхность МПО выделена серым, ЦП –
фиолетовым, гем МПО – зеленым [Samygina et al., 2013].
Исследование структуры комплексов ЦП, ЛФ и МПО подтвердило как выводы о
стехиометрии белков в комплексах, так и данные об их взаимном влиянии на
ферментативные свойства. Анализ трехмерной структуры комплекса 2ЦП-МПО прояснил
механизм ингибирования интактным ЦП активности МПО, а также эффект активации
МПО p-PD-оксидазной активности ЦП. Активация МПО p-PD-оксидазной активности
182
ЦП, обусловленная увеличением сродства ЦП к субстрату, согласуется с тем, что
полипептидная цепь МПО в районе R185 контактирует с остатками 667–669 (рис. 4.5, г)
вблизи остатка W669 в домене 4 ЦП (сайт связывания p-PD) [Zaitsev et al., 1999].
Рис. 4.5. Зоны контакта между МПО и 3-м, 4-м и 5-м доменами ЦП [Samygina et al.,
2013]. а) Контакт между N-концом легкой цепи МПО и петлей 699–720 ЦП. б) Контакт
между петлей ЦП 699–720 и симметричным мономером МПО (симметричная молекула
ЦП не показана). в) Зона контакта вблизи петель ЦП 542–557 и 618–624. г) Контакт R185
МПО c p-PD-связывающим сайтом ЦП (667–669).
Подвижная петля ЦП (а. о. 699–710) вовлечена во взаимодействие с N-концом легкой
цепи МПО (1–27) (рис. 4.5, а). Кроме того, остатки вблизи активного центра МПО (а. о.
191–193, 229, 272, 274) контактируют с остатками 4-го домена (а. о. 511, 542, 553, 554) и
6-го домена (а. о. 989) в ЦП.
183
Мономеры МПО в комплексе не отличаются по структуре от интактной МПО.
Углеводные цепи, соединенные с N137, принимают участие в контакте мономер-мономер
и хорошо определяются в карте электронной плотности (рис 4.6, а, б). С другой стороны,
углеводные цепи ЦП (соединенные с остатками N119, 339, 378, 743), вероятно, не
участвуют в контакте с МПО. Молекулы ЦП в комплексе расположены вдоль оси
симметрии 2-го порядка, зона контакта двух молекул ЦП, взаимодействующих с
димерной МПО, не превышает 3,5 Å и формируется а. о. K806, L831, G833, E834, T835,
T772 и R774 каждой из молекул ЦП (рис. 4.6, в, г).
Рис. 4.6. Зона контактов двух протомеров МПО (а, б – увеличенная область) и молекул
ЦП в комплексе 2ЦП-МПО (в, г – увеличенная область) [Samygina et al., 2013].
В полученной нами на основании метода SAXS трехмерной модели комплекса ЦП-ЛФ
три из четырех доменов ЛФ (N1, C1 и C2) контактируют с ЦП (рис. 4.7).
184
Рис. 4.7. Увеличенная область контакта ЦП и ЛФ, представленная в виде полупрозрачных
поверхностей [Samygina et al., 2013]. Домен ЛФ-N1 выделен коричневым, ЛФ-N2 –
желтым, ЛФ-С1 – розовым, ЛФ-С2 – красным. Показан контакт углевода, соединенного с
доменом ЛФ-С1, с I доменом ЦП. ЦП выделен голубым, граница между I и VI доменами
ЦП показана синей линией. Сайт гликозилирования ЦП (N119) показан черной стрелкой.
ЛФ взаимодействует с 1-м (а. о. 60–66, 85, 108–111, 123, 124, 137–139, 189) и 6-м (а. о.
1012–1014, 1039) доменами ЦП. Наиболее вовлечен в контакт с ЦП домен N1 ЛФ. Зона
контакта включала а. о. 24–31, 265, 277, 282 и 309 ЛФ. Регион ЛФ, включающий а. о. 678–
684 из домена С1 в ЛФ, взаимодействовал с 1-м доменом в ЦП (а. о. 60–66). Углеводные
остатки, соединенные с N479, были вовлечены во взаимодействие с 1-м и 2-м доменами
ЦП. С2 домен ЛФ вовлечен во взаимодействие за счет контакта с углеводами ЦП,
соединенными с N339. Кроме того, нельзя исключить взаимодействие углеводов,
185
соединенных с N119 и N743 ЦП, с N-долей ЛФ. Участки контакта ЦП и ЛФ, полученные
при моделировании трехмерной структуры их комплекса по данным SAXS, в целом
согласуются с полученными нами данными. Со стороны ЛФ во взаимодействии
участвуют главным образом участки домена N1, в частности 24–31, которые по нашим
данным взаимодействуют с полианионами (гепарин, ДНК, ЛПС), разобщающими
комплекс ЦП-ЛФ [Pulina et al., 2002]. На основе данных биохимического анализа
вытеснения ЛФ из комплекса с ЦП с помощью полианионов (ДНК, ЛПС, гепарин), а
также пептидов, имитирующих N-концевой катионный кластер ЛФ (2RRRR5), можно
заключить, что с ЦП взаимодействует N-конец ЛФ [Pulina et al., 2002; Соколов и соавт.,
2006; Соколов и соавт., 2013]. Данные об отсутствии вытеснения ЦП из комплекса с ЛФ
анионными пептидами, гомологичными участкам ЦП: DQVDKEDEDFQE (586–597),
EVEWDYSPQREWE (721–734) и DENESWYLDD (905–914) [Соколов и соавт., 2006],
противоречат недавно опубликованной модели комплекса ЦП-ЛФ, построенной на
основе данных о взаимодействии ЛФ с двумя сходными пептидами YYIAAVEVEWDYS
(715–727) и FDENESWYLDDNI (904–916), обнаруженными путем сорбции меченого
пероксидазой хрена ЛФ на пептидной библиотеке ЦП [White et al., 2012]. В полученной
нами модели данные участки не входили в зону контакта ЦП-ЛФ (рис. 4.8, а). Со стороны
ЦП в контакте участвуют остатки из 1-го и 6-го доменов ЦП (рис. 4.8, б), которые
содержат аминокислотные лиганды для ионов меди трехъядерного активного центра ЦП
[Lindley et al., 1997]. Ранее при анализе пептидов ЦП, связывающихся с ЛФ-Сефарозой,
нами были обнаружены пептиды, относящиеся к 1-му и 6-му доменам ЦП [Соколов,
2007], содержавшие медь-связывающие аминокислоты. Если учесть, что ЛФ активирует
ферроксидазную активность ЦП [Соколов, 2007; Sokolov et al., 2009], непосредственно
связанную с активным центром, можно предположить, что связывание ЛФ вблизи
аминокислотных лигандов ионов меди в 1-м и 6-м доменах может повлиять на
каталитические свойства активного центра ЦП.
В отличие от взаимодействия ЦП и МПО, в котором практически не заметно вклада
углеводных компонентов ни ЦП, ни МПО, в комплексообразование ЦП и ЛФ по данным
полученной модели вносят вклад углеводные остатки обоих гликопротеинов (рис. 4.7).
Учитывая, что выведение ЛФ и МПО из кровяного русла обусловлено узнаванием
терминальных углеводных остатков рецепторами клеток печени и лектинами плазмы
крови, не исключено, что значительное по сравнению с МПО время циркуляции в
кровотоке ЛФ [Zakharova et al., 2000; Соколов и соавт., 2007] обусловлено маскированием
углеводов ЛФ при контакте с ЦП плазмы крови.
186
Рис. 4.8. а) Лабильные сайты связывания Fe(II) LS1 и LS2 в ЦП выделены красным,
анионные пептиды (715–727 и 904–915) – синим, а. о., лигандирующие Fe (III) в ЛФ, –
фиолетовым. б) Зона контакта N-концевого кластера катионных а. о. ЛФ (2–5 и 28–32) с
участками 1-го (50–110) и 6-го (926–1012) доменов ЦП, лигандирующими ионы меди
трехъядерного центра (красный треугольник).
Контакт петли, соединяющей 5-й и 6-й домены ЦП, с входом в гемовый карман МПО
(рис. 4.4) объясняет как влияние ЦП на спектральные характеристики гема МПО, так и
187
зависимость ингибирования пероксидазной активности МПО под действием ЦП. Ранее
было описано смещение полосы Соре (максимум поглощения гема МПО) при добавлении
ЦП к МПО [Соколов, 2007; Sokolov et al., 2008], и аналогичный эффект мы наблюдали
при исследовании влияния ЦП на спектральные свойства гема ЭПО (рис. 3.12, б). В
предыдущих исследованиях был проведен анализ ингибирования ЦП окисления
различных по размеру субстратов пероксидазного цикла МПО, когда мы наблюдали
увеличение эффективности ингибирования ЦП активности МПО по мере увеличения
размера субстрата [Соколов, 2007]. Этот эффект исчезал при протеолитической
деградации петли, контактирующей с активным центром МПО, хотя белки при этом
продолжали формировать комплекс. С легкой цепью МПО контактирует также петля ЦП
669–710, содержащая сайт протеолиза R701, и этим контактом можно объяснить то, что
при добавлении к комплексу ЦП с МПО различных протеиназ мы наблюдали защитный
эффект МПО от протеолитической атаки ЦП протеиназами не только в отношении связи
между 5-м и 6-м доменами, но и практически полную защиту от деградации плазмином и
эластазой [Соколов, 2007]. Вместе с тем не исключено, что гидролиз ЦП данными
протеиназами подчиняется определенной последовательности расщепления сайтов, т.е.
пока не происходит гидролиза связи между 5-м
гидролиз
по
следующим
связям
в
ЦП
и 6-м доменами, будет затруднен
[Sokolov
et
al.,
2008].
Добиться
удовлетворительного разрешения подвижной петли ЦП 669–710 мы смогли благодаря
предварительным исследованиям структуры недеградированного ЦП с предельным на
настоящий момент разрешением 2,6 Å [Самыгина и соавт., 2008], в которой данная петля
участвовала в образовании межмолекулярных контактов в тригональной форме
кристаллов ЦП. Интересно, что в структуре комплекса 2ЦП-МПО происходит
формирование контактов между двумя молекулами ЦП (рис. 4.6, в, г). Нельзя исключить,
что благодаря этим контактам достигается дополнительная жесткость структуры
комплекса димерной МПО с двумя ингибирующими ее молекулами ЦП.
В конце 80-х годов серией работ группы Лызловой С.Н. [Говорова и соавт., 1986;
Шаронов и соавт., 1988; Sharonov et al., 1988] было показано, что среди антиоксидантных
белков плазмы крови именно ЦП проявляет наибольший потенциал как скавенджер
супероксидного анион-радикала и HOCl, которые выступают как субстрат и продукт
катализа МПО соответственно. В 1991 году неидентифицированный белковый ингибитор
МПО, с М ~ 150 кДа, был выделен из сыворотки крови на иммобилизованной МПО [Yea
et al., 1991], но только в 1997 году он был идентифицирован как ЦП [Segelmark et.al.,
1997]. В наших опытах ЦП эффективно подавлял продукцию НФ пероксида водорода
(рис. 3.58), т. е. лишал МПО субстрата. Роль ЦП как физиологического ингибитора
активности МПО не вызывает сомнения. Недавно было показано, что белки острой фазы
188
воспаления: С-реактивный белок и маннозо-связывающий лектин, которые также
взаимодействуют с МПО, не препятствуют ее ингибированию ЦП [Берлов и соавт., 2011;
Xu et al., 2013]. В нашей работе мы показали, что иммунопреципитация ЦП из плазмы
снижает ее способность ингибировать пероксидазную активность МПО (рис. 3.20, б), но
при этом не отменяет способность МПО утилизировать пероксид водорода для окисления
более физиологических субстратов (рис. 3.21, а) [Sokolov et al., 2014]. Действительно,
окисление тиоцианата с минимальным для МПО значением KM и наибольшей
специфичностью [van Dalen et al., 1997] не ингибируется в присутствии ЦП (рис. 3.21, б).
Конкурентный механизм ингибирования ЦП активности МПО, очевидно, не эффективен
в случае окисления такого специфического для МПО субстрата, как тиоцианат [Костевич
и Соколов, 2010]. Важно отметить, что KM для пероксида водорода не изменяется в
присутствии ЦП [Соколов, 2007], а учитывая, что процессивность (kcat) МПО около 90/c
почти на 2 порядка превышает таковую (0,5/с) для окисления наиболее специфичного
субстрата ЦП, Fe2+ [Stoj and Kosman, 2003], едва ли ЦП может восстанавливать
высокореактивное Соединение I МПО [Chapman et al., 2013]. В модельной системе в
присутствии глюкозоксидазы, генерирующей пероксид водорода, ЦП терял оксидазную
активность под действием хлорирующей и бромирующей МПО (рис. 3.19), тиоцианат же
препятствовал модификации ЦП. Модификация ЦП продуктами катализа МПО (HOCl,
HOBr) приводила к снижению его ферроксидазной и p-PD-оксидазной активности, при
этом несколько повышалась его SOD-активность (рис. 3.56), что совпадало со
способностью модифицированного ЦП ингибировать респираторный взрыв НФ (таблица
3.22). Однако ЦП и его пептид (883-892) после модификации HOCl, HOBr становились
неэффективными ингибиторами активности МПО (таблица 3.21). В то же время, мягкий
окислитель HOSCN, образование которого при катализе МПО не ингибируется ЦП (рис.
3.21, б), практически не снижал ни один из видов оксидазной активности ЦП, его
способность ингибировать и МПО, и респираторный взрыв НФ. Таким образом,
направляя МПО на окисление тиоцианата, а не хлорида, ЦП способствует образованию
относительно безопасного для человека гипотиоцианата, являющегося эффективным
антимикробным агентом. ЛФ, как участник пентамерного комплекса 2ЛФ-2ЦП-МПО,
ограничивает образование активных форм кислорода по нескольким механизмам: вопервых, способствуя окислению Fe2+, катализируемому ЦП, ЛФ снижает окислительный
потенциал прооксидантных ионов железа [Соколов и соавт., 2005]; во-вторых, связывая
ионы Cu2+, ЛФ препятствует образованию гидроксильных радикалов при H2O2индуцированной деградации ЦП (рис. 3.31) [Sokolov et al., 2012]. Наконец, ЛФ не
препятствует ингибированию ЦП хлорирующей активности МПО (рис. 3.18), и кроме
189
того, он связывает ионы Fe3+, снижая вероятность образования гидроксильных радикалов
в реакции HOCl с Fe2+.
Хорошо известно о синергичном антимикробном действии ЛФ и функционирующей
по (псевдо)галогенирующему циклу МПО [Кокряков, 1999; Tenovuo, 2002; Берлов и
соавт., 2009]. Ни один из использованных нами ранее методов не показал взаимодействия
между ЛФ и МПО при комплексообразовании с ЦП, аналогичные результаты были
получены и при анализе трехмерной модели комплекса. Взаимодействие с ЛФ не
отменяет ингибирующего влияния ЦП на хлорирующую активность МПО (рис. 3.18, б)
[Панасенко и соавт., 2008]. ЦП препятствовал антимикробному эффекту МПО лишь в том
случае, когда субстратом галогенирующего цикла был хлорид (таблица 3.11). В том
случае, когда на фоне PBS было возможно образование гипотиоцианата, образующегося в
(псевдо)галогенирующем цикле МПО, ЦП не подавлял антимикробную активность
системы (таблица 3.11). Тот факт, что ЦП не препятствует синергичному эффекту ЛФ и
МПО и направляет систему по пути синтеза относительно безопасного для организма
антимикробного агента, гипотиоцианата, свидетельствует в пользу участия комплекса
2ЛФ-2ЦП-МПО в защите организма от галогенирующего стресса при воспалении
[Панасенко и соавт., 2013; Sokolov et al., 2014].
При исследовании деструкции ЦП пероксидом водорода концентрации исследуемых
белков в модельной системе соответствовали их концентрациям в плазме крови человека,
однако концентрация Н2О2 была подобрана так, чтобы процесс деградации ЦП
демонстрировался наиболее наглядно. Наблюдается разрушение полипептидной цепи ЦП
до низкомолекулярных фрагментов (не видны при электрофорезе в ПААГ) и снижение
его оксидазной активности в зависимости от концентрации Н2О2 и от времени совместной
инкубации. Хемилюминесценция, детектируемая в системе ЦП и Н 2О2, показывает
образование в ней АФК (рис. 3.34). Так как Cu,Zn-SOD не оказывала влияния на
деструкцию ЦП, можно предположить, что образования супероксидных анион-радикалов
в данной системе не происходит. Отсутствие защиты ЦП от деградации такими
«ловушками» гидроксильных радикалов как маннитол и ДМСО может объясняться «сайтспецифическим»
деструктивным
действием
этих
радикалов
на
молекулу
ЦП.
Возможность такого механизма описана для ряда металл-содержащих ферментов,
например, Cu,Zn-SOD. Продукция гидроксильных радикалов была зарегистрирована с
помощью метода ЭПР (рис. 3.27), показавшего образование алкоксильных радикалов при
добавлении в систему этанола либо метанола. За счет своего короткого времени жизни
ОН˙ разрушает белок-мишень непосредственно вблизи места своего образования, не
успевает выйти в раствор и взаимодействовать с маннитолом или ДМСО.
190
Было показано, что вещества, связывающие ионы меди, обладают в отношении ЦП
защитным эффектом разной степени выраженности, что с большой степенью вероятности
указывает на ведущую роль ионов меди в окислительной деструкции ЦП. Ярко
выраженный эффект подавления хемилюминесценции люминола в системе «ЦП + Н2О2»
в присутствии ЭДТА может быть объяснен тем фактом, что этот хелатор способен
связывать ионы меди в составе ЦП. Возможно, реакция разложения Н2О2 не успевает
начаться из-за того, катализирующий реакцию ион меди связывается с ЭДТА. Вместе с
тем, умеренный защитный эффект ЭДТА по отношению к оксидазной активности ЦП (20
%), может объясняться свойством этого хелатора извлекать часть ионов меди из
активного центра ЦП, что вызывает снижение оксидазной активности и подавление
защитного действия ЭДТА. Высокий защитный эффект гистидина (75 %) с отношении
ЦП объясняется его способностью не только связывать ионы меди, но и служить
ловушкой
АФК,
о
чем
свидетельствует
сравнительно
низкий
уровень
хемилюминесценции в системе с гистидином. Белки, способные связывать ионы меди,
также препятствуют перекисной деструкции ЦП. Неожиданным оказался тот факт, что по
уровню защитного эффекта ЛФ не отличается от ЧСА. Это может объясняться тем, что
ЧСА способен ассоциировать ионы меди (около 5 % меди плазмы крови связано с этим
белком). Помимо нескольких низкоаффинных сайтов для связывания ионов меди, ЧСА в
N-концевой области имеет высокоаффинный сайт: H3. Менее выраженное защитное
действие альбумина собаки (60 %) по сравнению с ЧСА (80 %) может объясняться
отсутствием гистидинов в N-концевой области альбумина собаки. Тем не менее,
имеющийся защитный эффект белка из сыворотки собаки может объясняться наличием в
нем низкоаффинных металлосвязывающих сайтов и его аминокислотным составом
(высокое содержание остатков, способных связывать ионы меди). Лизоцим, не
обладающий
защитным
эффектом,
беден
такими
аминокислотными
остатками
(соотношение количества некоторых аминокислотных остатков ЧСА/лизоцим: гистидин –
16/1, метионин – 6/2, цистеин – 20/8). Таким образом, подавление деградации ЦП в наших
экспериментах объясняется выведением активных ионов меди из реакционной смеси и
наличием аминокислот, способных связывать ионы меди в белках-антиоксидантах. По
способности защищать ЦП ЛФ оказался более «мягким» хелатором, чем ЭДТА: он не
извлекает ионы меди из активного центра ЦП, сохраняя до 80 % оксидазной активности
ЦП по сравнению с 20 %, сохраняемыми ЭДТА. Кроме того, защитный эффект ЛФ
проявляется при более низких концентрациях: 3 – 12 мкМ для ЛФ против 10 мМ для
ЭДТА (таблица 3.14).
Различное влияние связанных с ЦП и отделяющихся от ЦП ионов меди в процессах
образования АФК и деструкции белка прослеживается в опытах по подавлению
191
хемилюминесценции (рис. 3.34). При этом Fe2-ЛФ меньше снижает уровень свечения, чем
апо-ЛФ. В то же время по уровню защитного действия на оксидазную активность ЦП эти
формы ЛФ не различаются, что свидетельствует о способности как насыщенной железом
формы, так и апо-формы ЛФ поверхностно связывать ионы меди, предотвращая
деструкцию ЦП при рН 7,4. Результаты экспериментов по изучению защитных свойств
ЛФ при снижении рН в реакционной среде показывают, что происходит потеря защитных
свойств этого белка. Как показали наши опыты, при понижении рН ниже 6,6 резко
уменьшается способность ЛФ связывать ионы меди (рис. 3.33).
ЦП и ЛФ являются белками острой фазы, и их количество в крови увеличивается при
воспалении: от 0,3 до 1 мг/мл для ЦП и от 1 мкг/мл до 10 мкг/мл для ЛФ, а при сепсисе до
0,2 мг/мл, достигая в местах воспаления значений до 1 мг/мл. Таким образом, при острых
воспалительных реакциях увеличивается содержание обоих белков, формирующих
циркулирующие комплексы ЦП-ЛФ [Соколов и соавт., 2007]. В таких условиях
взаимодействие ЦП с ЛФ, который синтезируется на 90 % в апо-форме, может
способствовать эффективному встраиванию высвобождающихся из ЦП ионов меди в ЛФ,
что в свою очередь должно тормозить реакции деградации ЦП. Таким образом,
взаимодействие ЛФ с ЦП может являться защитным механизмом от чрезмерной
активации окислительных процессов в очагах воспаления, обеспечивая более быстрое
удаление прооксидантной меди ЦП в условиях образования пероксида водорода и АФК
стимулированными НФ. Связывание ионов меди апо-ЛФ и таким белком как ЧСА может
предотвращать дальнейшее усиление окислительных процессов. Казалось бы, содержание
ЧСА в организме настолько велико, что можно не опасаться прооксидантной меди ЦП.
Однако понижение рН, которое может наблюдаться в местах воспаления, уменьшает
способность обоих белков связывать медь. Снижение рН примерно на одну единицу (от
рН 7,4 до рН 6,5) подавляет защиту ЦП на 50 %, а при рН 5,5 защитный эффект почти
отсутствует. Следует признать, что значения рН могут менять направленность процесса в
сторону подавления деградации ЦП или в сторону его деструкции. Когда при закислении
среды защитный эффект ЛФ по отношению к ЦП резко снижается (рис. 3.32), происходит
деградация ЦП и высвобожение из его молекулы ионов меди, усиливающих образование
бактерицидных АФК в очаге воспаления. При возрастании значений рН этот процесс в
присутствии ЛФ резко тормозится – продукция АФК, как следствие, их разрушительный
эффект уменьшаются. Подобное явление может наблюдаться на границах пораженных и
здоровых тканей. В этих случаях активный деструктивный процесс непосредственно в
очаге воспаления не будет распространяться на окружающие здоровые участки.
192
Защитное действие комплекса ЦП-ЛФ подтверждается при их клиническом
применении в качестве антиоксидантов у онкологических больных [Якубовская и соавт.,
2005]. Тот факт, что гены ЦП и ЛФ активируются при инволюции молочной железы у
мышей [Nakamura et al., 2006], а их комплекс обнаруживается в грудном молоке [Соколов и
соавт., 2006] и слезной жидкости [Соколов и соавт., 2013], также свидетельствует в
пользу защитного действия кодируемых ими белков. В условиях очагового воспаления и
недостатка кислорода ЦП может быть тем фактором, который способствует встраиванию
железа в апо-ЛФ и реализации его антимикробной функции.
Избирательность
взаимодействия трех металлосодержащих белков – ЦП, ЛФ и МПО, участвующих в
воспалительных реакциях и антимикробной защите организма, представляется нам
неслучайной, учитывая, что ЦП является предпочтительным партнером для ЛФ среди
других
белков
хлорирующую
плазмы,
активность
а
также
МПО,
специфически
но
не
ингибирует
продукцию
пероксидазную
антимикробного
и
агента,
гипотиоцианата [Sokolov et al., 2014].
Высокая аффинность ЦП к МПО, которая в свою очередь взаимодействует с апоВ-100содержащими липопротеинами (ЛНП и ЛОНП), позволила выявить в сыворотке больных
с атеросклерозом комплексы, включающие ЦП, МПО и ЛНП либо ЛОНП (рис. 3.4).
Использование метода ФКС позволило объяснить стехиометрическое соотношение в
комплексах, формируемых ЦП, МПО и апоВ-100-содержащими липопротеинами
[Sokolov et al., 2010]. С помощью методов гель-фильтрации и электрофореза мы
подтвердили возможность формирования таких комплексов, а также выяснили, что
ключевым звеном данных комплексов является МПО, связывающаяся с ЦП и с апоВ-100
липопротеинов, в случае ЛНП соотношение компонентов – 2ЦП:МПО:ЛНП, привем в
случае ЛОНП – 2ЦП:МПО:2ЛОНП. Формально такие различия в стехиометрии
противоречат выводу о том, что МПО взаимодействует с ЛОНП и ЛНП за счет контакта с
апоВ-100. Но эти же данные согласуются с измеренными значениями Ki для ЛОНП и
ЛНП – 0,12–0,15 и 0,28–0,33 нМ, отличающимися примерно в 2 раза. Кроме того, такая
особенность стехиометрии объясняет отсутствие комплексов, которые бы включали
одновременно ЛОНП и ЛНП. Вероятно, связывание одной частицы ЛНП с комплексом
2ЦП-МПО препятствует связыванию второго лиганда, в отличие от ЛОНП, которые
формируют комплекс 2ЦП-МПО-2ЛОНП. Это может быть связано с различиями
конформации липопротеина апоВ-100 в частицах ЛОНП и ЛНП. Не исключено, что
присутствие в ЛОНП других типов апо-липопротеинов способствует формированию
комплекса, включающего две частицы ЛОНП. Следует при этом отметить, что при
возможности оценить стехиометрическое соотношение ЦП и МПО в комплексах, мы
всегда обнаруживали соотношение компонентов 2ЦП:МПО. Например, при гель-
193
фильтрации образца плазмы с добавкой МПО (рис. 3.46) во фракции 2, содержавшей
липопротеиновые комплексы МПО и ЦП, соотношение ЦП и МПО составило 280 нг/мл
(2,1 нМ) и 135 нг/мл (0,9 нМ). Несмотря на то, что участие липопротеинов в
комплексообразовании с ЦП и МПО усиливает аффинность ЦП к МПО, сравнение
сродства МПО к липопротеинам и ЦП, а также концентрации ЦП и липопротеинов в
плазме, показало, что в первую очередь МПО взаимодействует со своей мишенью
(липопротеинами), а уже после определенного порога с ингибитором (ЦП).
Исследование взаимодействия МПО с ЛНП показало, что их сродство к МПО не
изменяется ни при модификации ЛНП функционирующей МПО, ни при добавлении к
ним HOCl/HOBr. Это свидетельствует о том, что действие использованных окислителей
не затрагивает сайт, ответственный за взаимодействие МПО с апоВ-100 [Sokolov et al.,
2011; Соколов и Костевич, 2012]. Последовательность P445–456: EQIQDDCTGDED
фактически содержит единственный остаток цистеина (C), который с большой
вероятностью мог бы подвергаться окислительной модификации со стороны HOCl/HOBr.
Зрелый апоВ-100 содержит 24 остатка цистеина. Принимая во внимание тот факт, что при
обработке ЛНП HOCl в мольном соотношении 1:100 исчезает только 20 % цистеина
[Malle et al., 2006], можно предположить, что модификация ЛНП 100-кратным мольным
избытком HOCl не затрагивает сайт связывания МПО. Это коренным образом отличается
от взаимодействия МПО с липопротеинами высокой плотности (ЛВП), при модификации
которых в аналогичных условиях исчезают все 100 % остатков цистеина [Marsche et al.,
2002].
Тот факт, что P445–456 полностью устранял влияние ЛНП на ингибирование
активности
МПО церулоплазмином,
доказывает
адекватность
выбранного нами
энзиматического подхода для оценки сродства МПО к модифицированным ЛНП (таблица
3.20). Значение Ki 0,2 нМ, характеризующее сродство ЛНП к МПО, близко к значению
0,13 нМ, полученному нами. Такое значение Ki позволило ожидать эффективного
разобщения взаимодействия ЛНП с МПО при добавлении к клеткам ЛНП и P445–456 в
конечных концентрациях 40 нМ и 80 нМ соответственно [Sokolov et al., 2014].
Действие P445–456 на накопление холестерина и его эфиров в клетках мы
исследовали,
используя
модельную
систему,
основанную
на
захвате
ЛНП
моноцитами/макрофагами и аккумуляции внутриклеточного холестерина. Эффект
пептида практически отсутствовал при инкубации ЛНП, модифицированных HOCl или
HOBr, с клетками (рис. 3.52, 3.53). Однако через 72 часа в присутствии таких ЛНП и
P445–456 концентрация МПО в среде оставалась достоверно более высокой по
сравнению с пробами, инкубированными без P445–456 (рис. 3.54). Это значит, что
разобщение
пептидом
взаимодействия
модифицированных
ЛНП
с
МПО
не
194
препятствовало
поглощению
клетками
модифицированных
ЛНП,
но
выбранная
концентрация P445–456 обеспечивала диссоциацию комплекса ЛНП-МПО, поскольку в
присутствии P445–456 моноциты/макрофаги поглощали холестерин ЛНП, но не МПО.
При сравнении накопления холестерина (и его эфиров) моноцитами/макрофагами в
присутствии ЛНП, модифицированных HOCl/HOBr и МПО, функционирующей в
присутствии Clˉ/Brˉ, видно, что P445–456 снижал накопление холестерина до уровня
практически сопоставимого с таковым в случае ЛНП, модифицированных HOCl/HOBr,
где пептид P445–456 оказывался неэффективным (рис. 3.52, 3.53). Аналогичный эффект
наблюдался при сравнении уровня МПО в среде: добавление P445–456 на сроке 12 часов
снижало экзоцитоз МПО под действием ЛНП, модифицированных МПО-H2O2-Clˉ/Brˉ, до
уровня, сравнимого с действием HOCl/HOBr (рис. 3.54). Напротив, на сроке 72 часа в
присутствии P445–456 концентрация МПО не снижалась и практически совпала с таковой
для модификации HOCl и МПО/H2O2/Clˉ, а также для HOBr и МПО/H2O2/Brˉ. Несколько
меньший выход МПО на сроке 12 часов в присутствии бромирующей МПО и пептида по
сравнению с HOBr может свидетельствовать о том, что разобщение взаимодействия МПО
с ЛНП снижало модифицирующее действие на ЛНП со стороны фермента и тем самым
уменьшало стимуляцию секреции МПО моноцитами (рис. 3.54).
Тот факт, что моноциты в присутствии модифицированных ЛНП секретируют МПО,
согласуется
с
результатами
опытов
по
увеличению
люминол-зависимой
хемилюминесценции этих клеток в присутствии окисленных ЛНП [Panasenko et al., 1991].
Накопление ТБК-реактивных продуктов в ЛНП, инкубированных с моноцитами и НФ,
ингибировалось в присутствии каталазы на 88 % и 65 % соответственно, что
свидетельствует в пользу участия МПО в окислительной модификации ЛНП [Panasenko et
al., 1991]. В случае добавления SCNˉ либо ABAH к галогенирующей МПО мы не
наблюдали ни накопления холестерина и его эфиров моноцитами/макрофагами, ни
секреции ими МПО. Таким образом, как ингибирование активности МПО, так и
переключение ее активности на продукцию менее реактивного окислителя – OSCNˉ –
снижало окислительную модификацию ЛНП, которая, судя по всему, является стимулом
для секреции МПО моноцитами.
Ранее было показано, что МПО, используя в качестве субстрата тиоцианат, вызывала
накопление в ЛНП продуктов пероксидации липидов [Exner et al., 2004], хотя
присутствие тиоцианата снижало модификацию ЛНП под действием HOCl. Кроме того,
ингибиторный
анализ
показал,
что
цистеин,
но
не
метионин
препятствовал
индуцированной НФ пероксидации липидов в ЛНП в присутствии тиоцианата [Exner et
al., 2004]. Вероятно, при использованной нами продолжительности инкубации (30 минут)
тиоцианат препятствовал повреждающему действию со стороны активных форм
195
галогенов, образующихся при функционировании галогенирующего цикла МПО, но сам
за это время не приводил к накоплению значительного количества продуктов
пероксидации липидов. Следует отметить, что хотя курение, являющееся фактором риска
атеросклероза, связывают с увеличением уровня тиоцианата в плазме крови, вероятно,
гораздо больше способствует атерогенезу не повышение концентрации тиоцианата, а
хроническая активация НФ у курильщиков. Показано, что употребление в пищу богатых
тиоцианатом крестоцветных снижает риск развития сердечно-сосудистых заболеваний у
лабораторных животных и пациентов с сахарным диабетом II типа [Bahadoran et al., 2012;
Tomofuji et al., 2012]. Ингибитор МПО – ABAH – также предотвращал проатерогенность
ЛНП,
вызванную
активными
формами
галогенов,
что
согласуется
с
его
противовоспалительными свойствами в отношении моноцитов [van der Does et al., 2012],
однако его применение для профилактики атеросклероза едва ли возможно, учитывая
сравнительно
высокую
токсичность
данного
соединения
(LD50
мг/кг)
180
[http://datasheets.scbt.com/sc-204107.pdf].
Снижение проатерогенности ЛНП в присутствии ЦП, физиологического ингибитора
МПО, зависело от субстрата галогенирующего цикла: эффективность ЦП в отношении
хлорирующего, но не бромирующего действия МПО можно объяснить тем, что он хуже
ингибирует бромирующую активность МПО (таблица 3.10), что связано с большим
сродством МПО к Brˉ по сравнению с Clˉ. Отсутствие эффекта у ЦПпр согласуется с тем,
что он не способен ингибировать хлорирующую активность МПО. Влияние ЦП на
проатерогенные свойства модифицированных ЛНП также может быть связано с его
способностью подавлять фагоцитарную активность моноцитов [Сенюк и соавт., 1994].
Таким образом, на основании полученных данных можно предложить обобщенную
схему участия МПО, продуцируемых ею активных форм галогенов, а также разобщителя
ее связывания с ЛНП (P445–456) и ингибиторов/модуляторов галогенирующей
активности (ЦП, ABAH, SCNˉ) в проатерогенной модификации ЛНП и формировании
пенистых клеток (рис. 4.9). Связывание МПО с ЛНП приводит к их сайт-специфической
модификации, заключающейся в повреждении главным образом белка, а также
галогенировании/пероксидации липидов под действием HOCl и HOBr, образующихся в
ходе галогенирующего цикла МПО. Модифицированные ЛНП являются стимулом для
лейкоцитов, провоцируя респираторный взрыв и экзоцитоз МПО моноцитами.
Секретируемая МПО связывается с ЛНП и, используя в качестве субстрата Н2О2,
продуцируемый лейкоцитами, усиливает их повреждение, замыкая тем самым «порочный
круг» образования модифицированных ЛНП. Модифицированные ЛНП в комплексе с
МПО
захватываются
моноцитами/макрофагами,
приводя
к
накоплению
в
них
холестерина и трансформации их в пенистые клетки. Ингибиторы/модуляторы
196
галогенирующей активности МПО (ЦП, ABAH и SCNˉ), равно как и разобщитель
комплекса
ЛНП-МПО
(P445–456)
препятствуют
окислительной/галогенирующей
модификации ЛНП, что, с одной стороны, уменьшает их захват клетками и снижает
аккумуляцию внутриклеточного холестерина и его эфиров, а с другой – размыкает
«порочный круг» активации моноцитов и образования модифицированных ЛНП.
Рис. 4.9. Обощенная схема участия МПО и активных форм галогенов, пептида P445–456,
разобщающего комплекс МПО-ЛПН, и ингибиторов/модуляторов (ABAH, ЦП, SCN-)
галогенирующей активности МПО в проатерогенной модификации ЛНП, активации
моноцитов и образовании пенистых клеток.
Данное исследование открывает перспективы для изучения эффекта разобщения
комплекса ЛНП-МПО на моделях атеросклеротического поражения, а также поиска
аналогов
P445–456,
не
менее
эффективно
конкурирующих
за
МПО
при
ее
взаимодействии с ЛНП, с целью создания принципиально новых подходов, направленных
на профилактику и лечение атеросклероза. Безусловным преимуществом таких подходов,
основанных на подавлении связывания МПО с ЛНП и переключении фермента на
окисление SCNˉ, является сохранение антимикробной активности МПО, которая
представляет собой важное звено врожденного иммунитета.
197
При хроническом воспалении антиоксидантый потенциал организма исчерпывается, и
липопротеины подвергаются окислительной модификации под действием МПО. Если
хлорирующая активность МПО эффективно ингибируется ЦП, то бромирующая
активность МПО (и ЭПО) и окисление тиоцианата практически не подавляются
концентрациями ЦП, присутствующими в плазме (рис. 3.15). Такие различия можно
объяснить тем, что сродство МПО и ЭПО к бромиду и тиоцианату превышает сродство к
хлориду, т. е. ЦП труднее конкурировать за активный центр МПО и ЭПО с
предпочтительными для них субстратами (таблица 3.9). Продукты окисления тиоцианата
считаются наименее опасными для «биомолекул организма хозяина», и мы показали, что
гипотиоцианат не способствует проатерогенной модификации ЛНП (рис. 3.52-54) и
практически не снижает оксидазные свойства ЦП (рис. 3.56). Учитывая, что для ЦП
также были показаны антиатерогенные свойства, не исключено, что обнаружение
комплексов, содержащих ЦП, МПО и липопротеины, у больных атеросклерозом является
свидетельством компенсаторного процесса [Sokolov et al., 2010]. Отдельного внимания
заслуживает
тот
факт,
что
протеолизованный
ЦП
практически
не
проявил
антиатерогенных свойств на модели моноцитов/макрофагов после предъявления им ЛНП,
подвергнутых окислительной модификации [Sokolov et al., 2014].
Протеолитическая деградация ЦП, обнаруженная нами в образцах синовиальной
жидкости у пациентов с ревматоидным артритом (рис. 3.35) [Соколов и Костевич, 2010],
является провоспалительным фактором, поскольку протеолизованный белок не способен
ингибировать не только МПО (рис. 3.42), но также ЭПО и 5-LO (рис. 3.13, 3.22).
Ингибирование ЦП пероксидазной активности ЭПО, строго подчиняющееся размеру
пероксидазного субстрата (рис. 3.14), и отсутствие влияния на бромирующую активность
можно объяснить большим сродством ЭПО к бромиду (таблица 3.9). Интересно, что
значения Ki ~ 34–39 нМ влияния ЦП на окисление ЭПО ее субстратов ABTS и H2O2
(таблица 3.8) оказались близки к Ka ~ 41 нМ для p-PD-оксидазной активности ЦП в
присутствии ЭПО (см. раздел 3.4.1). Сравнение сайтов для взаимодействия с ЦП в МПО с
гомологичными сайтами в ЭПО (таблица 4.1) показывает высокую степень гомологии
между ними, особенно в области контакта петли между 5-м и 6-м доменами ЦП с
последовательностями пероксидаз у входа в гемовый карман. Влияние ЦП на
спектральные свойства гема ЭПО (рис. 3.12, б), отсутствие ингибирующего эффекта у
протеолизованного ЦП и защитный эффект ЭПО при ограниченном протеолизе ЦП
плазмином (рис. 3.12, а) отражают эволюционное сходство взаимодействия ЦП с
гомологичными пероксидазами лейкоцитов – МПО и ЭПО [Sokolov et al., 2015].
Поскольку ингибирующее
действие
ЦП
на
активность
5-LO
исчезает
при
ограниченном протеолизе, можно предположить, что в основе ингибирования активности
198
5-LO высокими дозами ЦП лежит непосредственное взаимодействие двух белков (рис.
3.22). Удаление из ЦП ионов меди с превращением его в апо-форму также лишает его
способности ингибировать МПО и 5-LO [Соколов и соавт., 2010]. Апо-форма ЦП
отличается от холо-формы белка нарушением третичной структуры, что отражается на
общей конформации молекулы (состояние «расплавленная глобула») [De Filippis et al.,
1996]. Вероятно, в таком состоянии ЦП не способен взаимодействовать с 5-LO.
Таблица 4.1
Сравнение аминокислотных последовательностей МПО, участвующих в
контакте с ЦП (номера а. о. приведены по данным 3D-структуры комплекса 2ЦПМПО, PDB (4ejx) [Samygina et al., 2013]), и последовательностей ЭПО (номера а. о.
соответствуют предшественнику ЭПО, P11678 в базе UNIProt (uniprot.org)).
Связывающий
сайт в
церулоплазмине
Пероксидаза
(а. о.)
Аминокислотная
последовательность
Петля между 5-м МПО (101–104) PEPA
и 6-м доменами
ЭПО (239–243) PESPA
МПО (113–116) VNCE
ЭПО (251–254) VDCE
МПО (214–219) DNLHDD
ЭПО (354–359) DNLHDD
p-PDМПО (181–188)
связывающий
ЭПО (319–326)
сайт
4-й домен (а. о. МПО (191–193)
511, 542–554)
ЭПО (329–331)
Петля 699–710
Гомология
участков (с
учетом
синонимичности
а. о.), %
80 (80)
75 (75)
100 (100)
EPLARNLR
VSLSLRLR
50 (50)
SNQ
TNY
33 (67)
МПО (270–274) RWDGE
ЭПО (408–412) RWNGD
60 (80)
МПО (5–27)
ЭПО (143–163)
81 (86)
DKYRTITGMCNNRRSPTLGAS
DKYRTITGRCNNKRRPLLGAS
Активирующий эффект низких доз ЦП на синтез лейкотриенов, возможно, связан со
способностью этого фермента окислять NO [Shiva et al., 2006] – эндогенный ингибитор
активности 5-LO [Coffey et al., 2000, Zagryazhskaya et al., 2010]. Что касается
ферроксидазной активности ЦП, придающей ферменту характер явного антиоксиданта,
то было показано, что, по крайней мере, в некоторых случаях она может лежать в основе
199
его прооксидантного действия. Так, у пациентов с локализованными агрессивными
периодонтитами, НФ которых синтезировали ЦП, окислявший железо, ионы Fe3+
вызывали активацию NADPH-оксидазы и увеличение продукции супероксидных анионрадикалов [Iwata et al., 2009]. Однако в наших опытах продукция супероксидных анионрадикалов подавлялась (рис. 3.24) начиная с дозы 2,5 мкг/мл (IC50 ~ 2 мкг/мл), что
подтверждает роль ЦП как антиоксиданта плазмы крови, обладающего активностью
супероксиддисмутазы
[Васильев
и
соавт.,
1988]
либо
подавляющего
синтез
супероксидного анион-радикала по альтернативному механизму [Sergeev et al., 1993].
Стимулирующее действие церулоплазмина на фагоцитоз НФ впервые показано в
работе группы Ярополова [Saenko et al., 1994]. Авторы указывают на важность
взаимодействия ЦП с клетками и отрицают роль ЦП в качестве опсонина для частиц
зимозана. Действительно, предварительная инкубация НФ с ЦП в наших экспериментах
оказывала значительное действие на такие клеточные ответы НФ, как фагоцитоз,
респираторный взрыв (продукция супероксидного анион-радикала, пероксида водорода)
и синтез физиологически активных метаболитов AA – лейкотриенов [Соколов и соавт.,
2010]. Несмотря на данные литературы о наличии рецепторов для ЦП на НФ [Kataoka and
Tavassoli, 1985], мы наблюдали, что отмывка НФ от ЦП с помощью PBS (рис. 3.57, в)
устраняла эффект подавления продукции пероксида водорода после активации НФ с
помощью fMLP. Аргументами в пользу того, что в основе ингибирования респираторного
взрыва НФ лежит SOD-подобная активность ЦП, что упоминалось ранее, являются
следующие наблюдения: 1) влияние ЦП на ингибирование продукции пероксида
водорода и восстановление цитохрома С исчезает при отмывке от белка клеток,
преинкубированных в течение 30 минут в присутствии ЦП (рис. 3.57); 2) в отличие от
Cu,Zn-SOD, продуктом взаимодействия которой с O2• является пероксид водорода, ЦП не
увеличивал скорость продукции пероксида водорода активированными НФ, что говорит в
пользу четырехэлектронного окисления ЦП супероксидного анион-радикала до воды
(рис. 3.58).
Нами впервые продемонстрировано влияние ЦП на 5-LO и получены данные в пользу
непосредственного взаимодействия данных белков. При этом наблюдается крайняя
чувствительность синтеза лейкотриенов к целостности молекулы ЦП. Протеолитическая
деградация ЦП приводит к потере эффективности его действия на этот синтез. Можно
предположить, что способность НФ синтезировать ЦП и вызывать его деградацию
протеиназами, секретируемыми при активации данных клеток, используется как
механизм тонкой регуляции клеточных ответов НФ при воспалении, в том числе в ответе
на инфекцию.
200
Примечательно, что ни одна из протеиназ, претендовавших на роль фермента,
деградирующего ЦП (плазмин, эластаза), не гидролизовала белок до набора фрагментов,
образующихся при «спонтанном» протеолизе препаратов ЦП. Как правило, расщепление
цепи было слишком частым, и образующиеся фрагменты не соответствовали по массе
фрагментам «спонтанного» протеолиза.
Одной из причин протеолиза препаратов ЦП может быть комплексообразование белка
с ММП-2 и ММП-12 [Соколов и соавт., 2009]. Хотя было показано, что апо-форма ЦП
способна ингибировать активность ММП-2 [Thompson, 2012], при выделении холоформы ЦП нами были обнаружены его комплексы с ММП-2 и ММП-12; возможно, что
именно эти белки не были идентифицированы в работе, посвященной попытке получения
ЦП без примесей металло-зависимых протеиназ [Ehrenwald and Fox, 1994]. Это не первый
пример взаимодействия ЦП с протеиназами, поскольку, как было показано нами ранее,
среди белков НФ с ЦП взаимодействуют три гомологичных протеиназы: NE, CG и PR3
[Соколов и соавт., 2007]. Как и большинство белков, взаимодействующих с ЦП
(лактоферрин, МПО, ПР, NE, CG, PR3, CAP37), ММП-2 и ММП-12 обладают
аффинностью к гепарину. Для катионных белков, взаимодействующих с ЦП, характерно
присутствие в первичной последовательности гепарин-связывающих мотивов вида
XBBXBX и XBBBXXBX, где B – K или R, реже H, а X – любая гидрофобная
аминокислота. Пептиды, ответственные за связывание с гепарином, вытесняют ЦП из
комплексов с катионными белками. В случае ЛФ такими пептидами являются
имитирующий N-концевой полиаргининовый кластер
2
RRRR5 и пептид
28
RKVR31
[Соколов и соавт., 2006], в случае CAP37 – пептид RKARPRQFPRRR, имитирующий
последовательность 5–13, 61–63 CAP37, связывающуюся с гепарином [Соколов и соавт.,
2010]. Хотя 5-LO не является катионным белком, в ее первичной последовательности
можно выделить катионные участки:
650
124
IHILKQHRRK133, 519MRGRKS524, 634ARFRKN639 и
RNKKKQ655. Эти аминокислотные последовательности можно рассматривать как
вероятные сайты контакта 5-LO с ЦП. Как ММП-2, так и ММП-12, взаимодействующие с
ЦП,
содержат
гепарин-связывающие
мотивы.
В
связи
с
этим
целесообразно
использование гепарин-Сефарозы для элиминации примесей протеиназ из препаратов ЦП
на финальных стадиях очистки белка [Соколов и соавт., 2005]. Тем более что FIIa,
идентифицированный нами как основная протеиназа, приводящая к деградации ЦП,
также обладает аффинностью к гепарину и образует комплекс с ЦП (рис. 3.40).
Мы впервые показали непосредственное участие FIIa в протеолитической деградации
ЦП в его препаратах (рис. 3.37), синовиальной жидкости (рис. 3.36, в), а также в цельной
сыворотке крови (рис. 3.39). Гипотеза о том, что FIIa участвует в протеолизе ЦП, была
высказана группой под руководством L. Calabrese, которая показала, что в препаратах ЦП
201
присутствует протромбин (FII) [Musci
et al., 1996], физико-химические свойства
которого сходны с ЦП. Их можно успешно разделить с применением аргинин-Сефарозы,
сорбирующей FII и практически не связывающей ЦП [Соколов и соавт., 2005]. Тот факт,
что добавление PMSF в плазму крови при выделении ЦП не обеспечивает интактности
белка, можно объяснить тем, что добавляемый в начале выделения PMSF действует
только на активные сериновые протеиназы и довольно быстро инактивируется в водной
среде. При этом в препаратах ЦП остаются следы FII, являющиеся источником FIIa, что
может вызывать его деградацию [Соколов и соавт., 2012].
Эволюционное родство ЦП с FV и FVIII послужило причиной того, что в его
последовательности можно идентифицировать сайты, гомологичные последовательности
гирудина, взаимодействующей с экзосайтом I в FIIa (таблица 3.16). Видимо, благодаря
непрочному связыванию FIIa с такой последовательностью в ЦП (946–954), протеиназа
расщепляет неканонический сайт K887–V888 в ЦП, но не расщепляет синтетический ЦПпептид 883–892 [Соколов и Костевич, 2010]. Последовательности PQSR481↓S482VPP и
PYLK887↓V888FNP, расщепляемые FIIa в ЦП, существенно отличаются от канонических
последовательностей, расщепляемых FIIa (таблица 3.15), однако они характеризуются
максимальным значением B-фактора (рис. 3.38, б) и экспонированы на поверхности
глобулы ЦП (рис. 3.38, а). Нельзя исключить, что совокупность изложенных выше фактов
отложила на многие годы проверку идеи о том, что FIIa способен привести к
образованию 19-кДа фрагмента ЦП, образующегося при хранении препаратов ЦП.
Учитывая,
что
протеолитическая
деградация
ЦП
в
синовиальной
жидкости
коррелировала с наличием активных FIIa и МПО (рис. 3.36), можно предположить, что
интактный ЦП является одним из противовоспалительных и антиоксидантных факторов,
присутствующих в синовиальной жидкости. Действительно, внутрисуставное введение
препарата ЦП кроликам с экспериментальным артритом снижало как клеточные
(количество лейкоцитов, макрофагов, фагоцитов), так и гуморальные (малоновый
диальдегид) провоспалительные показатели [Белова и Карякина, 2008]. Известно, что
одним из патологических факторов развития
ревматоидного артрита является FIIa,
содержание комплексов которого с антитромбином III повышено у больных с
ревматоидным артритом. Применение гирудина при терапии ревматоидного артрита
существенно облегчает течение заболевания. В наших опытах гирудин эффективно
ингибировал протеолиз ЦП в сыворотке крови и синовиальной жидкости (рис. 3.36, в;
рис. 3.39). Учитывая, что, по нашим данным, только интактный ЦП обладает
способностью ингибировать провоспалительный фермент лейкоцитов, МПО, можно
предположить, что именно FIIa снижает антиоксидантные свойства ЦП путем его
протеолитической деградации (рис. 3.42). Мы впервые выявили протеолизованный ЦП в
202
синовиальной
жидкости
больных
ревматоидным
артритом.
Появление
фрагментированного ЦП с молекулярной массой около 50 кДа было также показано при
исследовании ЦП в сыворотке крови пациентов с болезнью Альцгеймера [Squitti et al.,
2008]. Авторы считают, что фрагментация ЦП приводит к появлению «свободной» меди в
кровотоке больных, которая может быть источником свободных радикалов. Не
исключено, что и в синовиальной жидкости фрагментация ЦП приводит к образованию
пула «свободной» меди, усугубляя течение ревматоидного артрита.
В
целом
полученные
противовоспалительных
результаты
реакциях,
а
дополняют
также
картину
показывают
участия
возможность
ЦП
в
участия
протеолизованного ЦП и прооксидантных ионов меди, которые он может терять при
определенных условиях, в развитии осложнений воспаления. С одной стороны, ЦП
ингибирует
продукцию
супероксидного
анион-радикала
и
пероксида
водорода
активированными НФ, лишая МПО возможности синтезировать HOCl, способствует
встраиванию прооксидантных ионов железа в апо-ЛФ, при комплексообразовании с ЦП
подавляются провоспалительные функции практически всех его партнеров (5-LO, МПО,
ЭПО). С другой стороны, протеолитическая деградация ЦП, которую мы наблюдали в
образцах синовиальной жидкости больных ревматоидным артритом, лишает его
способности ингибировать провоспалительные свойства 5-LO и МПО. Усиление
продукции лейкотриенов должно способствовать привлечению в очаг НФ. Оксиданты,
образующиеся под действием МПО, способны модифицировать ЦП, снижать его
ферроксидазную активность и приводить к освобождению прооксидантных ионов меди.
Действительно, в синовиальной жидкости часть ЦП присутствует в апо-форме, а медь
обнаруживается в низкомолекулярной фракции при ультрафильтрации синовия.
Образующиеся окислители могут модифицировать также и другие белки. Как показали
наши недавние исследования [Gorudko et al., 2014], ЧСА, модифицированный HOCl,
может
активировать
НФ
и
усиливать
респираторный
взрыв
клеток,
который
сопровождается частичной секрецией МПО и протеиназ НФ. При активации НФ
усиливается
концентрация
активация
FIIa.
каскада
свертывания
Увеличение
крови,
концентрации
в
FIIa
том
числе
повышается
способствует
снижению
антиоксидантной активности ЦП за счет усиления его деградации, что коррелирует с
присутствием
активной
МПО
в
синовиальной
жидкости.
Таким
образом,
провоспалительные белки, взаимодействующие с ЦП, могут влиять на целостность его
молекулы, лабильность связанных с ним прооксидантных ионов меди и определять
способность ЦП регулировать функции НФ при воспалении.
203
5. ВЫВОДЫ
1.
Для церулоплазмина характерно образование комплексов электростатической
природы с белками, содержащими гепарин-связывающие мотивы: лактоферрином,
миелопероксидазой,
пероксидазой
эластаза,
G,
катепсин
эозинофилов,
протеиназа
3,
серпроцидинами
азуроцидин),
(нейтрофильная
тромбином,
матриксными
металлопротеиназами 2 и 12.
2.
В молекуле церулоплазмина можно выявить два сайта для взаимодействия с
белками, при этом значения констант диссоциации для предпочтительных партнеров
близки (~ 13 нМ). Первый сайт расположен между 1-м и 6-м доменами церулоплазмина, и
связывание с ним белка-партнера (лактоферрин, тромбин) влияет на ферроксидазную
активность, второй расположен в 4-м домене и позволяет связавшемуся белку
(миелопероксидаза,
серпроцидины,
пероксидаза
эозинофилов)
влиять
на
пара-
фенилендиамин-связывающий сайт в церулоплазмине.
3.
Церулоплазмин взаимодействует с лактоферрином и миелопероксидазой, образуя
пентамерный комплекс (2ЛФ:2ЦП:МПО), в котором с димерной миелопероксидазой
взаимодействуют две молекулы церулоплазмина, каждая из которых взаимодействует с
лактоферрином.
4.
Протеолитическая
ингибировать
деградация
активность
церулоплазмина
провоспалительных
лишает
ферментов:
его
способности
миелопероксидазы,
пероксидазы эозинофилов и 5-липоксигеназы.
5.
Протеолитическая деградации церулоплазмина обусловлена его гомологией с
факторами свертывания V и VIII, что проводит к гидролизу тромбином неканонического
сайта K887–V888. Выявление активного тромбина в синовиальной жидкости больных
ревматоидным артритом коррелирует с протеолитической деградацией церулоплазмина и
наличием там же активной миелопероксидазы.
6.
Апо-лактоферрин защищает церулоплазмин от деструкции пероксидом водорода,
препятствуя образованию гидроксильных радикалов, а тиоцианат – от повреждения
системой
«миелопероксидаза/пероксид
водорода/хлорид
(бромид)»
вследствие
конкуренции с субстратами за активный центр миелопероксидазы. Модифицированный
под
действием
HOCl,
HOBr
или
HOSCN
церулоплазмин
сохраняет
супероксиддисмутазную активность и способность снижать продукцию активных форм
кислорода активированными нейтрофилами.
7.
Способность миелопероксидазы связывать церулоплазмин и апоВ-100-содержащие
липопротеины приводит к появлению в плазме крови мультикомпонентных комплексов.
Интактный
церулоплазмин
снижает
проатерогенное
миелопероксидазы на липопротеины низкой плотности.
действие
хлорирующей
204
6. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
4-ПОБН – -(4-пиридил-1-оксил)-N-третбутилнитрон
5-LO – 5-липоксигеназа
а. о. – аминокислотный остаток
АФК – активные формы кислорода
ДМСО – диметилсульфоксид
ЛВП – липопротеины высокой плотности
ЛНП – липопротеины низкой плотности
ЛОНП – липопротеины очень низкой
плотности
ЛПС – липополисахарид
ЛФ – лактоферрин
МБА – N,N'-метиленбисакриламид
ММП – матриксная металлопротеиназа
МПО – миелопероксидаза
НФ – нейтрофилы
ПААГ – полиакриламидный гель
ПОЛ – перекисное окисление липидов
ПР – протамин кеты
ПЭГ – полиэтиленгликоль
ТЕМЕД – N,N,N',N'тетраметилэтилендиамин
ТФ – трансферрин
ФКС – фотонная корреляционная
спектроскопия
ЦП – церулоплазмин
ЦПпр – протеолизованный церулоплазмин
ЧСА – альбумин сыворотки человека
ЭДТА – этилендиаминтетраацетат (натрия)
ЭОФ – эозинофилы
ЭПО – пероксидаза эозинофилов
ЭПР – электронный парамагнитный
резонанс
ЭФ – электрофорез
AA – арахидоновая кислота
ABAH – гидразид 4-аминобензойной
кислоты
ABCA-1 – АТФ-связывающий кассетный
транспортер A1
ABTS – 2,2’-диазинобис(3-этилбензотриазолин-6-сульфонат) натрия
AIR – аутоингибирующий участок
AE – аминоэтил
AP-1 – активирующий белок-1
BLOTTO (bovine lacto transfer technique
optimizer) – 3%-ный раствор белков
молока в PBS
BLOTTO-T – BLOTTO с добавлением
0,05 % (v/v) Tween 20
BTEE – N-бензоил-L-тирозина этиловый
эфир
CAP37 – азуроцидин
CD – кластер дифференцировки
CG – катепсин G
CM – карбоксиметил
cPLA2 – цитозольная фосфолипаза A2
СТАВ – цетилтриметиламмония бромид
Cu,Zn-SOD – Cu,Zn-супероксиддисмутаза
DEAE – диэтиламиноэтил
DMT1 – транспортер двухвалентных
металлов
DOPA – дигидроксифенилаланин
ELISA – твердофазный
иммуноферментный анализ
ERK – киназа, регулируемая
внеклеточными сигналами
F(римская цифра) – фактор свертывания
крови
FII – протромбин
FIIa – тромбин
fMLP – формил-метионил-лейцилфенилаланин
G-CSF – гранулоцитарный колониестимулирующий фактор
GM-CSF – гранулоцитомакрофагальный
колониестимулирующий фактор
GSH – глутатион (восстановленный)
GPI – глицеролфосфоинозидный (якорь)
HBSS – среда Хэнкса
HIF – гипоксия-индуцибельный фактор
IC50 – концентрация полумаксимального
ингибирования
Ig – иммуноглобулины
IL – интерлейкин
IREG1 – ферропортин 1
Ka – константа активации
kcat – число оборотов фермента
Kd – константа диссоциации
Ki – константа ингибирования
KM – константа Михаэлиса
LCAT – лецитин:холестеринацилтрансфераза
LT – лейкотриен
MALDI – матрично-активированная
лазерная десорбция/ионизация
MAPK – митоген-активируемая киназа
белков
MAP-KAP – киназа, активируемая MAPK
MIF – фактор, ингибирующий миграцию
макрофагов
NBA – пара-нитрофенол-t-BOC-Ala
NIH – единица коагуляционной
активности FIIa в соответствии со
стандартом National Institute of Health
NF- B – ядерный фактор «каппа-би»
205
N-GAL – желатиназо-ассоциированный
липокалин нейтрофилов
NE – эластаза нейтрофилов
О2 – супероксидный анион-радикал
o-DA – орто-дианизидин
ОH – гидроксильный радикал
OZ – опсонизированный зимозан
P1–15 – пептид EEEMLENVSLVCPKD
(апоВ-100 а. о. 1–15)
P445–456 – пептид EQIQDDCTGDED
(апоВ-100 а. о. 445–456)
PABP – белковый фактор, связывающийся
с полиаденилированным концом иРНК
PACAP38 – пептид гипофиза,
активирующий аденилатциклазу
PBS – 150 мМ NaCl, 10 мМ Na-фосфатный
буфер, pH 7,4
PI3K – фосфатидилинозитол-3-киназа
PKA – протеинкиназа А
PMA – форбол-12-миристат-13-ацетат
PMSF – фенилметилсульфонилфторид
p-PD – пара-фенилендиамин
PR3 – протеиназа 3
PRR – пролин-обогащенный участок
PX – фагоцитооксидазный домен
QAE – четвертичный аминоэтил
Rac – малый G-белок (Ras-related C3
botulinum toxin substrate)
SAXS – рассеяние рентгеновских лучей
под малыми углами
SDS – додецилсульфат натрия
SOD – супероксиддисмутазная
(активность)
SR – скавенджер-рецептор
TBS – 150 мМ NaCl, 10 мМ Tris-HCl
буфер, pH 7,4
TMB – 3,3',5,5'-тетраметилбензидин
TNF – фактор некроза опухоли
Tris – трис-(оксиметил)-аминометан
Ve – объем элюции
Vmax – максимальная скорость реакции
206
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.
Алексанян Л.Р. Некоторые особенности свободнорадикального окисления и
антиоксидантной защиты у больных гемофилией в зависимости от степени тяжести
заболевания. // Дисс. канд. биол. наук, 2007. ФГУ «РНИИ гематологии и трансфузиологии
ФАВМП», Санкт-Петербург.
2.
Баркаган, З.С., Момот, А.П., Мамаев, А.Н., Макаров, В.А., Воюшина, Т.Л.,
Неведрова, О.А., Шилова, А.Н., Зяблицкая, Н.К. Новый метод определения антитромбина
III и его диагностическое значение. // Клин. лаб. диагностика. 2004. Т. 7. С. 18-21.
3.
Белова, С. В., Карякина, Е.В. Состояние окислительного гомеостаза и возможность
его коррекции в условиях экспериментального ревматоидного артрита. // Российский
физиологический журнал им. И. М. Сеченова. 2008. Т. 94. С. 962-968.
4.
Берлов, М.Н., Кораблева, Е.С., Филимонов, В.Б., Кокряков В.Н. Исследование
антимикробной активности миелопероксидазы и лактоферрина. // Вестник СанктПетербургского Университета. Серия3: Биология. 2009. №1 С. 83-89.
5.
Берлов, М.Н., Шехова, Е.А., Соколов, А.В., Филимонов, В.Б., Кокряков, В.Н.
Взаимодействие маннозо связывающего лектина и миелопероксидазы. // Вестник СанктПетербургского Университета. Серия3: Биология. 2001. № 4. С. 63-72.
6.
Василец, И.М., Машкова, Е.Т., Тетерина, З.К., Рафальсон, Д.И., Шавловский, М.М.,
Нейфах, С.А. Генетические варианты церулоплазмина среди населения Ленинграда. //
Генетика. 1974. Т 10. С. 144-151.
7.
Васильев, В.Б., Качурин, А.М., Сорока, Н.В. Дисмутирование супероксидных
радикалов церулоплазмином – детали механизма. // Биохимия. 1988. Т. 53. С. 2051-2058.
8.
Власова, И.И., Арнхольд, Ю., Осипов, А.Н., Панасенко, О.М. рН-Зависимая
регуляция активности миелопероксидазы. // Биохимия. 2006. Т. 71. С. 825 – 837.
9.
Воронина, О.В., Монахов, Н.К. Индукция образования под влиянием эстрадиола
полирибосомного конмплекса, синтезирующего церулоплазмин у крыс. // Биохимия. 1980.
Т. 45. С. 1110-1016.
10.
Говорова, Н.Ю., Шаронов, Б.П., Янковский, О.Ю., Лызлова, С.Н. Инактивация
активных форм кислорода, генерируемых миелопероксидазой, сывороточными белками. //
Докл. АН СССР. 1986. Т. 290. С. 480-483.
11.
Горудко, И.В., Черкалина, О.С., Соколов, А.В., Пулина, М.О., Захарова, Е.Т.,
Васильев, В.Б., Черенкевич, С.Н., Панасенко, О.М. Новые подходы к определению
концентрации и пероксидазной активности миелопероксидазы в плазме крови человека. //
Биоорганическая химия. 2009. Т. 35. С. 629-639.
12.
Зайчик, А.Ш., Чурилов, Л.П. Основы патохимии. Санкт-Петербург, ЭЛБИ-СПб.
2001. С. 417-418.
13.
Кокряков, В.Н. Биология антибиотиков животного происхождения, Изд-во Наука,
Санкт-Петербург. 1999.
14.
Костевич, В.А., Соколов, А.В. Взаимодействие церулоплазмина и тиоцианата как
ингибиторов миелопероксидазы в плазме крови. // Медицинский Академический Журнал.
2010. Т. 10. С. 210.
15.
Крупянко, В.И. Коррекция уравнений расчета констант двухпараметрических
типов ингибирования и активации ферментов. // Биохимия. 2007. Т. 72. С. 473-486.
16.
Маурер, Г. Диск-электрофорез. М., Мир. 1971. С. 60-61.
17.
Панасенко, О.М., Арнхольд, Ю., Сергиенко, В.И. Повреждение липидов мембран
гипохлоритом. // Биол. мембраны. 2002. Т. 19. С. 403-434.
18.
Панасенко, О.М., Горудко, И.В., Соколов, А.В. (2013) Хлорноватистая кислота как
источник свободных радикалов. // Успехи биологической химии. Т. 53. С. 195-244.
19.
Панасенко, О.М., Осипов, А.Н., Чеканов, А.В., Арнхольд, Ю., Сергиенко, В.И. При
взаимодействии гипохлорита с трет-бутилгидропероксидом образуется пероксильный
радикал. // Биохимия. 2002. Т. 67. С. 1061-1070.
207
20.
Панасенко, О.М., Осипов, А.Н., Шиллер, Ю., Арнхольд, Ю. Взаимодействие
экзогенного гипохлорита и гипохлорита, продуцируемого в системе МПО+Н2О2+Сl- с
ненасыщенным фосфатидилхолином. // Биохимия. 2002. Т. 67. С. 1071-1084.
21.
Панасенко, О.М., Панасенко, О.О., Бривиба, К., Сис, Г. Гипохлорит разрушает
каротиноиды в липопротеинах низкой плотности, снижая их резистентность к перекисной
модификации. // Биохимия. 1997. Т. 62. С. 1332-1338.
22.
Панасенко, О.М., Сергиенко, В.И. Гипохлрорит, окислительная модификация
липопротеинов крови и атеросклероз. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2001. Т.
131. С. 484-494.
23.
Панасенко, О.М., Чеканов, А.В., Власова, И.И., Соколов, А.В., Агеева, К.В.,
Пулина, М.О., Черкалина, О.С., Василье, В.Б. Влияние церулоплазмина и лактоферрина на
хлорирующую активность лейкоцитарной миелопероксидазы. Изучение методом
хемилюминесценции. // Биофизика. 2008. Т. 53. С. 573-581.
24.
Панасенко, О.М., Шпальтехольц, Г., Шиллер, Ю., Арнхольд, Ю. Опосредованное
лейкоцитарной миелопероксидазой образование бромгидринов и лизофосфолипидов из
ненасыщенных фосфатидилхолинов. // Биохимия. 2006. Т. 71. С. 707-718.
25.
Панасенко, О.М., Шпальтехольц, Г., Шиллер, Ю., Арнхольд, Ю. Опосредованная
миелопероксидазой деструкция ненасыщенных фосфатидилхолинов в составе липосом. //
Биол. мембраны. 2004. Т. 21. С. 138-150.
26.
Самыгина, В.Р., Соколов, А.В., Пулина, М.О., Бартуник, Г., Васильев, В.Б.
Рентгеноструктурный анализ высокоочищенного церулоплазмина человека. //
Кристаллография. 2008. Т. 53. С. 690-698.
27.
Сенюк, О.Ф., Скоробогатько, О.В, Тарасенко, П.Д., Ромашко, В.В., Журавец, Л.А.,
Задорожная, Л.В., Ярополов, А.И. Исследование физиологических функций человеческого
церулоплазмина. Эффект церулоплазмина на иммуноциты в норме и при патологии. //
Биохимия. 1994. Т. 59. С. 1113-1118.
28.
Соколов А.В. Структурно-функциональные характеристики взаимодействия
церулоплазмина с лактоферрином и миелопероксидазой. // Дисс. канд. биол. наук, 2007.
ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург.
29.
Соколов, А.В., Агеева, К.В., Костевич, В.А., Берлов, М.Н., Рунова, О.Л., Захарова,
Е.Т., Васильев, В.Б. Взаимодействие церулоплазмина с серпроцидинами. // Биохимия.
2010. Т. 75. С. 1544-1552.
30.
Соколов, А.В., Голенкина, Е.А., Костевич, В.А., Васильев, В.Б., Судьина, Г.Ф.
Взаимодействие церулоплазмина и 5-липоксигеназы. // Биохимия. 2010. Т. 75. С. 16871694.
31.
Соколов А.В., Захарова Е.Т., Костевич В.А., Васильев В.Б. Способ получения особо
чистого препарата ферроксидазы церулоплазмина и/или фактора свертывания крови
протромбина. Аффинный неомициновый сорбент для их получения. // Патент на
изобретение, RUS 2488403, 15.12.2011.
32.
Соколов, А.В., Захарова, Е.Т. Шавловский, М.М., Васильев, В.Б. Получение
стабильного церулоплазмина человека и его взаимодействие с протамином кеты. //
Биоорганическая химия. 2005. Т. 31. C. 269-279.
33.
Соколов, А.В., Костевич, В.А. Возможности регуляции проатерогенных свойств
миелопероксидазы с помощью веществ, ингибирующих ее активность и препятствующих
ее взаимодействию с липопротеинами низкой плотности. // Медицинский Академический
Журнал. 2012. Т. 12. С. 80-81.
34.
Соколов, А.В., Костевич, В.А. Протеолитическая деградация церулоплазмина
тромбином – пример неканонического гидролиза связи K887-V888. // Медицинский
Академический Журнал. 2010. Т. 10. С. 63-64.
35.
Соколов, А.В., Костевич, В.А., Романико, Д.Н., Захарова, Е.Т., Васильев, В.Б.
Двухстадийный метод получения церулоплазмина на основе его взаимодействия с
неомицином. // Биохимия. 2012. Т. 77. С. 775-784.
208
36.
Соколов, А.В., Прозоровский, В.Н., Васильев, В.Б. Исследование взаимодействия
церулоплазмина, лактоферрина и миелопероксидазы с помощью фотонной
корреляционной спектроскопии. // Биохимия. 2009. Т. 74. С. 1506-1509.
37.
Соколов, А.В., Пулина, М.О., Агеева, К.В., Айрапетов, М.И., Волгин, Г.Н., Берлов,
М.Н., Марков, А.Г., Яблонский, П.К., Колодкин, Н.И., Захарова, Е.Т., Васильев, В.Б.
Взаимодействие церулоплазмина, лактоферрина и миелопероксидазы. // Биохимия. 2007.
Т. 72. С. 506-514.
38.
Соколов, А.В., Пулина, М.О., Агеева, К.В., Черкалина, О.С., Захарова, Е.Т.,
Васильев, В.Б. Идентификация комплексов церулоплазмина с матриксными
металлопротеиназами 2 и 12. // Биохимия. 2009. Т. 74. С. 1703-1708.
39.
Соколов, А.В., Пулина, М.О., Захарова, Е.Т., Сусорова, А.С., Рунова, О.Л.,
Колодкин, Н.И., Васильев, В.Б. Обнаружение и выделение комплекса церулоплазминлактоферрин из грудного молока. // Биохимия. 2006. Т. 71. С. 208-215.
40.
Соколов, А.В., Пулина, М.О., Захарова, Е.Т., Шавловский, М.М., Васильев, В.Б.
Влияние лактоферрина на ферроксидазную активность церулоплазмина. // Биохимия.
2005. Т. 70. С. 1231-1236.
41.
Соколов, А.В., Пулина, М.О., Рунова, О.Л., Захарова, Е.Т., Васильев, В.Б. Комплекс
церулоплазмина и лактоферрина в слезной жидкости. // Медицинский Академический
Журнал. 2013. Т. 13. С. 39-43.
42.
Шапошников, А.М., Муха, Г.В., Здродовская, Е.П. Об общих свойствах
церулоплазминов человека и обезьяны. // Биохимия. 1967. Т. 32. С. 908-912.
43.
Шаронов, Б.П., Говорова, Н.Ю., Лызлова, С.Н. Антиоксидантные свойства и
деградация белков сыворотки активными формами кислорода (O2·, OCl-), генерируемыми
стимулированными нейтрофилами. // Биохимия. 1988. Т. 53. С. 816-825.
44.
Якубовская, Р.И., Осипова, Н.А., Немцова, Е.Р., Эделева, Н.В., Иванова, Л.М.
Препараты
Церулоплазмин
и
Лапрот
в
комплексном лечении
тяжелых
послеоперационных гнойно-септических осложнений в онкохирургии. // Российский
онкологический журнал. 2005. Т. 6. С. 34-39.
45.
Abu-Soud, H.M., and Hazen, S.L. Nitric oxide is a physiological substrate for
mammalian peroxidases. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 37524-37532.
46.
Abu-Soud, H.M., and Hazen, S.L. Nitric oxide modulates the catalytic activity of
myeloperoxidase. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 5425-5430.
47.
Acharya, K.R., and Ackerman, S.J. Eosinophil Granule Proteins: Form and Function. // J.
Biol. Chem. 2014. V. 289. № 25. P. 17406-17415.
48.
Agner, K. Verdoperoxidase. A ferment isolated from leukocytes. // Acta. Physiol. Scand.
1941. V. 2.
49.
Ago, T., Kuribayashi, F., Hiroaki, H., Takeya, R., Ito, T., Kohda, D., and Sumimoto, H.
Phosphorylation of p47phox directs phox homology domain from SH3 domain toward
phosphoinositides, leading to phagocyte NADPH oxidase activation. // Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 2003. V. 100. P. 4474–4479.
50.
Ago, T., Takeya, R., Hiroaki, H., Kuribayashi, F., Ito, T., Kohda, D., and Sumimoto, H.
The PX domain as a novel phosphoinositide-binding module. // Biochem. Biophys. Res.
Commun. 2001. V. 287. P. 733–738.
51.
Alcain, F., Low, H., and Crane, F.L. Ceruloplasmin oxidant stimulates growth. //
Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. V. 180. P. 790-796.
52.
Allard, J.B., and Brock, T.G. Structural organization of the regulatory domain of human
5-lipoxygenase. // Curr. Protein Pept. Sci. 2005. V. 6. P. 125–131.
53.
Almeida, R.P., Melchior, M., Campanelli, D., Nathan, C., and Gabay, J.E.
Complementary DNA sequence of human neutrophil azurocidin, an antibiotic with extensive
homology to serine proteases. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. V. 177. P. 688-695.
54.
Anderson, B.F., Baker, H.M., Dodson, E.J., Norris, G.E., Rumball, S.V., Waters, J.M.,
and Baker, E.N. The structure of human lactoferrin at 3.2 Å resolution. // Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 1984. V. 84. P. 1769–1773.
209
55.
Anderson, G.J., Frazer, D.M., McKie, A.T., and Vulpe, C.D. The ceruloplasmin homolog
hephaestin and the control of intestinal iron absorption. // Blood Cells Mol. Dis. 2002. V. 29. P.
367-375.
56.
Anderson, G.J., Frazer, D.M., McKie, A.T., Wilkins, S.J., and Vulpe, C.D. The
expression and regulation of the iron transport molecules hephaestin and IREG1: implications
for the control of iron export from the small intestine. // Cell Biochem. Biophys. 2002. V. 36. P.
137-146.
57.
Anderson, N.L., Nance, S.L., Pearson, T.W., and Anderson, N.G. Specific antiserun
staining of two-dimensional electrophoretic patterns of human plasma proteins immobilized on
nitricellulose. // Electrophoresis. 1982. V. 3. P. 135-142.
58.
Andersson, E., Hellman, L., Gullberg, U., and Olsson, I. The role of the propeptide for
processing and sorting of human myeloperoxidase. // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 4747-4753.
59.
Aratani, Y., Koyama, H., Nyui, S., Suzuki, K., Kura, F., and Maeda, N. Severe
impairment in early host defense against Candida albicans in mice deficient in myeloperoxidase.
// Infect. Immun. 1999. V. 67. P. 1828–1836.
60.
Arnold, R.R., Brewer, M., and Gauthier, J.J. Bactericidal activity of human lactoferrin.
Sensitivity of a variety of microorganisms. // Infect. Immun. 1980. V. 28. P. 893-898.
61.
Askari, A.T., Brennan, M.L., Zhou, X., Drinko, J., Morehead, A., Thomas, J.D., Topol,
E.J., Hazen, S.L., and Penn, M.S. Myeloperoxidase and plasminogen activator inhibitor 1 play a
central role in ventricular remodeling after myocardial infarction. // J. Exp. Med. 2003. V. 197.
P. 615-624.
62.
Atassi, M.Z., and Manshouri, T. Design of peptide enzymes (pepzymes): Surfacesimulation synthetic peptides that mimic the chymotrypsin and trypsin active sites exhibit the
activity and specificity of the respective enzyme. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1993. V. 90. P.
8282-8286.
63.
Augusto, O., Du Plessis, L.R., and Weingrill, C.L. Spin-trapping of methyl radical in the
oxidative metabolism of 1,2-dimethylhydrazine. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1985. V.
126. P. 853-858.
64.
Augusto, O., Weingrill, C.L., Schreier, S., and Amemiya, H. Hydroxyl radical formation
as a result of the interaction between primaquine and reduced pyridine nucleotides. // Arch.
Biochem. Biophys. 1986. V. 244. P. 147-155.
65.
Austin, G.E., Zhao, W.G., Zhang, W., Austin, E.D., Findley, H.W., and Murtagh, J.J.
Identification and characterization of the human myeloperoxidase promoter. // Leukemia. 1995.
V. 9. P. 848–857.
66.
Avogaro, P., Bon, G.B., and Cazzolato, G. Determination of high-density lipoproteins:
screening methods compared. // Arteriosclerosis. 1988. V. 8. P. 79-87.
67.
Bahadoran, Z., Mirmiran, P., Hosseinpanah, F., Rajab, A., Asghari, G., and Azizi, F.
Broccoli sprouts powder could improve serum triglyceride and oxidized LDL/LDL-cholesterol
ratio in type 2 diabetic patients: a randomized double-blind placebo-controlled clinical trial. //
Diabetes Res. Clin. Pract. 2012. V. 96. P. 348-354.
68.
Baker, E.N. Structure and reactivity of transferrins. // Adv. Inorg. Chem. 1994. V. 41. P.
389–463.
69.
Baker, E.N., Rumball, S.V., and Anderson, B.F. Transferrins: Insights into structure and
function from studies on lactoferrin. // Trends. Biochem. Sci. 1987. V. 12. P. 350–353.
70.
Baker, H.M., and Baker, E.N. Lactoferrin and iron: structural and dynamic aspects of
binding and release. // Biometals. 2004. V. 17. P. 209-216.
71.
Baker, H.M., and Baker, E.N. Molecular structure, binding properties and dynamics of
lactoferrin. // Cell. Mol. Life Sci. 2005. V. 62. P. 2531-2539.
72.
Bakhautdin, B., Febbraio, M., Goksoy, E., de la Motte, C.A., Gulen, M.F., Childers, E.P.,
Hazen, S.L., Li, X., and Fox, P.L. Protective role of macrophage-derived ceruloplasmin in
inflammatory bowel disease. // Gut. 2013. V. 62. P. 209-219.
210
73.
Bakkenist, A.R., Wever, R., Vulsma, T., Plat, H., and van Gelder, B.F. Isolation
procedure and some properties of myeloperoxidase from human leucocytes. // Biochim. Biophys.
Acta. 1978. V. 524. P. 45-54.
74.
Baldus, S., Heeschen, C., Meinertz, T., Zeiher, A.M., Eiserich, J.P., Munzel, T., Simoons,
M.L., and Hamm, C.W. Myeloperoxidase serum levels predict risk in patients with acute
coronary syndromes. // Circulation. 2003. V. 108. P. 1440-1445.
75.
Bank, U., and Ansorge, S. More than destructive: neutrophil-derived serine proteases in
cytokine bioactivity control. // J. Leukoc. Biol. 2001. V. 69. P. 197-206.
76.
Bannister, J.V., Bannister, W.H., Hill, A.O., Mahood, J.F., Willson, R.L., and
Wolfenden, B.S. Does caeruloplasmin dismute superoxide? No. // FEBS Lett. 1980. V. 188. P.
127-129.
77.
Baveye, S., Elass, E., Mazurier, J., and Legrand, D. Lactoferrin inhibits the binding of
lipopolysaccharides to L-selectin and subsequent production of reactive oxygen species by
neutrophils. // FEBS Lett. 2000. V. 469. P. 5–8.
78.
Beaufort, N., Leduc, D., Rousselle, J.C., Magdolen, V., Luther, T., Namane, A.,
Chignard, M., and Pidard, D. Proteolytic regulation of the urokinase receptor/CD87 on
monocytic cells by neutrophil elastase and cathepsin G. // J. Immunol. 2004. V. 172. P. 540-549.
79.
Beckman, J.S., Ye, Y.Z., Anderson, P.G., Chen, J., Accavitti, M.A., Tarpey, M.M., and
White, R. Extensive nitration of protein tyrosines in human atherosclerosis detected by
immunohistochemistry. // Biol. Chem. Hoppe Seyler. 1993. V. 375. P. 81-88.
80.
Beers, R.F., and Jr. Sizer, I.W. A spectrophotometric method for measuring the
breakdown of hydrogen peroxide by catalase. // J. Biol. Chem. 1952. V. 195. P. 133-140.
81.
Bellamy, W., Takase, M., Yamauchi, K., Wakabayashi, H., Kawase, K., and Tomita, M.
Identification of the bactericidal domain of lactoferrin. // Biochim. Biophys. Acta. 1992. V.
1121. P. 130-136.
82.
Beltramini, M., Salvato, B., Santamaria, M., and Lerch, K. The reaction of CN- with the
binuclear copper site of Neurospora tyrosinase: its relevanse for a comparison between
tyrosinase and hemocyanin active sites. // Biochim. Biophys. Acta. 1990. V. 1040. P. 365-372.
83.
Benelli, R., Albini, A., and Noonan, D. Neutrophils and angiogenesis: potential initiators
of the angiogenic cascade. // Chem. Immunol. Allergy. 2003. V. 83. P. 167-181.
84.
Bento, I., Peixoto, C., Zaitsev, V.N., and Lindley, P.F. Ceruloplasmin revisited: structural
and functional roles of various metal cation-binding sites. // Acta Crystallogr. D Biol.
Crystallogr. 2007. V. 63. P. 240-248.
85.
Bergt, C., Pennathur, S., Fu, X., Byun, J., O'Brien, K., McDonald, T.O., Singh, P.,
Anantharamaiah, G.M., Chait, A., Brunzell, J., Geary, R.L., Oram, J.F., and Heinecke, J.W. The
myeloperoxidase product hypochlorous acid oxidizes HDL in the human artery wall and impairs
ABCA1-dependent cholesterol transport. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004. V. 101. P.
13032-13037.
86.
Betten, A., Dahlgren, C., Mellqvist, U.H., Hermodsson, S., and Hellstrand, K. Oxygen
radical-induced natural killer cell dysfunction: role of myeloperoxidase and regulation by
serotonin. // J. Leukoc. Biol. 2004. V. 75. P. 1111-1115.
87.
Bianchini, A., Musci, G., and Calabrese, L. Inhibition of endothelial nitric-oxide synthase
by ceruloplasmin. // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 20265–20270.
88.
Bielli, P., Bellenchi, G.C., and Calabrese, L. Site-directed mutagenesis of human
ceruloplasmin. Production of a proteolytically stable protein and structure-activity relationships
of type 1 sites. // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 2678-2685.
89.
Blair-Johnson, M., Fiedler, T., and Fenna, R. Human myeloperoxidase: structure of a
cyanide complex and its interaction with bromide and thiocyanate substrates at 1.9 Å resolution.
// Biochemistry. 2001. V. 4. P. 13990-13997.
90.
Boesman-Finkelstein, M., and Finkelstein, R.A. Sequential purification of lactoferrin,
lysozyme and secretory immunoglobulin A from human milk. // FEBS Lett. 1982. V. 144. P. 15.
211
91.
Bolscher, B.G., Plat, H., and Wever, R. Some properties of human eosinophil peroxidase,
a comparison with other peroxidases. // Biochim. Biophys. Acta. 1984. V. 784. P. 177-186.
92.
Borregaard, N., and Cowland, J.B. Granules of the human neutrophilic
polymorphonuclear leukocyte. // Blood. 1997. V. 89. P. 3503-3521.
93.
Borregaard, N., and Cowland, J.B. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin, a
siderophore-binding eukaryotic protein. // Biometals. 2006. V. 19. P. 211-215.
94.
Borregaard, N., Heiple, J.M., Simons, E.R., and Clark, R.A. Subcellular localization of
the b-cytochrome component of the human neutrophil microbicidal oxidase: translocation during
activation. // J. Cell Biol. 1983. V. 97. P. 52-61.
95.
Bosio, S., De Gobbi, M., Roetto, A., Zecchina, G., Leonardo, E., Rizzetto, M., Lucetti,
C., Petrozzi, L., Bonuccelli, U., and Camaschella, C. Anemia and iron overload due to
compound heterozygosity for novel ceruloplasmin mutations. // Blood. 2002. V. 100. P. 22462248.
96.
Boussetta, T., Gougerot-Pocidalo, M.A., Hayem, G., Ciappelloni, S., Raad, H., Arabi
Derkawi, R., Bournier, O., Kroviarski, Y., Zhou, X.Z., Malter, J.S., Lu, P.K., Bartegi, A., Dang,
P.M., and El-Benna, J. The prolyl isomerase Pin1 acts as a novel molecular switch for TNFalpha-induced priming of the NADPH oxidase in human neutrophils. // Blood. 2010. V. 116. P.
5795-5802.
97.
Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. // Anal. Biochem. 1976. V.
72. P. 248-254.
98.
Brennan, M.L., Anderson, M.M., Shih, D.M., Qu, X.D., Wang, X.,. Mehta, A.C, Lim,
L.L., Shi, W., Hazen, S.L., Jacob, J.S., Crowley, J.R., Heinecke, J.W., and Lusis, A.J. Increased
atherosclerosis in myeloperoxidase-deficient mice. // J. Clin. Invest. 2001. V. 107. P. 419-430.
99.
Brennan, M.L., Penn, M.S., Van Lente, F., Nambi, V., Shishehbor, M.H., Aviles, R.J.,
Goormastic, M., Pepoy, M.L., McErlean, E.S., Topol, E.J., Nissen, S.E., and Hazen, S.L.
Prognostic value of myeloperoxidase in patients with chest pain. // N. Engl. J. Med. 2003. V.
349. P. 1595-1604.
100. Brennan, M.L., Wu, W., Fu, X., Shen, Z., Song, W., Frost, H., Vadseth, C., Narine, L.,
Lenkiewicz, E., Borchers, M.T., Lee, J.J., Lee, N.A., Abu-Soud, H.M., Ischiropoulos, H., and
Hazen, S.L. A tale of two controversies: defining both the role of peroxidases in nitrotyrosine
formation in vivo using eosinophil peroxidase and myeloperoxidase-deficient mice, and the
nature of peroxidase-generated reactive nitrogen species. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P.
17415-17427.
101. Britigan, B.E., Lewis, T.S., Waldschmidt, M., McCormick, M.L., and Krieg, A.M.
Lactoferrin binds CpG-containing oligonucleotides and inhibits their immunostimulatory effects
on human B cells. // J. Immunol. 2001. V. 167. P. 2921-2928.
102. Britos-Bray, M., and Friedman, A.D. Core binding factor cannot synergistally activate the
myeloperoxidase proximal enhancer in immature myeloid cells without c-myb. // Mol. Cell.
Biol. 1997. V. 17. P. 5127–5135.
103. Brock, J.H. Lactoferrin in human milk: its role in iron absorption and protection against
enteric infection in the newborn infant. // Arch. Dis. Child. 1980. V. 55. P. 417–421.
104. Brock, J.H. The physiology of lactoferrin. // Bioch. Cell. Biol. 2002. V. 80. P. 1-6.
105. Broman, L. Separation and characterization of two caeruloplasmins from human serum. //
Nature. 1958. V. 182. P. 1655-1657.
106. Brown, M.A., Stenberg, L.M., and Grant Mauk, A. Identification of catalytically
important amino acids in human ceruloplasmin by site-directed mutagenesis. // FEBS Lett. 2002.
V. 520. P. 8-12.
107. Cainelli, G., Galetti, P., Garbisa, S., Giacomini, D., Sartor, L., and Quintavalla, A. 4alkylidene-azetidin-2-ones: novel inhibitors of leukocyte elastase and gelatinase. // Bioorg. Med.
Chem. 2003. V. 11. P. 5391-5399.
212
108. Carr, A.C., Myzak, M.C., Stocker, R., McCall, M.R., and Frei, B. Myeloperoxidase binds
to low-density lipoprotein: potential implications for atherosclerosis. // FEBS Lett. 2000. V. 487.
P. 176-180.
109. Castellani, L.W., Chang, J.J., Wang, X., Lusis, A.J., and Reynolds, W.F. Transgenic mice
express human MPO -463G/A alleles at atherosclerotic lesions, developing hyperlipidemia and
obesity in -463G males. // J. Lipid. Res. 2006. V. 47. P. 1366-1377.
110. Cha, M.K., and Kim, I.H. Ceruloplasmin has a distinct active site for the catalyzing
glutathione-dependent reduction of alkyl hydroperoxide. // Biochemistry. 1999. V. 38. P. 1210412110.
111. Chatham, W.W., Blackburn, W.D. Jr., and Heck, L.W. Additive enhancement of
neutrophil collagenase activity by HOCl and cathepsin G. // Biochem. Biophys. Res. Commun.
1992. V. 184. P. 560–567.
112. Chen, H., Su, T., Attieh, Z.K., Fox, T.C., McKie, A.T., Anderson, G.J., and Vulpe, C.D.
Systemic regulation of hephaestin and IREG1 revealed in studies of genetic and nutritional iron
deficiency. // Blood. 2003. V. 102. P. 1893-1899.
113. Chen, L., Dentchev, T., Wong, R., Hahn, P., Wen, R., Bennett, J., and Dunaief, J.L.
Increased expression of ceruloplasmin in the retina following photic injury. // Mol. Vis. 2003. V.
9. P. 151-158.
114. Church, W.R., Jernigan, R.L., Toole, J., Hewick, R.M., Knopf, J., Knutson, G.J.,
Nesheim, M.E., Mann, K.G., and Fass, D.N. Coagulation factors V and VIII and ceruloplasmin
constitute a family of structurally related proteins. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1984. V. 81.
P. 6934-6937.
115. Coffey, M.J., Phare, S.M., and Peters-Golden, M. Induction of inducible nitric oxide
synthase by lipopolysaccharide/interferon gamma and sepsis down-regulates 5-lipoxygenase
metabolism in murine alveolar macrophages. // J. Immunol. 2000. V. 165. P. 3592-3598.
116. Cole, A.M., Shi, J., Ceccarelli, A., Kim, Y.H., Park, A., and Ganz, T. Inhibition of
neutrophil elastase prevents cathelicidin activation and impairs clearance of bacteria from
wounds. // Blood. 2001. V. 97. P. 297-304.
117. Cooper, R.A. Inhibition of biofilms by glucose oxidase, lactoperoxidase and guaiacol: the
active antibacterial component in an enzyme alginogel. // Int. Wound J. 2013. V. 10. P. 630-637.
118. Cregar, L., Elrod, K.C., Putnam, D., and Moore, W.R. Neuthrophil myeloperoxidase is a
potent and selective inhibitor of mast cell tryptase. // Arch. Biochem. Biophys. 1999. V. 366. P.
125-130.
119. Cuatrecasas, P., Wilchek, M., and Anfinsen, C.B. Selective enzyme purufication by
affinity chromatography. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1968. V. 61. P. 636-643.
120. Dahan, I., and Pick, E. Strategies for identifying synthetic peptides to act as inhibitors of
NADPH oxidases, or "all that you did and did not want to know about Nox inhibitory peptides".
// Cell. Mol. Life Sci. 2012. V. 69. P. 2283-2305.
121. Dalen, C.J., Whitehouse, M.W., Winterborn, C.C., and Kettle, A.J. Thiocyanate and
chloride as competing substrates for myeloperoxidase. // Biochem. J. 1997. V. 327. P. 487-492.
122. Dancey, J.T., Deubelbeiss, K.A., Harker, L.A., and Finch, C.A. Neutrophil kinetics in
man. // J. Clin. Invest. 1976. V. 58. P. 705-715.
123. Das, D., Tapryal, N., Goswami, S.K., Fox, P.L., and Mukhopadhyay, C.K. Regulation of
ceruloplasmin in human hepatic cells by redox active copper: identification of a novel AP-1 site
in the ceruloplasmin gene. // Biochem. J. 2007. V. 402. P. 135-141.
124. Daugherty, A., Dunn, J.L., Rateri, D.L., and Heinecke, J.W. Myeloperoxidase, a catalyst
for lipoprotein oxidation, is expressed in human atherosclerotic lesions. // J. Clin. Invest. 1994.
V. 94. P. 437-444.
125. Davies, J.M., Horwitz, D.A., and Davies, K.J. Potential roles of hypochlorous acid and
N-chloroamines in collagen breakdown by phagocytic cells in synovitis. // Free Radic. Biol.
Med. 1993. V. 15. P. 637–643.
126. Davis, B.J. Disk Elecrtophoresis. II. Method and application to human serum proteins. //
Ann. N. Y. Acad. Sci. 1964. V. 121. P. 404-427.
213
127. Dawson, J.H., Dooley, D.M., Clark, R., Stephens, P.J., and Gray, H.B. Spectroscopic
studies of ceruloplasmin. Electronic structures of the copper sites. // J. Am. Chem. Soc. 1979. V.
101. P. 5046-5053.
128. De Domenico, I., Ward, D.M., di Patti, M.C., Jeong, S.Y., David, S., Musci, G., and
Kaplan, J. Ferroxidase activity is required for the stability of cell surface ferroportin in cells
expressing GPI-ceruloplasmin. // EMBO J. 2007. V. 26. P. 2823-2831.
129. De Filippis, V., Vassiliev, V.B., Beltramini, M., Fontana, A., Salvato, B., Gaitskhoki,
V.S. Evidence for the molten globule state of human apo-ceruloplasmin. // Biochim. Biophys.
Acta. 1996. V. 1297. P. 119-123.
130. De Visser, M.C.H., Souverijn, J.H.M., Rosendaal, F.R., and Bertina, R.M. The effect
plasma ceruloplasmin levels on the sensitivity for activated protein C. // Br. J. Hematol. 1992. V.
118. P. 843-846.
131. Diamon, M., Yamatani, K., Igarashi, M., Fukase, N., and Kawanami, T. Fine structure of
human ceruloplasmin gene. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. V. 208. P. 1028-1035.
132. Diebold, B.A., and Bokoch, G.M. Molecular basis for Rac2 regulation of phagocyte
NADPH oxidase. // Nat. Immunol. 2001. V. 2. P. 211–215.
133. Diekmann, D., Abo, A., Johnston, C., Segal, A.W., and Hall, A. Interaction of Rac with
p67phox and regulation of phagocytic NADPH oxidase activity. // Science. 1994. V. 265. P.
531–533.
134. Duling, D.R. Simulation of multiple isotropic spin-trap EPR spectra. // J. Magn. Reson.
B. 1994. V. 104. P. 105-110.
135. Ehrenwald, E., and Fox, P.L. Isolation of nonlabile human ceruloplasmin by
chromatographic removal of a plasma metalloproteinase. // Arch. Biochem. Biophys. 1994. V.
309. P. 392-395.
136. Eiserich, J.P., Baldus, S., Brennan, M.L., Ma, W., Zhang, C., Tousson, A., Castro, L.,
Lusis, A.J., Nauseef, W.M., White, C.R., and Freeman, B.A. Myeloperoxidase, a leukocytederived vascular NO oxidase. // Science. 2002. V. 296. P. 2391-2394.
137. El Benna, J., Faust, L.P., and Babior, B.M. The phosphorylation of the respiratory burst
oxidase component p47phox during neutrophil activation. Phosphorylation of sites recognized by
protein kinase C and by proline-directed kinases. // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 23431–
23436.
138. El Ouriaghli, F., Fujiwara, H., Melenhorst, J.J., Sconocchia, G., Hensel, N., and Barrett,
A.J. Neutrophil elastase enzymatically antagonizes the in vitro action of G-CSF: implications for
the regulation of granulopoiesis. // Blood. 2003. V. 101. P. 1752-1758.
139. Elass, E., Masson, M., Mazurier, J., and Legrand, D. Lactoferrin inhibits the
lipopolysaccharide-induced expression and proteoglycan-binding ability of interleukin-8 in
human endothelial cells. // Infect. Immun. 2002. V. 70. P. 1860–1866.
140. Elass-Rochard, E., Legrand, D., Salmon, V., Roseanu, A., Trif, M., Tobias, P.S.,
Mazurier, J., and Spik, G. Lactoferrin inhibits the endotoxin interaction with CD14 by
competition with the lipopolysaccharide-binding protein. // Infect. Immun. 1998. V. 66. P. 486–
491.
141. El-Benna, J., Dang, P.M., Gougerot-Pocidalo, M.A., Marie, J.C., and Braut-Boucher, F.
p47phox, the phagocyte NADPH oxidase/NOX2 organizer: structure, phosphorylation and
implication in diseases. // Exp. Mol. Med. 2009. V. 41. P. 217-225.
142. Ellison, R.T., and Giehl, T.J. Killing of gram-negative bacteria by lactoferrin and
lysozyme. // J. Clin. Invest. 1991. V. 88. P. 1080-1091.
143. Elrod, K.C., Moore, W.R., Abraham, W.M., and Tanaka, R.D. Lactoferrin, a potent
tryptase inhibitor, abolishes latephase airway responses in allergic sheep. // Am. J. Respir. Crit.
Care Med. 1997. V. 156. P. 375–381.
144. Exner, M., Hermann, M., Hofbauer, R., Hartmann, B., Kapiotis, S., and Gmeiner, B.
Homocysteine promotes the LDL oxidase activity of ceruloplasmin. // FEBS Lett. 2002. V. 531.
P. 402-406.
214
145. Eyer, P., Worek, F., Kiderlen, D., Sinko, G., Stuglin, A., Simeon-Rudolf, V., and Reiner,
E. Molar absorption coefficients for the reduced Ellman reagent: reassessment. // Anal. Biochem.
2003. V. 312. P. 224-227.
146. Farver, O., Bendahl, L., Skov, L.K., and Pecht, I. Human ceruloplasmin. Intramolecular
electron transfer kinetics and equilibration. // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 26135-26140.
147. Fiedler, T.J., Davey, C.A., and Fenna, R.E. X-ray crystal structure and characterization of
halide-binding sites of human myeloperoxidase at 1.8 Å resolution. // J. Biol. Chem. 2000. V.
275. P. 11964–11971.
148. Finan, P., Shimizu, Y., Gout, I., Hsuan, J., Truong, O., Butcher, C., Bennett, P.,
Waterfield, M.D., and Kellie, S. An SH3 domain and proline-rich sequence mediate an
interaction between two components of the phagocyte NADPH oxidase complex. // J. Biol.
Chem. 1994. V. 269. P. 13752–13755.
149. Flamand, N., Luo, M., Peters-Golden, M., and Brock, T.G. Phosphorylation of serine 271
on 5-lipoxygenase and its role in nuclear export. // J. Biol. Chem. 2009. V. 284. P. 306–313.
150. Fleming, A. On a remarkable bacteryolytic fermant found in tissues and secretions. //
Proc. Roy. Soc. Lond. 1922. V. 93. P. 306-317.
151. Fleming, R.E., and Gitlin, J.D. Structural and functional analysis of the 5`-flanking region
of the rat ceruloplasmin gene. // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 479-486.
152. Fling, S.P., and Gregerson, D.S. Peptide and protein molecular weigth determination by
electrophoresis using a high-molarity tris buffer system without urea. // Anal. Biochem. 1986. V.
155. P. 83-88.
153. Floris, G., Medda, R., Padiglia, A., and Musci, G. The physiopathological significance of
ceruloplasmin. A possible therapeutic approach. // Biochem. Pharmacol. 2000. V. 60. P. 17351741.
154. Ford, A.M., Bennett, C.A., Healy, L.E., Towatori, M., Greaves, M.F., and Enver, T.
Regulation of the myeloperoxidase enhancer binding proteins Pu1, C-EBP alpha, -beta and -delta
during granulocyte lineage specification. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1996. V. 93. P. 10838–
10843.
155. Fortna, R.R., Watson, H.A., and Nyguist, S.E. Glycosyl phosphatidylinositol-anchored
ceruloplasmin is expressed by rat Sertoli cells and is concentrated in detergent-insoluble
membrane fractions. // Biol. Reprod. 1999. V. 61. P. 1042-1049.
156. Fox, P.L. The copper-iron chronicles: the story of an intimate relationship. // Biometals.
2003. V. 16. P. 9-40.
157. Fransson, G.B., and Lonnerdal, B. Iron in human milk. // J. Pediatr. 1980. V. 96. P. 380384.
158. Freeman, J.L., and Lambeth, J.D. NADPH oxidase activity is independent of p47phox in
vitro. // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 22578–22582.
159. Freinstein, G., and Janoff, A. A rapid method of purification of human granulocyte
cationic neutral proteases: purification and further characterization of human granulocyte
elastase. // Biochim. Biophys. Acta. 1975. V. 403. P. 493-505.
160. Frieden, E., and Hsieh, S. Ceruloplasmin: the cooper transport protein with essential
oxidase activity. // Аdv. Enzymol. 1976. V. 44. P. 187-236.
161. Furmanski, P., Li, Z.P., Fortuna, M.B., Swamy, C.V., and Das, M.R. Multiple molecular
forms of human lactoferrin. Identification of a class of lactoferrins that possess ribonuclease
activity and lack iron-binding capacity. // J. Exp. Med. 1989. V. 170. P. 415-429.
162. Furtmüller, P.G., Burner, U., and Obinger, C. Reaction of myeloperoxidase compound I
with chloride, bromide, iodide, and thiocyanate. // Biochemistry. 1998. V. 37. P. 17923–17930.
163. Furtmüller, P.G., Zederbauer, M., Jantschko, W., Helm, J., Bogner, M., Jakopitsch, C.,
and Obinger, C. Active site structure and catalytic mechanisms of human peroxidases. // Arch.
Biochem. Biophys. 2006. V. 445. P. 199-213.
164. Gabay, J.E., and Almeida, R.P. Antibiotic peptides and serine protease homologs in
human polymorphonuclear leukocytes: defensins and azurocidin. // Curr. Opin. Immunol. 1993.
V. 5. P. 97-102.
215
165. Gallwitz, M., Enoksson, M., Thorpe, M., and Hellman, L. The extended cleavage
specificity of human thrombin. // PLoS One. 2012. V. 7. e31756.
166. Gambling, L., Danzeisen, R., Fosset, C., Andersen, H.S., Dunford, S., Srai, S.K., and
McArdle, H.J. Iron and copper interactions in development and the effect on pregnancy outcome.
// J. Nutr. 2003. V. 133. P. 1554-1556.
167. Gardiner, E.E., De Luca, M., McNally, T., Michelson, A.D., Andrews, R.K., and Berndt,
M.C. Regulation of P-selectin binding to the neutrophil P-selectin counter-receptor P-selectin
glycoprotein ligand-1 by neutrophil elastase and cathepsin G. // Blood. 2001. V. 98. P. 14401447.
168. Gazda, M., and Margerum, D.W. Reactions of monochloramine with Br2, Br3ˉ, HOBr,
and OBrˉ: formation of bromochloramines. // Inorg. Chem. 1994. V. 33. P. 118-123.
169. Gazzano-Santoro, H., Parent, J.B., Grinna, L., Horwitz, A., Parsons, T., Theofan, G.,
Elsbach, P., Weiss, J., and Conlon, P.J. High-affinity binding of the bactericidal/permeabilityincreasing protein and a recombinant amino-terminal fragment to the lipid A region of
lipopolysaccharide. // Infect. Immun. 1992. V. 60. P. 4754-4761.
170. Ghibaudi, E., and Laurenti, E. Unraveling the catalytic mechanism of lactoperoxidase and
myeloperoxidase. // Eur. J. Biochem. 2003. V. 270. P. 4403-4412.
171. Gifford, J.L., Ishida, H., and Vogel, H.J. Structural characterization of the interaction of
human lactoferrin with calmodulin. // PLoS One. 2012. V. 7. e51026.
172. Gitlin, J.D. Transcriptional regulation of ceruloplasmin gene expression during
inflammation. // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 6821-6287.
173. Glezer, I., Chernomoretz, A., David, S., Plante, M.M., and Rivest, S. Genes involved in
the balance between neuronal survival and death during inflammation. // PLoS One. 2007. V. 2.
e310.
174. Goldstein, I.M., Kaplan, H.B., Edelson, H.S., and Weissmann, G. Ceruloplasmin a
scavenger of superoxide anion radicals. // J.Biol. Chem. 1979. V. 254. P. 4040-4045.
175. Gorudko, I.V., Grigorieva, D.V., Shamova, E.V., Kostevich, V.A., Sokolov, A.V.,
Mikhalchik, E.V., Cherenkevich, S.N., Arnhold, J., and Panasenko, O.M. Hypohalous acidmodified human serum albumin induces neutrophil NADPH-oxidase activation, degranulation
and shape change. // Free Radic. Biol. Med. 2014. V. 68. P. 326-334.
176. Grasso, G., and Bonnet, S. Metal complexes and metalloproteases: targeting
conformational diseases. // Metallomics. 2014. V. 6. P. 1346-1357.
177. Griffin, S.V., Chapman, P.T., Lianos, E.A., and Lockwood, C.M. The inhibition of
myeloperoxidase by ceruloplasmin can be reversed by anti-myeloperoxidase antibodies. //
Kidney Internation. 1999. V. 55. P. 917-925.
178. Groemping, Y., Lapouge, K., Smerdon, S.J., and Rittinger, K. Molecular basis of
phosphorylation-induced activation of the NADPH oxidase. // Cell. 2003. V. 113. P. 343–355.
179. Guinier, A. La diffraction des rayons X aux tres petits angles; application a l'etude de
phenomenes ultramicroscopiques. // Ann. Phys. (Paris). 1939. V. 12. P. 161-237.
180. Gunther, M.R., Hanna, P.M., Mason, R.P., and Cohen, M.S. Hydroxyl radical formation
from cuprous ion and hydrogen peroxide: A spin-trapping study. // Arch. Biochem. Biophys.
1995. V. 316. P. 515-522.
181. Gutteridge, J.M.C., and Stocks, J. Caeruloplasmin: physiological and pathological
perspectrives. // Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 1981. V. 14. P. 257-329.
182. Ha-Duong, N.T., Eid, C., Hémadi, M., and El Hage Chahine J.M. In vitro interaction
between ceruloplasmin and human serum transferrin. // Biochemistry. 2010. V. 49. P. 1026110263.
183. Hallett, M.B., and Lloyds, D. Neutrophil priming: the cellular signals that say 'amber' but
not 'green'. // Immunol. Today. 1995. V. 16. P. 264-268.
184. Hammarberg, T., Provost, P., Persson, B., and Radmark, O. The N-terminal domain of 5lipoxygenase binds calcium and mediates calcium stimulation of enzyme activity. // J. Biol.
Chem. 2000. V. 275. P. 38787–38793.
216
185. Hampton, M.B., Kettle, A.J., and Winterbourn, C.C. Inside the neutrophil phagosome:
oxidants, myeloperoxidase, and bacterial killing. // Blood. 1998. V. 92. P. 3007–3017.
186. Harris, Z.L., Durley, A.P., Man, Tsz.K., and Gitlin, J.D. Targeted gene disruption reveals
an essential role for ceruloplasmin in cellular iron efflux. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1999.
V. 96. P. 10812-10817.
187. Harris, Z.L., Klomp, L.W.J., and Gitlin, J.D. Aceruloplasminemia: an inherited
neurodegenerative disease with impairment of iron homeostasis. // Am. J. Clin. Nutr. 1998. V.
67. P. 972-977.
188. Harris, Z.L., Takahashi, Y., Miyajima, H., Serizawa, M., MacGillivray, R.T.A., and
Gitlin, J.D. Aceruloplasminemia: molecular characterization of this disorder of iron metabolism.
// Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1995. V. 92. P. 2539–2543.
189. Hart, E.B., Steenbock, H., Waddell, H., and Elvahjem, C.A. Iron in nutrition. VII.
Copper as a supplement to iron for hemoglobin building in the rat. // J. Biol. Chem. 1928. V. 77.
P. 797-812.
190. Haversen, L., Ohlsson, B.G., Hahn-Zoric, M., Hanson, L.A., and Mattsby-Baltzera, I.
Lactoferrin down-regulates the LPS-induced cytokine production in monocytic cells via NF-kB.
// Cell. Immunol. 2002. V. 220. P. 83-95.
191. Hawkins, C.L., and Davies, M.J. The role of reactive N-bromo species and radical
intermediates in hypobromous acid-induced protein oxidation. // Free Radic. Biol. Med. 2005. V.
39. P. 900-912.
192. Hazeldine, J., Hampson, P., and Lord, J.M. The impact of trauma on neutrophil function.
// Injury. 2014. pii: S0020-1383(14)00314-3. doi: 10.1016/j.injury.2014.06.021.
193. Hazell, L.J., Arnold, L., Flowers, D., Waeg, G., Malle, E., and Stocker, R. Presence of
hypochlorite-modified proteins in human atherosclerotic lesions. // J. Clin. Invest. 1996. V. 97.
P. 1535-1544.
194. Hazen, S.L., and Heinecke, J.W. 3-Chlorotyrosine, a specific marker of myeloperoxidasecatalyzed oxidation, is markedly elevated in low density lipoprotein isolated from human
atherosclerotic intima. // J. Clin. Invest. 1997. V. 99. P. 2075-2081.
195. Hazen, S.L., Hsu, F.F., Mueller, D.M., Crowley, J.R., and Heinecke, J.W. Human
neutrophils employ chlorine gas as an oxidant during phagocytosis. // J. Clin. Invest. 1996. V.
98. P. 1283-1289.
196. He, J., and Furmanksi, P. Sequence specificity and transcriptional activation in the
binding lactoferrin to DNA. // Nature. 1995. V. 373. P. 721-724.
197. He, S., McEuen, A.R., Blewett, S.A., Li, P., Buckley, M.G., Leufkens, P., and Walls,
A.F. The inhibition of mast cell activation by neutrophil lactoferrin: uptake by mast cells and
interaction with tryptase, chymase and cathepsin G. // Biochem. Pharmacol. 2003. V. 65. P.
1007–1015.
198. Hellman, N.E., Kono, S., Mancini, G.M., Hoogeboom, A.G., de Jong, G.L., and Gitlin,
J.D. Mechanisms of copper incorporation into human ceruloplasmin. // J. Biol. Chem. 2002. V.
277. P. 46632-46638.
199. Heyworth, P.G., Cross, A.R., and Curnutte, J.T. Chronic granulomatous disease. // Curr.
Opin. Immunol. 2003. V. 15. P. 578–584.
200. Hilton, M., Spenser, D.C., Ross, P., Ramsey, A., and McArdle, H.J. Characterisation of
the copper uptake mechanism and isolation of the ceruloplasmin receptor/copper transporter in
human placental vesicles. // Biochim. Biophys. Acta. 1995. V. 1245. P. 153-160.
201. Hindenburg, A., Spitznagel, J., and Arnheim, N. Isozymes of lysozyme in leukocytes and
egg white: evidence for the species-specific control of egg-white lysozyme synthesis. // Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1974. V. 71. P. 1653-1657.
202. Holmberg, C.G. On the presence of a laccase-like enzyme in serum and its relation to the
copper in serum. // Acta Physiol. Scand. 1944. V. 8. P. 227-229.
203. Holmberg, C.G., and Laurell, C.B. Investigation in serum copper. II. // Acta Chem.
Scand. 1948. V. 2. P. 550-556.
217
204. Holmberg, C.G., and Laurell, C.B. Investigation in serum copper. III. // Acta Chem.
Scand. 1951. V. 5. P. 476-480.
205. Hudson, D.M., Krisinger, M.J., Griffiths, T.A., and Macgillivray R.T. Neither human
hephaestin nor ceruloplasmin forms a stable complex with transferrin. // J Cell Biochem. 2008.
V. 103. P. 1849-1855.
206. Hurley, C.K. Electrophoresis of histones: a modified Panyim and Chalkley system for
slab gels. // Anal. Biochem. 1977. V. 80. P. 624-626.
207. Ilumets, H., Rytila, P., Demedts, I., Brusselle, G.G., Sovijarvi, A., Myllarniemi, M.,
Sorsa, T., and Kinnula, V.L. Matrix metalloproteinases -8, -9 and -12 in smokers and patients
with stage 0 COPD. // Int. J. Chron. Obstruct. Pulmon. Dis. 2007. V. 2. P. 369–379.
208. Inanami, O., Johnson, J.L., McAdara, J.K., El Benna, J., Faust, L.R., Newburger, P.E.,
and Babior, B.M. Activation of the leukocyte NADPH oxidase by phorbol ester requires the
phosphorylation of p47PHOX on serine 303 or 304. // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 9539–
9543.
209. Inoue, K., Akaike, T., Miyamoto, Y., Okamoto, T., Sawa, T., Otagiri, M., Suzuki, S.,
Yoshimura, T., and Maeda, H. Nitrosothiol formation catalyzed by ceruloplasmin. Implication
for cytoprotective mechanism in vivo. // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 27069-27075.
210. Iwata, T., Kantarci, A., Yagi, M., Jackson, T., Hasturk, H., Kurihara, H., and Van Dyke,
T.E. Ceruloplasmin induces polymorphonuclear leukocyte priming in localized aggressive
periodontitis. // J. Periodontol. 2009. V. 80. P. 1300-1306.
211. Jain, S., Gautam, V., Naseem, S. Acute-phase proteins: As diagnostic tool. // J. Pharm.
Bioall. Sci. 2011. V. 3. P. 118-127.
212. Jeong, S.Y., and David, S. GPI-anchored ceruloplasmin is required for iron efflux from
cells in the central nervous system. // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 27144-27148.
213. Juan, S.H., and Aust, S.D. Studies on the interaction between ferritin and ceruloplasmin.
// Arch. Biochem. Biophys. 1998. V. 355. P. 56-62.
214. Kami, K., Takeya, R., Sumimoto, H., and Kohda, D. Diverse recognition of non-PxxP
peptide ligands by the SH3 domains from p67phox, Grb2 and Pex13p. // EMBO J. 2002. V. 21.
V. 4268–4276.
215. Kanai, F., Liu, H., Field, S.J., Akbary, H., Matsuo, T., Brown, G.E., Cantley, L.C., and
Yaffe, M.B. The PX domains of p47phox and p40phox bind to lipid products of PI(3)K. // Nat.
Cell. Biol. 2001. V. 3. P. 675–678.
216. Kang, J.H., Kim, K.S., Choi, S.Y., Kwon, H.Y., Won, M.H., and Kang, T.C. Carnosine
and related dipeptides protect human ceruloplasmin against peroxyl radical-mediated
modification. // Mol. Cells. 2002. V. 13. P. 498-502.
217. Karathanassis, D., Stahelin, R.V., Bravo, J., Perisic, O., Pacold, C.M., Cho, W., and
Williams, R.L. Binding of the PX domain of p47phox to phosphatidylinositol 3,4-bisphosphate
and phosphatidic acid is masked by an intramolecular interaction. // EMBO J. 2002. V. 21. P.
5057–5068.
218. Karlsson, A., and Dahlgren, C. Assembly and activation of the neutrophil NADPH
oxidase in granule membranes. // Antioxid. Redox. Signal. 2002. V.4. P. 49-60.
219. Kataoka, M., and Tavassoli, M. Identification of ceruloplasmin receptors on the surface
of human blood monocytes, granulocytes, and lymphocytes. // Exp. Hematol. 1985. V. 13. P.
806-810.
220. Khanna-Gupta, A., Zibello, T., Kolla, S., Neufeld, E.L., and Berliner, N. CCAAT
displacement protein (CDP/cut) recognizes a silenser elenent within the lactoferrin gene
promoter. // Blood. 1997. V. 90. P. 2784-2795.
221. Khanna-Gupta, A., Zibello, T., Simkevich, C., Rosmarin, A.G., and Berliner, N. Sp1 and
C/EBP are nessesary to activate the lactoferrin gene promoter during myeloid differentiation. //
Blood. 2000. V. 95. P. 3734-3741.
222. Kim, I.G., and Park, S.Y. Requirement of intact human ceruloplasmin for the glutathionelinked peroxidase activity. // FEBS Lett. 1998. V. 437. P. 293-296.
218
223. Kim, I.G., Park, S.Y., Kim, K.C., and Yum, J.J. Thiol-linked peroxidase activity of
human ceruloplasmin. // FEBS Lett. 1998. V. 431. P. 473-475.
224. Kim, K.S., Choi, S.Y., Kwon, H.Y., Won, M.H., Kang, T.-C., and Kang, J.H. The
ceruloplasmin and hydrogen peroxide system induces alpha-synuclein aggregation in vitro. //
Biochemie. 2002. V. 84. P. 625-631.
225. Kingston, I.B., Kingston, B.L., and Putnam, F.W. Chemical evidence that proteolytic
cleavage causes the heterogeneity present in human ceruloplasmin preparations. // Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 1977. V. 74. P. 5377-5381.
226. Kingston, I.B., Kingston, B.L., and Putnam, F.W. Complete amino acid sequence of a
histidine-rich proteolytic fragment of human ceruloplasmin. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
1979. V. 76. P. 1668-1672.
227. Kingston, I.B., Kingston, B.L., and Putnam, F.W. Complete amino acid sequence of a
histidine-rich proteolytic fragment of human ceruloplasmin. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
1979. V. 76. P. 1668-1672.
228. Klebanoff, S.J. Bactericidal effect of Fe2+, ceruloplasmin and phosphate. // Arch.
Biochem. Biophys. 1992. V. 295. P. 302-308.
229. Klebanoff, S.J. Myeloperoxidase: contribution to the microbicidal activity of intact
leukocytes. // Science. 1970. V. 169. P. 1095-1097.
230. Klebanoff, S.J. Myeloperoxidase: friend and foe. // J. Leukoc. Biol. 2005. V. 77. P. 598625.
231. Klempner, M.S., Dinarello, C.A., and Gallin, J.I. Human leukocytic pyrogen induces
release of specific granule contents from human neutrophils. // J. Clin. Invest. 1978. V. 61. P.
1330-1336.
232. Klomp, L.W.J., and Gitlin, J.D. Expression of the ceruloplasmin gene in the human retina
and brain: implications for a pathogenic model in aceruloplasminemia. // Human. Molecular.
Genetics. 1996. V. 5. P. 1989-1996.
233. Klomp, L.W.J., Farhangrazi, Z.S., Dugan, L.L., and Gitlin, J.D. Ceruloplasmin gene
expression in the murine central nervous system. // J. Clin. Invest. 1996. V. 98. P. 207-215.
234. Knaus, U.G., Heyworth, P.G., Evans, T., Curnutte, J.T., and Bokoch, G.M. Regulation of
phagocyte oxygen radical production by the GTP-binding protein Rac 2. // Science. 1991. V.
254. P. 1512–1515.
235. Koga, H., Terasawa, H., Nunoi, H., Takeshige, K., Inagaki, F., and Sumimoto, H.
Tetratricopeptide repeat (TPR) motifs of p67phox participate in interaction with the small
GTPase Rac and activation of the phagocyte NADPH oxidase. // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P.
25051–25060.
236. Kolset, S.O., and Gallagher, J.T. Proteoglycans in haemopoietic cells. // Biochim.
Biophys. Acta. 1990. V. 1032. P. 191–211.
237. Kono, S. Aceruloplasminemia: an update. // Int. Rev. Neurobiol. 2013. V. 110. P. 125151.
238. Koshkin, V., Lotan, O., and Pick, E. The cytosolic component p47phox is not a sine qua
non participant in the activation of NADPH oxidase but is required for optimal superoxide
production. // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 30326–30329.
239. Krauss, R.M., and Burke, D.J. Identification of multiple subclasses of plasma low density
lipoproteins in normal humans. // J. Lipid Res. 1982. V. 23. P. 97-104.
240. Krsek-Staples, J.A., and Webster, R.O. Ceruloplasmin inhibits carbonyl formation in
endogenous cell proteins. // Free Radic. Biol. Med. 1993. V. 14, P. 115-125.
241. Kuhlov, C.J., Krady, J.K., Basu, A., and Levinson, S.W. Astrocytic ceruloplasmin
expression, which is induced by IL-1beta and by traumatic brain injury, increases in the absence
of the IL-1 type 1 receptor. // Glia. 2003. V. 44. P. 76-84.
242. Kumar, A.P., and Reynolds, W.F. Statins downregulate myeloperoxidase gene expression
in macrophages. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005. V. 331. P. 442-451.
219
243. Kuribayashi, F., Nunoi, H., Wakamatsu, K., Tsunawaki, S., Sato, K., Ito, T., and
Sumimoto, H. The adaptor protein p40phox as a positive regulator of the superoxideproducing
phagocyte oxidase. // EMBO J. 2002. V. 21. P. 6312–6320.
244. Kutter, D., Devaquet, P., Vanderstocken, G., Paulus, J.M., Marchal, V., and Gothot, A.
Consequences of total and subtotal myeloperoxidase deficiency: risk or benefit. // Acta
Haematol. 2000. V. 104. P. 10-15.
245. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
Bacteriophag. // Nature (London). 1970. V. 227. P. 680-686.
246. Lahey, M.E., Gubler, C.J., Chase, S., and Cartwright, G.E. Studies in copper metabolism
II. Hematologic manifestations of cooper deficiency in swine. // Blood. 1952. V. 7. P. 10531073.
247. Lanza, F. Clinical manifestation of myeloperoxidase deficiency. // J. Mol. Med. 1998. V.
76. P. 676–681.
248. Laurell, C.B. Quantitative estimation of proteins by electrophoresis in antibodycontaining agarose gel. // In Protides of the biological fluids. Edited by H. Peeters. Elsevier,
Amsterdam. 1967. P. 499-502.
249. Lee, C.M., Lo, H.W., Shao, R.P., Wang, S.C., Xia, W., Gershenson, D.M., and Hung,
M.C. Selective activation of ceruloplasmin promoter in ovarian tumors: potential use for gene
therapy. // Cancer Res. 2004. V. 64. P. 1788–1793.
250. Legrand, D., Mazurier, J., Aubert, J.P., Loucheux-Lefebvre, M.H., Montreuil, J., and
Spik, G. Evidence for interactions between the 30 kDa N- and 50 kDa C-terminal tryptic
fragments of human lactotransferrin. // Biochem. J. 1986. V. 236. P. 839-844.
251. Leong, W-I., and Lonnerdal, B. Hepcidin, the recently identified peptide that appears to
regulate iron absorbtion. // J. Nutr. 2004. V. 134. P. 1-4.
252. Leoni, V., Albertini, R., Passi, A., Abuja, P.M., Borroni, P., D'Eril, G.M., and De Luca,
G. Glucose accelerates copper- and ceruloplasmin-induced oxidation of low-density lipoprotein
and whole serum. // Free Radic. Res. 2002. V. 36. P. 521-529.
253. Leto, T.L., Adams, A.G., and de Mendez, I. Assembly of the phagocyte NADPH oxidase:
binding of Src homology 3 domains to proline-rich targets. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1994.
V. 91. P. 10650–10654.
254. Leusen, J.H., Fluiter, K., Hilarius, P.M., Roos, D., Verhoeven, A.J., and Bolscher, B.G.
Interactions between the cytosolic components p47phox and p67phox of the human neutrophil
NADPH oxidase that are not required for activation in the cell-free system. // J. Biol. Chem.
1995. V. 270. P. 11216–11221.
255. Lindley, P.F., Card, G., Zaitseva, I., Zaitsev, V., Reinhammar, B., Selin-Lindgren, E., and
Yosida, K. An X-ray structural study of human ceruloplasmin in relation to ferroxidase activity.
// J. Biol. Inorg. Chem. 1997. V. 2. P. 454-463.
256. Liu, L.H., Gladwell, W., and Teng, C.T. Detection of exon polymorphisms in the human
lactoferrin gene. // Biocem. Cell Biol. 2002. V. 80. P. 17-22.
257. Lopez-Boado, Y.S., Espinola, M., Bahr, S., and Belaaouaj, A. Neutrophil serine
proteinases cleave bacterial flagellin, abrogating its host response-inducing activity. // J.
Immunol. 2004. V. 172. P. 509-515.
258. Lu, Y., Roe, J.A., Gralla, E.B., and Valentine, J.S. Metalloprotein ligand redesign:
characterization of cooper-cysteinate proteins derived from yeast copper-zinc superoxide
dismutase. // In: Bioorganic Chemistry of Copper; (Karlin K.D. and Tieklar Z. - eds.); Chapman
& Hall, New York. 1993. P. 64-77.
259. Luo, M., Jones, S.M., Flamand, N., Aronoff, D.M., Peters-Golden, M., and Brock, T.G.
Phosphorylation by protein kinase a inhibits nuclear import of 5-lipoxygenase. // J. Biol. Chem.
2005. V. 280. P. 40609–40616.
260. MacLachlan, J., Wotherspoon, A.T., Ansell, R.O., and Brooks, C.J. Cholesterol oxidase:
sources, physical properties and analytical applications. // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 2000.
V. 72. P. 169-195.
220
261. Magdoff-Fairchild, B., Lovell, F.M., and Low, B.W. An X-ray crystallographic study of
ceruloplasmin. Determination of molecular weight. // J. Biol. Chem. 1969. V. 244. P. 3497-3499.
262. Makni-Maalej, K., Chiandotto, M., Hurtado-Nedelec, M., Bedouhene, S., GougerotPocidalo, M.A., Dang, P.M., and El-Benna, J. Zymosan induces NADPH oxidase activation in
human neutrophils by inducing the phosphorylation of p47phox and the activation of Rac2:
involvement of protein tyrosine kinases, PI3Kinase, PKC, ERK1/2 and p38MAPkinase. //
Biochem. Pharmacol. 2013. V. 85. P. 92-100.
263. Malle, E., Hazell, L., Stocker, R., Sattler, W., Esterbauer, H., and Waeg, G. Immunologic
detection and measurement of hypochlorite-modified LDL with specific monoclonal antibodies.
// Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 1995. V. 15. P. 982-989.
264. Malle, E., Marsche, G., Arnhold, J., and Davies, M.J. Modification of low-density
lipoprotein by myeloperoxidase-derived oxidants and reagent hypochlorous acid. // Biochim.
Biophys. Acta. 2006. V. 1761. P. 392-415.
265. Malle, E., Wag, G., Thiery, J., Sattler, W., and Grone, H.J. Hypochlorite-modified
(lipo)proteins are present in rabbit lesions in response to dietary cholesterol. // Biochem.
Biophys. Res. Commun. 2001. V. 289. P. 894-900.
266. Mancuso, P., Nana-Sinkam, P., and Peters-Golden, M. Leukotriene B4 augments
neutrophil phagocytosis of Klebsiella pneumoniae. // Infect. Immun. 2001. V. 69. P. 2011-2016.
267. Mann, K.G., Lawler, C.M., Vehar, G.A., and Church, W.R. Coagulation Factor V
contains copper ion. // J. Biol. Chem. 1984. V. 259. P. 12949-12951.
268. Marques, L., Auriac, A., Willemetz, A., Banha, J., Silva, B., Canonne-Hergaux, F., and
Costa, L. Immune cells and hepatocytes express glycosylphosphatidylinositol-anchored
ceruloplasmin at their cell surface. // Blood Cells Mol. Dis. 2012. V. 48. P. 110-120.
269. Marsche, G., Furtmüller, P.G., Obinger, C., Sattler, W., and Malle, E. Hypochloritemodified high-density lipoprotein acts as a sink for myeloperoxidase in vitro. // Cardiovasc. Res.
2008. V. 79. P. 187-194.
270. Martin, F., Linden, T., Katschinski, D.M., Oehme, F., Flamme, I., Mukhopadhyay, C.K.,
Eckhardt, K., Tröger, J., Barth, S., Camenisch, G., and Wenger, R.H. Copper-dependent
activation of hypoxia-inducible factor (HIF)-1: implications for ceruloplasmin regulation. //
Blood. 2005. V. 105. P. 4613-4619.
271. Martinez-Subiela, S., Tecles, F., and Ceron, J.J. Comparison of two automated
spectrophotometric methods for ceruloplasmin measurement in pigs. // Res. Vet. Sci. 2007. V.
83. P. 12-19.
272. Masson, P.L. La Lactoferrine. Proteine des Secretions Externes et des Leucocytes
Neutrophiles, Editions Arscia S.A., Brussels. 1970.
273. Masson, P.L., Heremans, J.F., and Schonne, E. Lactoferrin, an iron-binding protein in
neutrophilic leukocytes. // J. Exp. Med. 1969. V. 130. P. 643–658.
274. Matute, J.D., Arias, A.A., Wright, N.A., Wrobel, I., Waterhouse, C.C., Li, X.J., Marchal,
C.C., Stull, N.D., Lewis, D.B., Steele, M., Kellner, J.D., Yu, W., Meroueh, S.O., Nauseef, W.M.,
and Dinauer, M.C. A new genetic subgroup of chronic granulomatous disease with autosomal
recessive mutations in p40 phox and selective defects in neutrophil NADPH oxidase activity. //
Blood. 2009. V. 114. P. 3309-3315.
275. Mazumder, B., Mukhopadhyay, C.K., Prok, A., Cathcart, M.K., and Fox, P.L. Induction
of ceruloplasmin synthesis by IFN-gamma in human monocytic cells. // J. Immunol. 1997. V.
159. P. 1938–1944.
276. Mazumder, B., Seshadri, V., Imataka, H., Sonenderg, N., and Fox, P. Translational
silencing of ceruloplasmin requires the essential elements of mRNA circularization: poly(A) tail,
poly(A)-binding protein, and eukaryotic translation initiation factor 4G. // Mol. Cell. Biol. 2001.
V. 21. P. 6440-6449.
277. McCabe, D., Cukierman, T., and Gabay, J.E. Basic residues in azurocidin/HBP contribute
to both heparin binding and antimicrobial activity. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 2747727488.
221
278. McCombs, M.L., and Bowman, B.H. Biochemical studies on human ceruloplasmin. //
Biochim. Biophys. Acta. 1976. V. 434. P. 452-461.
279. McMillen, T.S., Heinecke, J.W., and LeBoeuf, R.C. Expression of human
myeloperoxidase by macrophages promotes atherosclerosis in mice. // Circulation. 2005. V. 111.
P. 2798-2804.
280. Messerschmidt, A., and Huber, R. The blue oxidases, ascorbate oxidase, laccase and
ceruloplasmin. // Eur. J. Biochem. 1990. V. 187. P. 341-352.
281. Messner, M.C., Albert, C.J., McHowat, J., and Ford, D.A. Identification of
lysophosphatidylcholine-chlorohydrin in human atherosclerotic lesions. // Lipids. 2008. V. 43. P.
243–249.
282. Metz-Boutigue, M.H., Jolles, J., Mazurier, J., Schoentgen, F., Legrand, D., Spik, G.,
Montreuil, J., and Jolles, P. Human lactotransferrin: amino acid sequence and structural
comparisons with other transferrins. // Eur. J. Biochem. 1984. V. 145. P. 659–676.
283. Meyer, L.A., Durley, A.P., Prohaska, J.R., and Harris, Z.L. Copper transport and
metabolism are normal in aceruloplasminemic mice. // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 3685739861.
284. Meyer-Siegler, K.L., Iczkowski, K.A., and Vera, P.L. Macrophage migration inhibitory
factor is increased in the urine of patients with urinary tract infection: macrophage migration
inhibitory factor-protein complexes in human urine. // J. Urol. 2006. V. 175. P. 1523-1528.
285. Michaelis, J., Vissers, M.C., and Winterbourn, C.C. Different effects of hypochlorous
acid on human neutrophil metalloproteinases: activation of collagenase and inactivation of
collagenase and gelatinase. // Arch. Biochem. Biophys. 1992. V. 292. P. 555–562.
286. Mittal, B., Doroudchi, M.M., Jeong, S.Y., Patel, B.N., and David, S. Expression of a
membrane-bound form of the ferroxidase ceruloplasmin by leptomeningeal cells. // Glia. 2003.
V. 41. P. 337-346.
287. Morgan, J.G., Sukiennicki, T., Pereira, H.A., Spitznagel, J.K., Guerra, M.E., and Larrick,
J.W. Cloning of the cDNA for the serine protease homolog CAP37/azurocidin, a microbicidal
and chemotactic protein from human granulocytes. // J. Immunol. 1991. V. 147. P. 3210-3214.
288. Morris, J.C. The acid ionisation constant of HOCl from 5o to 35 o. // J. Phys. Chem. 1966.
V. 195. P. 133–140.
289. Moshkov, K.A., Lakatos, S., Hajdu, J., Zavodsky, P., and Neifakh, S.A. Proteolysis of
human ceruloplasmin. Some peptide bonds are particularly susceptible to proteolytic attack. //
Eur. J. Biochem. 1979. V. 94. P. 127-134.
290. Mukhopadhyay, C.K., Ehrenwald, E., and Fox, P.L. Ceruloplasmin enhances smooth
muscle cell- and endothelial cell-mediated low density lipoprotein oxidation by a superoxidedependent mechanism. // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 14773-14778.
291. Mukhopadhyay, C.K., Mazumder, B., and Fox, P.L. Role of hypoxia-inducible factor-1 in
transcriptional activation of ceruloplasmin by iron dificiency. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P.
21048-21054.
292. Mukhopadhyay, C.K., Mazumder, B., Lindley, P.F., and Fox, P.L. Identification of the
prooxidant site of human ceruloplasmin: A model for oxidative damage by copper bound to
protein surfaces. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1997. V. 94. P. 11546–11551.
293. Muniz, V.S., Weller, P.F., and Neves, J.S. Eosinophil crystalloid granules: structure,
function, and beyond. // J. Leukoc. Biol. 2012. V. 92. P. 281-288.
294. Murphy, G., Bretz, U., Baggiolini, M., and Reynolds, J.J. The latent collagenase and
gelatinase of human polymorphonuclear neutrophil leucocytes. // Biochem. J. 1980. V. 192. P.
517–525.
295. Musci, G., Bonaccorsi, di Patti M.C., Fagiolo, U., and Calabrese, L. Age-related changes
in human ceruloplasmin. Evidence for oxidative modifications. // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P.
13388-13395.
296. Musci, G., Bonaccorsi, di Patti M.C., Petruzzelli, R., Giartosio, A., and Calabrese, L.
Divalent cation binding to ceruloplasmin. // Biometals. 1996. V. 9. P. 66-72.
222
297. Musci, G., Polticelli, F., and Bonaccorsi, di Patti M.C. Ceruloplasmin-ferroportin system
of iron traffic in vertebrates. // World J. Biol. Chem. 2014. V. 5. P. 204-215.
298. Nakamura, M., Tomita, A., Nakatani, H., Matsuda, T., and Nadano, D. Antioxidant and
antibacterial genes are upregulated in early involution of the mouse mammary gland: sharp
increase of ceruloplasmin and lactoferrin in accumulating breast milk. // DNA Cell Biol. 2006.
V. 25. P. 491-500.
299. Nauseef, W.M. Assembly of the phagocyte NADPH oxidase. // Histochem. Cell Biol.
2004. V. 122. P. 277-291.
300. Nauseef, W.M. The proper study of mankind. // J. Clin. Invest. 2001. V. 107. P. 401-403.
301. Nauseef, W.M., McCormick, S.J., and Clark, R.A. Calreticulin functions as a molecular
chaperone in the biosynthesis of myeloperoxidase. // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 4741–4747.
302. Nguyen-Khoa, T., Massy, Z.A., Witko-Sarsat, V., Canteloup, S., Kebede, M., Lacour, B.,
Drüeke, T., and Descamps-Latscha, B. Oxidized low-density lipoprotein induces macrophage
respiratory burst via its protein moiety: A novel pathway in atherogenesis? // Biochem. Biophys.
Res. Commun. 1999. V. 263. P. 804-809.
303. Nicholls, S.J., and Hazen, S.L. Myeloperoxidase, modified lipoproteins, and
atherogenesis. // J. Lipid Res. 2009. V. 50. P. 346-351.
304. Noyer, M., Dwulet, F.E., Hao, Y.L., and Putnam, F.W. Purification and characterization
of undegraded human ceruloplasmin. // Anal. Biochem. 1980. V. 102. P. 450-458.
305. Nurcombe, H.L., Bucknall, R.C., and Edwards, S.W. Neutrophils isolated from the
synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis: priming and activation in vivo. // Ann.
Rheum. Dis. 1991. V. 50. P. 147-153.
306. Ofosu, F.A. Modulation of the enzymatic activity of alpha-thrombin by polyanions:
consequences on intrinsic activation of factor V and factor VIII. // Haemostasis. 1991. V. 21. P.
240-247.
307. Oh, S.M., Hahm, D.H., Kim, I.H., and Choi, S.Y. Human neutrophil lactoferrin transactivates the matrix metalloproteinase 1 gene through stress-activated MAPK signaling modules.
// J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 42575-42579.
308. Olsen, R.L., and Little, C. Purification and some properties of myeloperoxidase and
eosinophil peroxidase from human blood. // Biochem. J. 1983. V. 209. P. 781-787.
309. Ortel, T.L., Takahashi, N., and Putnam, F.W. Structural model of human ceruloplasmin
based on interal triplication, hyderophilic/hydrophobic cheracter, and secondary structure of
domains. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1984. V. 81. P. 4761-4765.
310. Osaki, S. Kinetic studies of ferrous ion oxidation with crystalline human ferrooxidase
(ceruloplasmin). // J. Biol. Chem. 1966. V. 241. P. 5053-5059.
311. Osaki, S., Johnson, D.A., and Frieden, E. The possible significance of the ferrous oxidase
activity of ceruloplasmin in normal human serum. // J. Biol. Chem. 1966. V. 241. P. 2746-2751.
312. Ouchterlony, O. Antigene antibody reaction in gels. // Acta Pathol. Microbiol. Scand.
1949. V. 26. P. 507-515.
313. Owen, C.A., and Smith, H. Detection of ceruloplasmin after zone electrophoresis. // Clin.
Chim. Acta. 1961. V. 6. P. 441-444.
314. Panasenko, O.M., Briviba, K., Klotz, L.O., and Sies, H. Oxidative modification and
nitration of human low-density lipoproteins by the reaction of hypochlorous acid with nitrite. //
Arch. Biochem. Biophys. 1997. V. 343. P. 254-259.
315. Panasenko, O.M., Spalteholz, H., Schiller, J., and Arnhold, J. Myeloperoxidase-induced
formation of chlorohydrins and lysophospholipids from unsaturated phosphatidylcholines. // Free
Radic. Biol. Med. 2003. V. 34. P. 553-562.
316. Panasenko, O.M., Vol'nova, T.V., Azizova, O.A., and Vladimirov, Y.A. Free radical
modification of lipoproteins and cholesterol accumulation in cells upon atherosclerosis. // Free
Radic. Biol. Med. 1991. V. 10. P. 137-148.
317. Park, Y.S., Suzuki, K., Mumby, S., Taniguchi, N., and Gutteridge, J.M.C. Antioxidant
binding of caeruloplasmin with myeloperoxidase: myeloperoxidase is inhibited, but oxidase,
223
peroxidaseand and immunoreactive properties of caeruloplasmin remain intact. // Free Radic.
Res. 2000. V. 33. P. 261-265.
318. Patel, B.N., and David, S. A novel glycosylphosphatidylinositol-anchored form of
ceruloplasmin is expressed by mammalian astrocytes. // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 20185–
20190.
319. Patel, B.N., Dunn, R.J., and David, S. Alternative RNA splicing generates a
glycosylphosphatidylinositol-anchored form of ceruloplasmin in mammalian brain. // J. Biol.
Chem. 2000. V. 275. P. 4305-4310.
320. Patel, B.N., Dunn, R.J., Jeong, S.Y., Zhu, Q., Julien, J.P., and David, S. Ceruloplasmin
regulates iron levels in the CNS and prevents free radical injury. // J. Neurosci. 2002. V. 22. P.
6578-6586.
321. Peng, D.Q., Brubaker, G., Wu, Z., Zheng, L., Willard, B., Kinter, M., Hazen, S.L., and
Smith, J.D. Apolipoprotein A-I tryptophan substitution leads to resistance to myeloperoxidasemediated loss of function. // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2008. V. 28. P. 2063-2070.
322. Peng, D.Q., Wu, Z., Brubaker, G., Zheng, L., Settle, M., Gross, E., Kinter, M., Hazen,
S.L., and Smith, J.D. Tyrosine modification is not required for myeloperoxidase-induced loss of
apolipoprotein A-I functional activities. // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 33775-33784.
323. Pennathur, S., Bergt, C., Shao, B., Byun, J., Kassim, S.Y., Singh, P., McDonald, T.O.,
Brunzell, J., Chait, A., Oram, J.F., O'brien, K., Geary, R.L., and Heinecke, J.W. Human
atherosclerotic intima and blood of patients with established coronary artery disease contain high
density lipoprotein damaged by reactive nitrogen species. // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P.
42977-42983.
324. Peppin, G.J., and Weiss, S.J. Activation of the endogenous metalloproteinase, gelatinase,
by triggered human neutrophils. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1986. V. 83. P. 4322–4326.
325. Podrez, E.A., Abu-Soud, H.M, and Hazen, S.L. Myeloperoxidase-generated oxidants and
atherosclerosis. // Free Radic. Biol. Med. 2000. V. 28. P. 1717-1725.
326. Podrez, E.A., Abu-Soud, H.M., and Hazen, S.L. Myeloperoxidase-generated oxidants and
atherosclerosis. // Free Radic. Biol. Med. 2000. V. 28. P. 1717-1725.
327. Podrez, E.A., Febbraio, M., Sheibani, N., Schmitt, D., Silverstein, R.L., Hajjar, D.P.,
Cohen, P.A., Frazier, W.A., Hoff, H.F., and Hazen, S.L. Macrophage scavenger receptor CD36
is the major receptor for LDL modified by monocyte-generated reactive nitrogen species. // J.
Clin. Invest. 2000. V. 105. P. 1095-1108.
328. Podrez, E.A., Schmitt, D., Hoff, H.F., and Hazen, S.L. Myeloperoxidase-generated
reactive nitrogen species convert LDL into an atherogenic form in vitro. // J. Clin. Invest. 1999.
V. 103. P. 1547-1560.
329. Poulik, M.D. Heterogeneity and structure of ceruloplasmin. // Ann. N. Y. Acad. Sci.
1968. V. 151. P. 476-501.
330. Prozorovski, V.N., Rashkovetski, L.G., Vasiliev, V.B., Shavlovski, M.M., and Neifakh,
S.A. Evidence that human ceruloplasmin molecule consists of homologous parts. // Int. J. Pept.
Protein Res. 1982. V. 19. P. 40-53.
331. Pryor, W.A. Oxy-radicals and related species: their formation, lifetimes, and reactions. //
Annu. Rev. Physiol. 1986. V. 48. P. 657-667.
332. Pulina, M.O., Zakharova, E.T., Sokolov, A.V., Shavlovski, M.M., Bass, M.G., Solovyov,
K.V., Kokryakov, V.N., and Vasilyev, V.B. Studies of the ceruloplasmin-lactoferrin complex. //
Biochem. Cell Biol. 2002. V. 80. P. 35-39.
333. Quintanar, L., Gebhard, M., Wang, T.P., Kosman, D.J., and Solomon, E.I. Ferrous
binding to the multicopper oxidases Saccharomyces cerevisiae Fet3p and human ceruloplasmin:
contributions to ferroxidase activity. // J. Am. Chem. Soc. 2004. V. 126. P. 6579-6589.
334. Rådmark, O., and Samuelsson, B. Regulation of the activity of 5-lipoxygenase, a key
enzyme in leukotriene biosynthesis. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2010. V. 396. P. 105110.
335. Ravin, H.A. An improved colorimetric enzymatic assay for caeruloplasmin. // J. Lab.
Clin. Med. 1961. V. 58. P. 161-168.
224
336. Reeves, E.P., Lu, H., Jacobs, H.L., Messina, C.G., Bolsover, S., Gabella, G., Potma, E.O.,
Warley, A., Roes, J., and Segal, A.W. Killing activity of neutrophils is mediated through
activation of proteases by K+ flux. // Nature. 2002. V. 416. P. 291–297.
337. Reilly, C.A., Sorlie, M., and Aust, S.D. Evidence for a protein-protein complex during
iron loading into ferritin by ceruloplasmin. // Arch. Biochem. Biophys. 1998. V. 354. P. 165-171.
338. Renesto, P., Si-Tahar, M., Moniatte, M., Balloy, V., Van Dorsselaer, A., Pidard, D., and
Chignard, M. Specific inhibition of thrombin-induced cell activation by the neutrophil
proteinases elastase, cathepsin G, and proteinase 3: evidence for distinct cleavage sites within the
aminoterminal domain of the thrombin receptor. // Blood. 1997. V. 89. P. 1944-1953.
339. Reszka, K.J., McCormick, M.L., and Britigan, B.E. Peroxidase- and nitrite-dependent
metabolism of the anthracycline anticancer agents daunorubicin and doxorubicin. //
Biochemistry. 2001. V. 40. P. 15349-15361.
340. Rice, E.W. Evaluation of the role of ceruloplasmin as an acute-phase reactant. // Clin.
Chim. Acta. 1961. V. 6. P. 652-655.
341. Rijken, F., Kiekens, R.C., and Bruijnzeel, P.L. Skin-infiltrating neutrophils following
exposure to solar-simulated radiation could play an important role in photoageing of human skin.
// Br. J. Dermatol. 2005. V. 152. P. 321–328.
342. Roos, D., de Boer, M., Kuribayashi, F., Meischl, C., Weening, R.S., Segal, A.W., Ahlin,
A., Nemet, K., Hossle, J.P., Bernatowska-Matuszkiewicz, E., and Middleton-Price, H. Mutations
in the X-linked and autosomal recessive forms of chronic granulomatous disease. // Blood. 1996.
V. 87. P. 1663–1681.
343. Roy, C.N., and Andrews, N.C. Recent advancesin disorders of iron metabolism:
mutations, mechanisms and modifiers. // Hum. Mol. Genet. 2001. V. 10. P. 2181-2186.
344. Roy, M.K., Kuwabara, Y., Hara, K., Watanabe,Y., and Tamai, Y. Peptides from the Nterminal end of bovine lactoferrin induce apoptosis in human leukemic (HL-60) cells. // J. Dairy
Sci. 2002. V. 85. P. 2065-2074.
345. Ryden, L. Evidence for proteolytic fragments in commercial samples of human
ceruloplasmin. // FEBS Lett. 1971. V. 18. P. 321-325.
346. Ryden, L. Single-chain structure of human ceruloplasmin. // Eur. J. Biochem. 1972. V.
26. P. 380-386.
347. Ryden, L., and Bjork, I. Reinvestigation of some physicochemical and chemical
properties of human ceruloplasmin (ferroxidase). // Biochemistry. 1976. V. 15. P. 3411-3417.
348. Saari, H., Sorsa, T., Lindy, O., Suomalainen, K., Halinen, S., and Konttinen, Y.T.
Reactive oxygen species as regulators of human neutrophil and fibroblast interstitial
collagenases. // Int. J. Tissue React. 1992. V. 14. P. 113–120.
349. Sabatucci, A., Angelucci, C.B., Maccarrone, M., Cozzani, I., Dainese, E., Beltramini, M.,
Salvato, B., Vachette, P., Vasilyev, V.B., Sokolov, A., and Pulina, M. Structural characterization
of the ceruloplasmin: lactoferrin complex in solution. // Journal of Molecular Biology. 2007. V.
371. P. 1038-1046.
350. Saenko, E.L., Skorobogat'ko, O.V., Tarasenko, P., Romashko, V., Zhuravetz, L.,
Zadorozhnaya, L., Senjuk, O.F., and Yaropolov, A.I. Modulatory effects of ceruloplasmin on
lymphocytes, neutrophils and monocytes of patients with altered immune status. // Immunol.
Invest. 1994. V. 23. P. 99-114.
351. Sakakibara, S., and Aoyama, Y. Dietary iron-deficiency up-regulates hephaestin mRNA
level in smal intestine rat. // Life Sci. 2002. V. 70. P. 3123-3129.
352. Sakamaki, K., Tomonaga, M., Tsukui, K., and Nagata, S. Molecular cloning and
characterization of a chromosomal gene for human eosinophil peroxidase. // J. Biol. Chem. 1989.
V. 264. P. 16828-16836.
353. Samokyszyn, V.M., Miller, D.M., Reif, D.W., and Aust, S.D. Inhibition of superoxide
and ferritin-dependent lipid peroxidation by ceruloplasmin. // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 2126.
225
354. Sampath, P., Mazumder, B., Seshadri, V., and Fox, P.L. Transcript-selective translational
silencing by gamma interferon is directed by a novel structural element in the ceruloplasmin
mRNA 3' untranslated region. // Mol. Cell. Biol. 2003. V. 23. P. 1509-1519.
355. Sampath, P., Mazumder, B., Seshadri, V., Gerber, C.A., Chavatte, L., Kinter, M., Ting,
S.M., Dignam, J.D., Kim, S., Driscoll, S.M., and Fox, P.L. Noncanonical function of glutamylprolyl-tRNA-synthetase: gene-specific silencing of translation. // Cell. 2004. V. 119. P. 195-208.
356. Samygina, V.R., Sokolov, A.V., Bourenkov, G., Petoukhov, M.V., Pulina, M.O.,
Zakharova, E.T., Vasilyev, V.B., Bartunik, H., Svergun, D.I. Ceruloplasmin: macromolecular
assemblies with iron-containing acute phase proteins. // PLoS One. 2013. V. 8. e67145.
357. Sang, Q.A. Specific proteolysis of ceruloplasmin by leukocyte elastase. // Biochem. Mol.
Biol. Int. 1995. V. 37. P. 573-581.
358. Sato, M., Schilsky, M.L., Stockert, R.J., Morell, A.G., and Sternlieb, I. Detection of
multiple forms of human ceruloplasmin. A novel Mr 200,000 form. // J. Biol. Chem. 1990. V.
265. P. 2533-2537.
359. Scapini, P., and Cassatella, M.A. Social networking of human neutrophils within the
immune system. // Blood. 2014. V. 124. P. 710-719.
360. Schaible, U.E., Collins, H.L., Priem, F., and Kaufmann, S.H. Correction of the iron
overload defect in beta-2-microglobulin knockout mice by lactoferrin abolishes their increased
susceptibility to tuberculosis. // J. Exp. Med. 2002. V. 196. P. 1507–1513. Segal, A.W. How
neutrophils kill microbes. // Annu Rev. Immunol. 2005. V. 23. P. 197-223.
361. Segelmark, M., Persson, B., Hellmark, T., and Wieslander, J. Binding and inhibition of
myeloperoxidase (MPO): a major function of ceruloplasmin? // Clin. Exp. Immunol. 1997. V.
108. P. 167-174.
362. Serezani, C.H., Aronoff, D.M., Jancar, S., and Peters-Golden, M. Leukotriene B4
mediates p47phox phosphorylation and membrane translocation in polyunsaturated fatty acidstimulated neutrophils. // J. Leukoc. Biol. 2005. V. 78. P. 976-984.
363. Sergeev, A.G., Pavlov, A.R., Revina, A.A., and Yaropolov, A.I. The mechanism of
interaction of ceruloplasmin with superoxide radicals. // Int. J. Biochem. 1993. V. 25. P. 15491554.
364. Seshadri, V., Fox, P.L., and Mukhopadhyay, C.K. Dual role of insulin in transcriptional
regulation of the acute phase reactant ceruloplasmin. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 2790327911.
365. Sharonov, B.P., Govorova, N.Ju., and Lyzlova, S.N. A comparative study of serum
proteins ability to scavenge active oxygen species: O2- and OCl-. // Biochem. Int. 1988. V. 17.
P. 783-790.
366. Shenoy, N.G., Gleich, G.J., and Thomas, L.L. Eosinophil major basic protein stimulates
neutrophil superoxide production by a class IA phosphoinositide 3-kinase and protein kinase Czeta-dependent pathway. // J. Immunol. 2003. V. 171. P. 3734-3741.
367. Shepherd, J., Hilderbrand, S.A., Waterman, P., Heinecke, J.W., Weissleder, R., and
Libby, P. A fluorescent probe for the detection of myeloperoxidase activity in atherosclerosisassociated macrophages. // Chem. Biol. 2007. V. 14. P. 1221-1231.
368. Shimizu, K., Matsuzawa, H., Okada, K., Tazume, S., Dosako, S., Kawasaki, Y.,
Hashimoto, K., and Koga, Y. Lactoferrin-mediated protection of the host from murine
cytomegalovirus infection by a T-cell-dependent augmentation of natural killer cell activity. //
Arch. Virol. 1996. V. 141. P. 1875–1889.
369. Shin, K., Hayasawa, H., and Lonnerdal, B. Mutations affecting the calcium-binding site
of myeloperoxidase and lactoperoxidase. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. V. 281. P.
1024-1029.
370. Shishehbor, M.H., Brennan, M.L., Aviles, R.J., Fu, X., Penn, M.S., Sprecher, D.L., and
Hazen, S.L. Statins promote potent systemic antioxidant effects through specific inflammatory
pathways. // Circulation. 2003. V. 108. P. 426-431.
371. Shiva, S., Wang, X., Ringwood, L.A., Xu, X., Yuditskaya, S., Annavajjhala, V.,
Miyajima, H., Hogg, N., Harris, Z.L., and Gladwin, M.T. Ceruloplasmin is a NO oxidase and
226
nitrite synthase that determines endocrine NO homeostasis. // Nat. Chem. Biol. 2006. V. 2. P.
486-493.
372. Simons, K., and Bearn, A.G. Isolation and partial characterization of the polypeptide
chains in human ceruloplasmin. // Biochim. Biophys. Acta. 1969. V. 175. P. 260-270.
373. Singh, P.K., Parsek, M.R., Greenberg, E.P., and Welsh, M.J. A component of innate
immunity prevents bacterial biofilm development. // Nature. 2002. V. 417. P. 552–555.
374. Sokolov, A.V., Ageeva, K.V., Cherkalina, O.S., Pulina, M.O., Zakharova, E.T.,
Prozorovskii, V.N., Aksenov, D.V., Vasilyev, V.B., and Panasenko, O.M. Identification and
properties of complexes formed by myeloperoxidase with lipoproteins and ceruloplasmin. //
Chemistry and Physics of Lipids. 2010. V. 163. P. 347-355.
375. Sokolov, A.V., Ageeva, K.V., Pulina, M.O., Cherkalina, O.S., Zakharova, E.T., Vasilyev,
V.B., Samygina, V.R., Vlasova, I.I., and Panasenko, O.M. Ceruloplasmin and myeloperoxidase
in complex affect the enzymatic properties of each other. // Free Radical Research. 2008. V. 42.
P. 989-998.
376. Sokolov, A.V., Ageeva, K.V., Pulina, M.O., Zakharova, E.T., and Vasilyev, V.B. Effect
of lactoferrin on oxidative features of ceruloplasmin. // BioMetals. 2009. V. 22. P. 521-529.
377. Sokolov, A.V., Kostevich, V.A., Runova, O.L., Gorudko, I.V., Vasilyev, V.B.,
Cherenkevich, S.N., and Panasenko, O.M. Proatherogenic modification of LDL by surfacebound myeloperoxidase. // Chemistry and Physics of Lipids. 2014. V. 180. P. 72-80.
378. Sokolov, A.V., Kostevich, V.A., Vasilyev, V.B., Chekanov, A.V., Aksenov, D.V., and
Panasenko, O.M. Revealing binding sites for myeloperoxidase on the surface of human low
density lipoproteins. // Chemistry and Physics of Lipids. 2011. V. 164. P. 49-53.
379. Sokolov, A.V., Kostevich, V.A., Zakharova, E.T., Samygina, V.R., Panasenko, O.M., and
Vasilyev V.B. Interaction of ceruloplasmin with eosinophil peroxidase as compared to its
interplay with myeloperoxidase: reciprocal effect on enzymatic properties. // Free Radical
Research. 2015. (doi:10.3109/10715762.2015.1005615)
380. Sokolov, A.V., Solovyov, K.V., Kostevich, V.A., Chekanov, A.V., Pulina, M.O.,
Zakharova, E.T., Shavlovski, M.M., Panasenko, O.M., and Vasilyev, V.B. Protection of
ceruloplasmin by lactoferrin against hydroxyl radicals is pH dependent. // Biochemistry and Cell
Biol. 2012. V. 90. P. 397-404.
381. Sokolov, A.V., Zakahrova, E.T., Kostevich, V.A., Samygina, V.R., and Vasilyev, V.B.
Lactoferrin, myeloperoxidase, and ceruloplasmin: complementary gearwheels cranking
physiological and pathological processes. // Biometals. 2014. V. 27. P. 815-828.
382. Sorensen, M., and Sorensen, M.P.L. The proteins in whey. // Compt. Rend. Trav. Lab.
Carlsberg. 1939. V. 23. P. 55–59.
383. Sorimachi, K., Akimoto, K., Hattori, Y., Ieiri, T., and Niwa, A. Activation of
macrophages by lactoferrin: secretion of TNF-alpha, IL-8 and NO. // Biochem. Mol. Biol. Int.
1997. V. 43. P. 79–87.
384. Spalteholz, H., Panasenko, O.M., and Arnhold, J. Formation of reactive halide species by
myeloperoxidase and eosinophil peroxidase. // Arch. Biochem. Biophys. 2006. V. 445. P. 225234.
385. Squitti, R., Quattrocchi, C.C., Salustri, C., and Rossini, P.M. Ceruloplasmin
fragmentation is implicated in 'free' copper deregulation of Alzheimer's disease. // Prion. 2008.
V. 2. P. 23-27.
386. Steinberg, D. Atherogenesis in perspective: hypercholesteremia and inflammation as
partners in crime. // Nat. Med. 2002. V. 8. P. 1211-1217.
387. Stoj, C., and Kosman, D.J. Cuprous oxidase activity of yeast Fet3p and human
ceruloplasmin: implication for function. // FEBS Lett. 2003. V. 554. P. 422-426.
388. Sumimoto, H. Structure, regulation and evolution of Nox-family NADPH oxidases that
produce reactive oxygen species. // FEBS J. 2008. V. 275. P. 3249-3277.
389. Sumimoto, H., Kage, Y., Nunoi, H., Sasaki, H., Nose, T., Fukumaki, Y., Ohno, M.,
Minakami, S., and Takeshige, K. Role of Src homology 3 domains in assembly and activation of
the phagocyte NADPH oxidase. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1994. V. 91. P. 5345–5349.
227
390. Syed, B.A., Beaumont, N.J., Patel, A., Naylor, C.E., Bayele, H.K., Joannou, C.L., Rowe,
P.S., Evans, R.W., and Srai, S.K. Analysis of the human hephaestin gene and protein:
comparative modelling of the N-terminus ecto-domain based upon ceruloplasmin. // Protein Eng.
2002. V. 15. P. 205-214.
391. Tagliavacca, L., Moon, N., Dunham, W.R., and Kaufman, R.J. Identification and
functional requirement of Cu(I) and its ligands within coagulation factor VIII. // J. Biol. Chem.
1997. V. 272. P. 27428-27434.
392. Takahashi, N., Ortel, T.L., and Putnam, F.M. Single-chain structure of human
ceruloplasmin: The complete amino acid sequence of the whole molecule. // Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 1984. V. 81. P. 390-394.
393. Takahashi, Y., Miyajima, H., Shirabe, S., Nagataki, S., Suenaga, A., and Gitlin, J.D.
Characterization of a nonsense mutation in the ceruloplasmin gene resulting in diabetes and
neurodegenerative disease. // Hum. Mol. Genet. 1996. V. 5. P. 81-84.
394. Takaki, A., Enfield, D.L., and Thompson, A.R. Cleavage and inactivation of Factor IX by
granulocyte elastase. // J. Clin. Invest. 1983. V. 72. P. 1706-1715.
395. Tams, J.W., Johnsen, A.H., and Fahrenkrug, J. Identification of pituitary adenylate
cyclase-activating polypeptide 1-38-binding factor in human plasma, as ceruloplasmin. //
Biochem. J. 1999. V. 341. P. 271-276.
396. Tapryal, N., Mukhopadhyay, C., Das, D., Fox, P.L., and Mukhopadhyay, C.K. Reactive
oxygen species regulate ceruloplasmin by a novel mRNA decay mechanism involving its 3'untranslated region: implications in neurodegenerative diseases. // J. Biol. Chem. 2009. V. 284.
P. 1873-1883.
397. Tapryal, N., Mukhopadhyay, C., Mishra, M.K., Das, D., Biswas, S., and Mukhopadhyay,
C.K. Glutathione synthesis inhibitor butathione sulfoximine regulates ceruloplasmin by dual but
opposite mechanism: Implication in hepatic iron overload. // Free Radic. Biol. Med. 2010. V. 48.
P. 1492-1500.
398. Teng, C.T. Lactoferrine gene expression and regulation: an overview. // Bioch. Cell Biol.
2002. V. 80. P. 7-16.
399. Teng, C.T., Pentecost, B.T., Marshall, A., Solomon, A., Bowman, B.H., Lalley, P.A., and
Naylor, S.L. Assignment of the lactotransferrin gene to chromosome 3 and mouse chromosome
9. // Somat. Cell Mol. Genet. 1987. V. 13. P. 689-693.
400. Tenovuo, J. Clinical applications of antimicrobial host proteins lactoperoxidase,
lysozyme and lactoferrin in xerostomia: efficacy and safety. // Oral Dis. 2002. V. 8. P. 23-29.
401. Thompson, M.W. Ceruloplasmin binds and inactivates matrix metalloproteinase-2. // The
FASEB Journal. 2012. V. 26. P. 557.3
402. Timoshenko, A.V., Kayser, K., and Gabius, H.J. Lectin-triggered superoxide/H2O2 and
granule enzyme release from cells. // Methods Mol. Med. 1998. V. 9. P. 441-451.
403. Togawa, J., Nagase, H., Tanaka, K., Inamori, M., Nakajima, A., Ueno, N. Saito, T., and
Sekihara, H. Oral administration of lactoferrin reduces colitis in rats via modulation of the
immune system and correction of cytokine imbalance. // J. Gastroenterol. Hepatol. 2002. V. 17.
P. 1291–1298.
404. Tomofuji, T., Ekuni, D., Azuma, T., Irie, K., Endo, Y., Yamamoto, T., Ishikado, A., Sato,
T., Harada, K., Suido, H., and Morita, M. Supplementation of broccoli or Bifidobacterium
longum-fermented broccoli suppresses serum lipid peroxidation and osteoclast differentiation on
alveolar bone surface in rats fed a high-cholesterol diet. // Nutr. Res. 2012. V. 32. P. 301-307.
405. Twomey, P.J., Wierzbicki, A.S., House, I.M., Viljoen, A., and Reynolds, T.M.
Percentage non-caeruloplasmin bound copper. // Clin. Biochem. 2007. V. 40. P. 749-750.
406. Uehara, A., Muramoto, K., Takada, H., and Sugawara, S. Neutrophil serine proteinases
activate human nonepithelial cells to produce inflammatory cytokines through protease-activated
receptor 2. // J. Immunol. 2003. V. 170. P. 5690-5696.
407. Vachette, P., Dainese, E., Vasyliev, V.B., Di Muro, P., Beltramini, M., Svergun, D.I., De
Filippis, V., and Salvato, B. A key structural role for active site type 3 copper ions in human
ceruloplasmin. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 40823-40831.
228
408. Van Berkel, P.H., Geerts, M.E., van Veen, H.A., Kooiman, P.M., Pieper, F.R., de Boer,
H.A., and Nuijens, J.H. Glycosylated and unglycosylated human lactoferrins both bind iron and
show identical affinities towards human lysozyme and bacterial lipopolysaccharide, but differ in
their susceptibilities towards tryptic proteolysis. // Biochem. J. 1995. V. 312. P. 107-114.
409. Van Berkel, P.H., Geerts, M.E., van Veen, H.A., Mericskay, M., de Boer, H.A., and
Nuijens, J.H. N-terminal stretch Arg2, Arg3, Arg4 and Arg5 of human lactoferrin is essential for
binding to heparin, bacterial lipopolysaccharide, human lysozyme and DNA. // Biochem. J.
1997. V. 328. P. 145-151.
410. van der Does, A.M., Hensbergen, P.J., Bogaards, S.J., Cansoy, M., Deelder, A.M., van
Leeuwen, H.C., Drijfhout, J.W., van Dissel, J.T., and Nibbering, P.H. The human lactoferrinderived peptide hLF1-11 exerts immunomodulatory effects by specific inhibition of
myeloperoxidase activity. // J. Immunol. 2012. V. 188. P. 5012-5009.
411. Van Eden, M.E., and Aust, S.D. Intact human ceruloplasmin is required for the
incorporation of iron into human ferritin. // Arch. Biochem. Biophys. 2000. V. 381. P. 119-126.
412. Van Snick, J.L., Masson, P.L., and Heremans, J.F. The involvement of lactoferrin in the
hyposideremia of acute inflammation. // J. Exp. Med. 1974. V. 140. P. 1068-1084.
413. Vashchenko, G., and MacGillivray, R.T. Multi-copper oxidases and human iron
metabolism. // Nutrients. 2013. V. 5. P. 2289-2313.
414. Vasilyev, V.B. Interactions of caeruloplasmin with other proteins participating in
inflammation. // Biochem. Soc. Trans. 2010. V. 38. P. 947-951.
415. Vassiliev, V., Harris, Z.L., and Zatta, P. Ceruloplasmin in neurodegenerative diseases. //
Brain Res. Brain Res. Rev. 2005. V. 49. P. 633-640.
416. Velliyagounder, K., Kaplan, J.B., Furgang, D., Legarda, D., Diamond, G., Parkin, R.E.,
and Fine, D.H. One of two human lactoferrin variants exhibits increased antibacterial and
transcriptional activation activities and is associated with localized juvenile periodontitis. //
Infect. Immun. 2003. V. 71. P. 6141–6147.
417. Vissers, M.C., and Winterbourn, C.C. Oxidative damage to fibronectin. I. The effects of
the neutrophil myeloperoxidase system and HOCl. // Arch. Biochem. Biophys. 1991. V. 285. P.
53–59.
418. Wada, M., Naito, H.K., Ehrhart, L.A., and Lewis, L.A. Polyacrylamide-gel blockelectrophoresis of plasma lipoproteins. // Clin. Chem. 1973. V. 19. P. 235-239.
419. Wakabayashi, H., Koszelak, M.E., Mastri, M., and Fay, P.J. Metal ion-independent
association of factor VIII subunits and the roles of calcium and copper ions for cofactor activity
and inter-subunit affinity. // Biochemistry. 2001. V. 40. P. 10293-10300.
420. Walker, F.J., and Fay, P.J. Characterization of an interaction between protein C and
ceruloplasmin. // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 1834-1836.
421. Wang, Z., Nicholls, S.J., Rodriguez, E.R., Kummu, O., Horkko, S., Barnard, J., Reynolds,
W.F., Topol, E.J., Didonato, J.A., and Hazen, S.L. Protein carbamylation links inflammation,
smoking, uremia and atherogenesis. // Nat. Med. 2007. V. 13. P. 1176-1184.
422. Weiler, J.M., Edens, R.E., and Gleich, G.J. Eosinophil granule cationic proteins regulate
complement. I. Activity on the alternative pathway. // J. Immunol. 1992. V. 149. P. 643-648.
423. Weiss, S.J., Peppin, G., Ortiz, X., Ragsdale, C., and Test, S.T. Oxidative autoactivation of
latent collagenase by human neutrophils. // Science. 1985. V. 227. P. 747–749.
424. Werz, O., Burkert, E., Fischer, L., Szellas, D., Dishart, D., Samuelsson, B., Rådmark, O.,
and Steinhilber, D. Extracellular signal-regulated kinases phosphorylate 5-lipoxygenase and
stimulate 5-lipoxygenase product formation in leukocytes. // FASEB J. 2002. V. 16. P. 1441–
1443.
425. Wheeler, M.A., Smith, S.D., Garcia-Cardena, G., Nathan, C.F., Weiss, R.M., and Sessa,
W.C. Bacterial infection induces nitric oxide synthase in human neutrophils. // J. Clin. Invest.
1997. V. 99. P. 110–116.
426. White, K.N., Conesa, C., Sánchez, L., Amini, M., Farnaud, S., Lorvoralak, C., and Evans,
R.W. The transfer of iron between ceruloplasmin and transferrins. // Biochim. Biophys. Acta.
2012. V. 1820. P. 411-416.
229
427. Williams, D.A., Tao, W., Yang, F., Kim, C., Gu, Y., Mansfield, P., Levine, J.E.,
Petryniak, B., Derrow, C.W., Harris, C., Jia, B., Zheng, Y., Ambruso, D.R., Lowe, J.B.,
Atkinson, S.J., Dinauer, M.C., and Boxer, L. Dominant negative mutation of the hematopoieticspecific Rho GTPase, Rac2, is associated with a human phagocyte immunodeficiency. // Blood.
2000. V. 96. P. 1646–1654.
428. Winterbourn, C.C., and Kettle, A.J. Reactions of superoxide with myeloperoxidase and
its products. // Jpn. J. Infect. Dis. 2004. V. 57. P. 31-33.
429. Winyard, P.G., Hider, R.C., Brailsford, S., Drake, A.F., Lunec, J., and Blake D.R. Effects
of oxidative stress on some physiochemical properties of caeruloplasmin. // Biochem. J. 1989. V.
258. P. 435-445.
430. Wu, H.M., and Church, F.C. Arginine 25 and arginine 28 of lactoferrin are critical for
effective heparin neutralization in blood. // Arch. Biochem. Biophys. 2003. V. 412. P. 121-125.
431. Wu, Z., Wagner, M.A., Zheng, L., Parks, J.S., Shy, J.M. 3rd, Smith, J.D., Gogonea, V.,
and Hazen, S.L. The refined structure of nascent HDL reveals a key functional domain for
particle maturation and dysfunction. // Nat. Struct. Mol. Biol. 2007. V. 14. P. 861-868.
432. Xie, S., Issa, R., Sukkar, M.B., Oltmanns, U., Bhavsar, P.K., Papi, A., Caramori, G.,
Adcock, I., and Chung, K.F. Induction and regulation of matrix metalloproteinase-12 in human
airway smooth muscle cells. // Respir. Res. 2005. V. 6. P. 148.
433. Xu, P.C., Li, Z.Y., Yang, X.W., Zhao, M.H., and Chen, M. Myeloperoxidase influences
the complement regulatory function of modified C-reactive protein. // Innate Immun. 2014. V.
20. P. 440-448.
434. Yang, D., Chertov, O., and Oppenheim, J.J. Participation of mammalian defensins and
cathelicidins in anti-microbial immunity: receptors and activities of human defensins and
cathelicidin (LL-37). // J. Leukoc. Biol. 2001. V. 69. P. 691-697.
435. Yang, F., Naylor, S., Lum, J., Cutshaw, S., McCombs, J., Naberhaus, K., McGill, J.,
Adrian, G., Moore, C., Barnett, D., and Bowman, B. Characterization, mapping, and expression
of the human ceruloplasmin gene. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1986. V. 83. P. 3257-3261.
436. Yang, S., Hua, Y., Nakamura, T., Keep, R.F., and Xi, G. Up-regulation of brain
ceruloplasmin in thrombin preconditioning. // Acta Neurochir. Suppl. 2006. V. 96. P. 203-206.
437. Yea, C.M., Dularay, B., and Elson, C.J. Identification of a myeloperoxidase inhibitor
from normal human serum. // Clin. Exp. Immunol. 1991. V. 84. P. 347-352.
438. Yoshida, K., Furihata, K., Takeda, S., Nakamura, A., Yamamoto, K., Morita, H.,
Hiyamuta, S., Ikeda, S., Shimizu, N., and Yanasigawa, N. A mutation in the ceruloplasmin gene
is associated with systemic hemosiderosis in humans. // Nat. Genet. 1995. V. 9. P. 267-272.
439. Zagryazhskaya, A.N., Lindner, S.C., Grishina, Z.V., Galkina, S.I., Steinhilber, D., and
Sud'ina, G.F. Nitric oxide mediates distinct effects of various LPS chemotypes on phagocytosis
and leukotriene synthesis in human neutrophils. // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2010. V. 42. P.
921-931.
440. Zaitsev, V.N., Zaitseva, I., Papiz, M., and Lindley, P.L. An X-ray crystallographic study
of the binding center of azide inhibitor and organic substrates of ceruloplasmin, a multi-copper
oxidase in plasma. // J. Biol. Inorg. Chem. 1999. V. 4. P. 579-587.
441. Zaitseva, I., Zaitsev, V., Card, G., Moshkov, K., Bax, B., Ralph, A., and Lindley, P. The
X-ray structure of human serum ceruloplasmin at 3.1 Å: nature of the copper centres. // J. Biol.
Inorg. Chem. 1996. V. 1. P. 15-23.
442. Zakharova, E.T., Shavlovski, M.M., Bass, M.G., Gridasova, A.A., Pulina., M.O., De
Filippis, V., Beltramini, M., Di Muro, P., Salvato, B., Fontana, A., Vasilyev, V.B., and
Gaitskhoki, V.S. Interaction of lactoferrin with ceruloplasmin. // Arch. Biochem. Biophys. 2000.
V. 374. P. 222-228.
443. Zhang, G.H., Mann, D.M., and Tsai, C.M. Neutralization of endotoxin in vitro and in vivo
by a human lactoferrinderived peptide. // Infect. Immun. 1999. V. 67. P. 1353–1358.
444. Zhang, R., Brennan, M.L., Fu, X., Aviles, R.J., Pearce, G.L., Penn, M.S., Topol, E.J.,
Sprecher, D.L., and Hazen, S.L. Association between myeloperoxidase levels and risk of
coronary artery disease. // JAMA. 2001. V. 286. P. 2136-2142.
230
445. Zhang, R., Brennan, M.L., Shen, Z., MacPherson, J.C., Schmitt, D., Molenda, C.E., and
Hazen, S.L. Myeloperoxidase functions as a major enzymatic catalyst for initiation of lipid
peroxidation at sites of inflammation. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 46116-46122.
446. Zhang, R., Shen, Z., Nauseef, W.M., and Hazen, S.L. Defects in leukocyte-mediated
initiation of lipid peroxidation in plasma as studied in myeloperoxidase-deficient subjects:
systematic identification of multiple endogenous diffusible substrates for myeloperoxidase in
plasma. // Blood. 2002. V. 99. P. 1802-1810.
447. Zheng, L., Nukuna, B., Brennan, M.L., Sun, M., Goormastic, M., Settle, M., Schmitt, D.,
Fu, X., Thomson, L., Fox, P.L., Ischiropoulos, H., Smith, J.D., Kinter, M., and Hazen, S.L.
Apolipoprotein A-I is a selective target for myeloperoxidase-catalyzed oxidation and functional
impairment in subjects with cardiovascular disease. // J. Clin. Invest. 2004. V. 114. P. 529-541.
448. Zheng, L., Settle, M., Brubaker, G., Schmitt, D., Hazen, S.L., Smith, J.D., and Kinter, M.
Localization of nitration and chlorination sites on apolipoprotein A-I catalyzed by
myeloperoxidase in human atheroma and associated oxidative impairment in ABCA1-dependent
cholesterol efflux from macrophages. // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 38-47.
231
8. ПРИЛОЖЕНИЕ
Таблица 8.1
Сравнение пептидных фингерпринтов фрагментов ЦП, полученных при
«спонтанном» и ограниченном протеолизе FIIa (см. рис. 3.46).
№
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
№
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
116 кДа-фрагмент ЦП (последовательность 1-887 а. о.)
Ограниченный протеолиз FIIa
«Спонтанный» протеолиз
M, Да
а. о.
№
M, Да
а. о.
2398,20 (2397,09)*
2299,28 (2298,16)
1647,95 (1646,83)
1912,23(1911,12)
1359,84 (1358,72)
2155,18 (2154,06)
3636,48 (3635,60)
1180,70 (1179,60)
1594,95 (1594,69)
1734,96 (1733,83)
1203,62 (1202,52)
2772,52 (2771,42)
745,40 (744,39)
1371,88 (1370,76)
2293,13 (2292,02)
1903,93 (1902,81)
2531,34 (2530,24)
1414,73 (1412,70)
2347,28 (2346,16)
2702,42 (2702,31)
2474,18 (2473,06)
3368,46 (3367,37)
1587,85 (1586,73)
2090,09 (2088,98)
2662,33 (2661,24)
1017,55 (1016,46)
1597,92 (1596,79)
2255,98 (2255,15)
2355,34 (2354,22)
3872,98 (3871,92)
4 – 23
24 – 43
50 – 62
63 – 79
80 – 91
92 – 109
126 – 158
159 – 168
227 – 239
404 – 417
408 – 417
419 – 443
444 – 449
450 – 462
463 – 481
466 – 481
482 – 504
505 – 518
519 – 539
558 – 579
580 – 600
591 – 619
701 – 713
714 – 730
714 – 734
767 – 774
767 – 779
780 – 800
781 – 802
807 – 841
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
2398,21 (2397,09)
2299,29 (2298,16)
1647,94 (1646,83)
1912,23(1911,12)
1359,85 (1358,72)
2155,18 (2154,06)
3636,49 (3635,60)
1180,71 (1179,60)
1594,96 (1594,69)
1734,96 (1733,83)
1203,61 (1202,52)
2772,53 (2771,42)
745,40 (744,39)
1371,89 (1370,76)
2293,13 (2292,02)
2531,35 (2530,24)
1414,73 (1412,70)
2347,28 (2346,16)
811,48 (810,41)
2702,42 (2702,31)
2474,19 (2473,06)
3368,46 (3367,37)
1587,86 (1586,73)
2090,09 (2088,98)
1017,54 (1016,46)
1597,92 (1596,79)
2255,98 (2255,15)
2355,33 (2354,22)
3872,99 (3871,92)
2176,23 (2175,22)
72 кДа-фрагмент ЦП (последовательность 482-1046 а. о.)
M, Да
а. о.
№
M, Да
2531,33 (2530,24)
1414,73 (1412,70)
1174,52 (1173,53)
2347,28 (2346,16)
2702,41 (2702,31)
2474,18 (2473,06)
3368,13 (3367,37)
2146,95 (2145,89)
1139,45 (1138,56)
883,49 (882,40)
1587,86 (1586,73)
2090,09 (2088,98)
1017,55 (1016,46)
1597,92 (1596,79)
2255,98 (2255,15)
2128,17 (2127,06)
2355,34 (2354,22)
3872,99 (3871,92)
2448,23 (2447,10)
1225,63 (1224,51)
799,43 (797,40)
2669,35 (2668,25)
482 – 504
505 – 518
519 – 528
519 – 539
558 – 579
580 – 600
591 – 619
601 – 619
692 – 700
694 – 700
701 – 713
714 – 730
767 – 774
767 – 779
780 – 800
781 – 800
781 – 802
807 – 841
846 – 868
926 – 938
939 – 945
990 – 1012
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
2531,33 (2530,24)
1414,73 (1412,70)
2347,29 (2346,16)
2703,21 (2702,31)
2474,12 (2473,06)
3368,44 (3367,37)
1587,74 (1586,73)
2090,12 (2088,98)
2662,33 (2661,24)
1017,57 (1016,46)
1597,94 (1596,79)
2256,00 (2255,15)
2355,34 (2354,22)
3873,04 (3871,92)
2176,08 (2175,22)
1225,61 (1224,51)
2962,39 (2961,41)
2669,33 (2668,25)
4 – 23
24 – 43
50 – 62
63 – 79
80 – 91
92 – 109
126 – 158
159 – 168
264 – 288
404 – 417
408 – 417
419 – 443
444 – 449
450 – 462
463 – 481
482 – 504
505 – 518
519 – 539
544 – 551
558 – 579
580 – 600
591 – 619
701 – 713
714 – 730
767 – 774
767 – 779
780 – 800
781 – 802
807 – 841
869 – 887
а. о.
482 – 504
505 – 518
519 – 539
558 – 579
580 – 600
591 – 619
701 – 713
714 – 730
714 – 734
767 – 774
767 – 779
780 – 800
781 – 802
807 – 841
869 – 887
926 – 938
988 – 1012
990 – 1012
232
67 кДа-фрагмент ЦП (последовательность 1-481 а. о.)
а. о.
№
M, Да
№
M, Да
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
2398,20 (2397,09)
2299,28 (2298,16)
2171,17 (2170,07)
1647,96 (1646,83)
1519,86 (1518,74)
1912,23 (1911,12)
1359,84 (1358,72)
2155,18 (2154,06)
3636,81 (3635,60)
1180,71 (1179,60)
1412,94 (1411,81)
2398,12 (2397,04)
2625,31 (2624,21)
2852,41 (2851,35)
906,55 (905,46)
1734,95 (1733,84)
1203,63 (1202,52)
2772,52 (2771,42)
2487,36 (2486,28)
745,40 (744,39)
2098,26 (2097,14)
2293,13 (2292,02)
1903,93 (1902,81)
№
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
№
1
2
3
4
4 – 23
24 – 43
25 – 43
50 – 62
51 – 62
63 – 79
80 – 91
92 – 109
126 – 158
159 – 168
169 – 182
240 – 261
240 – 263
264 – 288
341 – 348
404 – 417
408 – 417
419 – 443
421 – 443
444 – 449
444 – 462
463 – 481
466 – 481
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
2398,18 (2397,09)
2299,28 (2298,16)
1647,96 (1646,83)
1912,24 (1911,12)
1359,84 (1358,72)
2155,18 (2154,06)
3636,79 (3635,60)
1180,71 (1179,60)
1412,93 (1411,81)
2625,39 (2624,21)
2852,40 (2851,35)
906,57 (905,46)
1734,96 (1733,84)
2772,51 (2771,42)
2487,34 (2486,28)
745,40 (744,39)
2098,23 (2097,14)
1371,88 (1370,76)
1903,93 (1902,81)
52 кДа-фрагмент ЦП (последовательность 482-887 а. о.)
M, Да
а. о.
№
M, Да
2531,34 (2530,24)
1414,73 (1412,70)
1174,57 (1173,54)
2347,28 (2346,16)
3160,62 (3159,53)
2702,42 (2702,31)
2474,18 (2473,06)
3368,14 (3367,37)
2146,97 (2145,89)
3423,49 (3422,60)
1139,43 (1138,56)
883,23 (882,40)
1587,86 (1586,74)
2090,09 (2088,98)
2662,33 (2661,24)
1017,55 (1016,46)
2255,98 (2255,15)
2355,34 (2354,22)
3872,99 (3871,92)
2448,13 (2447,10)
482 – 504
505 – 518
519 – 528
519 – 539
554 – 579
558 – 579
580 – 600
591 – 619
601 – 619
620 – 649
692 – 700
694 – 700
701 – 713
714 – 730
714 – 734
767 – 774
780 – 800
781 – 802
807 – 841
846 – 868
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
2531,34 (2530,24)
1413,53 (1412,70)
1174,56 (1173,54)
2347,28 (2346,16)
939,52 (938,50)
3160,63 (3159,53)
2703,12 (2702,31)
2474,17 (2473,06)
3368,12 (3367,37)
2146,96 (2145,89)
1139,63 (1138,56)
1587,84 (1586,74)
2090,07 (2088,98)
2662,31 (2661,24)
1017,53 (1016,46)
1597,92 (1596,79)
2256,18 (2255,15)
3872,97 (3871,92)
2448,11 (2447,10)
19 кДа-фрагмент ЦП (последовательность 888-1046 а. о.)
M, Да
а. о.
№
M, Да
1225,49 (1224,51)
799,43 (797,40)
2962,33 (2961,41)
2669,20 (2668,25)
926 – 938
939 – 945
988 – 1012
990 – 1012
1
2
3
4
5
6
1225,54 (1224,51)
799,42 (797,40)
2962,39 (2961,41)
2669,19 (2668,25)
3660,70 (3659,75)
3804,77 (3803,80)
а. о.
4 – 23
24 – 43
50 – 62
63 – 79
80 – 91
92 – 109
126 – 158
159 – 168
169 – 182
240 – 263
264 – 288
341 – 348
404 – 417
419 – 443
421 – 443
444 – 449
444 – 462
450 – 462
466 – 481
а. о.
482 – 504
505 – 518
519 – 528
519 – 539
543 – 551
554 – 579
558 – 579
580 – 600
591 – 619
601 – 619
692 – 700
701 – 713
714 – 730
714 – 734
767 – 774
767 – 779
780 – 800
807 – 841
846 – 868
а. о.
926 – 938
939 – 945
988 – 1012
990 – 1012
1013 – 1044
1013 – 1046
* – Значение M в скобках соответствует теоретическому, рассчитанному на основании
аминокислотной последовательности пептида