Набор для выявления вируса инфекционного бронхита

Содержание
Компоненты набора................................................... 3
Область применения ................................................. 3
Гарантия ..................................................................... 3
Набор для
выявления вируса
инфекционного
бронхита
Описание .................................................................... 4
(Вир-11-50, на 50 реакций)
Этап III. Анализ результатов .................................... 9
Меры предосторожности ......................................... 4
Необходимое оборудование .................................... 4
Важные замечания .................................................... 5
Выделение РНК ........................................................ 5
Необходимые контрольные образцы ...................... 6
Этап I. Постановка обратной транскрипции .......... 7
Этап II. Постановка ПЦР .......................................... 8
Проблемы и рекомендации..................................... 10
Контроль качества ................................................... 10
Хранение и стабильность ....................................... 11
Служба технической поддержки ........................... 11
Информация для заказов......................................... 11
1
2
Компоненты набора
Компоненты
количество
Этап обратной транскрипции
550 мкл
2X Микс Транскрипция
27 мкл
М-MLVобратная транскриптаза
Этап ПЦР
700 мкл
2X Микс ПЦР
27 мкл
H-Taq полимераза
270 мкл
Контрольный образец
2 мл
Вода
модифицировать любой продукт в целях улучшения его
качеств и дизайна. Если у Вас возникли вопросы по
применению продукта или оценке результата, вы можете
обращаться в Службу технической поддержки (см. на
обороте).
Описание
Процедура анализа состоит из трёх этапов: 1) постановка
обратной транскрипции, 2) проведение ПЦР с
флуоресцентной детекцией в реальном времени, 3) анализ
результатов. Для детекции используется канал R6G (макс.
поглощения 520 нм, макс. флуоресценции 550 нм).
Область применения
Набор предназначен для выявления геномной РНК вируса
инфекционного бронхита, выделенной из биологических
образцов и смывов, с помощью ПЦР в реальном времени.
Чувствительность набора до 103/мл геном эквивалентов в
исходной пробе. Набор рассчитан на проведение 50
реакций, включая контроли.
Меры предосторожности
При приготовлении смесей используйте индивидуальные
средства защиты. Компоненты набора не обладают
токсическими и другими свойствами, за счёт которых
возможно негативное воздействие на человека.
Необходимое оборудование
Гарантия
Фрактал Био гарантирует изготовление всех продуктов
согласно описанию в руководстве. Покупатель должен
определить соответствие продукта для конкретного его
использования. Если продукт не дает заявленного
результата по любой причине, за исключением
неправильного использования, мы бесплатно произведем
замену продукта или вернем покупателю его полную
стоимость. Мы сохраняем за собой право изменять или
3
•
•
•
•
•
•
•
•
Термостат
Амплификатор для ПЦР в реальном времени
Микроцентрифуга
Ламинарный и ПЦР-бокс
Набор дозаторов
Одноразовые наконечники с фильтрами для дозаторов
Одноразовые
полипропиленовые
микропробирки
объёмом 0,2 (0,5) мл
Штативы для наконечников и микропробирок
4
•
Халат и одноразовые перчатки
Важные замечания
•
•
•
•
•
•
При работе с РНК необходимо использовать только
одноразовые пластиковые расходные материалы,
имеющие специальную маркировку “RNase-free”,
“DNase-free”.
Для приготовления смесей и добавления нуклеиновых
кислот используйте только наконечники с фильтрами.
Работать только в одноразовых перчатках.
Всё лабораторное оборудование, в том числе дозаторы,
лабораторная посуда, а также все рабочие растворы,
должны быть строго стационарным.
Выделение РНК, приготовление смеси для обратной
транскрипции необходимо проводить в ламинарном
боксе.
Приготовление реакционных смесей для ПЦР
необходимо проводить в ПЦР-боксе.
при 12000 об./мин в течение 5 мин. Для выделения РНК
использовать супернатант.
Обязательно проводите отрицательный контроль (К) – выделение РНК из воды. Этот же образец используйте
при постановках обратной транскрипции и ПЦР.
При использовании набора “ФБиоНуклео” (Фрактал
Био) для выделения РНК, рекомендуется элюировать РНК
в 15 мкл буфера ЕБ или воды. Таким образом, для
постановки обратной транскрипции следует использовать
весь полученный элюат (10 мкл).
Необходимые контрольные образцы
Этап выделения РНК
•
Отрицательный контрольный образец (выделение
РНК из воды)
Этап постановки обратной транскрипции:
•
Выделение РНК
Отрицательный контрольный образец (вода или
продукт выделение РНК из воды)
При выделении РНК не рекомендуется использовать
наборы на основе силики или диатомовой земли. Наиболее
подходящие варианты - наборы с микроцентрифужными
колонками
или
на
основе
фенол-хлороформной
экстракции.
При выделении из суспензии клеток используйте не
более
100
мкл
суспензии.
Перед
выделением
рекомендуется 3-4 раза заморозить-разморозить образец.
После чего осадить клеточные стенки центрифугированием
Положительный контрольный образец всегда добавляйте
последним, после закрытия пробирок с пробами.
5
6
Этап постановки ПЦР:
•
•
Отрицательный контрольный образец (вода или
продукт обратной транскрипции с воды)
Положительный контрольный образец (входит в
состав набора)
Компонент
Этап I. Постановка обратной транскрипции.
1.
Смешайте компоненты, входящие в набор, в
указанных ниже пропорциях:
Компонент
Количество
2X Микс Транскрипция
10 мкл
РНК матрица
10 мкл
Перемешайте,
осадите
капли
кратковременным
центрифугированием
2.
Инкубируйте смесь 5 мин. при +70 °С, перенесите
пробирку в лед и соберите капли кратковременным
центрифугированием.
3.
Добавьте 0,5 мкл обратной транскриптазы M-MLV.
4.
Инкубируйте смесь в течение 30 мин. при +37°С.
5.
Остановите реакцию прогреванием смеси в течение
10 минут при +70°С. Перенесите смесь в лёд и
инкубируйте 5 минут.
6.
Добавьте 80 мкл ТЕ буфера или воды. Таким
образом, итоговый объём смеси будет 100 мкл.
Полученная кДНК может быть непосредственно сразу же
использована для ПЦР. Храните синтезированную кДНК
при -20 °С.
Этап II. Постановка ПЦР.
1.
Смешайте компоненты, входящие в набор, в
указанных ниже пропорциях:
7
2Х Микс
H-Taq
полимераза
Вода
На 1
реакцию
(мкл)
12,5
0,5
На 5
реакций
(мкл)
62
2,5
7
35
На N реакций
12,5х(N+1) мкл
0,5х(N+1) мкл
7х(N+1) мкл
Важно! ПЦР смесь на несколько реакций (более пяти)
готовится на одну реакцию больше, чем нужно, чтобы
избежать недостатка смеси из-за погрешности пипеток и
потерь на наконечниках.
H-Taq полимеразу следует убрать на -20 °С сразу после
использования.
2.
Перемешайте подготовленную смесь на вортексе и
осадите капли кратковременным центрифугированием (2-3
сек).
3.
После приготовления смеси перенесите по 20 мкл в
каждую пробирку для ПЦР.
4.
Внесите в первую пробирку с ПЦР смесью 5 мкл
отрицательного контрольного образца (К-).
5.
Внесите по 5 мкл каждого образца кДНК в пробирки
с ПЦР смесью, кроме одной. Закройте крышки пробирок. В
последнюю пробирку добавьте 5 мкл контрольного образца
(КО).
ВАЖНО: Пробирку с контрольным образцом, входящую в
набор, открывайте только после раскапывания и закрытия
крышек пробирок всех исследуемых проб.
6.
Поместите пробирки в амплификатор и запустите
программу амплификации:
8
95°С - 3 минуты
50 циклов 60°С - 30 секунд
95°С - 20 секунд
Если хотя бы один из пунктов не выполняется,
воспользуйтесь разделом “Проблемы и рекомендации”.
Проблемы и рекомендации
Для приборов компании “BioRad”
установить на этапе 60 °С – 30 секунд.
съёмку
следует
Этап III. Анализ результатов.
По
каналу
R6G
регистрируется
сигнал,
свидетельствующий о накоплении продукта амплификации
кДНК проб.
Определите пороговые циклы (Ct) для каждой из проб. При
этом:
1) Сt для отрицательного контроля (К-) по каналу R6G
должно быть >50.
2) Сt для контрольного образца (КО) по каналу R6G
должно быть < 40
Геномная РНК вируса инфекционного бронхита
обнаружена, если для данной пробы в таблице
результатов по каналу R6G определено значение
порогового цикла Сt пробы < 40
Геномная РНК вируса инфекционного бронхита не
обнаружена, если для данной пробы в таблице
результатов по каналу R6G не определено значение
порогового цикла (Сt >50).
Сt для контрольного Убедитесь, что не вышел срок
образца не определено годности.
Обратитесь
к
(Сt >50).
производителю
Сt для проб меньше 17
Разведите кДНК в 10-1000 раз
и повторите анализ.
Сt для отрицательного Возможно,
установлены
контроля <40
некорректные параметры для
расчёта.
Контаминация.
Проведите мероприятия по
очистке
оборудования
и
помещения от контаминантов.
Смените
реактивы.
Не
открывайте
пробирку
с
контрольным образцом до
приготовления отрицательного
контроля и анализируемых
проб.
Контроль качества
Внимание: Сt в районе 36-40 циклов является
пограничным по чувствительности. В этом случае
рекомендуется повторить анализ с этапа выделения РНК,
взяв в несколько раз больше материала.
Тестирование набора проводилось на клеточной культуре,
содержащей инактивированный вирус инфекционного
бронхита, в соответствии с протоколом, описанным выше.
Выделение РНК проводилось с помощью набора
“ФБиоНуклео” (Фрактал Био).
9
10
Хранение и стабильность
Набор может храниться до 6 месяцев без изменения
качественных характеристик при температуре -20°С.
Для заметок
Служба технической поддержки
В случае появления вопросов обращайтесь в службу
технической поддержки: technic@fractalbio.com
Информация для заказов
Наименование
Кат.номер
Набор
для
выявления
вируса
инфекционного бронхита (на 50
реакций)
Набор
для
выявления
вируса
инфекционного бронхита (на 100
реакций)
Набор «ФБиоНуклео» для выделения
нуклеиновых
кислот
из
биологического материала (на 4
выделения)
Набор «ФБиоНуклео» для выделения
нуклеиновых
кислот
из
биологического материала (на 50
выделений)
11
Вир-11-50
Вир-11-100
НК-1-4
НК-1-50
12
Для заметок
Произведено: ООО “Фрактал Био”, 190020, г. СанктПетербург, ул. Бумажная, д. 17
сайт: fractalbio.com
E-mail: info@fractalbio.com
Контактный телефон/факс: (812) 495-96-95
Дата изготовления: май 2011
13
14