2 478 647(13) C1

РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
(19)
RU
(11)
2 478 647
(13)
C1
(51) МПК
C07K
C12P
G01N
C12R
16/12 (2006.01)
21/00 (2006.01)
33/569 (2006.01)
1/07 (2006.01)
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
(12) ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ
(21)(22) Заявка: 2011133505/10, 10.08.2011
(24) Дата начала отсчета срока действия патента:
10.08.2011
(72) Автор(ы):
Соболев Виктор Васильевич (RU),
Захарченко Олег Сергеевич (RU)
(45) Опубликовано: 10.04.2013 Бюл. № 10
C 1
2 4 7 8 6 4 7
R U
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЫВОРОТКИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ И
ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ НАБОР
(57) Реферат:
Изобретение раскрывает способ получения
сыворотки для диагностики сибирской язвы
путем гипериммунизации продуцентов - волов
антигеном из штамма Bacillus anthracis M-71.
Гипериммунизацию проводят в возрастающих
дозах: первое введение антигена подкожно в
дозе 100-120 млн. микробных клеток совместно
с 2,5-3 мкг сапонина, через 12-14 суток антиген
вводят внутрикожно в дозе 2,5-3,0 млрд.
микробных клеток совместно с 2,5-3 мкг
сапонина, через 6-7 суток с интервалом 3-4 дня
антиген вводят 12-14 раз внутривенно в
возрастающих дозах от 10,0 до 210 млрд. м. к.
Затем
осуществляют
забор
крови,
выдерживают при температуре 37-38°С в
течение 2-3 часов, а затем помещают в
холодильник при 2-8°С на 3-5 суток, после чего
отделяют сыворотку. Полученную сыворотку
консервируют
5-7%-ным
раствором
карболовой
кислоты
на
изотоническом
растворе
в
соотношении
(9-10):1,
соответственно. Готовая сыворотка стерильная
и имеет титр в РА не ниже 1:1000, в РСК - не
ниже 1:20. Диагностический набор для
диагностики сибирской язвы содержит антиген
из штамма Bacillus anthracis M-71, сыворотку
для диагностики сибирской язвы и нативную
сыворотку здорового крупного рогатого
скота. Изобретение обеспечивает повышение
специфической
активности
сыворотки
и
эффективность
диагностики
возбудителя
сибирской язвы. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 1 табл., 4 пр.
C 1
Адрес для переписки:
105120, Москва, 3-й Сыромятнический пер.,
3/9, стр.1, ОАО "Институт биотехнологий
ветеринарной медицины", генеральному
директору П.П. Рахманину
Ñòð.: 1
ru
2 4 7 8 6 4 7
(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске: RU 2252031 С1, 20.05.2005. RU 2191603
С1, 27.10.2002. US 7456264 В2, 25.11.2008. US
20110117104 А1, 19.05.2011. US 6,878,519 В2,
12.04.2005. CN 1963508 А, 16.05.2007. JP
4107849 В2, 25.06.2008. US 7393647 В2,
01.07.2008.
R U
(73) Патентообладатель(и):
Открытое акционерное общество "Институт
биотехнологий ветеринарной медицины"
(RU)
Приоритет(ы):
(22) Дата подачи заявки: 10.08.2011
RUSSIAN FEDERATION
(19)
RU
(11)
2 478 647
(13)
C1
(51) Int. Cl.
C07K
C12P
G01N
C12R
16/12 (2006.01)
21/00 (2006.01)
33/569 (2006.01)
1/07 (2006.01)
FEDERAL SERVICE
FOR INTELLECTUAL PROPERTY
(12) ABSTRACT
OF INVENTION
(72) Inventor(s):
Sobolev Viktor Vasil'evich (RU),
Zakharchenko Oleg Sergeevich (RU)
(21)(22) Application: 2011133505/10, 10.08.2011
(24) Effective date for property rights:
10.08.2011
(45) Date of publication: 10.04.2013 Bull. 10
sampling, keeping at temperature 37-38°C for 2-3
hours, placing in a fridge at 2-8°C for 3-5 days,
separating serum. The prepared serum is preserved in
5-7% carbolic acid in isotonic solution in ratio (910):1 respectively. The ready serum is sterile and
has an AR titre min. 1:1000, a CFT titre min. 1:20. A
diagnostic set for anthrax diagnosis comprises the
antigen of the strain Bacillus anthracis M-71, the
anthrax diagnostic serum and healthy bovine's native
serum.
EFFECT: invention provides higher specific
activity of the serum and diagnostic effectiveness
for an anthrax agent.
5 cl, 1 tbl, 3 ex
R U
2 4 7 8 6 4 7
(57) Abstract:
FIELD: medicine, pharmaceutics.
SUBSTANCE: invention discloses a method for
preparing an anthrax diagnostic serum by
hyperimmunisation of ox producers with an antigen
of
the
strain
Bacillus
anthracis
M-71.
Hyperimmunisation is conducted in increasing doses:
first subcutaneous introduction of the antigen 100120 mln microbial cells together with saponin 2.5-3
mcg; 12-14 days later, the antigen is introduced
intracutaneously in a dose of 2.5-3.0 bln microbial
cells together with saponin 2.5-3 mcg; 6-7 days
later, every 3-4 days, the antigen is introduced
intravenously 12-14 times in increasing doses 10.0 to
210 bln. microbial cells. It is followed by blood
Ñòð.: 2
en
C 1
C 1
(54) METHOD FOR PREPARING ANTHRAX DIAGNOSTIC SERUM AND DIAGNOSTIC SET
2 4 7 8 6 4 7
Mail address:
105120, Moskva, 3-j Syromjatnicheskij per., 3/9,
str.1, OAO "Institut biotekhnologij veterinarnoj
meditsiny", general'nomu direktoru P.P.
Rakhmaninu
R U
(73) Proprietor(s):
Otkrytoe aktsionernoe obshchestvo "Institut
biotekhnologij veterinarnoj meditsiny" (RU)
Priority:
(22) Date of filing: 10.08.2011
RU 2 478 647 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Изобретение относится к ветеринарии, в частности к ветеринарной микробиологии,
и может быть использовано при производстве сыворотки для диагностики сибирской
язвы.
Известен способ получения сыворотки для диагностики сибирской язвы путем
иммунизации продуцентов антигеном из бескапсульного штамма Bacillus anthracis 55ВНИИВВиМ, для гипериммунизации используют лошадей. Антиген из
бескапсульного штамма 55-ВНИИВВиМ вводили лошадям внутривенно в
нарастающих дозах от 5,0 до 70 см 3, с концентрацией 2,0-3,0 млрд. м. клеток в см 3
вегетативных культур штаммов В. anthracis. Интервал между инъекциями - 3-4 дня.
Сыворотку от лошадей по окончании периода гипериммунизации (через 8-10 суток
после введения последней дозы антигена) получали по следующей методике: лошадей
перед взятием крови предварительно выдерживали 12 часов на голодной диете, не
ограничивая водопой. Затем животных термометрировали, и от имеющих
нормальную температуру брали кровь из расчета 8,0 см 3 на 1 кг массы продуцента в
первое крововзятие и 14,0-16,0 см 3 в последующие, кровь собирали в градуированные
стеклянные баллоны емкостью 15-20 литров. Сыворотку получали цитратным
методом, используя стерильный 10% раствор лимоннокислого натрия с последующим
сепарированием для отделения форменных элементов крови и дефибринацией плазмы
(Шморгун Б.И. Изготовление сибиреязвенного антигена из вакцинных бескапсульных
штаммов. / Сб. науч. трудов. ВИЭВ - М. - 1989. - С.17-18.).
Недостатком известного способа является низкое качество, что снижает
специфическую активность сыворотки.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение
качества целевого продукта за счет увеличения его специфичности.
Предложена группа изобретений, объединенная единым изобретательским
замыслом с достижением единого технического результата.
Технический результат достигается в способе получения сыворотки для
диагностики сибирской язвы путем гипериммунизации продуцентов антигеном из
штамма Bacillus anthracis, гипериммунизацию проводят в возрастающих дозах с
последующим взятием крови у продуцента, отделением сыворотки и выделением
целевого продукта тем, что для гипериммунизации используют волов и антиген из
штамма Bacillus anthracis M-71, причем гипериммунизацию проводят следующим
образом: первое введение антигена подкожно в дозе 100-120 млн. микробных клеток
совместно с 2,5-3 мкг сапонина, через 12-14 суток антиген вводят внутрикожно в
дозе 2,5-3,0 млрд. микробных клеток совместно с 2,5-3 мкг сапонина, через 6-7 суток с
интервалом 3-4 дня антиген вводят 12-14 раз внутривенно в возрастающих дозах
от 10,0 до 210 млрд. микробных клеток.
Технический результат достигается также в способе получения сыворотки для
диагностики сибирской язвы тем, что сыворотка стерильная и имеет титр в РА не
ниже 1:1000, а в РСК - не ниже 1:20.
Технический результат достигается также в способе получения сыворотки для
диагностики сибирской язвы тем, что кровь животных-продуцентов выдерживают при
температуре 37-38°С в течение 2-3 часов, а затем помещают в холодильник при 2-8°С
на 3-5 суток, после чего сыворотку отделяют.
Технический результат достигается также в способе получения сыворотки для
диагностики сибирской язвы тем, что полученную сыворотку консервируют 5-7%-ным
раствором карболовой кислоты на изотоническом растворе в соотношении 1:(9-10).
Технический результат достигается также тем, что создан диагностический набор
Ñòð.: 3
DE
RU 2 478 647 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
для диагностики сибирской язвы, который содержит антиген из штамма Bacillus
anthracis M-71, сыворотку для диагностики сибирской язвы и нативную сыворотку
здорового крупного рогатого скота.
В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения,
содержащие режимы для диагностики сибирской язвы, аналогичные заявляемому, т.е.
предложение соответствует критерию «новизна».
Все режимы способа осуществимы в лабораторных и промышленных условиях,
направлены на решение реальной технической задачи, т.е. предложение
«промышленно применимо».
Однако существующие иммунные сыворотки для диагностики сибирской язвы,
получаемые в процессе иммунизации животных на атигены штаммов Bacillus anthracis,
производят без учета характеристик компонентов клетки возбудителей,
функционально относящихся к факторам патогенности: капсульных, поверхностных
антигенов штамма Bacillus anthracis и антител к ним, без определения уровня их
специфической активности в процессе гипериммунизации животных, а также степени
накопления и сохранения активности в процессе получения готового препарата.
Известные технологические процессы получения иммунных сывороток для
диагностики сибирской язвы также проводятся в неконтролируемых по факторам
патогенности режимах.
Нами впервые установлено, что проведение иммунизации животных-продуцентов
антигеном из штамма Bacillus anthracis M-71 при определенных режимах позволяет
получить неочевидный положительный эффект - повышение качества целевого
продукта за счет увеличения его специфичности и ускорения способа, т.е. предложение
соответствует критерию «изобретательский уровень».
Способ иллюстрируется на следующих примерах.
Пример 1. Получают сыворотку для диагностики сибирской язвы следующим
образом.
Животных-продуцентов (волы) гипериммунизируют антигеном из штамма Bacillus
anthracis M-71, причем гипериммунизацию проводят следующим образом: первое
введение антигена подкожно в дозе 100 млн. микробных клеток совместно с 2,5 мкг
сапонина, через 12 суток антиген вводят внутрикожно в дозе 2,5 млрд. микробных
клеток совместно с 2,5 мкг сапонина, через 6 суток с интервалом 3 дня антиген
вводят 12 раз внутривенно в возрастающих дозах от 10,0 до 210 млрд. микробных
клеток, а именно: 1 введение - 10,0 млрд. микробных клеток, 2 введение - 25 млрд.
микробных клеток, 3 введение - 40,0 млрд. микробных клеток, 4 введение - 50,0 млрд.
микробных клеток, 5 введение - 65,0 млрд. микробных клеток, 6 введение - 80,0 млрд.
микробных клеток, 7 введение - 95,0 млрд. микробных клеток, 8 введение - 110,0 млрд.
микробных клеток, 9 введение - 130,0 млрд. микробных клеток, 10 введение - 140,0
млрд. микробных клеток, 11 введение - 160,0 млрд. микробных клеток, 12 введение 200,0 млрд. микробных клеток. При достижении уровня антител в крови продуцентов
в РА 1:1000, а в РСК 1:20, осуществляют производственное кровопускание. Кровь
выдерживают при температуре 37°С в течение 2 часов, а затем помещают в
холодильник при 2°С на 3 суток, после чего отделяют сыворотку.
Полученную сыворотку консервируют 5% раствором карболовой кислоты на
изотоническом растворе хлористого натрия в соотношении 9:1 и расфасовывают.
Пример 2. Получают сыворотку для диагностики сибирской язвы следующим
образом.
Животных-продуцентов (волы) гипериммунизируют антигеном из штамма Bacillus
Ñòð.: 4
RU 2 478 647 C1
5
10
15
20
25
30
anthracis M-71, причем гипериммунизацию проводят следующим образом: первое
введение антигена подкожно в дозе 120 млн. микробных клеток совместно с 3,0 мкг
сапонина, через 14 суток антиген вводят внутрикожно в дозе 3,0 млрд. микробных
клеток совместно с 3,0 мкг сапонина, через 7 суток с интервалом 4 дня антиген
вводят 14 раз внутривенно в возрастающих дозах от 15,0 до 210 млрд. микробных
клеток, а именно: 1 введение - 15,0 млрд. микробных клеток, 2 введение - 30 млрд.
микробных клеток, 3 введение - 45,0 млрд. микробных клеток, 4 введение - 60,0 млрд.
микробных клеток, 5 введение - 75,0 млрд. микробных клеток, 6 введение - 90,0 млрд.
микробных клеток, 7 введение - 105,0 млрд. микробных клеток, 8 введение - 120,0 млрд.
микробных клеток, 9 введение - 140,0 млрд. микробных клеток, 10 введение - 150,0
млрд. микробных клеток, 11 введение - 170,0 млрд. микробных клеток, 12 введение 210,0 млрд. микробных клеток, 13 введение - 210,0 млрд. микробных клеток, 14
введение - 210,0 млрд. микробных клеток. При достижении уровня антител в крови
продуцентов в РА 1:1000, а в РСК 1:20, осуществляют производственное
кровопускание. Кровь выдерживают при температуре 38°С в течение 3 часов, а затем
помещают в холодильник при 8°С на 5 суток, после чего отделяют сыворотку.
Полученную сыворотку консервируют 7% раствором карболовой кислоты на
изотоническом растворе хлористого натрия в соотношении 10:1 и расфасовывают.
Пример 3. Определение специфичности сывороток, полученных к отдельным
антигенам В.anthracis.
Штаммы В.anthracis и близкородственных микроорганизмов засевали в виде
газонов на питательный агар. После 18-часовой инкубации при 37°С против газонов
выросших культур в агаре пробивали лунки (диаметром 6 мм), в которые вносили
исследуемые сыворотки, чашки оставляли при комнатной температуре. Через 18-24
часа между выросшими культурами и лунками с сывороткой образовывались зоны
преципитатов.
После образования преципитатов культуры обеззараживали парами формалина.
Таблица
№№ Штаммы
35
40
45
50
Наличие зон преципитации
прототип
заявляемая сыворотка
1
В.anthracis СТИ
есть
есть
2
В.anthracis 55 ВНИИВВиМ
есть
есть
3
В.anthracis M 71
есть
есть
4
В.anthracis 619/42
есть
есть
5
В.anthracis 591/2
есть
есть
6
В.anthracis Davies
есть
есть
7
В.cereus NP
есть
нет
8
В.cereus ATCC 6464
есть
нет
9
В.thuringiensis V.thuringiensis "Pasteur"
есть
нет
10
B.megaterium 216
есть
нет
11
В.thuringiensis V.tburingiensis "Galleria"
есть
нет
12
B.subtilis 407
есть
нет
13
В.subtilis BD 430
есть
нет
Из данных таблицы видно, что заявляемая сыворотка образует зону преципитата
только с антигенами В. anthracis как содержащими плазмиды вирулентности, так и с
антигенами бесплазмидных сибиреязвенных штаммов в отличие от сывороткипрототипа, которая образует зоны преципитатов как с антигенами сибиреязвенных
штаммов, так и с антигенами близкородственных микроорганизмов.
Таким образом, сыворотка к высокомолекулярному антигенному комплексу В.
Ñòð.: 5
RU 2 478 647 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
anthracis в отличие от сывороток к другим внеклеточным антигенам В. anthracis и
коммерческого сибиреязвенного глобулина является высокоспецифичной и может
быть использована для идентификации штаммов В. anthracis как содержащих
плазмиды вирулентности, так и бесплазмидных штаммов.
Пример 4. Набор для диагностики сибирской язвы («Преципантр»).
В состав набора входят следующие компоненты:
- антиген из штамма Bacillus anthracis M-71;
- сыворотка для диагностики сибирской язвы;
- сыворотка негативная, представляющая собой нативную сыворотку здорового
крупного рогатого скота.
Антиген из штамма Bacillus anthracis M-71 выявляет в указанных серологических
реакциях специфические антитела в сыворотке крови больных сибирской язвой
животных или иммунизированных противосибиреязвенными вакцинами.
Сыворотка для диагностики сибирской язвы содержит специфические
сибиреязвенные антитела, дающие положительные серологические реакции с
сибиреязвенным антигеном.
Сыворотка негативная, представляющая собой нативную сыворотку здорового
крупного рогатого скота и не дает серологических реакций с сибиреязвенным
антигеном.
Диагностическую сыворотку используют согласно «Инструкции по применению
сыворотки сибиреязвенной преципитирующей из крови лошадей» /Утв. Федеральной
службой по ветеринарному и фитосанитарному надзору МСХ России 21.07.2009 г./.
Набор для диагностики сибирской язвы («Преципантр») применяют в реакции
преципитации (по Асколи) при исследовании кож и другого патологического
материала на сибирскую язву. Перед использованием диагностическую сыворотку
контролируют на активность и специфичность в реакции преципитации с антигеном из
штамма Bacillus anthracis M-71 и сывороткой нативной. Сыворотка диагностическая
должна давать положительную реакцию с антигеном из штамма Bacillus anthracis M-71
в течение 1 мин и не взаимодействовать с сывороткой нативной в течение 15 минут.
К обезвреженному в автоклаве при температуре 121°С и давлении 0,1 МПа
испытуемому образцу (кожа крупного рогатого скота) в измельченном состоянии
добавляют экстрагирующую жидкость, содержащую 0,3% фенол в изотоническом
растворе в соотношении 1:10 и проводят экстракцию в течение 16-20 часов.
Отфильтрованный экстракт используют в реакции преципитации с диагностической
сывороткой. Соединение компонентов реакции достигается наслаиванием
профильтрованного экстракта на диагностическую сыворотку в пробирках Уленгута.
Реакцию преципитации считают положительной, если через 1-2 мин на границе между
сывороткой и экстрактом появится четко выраженное компактное серовато-белое
кольцо преципитата. При отрицательном результате на границе между компонентами
признаки преципитации отсутствуют.
Применение в качестве антигена культуры одного штамма Bacillus anthracis M-71 по
указанной схеме позволяет повысить специфическую активность сыворотки для
диагностики сибирской язвы, значительно упростить и удешевить технологию ее
производства, исключить возможность заражения сибирской язвой людей и
обсеменения окружающей среды спорами вирулентных штаммов антракса, в более
короткие сроки (43-57 дней вместо 59-109 дней) получить сыворотку, значительно
более эффективно использовать продуценты (очередные крововзятия через 10-12 дней
вместо 31-80).
Ñòð.: 6
RU 2 478 647 C1
Как показали результаты экспериментальных исследований, согласно примерам 13, предлагаемый способ позволяет в повысить качество целевого продукта за счет
увеличения специфичности.
5
10
15
20
25
30
Формула изобретения
1. Способ получения сыворотки для диагностики сибирской язвы путем
гипериммунизации продуцентов антигеном из штамма Bacillus anthracis в
возрастающих дозах с последующим получением крови и отделением целевого
продукта, отличающийся тем, что в качестве продуцентов используют волов, а в
качестве антигена - антиген из штамма Bacillus anthracis M-71, при этом
гипериммунизацию проводят следующим образом: первое введение антигена
осуществляют подкожно в дозе 100-120 млн микробных клеток совместно с 2,5-3 мкг
сапонина, через 12-14 суток антиген вводят внутрикожно в дозе 2,5-3,0 млрд.
микробных клеток совместно с 2,5-3 мкг сапонина, через 6-7 суток - антиген вводят 1214 раз с интервалом 3-4 дня внутривенно в возрастающих дозах от 10,0 до 210 млрд
микробных клеток.
2. Способ получения сыворотки для диагностики сибирской язвы по п.1,
отличающийся тем, что перед отделением сыворотки полученную кровь животныхпродуцентов предварительно выдерживают при температуре 37-38°С в течение 2-3 ч, а
затем помещают в холодильник при 2-8°С на 3- 5 суток.
3. Способ получения сыворотки для диагностики сибирской язвы по п.1,
отличающийся тем, что полученную сыворотку консервируют 5-7%-ным раствором
карболовой кислоты на изотоническом растворе в соотношении (9-10):1
соответственно.
4. Способ получения сыворотки для диагностики сибирской язвы по любому из
пп.1-3, отличающийся тем, что сыворотка стерильная, имеет титр в РА не ниже 1:1000,
в РСК - не ниже 1:20.
5. Набор для диагностики сибирской язвы, отличающийся тем, что содержит
антиген из штамма Bacillus anthracis M-71, сыворотку для диагностики сибирской язвы,
полученную по любому из пп.1-4, и нативную сыворотку здорового крупного
рогатого скота.
35
40
45
50
Ñòð.: 7
CL