Pyloriset Dry - Пилорисет Драй

Pribori Oy
Пилорисет Драй Руководство
Символы, использованные на этикетках
для использования в лабораторных условиях
номер в каталоге
код партии
температура хранения
использовать до
см. инструкцию по применению
содержание
содержит азид натрия
реагент
растворяющая буферная смесь
Положительный контрольный образец
Отрицательный контрольный образец
источник: кролик
источник: теленок
Схема 1
Pyloriset® Dry
Схема 2
Cat. No. 68194 Stock No. 67459 (USA)
1 ПРЕДНАЗНАЧЕНИЕ
Pyloriset Dry – это быстры тест на реакцию латекс-агглютинации для количественного
определения общего количества антител Helicobacter pylori в сыворотке крови для
помощи в диагностике инфицирования H. pylori. Продукт предназначен для
использования в тестировании пациентов с симптомами желудочно-кишечных
расстройств. Для использования в лабораторных условиях.
2 КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ И ОБЪЯСНЕНИЯ
В 1983 году Marshall и Warren культивировали новый патоген у пациентов с гастритом.1
Это открытие повлекло за собой исследование взаимосвязи между Helicobacter pylori и
желудочных заболеваний. Исследования показали, что H. Pylori (ранее известные как
Campylobacter pylori) могжет вызывать хронический гастрит2 , и находится все больше и
больше подтверждений тому, что существует связь между инфекцией H. Pylori и
пептической язвой 3,4,5. В последнее время, H. Pylori был признан фактором риска для рака
желудка 6,7. примерно 100% пациентов с язвой двенадцатиперстной кишки8,9 , 70%
больных с язвой желудка 2,10,11 и более 80% пациентов с раком желудка6,12 имеют
инфекцию H. Pylori. Когда инфекция, вызываемая H. Pylori диагностирована, пациента
модно лечить противомикробными лекарствами. Успешное уничтожение H. Pylori
приводит к исчезновению желудочного воспаления 13. среди пациентов с язвой
двенадцатиперстной кишки, за уничтожением H. Pylori последовало заживление язвы и
уменьшение количества язвенных обострений 14,15. Теперь доступно несколько методов,
как инвазивных, так и неинвазивных для диагностики инфекции H. Pylori. Инвазивные
методы включают культивирование, гистологическое исследование и тестирование
уреазы пунктатов. Они требуют сбор множественных пунктатов, взятых в ходе
эндоскопии верхних отделов желудочно-кишечного тракта. Несмотря на их широкое
применение, инвазивные методы долгие и утомительные, к тому же требуются проводить
процедуру, которая может вызвать дискомфорт пациента. К тому же, H. Pylori – нежный
организм, и таким образом, легко разрушается при транспортировке.
Доступные неинвазивные средства включают тест на вдыхание мочевины, который связан
с приемом внутрь изотопа угля, производного мочевины 16,17,18 и серологическим
определением сывороточных антител к H. Pylori 19, 20, 21. H. Pylori дает особую
серологическую реакцию в теле инфицированного человека, и определение антител к H.
Pylori в сыворотке крови пациента является достоверным показателем инфекции H.
Pylori.22 Серология также доказано является полезным средством для мониторинга
эффективности противомикробного лечения.22
3 ПРИНЦИП ПРОЦЕДУРЫ.
Pyloriset Dry латексный реагент, содержащий фракции латекса сенсибилизированные с
частично очищенными антигенами H. Pylori, высушен на тестовой карточке в виде сухих
пятен. Антитела H. Pylori присутствующие в сывороточной пробе будут реагировать с
сенсибилизированными фракциями латекса, приводя к визуально заметному склеиванию.
Сыворотка, содержащая антитела реагирующие на H. Pylori и сыворотка, не содержащая
антител к H. Pylori, включены в набор как положительный и отрицательный контрольный
образец соответственно.
4 Реагенты Pyloriset Dry
4.1 Содержимое набора
Тестовые карточки Pyloriset Dry
Положительный контрольный образец
Отрицательный контрольный образец
Растворяющая буферная смесь
Палочки для смешивания
Пластиковый карман для хранения
24 теста
4 упаковки по 2 шт
1 ампула
1 ампула
1 бутылочка
30шт
1. Тестовые карточки
Четыре упаковки карточек, 2 тестовые карточки в каждой с тремя кружками для
химической реакции. Сенсибилизированные фракции латекса с частично очищенными
антигенами H. Pylori высушены на реактивных кружках.
2. Положительный контрольный образец
Одна ампула (0.5 мл) разведенной кроличьей сыворотки с антителами, реактивными к H.
Pylori.. Данный реагент поставляется готовым к использованию. Дайте реагенту нагреться
до 18…25°C перед проведением тестирования.
3. Отрицательный контрольный образец
Одна ампула (0.5 мл) разведенной сыворотки новорожденного теленка, нереактивный к H.
Pylori. Данный реагент поставляется готовым к использованию. Дайте реагенту нагреться
до 18…25°C перед проведением тестирования.
4. Растворяющая буферная смесь
Одна бутылочка (30 мл) фосфатно-буферного солевого раствора, pH 7.2 ±0.1. Буфер
поставляется готовым к использованию. Дайте нагреться до 18…25°C перед проведением
тестирования
5. Палочки для смешивания
Тридцать (30) двусторонних палочек для смешивания латекса и разведенной сыворотки.
6. Пластиковый карман для хранения
Один пластиковый карман для хранения открытой упаковки с не использованными
тестовыми карточками. Реагенты содержат азид натрия, см «Меры предосторожности»
4.2
Необходимые материалы, не входящие в набор
• Микропипетка
Необходимы микропипетки, способные работать с объемами 40 µl, 50 µl и 150 µl (см.
Процедура, метод разведения А) или 10 µl и 30 µl (см. Процедура, метод разведения В)
• Пробирки
Пластиковые или стеклянные пробирки для разведения образцов сыворотки пациента
перед тестированием, если Вы пользуетесь методом разведения А.
5 Меры предосторожности
Информация по здоровью и безопасности
1. Тест Pyloriset Dry разработан в целях диагностики в лабораторных условиях и должен
использоваться квалифицированными специалистами.
2. Препараты могут содержать инфекционные агенты. Со всеми препараты необходимо
обращаться и утилизировать как потенциально биологически опасное вещество.
3. Не одноразовые приборы должны быть соответствующим образом стерилизованы после
использования, хотя предпочтительным методом является автоклавирование в течение 15
минут при температуре 121°C; одноразовые предметы должны быть автоклавированы и
сожжены. Если Вы пролили потенциально инфекционный материал, немедленно удалите
жидкость адсорбирующим бумажным полотенцем и протрите зараженную зону
стандартным бактериальным дезинфицирующим средством или 70% спиртом. Предметы,
использованные при уборке пролитого вещества должны быть утилизированы как
биологически опасные отходы.
4. Не пипетируйте при помощи рта. Наденьте одноразовые перчатки, когда Вы работаете с
образцами и проводите тест. Тщательно помойте руки после завершения тестирования.
5. Жидкие реагенты содержат < 0.1% азид натрия в качестве консерванта. Азит натрия
высвобождает токсичный газ при соприкосновении с кислотами. Азиды могут вступать в
реакцию с металлическими трубами, формируя взрывоопасные соединения. Накопления
азидов можно избежать, сливая ненужные реагенты вместе с большим количеством воды.
6. Хотя реагенты не содержат инфекционных агентов H. pylori, они приготовляются из
биологических материалов и с ними нужно обращаться и утилизировать как потенциально
биологически опасные вещества.
7. Утилизация всех препаратов и тестовых материалов должно производиться в
соответствии с государственным и местным законодательством.
8. При использовании в соответствии с принципами надлежащей лабораторной практики,
высокими стандартами рабочей гигиены и инструкциями данного руководства,
поставляемые реагенты не должны представлять угрозу здоровью.
Аналитические меры предосторожности.
1. Не используйте реагенты после окончания срока годности. Необходимо избегать
микробиологического загрязнения реагентов, так как это может привести к
уменьшению срока годности продукта и вызвать ошибочные результаты.
2. Перед использованием позвольте реагентам нагреться до комнатной температуры.
Сразу после использования верните в охлажденное состояние 2…8°C для хранения.
3. Не смешивать реагенты из разных партий Pyloriset Dry.
4. Не касайтесь реактивных мест на карточках
5. Не замораживайте набор
6. Липкий сухой кружок на тестовой карточке – это показатель того, что реагент был
подвержен влиянию влажности и излишней температуры. Его нельзя использовать.
6 Хранение и срок годности
До вскрытия все компоненты должны храниться при температуре 2…8°C, при которой
они сохранят свою способность вступления в реакцию до момента указанного на этикетке.
Открытые пакеты с тестовыми карточками должны храниться в предоставляемом
пластиковом пакете для хранения, плотно закрывайте пакет (не вынимайте упаковку с
силикагелем из упаковки карточек!) Упаковка карточек может использоваться в течение 5
недель после вскрытия, при условии верного хранения.
7 Хранения и обращение с препаратами
Необходимо взять обычный образец венозной крови и выделить сыворотку. Если
сыворотку не анализируют тут же, ее модно хранить при температуре 2…8°C в течение 7
дней или при температуре –20°C и ниже в течение нескольких месяцев. (не храните в
саморазмораживающихся холодильниках)
8 Процедура
Достаньте реагенты из холодильника и дайте им нагреться до комнатной температуры
(18…25°C) перед использованием. Для получения верных результатов теста, разведите
образцы пациента растворяющей буферной жидкостью перед проведением теста
(положительный и отрицательный образцы используются без предварительного
разбавления). Процесс разведения можно проводить как отдельно в стеклянной или
пластиковой пробирке (Метод разведения А) или прямо на тестовой карточке (метод
разведения В). Оба метода разведения дают одинаковые результаты.
Метод разведения А
(разведение в пробирке - см. схему 1 на стр. 4)
1. Разведите образец сыворотки 1:4 с растворяющей буферной жидкостью в пробирке
(например, 50 µl образца + 150 µl буфера)
2. Накапайте 40 µl разведенной сыворотки на кружок тестовой карточки рядом с
латексным реагентом. Действуйте как описано в «Использовании тестовых
карточек»
Метод разведения В
(разведение на тестовой карточке – см. рисунок 2 на стр. 4)
1. Используя микропипетку, накапайте 30 µ растворяющей буферной жидкости рядом
с латексным реагентом на кружочек на тестовой карточке для каждого образца,
который необходимо протестировать.
2. Накапайте 10 µl сыворотки пациента, которую нужно протестировать на каплю
растворяющей буферной жидкости. Тщательно перемешайте засасывая раствор в
пипетку и выпрыскивая его обратно минимум 5 раз. Далее действуйте как описано
в «Использовании сухих латексных тестовых карточек»
Использование сухих тестовых карточек
(см. схемы на стр. 4)
При тестировании отрицательного или положительного контрольного образца набора,
капните одну каплю из соответствующего пузырька с капельницей на чистый кружочек
тестовой карточки. Примечание: контрольные реагенты уже разведены и используются в
поставляемом виде.
3. Используйте чистый конец палочки для смешения для каждого кружочка,
тщательно перемешайте образцы или контрольные образцы и латексным реагентом
на карточке. Полностью покройте образцом кружок. Выбросите каждую палочку
после использования.
4. Наклоняйте и поворачивайте тестовую карточку, перемещая реагенты
кругообразно внутри кружка. Вы увидите частицы латекса как свидетельство
протекающего образования скоплений через 3 минуты.
9 Снятие и интерпретация результатов
Результат теста реактивный, то есть сыворотка содержит определимое количество H.
pylori, когда образование скоплений обнаруживается через 3 минуты. Агглютинация
может быть полной (красные гранулы на белом фоне) или частичной (гранулы различимы,
но фон остается темной).
Результат теста нереактивный, и образец не содержит определимого числа антител к H.
Pylori, когда агглютинация не различима в кружке через 3 минуты. Если контрольные
образцы не ведут себя, как это ожидалось, результаты исследования недействительны.
10 Контроль качества
Для проверки действия реагентов набора используйте предоставляемые отрицательный и
положительный Контрольные образцы вместо образца пациента. Контроль должен
производиться каждый день, когда используется тест Pyloriset Dry. Следуйте процедуре,
описанной в разделе «Процедура». Для проверки работы растворяющей буферной
жидкости следуйте инструкциям раздела «Процедура» заменяя разведенный образец 40 µl
растворяющей буферной жидкости. Невозможность Положительного контрольного
образца дать агглютинацию в течение 3 минут или какое-нибудь свидетельство
неспециальной агглютинации с Отрицательным контрольным образцом или
растворяющей буферной жидкости считается свидетельством порчи реагента. Такие
реагенты не должны использоваться для тестирования образцов пациента. Контрольные
образцы не должны использоваться, если они загрязнены.
11 Ограничения процедуры
1. результаты теста должны быть взвешены с клинической симптоматикой пациента
для определения значимости
2. Отрицательный результат указывает, что у пациента нет определимого количества
антител к H. pylori. Это может встречаться при тестировании пациента на слишком
ранней стадии развития болезни, до того, как иммунная реакция повысилась.
3. Положительный результат теста не делает различия между активной и пассивной
болезнью или колонизации в пациенте.
4. Положительный результат теста не обязательно свидетельствует о желудочнокишечном расстройстве.
5. Тест Pyloriset Dry должен проводиться для пациентов с симптомами желудочнокишечного расстройства и не предназначается для использования с пациентами, не
обнаруживающими симптомов заболевания.
12 Ожидаемые значения
Существует немного исследований, затрагивающих инфекцию H. pylori в бессимптомных
популяциях из-за того, что доступные методы диагностики (эндоскопия и биопсия)
являются инвазивными. Siurala23 and Kekki24 показали в своих исследованиях, что
появление гастрита у людей, не обнаруживающих симптомов заболевания в Финляндии и
Эстонии увеличивается с возрастом. Среди людей в возрасте 30 лет число случаев
равнялось 30% и увеличивалось до 70% к 60 летнему возрасту. Далее, Petross25, Rauws26
and Barthel27 отметили, что у 20% молодых людей, не обнаруживающих симптомов
заболевания (средний возраст 30) страдали от гистологического гастрита, ассоциируемого
с инфекцией H. pylori. Частота гистологически подтвержденного гастрита в нормальной
совокупности, соотносится со случаями наличия специфических антител к H. pylori. Это
было подтверждено в исследованиях уровней антител к H. pylori у населения, не
обнаруживающего
симптомов
заболевания,
неинвазивными
серологическими
28,29
методами . Таблица 1 показывает доминирование антител к H. pylori, находимыми с
помощью теста Pyloriset Dry с сухим латексом у 500 Финских доноров крови, не
обнаруживающих симптомов заболевания, в возрасте 18–65 лет30.
ТАБЛИЦА 1
Процент Финских доноров крови в разных возрастных группах с антителами к H. Pylori
Число случаев нахождения антител к H. pylori при помощи латексного теста Pyloriset Dry
в пациентах с разным диагностическим статусом представлена в таблице 2. Были
исследованы образцы сыворотки 195 пациентов с жалобами на верхнюю часть брюшной
полости30.
ТАБЛИЦА 2
Число случаев нахождения антител к H. Pylori при помощи латексного теста Pyloriset Dry
в пациентах с разным диагностическим статусом
Диагноз
Язва
двенадцатиперстной
кишки
Ферментативная активность
Язва желудка
Антитела к H. pylori
100
Кол-во
20
92
84
115
19
Атрофия
80
100
Внутренняя метаплазия
Воспаление
80
78
54
147
Кол-во – количество людей с каждым диагнозом, только один тип диагноза или несколько
видов диагноза могли быть найдены у одного пациента. Чаще всего два и более диагноза
были поставлены.
13 Эксплутационные характеристики
Исследование 1.
Сравнение работы теста Pyloriset Dry с результатами, полученными эталонными
методами, включая культивирование, окрашивание акридина, и окрашивание азурэозином по Гимзе. Тест Pyloriset Dry был оценен с использованием образцов сыворотки
195 пациентов с симптомами в верхних отделах желудочно-кишечного тракта,
посещающими гастроэнтерологическую клинику30. Результаты представлены в таблице 3.
ТАБЛИЦА 3. Соотношение между Pyloriset Dry и эталонными тестами.
Чувствительность 97% (от 91.9% до 99.4%)*
Специфичность 85% (от 76.3% до 92.0%)*
Совпадение 92%
* Представляет 95% ограничение конфиденциальности
Результаты были сопоставлены с результатами, полученными эталонными способами,
включая культивирование, окрашивание акридина, и окрашивание азур-эозином по Гимза.
Эталонным метод считался положительным, если хотя бы одеин тест был положительным
для H. pylori. Эталонный метод считался отрицательным, если все тесты давали
отрицательный результат.
Анализ противоречивых результатов.
Противоречивые результаты (13 эталонных методов отрицательные, а тест Pyloriset Dry положительный результат; 3 эталонных метода положительные, а тест Pyloriset Dry –
отрицательный) были перепроверены процедурой имуноболт.
Противоречивые
результаты отображены в таблице 4. Из 13 негативных результатов эталонных методов/
Pyloriset Dry положительный результат, 11 содержали специфические антитела к H. pylori
при тестировании имуноболтом. Все три положительных результата эталонных методов/
Pyloriset Dry отрицательный результат оказались отрицательными при проверке
имоноболтом. Эти образцы считались бы положительными результатами эталонных
методов. Если их считать отрицательными согласно результатам имуноболта,
чувствительность и специфичность были бы 97.4% и 97.4% соответственно.
ТАБЛИЦА 4 Противоречивые результаты в сравнении с диагнозом.
Взаимосвязь между данными биопсии (хронический гастрит +/– и H. pylori +/–) и Pyloriset
Dry показана в таблице 5. Статус хронического гастрита установлен, основываясь на
обследовании патолога и наличие H. pylori установлено получением положительных
результатов путем культивирования, окрашивания акридина, и окрашивания азур-эозином
по Гимза.30
ТАБЛИЦА 5 Взаимосвязь данных биопсии и Pyloriset Dry
* Культивирование и/или окрашивания акридинового оранжеавого и/или окрашивания
азур-эозином по Гимза – положительный результат
Исследование II. Сравнительна характеристика параметров теста Pyloriset Dry и
результатов культивирования и иммуноферментного анализа (ИгГ)
Был проведен сопоставительный анализ теста Pyloriset Dry, культивирования и
иммуноферментного анализа 30. Были собраны образцы сыворотки у 691 пациента с
желудочно-кишечными симптомами. Биопсии 688 были культивированы на наличие H.
pylori.
Использованная процедура иммуноферментного анализа представляет собой
исследование, основанное на использовании титрационного микропланшета с
использованием антигена, экстрагированного из глицина. Антитела, присутствующие в
сыворотке пациента были обнаружены при помощи щелочной фосфатазы, сопрягающейся
в не человеческое ИгИ сложное соединение. Бактерии H. pylori были обнаружены в 264
из 688 культивированных биопсий. 97.7% из этих пациентов получили положительный
результат при проверке тестом Pyloriset Dry. Результаты представлены в таблице 6.
ТАБЛИЦА 6
Сравнение Pyloriset Dry и культивирования
Относительная чувствительность 98% (95.1% до 99.2%)*
Относительная специфичность 81% (77.4% до84.9%)*
Совпадение 88%
* Представляет 95% лимит конфиденциальности
Из 6 культивирование положительных/ Pyloriset Dry отрицательных образцов, три были
также положительными, согласно иммуноферментному анализу (2 ИгГ и 1 ИгА). Среди 80
культивирование отрицательных/ Pyloriset Dry положительных образцов, 50 были
положительными, согласно иммуноферментному анализу (20 ИгГ и 5 ИгА, 25 и ИгГ и
ИгА)
Результаты сравнения теста Pyloriset Dry с процедурой иммуноферментного анализа (ИгГ)
представлены в таблице 7. Тест Pyloriset Dry определил 97.3% (291/299) положительных
образцов
сыворотки согласно иммуноферментному анализу. Два из восьми ИгГ
положительных/ Pyloriset Dry отрицательных образцов дали положительный результат
при культивировании. К тому же, 14 из 49 ИгГ отрицательных/ Pyloriset Dry
положительных образцов
сыворотки дали положительный результат при
культивировании, пять дали положительный результат на ИгА.
ТАБЛИЦА 7 Результаты сравнения
иммуноферментного анализа (ИгГ)
теста
Pyloriset
Dry
с
процедурой
Относительная Чувствительность 97% (94.8% до 98.8%)*
Относительна Специфичность 88% (84.2% до 90.8%)*
Совпадение 92%
* Представляет 95% лимит конфиденциальности
Исследование III. Сравнительна характеристика параметров теста Pyloriset Dry и
результатов теста Pylori ELISA
III / a. 182 образцов сыворотки из исследования I были протестированы тестом Pyloriset
Dry и набора для тестирования Pylori Elisa. Результаты представлены в таблице 8.
ТАБЛИЦА 8 Сравнительна характеристика параметров теста Pyloriset Dry и
результатов теста Pylori ELISA
Относительная Чувствительность 88.0% (82.2% до 93.9%)*
Относительна Специфичность 96.8% (89.0% до 99.6%)*
Совпадение 91.1%
* Представляет 95% лимит конфиденциальности
Результаты тестирования двух образцов сыворотки были исключены из подсчета
чувствительности, специфичности и совпадения из-за двусмысленных результатов,
полученных при использовании набора для тестирования Pylori Elisa.
III / b. 274 из 691 образцов сыворотки пациентов из исследования 2 были протестированы
Pylori Elisa. Результаты были сопоставлены с результатами, полученными Pyloriset Dry.
Результаты приведены в таблице 9.
ТАБЛИЦА 9 Сравнение Pyloriset Dry и теста Pylori ELISA
Относительная Чувствительность 96.5% (92.0% to 98.9%)*
Относительна Специфичность 95.3% (90.0% to 98.2%)*
Совпадение 95.9%
* Представляет 95% лимит конфиденциальности
Четыре результата теста были исключены из вычисления чувствительности,
специфичности и совпадения из-за двусмысленных результатов, полученных при
использовании набора для тестирования Pylori Elisa.
Бактериальная перекрестная реактивность Pyloriset Dry
Специфичность теста Pyloriset Dry была протестирована путем истощения образцов
пациентов экстрактами антигенов различных бактериальных видов. Аликвоты каждых
двух сывороток пациентов, положительный результат которых был подтвержден
культивированием биопсии, были предварительно обработаны озвученными вытяжками
антигенов (0.3 мг/мл) из перечня видов бактерий. После инкубации образцы были
повторно протестированы Pyloriset Dry. Результаты представлены в таблице 10.
ТАБЛИЦА 10 Специфичность Pyloriset Dry
Результаты показывают, что реактивность Pyloriset Dry была ингибирована в обоих
образцах после истощения сыворотки антигеном H. pylori. Истощение экстрактами
антигенов других протестированных бактерий не оказывала никакого эффекта на
результаты Pyloriset Dry. Это указывает на то, что Pyloriset Dry не дает перекрестную
реакцию ни с одним из протестированных видов бактерий.
Воспроизводимость Pyloriset Dry
Три экземпляра сыворотки были исследованы в течение 3 дней, используя свежий раствор
каждой сыворотки каждый день. Одна сыворотка была отрицательная (титр 110), одна на
границе с положительной (титр 690), одна высоко положительная (титр 9380) при
тестировании Pyloriset EIA-G. Малозначимая величина иммуноферментного анализа (EIA)
равнялась 500. Наборы для тестирования Pyloriset Dry из одной партии использовались
для всего тестирования. Результаты представлены в таблице 11.
ТАБЛИЦА 11
Высокая согласованность результатов теста и повторяемость теста каждый день
предполагает, что технические характеристики испытаний и интерпретация результатов
высоко воспроизводимы.
Pribori Oy
Россия, 115035 г. Москва
Климентовский пер. 12, стр.1
Тел.: +7 495 937 45 94
Факс: +7 495 937 45 92
www.pribori.com