УДК 577.543.42 Ахмадеева А.К.

Структура и динамика молекулярных систем. Яльчик-2002
39
УДК 577.543.42
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ КАТАЛИЗА
СУПРАМОЛЕКУЛЯРНЫМИ СОЕДИНЕНИЯМИ
Ахмадеева А.К.
Казанский государственный университет
Работа посвящена изучению возможности использования принципа
захвата и переноса заряженных частиц супрамолекулярными соединениями в
биотехнологии и в регулировании катализа, протекающего в среде, содержащей
однозарядные ионы. Ионактивные супермолекулы – новые необычайно
перспективные вещества с уникальными свойствами, и нами исследуется их
применение в качестве инструментов изучения и в регуляции катализа.
Представляет интерес, что синтез макроциклов осуществляется с заранее
заданными
конформационными
характеристиками
и
с
заданным
межмолекулярным взаимодействием [1]. Мы предположили, что макроциклы,
благодаря своим специфическим катионактивынм свойствам, могут
осуществлять процесс регулирования ферментативной активностью. Эти
соединения обладают свойствами с высокой специфичностью связывать
определенные ионы, включая их во внутреннюю полость своей кольцевидной
молекулы, что приводит к появлению у соединений совершенно новых свойств
и к сильной активации аниона. Комплексообразование, похожее на совмещение
поверхностей ключа и замка, возможно не только внутри, но и снаружи
молекулы, функциональные группы которой образуют сложный рельеф впадин
и выступов, и могут селективно связывать полярные агенты, вплоть до
аминокислот [2].
В задачу наших исследований входило изучение структурнофункциональной регуляции катализа супрамолекулярным соединением
криптандом [2.2.2.] Действие регуляторов катализа изучали на ферментах –
протеиназах; объекты: протеолитические ферменты трипсин (Sigma) и αхимотрипсин. Ферментативную активность трипсина (Sigma) определяли в
реакции гидролиза сложного эфира аминокислоты L-аргинина: N-α-бензоил-Lаргинин этиловый эфир, БАЭ1Э, а ферментативную активность αхимотрипсина определяли в реакции гидролиза низкомолекулярного субстрата
– пара-нитрофенилацетата, ПНФА. Реакцию гидролиза БАЭЭ ферментом
трипсином проводили в 0,05 М трис-ацетатным буфере, pH-8,2, в вариантах с
добавлением солей NaCl и KCl в концентрации 0,1 М, и макроцикла криптанда
[2.2.2.] в концентрации 4,3⋅10-5 М. Реакцию расщепления ПНФА,
осуществляемое α-химотрипсином, проводили в 0,1 М трис-HCl буфере, pH-7,7
с добавлением солей NaCl и KCl в концентрации от 0,05 до 3 М. Кинетику
реакций расщепления БАЭЭ и ПНФА регистрировали на спектрофотометре
40
Ахмадеева А.К
Specord M-40 (Carl Zeiss, Jena) по изменению амплитуды разностного спектра
поглощения при 253 нм и 418 нм, соответственно.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
Трипсин и химотрипсин относятся к ферментам, гидролизующим
непосредственно белок и полипептиды. Активность фермента трипсина
изучали на специфическом субстрате, содержащем аминокислоту L-аргинин,N-α-бензоил-L-аргинин этиловый эфир (БАЭЭ). Рядом работ, проведенных за
последние годы, показано, что трипсин катализирует не только расщепление
пептидных, но также сложноэфирных связей, в том числе расщепляет этиловый
эфир бензоил-L-аргинина с образованием соответствующего спирта и бензоилL-аргинина [3]. Для биологических катализаторов, расщепляющих
биополимеры, характерна весьма высокая активность: по некоторым данным,
каждая молекула фермента в течение 2 секунд при температуре 37°С может
привести в движение около 500 молекул вещества (субстрата), на которое она
воздействует [4]. В наших опытах скорость расщепления БАЭЭ трипсином
достигает максимальной скорости, Vmax = 19,96⋅10-6 М/с, о которой мы судим по
изменению концентрации исходного вещества, гидролиз которого
осуществляется ферментом.
Скорость химических реакций, осуществляемых ферментами, является
важным показателем их активности по отношению к биополимерам. В природе
существуют регуляторы активности ферментов, а также механизмы её
снижения. Предварительные исследования, проведенные нами [5] с ферментом
α-химпотрипсином, показали, что его реакционная способность зависит от
концентрации однозарядных ионов калия, натрия и хлора. В опытах по
влиянию К+, Nа+ и Сl– на процессы ферментативного гидролиза αхимотрипсином низкомолекулярного субстрата паранитрофенилацетата,
ПНФА, установили, что наблюдается колоколообразная зависимость в связи с
изменением концентрации NaCl и КCl от 0,05 до 3,0 М. Общность характера
действия ферментов по К+ и Nа+ на кинетику гидролиза дает возможность
объяснить наблюдаемые явления специфическим ионными воздействиями,
свойственными катионам металлов, что влечет как к усилению, так и к
ослаблению взаимодействия субстрата с ферментом. С повышением
концентрации соли до 3,0 М наблюдается более высокое сдерживающее
действие K+ на ферментативный гидролиз, чем Na+. При изучении скорости
расщепления различных концентраций субстрата ПНФА α-химотрипсином
также прослеживается колоколообразная зависимость от концентрации
катионов, что указывает на специфичность ионных воздействий, оказываемых
катионами металлов калия, натрия и анионом хлора на взаимодействие
комплекса фермент-субстрат (табл. 1). Однако между действиями К+ и Nа+ есть
и различия: уменьшение активности фермента было более значительное при
повышении концентрации KCl до 3 М, чем по NaCl, что указывает на более
высокое ионное действие калия, чем натрия.
Структура и динамика молекулярных систем. Яльчик-2002
41
Таблица 1
Изменения оптической плотности ∆D418 нм за 15 сек в реакционной смеси,
содержащей пара-нитрофенилацетат при 25°С при различной концентрации солей
KCl и NaCl. Концентрация фермента α-химотрипсина – 6⋅10-6 М.
Концентрация Контроль
ПНФА •10–3М ∆D418x 10-2
0,1М
NaCl
D418 x 10-2
0,1M
KCl
1M
NaCl
3M
NaCl
3M
KCl
1,5M KCl +
1,5M NaCl
2.64
1.1
7.62
8.4
8.4
11.12
2.88
1.96
0.83
6.08
7.0
6.2
8.2
2.76
2.08
0.55
5.0
4.76
5.04
5.36
2.36
1.68
0.28
3.28
3.32
3.6
4.2
2.04
1.4
0.11
2.4
2.08
2.4
2.8
1.6
1.44
0.055
1.92
2.32
1.32
1.68
0.76
В связи с выявлением определенного регуляторного влияния
однозарядных ионов на ферментативный катализ, мы предположили, что
рычагом направленного воздействия на ионно-ферментную систему могут
стать катионактивные супрамолекулярные соединения, способные брать в
«ловушку» катионы, изменяя катионно-анионную активность среды. В
проводимых нами опытах, в присутствии макроцикла криптанда [2.2.2] в
концентрации 4,3 · 10–5 М, наблюдается снижение каталитического действия
фермента трипсина на субстрат БАЭЭ, – со скорости Vmax, равной
19,96·10–6, М/с, на контроле, до Vmax, равной 17,53·10–6 М/с, с макроциклом
криптандом [2.2.2.] (табл. 2).
Таблица 2.
Кинетические параметры реакции гидролиза субстрата БАЭЭ трипсином.
Концентрация трипсина в кювете 2,1⋅ 10-6, М
Варианты
контроль
криптанд
4,3⋅10-5, М
Vmax x 10-6, M/s
19,96 ± 0,3
17,53 ± 0,4
Kcat , s-1
9,5 ± 0,02
8,3 ± 0,03
Наблюдается также незначительное уменьшение в присутствии
макроцикла
криптанда
[2.2.2.]
каталитической
константы
Kcat,
–1
характеризующей скорость ферментативной реакции, с 9,5 до 8,3,S (табл. 2).
Кинетические параметры реакции гидролиза субстрата БАЭЭ трипсином,
выраженные графически на рис. 1, показывают, что с течением времени
действие макроцикла криптанда [2.2.2.] усиливается. Присутствие макроцикла
может влиять также на конформационную структуру фермента благодаря
межмолекулярным взаимодействиям, что сказывается на взаимодействии
фермент-субстрат. Основной фактор, "подвластный" макроциклу – образование
комплекса «гость-хозяин» и его влияние на катионно-анионную активность
среды, активацию аниона с последующим изменением физико-химических
условий катализа.
42
Ахмадеева А.К
Рис. 1. Влияние макроцикла криптанда [2.2.2.] на максимальную скорость гидролиза
БАЭЭ трипсином в зависимости от времени, Т=25°С 1 – контроль-0,1 М трис -НСl
буфер, рН-8,2. 2 – криптанд – 4,3 х 10 – 5, М концентрация трипсина – 2,1 х 10 – 6, М
Как свидетельствует исследование, катионы металлов калия и натрия и
анионы хлора, до определенного уровня, вызывают активность ферментовпротеиназ. Регуляторами более направленного действия катионов могут быть
супрамолекулярные соединения. Их синтез осуществляется с заданными
свойствами: криптанд [2.2.2.] образует с катионами калия и натрия
высокоустойчивые криптаты, что приводит к сильной активации аниона. При
изменении в реакционной среде соотношения однозарядных ионов и
супрамолекулярных соединений может наблюдаться либо повышение
активности ферментов, либо угнетение их каталитического действия.
Важнейшим инструментом регулирования структурно-функциональной
активности ферментов и катализа через действие однозарядных ионов могут
стать супрамолекулярные соединения типа криптанда [2.2.2.].
Работа выполнена при поддержке НИОКР РТ [проект 23-26/2000(Ф)].
ЛИТЕРАТУРА
1. Химия комплексов "Гость-хозяин". Синтез, структуры и применения / Под ред.
Ф. Фегтле и Э. Вебер: Пер. с англ. М.: Мир, 1988. С. 320.
2. Лен Жан Мари. Супрамолекулярная химия – масштабы и перспективы.
Молекулы – супермолекулы – молекулярные устройства: Нобелевская лекция.
М.: Знание. Сер. Новое в жизни, науке, технике. 1989. № 2. С. 35.
3. Клесов А.А., Березин И.В. Ферментативный катализ. М.: Изд-во МГУ, 1980.
С. 263.
4. Асатиани В.С. Ферментные методы анализа. М.: Наука, 1969. – С. 740.
5. Файзуллин Д.А., Ступишина Е.А., Ахмадеева А.К. // Структура и динамика
молекулярных систем: Сб. Статей. М., 2000. Вып. VII. С. 199-201.