ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЖИДКОСТНОМ АМИНОКИСЛОТ В НИТЧАТЫХ ВОДОРОСЛЯХ НА ХРОМАТОГРАФЕ LC-20 PROMINENCE

УДК 543.544.5:582.263
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ В НИТЧАТЫХ ВОДОРОСЛЯХ НА
ЖИДКОСТНОМ ХРОМАТОГРАФЕ LC-20 PROMINENCE
А.Т.Калымбекова, К.К.Кабдулкаримова, Н.А Серикканова, Д.Иминова
Государственный университет имени Шакарима города Семей
Семей, Казахстан
Аннотация. В статье приведены результаты определения аминокислот в нитчатых
водорослей пресных водоемов близлежащих Семейскому региону. Проведены следующие
этапы исследования нитчатых водорослей: заготовка растительного сырья; определения
аимонкислот методом хроматографии на жидкостном хроматографе LC-20 Prominence.
Полученные данные показали, что в составе нитчатых водорослей содержатся 8
индивидуальных аминокислот и содержание аминокислот у исследованных нитчатых
водорослях сопоставимо с таковым у морских водорослей.
Ключевые слова: нитчатые водоросли (Спирагира, Улотрикс), пресные водоемы,
Семейский регион, биологически активная добавка (БАВ), жидкостной хроматограф.
Органические вещества водорослей представлены сложным комплексом углеводов,
азотсодержащих веществ, липидами, каротиноидами, витаминами и т.д.
К азотсодержащим веществам относятся главным образом белки и свободные
аминокислоты (САК).
Химический состав водорослей неоднороден.
Согласно литературным данным, среди бурых водорослей наибольшее содержание
САК найдено у Laminaria japonica, а среди красных − у некоторых видов Porphyra.
Содержание САК, как и содержание белков, зависит от сезона. При этом динамика их
накопления у разных видов может быть прямо противоположной. Например, у Laminaria
japonica в июле содержание САК может быть в 2,5-3 раза больше, чем в апреле, а у
Chondrus ocellatus, напротив, в апреле содержание САК может достигать 1240-1630 мг%,
а к июлю падать до 200-350 мг%. Поскольку содержание не связанных аминокислот во
многом определяет пищевую и лечебно-профилактическую ценность водорослевого
сырья, при планировании сроков промысла макрофитов следует учитывать это
обстоятельство[1-3].
В составе САК различных видов водорослей обнаружены от 15 до 20 индивидуальных
аминокислот. Наиболее массовыми среди них являются моноаминодикарбоновые кислоты
(аспарагиновая и глутаминовая), из моноаминомонокарбоновых кислот − аланин. Состав
САК достаточно специфичен для разных видов. Для Ulva наиболее массовой является
цистиновая кислота, для Laminariajaponica - глутаминовая и аспарагиновая, для Porphyra
- аланин, глутаминовая и аспарагиновая кислоты.
В составе САК камчатских видов обнаружено до 18 аминокислот [2]. Наиболее
массовыми среди них являются моноаминодикарбоновые кислоты(аспарагиновая и
глутаминовая), из моноаминомонокарбоновых кислот − аланин. При этом у ламинарии
Бонгарда наиболее высоко содержание глутаминовой и аспарагиновой аминокислот, у
пальмарии узко угольной − аланина, глутаминовой и аспарагиновой кислот.
Белки водорослей полезнее для организма человека, чем белки наземных растений,
поскольку некоторые из них обладают повышенной гормоноподобной активностью. Это
объясняется тем, что в их состав входит моно- и дийодтирозин. Кроме того, в водорослях
обнаружены такие биологически активные вещества, как таурин (до 220мг%), цитрулин
(до 240мг%), хондрин (до 190мг%) и др., играющие важную роль в обмене веществ в
организме человека. В настоящее время в пищевой промышленности, биотехнологии,
косметологии, медицине и фармацевтике широко используют добавки, обладающие
биологической активностью (БАВ).
Фундаментальными и прикладными исследованиями ученых разных стран мира
убедительно показано, что морские водоросли являются полифункциональными
пищевыми добавками и способствуют повышению технологических характеристик
продуктов [3-5].
Однако в нашей стране использование водорослей не поставлено, это объясняется не
изученностью
химического состава,
недостаточностью теоретических знаний и
экспериментальных исследований в технологии производства БАВ на основе водорослей.
Поэтому глубокое изучение химического состава водорослей и научных основ их
использования в составе пищевых продуктов, являются актуальными и позволяют
определить пути получения и применения полифункциональных пищевых добавок.
Нами в нитчатых водорослях (в Спирагире и Улотриксе) определены 17 минеральных
веществ (макро- и микроэлементов) методов масс-спектрометрии с индуктивно связанной
плазмой (ИСП-МС) [6].
Так, в составе Спирагира и Улотрикс были обнаружены такие микроэлементы, как
марганец, кобальт, молибден, медь, цинк и селен. Следует также отметить, что
Спирагира и Улотрикс являются источником натрия, калия, магния, фосфора, кальция [6].
Установлено, что при сжигании водорослей для получения золы для определения
минеральных веществ пропадают все органические вещества, при выработке только
органических веществ пропадают все зольные элементы. Поэтому нами выработана
методы комплексной переработки водорослей, которые позволили бы получить из одной и
той же порции водорослей максимальное количество продуктов.
Определение аминокислот на жидкостном хроматографе SHIMADZU LC-20
Prominence (Япония) с флуориметрическим и спектрофотометрическим детектором
проводили в испытательной региональной лаборатории инженерного профиля «Научный
центр радиоэкологических исследований» Государственного университета имени
Шакарима города Семей.
Сущность метода заключается в расщеплении пептидных связей белка соляной
кислотой при нагревании и избирательной сорбции аминокислот на ионообменнике
жидкостной хроматографической колонки [7].
Использовалась хроматографическая колонка размером 25см·4,6мм SUPELCO
C18,5мкм (США) с предколонкой для защиты основной колонки от примесей.
Хроматографический анализ проводили в градиентном режиме при расходе элюента
1,2мл/мин и температуре термостата колонки 400С. Измерение проводили методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с обращённой фазой с
спектрофотометрическим и флуориметрическим детекторами на длинах волн 246нм и
260нм с использованием кислотного гидролиза и модификации аминокислот раствором
фенилизотиоцианата в изопропиловом спирте с получением фенилтиогидантоинов. В
качестве подвижной фазы использовали смесь 6,0 мМ раствора CH3COONa с рН 5,5
(компонентА), 1% раствор изопропилового спирта в ацетонитриле (компонент В) и 6,0
мМ раствора CH3COONa с рН 4,05(компонент С). Оптимизированы условия кислотного
гидролиза образцов при проведении процедуры пробоподготовки.
Использовали стандартные образцы аминокислот производство Sigma Aldrich,
ацетонитрил о.с.ч., изопропиловый спирт о.с.ч. для жидкостной хроматографии,
фенилизотиоцианат (ФИТЦ) производство Sigma Aldrich, ацетат натрия о.с.ч., соляную
кислоту о.с.ч., гидроксид натрия о.с.ч.
Пробоподготовка:
Для проведения гидролиза в стеклянные ампулы с оттянутым концом помещаем
(1000±0,0002) г навески воздушно-сухого водоросли. Далее добавляли 10 мл 6М раствора
соляной кислоты. Смесь тщательно перемешивали и обдували током азота в течение 2
мин. Стеклянные ампулы запаивали и помещали в термостат. Гидролиз проводили при
температуре 1100С в течение 24ч. После охлаждения гидролизата фильтровали через
мембранные фильтры диаметром пор 0,45мкм, и отбирали аликвоты 0,5мл. Аликвоты
высушивали при 650С в токе воздуха. К высушенным аликвотам добавляли 0,10 мл 0,15М
раствора
NaOH и тщательно перемешивали. Затем приливали 0,35мл раствора
фенилизотиоцианата в изопропиловом спирте, перемешивали и добавляли 5мл
дистиллированной воды и фильтровали через мембранный фильтр с диаметром пор
0,45мкм. Полученные растворы подвергали хроматографическому анализу. Получали
хроматограммы с пиками кривых, площади которых пропорциональны концентрациям
аминокислот.
Рис.1. Хроматограмма аминокислоты
Для расчета площади пика на хроматограмме проводили базовую линию,
касательную к двум основаниям, и высоту һ, проходящую через вершину кривой
параллельно оси ординат. На уровне, равном половине высоты, проводили линию,
параллельную базовой. (Отрезок, отсекаемый на этой линии кривой, называется
полушириной пика b(рис.1)). Площадь пика S, в квадратных миллиметрах вычисляли по
формуле: S = h·b. Массу аминокислоты (Х) в граммах на 100г воздушно-сухого водоросли
вычисляли по формуле: X = C·S·V·1000/Sст ·m.
C – концентрация аминокислоты стандартного рабочего раствора, мг/см3;
S – площадь пика аминокислоты исследуемой пробы, мм2;
V – конечный объем гидролизата, см3;
Sст – площадь пика аминокислоты стандартного рабочего раствора, мм2;
m – масса навески пробы, взятая на гидролиз, мг.
Хроматограф жидкостной LC-20 Prominence
(производство Япония).
Жидкостной хроматограф LC-20 Prominence имеет блочную конфигурацию, состоит из
следующих блоков:
- Поддон с подвижной фазой;
- Насосы серии LC-20 Prominence;
- Автодозатор;
- Термостат серии LC-20 Prominence;
- Детектор (флуориметрический, спектрофотометрический).
Таблица 1 - Результаты хроматографического анализа аминокислот водорослей
мг/100г воздушно
-сухого вещества
№
№ пробы Наименование
проб
1
1988
Водоросли
Место
отбора
проб
Наименование аминокислот
Ед.
изм.
р.Иртыш
Валин
Лейцин
Фенилаланин
Трифтофан
Метионин
Изолейцин
Аргинин
Лизин
мг/100г
мг/100г
мг/100г
мг/100г
мг/100г
мг/100г
мг/100г
мг/100г
Литература
Фактич.
значения
содержания
аминокислот
8,12±0,15
1,24±0,09
4,06±0,42
2,01±0,21
3,26±0,25
4,14±0,26
12,45±0,33
2,82±0,24
1. Подкорытова А.В., Кадникова И.А. Качество, безопасность и методы анализа
продуктов из гидробионтов. Руководство по современным методам исследований
морских водорослей, трав и продуктов их переработки, М.: ВПИРО, 2009, в.3 – 108с.
2. Клочкова Н.Г., Березовская В.А. Водоросли Камчатского шельфа:
распространение, биология, химический состав: монография. – Владивосток: Дальнаука,
1997. – 156с.
3. Попова С., Устинков Н., Думан Т. «Дары морей и океанов», ГБОУ СПО ЯНАО
«Ямальский полярный агроэкономический техникум». 2011. – с.1-19.
4. Аминина Н.М., Гурулева О.Н. Химический состав бурых водорослей
Авачинского залива (побережье п-ова Камчатка) // Вопросы современной альгологии,
2012. - №2(2).
5. ГОСТ 26185-84. Водоросли морские, травы морские и продукты их переработки.
Методы анализа. – М.: Стандарт, 1984. – 53с.
6. Кабдулкаримова К.К., Омарова Н.М. Использование нитчатых водорослей в
агропромышленности в качестве биологической активной добавки. Химический журнал
Казахстана, 2015. – №3. – 62-67с.
7. ГОСТ 32195 – 2013. Корма, комбикорма. Метод определения содержания
аминокислот. – М.: Стандартинформ, 2014.