Набор для выявления вируса болезни Гамборо

Содержание
Компоненты набора................................................... 3
Область применения ................................................. 3
Гарантия ..................................................................... 3
Описание .................................................................... 4
Набор для
выявления вируса
болезни Гамборо
(Вир-3-50, на 50 реакций)
Меры предосторожности ......................................... 4
Необходимое оборудование .................................... 4
Важные замечания .................................................... 5
Выделение РНК ........................................................ 5
Необходимые контрольные образцы ...................... 6
Этап I. Постановка обратной транскрипции .......... 7
Этап II. Постановка ПЦР .......................................... 7
Этап III. Анализ результатов .................................... 9
Проблемы и рекомендации..................................... 10
Контроль качества ................................................... 11
Хранение и стабильность ....................................... 11
Служба технической поддержки ........................... 11
Информация для заказов......................................... 12
2
Компоненты набора
Компоненты
количество
Этап обратной транскрипции
550 мкл
2X Микс Транскрипция
27 мкл
М-MLVобратная транскриптаза
Этап ПЦР
700 мкл
2X Микс ПЦР
27 мкл
H-Taq полимераза
270 мкл
Контрольный образец
2 мл
Вода
Область применения
Набор предназначен для выявления геномной РНК вируса
болезни Гамборо, выделенной из биологических образцов
и смывов, с помощью ПЦР в реальном времени.
Чувствительность набора до 103/мл геном эквивалентов в
исходной пробе. Набор рассчитан на проведение 50
реакций, включая контроли. Набор детектирует вирус при
выделении РНК из фрагментов фабрициевой сумки,
фрагментов мышечной ткани, пятен крови, вакцины.
замену продукта или вернем покупателю его полную
стоимость. Мы сохраняем за собой право изменять или
модифицировать любой продукт в целях улучшения его
качеств и дизайна. Если у Вас возникли вопросы по
применению продукта или оценке результата, вы можете
обращаться в Службу технической поддержки (см. на
обороте).
Описание
Процедура анализа состоит из трёх этапов: 1) постановка
обратной транскрипции, 2) проведение ПЦР с
флуоресцентной детекцией в реальном времени, 3) анализ
результатов. Для детекции используется канал ROX (макс.
поглощения 580 нм, макс. флуоресценции 610 нм).
Меры предосторожности
При приготовлении смесей используйте индивидуальные
средства защиты. Компоненты набора не обладают
токсическими и другими свойствами, за счёт которых
возможно негативное воздействие на человека.
Необходимое оборудование
Гарантия
Фрактал Био гарантирует изготовление всех продуктов
согласно описанию в руководстве. Покупатель должен
определить соответствие продукта для конкретного его
использования. Если продукт не дает заявленного
результата по любой причине, за исключением
неправильного использования, мы бесплатно произведем
3
•
•
•
•
•
•
Термостат
Амплификатор для ПЦР в реальном времени
Микроцентрифуга
Ламинарный и ПЦР-бокс
Набор дозаторов
Одноразовые наконечники с фильтрами для дозаторов
4
•
•
•
Одноразовые
полипропиленовые
микропробирки
объёмом 0,2 (0,5) мл
Штативы для наконечников и микропробирок
Халат и одноразовые перчатки
Важные замечания
•
•
•
•
•
•
При работе с РНК необходимо использовать только
одноразовые пластиковые расходные материалы,
имеющие специальную маркировку “RNase-free”,
“DNase-free”.
Для приготовления смесей и добавления нуклеиновых
кислот используйте только наконечники с фильтрами.
Работать только в одноразовых перчатках.
Всё лабораторное оборудование, в том числе дозаторы,
лабораторная посуда, а также все рабочие растворы,
должны быть строго стационарным.
Выделение РНК, приготовление смеси для обратной
транскрипции необходимо проводить в ламинарном
боксе.
Приготовление реакционных смесей для ПЦР
необходимо проводить в ПЦР-боксе.
При выделении из суспензии клеток используйте не
более
100
мкл
суспензии.
Перед
выделением
рекомендуется 3-4 раза заморозить-разморозить образец.
После чего осадить клеточные стенки центрифугированием
при 12000 об./мин в течение 5 мин. Для выделения РНК
использовать супернатант.
Обязательно проводите отрицательный контроль (К) – выделение РНК из воды. Этот же образец используйте
при постановках обратной транскрипции и ПЦР.
При использовании набора “ФБиоНуклео” (Фрактал
Био) для выделения РНК, рекомендуется элюировать РНК
в 15 мкл буфера ЕБ или воды. Таким образом, для
постановки обратной транскрипции следует использовать
весь полученный элюат (10 мкл).
Необходимые контрольные образцы
Этап выделения РНК
•
Отрицательный контрольный образец (выделение
РНК из воды)
Этап постановки обратной транскрипции:
•
Выделение РНК
Отрицательный контрольный образец (вода или
продукт выделение РНК из воды)
Этап постановки ПЦР:
При выделении РНК не рекомендуется использовать
наборы на основе силики или диатомовой земли. Наиболее
подходящие варианты - наборы с микроцентрифужными
колонками
или
на
основе
фенол-хлороформной
экстракции.
5
•
•
Отрицательный контрольный образец (вода или
продукт обратной транскрипции с воды)
Положительный контрольный образец (входит в
состав набора)
6
Компонент
Этап I. Постановка обратной транскрипции.
1.
Смешайте компоненты, входящие в набор, в
указанных ниже пропорциях:
Компонент
Количество
2X Микс Транскрипция
10 мкл
РНК матрица
10 мкл
Перемешайте,
осадите
капли
кратковременным
центрифугированием
2.
Инкубируйте смесь 5 мин. при +70°С, перенесите
пробирку в лед и соберите капли кратковременным
центрифугированием.
3.
Добавьте 0,5 мкл обратной транскриптазы M-MLV.
4.
Инкубируйте смесь в течение 30 мин. при +37°С.
5.
Остановите реакцию прогреванием смеси в течение
10 минут при +70°С. Перенесите смесь в лёд и
инкубируйте 5 минут.
6.
Добавьте 80 мкл ТЕ буфера или воды. Таким
образом, итоговый объём смеси будет 100 мкл.
Полученная кДНК может быть непосредственно сразу же
использована для ПЦР. Храните синтезированную кДНК
при -20 °С.
Этап II. Постановка ПЦР.
1.
Смешайте компоненты, входящие в набор, в
указанных ниже пропорциях:
7
2Х Микс
H-Taq
полимераза
Вода
На 1
реакцию
(мкл)
12,5
0,5
На 5
реакций
(мкл)
62
2,5
7
35
На N реакций
12,5х(N+1) мкл
0,5х(N+1) мкл
7х(N+1) мкл
Важно! ПЦР смесь на несколько реакций (более пяти)
готовится на одну реакцию больше, чем нужно, чтобы
избежать недостатка смеси из-за погрешности пипеток и
потерь на наконечниках.
H-Taq полимеразу следует убрать на -20 °С сразу после
использования.
2.
Перемешайте подготовленную смесь на вортексе и
осадите капли кратковременным центрифугированием (2-3
сек).
3.
После приготовления смеси перенесите по 20 мкл в
каждую пробирку для ПЦР.
4.
Внесите в первую пробирку с ПЦР смесью 5 мкл
отрицательного контрольного образца (К-).
5.
Внесите по 5 мкл каждого образца кДНК в пробирки
с ПЦР смесью, кроме одной. Закройте крышки пробирок. В
последнюю пробирку добавьте 5 мкл контрольного образца
(КО).
ВАЖНО: Пробирку с контрольным образцом, входящую в
набор, открывайте только после раскапывания и закрытия
крышек пробирок всех исследуемых проб.
6.
Поместите пробирки в амплификатор и запустите
программу амплификации:
8
95°С - 3 минуты
50 циклов 60°С - 30 секунд
95°С - 20 секунд
Для приборов компании “BioRad”
установить на этапе 60 °С – 30 секунд.
Проблемы и рекомендации
съёмку
следует
Сt для контрольного Убедитесь, что не вышел срок
образца не определено годности.
Обратитесь
к
(Сt >50).
производителю
Сt для проб меньше 17
Этап III. Анализ результатов.
По
каналу
ROX
регистрируется
сигнал,
свидетельствующий о накоплении продукта амплификации
кДНК проб.
Определите пороговые циклы (Ct) для каждой из проб. При
этом:
1) Сt для отрицательного контроля (К-) по каналу ROX
должно быть >50.
2) Сt для контрольного образца (КО) по каналу ROX
должно быть < 40
Геномная РНК вируса болезни Гамборо обнаружена,
если для данной пробы в таблице результатов по каналу
ROX определено значение порогового цикла Сt пробы < 40
Геномная РНК вируса болезни Гамборо не обнаружена,
если для данной пробы в таблице результатов по каналу
ROX не определено значение порогового цикла (Сt >50).
Внимание: Сt в районе 36-40 циклов является
пограничным по чувствительности. В этом случае
рекомендуется повторить анализ с этапа выделения РНК,
взяв в несколько раз больше материала.
Разведите кДНК в 10-1000 раз
и повторите анализ.
Сt для отрицательного Возможно,
установлены
контроля <40
некорректные параметры для
расчёта.
Контаминация.
Проведите мероприятия по
очистке
оборудования
и
помещения от контаминантов.
Смените
реактивы.
Не
открывайте
пробирку
с
контрольным образцом до
приготовления отрицательного
контроля и анализируемых
проб.
Контроль качества
Тестирование набора проводилось на вакцине, содержащей
инактивированный вирус болезни Гамборо, в соответствии
с протоколом, описанным выше. Выделение РНК
проводилось с помощью набора “ФБиоНуклео” (Фрактал
Био).
Если хотя бы один из пунктов не выполняется,
воспользуйтесь разделом “Проблемы и рекомендации”.
9
10
Хранение и стабильность
Набор может храниться до 6 месяцев без изменения
качественных характеристик при температуре -20°С.
Служба технической поддержки
В случае появления вопросов обращайтесь в службу
технической поддержки: technic@fractalbio.com.
Информация для заказов
Наименование
Кат.номер
Набор для выявления вируса болезни
Гамборо (на 50 реакций)
Набор для выявления вируса болезни
Гамборо (на 100 реакций)
Набор «ФБиоНуклео» для выделения
нуклеиновых
кислот
из
биологического материала (на 4
выделения)
Набор «ФБиоНуклео» для выделения
нуклеиновых
кислот
из
биологического материала (на 50
выделений)
11
12
Вир-3-50
Вир-3-100
НК-1-4
НК-1-50
Для заметок
Произведено: ООО “Фрактал Био”, 190020, г. СанктПетербург, ул. Бумажная, д. 17
сайт: fractalbio.com
E-mail: info@fractalbio.com
Контактный телефон/факс: (812) 495-96-95
Дата изготовления: май 2011
13
14