Аносова Юлия Александровна НАПРАВЛЕННЫЙ ТРАНСПОРТ

На правах рукописи
Аносова Юлия Александровна
НАПРАВЛЕННЫЙ ТРАНСПОРТ АНТИБИОТИКОВ
В ЛЕЧЕНИИ ОСТРОГО ГНОЙНОГО ПИЕЛОНЕФРИТА
У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ
14.01.23 – урология
14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Саратов – 2010
2
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего
профессионального образования «Воронежская государственная медицинская
академия им. Н.Н. Бурденко Федерального агентства по здравоохранению и
социальному развитию».
Научные руководители:
доктор медицинских наук, профессор
Кузьменко Владимир Васильевич;
доктор медицинских наук, профессор
Свистунов Андрей Алексеевич.
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор
Морозов Дмитрий Анатольевич;
чл.-корр. РАМН, профессор
Спасов Александр Алексеевич.
Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего
профессионального образования «Курский государственный медицинский
университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному
развитию.
Защита диссертации состоится «27» января 2010г. в _____часов на заседании
диссертационного совета Д 208.094.01 при ГОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И.
Разумовского Росздрава по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Б.Казачья, 112.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Саратовский ГМУ
им. В.И. Разумовского Росздрава.
Автореферат разослан «
»______________________2009г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
доктор медицинских наук, профессор
Маслякова Г.Н.
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования
Пиелонефрит – одно из самых распространенных заболеваний почек в
любых возрастных группах, частота которого за последние годы
увеличивается (Тиктинский О. Л. и соавт., 2002; O'Donnell J. et al., 2002).
Увеличение частоты встречаемости острого пиелонефрита связано с
возросшей вирулентностью микроорганизмов в результате приобретенной
ими устойчивости к антибактериальным препаратам, следствием чего
явилось снижение эффективности консервативной терапии (Неймарк А.И.,
Симашкевич А.В., 2007).
В последние годы наблюдается увеличение числа случаев атипичного
течения острого пиелонефрита. Объясняется это не только улучшением
диагностики и резко возросшей вирулентностью микроорганизмов, но и
изменением течения инфекционного процесса в почке вследствие подавления
иммунных реакций при проведении антибактериальной терапии и на фоне
измененной реактивности организма (Лоран О.Б., 1998).
Применяемая традиционная антибактериальная терапия нередко не
оказывает достаточного лечебного эффекта, так как в результате нарушений
в системе гомеостаза снижается возможность доставки препарата в очаг
воспаления и достижения необходимой концентрации в нём (Пытель Ю.А. и
соавт., 1994; Лохвицкий С.В., 1999; Naber К.G., 2000; Gilbert D. et al., 2002).
Антибиотикотерапия становится эффективной при условии создания
высоких, длительно сохраняющихся концентраций лекарственного вещества
в очаге микробного воспаления (Черний В.И., 2004). При внутримышечном и
внутривенном введении лекарственных препаратов не всегда удается достичь
необходимой концентрации в ткани почки (Чазов Е.И., 1987).
Говоря о лечении деструктивных форм пиелонефрита, следует уделить
внимание
влиянию
оперативного
вмешательства,
наркоза,
антибактериальной терапии на функциональное состояние почек. Нарушение
кровообращения в почке как в ходе операций, так и при эндогенных и
экзогенных интоксикациях организма, делают почку более восприимчивой к
инфекции (Калугина Г.В., 1996).
Одним из возможных решений является поиск и изучение новых
перспективных методов лечения, каким и является методика направленного
транспорта антибиотиков (Белобородов В.Б., 1999), что по эффективности и
минимальной токсичности можно сравнить с «точечным бомбовым ударом»
(Карпушина И.А. и соавт., 2004).
Направленный транспорт антибиотиков в зону воспаления позволяет,
наряду с созданием в ней высокой концентрации вводимого препарата,
максимально
уменьшить
нежелательные
реакции
организма
на
медикаментозное воздействие, снизить терапевтическую дозу препарата и
кратность введения (Сипливая Л.Е. и соавт., 1998).
4
Таким образом, острый пиелонефрит и его гнойные формы
представляют актуальную клиническую проблему, обусловленную
неудовлетворительными результатами лечения и связанную со сложностью
выбора оптимальной лечебной тактики, значительными экономическими
затратами и длительной реабилитацией этой категории больных.
Цель исследования
Цель исследования – повышение эффективности лечения острого
гнойного пиелонефрита путем применения метода направленного транспорта
антибиотиков в эксперименте на животных.
1.
2.
3.
4.
5.
Задачи исследования:
Изучить возможность повышения концентрации антибиотиков в
форменных элементах крови путем изменения инкубационной
среды.
In vitro определить и обосновать объем крови, необходимый для
связывания разовой дозы антибиотика.
Изучить кривые концентраций цефотаксима в плазме крови при
традиционном внутривенном введении и введении антибиотика
методом направленного транспорта.
Изучить влияние введения цефотаксима методом направленного
транспорта на концентрацию антибиотика в ткани почки.
Изучить влияние введения цефотаксима методом направленного
транспорта на эффективность антибактериальной терапии у
животных с острым гнойным пиелонефритом.
Научная новизна
Установлено оптимальное соотношение объема форменных элементов
крови и антибиотика для проведения направленного транспорта.
Изучена динамика концентрации цефотаксима в форменных элементах
крови при изменении условий инкубационной среды, что позволило
повысить содержание антибиотика внутри клеток крови.
Изучено влияние метода введения антибиотика на его концентрацию в
плазме крови и ткани почки при моделированном остром пиелонефрите.
Дана оценка эффективности антибактериальной терапии острого
пиелонефрита у экспериментальных животных при введении цефотаксима
методом направленного транспорта.
Практическая значимость исследования
Исследование влияния калия хлорида на проникновение цефотаксима
внутрь клеток крови позволило определить оптимальные условия для
инкубации
клеточной
взвеси
с
антибиотиком.
Проведение
антибактериальной терапии методом направленного транспорта позволит в
5
значительной степени улучшить результаты лечения острого гнойного
пиелонефрита.
Реализация результатов работы
Результаты работы внедрены в работу экспериментальной лаборатории
ГУЗ «Воронежская областная клиническая больница №1». Материалы
диссертации используются в учебном процессе на кафедре урологии
Государственного
образовательного
учреждения
высшего
профессионального
образования
«Воронежская
государственная
медицинская академия им. Н.Н. Бурденко Федерального агентства по
здравоохранению и социальному развитию».
Основные положения, выносимые на защиту
1. При инкубации клеточной взвеси с антибиотиком наличие в
инкубационной среде раствора калия хлорида способствует
повышению концентрации антибиотика внутри клеток крови.
2. Для проведения направленного транспорта цефотаксима объем
крови, необходимый для связывания 1,0г антибиотика, составляет
30 мл при условии наличия в среде инкубации раствора калия
хлорида в концентрации 0,25 мг/мл.
3. Применение метода направленного транспорта антибиотиков
позволяет повысить эффективность комплексной терапии острого
гнойного пиелонефрита, что выражается в более ранних сроках
нормализации показателей периферической крови, состояния
экспериментальных животных и ускорении темпов воспалительного
процесса.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 136 страницах компьютерного текста,
содержит 15 таблиц, 29 рисунков, состоит из введения, обзора литературы,
описания материалов и методов исследования, трех глав результатов
собственных
исследований,
заключения,
выводов,
практических
рекомендаций и списка литературы, включающего 191 источник (117
отечественных и 74 иностранных).
Апробация работы и публикации
Основные положения диссертации представлены на областном
обществе урологов (Воронеж, 2008); межрегиональной конференции
урологов «Современные вопросы урологии» (Воронеж, 2008); научнопрактической межрегиональной конференции урологов «Актуальные
проблемы урологии и андрологии, стандартизация подходов» (Воронеж,
2009); российской научной конференции с международным участием
«Фундаментальные исследования в уронефрологии» (Саратов, 2009);
совместном заседании кафедр урологии с курсом урологии и андрологии
6
ИПМО, общей хирургии, онкологии и лучевой терапии ВГМА им Н.Н.
Бурденко.
Результаты исследований изложены в сборнике научных статей
«Современное состояние и перспективы развития медицины» (Воронеж,
2006); материалах научно-медицинского вестника Центрального Черноземья
(Воронеж, 2008); материалах III Всероссийской конференции молодых
ученых, организованной Воронежской государственной медицинской
академией им. Н.Н.Бурденко и Курским государственным медицинским
университетом (Курск, 2009); материалах российской научной конференции
с международным участием «Фундаментальные исследования в
уронефрологии» (Воронеж, 2009); материалах научно-практической
межрегиональной конференции «Актуальные проблемы урологии и
андрологии, стандартизация подходов» (Воронеж, 2009); «Вестнике
Воронежского государственного университета» Серия: Химия. Биология.
Фармация
(Воронеж,
2009);
Уральском
медицинском
журнале
(Екатеринбург, 2009).
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
В ходе работы был использован антибиотик группы цефалоспоринов с
действующим веществом «цефотаксим». Цефотаксим в своем составе имеет
несколько ионогенных групп, поэтому можно предположить о фиксации
цефотаксима на мембране эритроцитов за счет слабых взаимодействий с
компонентами мембраны. Кроме того, не исключены проникновение
цефотаксима внутрь эритроцита и его взаимодействие с внутриклеточным
содержимым.
В работе приведены данные исследования зависимости распределения
цефотаксима между средой инкубации и фракцией форменных элементов
крови при изменении инкубационной среды.
В инкубационные системы поочередно были внесены разные
модификаторы.
Были выбраны:
- АТФ (за счет энергии гидролиза которого происходит активный
транспорт ионов через клеточную мембрану);
- MgSO4 (ионы Mg++, связываясь с клеточными мембранами,
регулируют их проницаемость для прочих ионов, а также механические
свойства мембран);
- глюкоза (при облегченной диффузии глюкозы в мембране эритроцита
открываются своеобразные каналы, через которые другие ионы могут
проникать внутрь эритроцита);
- KCl (ионы К+ снижают устойчивость мембран клеток).
В ходе исследования форменные элементы крови после инкубации с
антибиотиком были отделены от плазмы крови центрифугированием.
7
Далее форменные элементы крови были гемолизированы путем
добавления дистиллированной воды, а в полученной взвеси определяли
концентрацию цефотаксима.
Все спектрофотометрические исследования были проведены в 30
повторах.
С целью определения объема крови, необходимого для проведения
направленного транспорта 1,0 г цефотаксима, были созданы инкубационные
системы с равными количествами в них цефотаксима и различными
объемами крови.
Во всех опытах был добавлен KCl в одинаковой конечной
концентрации в клеточной взвеси, равной 0,25 мг/мл (оптимальная
концентрация).
Полученные данные были применены далее в
лечении
моделированного пиелонефрита у собак.
Экспериментальное исследование проводилось в двух группах на 30
беспородных собаках. Для опыта отбирались внешне здоровые животные без
видимых дефектов на коже и признаков общей патологии массой тела 1418кг.
Группы экспериментальных животных отличались методом введения
антибиотика цефотаксима:
- первая группа (контрольная) включала 15 собак, которым
проводилась антибактериальная терапия путем традиционных внутривенных
инъекций цефотаксима;
- вторая группа (опытная) состояла из 15 собак, которым цефотаксим
вводился методом направленного транспорта.
Методика направленного транспорта антибиотиков предусматривает
забор венозной крови, добавление гепарина и полиглюкина, удаление плазмы
после осаждения форменных элементов, экстракорпоральную инкубацию
клеточной массы с цефотаксимом, последующее добавление 0,9%-ного
раствора NaCl и внутривенное введение полученной взвеси.
Для того чтобы максимально приблизить условия проводимой терапии
в группах сравнения, в контрольной группе также выполнялась эксфузия
венозной крови, добавление полиглюкина и гепарина в аналогичных
дозировках и замещение плазмы 0,9%-ным раствором NaCl.
Ежедневно оценивали общее состояние животных, отмечали наличие
гипертермии, тахикардии, тахипноэ, сниженного аппетита и массы тела.
В начале эксперимента все животные подвергались оперативному
вмешательству с целью моделирования острого гнойного пиелонефрита
путем создания обратимой обструкции верхних мочевых путей и введения
взвеси Escherichia coli, 105 КОЭ в 1 мл в почечную лоханку.
Введение взвеси Escherichia coli, 105 КОЭ в 1 мл обеспечивает
получение
достоверной
модели
пиелонефрита
при
отсутствии
инфицирования брюшной полости и послеоперационной раны (Лоран О.Б. и
соавт., 2006).
8
На третьи сутки у всех экспериментальных животных в разной степени
выраженности отмечались повышение температуры тела, тахипноэ,
тахикардия, снижение аппетита. Наблюдали общее угнетение животного,
утомляемость, исхудание.
Производилась биопсия почки с целью гистологического исследования
(гистологическое подтверждение развития гнойного пиелонефрита).
У всех животных был произведен общий анализ крови с лейкоцитарной
формулой.
На третьи сутки уродинамика на стороне поражения была
восстановлена путем снятия П-образного шва с устья мочеточника. После
восстановления пассажа мочи начиналась антибактериальная терапия.
Антибактериальную терапию проводили препаратом цефотаксим. Введение
лекарственных препаратов проводилось традиционными внутривенными
инъекциями или путем направленного транспорта (табл.1).
Сутки
эксперимента
Начало
эксперимента
Третьи
сутки
Шестые
сутки
Девятые
сутки
Таблица 1
План экспериментального исследования на животных
Контрольная группа
Опытная группа
Моделирование пиелонефрита
Моделирование пиелонефрита
Биопсия почки
(гистологическое
исследование).
Восстановление уродинамики
путем снятия П-образного шва
с устья мочеточника.
Начало антибактериальной
терапии путем традиционных
внутривенных инъекций
цефотаксима.
Ревизия, декапсуляция почки.
Биопсия почки
(гистологическое и
хроматографическое
исследования).
Нефрэктомия
(гистологическое и
хроматографическое
исследования).
Биопсия почки
(гистологическое
исследование).
Восстановление уродинамики
путем снятия П-образного шва
с устья мочеточника.
Начало антибактериальной
терапии методом
направленного транспорта
цефотаксима.
Ревизия, декапсуляция почки.
Биопсия почки
(гистологическое и
хроматографическое
исследования).
Нефрэктомия
(гистологическое и
хроматографическое
исследования).
9
На шестые сутки всем животным производили ревизию, декапсуляцию
почки, при выявлении карбункулов – крестообразное вскрытие.
После этого производили биопсию почки (с целью гистологического и
хроматографического исследований) и общий анализ крови. В
послеоперационном периоде продолжалась проводимая антибактериальная
терапия.
На девятые сутки выполняли нефрэктомию, взятие материала для
гистологического и хроматографического исследований и общий анализ
крови.
Предложенный способ направленного транспорта антибиотиков
заключается в следующем.
В шприц набирают из вены кровь, при этом добавляют гепарин и
полиглюкин в расчете – на 30 мл крови 0,5 мл (2500 ЕД) гепарина и 1 мл
полиглюкина.
Взвесь
отстаивается,
плазма
удаляется.
Разовую
среднетерапевтическую дозу цефотаксима растворяют в 0,9%-ном растворе
NaCl и растворе KCl (конечная концентрация KCl – 0,25 мг/мл) и добавляют
в шприц с клеточной массой. Создают однородную гомогенную массу взвеси
клеток крови с антибиотиком, которую затем инкубируют в термостате при
температуре 370С в течение 30 минут. После этого доводят объем крови в
шприце стерильным 0,9%-ным раствором NaCl до исходного объема и вводят
внутривенно.
При изменении дозы цефотаксима объем забираемой венозной крови
высчитывается по формуле:
V = 30 мл венозной крови × доза цефотаксима (мг).
1000 мг цефотаксима
Для обработки данных изучаемых показателей был использован
компьютерный пакет прикладных программ STATISTICA (StatSoft, версия
6). Статистическая нулевая гипотеза о соответствии данных нормальному
закону проверялась с помощью критерия Шапиро–Уилка. В качестве
порогового уровня статистической значимости р (вероятности ошибочно
отклонить нулевую гипотезу) было принято значение 0,05.
Для проверки различий средних изучаемых признаков в исследуемых
группах использовали t-критерий Стьюдента для независимых групп,
который заключается в проверке нулевой гипотезы о том, что средние
значения в группах не различаются. При значениях p < 0,05 принималась
альтернативная гипотеза о существовании различий средних значений.
Анализ качественных данных включал подсчет абсолютных и
относительных частот для каждого признака. По результатам подсчета
проводилось сравнение контрольной и основной групп путем проверки
нулевой гипотезы о равенстве относительных частот с помощью
"Вероятностного калькулятора" пакета прикладных программ STATISTICA с
использованием двустороннего критерия статистической значимости, когда
неизвестно, какая из групп преобладает по частоте.
10
В качестве порогового уровня статистической значимости было
принято значение 0,05 (Реброва О.Ю., 2002; Гринхальх Т., 2004).
Результаты исследования
Экспериментальное обоснование условий инкубации и объема
крови для проведения направленного транспорта цефотаксима
В начале исследования выявляли влияние концентрации цефотаксима,
добавленного к клеточной взвеси, на его распределение между форменными
элементами крови и надосадочной жидкостью. Цитовзвесь готовилась из
венозной крови. Для этого к 30 мл крови из вены добавляли 0,5 мл гепарина
и 1 мл полиглюкина (для ускорения осаждения форменных элементов крови).
Спустя один час после осаждения форменных элементов крови плазму
удаляли, оставшуюся цитовзвесь использовали для дальнейших
исследований. После инкубации клеточной взвеси с антибиотиком
форменные элементы были отделены от плазмы крови центрифугированием.
Далее форменные элементы крови подвергались гемолизу путем добавления
дистиллированной воды и в полученной взвеси определяли концентрацию
цефотаксима. Наличие цефотаксима в клеточной массе после
центрифугирования и удаления надосадочной жидкости позволяет судить о
том, что данный антибиотик способен проникать в клетки крови или
связываться с компонентами мембраны этих клеток.
Оказалось, что при увеличении концентрации цефотаксима, вносимого
в инкубационную среду, увеличивается его концентрация в клетках крови, но
при этом увеличивается его концентрация и в супернатанте. Соотношение
данного антибиотика в форменных элементах и супернатанте увеличилось
незначительно, при этом оставаясь выше во внеклеточном пространстве в
1,6-2,0 раза (рис.1).
Концентрация
цефотаксима, мг/мл
0,005
0,004
0,003
0,002
0,001
0
без
АТФ
модификаторов
Концентрация в клетках крови
MgSO4
глюкоза
KCl
Концентрация в супернатанте
Рис.1. Концентрация цефотаксима в клеточной массе
и супернатанте при разных условиях инкубации