017617 B1 017617 B1 (11) 017617

Евразийское
патентное
ведомство
(19)
(11)
017617
(13)
B1
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45)
Дата публикации и выдачи патента
2013.01.30
(21)
Номер заявки
(51) Int. Cl. G01N 33/531 (2006.01)
A61K 35/16 (2006.01)
A61B 10/00 (2006.01)
201101070
(22)
Дата подачи заявки
2011.08.10
(54)
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЫВОРОТКИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ И
ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ НАБОР
B1
(72)
Изобретатель:
(74)
Представитель:
(57)
Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и может быть использовано при
производстве сыворотки для диагностики сибирской язвы. Предложен способ получения
сыворотки для диагностики сибирской язвы путем гипериммунизации продуцентов антигеном из
штамма Bacillus anthracis. Гипериммунизацию проводят в возрастающих дозах с последующим
взятием крови у продуцента, отделением сыворотки и выделением целевого продукта, причем для
повышения специфической активности сыворотки в качестве продуцентов для гипериммунизации
используют волов, а в качестве антигена - антиген из штамма Bacillus anthracis M-71, а
гипериммунизацию проводят следующим образом: первое введение антигена подкожно в дозе
100-120 млн микробных клеток совместно с 2,5-3 мкг сапонина, через 12-14 суток антиген вводят
внутрикожно в дозе 2,5-3,0 млрд микробных клеток совместно с 2,5-3 мкг сапонина, через 6-7
суток с интервалом 3-4 дня антиген вводят 12-14 раз внутривенно в возрастающих дозах от
10,0 до 210 млрд микробных клеток, при чем кровь животных-продуцентов выдерживают при
температуре 37-38°С в течение 2-3 ч, а затем помещают в холодильник при 2-8°С на 3-5 суток,
после чего стерильную сыворотку, имеющую титр в РА не ниже 1:1000, а в РСК - не ниже
1:20, отделяют. Полученную сыворотку консервируют 5-7%-ным раствором карболовой кислоты
на изотоническом растворе в соотношении (9-10):1 соответственно. Диагностический набор для
диагностики сибирской язвы содержит антиген из штамма Bacillus anthracis M-71, сыворотку для
диагностики сибирской язвы и нативную сыворотку здорового крупного рогатого скота.
Соболев Виктор Васильевич,
Захарченко Олег Сергеевич (RU)
Майстренко Е.С. (RU)
B1
017617
(56) RU-C1-2010577
RU-C1-2191603
RU-C1-2252031
EP-A1-1304387
CLEMENT Kristin H. et al.: Vaccination of
Rhesus Macaques with the Anthrax Vaccine Adsorbed
Vaccine Produces a Serum Antibody Response that
Effectively Neutralizes Receptor-Bound Protective
Antigen in Vitro. Clinical and Vaccine Immunology,
2010, vol. 75, no. 11, pp. 1753-1762
SELA-ABRAMOVICH Sagit et al.: Novel and
Unique Diagnostic Biomarkers for Bacillus anthracis
Infection. Applied and Environmental Microbiology,
2009, vol. 75, no. 19, pp. 6157-6167
017617
(43) 2012.12.28
(96) 2011000112 (RU) 2011.08.10
(71)(73) Заявитель и патентовладелец:
ОТКРЫТОЕ АКЦИОНЕРНОЕ
ОБЩЕСТВО "ИНСТИТУТ
БИОТЕХНОЛОГИЙ
ВЕТЕРИНАРНОЙ
МЕДИЦИНЫ" (RU)
017617
Изобретение относится к ветеринарии, в частности к ветеринарной микробиологии, и может быть
использовано при производстве сыворотки для диагностики сибирской язвы.
Известен способ получения сыворотки для диагностики сибирской язвы путем иммунизации продуцентов антигеном из бескапсульного штамма Bacillus anthracis 55-ВНИИВВиМ, для гипериммунизации используют лошадей. Антиген из бескапсульного штамма 55-ВНИИВВиМ вводили лошадям внутривенно в нарастающих дозах от 5,0 до 70 см3, с концентрацией 2,0-3,0 млрд м. клеток в см3 вегетативных культур штаммов В. anthracis. Интервал между инъекциями - 3-4 дня. Сыворотку от лошадей по
окончании периода гипериммунизации (через 8-10 суток после введения последней дозы антигена) получали по следующей методике: лошадей перед взятием крови, предварительно выдерживали 12 ч на голодной диете, не ограничивая водопой. Затем животных термометрировали и от имеющих нормальную
температуру брали кровь из расчета 8,0 см3 на 1 кг массы продуцента в первое крововзятие и 14,0-16,0 см3 в
последующие кровь собирали в градуированные стеклянные баллоны емкостью 15-20 л. Сыворотку получали цитратным методом, используя стерильный 10%-ный раствор лимоннокислого натрия с последующим сепарированием для отделения форменных элементов крови и дефибринацией плазмы. (Шморгун Б.И. Изготовление сибиреязвенного антигена из вакцинных бескапсульных штаммов. /Сб. науч. трудов. ВИЭВ, М., 1989, с. 17-18.).
Недостатками известного способа являются низкое качество, что снижает специфическую активность сыворотки.
Техническим результатом предполагаемого изобретения является повышение качества целевого
продукта за счет увеличения его специфичности.
Предложена группа изобретений, объединенная единым изобретательским замыслом с достижением единого технического результата.
Технический результат достигается в способе получения сыворотки для диагностики сибирской язвы путем гипериммунизации продуцентов антигеном из штамма Bacillus anthracis, гипериммунизацию
проводят в возрастающих дозах с последующим взятием крови у продуцента, отделением сыворотки и
выделением целевого продукта тем-, что для гипериммунизации используют волов и антиген из штамма
Bacillus anthracis M-71, причем гипериммунизацию проводят следующим образом: первое введение антигена подкожно в дозе 100-120 млн. микробных клеток совместно с 2,5-3 мкг сапонина, через 12-14 суток
антиген вводят внутрикожно в дозе 2,5-3,0 млрд. микробных клеток совместно с 2,5-3 мкг сапонина, через 6-7- суток с интервалом 3-4 дня антиген вводят 12-14 раз внутривенно в возрастающих дозах от 10,0
до 210 млрд. микробных клеток.
Технический результат достигается также в способе получения сыворотки для диагностики сибирской язвы тем, что сыворотка стерильная и имеет титр в РА не ниже 1:1000, а в РСК - не ниже 1:20.
Технический результат достигается также в способе получения сыворотки для диагностики сибирской язвы тем, что кровь животных-продуцентов выдерживают при температуре 37-38°С в течение 2-3
часов, а затем помещают в холодильник при 2-8°С на 3-5 суток, после чего сыворотку отделяют.
Технический результат достигается также в способе получения сыворотки для диагностики сибирской язвы тем, что полученную сыворотку консервируют 5-7%-ным раствором карболовой кислоты на
изотоническом растворе в соотношении (9-10):1.
Технический результат достигается также тем, что создан диагностический набор для диагностики
сибирской язвы содержит антиген из штамма Bacillus anthracis M-71, сыворотку для диагностики сибирской язвы и нативную сыворотку здорового крупного рогатого скота.
В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения, содержащие режимы для диагностики сибирской язвы аналогичное заявляемому, т.е. предложение соответствует критерию «новизна».
Все режимы способа осуществимы в лабораторных и промышленных условиях, направлены на решение реальной технической задачи, т.е. предложение «промышленно применимо».
Однако существующие иммунные сыворотки для диагностики сибирской язвы, получаемые в процессе иммунизации животных на атигены штаммов Bacillus anthracis, производят без учета характеристик компонентов клетки возбудителей, функционально относящихся к факторам патогенности: капсульных, поверхностных антигенов штамма Bacillus anthracis и антител к ним, без определения уровня их
специфической активности в процессе гипериммунизации животных, а также степени накопления и сохранения активности в процессе получения готового препарата. Известные технологические процессы
получения иммунных сывороток для диагностики сибирской язвы, также проводятся в неконтролируемых по факторам патогенности режимах.
Нами впервые установлено, что при проведении иммунизации животных-продуцентов антигеном из
штамма Bacillus anthracis M-71 при определенных режимах позволяет получить неочевидный положительный эффект - повышение качества целевого продукта за счет увеличения его специфичности и ускорения способа, т.е. предложение соответствует критерию «изобретательский уровень».
Способ иллюстрируется на следующих примерах.
Пример 1. Получают сыворотку для диагностики сибирской язвы следующим образом.
Животных-продуцентов (волы) гипериммунизируют антигеном из штамма Bacillus anthracis M-71,
-1-
017617
причем гипериммунизацию проводят следующим образом: первое введение антигена подкожно в дозе
100 млн микробных клеток совместно с 2,5 мкг сапонина, через 12 суток антиген вводят внутрикожно в
дозе 2,5 млрд микробных клеток совместно с 2,5 мкг сапонина, через 6 суток с интервалом 3 дня антиген
вводят 12 раз внутривенно в возрастающих дозах от 10,0 до 210 млрд микробных клеток, а именно: 1
введение - 10,0 млрд микробных клеток, 2 введение - 25 млрд микробных клеток, 3 введение - 40,0 млрд
микробных клеток, 4 введение - 50,0 млрд микробных клеток, 5 введение - 65,0 млрд микробных клеток,
6 введение - 80,0 млрд микробных клеток, 7 введение - 95,0 млрд микробных клеток, 8 введение - 110,0
млрд микробных клеток, 9 введение - 130,0 млрд микробных клеток, 10 введение - 140,0 млрд микробных клеток, 11 введение - 160,0 млрд микробных клеток, 12 введение - 200,0 млрд микробных клеток.
При достижении уровня антител в крови продуцентов в РА 1:1000, а в РСК 1:20, осуществляют производственное кровопускание. Кровь выдерживают при температуре 37°С в течение 2 ч, а затем помещают
в холодильник при 2°С на 3 суток, после чего отделяют сыворотку.
Полученную сыворотку консервируют 5%-ным раствором карболовой кислоты на изотоническом
растворе хлористого натрия в соотношении 9:1 и расфасовывают.
Пример 2. Получают сыворотку для диагностики сибирской язвы следующим образом.
Животных-продуцентов (волы) гипериммунизируют антигеном из штамма Bacillus anthracis M-71,
причем гипериммунизацию проводят следующим образом: первое введение антигена подкожно в дозе
120 млн микробных клеток совместно с 3,0 мкг сапонина, через 14 суток антиген вводят внутрикожно в
дозе 3,0 млрд микробных клеток совместно с 3,0 мкг сапонина, через 7 суток с интервалом 4 дня антиген
вводят 14 раз внутривенно в возрастающих дозах от 15,0 до 210 млрд микробных клеток, а именно: 1
введение - 15,0 млрд микробных клеток, 2 введение -30 млрд микробных клеток, 3 введение - 45,0 млрд
микробных клеток, 4 введение - 60,0 млрд микробных клеток, 5 введение - 75,0 млрд микробных клеток,
6 введение - 90,0 млрд микробных клеток, 7 введение - 105,0 млрд микробных клеток, 8 введение - 120,0
млрд микробных клеток, 9 введение - 140,0 млрд микробных клеток, 10 введение - 150,0 млрд микробных клеток, 11 введение - 170,0 млрд микробных клеток, 12 введение - 210,0 млрд микробных клеток, 13
введение - 210,0 млрд микробных клеток, 14 введение - 210,0 млрд микробных клеток. При достижении
уровня антител в крови продуцентов в РА 1:1000, а в РСК 1:20, осуществляют производственное кровопускание. Кровь выдерживают при температуре 38°С в течение 3 ч, а затем помещают в холодильник
при 8°С на 5 суток, после чего отделяют сыворотку.
Полученную сыворотку консервируют 7% раствором карболовой кислоты на изотоническом растворе хлористого натрия в соотношении 10:1 и расфасовывают.
Пример 3. Определение специфичности сывороток, полученных к отдельным антигенам В.
anthracis.
Штаммы В. anthracis и близкородственных микроорганизмов засевали в виде газонов на питательный агар. После 18-часовой инкубации при 37°С против газонов выросших культур в агаре пробивали
лунки (диаметром 6 мм), в которые вносили исследуемые сыворотки, чашки оставляли при комнатной
температуре. Через 18-24 ч между выросшими культурами и лунками с сывороткой образовывались зоны
преципитатов. После образования преципитатов культуры обеззараживали парами формалина.
Из данных таблицы видно, что заявляемая сыворотка образует зону преципитата только с антигенами В. Anthracis, как содержащими плазмиды вирулентности, так и с антигенами бесплазмидных сиби-2-
017617
реязвенных штаммов в отличие от сыворотки-прототипа, которая образует зоны преципитатов как с антигенами сибиреязвенных штаммов, так и с антигенами близкородственных микроорганизмов.
Таким образом, сыворотка к высокомолекулярному антигенному комплексу В. anthracis в отличие
от сывороток к другим внеклеточным антигенам В. anthracis и коммерческого сибиреязвенного глобулина является высокоспецифичной и может быть использована для идентификации штаммов В. Anthracis,
как содержащих плазмиды вирулентности, так и бесплазмидных штаммов.
Пример 4. Набор для диагностики сибирской язвы ("Преципантр").
В состав набора входят следующие компоненты: антиген из штамма Bacillus anthracis M-71; сыворотка для диагностики сибирской язвы; сыворотка негативная, представляющая собой нативную сыворотку здорового крупного рогатого скота.
Антиген из штамма Bacillus anthracis M-71 выявляет в указанных серологических реакциях специфические антитела в сыворотке крови больных сибирской язвой животных или иммунизированных противосибиреязвенными вакцинами.
Сыворотка для диагностики сибирской язвы содержит специфические сибиреязвенные антитела,
дающие положительные серологические реакции с сибиреязвенным антигеном.
Сыворотка негативная представляет собой нативную сыворотку здорового крупного рогатого скота
и не дает серологических реакций с сибиреязвенным антигеном.
Диагностическую сыворотку используют согласно "Инструкции по применению сыворотки сибиреязвенной преципитирующей из крови лошадей" (Утв. Федеральной службой по ветеринарному и фитосанитарному надзору МСХ России 21.07.2009 г.).
Набор для диагностики сибирской язвы ("Преципантр") применяют в реакции преципитации (по
Асколи) при исследовании кож и другого патологического материала на сибирскую язву. Перед использованием диагностическую сыворотку контролируют на активность и специфичность в реакции преципитации с антигеном из штамма Bacillus anthracis M-71 и сывороткой нативной. Сыворотка диагностическая должна давать положительную реакцию с антигеном из штамма Bacillus anthracis М-71 в течение
1 мин и не взаимодействовать с сывороткой нативной в течение 15 мин.
К обезвреженному в автоклаве при температуре 121°С и давлении 0,1 МПа испытуемому образцу
(кожа крупного рогатого скота) в измельченном состоянии добавляют экстрагирующую жидкость, содержащую 0,3% фенола в изотоническом растворе в соотношении 1:10 и проводят экстракцию в течение
16-20 ч. Отфильтрованный экстракт используют в реакции преципитации с диагностической сывороткой.
Соединение компонентов реакции достигается наслаиванием профильтрованного экстракта на диагностическую сыворотку в пробирках Уленгута. Реакцию преципитации считают положительной, если через
1-2 мин на границе между сывороткой и экстрактом появится чётко выраженное компактное сероватобелое кольцо преципитата. При отрицательном результате на границе между компонентами признаки
преципитации отсутствуют.
Применение в качестве антигена культуры одного штамма Bacillus anthracis M-71 по указанной
схеме позволяет повысить специфическую активность сыворотки для диагностики сибирской язвы, значительно упростить и удешевить технологию ее производства, исключить возможность заражения сибирской язвой людей и обсеменения окружающей среды спорами вирулентных штаммов антракса, в более короткие сроки (43-57 дней вместо 59-109 дней) получить сыворотку, значительно более эффективно
использовать продуценты (очередные крововзятия через 10-12 дней вместо 31-80).
Как показали результаты экспериментальных исследований согласно примерам 1-3, предлагаемый
способ позволяет повысить качество целевого продукта за счет увеличения специфичности.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения сыворотки для диагностики сибирской язвы путем гипериммунизации продуцентов антигеном из штамма Bacillus anthracis в возрастающих дозах с последующим взятием крови у
продуцента, отделением сыворотки и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что для гипериммунизации используют волов и антиген из штамма Bacillus anthracis M-71, причем гипериммунизацию проводят следующим образом: первоначально антиген вводят подкожно в дозе 100-120 млн микробных клеток совместно с 2,5-3 мкг сапонина, через 12-14 суток антиген вводят внутрикожно в дозе 2,53,0 млрд микробных клеток совместно с 2,5-3 мкг сапонина и через 6-7 суток с интервалом 3-4 дня антиген вводят 12-14 раз внутривенно в возрастающих дозах от 10,0 до 210 млрд микробных клеток.
2. Способ получения сыворотки для диагностики сибирской язвы по п.1, отличающийся тем, что
сыворотка стерильная и имеет титр в РА не ниже 1:1000, а в РСК - не ниже 1:20.
3. Способ получения сыворотки для диагностики сибирской язвы по п.1, отличающийся тем, что
кровь животных-продуцентов выдерживают при температуре 37-38°С в течение 2-3 ч, а затем помещают
в холодильник при 2-8°С на 3-5 суток, после чего сыворотку отделяют.
4. Способ получения сыворотки для диагностики сибирской язвы по пп.1-3, отличающийся тем, что
полученную сыворотку консервируют 5-7%-ным раствором карболовой кислоты на изотоническом растворе в соотношении (9-10):1 соответственно.
-3-
017617
5. Набор для диагностики сибирской язвы, отличающийся тем, что содержит антиген из штамма
Bacillus anthracis M-71, сыворотку для диагностики сибирской язвы по пп.1-4 и нативную сыворотку здорового крупного рогатого скота.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
-4-